Formato Preinforme de Laboratorio (2)

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas , Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA

Programa :Ingeniería Ambiental-IA PREINFORME Laboratorio de Microbiología

Nombre y Apellido: Diana Marcela Palacio Barreneche Código: 43.257.915 Fecha: 31 de Octubre de 2015

TEORÍA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIÓN: Para el desarrollo de las prácticas de laboratorio es conveniente tener

en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda

escrupulosidad. Cuando se trabaja en un laboratorio existe el peligro potencial de

ACCIDENTES, debido a las sustancias químicas y elementos que se utilizan y la

posibilidad de cometer algún error al realizar un experimento, por tal motivo la seguridad y

la protección de la salud son indispensables para un ambiente de estudio y trabajo seguro

en un laboratorio, por lo tanto todo estudiante, auxiliar y docente debe cumplir las reglas

de seguridad e higiene en el laboratorio.

MENTEFACTO CONCEPTUAL

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Conjunto de medidas Técnicas, científicas y

organizativas

Que previenen a:

Personas Instituciones Medio ambiente

De la exposición a:

Agentes infecciosos

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Equipos requeridos: N/A

Reactivos a utilizar: N/A

PROCEDIMIENTO: N/A

TABLA DE DATOS: N/A

RESULTADOS ESPERADOS:




Se espera que como estudiantes conozcamos las normas de bioseguridad en el

laboratorio, para que de esta manera la práctica se desarrolle en adecuadas condiciones

y no se presente ningún tipo de accidente.

GLOSARIO

Agente biológico: Microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados,

cultivos celulares y endoparásitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de

infección, alergia o toxicidad.

Agentes patógenos: Todo aquel microorganismo capaz de producir enfermedades o

infección.

Contaminación: Presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo;

también en vestimenta, instrumentos quirúrgicos, apósitos u otros objetos inanimados o

substancias, incluyendo el agua y los alimentos.

Riesgo: Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto daño,

pudiendo por ello cuantificarse.

BIBLIOGRAFIA

- Guía de seguridad y bioseguridad. Recuperado de

http://www.usbcartagena.edu.co/phocadownload/facultades/salud/GUIA_SEGURIDA

D_Y_BIOSEGURIDAD.pdf

PRÁCTICA No. 1 DE RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE MICROBIOLOGIA

INTRODUCCION: Es muy importante que los materiales y equipos de uso común en el laboratorio se identifiquen por su nombre correcto y uso especifico que tiene cada uno, pero más importante es saber manejarlo correctamente en el momento oportuno, teniendo en cuenta los cuidados y normas especiales para el uso de aquellos que así lo requieran. Los instrumentos y útiles de laboratorio están constituidos de materiales diversos.


http://www.usbcartagena.edu.co/phocadownload/facultades/salud/GUIA_SEGURIDAD_Y_BIOSEGURIDAD.pdf

http://www.usbcartagena.edu.co/phocadownload/facultades/salud/GUIA_SEGURIDAD_Y_BIOSEGURIDAD.pdf




MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO

Para poder efectuar operaciones concretas en el laboratorio se

trabaja con aparatos elaborados con materiales diversos como

vidrio, plástico, porcelana y metal. Se clasifican de la siguiente

manera:

Material de vidrio

Material de porcelana

Material de plástico

Material de metal y madera

Equipos usados en el laboratorio

MicroscopioBalanza analítica

HornoPlancha de calentamiento

Centrifugas


Materiales y Equipos requeridos:

Materiales Equipos

Portaobjetos Estufas bacteriológicas

Cubreobjetos Baño bacteriológico

Caja petri Horno Pasteur

Pipetas graduadas Autoclave

Pipetas Pasteur Jarra de anaerobiosis

Tubos de ensayo Centrifuga

Matraces Nefelómetro de Mac Farland

Probetas Membranas millipore

Tubos de Durham Cuenta colonias

Asas de inoculación Microscopio

Mecheros


PROCEDIMIENTO: N/A




TABLA DE DATOS: N/A


Describir los materiales y equipos de laboratorio de manera detallada.

GLOSARIO

Microscopio: (del griego μικρός micrós, ‘pequeño’, y σκοπέω scopéo, ‘mirar’)1 es un

instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a

simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se

trata de un instrumento óptico que contiene dos o más lentes que permiten obtener una

imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción.

