UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE NICARAGUA, León FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE FARMACIA

FOLLETO DE ANÁLISIS

INSTRUMENTAL

UV-vis

MSc. Azucena Montenegro Reyes.

León, Septiembre de 2014

INTRODUCCIÓN

Los métodos que utiliza la Química Analítica para la caracterización de la materia suelen clasificarse en: Químicos e Instrumentales.

Los métodos químicos están basados en interacciones materia-materia, esto es, en reacciones químicas. El analito se determina por medidas gravimétricas o volumétricas. Los métodos instrumentales basados en interacciones materia-energía, utilizan un instrumento más o menos complejo para evaluar una propiedad física o físico-química del sistema objeto de análisis.

Un método analítico se considera físico cuando no incluye reacción química alguna, y la operación de medida no modifica la composición química del sistema.

Los métodos de análisis pueden clasificarse de acuerdo a la propiedad que miden en:

1. Cualitativos los que de la medida de una propiedad se puede indicar la presencia de un analito en una matriz.

2. Cuantitativos la magnitud de la propiedad medida es proporcional a la concentración del analito en la matriz. Frecuentemente, el mismo método instrumental es usado para el análisis cualitativo y cuantitativo.

De acuerdo al tamaño de la muestra los métodos se clasifican en:

Método Peso de muestra (mg) Volumen de muestra (ml)

Macroanálisis > 100 > 10Semimicroanálisis 10 - 100 1 - 10Microanálisis 1 - 10 0,1 - 1Ultramicroanálisis < 1 < 0,1

Técnicas espectrofotométricas más utilizadas en análisis

Propiedad utilizada TécnicaEmisión de Radiación Espectroscopia de emisión – Luminiscencia:

Fluorescencia, FosforescenciaAbsorción de Radiación Espectroscopia de Absorción -

Espectrofotometría, Fotometría Resonancia magnética nuclearResonancia de espín electrónico

Difracción de la Radiación Difracción de Rayos X, Difracción de electrones

Rotación de la Radiación Polarimetría, Dicroísmo circularCorriente Eléctrica Voltametría: amperometría, polarografíaRelación masa/carga Espectrometría de MasasRadioactividad Activación neutrónica, dilución isotópica

La espectrofotometría uv- visible, surge a partir del conocimiento del campo electromagnético, la técnica se basa en hacer incidir un haz de luz en la muestra, esto provoca la excitación de las partículas, en este momento, los electrones saltan de un estado de energía a otro mayor, dentro de los orbitales cuánticos que rodean la molécula. Es por esto que este fenómeno está muy relacionado con otros tales como la fluorescencia y luminiscencia.

La técnica indica la composición de la muestra, en función de los cambios energéticos, esta técnica no solo es cualitativa, sino que también es cuantitativa, ya que su función es medir la luz que sale, es posible bajo la longitud de onda adecuada y habiendo preparado antes una curva de calibración conocer la concentración exacta de una sustancia por medio de una extrapolación matemática usando el método de mínimos cuadrados, o bien una regresión lineal.

Aplicaciones Cuantitativas a especies absorbentes y no absorbentes

Especies absorbentes: son compuestos orgánicos que contienen grupos cromóforos y especies inorgánicas como los metales de transición

Especies no absorbentes: los analitos que reaccionan con un reactivo para producir un compuesto absorbente

Grupos cromóforos: grupo atómico presente en una molécula que lleva asociada una banda electrónica, C=O, C=C, N=N

Grupos auxocromos: grupos que no producen banda de absorción, pero intensifican la banda de los grupos cromóforos, C-Br, C-OH

Clasificación de las especies absorbentes:

Especies que Contienen electrones π, σ y n Especies que contienen electrones d y f Especies que contienen electrones de transferencia de carga

A). Absorción por compuestos orgánicos

La absorción de radiación por moléculas orgánicas en la región de de 180 a 750nm se origina por la interacción de los fotones y aquellos electrones que o bien participan directamente en el enlace y están, por tanto, asociados a más de un átomo, o bien están localizados sobre átomos tales como O, S, N, X.

Los electrones implicados en dobles o triples enlaces de moléculas orgánicas no están tan fuertemente retenidos, y son, por tanto, más fácilmente excitados por la radiación. Así pues las especies con enlaces múltiples (dobles o triples) generalmente presentan unos máximos de absorción útiles.

Los electrones no compartidos en elementos como S, Br, I, etc., están retenidos menos fuertemente que el par de electrones de un enlace saturado. Como consecuencia de ello, las moléculas orgánicas que contienen esos elementos presentan con frecuencia picos de absorción útiles en la región UV.

En conclusión, dos tipos de e- son responsables de que las moléculas absorban radiación UV-Vis:

e- compartidos que participan directamente en la formación de enlaces y que están asociados a más de un átomo.

e- externos no compartidos, localizados preferentemente entorno a átomos como O, S, N y halógenos.(e situados en orbitales no enlazantes n)

B). Absorción por compuestos inorgánicos

Los espectros presentan máximos de absorción anchos y poca estructura fina. En general los iones y complejos de las dos primeras series de transición absorben radiación VIS al menos en uno de sus estados de oxidación y son, en consecuencia, coloreados. Aquí, la absorción supone transiciones entre “orbitales d” ocupados y libres. Las diferencias de energía entre estos orbitales d (y, por tanto, la posición del correspondiente pico de absorción) dependen de la posición del elemento en el sistema periódico, su estado de oxidación y la naturaleza del ligando al que está unido.

C). Absorción por transferencia de carga

La absorción por transferencia de carga es de gran importancia desde el punto de vista analítico, ya que las de los máximos de transferencia de carga se encuentran entre las mayores observadas en espectroscopia (>10.000). Estas proporcionan por tanto sensibilidades altas. Muchos complejos presentan este tipo de absorción y se conocen como complejos de transferencia de carga. Estos complejos, contienen generalmente un grupo dador de electrones, y uno aceptor dentro del complejo. La absorción de radiación implica la transición de un electrón desde el grupo dador al aceptor. El estado excitado es, por tanto, el resultado de un proceso de oxidación-reducción interno.Ejemplos comunes son los complejos de tiocianato, el complejo de Fe(II) con o-fenantrolina y el complejo de ferrocianuro férrico responsable del color azul Prusia.

Teoría de orbitales moleculares

Cuando se combinan dos orbitales atómicos se origina un orbital molecular enlazante de baja energía (e- en estado fundamental) y un orbital molecular antienlazante de alta energía.

a) Orbitales moleculares asociados con enlaces sencillos: orbitales sigma σ

b) Orbitales moleculares asociados con enlaces dobles: orbitales sigma σ, orbitales π

c) Electrones que no participan en ningún enlace: electrones n

La región entre 200 y 400 nm, llamada Ultravioleta cercana, es de gran utilidad en la determinación estructural de insaturación conjugada, aromaticidad o de ciertos grupos insaturados con pares electrónicos libres (carbonilo, nitro, etc.), sin presentar los serios inconvenientes del Ultravioleta de vacío. Se requieren materiales ópticos de cuarzo si se quiere acceder a la zona de longitudes de onda inferiores a 350nm, mientras que el vidrio es utilizable en el resto de la región Ultravioleta cercana y toda la región visible.

