Forensic DNA Fingerprinting Kit Find skildpadden

Forensic DNA Fingerprinting Kit

Find skildpadden

Kit nr. 166‐0007EDU

Explorer.bio‐rad.com

Åbn straks kittet ved modtagelsen, da det indeholder dele, der skal opbevares ved ‐20oC

Oversat og bearbejdet af Kim Kusk Mortensen, Bent Rasmussen og Birgit Sandermann Justesen, februar 2010


Instruction Manual

Catalog #166-0007EDU

explorer.bio-rad.com

The kit is shipped at room temperature. Open immediately uponarrival and store reagent bag at –20°C within 3 weeks of receipt.

For technical service call your local Bio-Rad office, or in the US, call 1-800-4BIORAD (1-800-424-6723)

Duplication of any part of this document is permitted for classroom use only.Please visit explorer.bio-rad.com to access our selection of language translations for

Biotechnology Explorer kit curriculum.

Biotechnology Explorer™


Instruction Manual

Catalog #166-0007EDU

explorer.bio-rad.com

The kit is shipped at room temperature. Open immediately uponarrival and store reagent bag at –20°C within 3 weeks of receipt.

For technical service call your local Bio-Rad office, or in the US, call 1-800-4BIORAD (1-800-424-6723)

Duplication of any part of this document is permitted for classroom use only.Please visit explorer.bio-rad.com to access our selection of language translations for

Biotechnology Explorer kit curriculum.

Biotechnology Explorer™

Kittets indhold Crime Scene (CS) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 1 (S1) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 2 (S2) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 3 (S3) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 4 (S4) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 5 (S5) DNA med buffer – frysetørret 1 glas EcoR1/Pst1 restriktionsenzymblanding frysetørret, 3000 units 1 glas Sterilt vand 2,5 mL 1 glas HindIII lambda (DNA størrelsesmarkør) 0,2µg/µL, 100µL 1 glas Loading dye 1 glas Farvede mikrocentrifugerør 2,0mL 60 Klare mikrocentrifugerør 1,5 mL 30 Agarose – 5g Elektroforesebuffer, 50xTAE, 100mL Skum-holdere 16 Gelfarvningskar 4 Fast Blast DNA-farve, 500x, 100mL Nødvendigt udstyr Mikropipetter 20‐200µL 1 Mikropipetter 2-20µL 1-8 Mikropipette 100-1000µL 1 Pipettespidser 0-200µL (nogle med aerosolbarriere) Pipettespidser 100-1000µL (med aerosolbarriere) Mærkepenne Elektroforeseudstyr til vandret elektroforese Stømforsyning Demineraliseret vand/destilleret vand Isbade Tape (gerne maletape) BlueCap flaske 500 mL til at smelte agarosen i i mikrobølgeovnen BlueCap flaske 500 mL Vandbad 37 oC Mikrocentrifuge Eventuelt et vippebord til gelfarvningen. Kittets enkelte dele kan købes som refill – se BioRads katalog og www.biorad.com

Teori Forsøget er en simplificeret model for en retsgenetisk DNA-metode til at identificere et individ ud fra en større population, og kan som sådan benyttes som model for, hvorledes retsgenetikere anvender moderne bioteknologi i forsøget på at identificere mordere eller sædelighedsforbrydere. Metoden er selvfølgelig også anvendelig i fadderskabssager. Af mere specielle anvendelser kan nævnes at metoden har afsløret svindel med hakket oksekød, der var iblandet svinekød, og det var ikke så heldigt, da kødet var leveret til et arabisk land. Eller hvad med sushi, som viste sig at indeholde kød fra delfiner og hvaler. Metoden benyttes desuden videnskabeligt i arbejdet med at fastslå slægtskabet mellem arter eller evt. i opsplitningen af arter i forskellige underarter. Ved DNA fingerprinting metodens anvendelse i kriminalsager og slægtsskabsundersøgelser benytter man den viden, at menneskets kromosomer i visse introns indeholder nogle små repeterede DNA-sekvenser, som ikke koder for noget kendt, men hvis frekvens er ret unik for det enkelte menneske. Klippes disse fragmenter med restriktionsenzym og opformeres vha. PCR teknik, vil de ved elektroforese danne et båndmønster, som er karakteristisk for det enkelte menneske. I dette eksperiment klippes med EcoRI og PstI, og de klipper som vist i figur 1 . DNA fra en mistænkt kan ved denne metode sammenlignes med DNA fra et gerningssted, og man kan med 99,99% fastslå om der er tale om identisk DNA, og dermed om det med stor sandsynlighed stammer fra samme person. Agarose-gelektroforese anvendes til næsten al kvalitativ og kvantitativ DNA analyse. Ved elektroforesen vil DNA fraktioner adskilles i agarosegelen, således at små fraktioner vandrer hurtigst, og dermed længst, mens større fraktioner vandrer kortest. Dvs. metoden adskiller fraktioner efter molarmasse eller antal nucleotider. Da DNA indeholder fosfatgrupper, som ved pH 7,6 (bufferens pH) alle har en negativ ladning, vil de alle vandre mod den positive pol i elektroforeseapparatet, derfor anbringes brøndene altid ved den negative pol.

