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FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR Y
APLICACIONES
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Contenido del CursoIntroducción a la Electroforesis Capilar
(EC).
Fundamentos de EC
Modalidades de separación por EC.
Principales variables y respuestas en EC.
Desarrollo de Métodos por EC.
Problemas y soluciones
Aplicaciones
Dr. Victor H. Abrego Reyes
INTRODUCCIÓN
Dr. Victor H. Abrego Reyes
IntroducciónEs una de las técnicas de separación más
utilizadas en el primer mundo.
De gran importancia en el análisis y purificación de biomoléculas
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Introducción
Descripción de migración debida a la aplicación de un campo eléctrico 1a vez Reuss 1809
Corriente eléctrica
Bateria
Ánodo Cátodo
Arena
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Introducción
Michaelis sugiere el nombre de electroforésis (1909)
Anie Tiselius perfecciona un instrumento para llevar a cabo la electroforesis de zona (1937)
Empleo de tubos capilares para mejorar la disipación del calor, DI 1-3mm, giraban en su propio eje para ser enfriados. Hjertén electroforesis capilar.(1967)
Dr. Victor H. Abrego Reyes
FUNDAMENTOS
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Electroforesis
Es la migración de especies cargadas que se encuentran disueltas o suspendidas en un electrolito, por influencia del campo eléctrico, de esta manera los cationes migran hacia el electrodo negativo (cátodo) y los aniones migran hacia el electrodo positivo (ánodo).
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Electroforesis Capilar…
Técnica analítica instrumental de separación, que permite la identificación y cuantificación de analitos en muestras que tienen una matriz compleja. Usando el principio de la Electroforesis convencional.
Electroforesis
Tradicional
Electroforesis Capilar
Es la migración de especies cargadas por influencia del campo eléctrico que se encuentran disueltas o suspendidas en un electrolito.
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Electroforesis convencional
cátodoánodo
Fuente de alimentación de voltaje
Detector
Compartimento termostatizado
Capilar de sílice fundida
Esquema básico de un equipo de Electroforesis Capilar
Electroforesis Capilar
Reservorio Reservorio
Electrodo ElectrodoAdquisición
De Datos
Entrada del capilar
Salida del capilar
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Principios básicos de ECEl entorno dentro del capilar
Entorno
Analito(muestra)
Buffer(medio)
Campo eléctrico
Pared del capilar
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Principios básicos de ECInfluencia de las propiedades del analito
Entorno
Analito(muestra)
Tamaño y forma
Carga neta
Masa
Buffer(medio)
Campo eléctrico
Pared del capilar
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Principios básicos de ECInfluencia de las propiedades del medio
Entorno
Analito(muestra)
Buffer(medio)
Fuerza iónica
Temperatura
pH
Viscosidad
Constante dieléctrica
Campo eléctrico
Pared del capilar
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Efecto de la temperaturaCalor de Joule. Ya que una corriente eléctrica
pasa a través del capilar esta se convierte en
calor.
Este depende también del diámetro interno
del capilar y el ambiente externo.
Un gradiente de temperatura es generado de
manera radial
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Efecto de la temperatura
Calor de Joule excesivo
Incrementa la mobilidad aproximadamente
2%/ºC
Incrementa el ancho del pico
Puede producir micro-burbujas las cuales serán
detectadas como picos falsos.