La región Visible, de 400 hasta cerca de 800 nm, es la única del espectro electromagnético a la que es sensible el ojo humano. Las bandas de absorción presentes en esta zona corresponden a transiciones electrónicas de muy baja energía. Todos los compuestos coloreados absorben selectivamente en esta región. Los compuestos fuertemente conjugados y ciertos complejos de metales de transición absorben significativamente en la región visible.Ciertas transiciones electrónicas pueden presentarse a longitudes de onda superiores a 800 nm pero estas no son comunes en los compuestos orgánicos.

Limitaciones de la Ley de Beer

a) Limitaciones propias de la Ley de Beer.

Solo es aplicable a soluciones diluídas (<10-2M) (Interacciones entre iones o moléculas afectan la absorción de radiación, provocando variación del índice de refracción).

b) Desviaciones químicas debido a la asociación o disociación del analito.

Cuando un analito se disocia, se asocia o reacciona con el disolvente para dar un producto con espectro de absorción diferente al del analito se producen desviaciones de la ley de Beer. (desviación positiva o negativa).

HIn ⇔H + + In− Ka = 1,34 x 10-5

color 1 color 2

La siguiente tabla muestra el desplazamiento del equilibrio motivado por la dilución. Solución no tamponadaSolución

HIn, M x 10-5 [HIn] x 105 [In-] x 105 % disociado A 430 A5702,00 0.88 1.12 56 % 0.236 0.0734,00 2.22 1.78 44.5% 0.381 0.1758,00 5.27 2.73 43.1% 0.596 0.40112,00 8.52 3.48 29 % 0.771 0.64016,00 11.9 4.11 25.7 % 0.922 0.887

A medida que la concentración aumenta la disociación es menor dando una curvatura positiva a 570 nm.

c) Desviaciones instrumentales:

1) Por radiación policromática. Cuando la medición de absorbancia se efectúa con radiación compuesta por diversas longitudes de onda, la absorbancia es una combinación dada por las absortividades diferentes a cada longitud de onda. Figura 7-6

2) Por radiación parásita. Desviación aparente de la ley de Beer por diversas cantidades de radiación parásita(o difusa)

Radiación parásita o difusa: Cualquier radiación que llega al detector, pero que no sigue la vía óptica entre la fuente y el detector. La radiación parásita limita la Absorbancia máxima de respuesta lineal, ya que cuando la Absorbancia es alta la

potencia radiante que llega al detector se vuelve pequeña, similar o menor al nivel de luz parásita.

La señal analítica puede dividirse en dos partes, una causada por el analito y la otra por los demás componentes de la matriz de la muestra y por la instrumentación utilizada en la medición. Esta última parte de la señal se conoce como ruido.

Por esta razón para describir la calidad de un método analítico o el funcionamiento de un instrumento, la relación señal/ruido es un parámetro de calidad mucho mejor que el ruido solo. La capacidad de un sistema para discriminar entre señales y ruido se expresa, usualmente como la relación señal ruido

Como norma general la detección cierta de una señal mediante un sistema visual resulta imposible cuando S/N < 2 ó 3.

Un aumento en la relación S/N generalmente indica una reducción del ruido y, por tanto, una medición más deseable.

ERROR INSTRUMENTAL EN FUNCIÓN DE LA TRANSMITANCIA

Se ha visto que la incertidumbre en la medida espectrofotométrica de la concentración varía en forma no lineal con la magnitud de la transmitancia.

error relativo= X - Xt * 100 % C * 100

Xt C

El error relativo en la concentración para una medida espectrofotométrica está dada por la siguiente expresión:

C = 0.434 T T= error fotométrico (incertidumbre absoluta C T log T para la transmitancia, ej 0.5% T)

Ejercicio. Calcular el error relativo en concentración porcentual para mediciones con absorbancias de: 0,125 (74,9 %T); 0,434 (36,8 %T) y 0,900 (12,5%T), suponiendo que existe una incertidumbre fotométrica instrumental de un 1 %.

C = 0.434 T C = 0.434 * 0.01 = -0.046 = 4.6% C T log T C 0.749 log 0.749

R: 4.6% ; 2.7% ; 3.8%

En Conclusión se elegirá un rango de concentraciones de trabajo tal que la transmitancia se mantenga en el rango 20%T – 70%T (0,7A -0,15A)

Determinaciones simultáneas o análisis multicomponente.

Es posible el análisis de varias especies absorbentes presentes en una muestra sin llevar a cabo separaciones previas de cada uno de los analitos, aprovechando el hecho de cada sustancia posee características espectrales diferentes. En el análisis simultáneo se aplica el principio de aditividad de las absorbancias o propiedad aditiva de la absorbancia:

A = Ai = A1 + A2 +......An = ( 1 ) bC1 + ( 2) bC2 +....+ ( n) bCn

La anterior ecuación, indica que la absorbancia total medida a una longitud de onda, es igual a la suma de las absorbancias de los componentes individuales y, que el aporte de cada componente a la absorbancia total es función del valor del coeficiente de absortividad molar de cada especie absorbente (y de la concentración) para una longitud de onda dada. Es decir, en un sistema con varias especies absorbentes de la misma concentración si se mide la absorbancia a una longitud de onda determinada, la especie que presentara una mayor contribución a la absorbancia total será la que presente mayor valor del coeficiente de absortividad molar.

Para una mezcla con n componentes absorbentes es posible establecer la concentración de ellos si se plantean, mínimo, n ecuaciones de aditividad para n longitudes de onda. Para el caso de una solución que contiene dos especies absorbentes a y b se escogerán como mínimo dos longitudes de onda, para la medida de la absorbancia total de la mezcla y se plantearan las ecuaciones:

A 1 mezcla = (Aa ) 1 + (Ab ) 1 = ( a ) 1 b Ca + ( b) 1bCb

A 2 mezcla = (Aa ) 2 + (A b ) 2 = ( a ) 2bCa + ( b) 2bCb

Los valores de A1mezcla y A2mezcla se miden experimentalmente, los cuatro coeficientes de absortividad molar a cada longitud de onda se obtienen de curvas de calibración preparadas con patrones de cada componente o de las curvas espectrales y Ca y Cb son las incógnitas.

Como se conocen las concentraciones de los patrones es posible entonces calcular la concentración de los dos componentes.

Para tres componentes se plantean como mínimo tres ecuaciones y se resuelven por matrices.

Si las medidas siempre fueran perfectas, podrían obtenerse resultados exactos incluso para mezclas de componentes con espectros muy similares. Sin embargo siempre hay errores en las medidas que pueden afectar significativamente a la exactitud de los resultados si los espectros están muy solapados.

La figura 1. muestra una mezcla simulada de dos componentes sin solapamiento de los espectros en los máximos

A

En contraste, la Figura 2 muestra una mezcla simulada de dos componentes con un solapamiento significativo de los espectros, en los máximos de absorbancia.

A

Para una mezcla de x e y donde cx = cy = 1, las absorbancias medidas deberían ser:

Con poco solapamiento espectral Con solapamiento espectral

A’(x + y) = 1.1 + 0.0 = 1.1 A’(x + y) = 0.6 + 0.5 = 1.1

A’’(x + y) = 0.0 + 0.9 = 0.9 A’’(x + y) = 0.4 + 0.5 = 0.9

Si ocurre un error del 10 % en la medida de A’ (x + y) y A’’ (x + y), es decir, A’ (x + y) = 0.99 (- 10 %) y A’’(x + y) = 0.99 (+ 10 %), el cálculo cuantitativo da lugar a los resultados mostrados en la Tabla 2:

Tabla 2. Comparación de los resultados de análisis multicomponente para ejemplos con poco y sustancial solapamiento espectral

Poco solapamiento Mucho solapamientoComponente Concentración

nominalConcentración calculada

% error Concentración calculada

% error

x 1 0.9 - 10% 0 -100 %y 1 1.1 +10% 1.98 + 98 %

Cuando se lleva a cabo un análisis multicomponente o simultáneo se deben tener en cuenta varias condiciones:

- Los componentes no deben presentar interacciones químicas entre sí ni con el solvente, es decir, las absorbancias deben ser aditivas si cada especie en la mezcla se comporta en forma independiente.

