FORMULASI DAN EVALUASI S-NITROSOGLUTHATIONE DALAM SEDIAAN FILM KITOSAN-POLIVINIL PIROLIDON K30

DAN UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN BIOFILM Staphylococcus aureus MDR (MULTI-DRUG RESISTANT)

FORMULATION AND EVALUATION OF S-NITROSOGLUTHATIONE IN CHITOSAN-POLYVINYL

PYRROLIDONE K-30 FILM AND STUDY OF INHIBITORY ACTIVITY AGAINST Staphylococcus aureus MDR

(MULTI-DRUG RESISTANT) BIOFILM

SATRIA PUTRA PENAROSA

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR 2017

FORMULASI DAN EVALUASI S-NITROSOGLUTHATIONE DALAM SEDIAAN FILM KITOSAN-POLIVINIL PIROLIDON K30 DAN UJI

AKTIVITAS PENGHAMBATAN BIOFILM Staphylococcus aureus MDR (MULTI-DRUG RESISTANT)

Tesis

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Magister

Program Studi

Magister Farmasi

Disusun dan diajukan oleh

SATRIA PUTRA PENAROSA

Kepada

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR 2017

PERNYATAAN KEASLIAN TESIS

Yang bertanda tangan dibawah ini

Nama : Satria Putra Penarosa Nomor Mahasiswa : P2500215010 Program Studi : Magister Farmasi Menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa tesis yang saya tulis ini

benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan pengambilanalihan tulisan atau pemikiran orang lain. Apabila dikemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa sebagian atau keseluruhan tesis ini hasil karya orang lain, saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.

Makassar, Yang Menyatakan,

Satria Putra Penarosa

v

PRAKATA

Segala puji penulis panjatkan kehadirat Allah swt atas segala

nikmat dan ridho-Nya, sehingga tesis ini dapat terselesaikan dengan baik.

Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan banyak

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ibu Dr. Hj. Latifah Rahman,

DESS.,Apt sebagai Ketua Komisi Penasehat sekaligus sebagai ketua

program studi magister farmasi Universitas Hasanuddin atas bimbingan

dan arahan mulai dari awal hingga selesainya tesis ini. Terima kasih juga

penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Sartini, M.Si., Apt. selaku wakil komisi

penasihat yang senantiasa memberikan masukan dan arahan dalam

proses pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si, Apt., sebagai dekan Fakultas

Farmasi Universitas Hasanuddin.

2. Ibu Dr. Aliyah, M.S., Apt., Ibu Prof. Dr.rer-nat. Marianti A. Manggau,

Apt. dan Prof. Dr. Asnah Marzuki, M.Si., Apt. sebagai komisi

penguji yang telah memberikan masukan dan saran dalam

penyusunan tesis ini.

3. Ibu Asmawati selaku staf prodi magister farmasi dalam membantu

urusan administrasi.

4. Ibu Nurhasni Hasan dan bapak Andi Arjuna atas bantuan alat,

bahan baku dan masukan yang diberikan selama penelitian.

vi

5. Ibu Haslia, S.Si., Ibu Sumiati S.Si, teman angkatan Genome

Pascasarjana Farmasi 2015 serta korps asisten mikrobiologi atas

bantuannya selama penelitian berlangsung.

6. Kepada semua pihak yang telah membantu dalam proses

penyelesaian tesis ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Tidak lupa pula penulis ucapkan terima kasih yang tak ternilai kepada

orang tua, saudara dan keluarga penulis atas bantuan berupa dukungan

moral dan materil dalam menyelesaikan tesis ini.

Akhir kata, semoga tesis ini dapat membantu dalam pengembangan

ilmu pengetahuan, khususnya dalam bidang farmasi.

Makassar, Agustus 2017

Satria Putra Penarosa

vii

ABSTRAK

SATRIA PUTRA PENAROSA. Formulasi dan Evaluasi S-Nitrosogluthatione dalam Sediaan Film Kitosan-Polivinil Pirolidon K-30 dan Uji Aktifitas Penghambatan biofilm Staphylococcus aureus MDR (MULTI-DRUG RESISTANT) (Dibimbing oleh Latifah Rahman dan Sartini)

Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh formula yang

memperlihatkan karakteristik fisik yang baik serta memiliki aktivitas penghambatan biofilm bakteri Staphylococcus aureus Multi Drug Resistant.

Pada penelitian ini dibuat tiga formula film yang mengandung

GSNO 1%, Kitosan 1,5% b/v dan propilen glikol 10% b/v. Formula F1, F2 dan F3 berturut-turut mengandung PVP K-30 dengan konsentrasi 0,25% 0,5% dan 0,75% b/v. Evaluasi fisik yang dilakukan meliputi ketebalan, ketahanan lipat, kandungan lembab, kapasitas penyerapan air, tensile strength, kandungan obat serta pelepasan secara in vitro.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua sediaan film yang

dihasilkan telah menunjukkan karakteristik fisik yang baik, dengan efisiensi pemuatan GSNO secara berturut-turut pada F1, F2 dan F3 yaitu 38,88%, 60,45% dan 65,95%. F3 memperlihatkan perbandingan polimer dengan kandungan GSNO tertinggi dari semua formulasi. Film dengan kandungan GSNO tertinggi (F3) diuji aktifitasnya terhadap strain Staphylococcus. aureus MDR yang positif menghasilkan biofilm. Formulasi sediaan film GSNO memiliki aktivitas penghambatan biofilm Staphylococcus aureus Multi Drug Resistant hingga 33,53%.