Restriction Digestion of DNABecause they cut DNA, restriction enzymes are the "chemical scissors" of the molecular

biologist. When a particular restriction enzyme "recognizes" a particular recognitionsequence (four- or six- base pair (bp)) on a segment of DNA, it cuts the DNA molecule atthat point. The recognition sequences for two commonly used enzymes, EcoRI and PstI,are shown below. The place on the DNA backbones where the DNA is actually cut isshown with a (!) symbol:

For the enzyme EcoRI

For the enzyme PstI

Like all enzymes, restriction enzymes function best under specific buffer and temperature conditions. The proper restriction enzyme buffer has been included with theDNA sample in this kit, so that when the rehydrated DNA and enzymes are mixed, the idealconditions are created for the enzymes to function optimally. The final reaction buffer consistsof 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DDT, pH 8.0, which is the ideal conditionfor EcoRI and PstI enzymes to function.

Making DNA Visible

DNA is colorless so DNA fragments in the gel cannot be seen during electrophoresis. A sample loading buffer containing two bluish dyes is added to the DNA samples. Theloading dye does not stain the DNA itself but makes it easier to load the samples and monitor the progress of the DNA electrophoresis. The dye fronts migrate toward the positiveend of the gel, just like the DNA fragments. Bromophenol blue, the “faster” dye, comigrateswith DNA fragments of approximately 500 bp in a 1% agarose gel, while the xylene cyanol,the “slower” dye, comigrates with DNA fragments of approximately 4,000 bp in a 1%agarose gel.

Staining the DNA pinpoints its location on the gel. When the gel is immersed in FastBlast DNA stain, the stain molecules attach to the DNA trapped in the agarose gel. Whenthe bands are visible, your students can compare the DNA restriction patterns of the differentsamples of DNA.

The gel on page 7 shows the DNA pattern that will be obtained by your students following electrophoresis. The DNA from the crime scene has been labeled CS, that fromSuspect #1, S1 and so on. The DNA from the crime scene is placed in lane 2; one suspect’sDNA is placed in each of lanes 3, 4, 5, 6 and 7. Lane 1 contains HindIII lambda digest(DNA size markers). By convention, the lanes are numbered from the top left. The students’task is to look at the DNA banding patterns and see if any of the suspects’ bands matchthose of the DNA found at the crime scene.

6

INS

TRU

CTO

R'S

MA

NU

AL

BA

CK

GR

OU

ND

Instructor’s Manual

G A A T T CC T T A A G

C T G C A GG A C G T C

!

!

!

!

Gelen er en fast gelé, som er støbt af agarose, et stof der minder om husblas og udvindes af tang. Agarosen fås på pulverform og opvarmes i vand blandet med en buffer. Når blandingen er klar og flydende kan den hældes i elektroforesekarret, hvor den stivner. Bufferen indeholder flere ting, bla. et stof der sørger for at pH ikke ændrer sig samt andre hjælpestoffer (se. evt. note i slutningen af forsøget). I gelen støbes brønde, hvori prøverne med klippet DNA anbringes. Over det hele er hældt en elektroforese buffer, en væske der skaber kontakt mellem de to elektroder. Når strømmen sluttes vil alle positive ioner vandre mod - polen og alle negative ioner, bla. DNA vandre mod + polen. DNA vil vandre i gelen. Agarosegelen er oftest støbt med et 1-2% indhold af agarose. Jo højere procent, jo mere trang er pladsen for de vandrende DNA fragmenter. En 2% agarose-gel er således særdeles velegnet til separation af små DNA fragmenter, mens en 1% gel er bedre til separation af større fragmenter.

For at følge elektroforesen tilsættes til hver brønd lidt farve (LD = Loading dye). Loading dye er sammensat af to farver, og vil derfor vise sig som to blåsorte bånd, der vil vandre mod den positive pol med hver sin hastighed. Den hurtigste vil vandre med samme hastighed som DNA fragmenter på 500 bp (basepar), mens den langsomste vil følge DNA fragmenter på 5 kbp (5000 bp). Elektroforesen stoppes før det hurtigst vandrende farvede bånd når enden af gelen. I forsøget benyttes brønd 1 til en DNA markør. Den indeholder lambda-DNA, som er klippet i kendte stykker, således at de enkelte bånd her kan relateres til DNA-fragmenter, hvis indhold af basepar er kendt. Markøren kan altså benyttes til størrelses bestemme DNA-fragmenter i de øvrige analyser. Efter elektroforesens afslutning farves de ellers usynlige DNA-holdige bånd og samtidig udvaskes markørbåndene. En agarosegel med DNA-fragmenter fra gerningsstedet og fra mistænkte kunne tage sig ud som vist på figur 2.

Figur 2: It is easy to see that the DNA taken from the crime scene and the DNA from S3 are

identical. You may want to point out how “strong” or “weak” this evidence is in convicting a suspect. The DNA evidence may place the suspect at the scene, but other evidence maybe needed to prove him or her guilty!

You may point out to your students that this is a simulation. In actual DNA fingerprinting,technicians analyze much larger segments of DNA and many more bands and lanes areproduced.

Reliability of DNA EvidenceTwo major factors affecting the reliability of DNA fingerprinting technology in forensics are

population genetics and genetic statistics. In humans there are thousands of RFLP loci or DNAsegments that can be selected and used for fingerprinting analysis. Depending on demographicfactors such as ethnicity or geographic isolation, some segments will show more variationthan others. In general one can assume that any two humans are 99.9% identical DNAsequence. Thus they will differ by only 1 bp in 1,000. It is necessary to examine areas thatdiffer to create a useful DNA fingerprint.

Some populations show much less variation in particular DNA segments than others.The degree of variation will affect the statistical odds of more than one individual havingthe same sequence. If 90% of a given population has the same frequency in its DNA fingerprinting pattern for a certain DNA segment, then very little information will be attained.But if the frequency of a DNA pattern turning up in a population for a particular segment isextremely low, then this segment can serve as a powerful tool to discriminate between individuals in that population. Different populations show different patterns in their genotypesdue to the contributions made to their individual gene pools over time.