- Si los espectros de los componentes tienen una gran similitud el análisis será más difícil e inexacto.

- La selección de las longitudes de onda analíticas óptimas es el parámetro crítico para obtener buenos resultados. Se debe evitar escoger longitudes de onda de análisis en las zonas donde dA / d l es grande (flancos de las bandas espectrales). En las regiones de absorción máxima y mínima, en cambio dA / d l es pequeño.

- Generalmente se escogen longitudes de onda donde un componente presente absorción alta mientras el otro componente, a dicha longitud de onda, presente una absorción mínima o no absorba.

- No se deben tomar medidas de absorbancias muy bajas o muy altas puesto que disminuye la exactitud del método.

EjercicioSe pueden determinar las concentraciones de una mezcla de Fe+3 y Cu+2 formando el complejo con hexacianorutenato (II), Ru(CN)6-4, que forma un

complejo de color azul- violáceo con el Fe+3 ( λmax = 550 nm) y un complejo gris pálido con el Cobre (λmax = 396 nm). Las absortividades molares de los complejos de metal se resumen en la tabla siguiente:

ε 550 ε 396Fe +3 9970 84Cu+2 34 856

Cuando una muestra que contiene Fe+3 y Cu+2 se analiza en una cubeta de 1 cm de paso óptico la absorbancia a 550 nm fue de 0,183 y la absorbancia a 396 nm fue de 0,109. ¿Cuál es la concentración molar de Fe +3 y Cu+2 en la muestra?

a 550 nm : 0,183 = 9970 CFe + 34 CCu a 396 nm : 0,109 = 84 CFe + 856 CCu

Despejamos C Cu en la primera ecuación CCu = 0.183 – 9970 C Fe 34 y sustituimos en la segunda

0,109 = 84· CFe + 856 0,183 −9970·CFe 34

= 4,607−(251x105 )·CFe

Despejando: CFe = 1,80 x 10 -5M ; CCu = 1,26 x 10-4 M

Cuantificación indirecta. Derivatización química

Debido a que muchos compuestos exhiben débil o ninguna absorbancia en las regiones UV o visible, se han desarrollado varios métodos con derivatización química. Tales métodos, normalmente implican el añadir un reactivo orgánico, que forma un complejo con fuerte absortividad. La etapa final de medida es prácticamente igual que la de los métodos directos. Con esta técnica, la elección apropiada del reactivo puede mejorar significativamente tanto la sensibilidad como la selectividad.Valoraciones espectrofotométricas

En análisis volumétricos, el cambio de color que señala el final de una valoración normalmente se detecta visualmente. Este proceso es inherentemente subjetivo y puede ser una fuente de error. El uso de un espectrofotómetro para detectar el final, introduce la objetividad y la automatización en el análisis

Elección de un método analítico

Un primer paso que debe preceder al método analítico, es una definición clara del problema analítico. El método de trabajo seleccionado depende de la respuesta a las siguientes cuestiones:

El Intervalo de concentración de trabajo Qué grado de exactitud se requiere Qué otros componentes hay en la muestra Qué propiedades físico-químicas tiene la muestra Cuantas muestras se analizan

Características de los métodos espectrofotométricos UV-Vis.

Amplia aplicabilidad Elevada sensibilidad: los límites detección 10-4 a 10-5 M. Selectividad de moderada a alta. Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso menores. Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas. Se prestan a una fácil automatización.

Interferencias

Idealmente, la absorbancia que ocurre durante las medidas UV-visible tiene que deberse sólo al analito de interés. Sin embargo, en la práctica, a menudo aparecen absorbancias que interfieren con las medidas, por razones químicas o físicas.

La presencia de cualquier compuesto que absorba en la misma región que el de interés, resultará en un error en la medida de absorbancia. A veces, sólo está presente un único compuesto absorbente conocido, por ejemplo un subproducto de la síntesis de un compuesto farmacéutico.En otros casos, múltiples especies absorbentes, muchas de ellas conocidas (por ejemplo, muestras biológicas como sangre), pueden causar una ancha absorción matriz.Un problema de los análisis farmacéuticos y biológicos es la dispersión, causada por las partículas suspendidas en disolución. En análisis farmacéuticos, estas partículas suelen ser los excipientes o rellenos utilizados en las formulaciones de las tabletas o cápsulas. La dispersión de radiación resulta en una absorbancia aparente de fondo que interfiere con las medidas de absorbancia. Filtrar las muestras antes de las medidas elimina la dispersión, pero no siempre es practicable y a menudo, el analista trabaja con espectros que incluyen este problema.

La dispersión causa una absorbancia aparente debida a que la luz, en lugar de pasar a través de la disolución hasta el detector, se dispersa con cierto ángulo. Por lo tanto, incluso si no hay absorción, menos luz alcanza el detector.

Muestra transparente

Muestra con dispersión

En la parte UV-visible del espectro, pueden observarse dos tipos de dispersión. La dispersión Rayleigh ocurre cuando las partículas son pequeñas relativamente a la longitud de onda de la luz y es inversamente proporcional a la cuarta potencia de λ. La dispersión Tyndall ocurre cuando las partículas son grandes relativamente a la longitud de onda de la luz y es inversamente proporcional al cuadrado de λ.

Dispersión Tyndall Dispersión Rayleigh A

λ

La magnitud del efecto de dispersión puede reducirse colocando la muestra lo más cerca posible del detector. Sin embargo, con una dispersión significativa, se pierde luz y la sensibilidad y la exactitud del análisis cuantitativo se ven seriamente comprometidas

Técnicas de corrección

Pueden utilizarse varias técnicas para eliminar o reducir los errores de interferencia. En general, si el origen del error es conocido y reproducible entre muestras, puede eliminarse. Por el contrario, si el origen es desconocido y varía de muestra a muestra, el error puede reducirse pero no eliminarse. Las técnicas de corrección siempre requieren datos de al menos dos longitudes de onda. Las técnicas más sofisticadas requieren datos multilongitud de onda o espectrales.

1. Isoabsorbancia

Cuando está presente un componente interferente de espectro conocido, puede

eliminarse el error introducido por este compuesto a la longitud de onda analítica, seleccionando una longitud de onda de referencia a la que la interferencia exhiba la misma absorbancia que a la longitud de onda analítica. La absorbancia a esta longitud de onda de referencia se resta de la absorbancia a la longitud de onda analítica, Figura 3. La absorbancia residual es la absorbancia real del analito.

Esta técnica es menos fiable cuando los espectros del analito y de la interferencia son muy similares. Además, permite corregir sólo una interferencia.

Figura 3. Espectro del analito Espectro interferente Espectro medido

A

λ

2. Análisis multicomponente

Una extensión de la isoabsorbancia es el análisis multicomponente, aquí, deben medirse como patrones los espectros de las interferencias. Esta técnica puede aplicarse con éxito cuando los espectros se solapan de manera considerable y cuando hay presente más de un compuesto interferente.

