Aplicaciones Técnicas DNA

Separación de moléculas de DNA mediante geles de electroforesis

La visualización de las moléculas de DNA se realiza mediante la utilización de colorantes fluorescentes

RNA total DNA Genómico El Bromuro de etidio fluoresce bajo la luz UV

El DNA debe ser fragmentando para poder ser analizado

El DNA debe ser fragmentando para poder ser analizado

Las enzimas de restricción son endonucleasas que cortan el DNA en sitios particulares mediante el reconocimiento de una secuencia de nucleótidos específica.

- Las Enzimas de restricción reconocen secuencias de DNA de 4-8 pb. - Cortan en una posición determinada - Pueden generar 2 tipos de corte y generar extremos cohesivos o romos

Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su función natural es proteger contra DNA extraño

Hibridación entre ácidos nucléicos (reconocimiento de secuencias con alta homología)

Temperatura 65oC

Temperatura 95oC

Desnaturalización alcalina

Sonda marcada

Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Vorsanova et al., 2010

DNA-DNA

Southern Blot (detección de secuencias específicas en muestras de DNA)

1.  Aislamiento de DNA 2.  Cortar con enzimas de

restricción 3.  Separar fragmentos por

electroforesis 4.  Desnaturalizar el DNA 5.  Transferir a membrana de

nitrocelulosa o nylon 6.  Hibridar con sonda específica 7.  Revelar con placa de Rayos X ó

pantalla de fosforimager

Permite el análisis de genes, polimorfismos, mutaciones… DNA-DNA

Southern Blot: Análisis de DNA

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Permite el análisis de genes, polimorfismos, mutaciones, facilita la secuenciación…

PCR: La amplificación es exponencial

En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de interés

El PCR se utiliza en Pruebas de identidad

Secuenciación de DNA por el método de Sanger

No acepta elongación de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa

•  dsDNA molde (¿secuencia?) •  4 desoxiribonucleótidos (dNTPs)

•  cebador de DNA

•  DNA polimerasa

Secuenciación de DNA por el método de Sanger

Secuenciación de DNA por el método de Sanger

5’

5’ 3’

3’

Secuenciación automatizada de DNA Fragmentos de DNA con ddNTPs marcados con fluorescencia(los fragmentos pequeños pasan primero a través del capilar

Como cada ddNTP tiene un fluoróforo distinto, al pasar por el detector se crea un pico de señal específico para cada ddNTP.

Tubo capilar

Laser Archivo de salida

Técnicas avanzadas para el análisis de DNA

•  Microarreglos de DNA

•  Secuenciación masiva de DNA

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Affymetrix oligonucleotide arrays

Affymetrix oligonucleotide arrays

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Agilent DNA microarray platform

Single long oligonucleotide probes(25-60 bases)

High density(244,000 features per chip)

In situ synthesis printing process(highly consistent SurePrint technology)

Supports 1 or 2 samples hybridization

Great design flexibility(rapid design of custom arrays using eArray)

Possibility of multiplexing(as many as 8 arrays in one slide)

Comparison of microarray platforms

higher ($500)lower (<$100)Costmodel (sequenced)anyOrganisms

a posterioria prioriComparison designhighmoderateSpecificity

higherlowerReplicabilitylowerhigherVariability

~absoluterelativeQuantificationsingle colortwo colorHybridization

highmoderateRepresentation10,000-40,0005,000-10,000Gene density

25-60 mer oligoscDNAs/BACsProbes

Oligonucleotidearrays

Custommicroarrays

PCR, sondas, hibridación

Fragmentación de DNA, ligación de adaptadores, PCR, secuenciación

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454 sequencing method

http://www.solexa.com/

Solexa Genome Analyzer

Chemistry based on reversible terminators

Sample amplified by solid-phase amplification

Read length 30-75 bp

>100 million reads per run

~10 Gb of sequence

4-8 days run

Solexa Genome Analyzer (Illumina)

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Solexa sequencing method

1. DNA fragmentation and adapters ligation

2. Solid-phase amplification and cluster generation by bridge PCR

Solexa sequencing method

3. Flowing of fluorescent reversible terminator dNTPsand incorporation of a single base per cycle

4. Read identity of each base of a cluster from sequencial images

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Solexa sequencing method

1. DNA fragmentation and adapters ligation

2. Solid-phase amplification and cluster generation by bridge PCR

Solexa sequencing method

3. Flowing of fluorescent reversible terminator dNTPsand incorporation of a single base per cycle

4. Read identity of each base of a cluster from sequencial images

Análisis de la metilación de DNA

Análisis de la metilación de DNA

Uso de las Técnicas avanzadas para el análisis de DNA

•  Identificación de patógenos en una muestra

•  Metagenomas, población de organismos en un ambiente o microambiente

•  Estimar número de copias de secuencias en un genoma

•  Identificar secuencias de unión a proteínas reguladoras (factores de transcripción)

•  Detección de modificaciones epigenéticas

•  Y muchas otras….

Uso del sistema de inmunidad bacteriana CRISPR para editar Genomas

CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas: Endonucleasa activada por RNA

CRISPR-Cas9 modificado para editar genomas

•  Se diseñan varios sgRNAs ESPECIFICOS para el gen de interés que deben incluir sitios PAM

•  Se clonan en tandem en vectores apropiados que ya contienen a Cas9.

•  Se transforma el organismo de interés

•  Se verifica mediante PCR la mutación