Kata Kunci : S-Nitrosogluthatione, Kitosan, PVP-K30, biofilm, S. aureus.

viii

ABSTRACT

SATRIA PUTRA PENAROSA. Formulation and Evaluation of S-Nitrosogluthatione in Chitosan-Polyvinyl Pyrrolidone K-30 Film and Study of Inhibitory Activity againts Staphylococcus aureus MDR (MULTI-DRUG RESISTANT) Biofilm (Supervised by Latifah Rahman and Sartini)

This study aims to obtain a formula that shows good physical

characteristics with inhibitory activity against Staphylococcus aureus Multi-

Drug Resistant biofilm.

In this research, the researcher prepared three film formulations

containing GSNO 1%, Chitosan 1,5% w/v, and propylene glycol 10% w/v

as plasticizer. Formulation F1, F2 and F3 contain PVP K-30 at

concentrations of 0.25% 0.5% and 0.75% w/v respectively. Physical

evaluation was conducted in terms of thickness, folding endurance,

moisture content, water absorption capacity, tensile strength, drug content,

and in vitro drug release. Film with the highest GSNO content (F3) was

tested for its activity against Staphylococcus aureus MDR strains that

positively produced biofilm.

The results showed that all of the films had good physical

characteristics. The levels of loading efficiency of GSNO in F1, F2 and F3

were 38,88%, 60,45%, and 65,95% respectively. F3 showed the polymer

ratio with the highest GSNO content of all formulations. The results

showed that GSNO film had anti-biofilm activity against Staphylococcus

aureus Multi-Drug Resistant with biofilm inhibiting activity that reached up

to 33.53%.

Keywords: S-Nitrosogluthatione, Chitosan, PVP-K30, biofilm, S. aureus.

ix

DAFTAR ISI

halaman

PRAKATA v

ABSTRAK vii

ABSTRACT viii

DAFTAR ISI ix

DAFTAR TABEL xi

DAFTAR GAMBAR xii

DAFTAR LAMPIRAN xiii

I. PENDAHULUAN 1

a. Latar Belakang 1

b. Rumusan Masalah 5

c. Tujuan Penelitian 5

d. Manfaat Penelitian 5

II. TINJAUAN PUSTAKA

a. Tinjauan Biofilm 6

b. Proses Terbentuknya Biofilm 7

c. Nitrit Oksida (NO) 9

d. S-Nitroso Gluthatione (GSNO) 10

e. Nitrit Oksida dan Biofilm 12

f. Sediaan Film 13

g. Kitosan dan Aplikasinya 15

h. Mekanisme Pelepasan Terkontrol pada Luka 19

x

i. Polivinil Pirolidon 20

j. Kerangka Teori 22

k. Kerangka Konsep 23

l. Hipotesis 24

III. METODE PENELITIAN

a. Alat dan Bahan 25

b. Metode Kerja 25

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

a. Karakteristik Fisik 33

b. Aktivitas Penghambatan Biofilm 40

V. PENUTUP

a. Kesimpulan 43

b. Saran 43

DAFTAR PUSTAKA 44

xi

DAFTAR TABEL

nomor halaman

1. Formula film S-Nitrosogluthatione 26

2. Hasil karakterisasi fisik sediaan film 34

3. Kandungan obat, Efisiensi Pemuatan (Loading efficiency) dan Kapasitas Muatan (Loading capacity) di dalam sediaan film 37

4. Hasil pelepasan in vitro sediaan film 38

5. Hasil pengukuran ketebalan sediaan film 49

6. Detail hasil kemampuan penyerapan air sediaan film 49

7. Serapan GSNO untuk pembuatan kurva baku 50

8. Hasil kuat tarik sediaan film 50

9. Detail hasil perhitungan kandungan obat, efisiensi pemuatan (loading efficiency) dan kapasitas muatan (loading capacity) sediaan film 51

10. Perhitungan pelepasan obat formula F1 53

11. Perhitungan pelepasan obat formula F2 54

12. Perhitungan pelepasan obat formula F3 55

13. Detail pengukuran serapan biofilm 58

xii

DAFTAR GAMBAR

nomor halaman

1. Struktur biofilm terlihat pada mikroskop 7

2. Proses terbentuknya biofilm 8

3. Reaksi pembentukan S-Nitrosogluthatione dari Gluthatione dan Natrium Nitrit 10

4. Penggabungan partikel oleh fusi karena aliran viskos. 14

5. Air kapiler berperan sebagai gaya kontraksi 15

6. Struktur Kitosan 17

7. Rumus struktur PVP 21

8. Sediaan film 33

9. Proses pengukuran kapasitas penyerapan air 36

10. Kurva persentase kemampuan penyerapan air film 36

11. Kurva profil pelepasan obat secara in vitro 39

12. Hasil uji pembentukan biofilm 40

13. Diagram persentase penghambatan biofilm. 41

14. Kurva baku GSNO 50

15. Sediaan film GSNO 59

16. Pengujian Penghambatan Biofilm 59

17. Uji in-vitro 59

18. Tensile Test Machine 59

19. Sumuran dan microplate reader 59

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

nomor halaman

1. Skema kerja pembuatan film S-Nitrosogluthatione 47

2. Skema kerja uji aktifitas antibiofilm 48

3. Hasil Evaluasi 59

4. Gambar penelitian 59

5. Serapan maksimum GSNO 60

6. Kurva baku GSNO 61

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Infeksi oleh mikroorganisme merupakan salah satu penyebab

utama terjadinya penyakit infeksi yang menjadi masalah serius diseluruh

dunia. Bakteri Gram positif Staphylococcus aureus dan Gram negatif

Pseudomonas aeroginosa adalah dua jenis bakteri yang menjadi

penyebab utama terjadinya infeksi lokal. Kejadian infeksi ini, dihubungkan

dengan kemampuan bakteri tersebut membentuk biofilm (Paraje, 2011).