3. Modelar el fondo

Modelar el fondo es apropiado cuando la interferencia se debe a un proceso físico (frecuentemente, dispersión) en la que la interferencia a la longitud de onda analítica puede estimarse por extrapolación a partir del modelo en otro rango de λ. Se selecciona una parte del espectro donde la absorbancia aparente se debe sólo a la interferencia. Entonces, se ajusta un polinomio a esta parte del espectro utilizando un ajuste por mínimos cuadrados al logaritmo de la absorbancia:A = aλn

log(A) = log(a) + nlog(λ)

donde A es absorbancia, λ es longitud de onda, n es el orden de la relación entre absorbancia y longitud de onda y a es una constante. La absorbancia de fondo al resto de las longitudes de onda puede estimarse utilizando los coeficientes determinados por el ajuste. Estos valores se restan de los valores medidos, para obtener las absorbancias debidas al analito, Figura 4.

Espectro medido

Espectro extrapolado de dispersión

A

λ

4. Referencia interna

Una de las técnicas más simples de corrección es la referencia interna, que utiliza una sola longitud de onda de referencia. Este método se suele utilizar cuando aparece deriva de la línea de base entre medidas En general, es mejor elegir una longitud de onda de referencia lo más cerca posible de la longitud de onda analítica, pero sin absorbancia significativa del analito. La absorbancia a la longitud de onda de referencia se resta de la de la longitud de onda analítica. Se corrige cualquier interferencia constante a todas las longitudes de onda, Figura 50. Aunque en la práctica las interferencias no suelen ser constantes a todas las longitudes de onda, esta simple técnica a menudo da lugar a sorprendentes mejoras en la exactitud. Figura 5

Espectro a Espectro b

A

λ

Corrección de tres puntos La corrección de tres puntos, o Morton-Stubbs, utiliza dos longitudes de onda de referencia, normalmente aquellas a los lados de la

longitud de onda analítica. Se estima entonces la absorbancia interferente de fondo a la longitud de onda analítica, usando interpolación lineal (Figura 6).Este método representa una mejora sobre la técnica de referencia a una λ, porque corrige cualquier absorbancia de fondo que exhiba una relación lineal con la longitud de onda. En muchos casos, si el rango de longitud de onda es estrecho, será una corrección razonable para absorbancias de fondo no lineales, como la resultante de la dispersión o de una matriz compleja. Figura 6

Espectro medido

A

λ

Parámetros instrumentales

1. Resolución espectral.

La resolución espectral es una medida de la capacidad de un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de onda adyacentes. Dos λ se consideran resueltas, normalmente, si el mínimo entre los dos picos de la señal de salida del detector es menor que el 80 % del máximo. Esto se conoce como el criterio Rayleigh. La Figura 7 muestra esquemáticamente un caso para dos líneas de emisión adyacentes (la entrada al instrumento) y la señal actual que es la salida del detector.

Intensidad Señal de salida del detector

Longitud de onda Longitud de onda

La resolución está muy relacionada con la anchura de banda espectral instrumental (SBW). La SBW se define como la anchura, a la mitad de su intensidad máxima, de la banda de luz que sale del monocromador (Figura 8). Absorbancia

SBW Longitud de NBW onda

La exactitud de cualquier absorbancia medida depende de la relación de la SBW a la anchura de banda natural (NBW) de la sustancia absorbente. La NBW es la anchura de la banda de absorción de la muestra a la mitad de su máximo de absorción (Figura 9)

Una relación SBW/NBW de 0.1 o menos, dará lugar a una medida de absorbancia con una exactitud del 99.5 % o mejor. A una relación SBW/NBW mayor de 0.1, el espectro medido se distorsiona progresivamente, como se muestra en la Figura 10 Las bandas no pueden resolverse correctamente y ocurrirán errores significativos en los valores de absorbancia, a la mayoría de las longitudes de onda. SBW es principalmente una función de las anchuras de las rendijas de entrada y salida del monocromador y de la dispersión generada por la red de difracción. No son inusuales resoluciones de 0.5, 0.2 y 0.1 nm, pero mayores resoluciones pueden causar un considerable deterioro de la relación S/N.

A

λ

En la práctica, es mejor fijar el intervalo de muestreo a un valor igual o más pequeño que la SBW

2. Exactitud y precisión de longitud de onda

La exactitud de longitud de onda es importante para comparar medidas realizadas en diferentes instrumentos. Sin embargo, en la mayoría de los análisis UV-visible las medidas se realizan en el mismo instrumento relativamente a un patrón y, la precisón de longitud de onda (es decir, la repetitividad) es más importante.La Figura 11 muestra el efecto de una pobre repetitividad de longitud de onda. Si se selecciona una λ en el máximo de absorción para medidas cuantitativas, los pequeños errores que ocurran al reprogramar el espectrofotómetro a esa longitud de onda, tendrán un mínimo efecto sobre la absorbancia medida. Este método da lugar a los resultados cuantitativos más reproducibles. Por otro lado, elegir una longitud de onda en un lateral de la banda de absorción, con el mismo error al reprogramar λ, resultará en errores significativos en la absorbancia medida. En este caso, no serán fiables los resultados cuantitativos.

Error 0.0 UA

A Error 0.1 UA(10%)

λ Figura 11

3. Exactitud y precisión fotométrica

Suponiendo un buen diseño óptico y electrónico, sólo dos factores influyen en la exactitud y precisión fotométrica: a) la luz dispersa y b) el ruido.

a) La luz dispersa se define como aquella luz detectada de cualquier longitud de onda, que cae fuera de la anchura de banda de la longitud de onda seleccionada.

La ecuación utilizada para calcular la transmitancia y, por lo tanto, laabsorbancia, es: T = (I +Is ) ⁄ (Io + Is)

donde T es la transmitancia, Io es la intensidad de la luz incidente, I es la intensidad de la luz transmitida e Is es la intensidad de la luz dispersa.La intensidad de la luz dispersa, normalmente, no depende de la luz transmitida. Si Is es prácticamente constante, se convierte en el término dominante a bajos niveles de I. A elevada absorción, la luz dispersa causa un hábito negativo en la respuesta del instrumento y, eventualmente, es el factor limitante para la absorbancia y, por lo tanto, para la concentración que pueda ser medida. Por lo tanto, se ve comprometida la exactitud fotométrica del instrumento.La Figura 12. muestra el efecto de varios niveles de luz dispersa sobre la absorbancia medida, comparada con la absorbancia actual.

0.00% Luz dispersa 0.01 % Luz dispersa 0.1 % Luz dispersa 1.0% Luz dispersa

A medida

A real

b) Ruido. Un espectrofotómetro, típicamente, tiene dos factores de ruido. El primero (ruido fotónico o Schott) resulta de la distribución estadística de los fotones emitidos por una fuente de luz. Es proporcional a la raiz cuadrada de laintensidad de luz. Cuando se miden muestras de baja concentración con bajas absorbancias, este factor puede evitar una medida exacta de la pequeña diferencia entre dos niveles de luz. El segundo factor es inherente a la electrónica del instrumento (amplificador del detector, convertidor analógico-digital, etc.) y es independiente de la intensidad medida. Este factor se convierte en significativo a altos niveles de absorbancia, donde la señal de muestra es muy pequeña. Puede minimizarse mediante un buen diseño.El ruido afecta negativamente a la precisión de las medidas y, para una medida sola, puede introducir también errores en la exactitud. Sin embargo, el ruido puede reducirse aumentando el tiempo de medida.

c) Deriva. Otra causa potencial de error fotométrico es la deriva. Esta normalmente resulta de variaciones de la intensidad de la lámpara entre las medidas de Io y la de I. Los cambios en la electrónica del instrumento también pueden causar deriva. Un buen diseño instrumental puede minimizar la deriva, pero este efecto puede reducir la exactitud de los resultados, especialmente en un periodo prolongado de tiempo (Figura 13).