Aumento: El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor será la distancia focal y mayor será el aumento. Se ha enunciado anteriormente que el microscopio compuesto aumenta en dos etapas y puesto que una sola lente no es suficiente se deben colocar varias lentes una detrás de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular (11). Cada sistema de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con la letra x, así que 10x significa que la imagen está aumentada 10 veces.

Resolución: Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro (14). La riqueza de detalles que puede ser observada al microscopio depende de la habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que están muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras más corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, más finos serán los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como Límite de Resolución, el cual es también referido como el Poder de Resolución y puede ser utilizada como un indicador del rendimiento del microscopio. Esto se puede comparar vagamente con algunos aspectos de la informática, el tamaño del pixel por ejemplo; mientras más pequeño sea el tamaño, mayor será la cantidad de detalles de la imagen digital.

Límite de resolución como la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que sean distinguidos por separado, comprenderemos fácilmente la relación inversa que se establece entre poder resolutivo y límite de resolución: cuanto menor sea la distancia que debe separar a dos puntos para que se distingan por separado, mayor será el poder resolutivo necesario para observarlos

Poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio (o el ojo humano, etc.) de

percibir por separado dos puntos pequeños, adyacentes y cercanos. Vale decir, es la

capacidad para percibir detalles. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la

distancia que separa dichos puntos. Es decir, si dos puntos distan 1cm uno del otro y yo

los veo como un solo punto borroso (aparte de necesitar urgente un oculista) tendré

https://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio#cite_note-1




menor poder resolutivo que alguien que los distingue por separado o que distingue

perfectamente puntos que distan de 0,5cm entre si.

BIBLIOGRAFIA

- Materiales y equipos de laboratorio. Recuperado de

file:///C:/Users/windows7/Downloads/informematerialdelaboratorio-150321235657-

conversion-gate01.pdf

- El microscopio. Recuperado de

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp1/microscopio.html

PRÁCTICA No. 2 MÉTODOS DE SIEMBRA – PARTE A

INTRODUCCION: La inoculación de medios de cultivo para la recuperación, mantenimiento y/o aislamiento de microorganismos, es un procedimiento fundamental e importante. Debe tenerse cuidado con las técnicas de siembra microbiana para evitar en lo posible la contaminación por otros microorganismos diferentes al deseado.


MÉTODOS DE SIEMBRA Sembrar: Es el acto de colocar el materialbacteriológico en el medio de cultivo para promoversu crecimiento y desarrollo, y subsiguientemultiplicación. El resultado de una siembra se llama:Cultivo

Las siembras pueden ser:

Primarias: cuando el material es inoculado en losmedios por primera vez.

Secundarias: cuando el material a inocularprocede de una siembra primaria.

Los métodos de siembra son:

Siembra por dilución

Siembra por estrías en superficie

Siembra por estría poragotamiento

Por picadura o punción

Siembra en TSI


http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp1/microscopio.html





Materiales Equipos

Muestra contaminada con microorganismos

Incubadora

Agar nutritivo en caja petri

Mechero

Asa redonda

Gradilla

Vinipel

Marcador de vidrio

Reactivos a utilizar:

Reactivo Fórmula Concentración

Agua peptonada

------ 0,1%

PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo.

2. Coger parte de la muestra y colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua

peptonada. Homogenizar.

3. Dejar 20 – 30 minutos en incubación los tubos.

4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un circulo de papel (8 cm) para

ponerlo debajo de la caja de Petri (Figura 1)

5. Finalizado el tiempo de incubación tomar el asa redonda y esterilizarla por calor hasta

que está esté roja, dejar enfriar cerca al mechero.

6. Abrir el tubo con la muestra y tomar una asada.

7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque nada

y de no pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este

8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento.

9. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla

en papel vinipel.




10. Colocar el tubo y la caja a incubar a 37°C. La caja debe estar boca abajo siempre. 11.

Desinfectar el área de trabajo, apagar el mechero y entregar el material

TABLA DE DATOS:

Anotar los resultados obtenidos


Este procedimiento se denomina aislamiento de bacterias, debido a que las bacterias

presentes en una muestra se distribuyen sobre la superficie de un agar, y cada célula se

reproduce independientemente hasta formar un conglomerado de bacterias observables a

simple vista (colonia bacteriana). De esta manera es posible observar sobre la superficie

del medio, colonias de diferentes características en cuanto a forma, superficie, borde,

forma, color, aspecto y elevación, lo que indica microscópicamente presencia de

diferentes tipos microbianos en la muestra. Así se puede estudiar e identificar

independientemente cada especie.