El buffer puede hervir, causando una caída de
corriente debido a la interrupción de la
conductividad
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Métodos de control
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Principios básicos de ECInfluencia de las propiedades del campo eléctrico
Entorno
Analito(muestra)
Buffer(medio)
Campo eléctrico
Voltaje aplicado
Longitud
Fuerzas conductoras
Pared del capilar
Dr. Victor H. Abrego Reyes
CE Fundamental Equations Terminology
CapillaryInlet
Reservoir
CapillaryOutlet
Reservoir
Detector
Lt
Total Capillary Length
Ld
Length to Detector
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Flujo electrosmótico
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Principios básicos de ECInfluencia de las propiedades del capilar
Entorno
Analito(muestra)
Buffer(medio)
Campo eléctrico
Pared del capilar
Carga superficial
Recubrimiento
Flujo electrosmótico
Dr. Victor H. Abrego Reyes
El capilar
Vidrio
Cubierto permanentemente con polimida
La superficie interna puede encontrarse
cargada
La carga en la superficie puede ser
manipulada
Responsable del flujo electroosmótico
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Ionización de los silanoles
Los grupos silanol son fácilmente
ionizables cerca del pH 4.
La pared del capilar estará cargada
negativamente
La cantidad de cargas es controlada
por el pH del buffer.
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Parámetros importantes en EC
Fuerza del campo eléctrico
Velocidad electroforética
Movilidad electroforética
Efecto del pH del buffer
Efecto del campo eléctrico
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Flujo electrosmótico
Dr. Victor H. Abrego Reyes
MOVILIDAD ELECTROOSMÓTICA
mEOmEO
Si
pH alto
pH bajo
Si
OH O -
-
- - - - - - - - - - - - - - -- - -
- - - - - - - - - - - - - - -- - -
-
FEO
MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA Y ELECTROOSMÓTICA
mE
O
mE
O
mE
OmEF=0
mE
F
mE
F
Vt
Vt
Vt
+ -
ANALITOS
NEUTROS
CATIONES
ANIONES
tm < tm < tm
EL PERFIL DE FLUJO
Perfil de velocidad electroosmótica
Perfil de velocidad electrodinámica (flujo laminar)
Dr. Victor H. Abrego Reyes
FLUJO ELECTROOSMÓTICO
El FEO puede ser eliminado permanentemente, si se modifica la pared del capilar o temporalmente, recubriendo la pared del capilar con algún polímero adicionado al electrolito soporte.
El FEO puede ser invertido.
Dr. Victor H. Abrego Reyes
PARÁMETROS QUE AFECTAN AL FEO
Campo eléctrico pH del buffer Fuerza iónica o concentración del buffer Temperatura Modificadores orgánicos Surfactantes Cubrimientos covalentes Polímeros hidrofílicos neutros
Dr. Victor H. Abrego Reyes
TIPOS DE SEPARACIÓN
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Tipos de separación
Electroforesis capilar de Zona (ECZ)Electrocromatografía Capilar (ECC)Cromatografía Electrocinética capilar (CECM)EC en gel o redes poliméricas (ECG)Isoelectroenfoque Capilar (IEC)Isotacoforesis (ITF).
Dr. Victor H. Abrego Reyes
CZE
Dr. Victor H. Abrego Reyes
ISOELECTROENFOQUE CAPILAR
Se usa un capilar neutro empacado con algún gel. Se administran anfolitos generado un gradiente de pH dentro del capilar. La muestra se prepara en un medio que permita tenerla con carga eléctrica y se inyecta en el capilar. Los compuestos se separan de acuerdo a su PI, al aplicar un potencial. Detección en línea
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ISOELECTROENFOQUE CAPILAR
+ + + +
+ + - -
+ -
- + - +- +
+-
Tiempo de migración
Señ
al
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Dr. Victor H. Abrego Reyes
EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS
Técnica muy usada en biología para la separación de proteínas y ácidos nucleicos.Las moléculas se separan al moverse a través de una red de polímero que actúa como tamiz molecular.Las moléculas grandes poseen una trayectoria más obstaculizada que las pequeñas, por lo que su tiempo de migración es mayor.
Dr. Victor H. Abrego Reyes
EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS
El proceso es similar a la electroforesis en gel de poliacrilamida, pero con las
ventajas de usar un capilar.En un inicio se usaban geles anclados que se reportó, proporcionan hasta 23 millones de platos teóricos.Actualmente se usan redes poliméricas (polímeros líquidos).