Error

A

λDesarrollo y Validación del método

La validación y la cualificación son vocablos que tendían a confundirse, la cualificación se refiere esencialmente al funcionamiento de la maquinaria, equipos y aparatos de laboratorio, de los cuales se ha de demostrar experimental y documentalmente que funcionan de acuerdo con el uso previsto.

La validación se refiere a procesos, sistemas y métodos y supone establecer una evidencia documentada de que un proceso se realiza y produce un producto que está dentro de las especificaciones predeterminadas. Finalmente, cabe destacar la definición de validación promulgada por las autoridades oficiales de la FDA: “Validación es la obtención de pruebas, con arreglo a las Normas de Correcta Fabricación, de que cualquier procedimiento, proceso, material, actividad o sistema produce el resultado previsto”.

Por otra parte, también en el laboratorio analítico, validación, cualificación y calibración son conceptos que se suelen emplear indistintamente por el personal, sin embargo, conceptualmente son diferentes.

Validar: comprobar y demostrar que un método o proceso cumple la función prevista

Cualificar: verificar o dotar a un aparato de las cualidades o características para que pueda cumplir su función

Calibrar: verificar mediante patrones la cualificación de un aparato.

Protocolo de validación: plan experimental prospectivo que cuando se ejecuta como se propone produce evidencia documentada de que el sistema ha sido validado. Hay muchas herramientas que pueden utilizarse como parte de una validación: cartas de control, estudios de capacidad, diseño de experimentos, análisis de tolerancias, diseño de métodos robustos, análisis modal de fallos y efectos, planes de muestreo y pruebas de fallos.

Validación analítica: Parámetros

Por validación analítica se entiende “la obtención de pruebas (adecuadamente documentadas) que demuestren que un método de análisis es lo suficientemente fiable para asegurar que el resultado obtenido corresponde a la realidad”. Las características de fiabilidad son las que demuestran la capacidad de un método analítico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de validación; junto a éstas cabe destacar las características de practicabilidad o facilidad de llevar a cabo el método, así como las pruebas de idoneidad.

Según la Conferencia Internacional de Armonización ICH los criterios fundamentales de la validación analítica incluyen el cálculo de la precisión, la exactitud, los límites de detección y cuantificación, la selectividad, la linealidad y el

intervalo de análisis, aunque no necesariamente son aplicables a todos los casos de análisis y dependerá de si se analiza sólo materias primas, productos acabados o impurezas.Mientras que el desarrollo del método implica la selección de parámetros y condiciones específicos, la validación se utiliza para confirmar que las características de rendimiento del método están de acuerdo con la aplicación pretendida de los estudios del laboratorio.

1. Linealidad

Es la capacidad del método para producir resultados proporcionales, directamente o mediante una transformación matemática, a la concentración del analito en las muestras, dentro de un determinado rango. En las medidas UV-visible, la relación lineal más usual es la ley de Beer, que indica que la absorbancia de un soluto es directamente proporcional a su concentración. A = kc El valor medido de absorbancia dividido por la concentración, es la pendiente Para construir una curva de calibración, deben medirse los espectros de un grupo de, al menos, tres disoluciones patrón del analito. Las concentraciones de los patrones deben “encerrar” el rango de concentración esperado de las muestras de análisis. Idealmente, todos los valores patrón medidos deben estar sobre una línea recta, pero en la práctica, los valores siempre presentan cierta dispersión(Figura 14 y 15). Debe aplicarse un método estadístico para encontrar el mejor ajuste de los datos a la curva de calibración y, en una segunda etapa, para determinar qué tipo de curva de calibración da lugar al mejor ajuste. El método estadístico más frecuente es la regresión lineal, que también se conoce como el método de mínimos cuadrados.

A A

C CPara comparar dos curvas de calibración, se requiere medir la bondad del ajuste de los patrones. Varios valores estadísticos, como el coeficiente de correlación, el error estándar de regresión y la incertidumbre, pueden usarse para esta medida. De estos, el coeficiente de correlación es el más popular. Este valor siempre está entre + 1 y - 1. Un valor + 1 indica una relación lineal perfecta entre absorbancia yconcentración, siendo A creciente. Un valor - 1 también indica una relación lineal perfecta, con A decreciente. El valor 0 indica que no hay correlación entre absorbancia y concentración.

2. Exactitud

La exactitud de un método analítico es “la capacidad para obtener resultados próximos al verdadero”.

La exactitud es una medida del rigor del método analítico y refleja los posibles errores sistemáticos del método. Se expresa como el porcentaje de recuperación de una cantidad de “analito” añadida a la muestra, tanto a niveles superiores como inferiores a la concentración que se espera en la muestra. Para comprobar que el método tiene una exactitud adecuada se aplica la fórmula, derivada de la aplicación del análisis estadístico paramétrico de t de Student:

texperimetnal = (|100-R|· √n ) / s

3. Precisión

La precisión de un método analítico es el “grado de acuerdo entre los resultados individuales de un ensayo, cuando éste se realiza repetidamente sobre una muestra homogénea, comenzándolo desde el principio”.

La precisión es una medida de grado de repetibilidad del método analítico, realizado en condiciones normales y refleja el error aleatorio del método. Se expresa como la desviación típica o coeficiente de variación (desviación típica relativa), del método repetido un mínimo de 6 veces (suele considerarse suficiente).

a) Repetibilidad

Precisión del método bajo condiciones idénticas: mismo analista, mismo equipo, mismos reactivos y cortos espacios de tiempo.

Se llama repetibilidad instrumental a la precisión (CV%) que daría una misma muestra analizada repetidas y consecutivas veces.

Se llama repetibilidad del método a la precisión (CV%) de muestras de concentraciones diferentes, analizadas varias y consecutivamente.

b) Precisión intermedia

Precisión de las variaciones dentro de un laboratorio: distintos analistas, distintos equipos o distintos días.

c) Reproducibilidad

1. Precisión en condiciones completamente diferentes de analistas, instrumentación, reactivos, laboratorios y días de análisis

4. Sensibilidad

Se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad de analito y, a menudo, se indica mediante dos factores analíticos: el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ).El LOD es la concentración más baja del analito que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada, en matrices de muestra. En general, el LOD es el punto al que la señal del analito es igual a tres veces el ruido de la medida. El LOD es, aproximadamente, tres veces la desviación estándar.El LOQ es la concentración más baja del analito que puede determinarse con una precisión y exactitud aceptables, en matrices de muestra. Para calcular el LOQ, deben definirse los límites aceptables de precisión y exactitud (que dependen de los objetivos del análisis).A menudo se supone que la longitud de onda con la máxima absorbancia da lugar a la mejor sensibilidad. Sin embargo, como el ruido instrumental puede variar significativamente con la longitud de onda, esto no siempre es necesariamente cierto.

