Funkcija Proteina - Hemoglobin

Univerzitet u Tuzli

Prof. Dr. Lejla Begić

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Proteini su dinamične molekule čije funkcije zavise od interakcije sa drugim molekulama.Molekula koja se reverzibilno veže za protein naziva se ligand.

Privremeni karakter protein-ligand interakcije omogućava organizmu da djeluje brzo i reverzibilno na metaboličke promjene i na promjene koje se dešavaju u okolini

Univerzitet u Tuzli




Određeni protein može imati odvojena mjesta vezivanja za nekoliko različitih liganda. Strukturna adaptacija koja se odvija između proteina i liganda naziva se izazvano prilagođavanje (induced fit).

Kada jedan protein ima više podjedinica, konformacione promjene u jednoj podjedinici često uzrokuju promjene i u drugim podjedinicama.

Univerzitet u Tuzli




Mioglobin i hemoglobin ilustriraju principe proteinske konformacije.Njihova trodimenzionalna struktura poznata do atomskih detalja pokazuje kako se protein svija, veže druge molekule i integrira informaciju.Interakcije koje se dešavaju između prostorno udaljenih mjesta na molekuli proteina zovu se alosteričke interakcije.Alosterički efekti imaju kritičnu ulogu u kontroli i integraciji molekularnih događaja u biološkim sistemima.Hemoglobin je najbolje shvaćen alosterički protein.

Univerzitet u Tuzli




Prelazak sa anaerobnog na aerobni način života predstavljao je golem evolucijski korak.Otkriven je novi rezervoar energije.U prisustvu oksigena iz glukoze se dobije 18 puta više energije.Da bi opskrbili svoje ćelije odgovarajućim dotokom oksigena kičmenjaci su razvili dva glavna mehanizma:1.Cirkulatorni sistem2.Korištenje molekula-prijenosnika oksigena, pomoću kojih se prevazilazi problem male topivosti oksigena u vodi.

Univerzitet u Tuzli




Prijenosnici oksigena u vertebrata su hemoglobin i mioglobin.Hemoglobin se nalazi u eritrocitima i služi kao prijenosnik oksigena u krvi. Hemoglobin povećava prijenosni kapacitet za oksigen u litri krvi sa 5 ml na 250 ml.Hemoglobin ima ključnu ulogu pri prijenosu karbon dioksida i hidrogena.Mioglobin, smješten u mišićima , služi kao spremnik oksigena i olakšava njegovo kretanje u mišićima.

Univerzitet u Tuzli




Oksigen se veže za prostetsku grupu-hem.

Oksigen je slabo topiv u vodenim otopinama.

Reverzibilno vezanje oksigena vrše prelazni metali Fe i Cu koji imaju jak afinitet za oksigen.

Slobodno Fe sa oksigenom gradi hidroksil radikale, a reaktivnost se smanjuje vezanjem Fe u hem.

Univerzitet u Tuzli




Hem se sastoji iz kompleksne organske prstenaste strukture, protoporfirina IX za koju se veže Fe u fero obliku Fe2+.

Porfirini se sastoje iz 4 pirolova prstena povezana metenskim vezama.

Univerzitet u Tuzli




Struktura hema

Koordinativno vezani atomi nitrogena imaju karakter elektron donora i imaju udjela u sprječavanju konverzije Fe2+u Fe3+.

Univerzitet u Tuzli




Struktura hema

U slobodnom hemu može doći do konverzije Fe2+ u Fe3+.

Univerzitet u Tuzli




Atom Fe ima 6 koordinativnih veza, 4 u ravnini porfirinskog prstena sa nitrogenima pirola i 2 okomite na ravninu prstena.

Univerzitet u Tuzli




Hem grupa prikazana sa strane. Vide se 5. i 6. koordinativno mjesto. Peto mjesto okupira histidin tzv. proksimalni His.

Šesto koordinativno mjesto je vezivno mjesto za oksigen.

Univerzitet u Tuzli




U proteinima se hem izolira duboko u proteinsku strukturu gdje je pristup dvjema otvorenim koordinativnim vezama prostorno ograničen.

Vezanjem O2 mijenjaju se elektronske karakteristike hem željeza. Zato se arterijska i venska krv razlikuju u boji.

Neke male molekule kao što su CO i NO jače se vežu za hem Fe.

Univerzitet u Tuzli




Atom željeza u hemu je 0.03 nm izvan ravni porfirina prema HisF8.

U deoksimioglobinu 6. koordinativna pozicija je prazna.