Therefore, in analyzing how incriminating the DNA evidence is, one needs to ask thequestion:

“Statistically, how many people in a population have the same pattern as that takenfrom a crime scene: 1 in 1,000,000? 1 in 10,000? Or, 1 in 10?”

7

M CS S1 S2 S3 S4 S51 2 3 4 5 6 7 8

INS

TRU

CTO

R'S

MA

NU

AL

BA

CK

GR

OU

ND

Instructor’s Manual

M: Markør CS: Crime Scene S1, S2 osv. Suspect – dvs. mistækte nr. 1, 2 osv Forsøget består af tre trin skæring med restriktionsenzymer, - elektroforesen og farvningen, affarvning og tolkning -, som enten kan klares på forskellige dage eller i ét 90 minutters modul Case: Sumpskildpadder – ”Find skildpadden”

Baggrundshistorie for undersøgelsen.

Hov hvad er nu det. I august 1996 var der avisskriveri om fund af sumpskildpadder i Danmark. Det er vel ingen sensation, da der hver sommer berettes om fund af sumpskildpadder i den danske natur, og endda om skildpadder der har levet i naturen i over 10 år. Der har dog været bred enighed om at det var dyr undsluppet fra fangenskab, evt. udsatte af lillebror som pludselig blev mere interesseret i piger end i "padden". En skildpadde kan jo være et næsten livslangt bekendtskab, da de jo bliver gamle. Den europæiske sumpskildpadde (Emys orbicularis) har en nutidig naturlig udbredelse som vist her på kortet, men der findes lokale bestande måske underarter, som har meget lidt kontakt med andre populationer.

Balkan dyrene er således genetisk lidt afvigende fra de nordeuropæiske populationer, hvilket kan erkendes ved at underkaste populationerne genetiske undersøgelser. Det kunne være at klippe Dna-prøver med restriktionsenzym(er), og herefter udføre gel elektroforese på analyserne. Visse båndmønstre vil være konstante for de enkelte populationer, men variere i forhold til andre. Finder man således en sumpskildpadde i naturen, og foretager en sådan analyse på den, kan man ud fra båndmønstret se, hvilken population den stammer fra. De dyr der handles i dyrehandler er alle importeret eller efterkommere af sumpskildpadder fra Balkan området,

især Grækenland.

Den nordlige underart har tidligere levet i Danmark, idet den kendes fra 275 fundne individer i forskellige arkæologiske udgravninger. Den er indvandret i den såkaldte postglaciale varmetid for 8000‐9000 år siden, og var en del af den danske natur i ca. 6000 år. Her efter uddøde den, ikke på grund af efterstræbelse, men p.g.a. klimaforværring. Sumpskildpadder kan godt tåle de kolde vintre, da de graver sig ned og ligger i dvale, men hvis sommerens varmeste måneds gennemsnits temperatur bliver under 18°, kan deres æg ikke klækkes. Det forklarer også at der kan findes endda gamle udsatte sumpskildpadder i dagens Danmark. Det enkelte individ kan overleve, men forsøg på forplantning mislykkes. At dyrene har haft det fint i den danske natur ses også af at de fundne rygskjolde har været 14‐25 cm lange, hvilket er lige så meget som man finder længere syd på, så skildpaddens livskædes svageste led har oplagt været formeringen.

Nu kommer så naturvejleder Jan Kærgaard ved Silkeborg Statsskovdistrikt og siger, at der vist lever sumpskildpadder af den nordeuropæiske slags i Velling Igelsø, som ligger i tilknytning til Salten Å syd for Silkeborg, og endnu mere

Figur 1. Den europæiske sumpskildpaddes udbredelse i dag.

Figur 2. Fund af sumpskildpadder. Både mose- og bopladsfund.

Figur 3. Det intetanende centrum for undersøgelsen.

utroligt, at det måske drejer sig om en lokalt overlevende bestand, af den oprindelige danske stamme, som ellers har været regnet for uddød i 2000 år. Der var i hvert fald fanget et eksemplar som lignede den nordiske type i en åleruse. Hvordan kan så stort et dyr, der er fra 25-35 cm fra hoved til halespids leve upåagtet i et så tætbefolket land som vort i så lang tid? Det kan der gives flere forklaringer på. Sumpskildpadder holder mest til i stillestående vand som små søer, moser og sumpe med rig vegetation, svært fremkommelige steder. Dette skal så kombineres med at den er meget sky og forsigtig, så selvom den gerne ligger og soler sig på en sten o.l. glider den straks ned i vandet ved mindste forstyrrelse. Desuden er den nataktiv, og jager i døgnets mørke timer alt fra orme, snegle til fisk. Alligevel er det mærkeligt om den ikke skulle blive set en gang i mellem, om ikke andet så via dens aktiviteter, idet den når den spiser fisk æder alt undtagen de store knogler og svømmeblæren. Svømmeblæren burde kunne røbe den, da den flyder ovenpå vandet, så en løsgående svømmeblære burde signalere, at der er sumpskildpadder i nærheden. Det er da også sandsynligt at lokalbefolkninger kan have set disse dyr, men at videnskaben ikke er blevet orienteret om fundene. De nuværende fund er dog ikke de første indicier, idet det i 1942 blev foreslået af en professor R. Spärck at sumpskildpadder fundet i Sønderjylland kunne være sådanne efterkommere, da man vidste at der på det tidspunkt fandtes vildtlevende sumpskildpadder i Holsten. På daværende tidspunkt havde man ikke nutidens genetiske redskaber til rådighed, så konklusionen blev dengang at det var efterkommere af udsatte dyr. Interessant er det dog at forfatteren til Danmarks Dyreverden bd. 5. i afsnittet om Europæisk sumpskildpadde side 246-250 ikke udelukker, at der kan være overlevende lokale sumpskildpadde populationer i Danmark, selvom han dog ikke finder det sandsynligt. Nu er det der er brug for din hjælp. Vi har modtaget prøver af DNA fra sumpskildpadder fanget i Salten Å området, i Polen, Ukraine, Serbien og i Grækenland. Din opgave bliver at undersøge om de nyfundne skildpadder fra Salten Å er tæt beslægtet med disse, om de udgør en isoleret population, og om der evt. kan spores en tidlig indvandringsrute. Sikkerhed Ved elektroforese kræves der ofte spændinger på 100-150 V, hvilket betyder, at det er læreren, der er ansvarlig for selve kørslen. Under elektroforesen placeres apparaterne i et lokale, hvor eleverne ikke har adgang. Bemærkning: Alle nyere elektroforeseapparater er konstrueret således, at det ikke er muligt at komme til gelen eller elektroforesebufferen, når der er spænding på. Alligevel skal de særlige sikkerhedsforhold angående stærk strøm overholdes. Bær handsker, når gelen håndteres! Så afsætter du ikke selv DNA på gelen. Og bær handsker, når gelen farves – farven binder sig specielt til DNA Når gelerne støbes skal man være påpasselig for at undgå stødkogning! Opvarm kort tid ad gange i mikrobølgeovnen - ryst forsigtigt med mundingen vendt væk fra