5. Rango

Rango es el intervalo entre (e incluidos) los niveles superior e inferior del analito, que han sido calculados con la precisión, exactitud y linealidad requeridos. El rango se determina analizando primero, muestras que contengan distintas concentraciones del analito y, a continuación, utilizando las herramientas descritaspara calcular la linealidad, precisión y exactitud de los resultados.

6. Selectividad

Selectividad es la capacidad de un método para cuantificar con exactitud y específicamente al analito o analitos, en presencia de otros compuestos.

La presencia de cualquier otro compuesto que absorba a la longitud de onda utilizada para cuantificar el analito, resultará en un error cuantitativo. Estos otros compuestos pueden ser precursores de la síntesis, impurezas conocidas, excipientes o productos de degradación de la matriz. Si el tipo de interferencia es conocido, la persona que desarrolla el método puede examinar los espectros del analito y de la interferencia, para seleccionar una longitud de onda a la que el analito tenga una absorbancia significativa pero a la que sea pequeña la de la interferencia. Si la elección de λ no evita lo suficiente el efecto de la interferencia, puede aplicarse una técnica de corrección apropiada, como el usode una longitud de onda de isoabsorbancia.

7. Robustez

Es el grado de reproducibilidad de los resultados de test, obtenidos analizando las mismas muestras bajo varias condiciones normales de test. El método no debe afectarse por cambios de tiempo o lugar.La reproducibilidad del método debe establecerse en varias condiciones, por ejemplo con diferentes lotes de reactivos, a diferentes temperaturas y con diferentes tiempos de prueba.

La robustez de un método analítico se determina analizando submuestras de una muestra homogénea, en diferentes laboratorios y con equipos distintos.

Requisitos instrumentales

En el desarrollo de un método analítico, son valiosos los datos espectrales completos, aunque no esenciales, para la evaluación de todas las opciones posibles. La reproducibilidad de longitud de onda del instrumento también debe ser excelente para no restringir la elección de la longitud o longitudes de onda. Un espectrofotómetro que mide automáticamente espectros múltiples y calcula los valores medio y de desviación estándar para cada absorbancia, puede mejorar la productividad en gran medida. Finalmente, el software instrumental debe ser capaz de procesar una gran cantidad de datos y utilizar las herramientas estadísticas apropiadas. Los cálculos manuales o la transferencia de los datos desde el espectrofotómetro a otras aplicaciones para su evaluación, limitan seriamente la productividad.

Parámetros de validación: requerimientos

Según la finalidad de los análisis, hay que considerar unos parámetros de validación u otros. Según la Comisión Internacional de Armonización, estos son los que se muestran en el cuadro 3:

TIPO DE ANÁLISIS IDENTIFICACIÓNIMPUREZAS

CUANTIFICACIÓNCUANTIF IDENTIF

EXACTITUD - SI - SIREPRODUCIBILIDADREPETIBILIDAD - SI - SIPRECISIÓN

- SI (1) - SI (1)INTERMEDIAESPECIFICIDAD SI SI SI SILÍMITE DETECCIÓN - - SI -LÍMITE

- SI - -CUANTIFICACIÓNLINEALIDAD - SI - SIINTERVALO - SI - SI

(1) Si se comprueba la reproducibilidad, la precisión intermedia no es necesaria.

Aplicaciones analíticas cuantitativas.

La Espectroscopia Ultravioleta-Visible es un método de profusa aplicación en la determinación cuantitativa de sustancias. Por su sensibilidad, bajo costo de los espectrofotómetros, la selectividad, rapidez y precisión, los métodos analíticos basados en la utilización de la ley de Lambert-Beer tienen una gran difusión en los laboratorios de control de procesos industriales y de análisis clínico.

El cumplimiento de la relación lineal entre absorbancia y concentración dada por dicha ley depende de determinadas condiciones que deben satisfacerse:

1. En la solución no deben presentarse equilibrios que dependan de la concentración de las especies. Es decir, la ley de Lambert-Beer es una ley límite válida solo para soluciones diluidas.

2. Debe utilizarse luz monocromática. Esta condición puede considerarse satisfecha cuando la anchura espectral de radiación que abandona el monocromador sea sensiblemente menor que la anchura media de las bandas de absorción a utilizar.

3. Los errores en la determinación de absorbancia son aceptables en el rango 0.2-1.0, tal como se muestra a continuación, siendo recomendable trabajar en el rango 0.3-0.8. En los equipos más modernos, la precisión fotométrica que se alcanza permite extender los límites antes mencionados.

La determinación de la concentración de numerosos productos en solución mediante la espectroscopia UV solo está limitada por la necesaria absorción en esta región de la especie a determinar. Ejemplos típicos son la determinación de ácidos insaturados como el sórbico y el úrico, la serotonina, el triptófano y sus metabolitos, las clorofilas, muchos alcaloides, las vitaminas A, B2, C y B12, la tiamina, los carotenos. En las proteínas es común determinar el contenido de tirosina y triptófano (aminoácidos con residuo aromático) por medio de la absorción en UV y utilizar esta absorción para la detección de proteínas o péptidos. También es posible desarrollar determinaciones de compuestos que no absorben en el UV por transformación cuantitativa de los mismos es especies absorbentes. Así la adrenalina se puede determinar como adenocromo a λ = 529 nm por su reacción con el yodo.

La técnica puede utilizarse en el análisis de mezclas siempre y cuando las sustancias posean espectros apreciablemente diferentes.

Si una mezcla contiene dos sustancias (1 y 2) que absorben ambas en la región UV-Vis y no es posible seleccionar longitudes de onda para las absorbancias independientes de cada una de ellas, pueden determinarse las concentraciones de ambas sustancias, partiendo de la aditividad de las absorbancias.

Estudio de los iones complejos

1. Método de variaciones continuas o método de Job

Este método fue propuesto inicialmente por Job para complejos 1:1, posteriormente Vosburgh y Cooper mostraron que era válido para relaciones mayores. Considerando la reacción:

M + nL Û MLn, en la que el complejo MLn es la especie absorbente (o es coloreado) y M y L no absorben (o son incoloros) a la longitud de onda de absorción del complejo, la metodología experimental seguida consiste en la preparación de soluciones de M y L de la misma concentración. Con dichas soluciones se prepara una serie de disoluciones en las que la concentración total de M + L se mantiene constante pero la relación de M a L es variable. Se mide la absorbancia de cada una de las disoluciones preparadas, a la longitud de onda escogida ( λ MAX o λ  ANALITICA) según el espectro del complejo.

La gráfica presentará un máximo en la fracción molar que corresponde a la composición del complejo formado. Así un máximo para la fracción molar de L igual a 0.5 indicará un complejo 1:1; un máximo para XL = 0.67 representa un complejo 1:2. La deducción exacta de la relación molar por este método no puede hacerse cuando la relación L: M es mayor que 4:1 (XL = 0.80) pues los datos no son suficientemente exactos como para distinguir esta composición de la de 5:1 (XL = 0.83).

Si se forma más de un complejo, cada uno con un espectro de absorción característico, las medidas a diferentes longitudes de onda-l que será el máximo de absorción o la longitud de onda analítica de cada complejo, producirán curvas de variaciones continuas para cada complejo, que permitirán hallar la composición estequiométrica de cada uno.

Si la formación del complejo no es cuantitativa cuando se emplean cantidades estequiométricas de M y L es decir, si el complejo esta disociado, la representación de la absorbancia frente a la fracción molar no da un máximo agudo, sino que se presenta una curvatura y cuanto más intensa esta curvatura más extensa es la disociación del complejo, representando los valores de absorbancia, de esta zona, concentraciones en equilibrio del complejo, ecuación 5.