GLOSARIO

Agar Nutritivo: Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento

de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.

Siembra: Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo)

en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y

multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura

adecuada para el crecimiento.

Siembra por estría por agotamiento: Con éste procedimiento se puede conseguir una

buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de

cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada

se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio

formando estrías.

Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material en la superficie de el agar

inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa

bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo

estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda

de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.

Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo

simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con

el material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS




- Métodos de siembra. Recuperado de

http://microbiologiauasd.blogspot.com.co/p/metodos-de-siembra.html

PRÁCTICA No. 2 MÉTODOS DE SIEMBRA – PARTE B

INTRODUCCION: Los microorganismos también pueden ser cultivados en distintos tipos de medios de cultivo tanto líquidos como sólidos, en esta parte los estudiantes deberán hacer una siembra del microorganismo en medio líquido.











Siembra en TSI



Materiales Equipos

Muestra contaminada con microorganismos

Incubadora

Caldo nutritivo en tubo de ensayo

Mechero

Agar nutritivo solido en tubo de ensayo

Pipeta de vidrio de 1ml

Asa redonda





Gradilla

Vinipel

Marcador de vidrio



Agua peptonada

------ 0,1%

PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo.

2. Coger parte de la muestra y colocarla en el frasco que contiene el agua peptonada.

Homogenizar.

3. Dejar 20 – 30 minutos en incubación .

4. tomar 1 ml de la suspensión y transferirla en el tubo que contiene el medio de cultivo.

5. incubar a 37° por 24 horas, observar el tipo de crecimiento

6. anotar los resultados obtenidos.

Siembra en medio semisólido.

De la misma suspensión inicial tomar con un asa recta e introducirla en dicha suspensión,

posteriormente siembre por punción en el medio semisólido como indica a continuación la

figura.




Siembra en medio sólido con superficie inclinada

Tomar con asa recta de la misma suspensión inicial (muestra) y proceder a realizar la

misma acción anterior, incubar y observar el crecimiento, a continuación se ilustra un

ejemplo.

Patrones de crecimiento en medios sólidos

TABLA DE DATOS:

Anotar el crecimiento que obtuvo con su microorganismo.


Se espera observar un crecimiento de microorganismos en los medios de cultivo

utilizados.

GLOSARIO














formando estrías.












-

PRÁCTICA SIEMBRA DE HONGOS

INTRODUCCION: Los hongos son microorganismos eucarióticos con condiciones de crecimiento especiales e interés ambiental, pueden ser utilizados a nivel de industria.















Siembra en TSI



Materiales Equipos

Cajas de petri con agar PDA

Incubadora

Agujas de disección, jeringas de insulina o

asa recta

----------------

Hongos de cualquier género con

crecimiento no mayor a 15 días antes de la

practica (En caja petri)

------------------


PROCEDIMIENTO:

1. Tome con la aguja de disección o asa un cuadro de la colonia fúngica de no más

de 5 mm de diámetro, intente tomar de los extremos de la colonia, cuidadosamente

coloque el cuadro en la caja de Petri con agar PDA en el centro de la misma, incubar a

25°.




TABLA DE DATOS:

Anotar el crecimiento que obtuvo con su microorganismo.


Se espera observar un crecimiento de microorganismos en los medios de cultivo

utilizados.

GLOSARIO











formando estrías.












-

PRÁCTICA No. 3 TÉCNICAS DE TINCIÓN





INTRODUCCION: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan

difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste

entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es

la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes

de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales

como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,

proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente,

aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y

alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores

cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células

que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y

siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el

encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan

mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han

sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. La mayoría de los

colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los

materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas

positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares

cargados negativamente, tales como los ácidos nucleídos y los polisacáridos ácidos.

Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.

Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los

constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos

colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes

son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales

lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o

depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.





TÉCNICAS DE TINCIÓN

La tinción es un proceso por el cual las moléculas deun colorante se absorben a una superficie. El uso decolorantes permite cambiar el color de las células delos microorganismos y poder realizar la observaciónen microscopio óptico.

tipos de tinción

Simple: el colorante utilizado sirve solo paradenotar la morfología celular.

Diferencial: el colorante utilizado pone demanifiesto diferencias entre células bacterianas oentre partes de una misma célula, estas técnicasutilizan más de un colorante o bien ciertosreactivos complementarios para la tinción.