kroppen, når den varme agar tages ud af mikroovnen - gentag flere gange indtil opløsningen er helt klar. Bær varmehandske Sørg altid for at elektroforeseapparaterne står på et fast bord, så der ikke kan rystes til systemet under prøvepåsætningen og under selve elektroforesen. Og sørg desuden for, at det hele står sikkert, så man ikke kan komme til at få fat i ledningerne eller andet, der rykker til systemet. Fast Blast er ufarlig, men man bør bære handsker ved omgang med farven

Elevvejledning Materialer -pr. gruppe Elektroforeseudstyr Enzymmix 80 µL Lambda skåret med HindIII Loading dye Mikropipetter 2-20 µL Pipettespidser Farvede mikrocentrifugerør Bøtte til affald Holder til mikrocentrifugerør Malertape Bøtte med is (knust is med lidt vand) Fælles materialer og udstyr Crime Scene (CS) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 1 (S1) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 2 (S2) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 3 (S3) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 4 (S4) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Mistænkt 5 (S5) DNA med buffer – frysetørret 1 glas Smeltet 1%agarose i 1xTAE-buffer TAE-buffer Vandbad 37 oC Mikrocentrifuge eller små bordcentrifuger (6000 rpm) Skæring med restriktionsenzym 1. Røret med enzymblandingen stilles på is 2. Mærk 6 farvede mikrocentrifugerør enten som anført i skema 1 (Find skildpadden) eller skema 2 (Find gerningsmanden) Skema 1:

Rør Mærke DNA fra Grøn S1 Salten 1 Blå S2 Salten 2

Orange P Polen Violet U Ukraine Rød G Grækenland Gul Se Serbien Grøn S1 Salten 1

Skema 2:

Rør Mærke DNA fra Grøn CS Gerningsstedet Blå M1 Mistænkt 1

Orange M2 Mistænkt 2 Violet M3 Mistænkt 3 Rød M4 Mistænkt 4 Gul M5 Mistænkt 5

3. Afpipetter 10 µL fra hver af DNA-stamprøverne og overfør til det tilsvarende mærkede rør. Husk at skifte pipettespids mellem hver prøve. Sørg for at prøverne placeres i bunden af rørene. 4. Afpipetter dernæst 10 µL enzymmix til hvert rør. Husk at skifte pipettespids ved hver prøve. Pipetter lidt op og ned for at blande godt 5. Luk rørene og bland yderligere ved at knipse på rørerne. Hvis du har mulighed for det centrifugeres til sidst kortvarigt for at samle alt i bunden af røret. Hvis der ikke kan centrifugeres bankes røret i bordet. 6. Inkuber rørene i 45 minutter ved 37oC eller natten over ved stuetemperatur i et kar med vand der ved starten var 37oC. Prøverne kan herefter opbevares i fryseren eller i køleskab. Hvis der umiddelbart skal fortsættes med elektroforesen, støbes gelerne nu

20

Lesson 1 Restriction Digestion

1. Place the tube containing the restric-tion enzyme mix, labeled ENZ, on ice.

2. Label one of each colored micro testtubes as follows:

green tube CS (crime scene)blue tube S1 (suspect 1)orange tube S2 (suspect 2)violet tube S3 (suspect 3)red tube S4 (suspect 4)yellow tube S5 (suspect 5)

Label the tubes with your name, date,and lab period. Place the tubes in thefoam micro test tube holder.

3. Using a fresh tip for each sample,pipet 10 µl of each DNA sample fromthe stock tubes and transfer to the corresponding colored micro testtubes. Make sure the sample is transferred to the bottom of the tubes.

4. Pipet 10 µl of enzyme mix (ENZ) intothe very bottom of each tube. Use afresh tip to transfer the ENZ sample to each tube. Pipet up and down carefully to mix well.

5. Tightly cap the tubes and mix the components by gently flicking the tubes with your finger. If a microcentrifuge is available, pulse-spin in the centrifuge to collect all theliquid in the bottom of the tube.Otherwise, gently tap the tube on the table top.