En este caso para determinar la composición del complejo, se recurre a la extrapolación de los primeros y últimos tramos de la gráfica (donde la disociación se ha suprimido debido al gran exceso de uno de los dos reactivos) para localizar la posición que corresponde a la composición del complejo. La intersección de los dos segmentos de recta corresponde al punto estequiométrico y el valor de absorbancia correspondiente a dicho punto se designa como absorbancia máxima, AMAX, valor que se utiliza para calcular el coeficiente de absortividad molar del complejo.

Cálculo de la constante: Los puntos o datos correspondientes a la curvatura de la gráfica se utilizan para el cálculo de la constante de formación. Si en la gráfica de variaciones continuas no se obtiene curvatura, es decir si el complejo presenta

una disociación despreciable, no es posible el cálculo de la constante de formación a partir de dichos datos.

Como a partir de AMAX se calcula e COMPLEJO , conociendo este valor y los valores de absorbancia de la zona curva de la grafica de variaciones continuas- que representan concentraciones en equilibrio- es posible hallar por la ley de Beer la concentración del complejo en equilibrio. Para cada punto de la gráfica se conoce la concentración inicial de M y L adicionados y por tanto se puede calcular las concentraciones del ion metalico y del ligando en el equilibrio, para el posterior calculo de la constante de formación con la ecuación 6. Para:

M + nLÛ MLn  ( 5)

[MLn ]eq = AMLn / b e MLn  (7)

( tomando absorbancias de la zona curva de la gráfica)

Meq = [ M]INICIAL - [ MLn ]eq  (8)

L eq = [ L ]INICIAL - n [MLn ]eq  (9)

y reemplazando en (6) se obtiene el valor de la constante.

2. Método de Relación Molar

Tomando la reacción M + nLÛ MLn donde solamente el complejo es la especie absorbente, Yoe demostró, que si un complejo esta muy poco disociado, la representación gráfica de la absorbancia del complejo frente a la relación molar entre la concentración del ligando y el metal, L/M , en series de soluciones preparadas de manera que la concentración del metal,[M], permanece constante y la concentración del ligando es variable,[L], da origen a una línea recta desde el origen de coordenadas, hasta el punto que corresponde a la relación estequiométrica del complejo formado, punto a partir del cual cambia la pendiente y se alcanza una absorbancia constante a medida que aumenta la relación L/M. 

Si el complejo en solución esta disociado en forma apreciable<, aparece en la gráfica una curvatura considerable en las cercanías de la relación molar que corresponde al punto estequiométrico. En este caso se extrapolan los segmentos rectos de la gráfica y el punto de intersección corresponde al punto estequiométrico, que indica la relación de moles del ligando a metal o composición del complejo. El valor de absorbancia correspondiente a la extrapolación de los valores de absorbancia constante en la gráfica, será AMAXIMA y a partir de este valor se calcula el coeficiente de absortividad molar del complejo.

Inicialmente, el método de relación molar se consideró aplicable únicamente a sistemas en los que se formara un solo complejo. Sin embargo, si se forma más

de un complejo y ellos tienen diferentes características de absorción y diferentes constantes de formación las medidas a diferentes longitudes de onda pueden revelar su presencia; igualmente si a una longitud de onda hay cambios significativos en la pendiente de la curva, indica la presencia de complejos diferentes.

Calculo de la constante: Los puntos o datos correspondientes a la curvatura de la gráfica se utilizan para el cálculo de la constante de formación . Conocido el valor de e COMPLEJO y los valores de absorbancia de la zona curva de la gráfica de relación molar - que representan concentraciones en equilibrio- se halla por la ley de Beer la concentración del complejo en equilibrio. Para cada punto de la gráfica se conoce la concentración inicial de M, que en este método es constante, y de L adicionados y por tanto se puede calcular las concentraciones del ion metálico y del ligando en el equilibrio, con las ecuaciones 7, 8 y 9 y la ecuación 6, dadas en el método de variaciones continuas se calcula la constante.

En los dos métodos tratados, los valores de absorbancia utilizados para el cálculo de la constante deben encontrarse entre 0.7-0.9 AMAXIMA , si los valores son muy cercanos a AMAXIMA , se presenta gran incertidumbre en las diferencias que se realizan para el calculo de M y L en equilibrio y se cometen errores apreciables en el cálculo de la constante.

3. Método de Relación de Pendientes

Considerando la reacción:

xM + yL Û MX LY  (10)

y suponiendo que se forma un sólo complejo que constituye la especie absorbente. Se prepara una serie de soluciones en las que se mantiene constante la concentración del ligando, L, (concentración en exceso con relación al metal para que evite la disociación del complejo) y se varia la concentración del metal, M, utilizando pequeños incrementos de M. Bajo estas condiciones la concentración del complejo [MXLY ] formado, en cada solución, es proporcional a la concentración analítica del metal [M] añadido, puesto que todo el metal va a reaccionar ya que hay exceso de ligando, entonces:

[MXLY ] = C METAL / x, donde x representa el número de moles de M que reaccionan.

Una gráfica de absorbancia del complejo vs la concentración del metal [M] origina una recta de pendiente m X. De la misma forma si se prepara una serie de soluciones donde [M] es constante y grande y se varia la concentración del ligando[L] con pequeños incrementos de éste, entonces la concentración del complejo formado será:

[MXLY ] = C LIGANDO / y, donde y representa el número de moles de L que reaccionan.

Una gráfica de absorbancia del complejo vs la concentración del ligando [L] origina una recta de pendiente m Y. La relación de las pendientes de las dos gráficas m X / m Y da la relación de moles del ligando a moles del metal y / x, permitiendo obtener la composición del complejo. Este método es útil para hallar la composición de complejos que presentan en solución gran disociación y el método de relación molar o variaciones continuas originan grandes curvaturas, que conducen a errores muy grandes en la extrapolación y ambigüedades en la composición.

Instrumentación de los espectrofotómetros UV-Vis.

Espectrofotómetro

Es un instrumento para medir la transmitancia o absorbancia de una muestra, en función de la longitud de onda de la radiación electromagnética. Los componentes clave de un espectrofotómetro, son:

a) una fuente que genera una banda ancha de radiación electromagnéticab) un dispositivo de dispersión que selecciona una longitud de onda particular

(o más correctamente, una banda de ondas) de la radiación de la fuentec) un área de muestrad) uno o más detectores para medir la intensidad de la radiación

Fuentes:

La fuente ideal de luz sería aquella que generara una intensidad constante a todas las longitudes de onda, con bajo ruido y gran estabilidad. Sin embargo, estas fuentes no existen. Las fuentes utilizadas, comúnmente, en los espectrofotómetros UV-visible son: la lámpara de deuterio (tiempo de vida media 1,000 hrs y la lámpara halógena de wolframio (tiempo de vida media 10,000 hrs. La mayoría de los espectrofotómetros utilizados para medir el rango UV-visible contienen ambos tipos de lámparas. En estos instrumentos, se utiliza un selector de fuente para cambiar de lámpara según corresponda, o se mezcla la luz procedente de las dos fuentes para dar lugar a una sola banda ancha.