Biofilm merupakan kumpulan bakteri yang saling melekat dan

menghasilkan matriks ekstraselulular, yang bertujuan untuk menjaga

nutrien dalam sel dan untuk melindungi bakteri dari respon imun dan agen

antimikroba. Biofilm bakteri dilaporkan sampai 10.000 kali lebih resisten

terhadap antibiotika dibandingkan dalam bentuk sel planktonic, sehingga

menyebabkan terjadinya infeksi kronis bahkan setelah pemberian

antibiotika (Smith, 2005). Secara statistik, Strain bakteri S. aureus Multi

Drug Resistant hasil isolat klinik dilaporkan lebih cenderung membentuk

biofilm pada luka infeksi maupun pada peralatan medis dibandingkan

dengan S. aureus non-resisten (Kwon, dkk. 2008).

Nitrit Oksida (NO) adalah radikal bebas yang secara endogen

dihasilkan oleh NO synthase melalui oksidasi asam amino L-arginin. NO

2

memiliki peran penting dalam berbagai proses fisiologi dan patofisiologi.

serta agen antibakteri endogen spektrum luas yang mampu membunuh

mikroorganisme dalam proses respon imun (Witte, 2002). NO diketahui

mampu membunuh sel bakteri dengan membentuk peroxynitrit (-OONO),

yang merupakan produk samping dari reaksi antara NO dan radikal bebas

superoksida (O2*-) (Al-Sha’doni dkk, 2005).

Kemampuan NO sebagai antimikroba telah dibuktikan terhadap

bakteri Gram positif maupun dengan Gram negatif yang diisolasi dari

pasien keratitis dengan nilai konsentrasi hambat minimum 4.6 ± 3.2 mM

pada bakteri Gram positif dan 12,4 ± 5,4 mM pada bakteri Gram negatif.

(Cariello, 2012). Dosis rendah NO (rentang picomolar hingga nanomolar),

yang tidak toksik terhadap sel mamalia, berhasil menginduksi terjadinya

degradasi biofilm pada beberapa strain bakteri yang telah dilaporkan

mengalami resisten terhadap antibiotika (Seabra, 2016). Oleh karena itu,

penggunaan NO menunjukkan pendekatan yang potensial dalam

mendegradasi biofilm bakteri resisten antibiotika.

Sebagai molekul sinyal, NO diketahui berperan penting dalam

peristiwa dispersi bakteri dalam biofilm. Hasil penelitian terbaru

memperlihatkan mekanisme NO dalam memediasi jalur sinyal yang

menyebabkan dispersi biofilm pada tahap akhir proses pematangan

biofilm. Hasil penelitian ini memperlihatkan efektivitas dari NO dalam

memisahkan sel-sel bakteri P. aeroginosa dari biofilm (Barraud dkk, 2006).

3

Molekul NO memiliki waktu paro yang pendek, sangat reaktif,

bersifat hidrofilik, dapat melewati dinding sel dan mampu berdifusi

menurut gradien konsentrasi dari lokasi produksinya (Weller, 2009). Oleh

karena itu, dalam penggunaan klinis maupun eksperimental digunakan

senyawa NO donor yaitu senyawa yang memiliki kemampuan sebagai

pembawa NO. Salah satu jenis senyawa NO donor adalah S-

Nitrosogluthatione (GSNO). Senyawa ini memiliki lebih banyak

keunggulan dibandingkan NO donor yang lain, efek yang diinginkan dapat

bersifat sistemis atau dapat diberikan secara lokal tanpa mengganggu

aktivitas sistemik (Antlej, 2014).

Sediaan ideal untuk GSNO adalah yang mampu menjaga

kestabilan NO pada suhu ruang dalam waktu yang diinginkan, mampu

mengeluarkan NO secara konsisten ketika dibutuhkan, dan mampu

memberikan suatu dosis yang spesifik dengan durasi yang cukup panjang

untuk menghasilkan efek biologis (Antlej, 2014).

Sediaan film merupakan suatu polimer yang mengeras yang dapat

digunakan dalam aplikasi klinis untuk penghantaran obat (Krogars, 2003).

Sediaan film dipilih karena diharapkan mampu menutupi, melindungi,

mampu menyerap eksudat ketika diaplikasikan pada luka serta diharapkan

mampu menjaga stabilitas S-Nitrosogluthatione selama proses

penyimpan.

Kitosan merupakan polimer nontoksik, biokompatibel dan

biodegradabel, sering digunakan dalam penghantaran obat, penghantaran

4

sel, orthopedi, penyembuhan luka, opthalmologi, dan penyembuhan

tulang. Kitosan mampu meningkatkan fungsi sel polimorfonuclear,

makrofag dan migrasi sel fibroblast. Kitosan juga menunjukkan aktivitas

antimikroba terhadap bakteri dan jamur, bersifat hipoalergenik, dan

mampu membekukan darah secara cepat (Moe, 2008).