U oksimioglobinu za 6. koordinativnu poziciju vezan je O2.

U ferimioglobinu za 6. koordinativnu poziciju vezana je voda.

Univerzitet u Tuzli




1.Mioglobin je kompaktna molekula dimenzija 4,5x 3,5 x 2,5nm.

2. 75% lanca je u obliku 8 α-heliksa. Između heliksa nalazi se 5 neheliksnih segmenata i još 2 neheliksna regiona na N- i C-terminusu.(2 AK na N i 5 AK na C)

3. U unutrašnjost se nalaze nepolarni ostaci i 2 polarna ostatka histidina.

Univerzitet u Tuzli




Struktura mioglobina. Osam α-heliksnih segmenata označeni su slovima od A do H. Neheliksni ostaci koji povezuju helikse označeni su kao AB, CD, EF itd. Hem je smješten u džepu koji najvećim dijelom grade E i F heliksi.

Univerzitet u Tuzli




Vezanje liganda na protein ovisi od proteinske strukture.

CO se veže za slobodni hem 20.000 puta jače nego O2.

CO se veže 200 puta jače za hem mioglobina nego O2.

Ova razlika se objašnjava steričkim odbijanjima.

O2 se veže za slobodni hem pod uglom.

Univerzitet u Tuzli




Veza O, C, Fe postavljena je linearno.

U mioglobinu His64 (E7) u blizini vezivnog mjesta za oksigen prisiljava CO da se veže pod uglom i time slabi interakciju CO s hemom, a pospješuje vezanje O2.

CO se stvara endogeno i blokira 1% mjesta u mioglobinu i hemoglobinu.

Univerzitet u Tuzli




Funkcija prostetske grupe modulirana je njenom polipeptidnom okolinom. Vezanje O2 za hem zavisi i od molekularnog kretanja odn. “disanja” proteinske strukture.

Na slici je prikazan prostorni raspored ključnih aminokiselinskih ostataka oko hema mioglobina. O2 je hidrogenskom vezom povezan za distalni histidin.

Univerzitet u Tuzli




Geni za mioglobin i hemoglobin divergirali su prije 700 miliona godina.

Podjedinice hemoglobina veoma su slične mioglobinu u 3D strukturi.

Univerzitet u Tuzli




Sekvence u 3 lanca (α, β i mioglobinu) podudaraju se u samo 27 mjesta.

Osnovni motiv je globinsko svijanje.

Univerzitet u Tuzli




Poznate su AK sekvence za više od 60 vrsta hemoglobina. 9 pozicija je očuvano u većini proučenih vrsta i one su važne za funkciju.

Na slici su prikazane aminokiselinske sekvence mioglobina kita, te α i β lanaca ljudskog hemoglobina. Crveno su osjenčena konzervirana područja.

Univerzitet u Tuzli




Hemoglobin se sastoji iz 4 polipeptidna lanca 2α i 2β lanca (A1).

Α lanci imaju po 141 AK ostatak, a β lanci po 146 ostataka.

Hemoglobin A2 sadrži 2α i 2δ lanca.

Fetusni hemoglobin (HbF) sadrži 2α i 2γ lanca.

U hemoglobinu A1c (glikozilirani hemoglobin) ostaci glukoze kovalentno su vezani za N-terminuse β lanaca.

Univerzitet u Tuzli




Promjene u produkciji globinskih lanaca tokom razvića.

Univerzitet u Tuzli




Max Perutz je od 1936-1959 istraživao strukturu hemoglobina.

Molekula je sferična d=5,5 nm.

Četiri polipeptidna lanca su tetraedarski raspoređena.

Univerzitet u Tuzli




Hem je smješten u procjepu blizu površine molekule.

4 vezivna mjesta za oksigen međusobno su udaljena. Dva najbliža Fe atoma su na udaljenosti od 2,5 nm.

Svaki α lanac u kontaktu

je sa 2β lanca i obrnuto.

Univerzitet u Tuzli




Na slici je pokazana kvartenerna struktura hemoglobina. Pokazani su α1 β2 kontakti između FG uglova i C heliksa.

Nepolarni karakter unutrašnjosti molekule važan je za vezanje hema i stabilizaciju 3D strukture svake podjedinice.