6. Place the tubes in the foam micro tubeholder and incubate for 45 min at 37°Cor overnight at room temperature in alarge volume of water heated to 37°C.

7. If required, follow the instructors directions to pour a 1% agarose gel.

8. After the incubation period, remove thetubes from the water bath and place inthe refrigerator until the next laboratoryperiod. If there is sufficient time to continue, proceed directly to step 2 ofLesson 2.

Forensic DNA Fingerprinting Kit Quick Guide

ENZ

CS S1 S2 S3 S4

Water bath

Ice

S4 S5

CS S1 S2 S3 S5S4Stock

DNA Samples +

Enzyme Mix

Flick TapQ

UIC

K G

UID

E

Student Manual

20













ENZ

CS S1 S2 S3 S4

Water bath

Ice

S4 S5


DNA Samples +

Enzyme Mix

Flick TapQ

UIC

K G

UID

E

Student Manual

20













ENZ

CS S1 S2 S3 S4

Water bath

Ice

S4 S5


DNA Samples +

Enzyme Mix

Flick Tap

QU

ICK

GU

IDE

Student Manual

Elektroforesen Støbning af geler:

• Forsegl enderne af gel-holderen enten med de tilhørende dele eller med malertape. Vær sikker på at tapen er tæt og glat. Sørg for at gel-holderen står vandret.

• Sæt kammen i ca. 2cm fra den ene ende. • Beregn hvor meget agaroseopløsning der skal bruges - bemærk gelen skal

være så tyk, at kammen når ca. 1-2 mm ned i gelen. • Fremstil en 1 % agaroseopløsningen ved at afveje fx 0,5g agarose i 50 mL

TAE buffer. Opvarm den i mikrobølgeovnen – lad den være i ovnen ca. 20 sekunder ad gangen indtil væsken er helt klar (og koger). Husk at låget skal sidde løst på mens flasken er i mikroovnen, så dampen kan komme ud.

• Lad den afkøle til ca. 60oC – dvs. så det er muligt at holde på flasken • Hæld den varme gel op i karret og lad den størkne i ca. 20 minutter. • Fjern forsigtigt kammen fra gelen ved at vippe den let frem og tilbage, mens

den løftes lodret op.

Man kan også vente med at tage kammen op til gelen er sat i apparatet og dække med buffer.

• Fjern støbeenderne/tapen. • Sæt gel-holderen med gelen i elektroforesekarret.

Klargøring af elektroforesen 7. Placer elektroforeseapparatet der hvor selve elektroforesen skal køre! Og sæt gel-holderen med gelen i apparatet 8. Fyld så meget TAE-buffer i, at gelen er dækket (1 x TAE-buffer).

9. Efter restriktionsskæringen af de 6 DNA-prøver samles rørenes indhold på bunden af rørene ved centrifugering eller ved at banke røret let mod bordoverfladen.

Lesson 2 Agarose Gel Electrophoresis (Laboratory Procedure)1. Obtain a prepoured agarose gel from your teacher, or if your teacher instructs you to do

so, prepare your own gel.

2. After preparing the gel, remove your digested samples from the refrigerator.

Using a new tip for each sample add 5 µl of sample loading dye "LD" to each tube:

DNA Samples Loading dyeCrime Scene [CS] 5 µl Suspect 1 [S1] 5 µl Suspect 2 [S2] 5 µl Suspect 3 [S3] 5 µl Suspect 4 [S4] 5 µl Suspect 5 [S5] 5 µl

Tightly cap each tube. Mix the components by gently flicking the tubes with your finger.If a centrifuge is available, pulse spin the tubes to bring the contents to the bottom of thetube. Otherwise, gently tap the tubes on the table top.

3. Place the casting tray with the solidified gel in it, into the platform in the gel box. Thewells should be at the (–) cathode end of the box, where the black lead is connected.Very carefully, remove the comb from the gel by pulling it straight up.

4. Pour ~ 275 ml of electrophoresis buffer into the electrophoresis chamber. Pour buffer inthe gel box until it just covers the wells of the gel by 1–2 mm.

5. Obtain the tube of HindIII lambda digest (DNA marker). The loading dye should alreadyhave been added by your instructor.

32

+–

CS S1 S2 S3 S4 FlickS5 Tap

Loading Dye

LDSTU

DE

NT M

AN

UA

LLE

SS

ON

2

Student Manual










32

+–


Loading Dye

LDSTU

DE

NT M

AN

UA

LLE

SS

ON

2

Student Manual

10 Tilsæt 5 mL farveblanding (LD = loading dye) til hvert rør, husk ny spids hver gang. Se figur under tilsætning af DNA og enzymmix øverst på denne side. 11. Luk rørene, knips for at blande og saml prøven på rørets bund som før. 12. Overfør nedenstående volumener af DNA-prøverne til hver sin brønd i gelen, husk en ny spids til hver prøve efter følgende skema.

Skema 1 (Skildpadde-case)

Brønd

Symbol Farve Volumen

1 M DNA, størrelsesmarkører

10 mL

2 Salten 1 Grøn 20 mL 3 Salten 2 Blå 20 mL 4 Polen Orange 20 mL 5 Ukraine Violet 20 mL 6 Grækenland Rød 20 mL 7 Serbien Gul 20 mL

Skema 2 (Find gerningsmanden)

Brønd

Symbol Farve Volumen

1 M DNA, størrelsesmarkører

10 mL

2 CS Grøn 20 mL 3 M1 Blå 20 mL 4 M2 Orange 20 mL 5 M3 Violet 20 mL 6 M4 Rød 20 mL 7 M5 Gul 20 mL










32

+–


Loading Dye

LDSTU

DE

NT M

AN

UA

LLE

SS

ON

2

Student Manual










32

+–


Loading Dye

LDSTU

DE

NT M

AN

UA

LLE

SS

ON

2

Student Manual










32

+–


Loading Dye

LDSTU

DE

NT M

AN

UA

LLE

SS

ON

2

Student Manual

6. Using a separate pipet tip for each sample, load your digested DNA samples into thegel. Gels are read from left to right. The first sample is loaded in the well at the left handcorner of the gel.