Beberapa penelitian telah menunjukkan kemampuan Kitosan dan

kombinasinya dengan berbagai polimer seperti Polivinil Pirolidon K-30

dalam melindungi stabilitas zat aktif serta mampu meningkatkan

bioavailabilitas dari bahan aktif dalam sistem penghantaran obat (Sezer

dkk, 2007; Koland, dkk 2010). Formulasi nanopartikel GSNO dengan

menggunakan polimer PLGA (poly-lactic-co-glycolic-acid) dan

polyethilenimin telah memperlihatkan kemampuannya sebagai antibakteri

dan penyembuhan luka pada tikus (Hasan, dkk 2015) hasil yang sama

diperlihatkan pada formulasi film yang hanya menggunakan polimer

kitosan (Kim, dkk 2015) namun dalam penelitian tersebut belum dilakukan

pengujian penghambatan biofilm.

Oleh karena itu, akan diformulasi sediaan film S-Nitrosogluthatione

dengan kombinasi Kitosan dan Polivinil Pirolidon (PVP) K-30 yang

memiliki sifat fisika kimia yang baik dan dapat menghantarkan GSNO yang

dapat menunjukkan aktivitas penghambatan biofilm terhadap

Staphylococcus aureus Multi Drug Resistance (MDR) sehingga dapat

dijadikan pengembangan strategi pengobatan dalam mengontrol infeksi

yang terkait dengan biofilm.

5

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan,

maka permasalahan yang timbul dalam penelitian ini adalah:

1. Berapakah perbandingan Kitosan dan PVP K30 yang dapat

menghasilkan film GSNO dengan karakteristik fisik yang baik?

2. Apakah film GSNO mampu memperlihatkan aktivitas

penghambatan biofilm terhadap bakteri Staphylococcus aureus

MDR ?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah;

1. Mengetahui perbandingan kitosan dan PVP K30 yang

memperlihatkan karakteristik fisik yang baik.

2. Mengetahui aktivitas film GSNO dalam menghambat pembentukan

biofilm bakteri Staphylococcus aureus MDR.

D. Manfaat Penelitian

Sediaan film yang dibuat diharapkan dapat dijadikan

pengembangan strategi pengobatan dalam mengontrol penyakit infeksi

khususnya yang terkait dengan biofilm.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Tinjauan Biofilm

Biofilm adalah lapisan yang merupakan koloni dari mikroba yang

menempel dan menutupi suatu permukaan benda padat di

lingkungan. Biofilm merupakan sebuah struktur komunitas dari bakteri,

algae atau jenis sel lainnya yang menghasilkan matriks polimerik dan

melekat pada permukaan. Secara fisik, keberadaan biofilm dapat dicirikan

sebagai berikut:

a) Jarak ketebalan dari beberapa mikron sampai lebih dari 1000 mikron.

b) Permukaan tidak rata (kasar)

c) Spesies heterogen

d) Tersusun dari dua bagian, yaitu dasar biofilm dan permukaan biofilm.

Walaupun banyak bakteri dapat tumbuh pada keadaan bebas (free-

living) atau planktonik, secara umum bakteri melekat ke suatu permukaan

dengan menghasilkan polisakarida ekstra seluller (EPS) atau pada

beberapa kasus dengan menggunakan holdfast. Pelekatan ini

menghasilkan mikrokoloni, sebagai awal perkembangan biofilm yang

dimulai dari satu sel tapi sering berkembang menjadi beberapa bakteri

membentuk matriks (Chung, dkk. 2014).

7

Gambar 1. Struktur biofilm terlihat pada mikroskop (Chung, dkk, 2014)

B. Proses Terbentuknya Biofilm

Bakteri di habitat alamiah umumnya dapat hidup dalam dua

lingkungan fisik yang berbeda, yaitu dalam keadaan planktonik, berfungsi

secara individu dan dalam keadaan diam dimana mikroorganisme melekat

ke suatu permukaan membentuk biofilm dan berfungsi sebagai matriks

pelindung dari faktor lingkungan.

Proses terbentuknya biofilm dibagi menjadi 5 tahap (Paraje, 2011):

1. Tahap pelekatan awal : pada tahap ini mikroba meleket pada

permukaan benda padat dengan perantara fili (rambut halus). Contoh

bakteri yang dapat melekat dan membentuk koloni adalah

Pseudomonas aeruginosa, bakteri gram negatif dengan molekul sinyal

utama homoserin lakton. Pelekatan awal ini disebabkan oleh sifat

hidrofobik dan elektrostatik (medan listrik statik).

2. Tahap pelekatan permanen : mikroba semakin menempel dengan

diprakarsai oleh matriks polimer ekstraseluler dengan bantuan

eksopolisakarida (EPS).

8

3. Maturasi I : Terjadi penarikan pada bakteri lain membentuk

polisakarida ekstraseluler dan sel bakteri terus tumbuh dan

berkembang. Pada tahap ini ketebalan biofilm lebih dari 10 µm.

4. Maturasi II : Pada tahap ini ketebalan biofilm mencapai 100 mm.

Bakteri yang terakumulasi membentuk beberapa lapisan. Bakteri yang

ada dilapisan dalam akan lebih terlebih terlindungi dari pada bakteri

yang berada pada lapisan luar. Koloni ini akan membentuk nutriennya

sendiri, karena bakteri yang mati dapat menjadi nutrien bagi yang

hidup.

5. Dispersi : Pada tahap ini biofilm yang sudah terbentuk dapat

mengalami pelepasan sel secara erosi atau sloghing. Erosi terjadi

secara berkala karena geseran dari cairan yang mengalir. Sloghing

adalah pelepasan banyak sel yang terjadi secara acak karena adanya

perubahan dalam medium pertumbuhan.