Tinción de Gram1) Las células son fijadas por medio del calor sobre un portaobjetos, se tiñen primero con una solución de cristal violeta y son lavadas después para quitar el exceso de colorante.

Tinción negativa:Un método sencillo de tinción para bacterias,que además es un claro caso de cromofobia yque por lo tanto funciona aun cuando losmétodos de tinción positiva fallan, es la tinciónnegativa



Materiales Equipos

Láminas Mechero

Laminillas Microscopio óptico

Agua destilada estéril

Asas bacteriológicas redonda y asa recta

Colonias aisladas de bacterias para observación de

bacterias

Guantes de látex



Azul de metileno

------ ------

Cristal violeta

------ ------

Lugol ------ ------

Alcohol ------- ------




cetona

Fucsina básica o safranina

----------------- -------------

Tinta china ---------- -----------

PROCEDIMIENTO:

1. Coloración simple

a. En una lámina portaobjetos limpia, colocar una gota del agua destilada estéril (trabajo

con muestra sólida) o una gota del cultivo bacteriano (trabajo con muestra liquida) sobre

la misma y con ayuda del asa redonda estéril extender la gota de suspensión a un área no

superior a dos centímetros cuadrados.

b. Dejar que la preparación se seque al aire. Fijar con calor, pasando tres veces seguidas

a través de la llama del mechero.

c. Dejar enfriar la lámina. Lo anterior se conoce como la realización de un frotis y se hace

para coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las coloraciones

respectivas.

d. Colocar la preparación sobre una rejilla encima del vertedero.

e. Cubrir la suspensión con algún colorante dado por el profesor, así: i. Cristal violeta: 1

minuto ii. Azul de metileno: 5 minutos iii. Fucsina: 1 minuto

f. Terminado el tiempo de coloración según el colorante empleado, eliminar el colorante

lavando con agua suavemente.

g. Dejar secar y colocar la preparación en la platina del microscopio y observar con el

objetivo de menor aumento inicialmente hasta llegar al objetivo de 100X

2. Coloración compuesta

a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada

b. Colocar en la rejilla para coloración y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que

transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante.

c. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis

d. Realizar la decoloración con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar

inmediatamente con agua.

e. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30 segundos.

Lavar con agua.




f. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las

observaciones respectivas.

TABLA DE DATOS:

Anotar las morfologías observadas posteriores a la coloración, si es posible tomar fotos


Se espera observar las morfologías posteriores a la coloración.

GLOSARIO

Tinción: La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a

una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los

microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las

bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se

encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo.

Tinción Simple: Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se

tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de

lactofenol). El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de

hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la

célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los

hongos.

Tinción Diferencial: Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares

se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia

constitución química. Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-

Neelsen

Tinciones específicas: Se utilizan para incrementar el contraste en las células

microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y

las cápsulas.

Tinción negativa: Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro

caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción

positiva fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser conseguido simplemente

extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota

de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos.

Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados fácilmente por medio de

microscopía en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el

medio oscuro que las rodea




Tinción Gram: La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en

el laboratorio bacteriológico. Su utilidad en la práctica de referencias a la morfología

celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la

tinción de GRAM


- Tinciones. Recuperado de

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

PRÁCTICA No. 4 OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS

INTRODUCCION: La célula fúngica es similar a cualquier organismo eucarionte, aunque existen diferencias subcelulares entre la célula de un hongo inferior a la de uno superior. Cuando se estudian los hongos se pueden observan dos grandes grupos: los algodonosos, que se conocen con el nombre de mohos y otros que forman colonias húmedas y se conocen como levaduras.


OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS

Método

A) Cultivo del mohoObservarás las hifas a modo de pequeñostubos, sin tabiques de separación y connumerosos núcleos esparcidos en elcitoplasma común (hifas sifonadas). En elextremo de algunas hifas aparece unengrosamiento (columnilla) rodeado delesporangio, en cuyo interior se hallan lasesporas..B) Observación con la lupa binocular

C) Observación con el microscopio



http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm




Materiales Equipos

Cultivo de hongos Microscopio

Láminas portaobjetos

Laminillas



Azul de lactofenol

------ ------

PROCEDIMIENTO:

Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota de azul de lactofenol, luego tomar con el asa micológica previamente estéril parte del hongo y resuspenderlo en la gota del colorante. Colocar luego una laminilla encima de esta preparación y esperar 3 minutos. Finalizado este tiempo montar al microscopio y observar en 10X y 40X.