α

Univerzitet u Tuzli




Nevarijantni ostaci u molekuli hemoglobina:

His F8 direktno vezan za željezo hema,

Tyr HC2 stabilizira strukturu stvarajući vodikove veze, povezuje H i F helikse

Gly B6 omogućava približavanje B i E heliksa

Pro C2 predstavlja kraj C heliksa,

His E7 distalni histidin blizu hema

Phe CD1 kontakt s hemom

Leu F4 kontakt s hemom

Uloga konzerviranih ostataka treonina C4 i lizina H10 nije poznata.

Univerzitet u Tuzli




Hemoglobin je alosterički protein.

Alosteričke interakcije omogućavaju hemoglobinu da koordinirano transportira O2, CO2 i H+.

α i β podjedinice su slične mioglobinu, ali poprimaju nove osobine kada se vežu u tetramer.

Dolazi do interakcije međusobno udaljenih mjesta.

Univerzitet u Tuzli




1. Afinitet hemoglobina za O2 zavisi od pH, konc. CO2, dok afinitet mioglobina ne zavisi od ovih faktora

2. Afinitet hemoglobina prema oksigenu regulira se pomoću organskih fosfata (BPG)

3. Vezanje jedne molekule O2 podstiče vezanje drugih molekula O2

Univerzitet u Tuzli




Y-saturacija predstavlja frakcioni udio mjesta zaposjednutih oksigenom u otopini mioglobina ili hemoglobina.

Vrijednosti Y od 0 do 1

Univerzitet u Tuzli




Dijagram saturacije Y u odnosu na parcijalni pritisak pO2 zove se krivulja disocijacije kiseonika.

Pri bilo kojoj vrijednosti pO2, Y

je veće za mioglobin nego za hemoglobin.

Znači da mioglobin ima veći afinitet prema oksigenu od hemoglobina.

Krivulja disocijacije oksigena za mioglobin ima oblik hiperbole, a za hemoglobin oblik sigmoide.

Univerzitet u Tuzli




.

Afinitet prema oksigenu određuje se na osnovu p50.

To je parcijalni pritisak oksigena kod kojeg je 50%

mjesta zaposjednuto.

Za mioglobin p50 iznosi 133,3 Pa (1 mmHg, 1 torr).

Za hemoglobin p50 iznosi 3,47 kPa (26 mmHg, 26 torra).

Univerzitet u Tuzli




Hemoglobin mora efikasno vezati oksigen u plućima gdje je parcijalni pritisak O2 oko 13,3 kPa i oslobađati ga u tkivima gdje je pO2 oko 4 kPa.

Hemoglobin može prelaziti iz stanja visokog afiniteta (R) u stanje niskog afiniteta (T) prema oksigenu i obrnuto. Zato hemoglobin ima hibridni (S) oblik krivulje vezanja oksigena.

Univerzitet u Tuzli




Kooperativno vezanje liganda na multimerni protein predstavlja oblik alosteričkog vezanja.

Vezanje jednog liganda utiče na afinitet preostalih nepopunjenih vezujućih mjesta, pa se O2 može smatrati i kao ligand i kao aktivirajući homotropni modulator.

Na svakoj podjedinici hemoglobina postoji jedno vezujuće mjesto za oksigen.

Univerzitet u Tuzli




Konformacijske promjene koje se prenose s jedne podjedinice na drugu izazvane su alosteričkim efektima koji povećavaju koperativnost.

Sigmoidna kriva omogućava mnogo senzitivniji odgovor na promjenu koncentracije liganda.

Univerzitet u Tuzli




Dva modela kooperativnosti: usklađeni i sekvencijalni model.

Univerzitet u Tuzli




Zahvaljujući kooperativnosti među podjedinicama za 1,83 puta povećava se količina oksigena koja se predaje tkivima.

Četvrta molekula oksigena se za 300 puta čvršće veže za hemoglobin od prve.

Univerzitet u Tuzli




Hemoglobin H predstavlja β tetramer hemoglobina.

Alosteričke osobine proizilaze iz interakcije među podjedinicama.

Rentgenostrukturne analize pokazale da se kvaternerne strukture oksihemoglobina i deoksihemoglobina značajno razlikuju.

Oksihemoglobin je značajno kompaktniji.Razmak između Fe u oksihemoglobinu manji za 0,7 nm.

Univerzitet u Tuzli




Vezanje oksigena izaziva strukturne promjene u hemoglobinu.Oksigen ima mnogo veći afinitet za R-oblik hemoglobina.Vezanje oksigena stabilizira R-oblik. Kada oksigen nije prisutan, T stanje je stabilnije.T-stanje je predominantna konformacija deoksihemoglobina. T stanje stabiliziraju ionski parovi koji su najvećim dijelom smješteni na α1β2 i α2β1 međupovršini.Ove međupovršine predstavljaju prekidač između T i R strukture.