Gambar 2. Proses terbentuknya biofilm. (Paraje, 2011)

9

Beberapa sel pada populasi yang berbeda dari bakteri planktonik

menempel ke berbagai macam permukaan. Pada medium cair yang

mengalir, bakteri yang melekat memperoleh akses ke sumber nutrien

yang berkelanjutan yang dibawa oleh aliran medium. Setelah melekat ke

permukaan, mikroorganisme tumbuh menjadi ukuran yang normal

kemudian memulai reproduksi sel. Pelekatan yang terus menerus

menunjang pembentukan biofilm.

C. Nitrit Oksida (NO) (Achuth, 2002)

Molekul NO dibentuk oleh 5 elektron nitrogen dan 6 elektron

Oksigen, sehingga ada 1 elektron yang tak berpasangan, menjadikan NO

sebagai molekul reaktif yang bersifat radikal bebas. Nitrogen Oksida

merupakan gas yang larut dalam air, dengan tingkat kelarutan 1-3 mmol/L

(30-90 mg/L). Kadar biologis aktifnya berkisar 1-100 nmol/L bersifat

lipofilik, sehingga mudah melewati sawar membran lipoprotein. Waktu

paruh NO teramat pendek sekitar 3-5 detik, karena NO akan cepat dan

spontan bereaksi dengan O2 membentuk ion nitrit (NO2-) dan nitrat (NO3

-)

yang akhirnya diekskresi lewat ginjal.

Nitrogen oksida yang dihasilkan oleh berbagai sel tubuh akibat

paparan infeksi akan bersifat sitostatik pada sel dengan pH asam (sel

target, mikroorganisme patogen). Aktifitas biologis nitrit lebih rendah

dibandingkan NO, sedangkan nitrat relatif tidak mempunyai aktifitas

biologis. Akibat waktu paruhnya yang pendek itu, NO hanya memiliki

aktifitas biologis disekitar tempat biosintesisnya saja. Sebagai contoh

10

sintesis NO di sel endotel vaskular, hanya mengakibatkan relaksasi otot

polos vaskular di dekatnya.

Selain dengan O2, radikal bebas NO juga mudah bereaksi dengan

molekul lain yang mempunyai elektron tak berpasangan, misalnya anion

superoksida (O2-) dan ferrum. Berbagai molekul yang mengandung O2 di

intra atau ekstraselular mampu mengkatalisasi oksidasi inaktif NO menjadi

nitrat, diantaranya oksihemoglobin (HbO2). Hemoglobin memiliki afinitas

yang tinggi terhadap NO daripada CO.

D. S- Nitroso Gluthatione (Antlej, 2014)

S-nitrosogluthatione (GSNO) merupakan bentuk derivat yang

membentuk senyawa nitroso dan merupakan agen pemberi nitrogen.

Terdapat dalam reservoir NO di dalam sel dan merupakan salah satu

kendaraan NO dalam transportasi antar sel, yang memiliki aktivitas

biologis yang beragam. Secara kimia, GSNO dapat disintesis secara

efisien, cepat dan memiliki yield yang tinggi dengan mereaksikan GSH

dan Natrium nitrit (NaNO2), yang akan langsung menghasilkan warna

merah muda.

Gambar 3. Reaksi pembentukan S-Nitrosogluthatione dari Gluthatione dan Natrium Nitrit (Achuth, 2002).

11

Reaksi langsung antara GSH dengan NO tidak menghasilkan GSNO,

reaksi ini membentuk gluthatione disulfida dan Nitroxyl anion(NO-). Hanya

reaksi antara NO dan oksigen molekular yang dapat membentuk GSNO

yang merupakan reaksi orde tiga, tergantung dari konsentrasi NO. Karena

oksigen intrasel rendah (tingkat jaringan) dan tingkat konsentrasi NO

rendah, hal ini menyebabkan oksidasi NO secara in vivo oleh oksigen

terjadi lambat dan prosesnya tidak signifikan.

Proses degradasi GSNO diperkirakan juga melalui jalur non

enzimatis atau reaksi dengan molekul biologis seperti ion tembaga, besi,

askorbat atau thiol, dan enzim. Dibandingkan dari semua senyawa S-

nitrosothiol, stabilitas GSNO lebih baik dan proses dekomposisi oleh ion

tembaga lebih lambat.

Sampai saat ini, telah ada lebih dari 20 penelitian klinis yang

menginvestigasi efikasi terapetik dari GSNO, pada umumnya terhadap

penyakit kardiovaskular. GSNO memiliki lebih banyak keunggulan

dibandingkan NO donor yang lain, efek yang diinginkan dapat bersifat

sistemis atau dapat diberikan secara lokal tanpa mengganggu aktifitas

sistemik. Efek yang telah diketahui secara baik dari GSNO pada manusia

adalah aksinya terhadap platelet (bekerja terutama sebagai NO donor,

mengurangi koagulasi dan trombosis). GSNO diketahui juga memberikan

efek mengurangi emboli setelah operasi dan pencangkokan, efek

menguntungkan terhadap fungsi ventrikel kiri jantung, vasodilatasi dan

preeklampsia. Penggunaan topikal sebagai gel GSNO memperlihatkan

12

peningkatan aliran darah clitoral (disarankan sebagai pengobatan

disfungsi seksual wanita), dan sebagai agen anti fungi yang dapat

menyembuhkan onychomycosis (infeksi fungi pada kuku) dan dapat

digunakan sebagai agen terapi pada cystic fibrosis.