TABLA DE DATOS:


Se espera observar las distintas partes que conforman un hongo.

GLOSARIO




Micología: es la ciencia que estudia los hongos, estos organismos fueron durante mucho tiempo considerados miembros del reino de las plantas.

Micelio: Un micelio fúngico es una red de filamentos llamados hifas. El micelio obtiene

nutrientes (generalmente de materia orgánica en descomposición) y produce el cuerpo

fructífero. A menudo, la mayor parte del micelio es subterráneo.

Cuerpo fructífero: El cuerpo fructífero de un hongo es una estructura reproductiva. Un

champiñón es un organismo típico de fructificación de hongos, que se adjunta a un micelio

bajo tierra. Un cuerpo fructífero produce esporas.

Esporas. Las esporas están involucradas en la reproducción de los hongos. Lanzadas por

el cuerpo fructífero, las esporas de hongos son haploides, es decir, que sólo tienen un

cromosoma de cada gen (como los gametos humanos). Las esporas pueden germinar

cuando golpean el suelo húmedo.


- Partes de un hongo. Recuperado de http://www.ehowenespanol.com/partes-hongos-hechos_506651/

PRÁCTICA No. 5 CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

INTRODUCCION: Los factores físicos y químicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o lo impiden. El conocimiento del efecto de esos parámetros medio ambientales no solo permitió estudiar los microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su crecimiento sino que posibilitó aprender la forma de controlarlos.


http://www.ehowenespanol.com/partes-hongos-hechos_506651/

http://www.ehowenespanol.com/partes-hongos-hechos_506651/




CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Parámetros físicos y químicos que afectan el crecimiento y desarrollo

de los microorganismos

Parámetros físicos

TemperaturaMicroorganismos psicrófilosMesófilosTermófilosPhPresión osmótica

Parámetros químicos

Las fuentes de carbonoNitrógeno, Azufre y FósforoOxígenoAgentes antimicrobianosEspectro de actividadantimicrobiana



Materiales Equipos

Cultivo de microorganismos Gram- Positivo

Estufa

Cultivo de microorganismos Gram- Negativo

Incubadora

Medio de cultivo nutritivo en cajas petri con diferentes PH´s

Medio de cultivo nutritivo en cajas de petri con diferentes concentraciones de

NaCl

Medio de cultivo nutritivo en cajas de

petri

Caldo Nutritivo




Pipetas estériles de 1 y 2 ml

Vaso de precipitado de 500 ml


PROCEDIMIENTO:

1. ACCIÓN DE LA TEMPERATURA Suspender una colonia del microorganismo

seleccionado en el caldo nutritivo y dejarlo por media hora para un desarrollo de los

microorganismos en el medio de cultivo. Luego tomar 0.1 mL del medio y sembrarlo sobre

el medio sólido del agar nutritivo. Llevar el caldo nutritivo donde se inoculo el

microorganismo a la estufa y ponerlo a ebullición por el tiempo dado por el profesor y

sembrar como al inicio. Llevar las dos cajas de Petri e incubarlas a 37oC.

2. ACCION DEL pH Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de

vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el microorganismo Gram-

negativo y en el otro el Grampositivo. Realizar este procedimiento con todas los medios

de diferentes pH.

3. ACCIÓN DE LA PRESIÓN OSMÓTICA Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes

con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el

microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo.

4. ACCIÓN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes

con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el

microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Seguidamente tapar la mitad

de la caja con papel de aluminio y colocar sobre la otra parte de la caja la luz ultravioleta

por 5 y/o 10 minutos, tapar la caja y llevar a incubar.

TABLA DE DATOS:

Anotar los resultados


Analizar el crecimiento bacteriano bajo ciertos parámetro físicos y químicos.

GLOSARIO

Temperatura: la supervivencia de los microorganismos se presenta normalmente en las

temperaturas usuales para el desarrollo de los animales superiores, aunque se da el caso

de algunas bacterias resistentes a extremos de frío o de calor. Se puede hablar por

consiguiente de una taxonomía microorgánica referida a rangos óptimos de adaptación a

la temperatura.




Microorganismos psicrófilos: adaptados a bajas temperaturas, en términos generales

se maneja un rango de 0°C a 20°C como límites normales para su crecimiento.

Mesófilos: viven en temperaturas moderadas, en un rango de 20°C a 40°C., los

microorganismos mesófilos, son los más comunes. Por ejemplo, la temperatura óptima

para la mayoría de las bacterias patógenas se aproxima a los 37°C.