Lane 1: HindIII DNA size marker, clear tube, 10 µl

Lane 2: CS, green tube, 20 µl

Lane 3: S1, blue tube, 20 µl

Lane 4: S2, orange tube, 20 µl

Lane 5: S3, violet tube, 20 µl

Lane 6: S4, red tube, 20 µl

Lane 7: S5, yellow tube, 20 µl

7. Secure the lid on the gel box. The lid will attach to the base in only one orientation: redto red and black to black. Connect electrical leads to the power supply.

8. Turn on the power supply. Set it for 100 V and electrophorese the samples for at least30 min. The gel can be run for up to 40 min to improve resolution if the time is available.The Fast Gel Protocol in Appendix D allows the gel to be run in 20 min at 200 V.

While you are waiting for the gel to run, you may begin the review questions on thefollowing page.

9. When the electrophoresis is complete, turn off the power supply and remove the lidfrom the gel box. Carefully remove the gel tray and the gel from the electrophoresischamber. Be careful, the gel is very slippery! Proceed to pg 35 for detailed instructionson staining your gel.

33

+-

Student Manual

STU

DE

NT

MA

NU

AL

LES

SO

N 2

13. Sæt låget på elektroforesekarret og forbind ledningerne til strømforsyningen. 14. Tænd for strømforsyningen og kør gelen 30 minutter ved 150 V. Elektroforesen afbrydes under alle omstændigheder når den blå markørfarve er nået halvt op ad gelen, da en del DNA-bånd vandrer foran farvebåndet. 15 Tag forsigtigt gelbakken med gelen op og lad forsigtigt gelen glide over i farvekarret. Fortsæt med punkt 16 eller 16a 16. Hæld farve (1x Fast Blast DNA-farve) over gelen til den er dækket (ca. 60 ml). Læg låg (evt. husholdningsfilm) på farvekarret. Gelen skal farve natten over. Ryst let, hvis det er muligt. Bemærk: I mange tilfælde vil man kunne se båndene allerede efter 1-2 timer. 16.a Hæld farve (50x Fast Blast DNA-farve) over gelen til den er dækket. Vip forsigtigt med fare karret i 3 minutter. Hæld farven fra og skyl forsigtigt efter med lunkent postevand 4-5 gange. Båndene vil kunne ses efter 5-10 minutter

Affarvning og analyse af gelen 17. Hæld gelfarven i en flaske – kan genbruges -. Hæld vand på gelen til den er dækket, og affarv gelen i ca. 15 minutter. Skyl evt. en ekstra gang. Skylningen må under ingen omstændigheder stå natten over, da farven da udvaskes (båndene affarves). 18. Hæld vandet væk og opmål gelen. Gelen kan fotograferes eller tørres. Benyt eventuelt LoggerPro til at behandle resultatet

6. Using a separate pipet tip for each sample, load your digested DNA samples into thegel. Gels are read from left to right. The first sample is loaded in the well at the left handcorner of the gel.

Lane 1: HindIII DNA size marker, clear tube, 10 µl

Lane 2: CS, green tube, 20 µl

Lane 3: S1, blue tube, 20 µl

Lane 4: S2, orange tube, 20 µl

Lane 5: S3, violet tube, 20 µl

Lane 6: S4, red tube, 20 µl

Lane 7: S5, yellow tube, 20 µl

7. Secure the lid on the gel box. The lid will attach to the base in only one orientation: redto red and black to black. Connect electrical leads to the power supply.

8. Turn on the power supply. Set it for 100 V and electrophorese the samples for at least30 min. The gel can be run for up to 40 min to improve resolution if the time is available.The Fast Gel Protocol in Appendix D allows the gel to be run in 20 min at 200 V.

While you are waiting for the gel to run, you may begin the review questions on thefollowing page.

9. When the electrophoresis is complete, turn off the power supply and remove the lidfrom the gel box. Carefully remove the gel tray and the gel from the electrophoresischamber. Be careful, the gel is very slippery! Proceed to pg 35 for detailed instructionson staining your gel.

33

+-

Student Manual

STU

DE

NT

MA

NU

AL

LES

SO

N 2

Staining DNA with Fast Blast DNA Stain (Laboratory Procedure)

There are two protocols for using Fast Blast DNA stain in the classroom. Use option 1for quick staining of gels to visualize DNA bands in 12–15 minutes, and option 2 forovernight staining. Depending on the amount of time available, your teacher will decidewhich protocol to use. Two student teams will stain the gels per staining tray (you may wantto notch gel corners for identification). Mark staining trays with initials and class periodbefore beginning this activity.

WARNINGAlthough Fast Blast DNA stain is nontoxic and noncarcinogenic, latex or vinylgloves should be worn while handling the stain or stained gels to keep hands frombecoming stained blue. Lab coats or other protective clothing should be worn toavoid staining clothes.

Protocol 1: Quick Staining of Agarose Gels in 100x Fast Blast DNAStain

This protocol allows quick visualization of DNA bands in agarose gels within 15 minutes.For quick staining, Fast Blast DNA stain (500x) should be diluted to a 100x concentration.We recommend using 120 ml of 100x Fast Blast to stain two 7 x 7 cm or 7 x 10 cm agarosegels in individual staining trays provided in Bio-Rad's education kits. If alternative staining traysare used, add a sufficient volume of stainingsolution to completely submerge the gels.