E. Nitrit Oksida dan Biofilm (Seabra, dkk. 2016)

Biofilm bakteri sangat sulit dan bahkan tidak dapat dilawan dengan

antibiotika konvensional, karena itu berbagai penelitian secara aktif

mencari pendekatan baru untuk menghancurkan biofilm. Sebagai molekul

sinyal, NO diketahui berperan penting dalam peristiwa dispersi bakteri

dalam biofilm. Hasil penelitian terbaru memperlihatkan mekanisme NO

dalam memediasi jalur sinyal yang menyebabkan dispersi biofilm pada

tahap akhir proses pematangan biofilm. Mekanisme NO dalam

mempercepat proses penghancuran biofilm lebih kepada pembentukan

sinyal molekul dibandingkan dengan menyebabkan bakteri mengalami

toksisitas sel. Oleh karena itu, penggunaan NO untuk menginduksi transisi

biofilm menjadi bakteri planktonic lebih memperkecil kemungkinan

terjadinya resisten bakteri, seperti pada penggunaan antibiotika. Lebih

menarik lagi, dosis rendah NO (rentang picomolar hingga nanomolar),

yang tidak toksik terhadap sel mamalia, berhasil menginduksi terjadinya

degradasi biofilm pada beberapa strain bakteri yang telah dilaporkan

mengalami resisten terhadap antibiotika. Oleh karena itu, penggunaan NO

donor menunjukkan pendekatan yang potensial dalam mendegradasi

biofilm bakteri resisten antibiotika. Terlebih lagi, kombinasi NO donor

13

dengan antibiotika konvensional mungkin dapat meningkatkan

kemampuan dispersi biofilm yang terbentuk.

Pembentukan biofilm dapat menyebabkan komplikasi pada luka

kronis, memperlambat proses penyembuhan, menyebarkan infeksi dari

jaringan ke dalam pembuluh darah. Berbagai penelitian telah

menunjukkan efikasi dari NO donor terhadap degradasi biofilm, Barraud

dkk menggunakan NO donor Sodium Nitroprussida (SNP), S-

Nitrosogluthatione (GSNO), dan S-Nitroso-N acetyl-penicillane (SNAP).

Konsentrasi rendah NO donor (dalam kisaran nanomolar hingga

mikromolar) mampu mengurangi massa biofilm dan meningkatkan jumlah

sel planktonik.

Dalam penelitian lainnya, efikasi antibiofilm NO donor Isosorbid

Mononitrat (ISMN) yang dienkapsulasi dalam liposom juga

memperlihatkan kemampuan mendegradasi biofilm bakteri S. aureus,

yang dikaitkan dengan sinusitis kronis yang sangat resisten terhadap

antibiotika konvensional. Liposom dalam konsentrasi 3 dan 60 mg/ml

memperlihatkan aktivitas antibiofilm yang signifikan setelah pemberian

selama 24 jam dibandingkan dengan kelompok kontrol. Interaksi muatan

dari liposom terhadap dinding sel bakteri diperkirakan mampu

meningkatkan penetrasi dari formulasi kedalam biofilm.

F. Sediaan Film (Krogars, 2003)

Sediaan film merupakan polimer yang mampu mengeras menjadi

film yang koheren. Polimer memiliki struktur kimia dalam molekulnya yang

14

memberikan kelarutan dalam medium tertentu. Sifat fisik polimer ini

penting untuk membentuk film.

Pembentukan film biasanya melibatkan proses pemanasan.

Selama pemanasan, pelarut menguap baik dari larutan maupun dispersi

polimer. Pada awalnya polimer berada dalam bentuk kumparan yang

terisolasi. Jika pelarut menguap secara lambat, kumparan akan saling

mendekat, hingga pada konsentrasi polimer tertentu, kumparan polimer

akan saling berpenetrasi satu sama lain.

Gambar 4. Penggabungan partikel oleh fusi karena aliran viskos. (Krogars, 2003)

Pembentukan film dari sistem dispersi polimer dapat digambarkan

oleh pembentukan film lateks yang merupakan koloid partikel polimer yang

terdispersi dalam cairan. Ikatan dua atau lebih partikel polimer kering

terjadi karena aliran polimer yang viskos, tegangan permukaan plastis,

sehingga menyediakan tekanan geser yang dibutuhkan.

15

Gambar 5. Kapiler berperan sebagai gaya kontraksi (Krogars, 2003)

Namun, untuk partikel yang tidak kering, pembentukan film akan

terjadi jika gaya kapiler lebih besar dari resistensi deformasi partikel

polimer. Pembentukan film akan dipengaruhi oleh tegangan permukaan,

ukuran partikel dispersi, waktu pengeringan, temperatur, dan sifat reologi

polimer.

Pembentukan film terjadi dalam tiga tahap yang berbeda.

Penguapan air terjadi pada tahap pertama, dan sebagai konsekuensinya

konsentrasi meningkat. Pada tahap ke dua air terus menguap dan,

sebagai konsekuensi dari gaya kapiler, partikel polimer saling mendekat

dan terjadi perubahan bentuk partikel. Pada tahap ke tiga terjadi

autohesion di mana molekul rantai polimer saling berdifusi, membentuk

ikatan kuat yang stabil.