Termófilos: soportan altas temperaturas, contemplan como rangos usuales de tolerancia

de 40°C. a 80°C. y por consiguiente sus endosporas son normalmente resistentes al calor

y sobreviven a los tratamientos térmicos aplicados a conservas enlatadas aunque no

crecen a las temperaturas normales de almacenamiento.

pH: Normalmente los pH (acidez o alcalinidad de una solución o medio de crecimiento) de rango neutro (6,5 a 7,5) son los más adecuados para el crecimiento bacteriano y muy pocas bacterias soportan pH inferiores a 4.0. Por esta razón el manejo de la acidez es un recurso para el control microorgánico. Como en el caso de las temperaturas existen algunas bacterias que soportan niveles extremos de acidez, razón por la cual se Las denomina acidófilas. Se conocen bacterias que sobreviven a pH de 1.Los rangos alcalinos generalmente inhiben el crecimiento microbiano. En los ensayos de laboratorio para el cultivo de bacterias se requiere neutralizar los ácidos que producen las bacterias mediante sustancias químicas denominadas tampones. Las sales de fosfato amortiguan la acidez y la mantienen en el rango usual de crecimiento para la mayoría de las bacterias (de 6,5 a 7,5) y de paso aportan el fósforo que es un nutriente necesario.

Presión osmótica: Los microorganismos están formados por un 80-90% de agua y por consiguiente son fácilmente afectados por soluciones hipertónicas o sea con una concentración de solutos mayor a la de la célula microbiana, razón por la cual esta pierde agua por el efecto conocido como plasmólisis. Por consiguiente la adición de sales o de azúcar produce una contracción celular que evita el crecimiento bacteriano.


- Control del crecimiento bacteriano. Recuperado de http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201504/micro/3_1controlcrec.htm

PRÁCTICA No. 6 RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS - UFC

INTRODUCCION: Microorganismo aerobio mesófilo son todas las bacterias, levaduras y hongos capaces de desarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30°C. Es un parámetro que sirve para estimar la flora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno de los indicadores más útiles del estado microbiológico de un alimento, agua, suelo entre otros. Tiene un valor limitado como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas. Altos recuentos microbianos se consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos.


http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201504/micro/3_1controlcrec.htm




RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS - UFC

En diversos estudios microbiológicos (como análisis de alimentos, de agua

de bebida, de productos farmacéuticos o del medioambiente entre otros), se

requiere conocer el número de microorganismos presentes en un

material con objeto de determinar su calidad.

MÉTODOS

Recuento directo de bacterias almicroscopio

Recuento directo con contadoreselectrónicos

Recuento en filtros de membrana

Métodos de recuento de bacteriasviables en placa

Recuento en placa por siembra en

profundidad.

Recuento en placa por siembra ensuperficie



Materiales Equipos

2 cajas de petri esteriles4 tubos de ensayo con agua

peptonada al 0,1% estériles

Incubadora a 35°C

4 pipetas de 1 ml o una pipeta automática

(100 – 1000 UL)

Balanza

1 frasco de dilución con 90 ml de agua peptonada al 0,1%

50 ml de agar nutritivo previamente preparado y

atemperado a 45 -48°C

Marcador de vidrio

Contador de colonias





PROCEDIMIENTO:

1. Hacer diluciones de la muestra líquida de acuerdo al tipo de producto.

• Si es una muestra contaminada deben realizarse diluciones altas

• En muestras procesadas se hacen diluciones bajas

2. Sembrar en profundidad por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones seleccionadas

3. Adicionar de 15 – 20 mL del agar nutritivo a la temperatura adecuada

4. Mezclar inmediatamente el inóculo con el medio, con movimientos circulares de la placa a favor y en contra de las manecillas del reloj, como en ángulo recto. Debe evitarse que el medio impregne la tapa.

5. Dejar solidificar, adicionar una capa sellante de 5 mL sobre la caja y dejar solidificar nuevamente.

6. Una vez solidificado el agar, se vierten las placas e introducen en la incubadora (35°C durante 72 horas).

7. Sacar de la incubadora y realizar el recuento

8. Lectura: se deben contar las cajas cuyo número de colonias esté comprendido entre 30 y 300 UFC. Es conveniente ir marcando las colonias para evitar volver a contarlas. Hallar la media. El número contado se multiplica por el factor de dilución y los resultados se expresarán en unidades formadoras de colonia (UFC) por mL o g, dependiendo del tipo de alimento de partida.