Dr. Victor H. Abrego Reyes
EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS
Señ
al
Tiempo de migración
EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS
Polímero Aplicación
Crosslinked polymersPoliacrilamida
Oligonucleotidos, Secuenciación de ADN, Proteínas SDS
Polímeros LinealesPoliacrilamida, Polivinil alcohol, dextran
Fragmentos de restricción Oligonucleotidos, Secuenciación de ADN, Proteínas
Agarosa Fragmentos de restricción Proteínas
Matrices de Polímeros para ECG
Dr. Victor H. Abrego Reyes
CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR
Dr. Victor H. Abrego Reyes
CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR
• Permite la separación de compuestos neutros (q=0) o con movilidades electroforéticas muy similares.
• La separación se debe a diferencias en la movilidad electroforética y a diferencias en interacciones con la fase pseudoestacionaria que presenta cada compuesto.
Porción
hidrofílica
Porción
hidrofóbica
+ s
s
s
s
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CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR
Es una técnica híbrida entre la cromatografía líquida de alta resolución y la electroforesis Capilar.El solvente es transportado por medio del flujo electrosmótico y no por presión como en HPLC.El empaque usado puede usarse con tamaño de partícula menor (0.5-2 micras).
Dr. Victor H. Abrego Reyes
CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR
Permite la separación de analitos neutros y con carga.
Es posible manipular la selectividad del proceso al variar la composición de la fase móvil y de la estacionaria.
Aplicaciones
Dr. Victor H. Abrego Reyes
APLICACIONES MOLÉCULAS DE INTERES BIOQUÍMICO. Fármacos, Análisis Clínicos. Productos Naturales, Industria Alimentaria. Quelatos Metálicos Contaminantes Explosivos Isómeros
Dr. Victor H. Abrego Reyes
APLICACIONESMOLÉCULAS DE INTERÉS BIOQUÍMICO: Prótidos, Aminoácidos, Amino-azúcares. Péptidos Ácidos Nucleicos
Purinas y Pirimidinas, Nucleósidos Nucleótidos y Oligonucleótidos Fragmentos de DNA.
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Perfiles proteínicos en leche
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Pesos Moleculares de proteínas
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Eritropoyetina Análisis de Isoformas según Farmacopea Europea.
Applying the European Pharmacopoeia Capillary Zone Electrophoresis Method for the Separation of Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO). Aplicación técnica Beckamn Coulter. En www.beckman.com
Dr. Victor H. Abrego Reyes
EC PARA LA EVALUACIÓN DE BIOCOMPATIBILIDAD DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS Y VACUNAS
Pureza
Heterogeneidad
Identidad
Dr. Victor H. Abrego Reyes
MEJOR RESOLUCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
CE-SDS reduced / UV (220nm)
kD
43
2
1
200
97.4
66.3
55.4
36.5
31
21.5
116.3
Minutes
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
AU
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
min6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
5
4325
6
6
1
Dr. Victor H. Abrego Reyes
RESOLUCIÓN DE IMPUREZAS EN IgG
Dr. Victor H. Abrego Reyes
RESOLUCIÓN DE IMPUREZAS EN VACUNAS
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Polisacáridos en vacunas
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Más de IgG
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Hirudina
A. Separación de r-hirudin de una muestra proveniente de un fermentador.B. Muestra de r-hirudin purificada.
Dr. Victor H. Abrego Reyes
HORMONA DE CRECIMIENTO
Separación de hormona del crecimiento humana A. recombinante.B. natural
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Glicanos
Dr. Victor H. Abrego Reyes
|Análisis de virus completos
Detector de Fluorescencia
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Otra aplicaciones. Separaciones Quirales
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Drogas de abuso
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Orina
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Cabello
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Dr. Victor H. Abrego Reyes
Residuos de Disparo
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Polvora
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Análisis Genético
Dr. Victor H. Abrego Reyes
Gracias