G. Kitosan dan Aplikasinya

Kitosan, dengan nama kimia poli-α-(1,4)-2-amino-2-deoksi-D-

glukosa, merupakan hasil dari deasetilasi parsial kitin dan merupakan

16

polisakarida yang terdiri atas kopolimer glukosamin dan N-

asetilglukosamin. Kitosan terdapat dalam berbagai derajat deasetilasi dan

depolimerisasi sehingga tidak mudah untuk menentukan komposisi

kimianya. Derajat deasetilasi yang dibutuhkan untuk memperoleh produk

yang larut harus lebih besar dari 80-85%. Bobot molekulnya berkisar

antara 10.000-1.000.000. Kitosan tidak berbau, berupa serbuk atau

serpihan berwarna putih atau krem. Pembentukan serat sering terjadi

selama pengendapan dan dapat terlihat ‘cottonlike’. Kitosan merupakan

poliamin kationik dengan kerapatan muatan yang tinggi pada pH < 6,5,

sehingga menempel pada permukaan yang bermuatan negatif dan

mengkelat ion logam. Selain itu, ia juga merupakan polielektrolit linier

dengan gugus amin dan hidroksil yang reaktif (tersedia untuk reaksi kimia

dan pembentukan garam) (Berger, 2004).

Kitosan larut dalam pelarut organik, HCl encer, HNO3 encer, dan

H3PO4 0,5%, tetapi tidak larut dalam basa kuat dan H2SO4. Sifat kelarutan

kitosan ini dipengaruhi oleh bobot molekul dan derajat deasetilasi yang

beragam bergantung pada sumber dan metode. Bobot molekul kitosan

beragam, bergantung pada degradasi yang terjadi selama proses

deasetilasi. Parameter mutu kitosan ditentukan melalui parameter nilai

derajat deasetilasi, kadar air, kadar abu, bobot molekul, dan viskositas.

17

Gambar 6. Struktur Kitosan (Dutta, dkk., 2004)

Kitosan telah banyak diteliti sebagai pembawa dalam sistem

penghantaran obat dalam berbagai bentuk sediaan, seperti gel, film,

beads, mikrosfer, tablet, dan penyalut untuk liposom (Rowe, dkk. 2006).

Penelitian tentang kitosan pada berbagai hewan uji menunjukkan

kemampuannya untuk meningkatkan hemostasis, menurunkan fibroplasia,

memfasilitasi osteogenesis, dan meningkatkan regenerasi jaringan.

Kitosan juga menunjukkan aktivitas antimikroba dan dapat mempercepat

penyembuhan luka (Dutta, 2004) .

Kitosan merupakan serat biopolimer yang menarik dan kompatibel

sehingga sangat direkomendasikan untuk digunakan dalam

pengembangan biomatriks untuk aplikasi klinis, seperti untuk alat

penghantaran obat, pembalut bioaktif dan perancah untuk rekayasa

jaringan. Kitosan juga bersifat tidak toksik, nonimunogenik, dan

biodegradabilitasnya baik.

Kitosan merupakan kandidat yang menjanjikan untuk mengobati

luka bakar. Kitosan dapat membentuk film yang kuat, mengabsorpsi air,

dan biokompatibel. Selain itu, permeabilitasnya terhadap oksigen sangat

baik. Sifat ini sangat penting untuk mencegah kekurangan oksigen pada

jaringan yang cedera. Sifat kitosan yang mampu menyerap air dan dapat

18

terdegradasi secara alami oleh enzim dalam tubuh terutama lisozim,

menyebabkan film kitosan yang sudah ditempel pada luka tidak perlu

dilepaskan sehingga tidak menyebabkan gangguan pada daerah yang

cedera tersebut (Moe, 2008).

Produk degradasi dari kitosan dapat diabsorpsi dan bahkan

memiliki nilai nutrisi. Polisakarida kitosan yang memiliki struktur yang mirip

dengan glikosaminoglikan dapat dipertimbangkan untuk mengobati luka

kronik dengan penggantian kulit (Moe,2008).

Sifat film kitosan bergantung pada morfologinya yang dipengaruhi

oleh sistem pelarut, bobot molekul, derajat N-asetilasi, penguapan pelarut,

dan mekanisme regenerasi amin bebas. Polimorfisme kitosan diatur oleh

kondisi preparasi dan memainkan peranan penting dalam sifat tensile

yang dihasilkan. Brine and Austin menunjukkan bahwa orientasi film dan

kekuatan tarik (tensile strength) meningkat dengan penarikan (drawing).

Namun bagaimanapun, untuk memperoleh film dengan kekuatan yang

cukup, film dicetak dengan menggunakan sistem pelarut anhidrat

(TCA/metilen klorida dengan kloral hidrat), menggunakan polimer dengan

bobot molekul yang tinggi, waktu disolusi yang cepat (

19

kg/mm2 (32,5 MPa) dengan elongasi 4%. Hal ini menunjukkan signifikansi

penarikan terhadap kekuatan tarik yang dihasilkan (Rathkee, dkk. 1994).

H. Mekanisme Pelepasan Terkontrol pada Luka (Boateng, dkk2007)

Mekanisme pelepasan obat secara terkontrol terhadap luka dari

formulasi polimer dikendalikan oleh satu atau lebih proses fisik, meliputi

hidrasi polimer oleh cairan, pengembangan polimer untuk membentuk gel,

difusi obat melalui gel yang mengembang, dan erosi langsung dari

polimer. Meskipun hanya sedikit literatur yang membahas tentang

pembalut luka polimer, seperti hidrokoloid, alginat, hidrogel dan poliuretan,

dapat terlihat jelas bahwa pengembangan, erosi dan kinetika pelepasan

obat secara langsung memegang peranan penting dalam mengendalikan

pelepasan obat dari pembalut luka ketika terjadi kontak dengan eksudat

luka. Setelah terjadi kontak antara pembalut luka polimer dengan

permukaan luka yang lembab, eksudat luka akan berpenetrasi kedalam

matriks. Hal ini menyebabkan hidrasi dan pengembangan polimer secara

perlahan-lahan dan membentuk gel dipermukaan luka.