Univerzitet u Tuzli




Na slici su prikazani ionski parovi koji stabiliziraju T stanje

hemoglobina.

Univerzitet u Tuzli




Na slici su prikazano ionski parovi koji stabiliziraju T stanje hemoglobina.

Univerzitet u Tuzli




Za 15o rotira αβ par pri prelasku T u R. Karboksiterminalni ostaci u R slobodno rotiraju.

Univerzitet u Tuzli




Promjena konformacije prilikom vezanja O2.

Univerzitet u Tuzli




Hemoglobin prenosi dva konačna proizvoda celularne respiracije CO2 i H+ do mjesta njihovog izlučivanja, pluća i bubrega.

CO2 se prenosi:

1.izohidričnim transportom

2. kao karbaminohemoglobin

3.otopljen u plazmi

Univerzitet u Tuzli




CO2 se hidratizira i prevodi u HCO3- i H+ uz enzim

karboanhidrazu.

CO2 + H2O ↔ H2CO3 ↔H+ + HCO3-

Puferovanje i izohidrični mehanizam regulišu koncentraciju H+ iona prilikom transporta CO2.

Univerzitet u Tuzli




Izohidrični transport CO2 i transport O2 putem hemoglobina.

Univerzitet u Tuzli




Izlazak bikarbonata iz eritrocita i ulazak hlorida u eritrocite u ekstrapulmonalnim tkivima-pomak hlorida.

Univerzitet u Tuzli




Izlazak hlorida iz eritrocita i ulazak bikarbonata u eritrocite u pulmonalnom tkivu-pomak hlorida.

Univerzitet u Tuzli




HHb+O2↔HbO2+H+

Međusobna ovisnost vezanja O2, CO2 i H+ predstavlja Bohrov efekat (Christian Bohr).

Glavni doprinos u Bohrovom efektu ima His 146 (HisCH3) β podjedinice.

Kada je protoniziran ovaj ostatak formira ionski par sa Asp94 (AspFG1) što pomaže stabilizaciji deoksihemoglobina u T obliku.

U R stanju dolazi do kidanja ionskih veza i oslobađanja protona.Sličan efekat ima i protonizacija aminoterminalnih ostataka α podjedinica i drugi His ostaci unutar molekule.

Univerzitet u Tuzli




His 146 (HisCH3) β

Asp 94 (AspFG1) β

Lys 40 (C5) α

Univerzitet u Tuzli




Efekat pH na vezivanje O2 za hemoglobin.

Aciditet povećava otpuštanje oksigena.

Univerzitet u Tuzli




Efekat temperature na vezivanje O2 za hemoglobin.

Povišena temperatura povećavaju otpuštanje oksigena.

Univerzitet u Tuzli




CO2 se veže kao karbamatna grupa na α-amino grupe amino terminusa svih globinskih lanaca i tako nastaje karbaminohemoglobin.

Vezani karbamati stvaraju ionske veze koje stabiliziraju T formu. Zato se smanjuje

afinitet hemoglobina prema oksigenu.

13-15% transporta CO2 odvija se preko karbaminohemoglobina.

Univerzitet u Tuzli




Vezanje oksigena za hemoglobin regulira 2,3-bisfosfoglicerat.

Univerzitet u Tuzli




Vezanje oksigena za hemoglobin regulira 2,3-bisfosfoglicerat.

Univerzitet u Tuzli




BPG se veže za deoksihemoglobin.

BPG smanjuje afinitet hemoglobina prema oksigenu 26 puta.

Univerzitet u Tuzli




BPG raste na velikim visinama-adaptacija na snižen pO2.

U tkiva se otpušta 40% od maksimalne količine oksigena koja se prenosi putem krvi.

U hipoksiji i kardiopulmonalnoj

insuficijenciji povišen je BPG.

U krvi koja stoji 10 dana smanji se nivo BPG sa 4,5 mmol/L na 0,5 mmol/L.

U medij se dodaje inozin koji se prevodi u BPG. Očuvana funkcionalna cjelovitost krvi.

Univerzitet u Tuzli




Hemoglobin fetusa ima veći afinitet prema oksigenu od majčinog hemoglobina.

Veći afinitet omogućava optimalni prijenos oksigena iz majčinog krvotoka u krvotok fetusa.

Hemoglobin F slabije veže oksigen od hemoglobina A usljed zamjene

His143 sa serinom u β -lancima hemoglobina.