Following electrophoresis, agarose gels must be removed from their gel trays beforebeing placed in the staining solution. This is easily accomplished by holding the base of thegel tray in one hand and gently pushing out the gel with the thumb of the other hand. Becausethe gel is fragile, special attention must be given when handling it. We highly recommendusing a large spatula or other supportive surfaceto transfer the gel from one container toanother. Destaining requires the use of at least one large-volume container, capable of holdingat least 500 ml, at each studentworkstation. Each student team may utilize separate washingcontainers for each wash step, or simply use a single container that is emptied after eachwash and refilled for the next wash.

1. Label the staining trays with your initials and class period. You will stain 2 gels per tray.

2. Stain gelsRemove each gel from the gel tray and carefully slide it into the staining tray. Pourapproximately 120 ml of 100x stain into the staining tray. If necessary, add more 100xstain to completely submerge the gels. Stain the gels for 2–3 minutes, but not for morethan 3 minutes. Using a funnel, pour the 100x stain into a storage bottle and save it forfuture use. The stain can be reused at least 7 times.

3. Rinse gelsTransfer the gels into a large container containing 500–700 ml of clean, warm(40–55°C) tap water. Gently shake the gel in the water for ~10 seconds to rinse.

36

2–3 minutes

10 seconds

STU

DE

NT M

AN

UA

LLE

SS

ON

2

Student Manual

Staining DNA with Fast Blast DNA Stain (Laboratory Procedure)

There are two protocols for using Fast Blast DNA stain in the classroom. Use option 1for quick staining of gels to visualize DNA bands in 12–15 minutes, and option 2 forovernight staining. Depending on the amount of time available, your teacher will decidewhich protocol to use. Two student teams will stain the gels per staining tray (you may wantto notch gel corners for identification). Mark staining trays with initials and class periodbefore beginning this activity.

WARNINGAlthough Fast Blast DNA stain is nontoxic and noncarcinogenic, latex or vinylgloves should be worn while handling the stain or stained gels to keep hands frombecoming stained blue. Lab coats or other protective clothing should be worn toavoid staining clothes.

Protocol 1: Quick Staining of Agarose Gels in 100x Fast Blast DNAStain

This protocol allows quick visualization of DNA bands in agarose gels within 15 minutes.For quick staining, Fast Blast DNA stain (500x) should be diluted to a 100x concentration.We recommend using 120 ml of 100x Fast Blast to stain two 7 x 7 cm or 7 x 10 cm agarosegels in individual staining trays provided in Bio-Rad's education kits. If alternative staining traysare used, add a sufficient volume of stainingsolution to completely submerge the gels.

Following electrophoresis, agarose gels must be removed from their gel trays beforebeing placed in the staining solution. This is easily accomplished by holding the base of thegel tray in one hand and gently pushing out the gel with the thumb of the other hand. Becausethe gel is fragile, special attention must be given when handling it. We highly recommendusing a large spatula or other supportive surfaceto transfer the gel from one container toanother. Destaining requires the use of at least one large-volume container, capable of holdingat least 500 ml, at each studentworkstation. Each student team may utilize separate washingcontainers for each wash step, or simply use a single container that is emptied after eachwash and refilled for the next wash.

1. Label the staining trays with your initials and class period. You will stain 2 gels per tray.

2. Stain gelsRemove each gel from the gel tray and carefully slide it into the staining tray. Pourapproximately 120 ml of 100x stain into the staining tray. If necessary, add more 100xstain to completely submerge the gels. Stain the gels for 2–3 minutes, but not for morethan 3 minutes. Using a funnel, pour the 100x stain into a storage bottle and save it forfuture use. The stain can be reused at least 7 times.

3. Rinse gelsTransfer the gels into a large container containing 500–700 ml of clean, warm(40–55°C) tap water. Gently shake the gel in the water for ~10 seconds to rinse.

36

2–3 minutes

10 seconds

STU

DE

NT M

AN

UA

LLE

SS

ON

2

Student Manual

Undersøgelse af geler fra elektroforese af DNA eller proteiner ved brug af LoggerPro software (Vernier) Formål: at analysere elektroforesen af DNA/proteiner og finde sammenhæng mellem vandringslængde og størrelsen. Fremgangsmåde: Gå ind i "insert" og importer et billede af en gel med farvede bånd. Billedet skal helst vise klare og tydelige bånd. Desuden skal der være påsat en standard med kendte størrelser af båndene.

1. Gå ind under "page" og klik ”auto arrange”. Nu vil billedet af gelen fint sidde ved siden af et

koordinatsystem med DNA/protein-størrelsen som funktion af vandringslængden 2. Ved siden af koordinatsystemet ses en bjælke med forskellige funktioner.

Først klikkes på den øverste knap og man kan sætte 0-linien, hvorfra man måler vandringslængden

3. Klik på næste knap og indstil skalaen ved at trække markøren fra 0-linien til det der svarer til 1 cm. Nu vil alle vandringslængder blive målt i cm.

4. Klik på tredie knap og indtast værdierne fra standarden. Dette gøres ved at

klikke på et af de kendte bånd og indtaste størrelsen på DNA'et/proteinerne i kb eller kDalton. Punktet bliver nu indsat på grafen, med logaritmen til størrelsen som funktion af vandringslængden.

5. Dette gøres for alle båndene i standarden, og der fremkommer en graf der i

forskellige områder er lineær.