9. Siempre se informan dos números enteros y el resto en exponente.

TABLA DE DATOS:



Se espera obtener el conteo de las colonias formadas.

GLOSARIO

Conteo bacteriano: señala la magnitud de la población total bacteriana. En ese sentido

se puede determinar por diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes

tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio o mediante un contador

electrónico de partículas o indirectamente con la cuenta de colonias), masa celular (en

forma directa pesando el contenido celular del nitrógeno o indirectamente por

turbidimetría, proporcional al número de células) y actividad celular (indirectamente

relacionando el grado de actividad bioquímica al tamaño de la población bacteriana)




Contador Coulter : es un aparato utilizado para contar y medir el tamaño de partículas en

solución. Se utiliza principalmente para contar células sanguíneas en su aplicación como

contador hematológico, pero también se puede utilizar para bacterias, células y partículas

virales.

Conteo en caja de petri: Método más usado para contar bacterias. Un caldo de

cultivo con microorganismos es diluido y posteriormente muestras del mismo son

distribuidas en la caja de petri contenedora de agar. Es de suponerse que cada célula se

dividirá en sus múltiples alrededores para producir colonias separadas en el agar. Cada

célula es llamada unidad formadora de colonias (UFC).

Conteo por filtración: Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña,

como en casos de lagos y arroyos relativamente puros. En esta técnica se necesitan al

menos 100 mL de agua que atraviesen una membrana delgada de un filtro, con poros tan

pequeños que no permitan el paso de bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la

superficie del filtro.

Unidades Formadoras de Colonias: (abreviadamente, UFC) es un valor que indica el

grado de contaminación microbiológica de un ambiente. Expresa el número relativo

de microorganismos de un taxón determinado en un volumen de un metro cúbico de agua.


- Conteo bacteriano. Recuperado de https://es.wikipedia.org/wiki/Conteo_bacteriano

PRÁCTICA No. 7 APLICACIONES DE LA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

INTRODUCCION: La microbiología enfocada en la parte ambiental ha permitido

diagnosticar e implementar nuevas alternativas para el desarrollo agrícola, en el ámbito de

la ingeniería ambiental y la industria. Con los conocimientos adquiridos en el curso y

teniendo un conocimiento básico de la microbiología, los estudiantes realizaran las

siguientes pruebas que actualmente se utilizan a nivel mundial y específicamente en el

país





APLICACIONES DE LA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

CONTROL DE CALIDAD EN ABONOS ORGÁNICOS Y SUELOS POR NÚMERO MÁS PROBABLE

(NMP)

DETECCIÓN DE PSEUDOMONAS EN

SUELOS

INDICADORES DE CONTAMINACION DE AGUAS

POTABLES



CONTROL DE CALIDAD EN ABONOS ORGÁNICOS Y SUELOS POR NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

1. Frascos con solución salina 0.85% o agua peptonada al 0.1% (90 ml)

2. Tubos tapa rosca con 9 ml de solución salina o agua peptonada al 0.1%

3. 15 tubos tapa rosca con 9 ml de caldo de cultivo LBT (Lauryl Tryptose Broth)

4. 15 campanas durham para observar producción de gas (dentro de los tubos de

LBT)

5. 15 tubos trapa rosca con 9 ml de caldo de cultivo LMX (FLUOROCULT) para

cultivo de E. coli

6. Reactivo de kovacs

7. Lámpara U.V

8. Pipetas de vidrio de 1 ml

9. Muestra de abono orgánico (los estudiantes deberán llevar la muestra, puede ser

abono orgánico comercial, lombricompost, humus etc)

DETECCIÓN DE PSEUDOMONAS EN SUELOS

1. Frascos con 90 ml de solución salina al 0.85% o agua peptonada al 0.1%

2. Tubos tapa rosca para diluciones con 9 ml de solución salina al 0.85% o agua

peptonada al 0.1%




3. Cajas de Petri con agar King b o cetrimide

4. Rastrillos de vidrio

5. Pipetas de vidrio de 1 ml

6. Suelo procedente del algún sitio de derrame de petróleo o que estpé impactado

por derivados del petróleo (suelos de cultivos donde se ha fumigado) o cualquier suelo.