Penelitian lebih lanjut menjelaskan pelepasan terkontrol protein dari

matriks alginat pada jaringan mukosa seperti pada luka. Ditemukan bahwa

sifat pengembangan dari polimer untuk membentuk gel berperan sebagai

barrier pada difusi obat. Seperti pada semua polimer, pengembangan

terjadi karena adanya proses pelarutan rantai polimer, yang menyebabkan

peningkatan jarak end-to-end dari tiap molekul polimer. Pada pembalut

luka, mekanisme pelepasan obat telah dijelaskan melalui aktifitas hidrolisis

20

enzim yang ada pada eksudat luka atau yang terdapat pada bakteri jika

terjadi infeksi luka. Berbagai jenis teknik telah dikembangkan untuk

mengetahui sifat pengembangan polimer hidrofilik ketika terjadi kontak

dengan air, menunjukkan bahwa pada media cair, polimer juga mengalami

proses relaksasi yang menyebabkan terjadinya proses disolusi yang lebih

lambat pada polimer yang terbasahi. Proses pengembangan dan disolusi

dapat terjadi secara langsung pada pembalut luka, yang masing-masing

mempengaruhi mekanisme pelepasan obat. Bagaimanapun, secara umum

tingkat pelepasan obat ditentukan oleh tingkat difusi dari medium disolusi

(eksudat) kedalam matriks polimer. Proses erosi menjadi mekanisme

pelepasan yang paling dominan dari semua profil pelepasan dari polimer.

Model pelepasan lain juga dikembangkan untuk menginvestigasi proses

pelepasan obat dari matriks, yang mengkombinasikan proses difusi,

pengembangan dan erosi polimer. Model ini berdasarkan pada proses

penetrasi air pada polimer yang kering dan disolusi polimer berdasarkan

teori peregangan molekul polimer dalam larutan.

I. Polivinil Pirolidon (Rowe dkk., 2006)

Polivinil pirolidon (PVP) mempunyai nama kimia 1-ethenyl–2

pyrrolidone homopolymer. Dijelaskan pula, PVP mempunyai beberapa

sinonim antara lain sebagai berikut kollidon, Plasdone, poly(1–(2-oxo-1-

pyrrolidinyl)ethylene), polyvidone, polivinil pyrolidon, PVP, 1–vynil–2-

pyrrolidine polymer. PVP adalah hasil polimerisasi 1-vinilpirolid-2-on

dalam berbagai bentuk polimer dengan rumus molekul (C6H9NO)n,

21

rumus struktur PVP terlihat di gambar 10. PVP memiliki pemerian berupa

serbuk putih atau putih kekuningan, berbau lemah atau tidak berbau, dan

bersifat higroskopik. Sedangkan untuk kelarutan, PVP mudah larut dalam

air, etanol (96%) P, kloroform P dan praktis tidak larut dalam eter P. PVP

memiliki bobot molekul berkisar antara 10.000 hingga 700.000, kelarutan

PVP tergantung dari bobot molekul rata–rata.

PVP merupakan salah satu polimer sintetik yang dapat mengontrol

pelepasan obat dari sediaan film atau patch. Pada umumnya PVP

membentuk lepaskan reservoir dalam membran kulit sehingga berpotensi

mengontrol pelepasan obat dari stratum corneum dalam selang

waktu yang lama.

Gambar 7. Rumus struktur PVP (Rowe dkk., 2006)

22

J. Kerangka Teori

1. 1. Kemampuan menutupi luka

2. 2.menyerap eksudat dan kelembaban

3. 3. Melebur pada suhu tubuh

- Memperlihatkan aktifitas antimikroba yang baik. - Mampu memisahkan sel bakteri dalam biofilm - Efek bersifat lokal tanpa mengganggu aktifitas sistemik.

Mampu menjaga kestabilan NO secara konsisten Mampu memberikan dosis spesifik untuk mencapai efek biologis Dapat diaplikasikan pada luka terbuka

Kompleks mikroorganisme yang mensekresi matriks polisakarida yang melekat pada lingkungan yang bersifat padat Menghambat penetrasi antibiotika sehingga memicu resistensi Secara topikal dapat terbentuk pada luka infeksi

Membutuhkan dosis hingga atusan kali lipat untuk menghancurkan biofilm.

S-Nitrosogluthatione -

Sediaan Film

Infeksi oleh Bakteri

Sel Planktonic

Biofilm

Antibiotika

Senyawa Antibiofilm

Film GSNO dengan karakteristik fisik baik dan memilik aktifitas

antibiofilm.

23

K. Kerangka Konsep

Sediaan Film S-Nitrosogluthatione

Formulasi Sediaan Film

S-Nitrosogluthatione Aktivitas Antibiofilm

1. Pemilihan konsentrasi Polimer

Kitosan-PVP K30

2. 2. Metode Pembuatan

Evaluasi Sediaan Film

Uji aktivitas Penghambatan

Biofilm S. aureus MDR Karakterisasi fisik dan uji

pelepasan in-vitro

24

L. Hipotesis

1. Kombinasi Kitosan dan PVP K30 dapat membentuk film GSNO

dengan sifat fisik yang baik.

2. Film GSNO memiliki aktivitas penghambatan biofilm terhadap

bakteri Staphylococcus aureus MDR.