6. Nu kan man bestemme båndlængde for alle de andre prøver ved at klikke

7. Klik nu på den fjerde knap og tilføj en prøve. (add lane!)

8. Dobbelt-klik på feltet over den søjlerne i regnearket for den nye prøve og indfør titel + evt. kb eller kD for størrelsen af båndene.

9. Nu kan denne procedure gentages for alle de andre prøver og man kan

sammenligne båndstørrelserne for de enkelte prøver. Opgaver og diskussion:

1. Tyd båndmønstret – Er ”vores skildpadder unikke eller er de blot udsatte stakler.

2. Søg de nyeste oplysninger på nettet om Salten Å skildpadderne, og kontroller om jeres hypoteser om oprindelsen passer med den nyeste viden. Diskuter jeres resultater i relation til oplysningerne I kan hente ud fra nettet.

3. Hvis restriktionsenzymerne ikke har fungeret, hvorledes ville gelen da se ud?

4. Jo større DNA stykket er, jo kortere vandrer

det i gelen. Det viser sig at hvis man i et koordinatsystem som y-akse afsætter logaritmen til antal basepar (log(bp)) og som x-akse sætter den afstand båndet har bevæget sig væk fra brønden, så får man er ret linie. (d.v.s ret linie ved afbildning på semilog-papir). Lambda DNA markøren i brønd 1 indeholder 6 DNA fragmenter med henholdsvis 23.130, 9.416, 6.556, 4.361, 2.322, 2.027. Udmål disse og lav ud fra disse en standardlinie på semilog. papir og bestem her ud fra størrelsen af DNA fragmenterne i de øvrige brønde. To DNA fragmenter med næsten identiske antal bp kan danne dobbeltbånd, som kan være svære at erkende som to bånd, men et sådant bånd vil ofte være bredere end de andre. Indsæt sammenhørende værdier af vandringsvej og bp i semilogaritmisk koordinatsystem (enkeltlogaritmisk), som vist på figuren her, og vis at de ligger på en ret linie. Bestem herefter størrelsen af DNAstykkerne i analysen.

5. Forestil jer to prøver med DNA, som er vist herunder.

a. Prøve 1:

6. CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTT 7. GTCACTAGAGCTTAAGCGATCATTGCAA

a. Prøve 2

8. TCATGAATTCCTGGAATCAGCAAATGCA 9. AGTACTTAAGGACCTTAGTCATTTACGT

Begge DNA stykker klippes med EcoRI. Hvad bliver resultatet? Forklar.

44

100

1,000

10,000

100,000

0 5 10 15 20 25 30

Distance, mm

Size

, bas

e pa

irsSemilog Graph Paper

STU

DE

NT M

AN

UA

LP

OS

T-LAB

AC

TIVITY

Student Manual

Lærerens forberedelser Forberedelse til DNA Fingerprint – lærerens fornøjelser. Forberedelsestiden tager ca. 45 minutter Kittet rækker til 8 hold. Hvis der er færre hold kan man nedfryse de opløste enzymer og DNA portioner til senere brug. . Opløs DNA prøverne i 200 µL sterilt vand (er med i sættet) og opbevar dem i køleskab – ca. 1 time før brug. De 6 flasker med DNA-prøver går på skift fra hold til hold, som så tager hver deres portion. Lad flaskerne rotere samlet i en holder. Opløs restriktionsenzymblandingen i 750 µL sterilt vand. Blandingen skal stå på is i mindst 5 minutter og ideelt ca. 20 minutter før brug og ikke over 12 timer før. Overfør 80 µL af den opløste enzymblanding til 1,5 mL mikrocentrifugerør mærket enz i et antal, der svarer til antallet af hold (max 8). Optø og omryst Loading Dye, opbevares ved stuetemperatur og omrystes før brug. Forbered lambda-DNA-markøren: Optøs og omrystes før brug. Opbevares i køleskab. Fremstil TAE bufferen. Opbevares ved stuetemperatur. Der kræves ca. 275 mL pr elektroforesekammer ved brug af Mini-Sub Cell GT System, samt ca 60-75 mL til støbning af en gel. Regn med ca. 350 mL pr hold. TAE-bufferen er 50x koncentreret. Der benyttes 20 mL 50x TAE til at fremstille 1 L 1xTAE-buffer Støbning af geler:

• Forsegl enderne af gel-holderen enten med de tilhørende dele eller med malertape. Vær sikker på at tapen er tæt og glat. Sørg for at gel-holderen står vandret.

• Sæt kammen i ca. 2cm fra den ene ende. • Beregn hvor meget agaroseopløsning der skal bruges - bemærk gelen skal

være så tyk, at kammen når ca. 1-2 mm ned i gelen. • Fremstil en 1 % agaroseopløsningen ved at afveje fx 0,5g agarose i 50 mL

TAE buffer*. Opvarm den i mikrobølgeovnen – lad den være i ovnen ca. 20 sekunder ad gangen indtil væsken er helt klar (og koger). Husk at låget skal sidde løst på mens flasken er i mikroovnen, så dampen kan komme ud.

• Lad den afkøle til ca. 60oC – dvs. så det er muligt at holde på flasken • Hæld den varme gel op i karret og lad den størkne i ca. 20 minutter. • Fjern forsigtigt kammen fra gelen ved at vippe den let frem og tilbage, mens

den løftes lodret op. Tænd vandbadet ved 37° . Fremstilling af Fast Blast farve (1x): 1mL af 500x Fast Blast fortyndes med 499 mL deioniseret vand. Benyt handsker

Documents

Forensic DNA Fingerprinting Kit Find skildpadden