7. Lámpara de luz UV

INDICADORES DE CONTAMINACION DE AGUAS POTABLES

1. Equipo de filtración por membrana (equipo millipore de plástico)

2. Membrana de nitrocelulosa de 0.45 micrometros para filtacion.

3. Jeringa (para hacer vacío) 4. Cajas de Petri con agar Cromocult para coliformes.


PROCEDIMIENTO:

CONTROL DE CALIDAD EN ABONOS ORGÁNICOS Y SUELOS POR NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

1. Pesar 10 gramos de la muestra, mezclarla con los 90 ml de solución salina o agua peptonada. 2. Realizar diluciones seriadas hasta 10-3 . 3. Marcar los tubos de LBT y LMX en 3 series de 5, es decir 5 tubos marcados como 10-1 , 5 tubos marcados como 10-2 , 5 tubos marcados como 10-3 . 4. A partir de las diluciones sembrar 1 ml de cada dilución en los tubos con los dos medios.recuerden que por cada dilución deben inocular 5 tubos de medio. 5. Incubar a 37° por 24 horas 6. Realizar la lectura, la cual se realiza contando el número de tubos positivos, para el caso de coliformes fecales (LBT) se presenta turbidez y presencia de gas en las campanas durham, sino se presentan los dos fenómenos se tomarán como negativos) 7. Por ejemplo en la dilución 10-1 se presentaron 3 tubos positivos, en la dilución 10-2 1 tubo positivo, en la dilución 10-3 0 tubos positivos, obteniéndose una combinación de 310, con ese número se dirigen a la tabla de Numero más probable según la EPA-1680 2006. DETECCIÓN DE PSEUDOMONAS EN SUELOS 1. Pesar 10 g de la muestra y mezclarlos con los 90 ml de solución diluyente, agitar bien y realizar diluciones seriadas hasta 10-6 . 2. Sembrar 0.1 ml de las diluciones 102 , 10-4 , 106 en superficie por duplicado, proceder a hacer siembra masiva con los rastrillos cuidando que no se rompa el agar, incubar a 30 grados por 4 días. 3. Posterior a la incubación con ayuda de la lámpara observar las colonias con fluorescencia o pigmentación azul verdosa, realizar el recuento de la dilución que contenga entre 30 y 300 colonias. 4. Realizar los cálculos de la siguiente manera, por ejemplo, en la dilución 10- 6 se contaron 48 colonias, ese valor se multiplica por el factor de dilución, por el factor de corrección así: 48(numero de colonias contadas x106(factor de dilución) x10(factor de




corrección, es un número constante)=48x108UFC/g (UFC hace referencia a unidades formadoras de colonia) INDICADORES DE CONTAMINACION DE AGUAS POTABLES 1. Tomar 100 ml de agua de la llave, la cual se inoculará con una asada de cultivo de E. coli, agitar muy bien. 2. Colocar la muestra en la parte superior de la campana de filtración y con la ayuda de la jeringa realizar el vacío para permitir el paso del agua de un lado al otro. 3. Con unas pinzas estériles retirar la membrana y colocarla sobre el agar cromocult, la parte de la cuadrícula debe ir mirando hacia arriba. 4. Incubar por 24 horas a 37° c y observar el número de colonias con las características típicas de E. coli y coliformes totales (consultar la coloración en este medio, se encuentra por internet)

TABLA DE DATOS:



Los indicadores de contaminación son utilizados para medir el grado de contaminación o

afectación de cuerpos de agua, agua de consumo etc, en Colombia para el caso de aguas

potables la normatividad exige un valor de 0 unidades formadoras de colonia en 100 ml de

agua muestreada para el caso de coliformes totales como indicador.

GLOSARIO

Agar cromocult: se establece como base para el nuevo estándar de la ISO® para la enumeración de las muestras en agua de E. coli y coliformes. E. coli: también conocida por la abreviación de su nombre, E. coli, es quizás el organismo procariota más estudiado por el ser humano. Se trata de una entero bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en multitud de ambientes, dado que es un organismo ubicuo. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominóBacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor.

Biorremediación: La biorremediación es el proceso de limpieza de ambientes contaminados (Coyne, 1998) o también, es el proceso de biodegradación y biotransformación controlado o espontáneo que busca eliminar o atenuar los contaminantes ambientales a través de la actividad biológica en los sitios afectados (Madsen, 2008).


- Aplicaciones de la microbiología ambiental. Recuperado de http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358010/exe/captulo_1_mundo_microbiano.html

http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358010/exe/captulo_1_mundo_microbiano.html

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