Univerzitet u Tuzli




Negativno nabijeni BPG veže se za nekoliko pozitivno nabijenih grupa u T konformaciji: His143, His2 i Lys82

Univerzitet u Tuzli




BPG stabilizira T-stanje smještajući se u šupljinu između β lanaca.

Negativno nabijeni BPG veže se za nekoliko pozitivno nabijenih grupa u T konformaciji: His143, His2 i Lys82.

Univerzitet u Tuzli




Nedostaci glikolize u eritrocitu mijenjaju prijenos oksigena.

Kod nedostatka heksokinaze nenormalno je visok afinitet prema oksigenu.

Kod nedostatka piruvat kinaze malen je afinitet prema oksigenu.

BPG nastaje u glikolizi (skretnica).

Univerzitet u Tuzli




Vezujući džep za BPG nestaje u R obliku.

Univerzitet u Tuzli




Vezanje O2, CO2 i H+ i BPG za hemoglobin međusobno je ovisno. Ove molekule i ion vežu se za udaljena mjesta koja međusobno komuniciraju kompleksnim konformacijskim promjenama unutar proteina.Međusobno obavještavanje između ovih mjesta obavlja se preko promjene kvaternerne strukture.

U evolucijskom koraku od mioglobina ka hemoglobinu nastala je makromolekula koja je sposobna da prima informacije iz svoje okoline.

Univerzitet u Tuzli




Normalni eritrociti

Mutacija gena koja dovodi do promjene samo jedne aminokiseline u jednom proteinu može izazvati bolest.

Najbolje proučena molekulska bolest je srpasta anemija.

Univerzitet u Tuzli




Srpastu anemiju karakteriziraju tanki, izduženi, srpasti-polumjesečasti eritrociti.

Poluživot ovih ćelija je kraći nego kod drugih eritrocita.

Hemoliza eritrocita dovodi do teške anemije.

Samo 1% eritrocita u venskoj cirkulaciji heterozigota je srpasto, dok je u homozigota 50% srpastih eritrocita

Univerzitet u Tuzli




Topivost deoksigeniranog srpastog hemoglobina abnormalno je niska i iznosi 1/25 normalnog hemoglobina.

U visokokoncentriranim otopinama srpastog hemoglobina pri deoksigenaciji stvaraju se fibrozni precipitati.

Ovi precipitati deformišu eritrocite i daju im srpast oblik.

Univerzitet u Tuzli




Jedna aminokiselina u β lancu je mutirana.1949. Pauling je pomoću elektroforeze utvrdio da je izoelektrična tačka HbS viša nego u HbA.1954. Fingerprinting metodom Ingram je odredio razliku između HbS i HbA.Na položaju 6 u β lancu u HbS nalazi se valin, a u HbA glutamat.Ova zamjena postavlja nepolarne ostatke na vanjsku stranu HbS koje čine tzv. ljepljive površine.

Univerzitet u Tuzli




Ljepljive površine se vežu za tzv. komplementarna mjesta na drugoj molekuli hemoglobina.Komplementarna mjesta su sastavljena od Phe β85 i Leu β88.

Komplementarna mjesta su izložena na vanjskoj strani u deoksigeniranoj formi hemoglobina.Srpaste ćelije se stvaraju kada je visoka koncentracija deoksigenirane forme hemoglobina S.

Univerzitet u Tuzli




Normalni hemoglobin i hemoglobin srpastih ćelija.

Komplementarno mjesto jedne molekule deoksi HbS stupa u interakciju sa ljepljivom plohom na drugoj molekuli deoksi HbS što dovodi do stvaranja dugih nakupina deoksi HbS.

Univerzitet u Tuzli




Stvaranje netopivih vlakana u srpastoj anemiji.

Vlakna se sastoje iz 14 heliksnih niti. Dijametar vlakna je 21,5 nm.

Gen srpaste anemije predstavlja zaštitu od malarije.

DNA fetusa može se analizirati da bi se otkrilo prisustvo gena za srpastu anemiju.Metoda koristi tehnike PCR, Southern blotting i enzime restrikcione endonukleaze.

Univerzitet u Tuzli




Talasemije su genetski poremećaji sinteze hemoglobina.U nekim dijelovima Italije 20% populacije nosi gen za ovu bolest.

Uzroci α ili β talasemija:

1. nedostaje gen2. gen prisutan ali je sinteza RNA ili procesiranje RNA defektno3. defektna translacija

Documents

Funkcija Proteina - Hemoglobin