Dispositivo de dispersión:

En los espectrofotómetros UV-visible, comúnmente se utilizan dos dispositivos de dispersión, prismas y redes holográficas de difracción,

La mayoría de los espectrofotómetros modernos contienen redes holográficas en lugar de prismas. Estos dispositivos son de cristal, en los que se realizan hendiduras muy estrechas. Las dimensiones de las hendiduras son del mismo orden que las longitudes de onda de la luz que se va dispersar.

Detector:

Un detector convierte una señal de luz en una señal eléctrica. Idealmente, debe ofrecer una respuesta lineal en un amplio rango, con bajo ruido y alta sensibilidad. Normalmente, los espectrofotómetros contienen un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo, como detector.

Espectrofotómetro convencional

La Figura 16 muestra un esquema de un espectrofotómetro convencional de haz simple. La luz policromática de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un monocromador, que transmite selectivamente una estrecha banda de luz. Esta luz, entonces, atraviesa el área de muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el detector cuando no hay muestra (el blanco) y comparándola con la intensidad de la luz que alcanza el detector después de atravesar la muestra.

Muestra

Monocromador Detector

Rendija de salida

Dispositivo de dispersión

Fuente Rendija de entrada

Este diseño es el adecuado para medir la absorbancia en un solo punto del espectro. Es menos apropiado, sin embargo, para medir diferentes compuestos a diferentes longitudes de onda o para obtener espectros de muestras.

Espectrofotómetro de diodos

La Figura 17. muestra un diagrama esquemático de un espectrofotómetro de diodos. La luz policromática de una fuente atraviesa el área de muestra y es enfocada en la rendija de entrada del policromador. Este dispersa la luz sobre una matriz de diodos, en la que cada diodo mide una banda estrecha del espectro. La anchura de banda de la luz detectada por un diodo está relacionada con el tamaño de la rendija de entrada del policromador y con el tamaño del diodo. Cada diodo, realiza la misma función que la rendija de salida de un monocromador

Matriz de diodos

Policromador

Dispositivo de dispersión

Rendija de entrada Fuente Muestra

Para minimizar posibles reacciones fotoquímicas, se utiliza un obturador para bloquear la luz de la fuente hasta que pueda realizarse una medida. Cuando la medida se inicia, el obturador se abre automáticamente y la luz pasa a través de la muestra hasta la matriz de diodos. Se mide la diferencia entre las intensidades de luz que alcanzan el detector con y sin muestra.

Tanto los espectrofotómetros convencionales como los de diodos son de haz simple. Los instrumentos de haz simple son de bajo costo y el sencillo sistema óptico ofrece alto rendimiento y, por consiguiente, alta sensibilidad.

En un espectrofotómetro convencional de haz simple (figura 18), el blanco y la muestra se miden consecutivamente, con un intervalo de varios segundos para una medida a una longitud de onda y hasta de varios minutos en una medida de un espectro completo. Las variaciones de la lámpara pueden dar lugar a errores significativos en intervalos largos de tiempo.

Obturador

Lente Lámpara de Wolframio

Muestra Lámpara de Lente Deuterio

Rendija

Red Matriz de diodos

Espectrofotómetro de haz simple

El espectrofotómetro de doble haz (figura 19.) fue desarrollado para compensar los cambios de intensidad de la lámpara entre las medidas de blanco y muestra. En esta configuración, se coloca un chópper en el paso óptico, cercano a la fuente. El chópper hace que al detector llegue intermitentemente la luz de referencia y la luz que atraviesa la muestra. Gira a una velocidad tal que las medidas alternas de blanco y muestra ocurren varias veces por segundo, corrigiendo, por lo tanto, los cambios a medio y largo plazo de la intensidad de la lámpara (deriva).

Monocromador

Rendija de salida

Dispositivo de Referencia dispersión Rendija Fuente de entrada Chópper Detector

Muestra

Espectrofotómetro de doble haz

Comparado con los diseños de haz simple, los instrumentos de doble haz contienen más componentes ópticos, lo que reduce el rendimiento y la sensibilidad. Para obtener alta sensibilidad, pueden requerirse largos tiempos de medida. Además, el diseño mecánico más complejo del espectrofotómetro de

doble haz, puede resultar en una menor fiabilidad. Los instrumentos de haz simple ofrecen mayor sensibilidad y más facilidad de uso

Test y los parámetros de aceptación.

a) Exactitud y precisión de longitud de onda

La exactitud de longitud de onda es el criterio de rendimiento más importante para diferenciar espectros, cuando se miden en instrumentos distintos. También es importante en el análisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de extinción o factores. Debido a que estos factores dependen de la longitud de onda, las medidas deben realizarse a exactamente la misma λ a la que los factores se determinaron originalmente. Cuando se comparan espectros o valores de absorbancia medidos en el mismo instrumento (como en la mayoría de los análisis cuantitativos en los que se mide un patrón), sin embargo, la precisión de longitud de onda es el parámetro crítico. Para medir la exactitud y precisión de longitud de onda, se requiere un patrón de referencia. Idealmente, este patrón debería tener picos bien definidos y muy estrechos, a una serie de longitudes de onda a lo largo de los rangos UV y visible. Este patrón ideal no existe, aunque algunos se aproximan.

b) Exactitud y precisión fotométrica

La exactitud fotométrica es el criterio más importante para el análisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de extinción o factores. Sin embargo, para medidasComparativas, la precisión fotométrica es el parámetro crítico.Es necesario un patrón de referencia para medir la exactitud y la precisión fotométrica. Idealmente, este patrón tendría absorbancia constante a todas las longitudes de onda a lo largo de los rangos UV y visible, pero los patrones utilizados, típicamente, tienen picos anchos y valles.

c) Luz dispersa.

La luz dispersa es el factor que más afecta a la relación lineal entre la absorbancia y la concentración a absorbancias elevadas. Introduce una predisposición sistemática a menores absorbancias en concentracionescrecientes. Para medir la luz dispersa, es necesario un filtro. Idealmente, este filtro absorbería toda la luz de la longitud de onda a la que se va a realizar la medida y transmitiría las longitudes de onda superiores o inferiores. En la práctica, sin embargo, este filtro no existe. En su lugar se utilizan filtros de corte que transmiten toda la luz por

encima o por debajo de una determinada longitud de onda y que bloquean toda la luz en un rango particular de λ

d) Resolución

La resolución es un factor crítico en la determinación de la forma de los picos. En general, la resolución instrumental debe ser aproximadamente 10 veces mejor que la anchura de banda del pico medido. Si la resolución instrumental no es suficiente, la absorbancia medida en el máximo de longitud de onda será demasiado baja. Por consiguiente, la exactitud fotométrica tiene una predisposición sistemática. Esta predisposición juega un papel clave si es esencial la exactitud absoluta pero, como se trata en “Resolución espectral” es menos importante para medidas relativas como las de cuantificación.Medir la resolución es difícil y, a menudo, se utilizan métodos empíricos como la medida de alturas relativas de picos y valles, para una muestra con una banda estrecha

e) Ruido

El ruido es el factor principal que afecta a la precisión de las medidas de absorbancia. Es especialmente significativo a bajas absorbancias, a las que suele determinarse el límite de detección. El ruido se mide, normalmente, a absorbancia cero, es decir, sin muestra en el paso de luz.

f) Estabilidad

La estabilidad afecta a la exactitud de las medidas de absorbancia en función del tiempo. La deriva de las medidas de absorbancia introduce errores sistemáticos enla exactitud fotométrica. La estabilidad se mide, normalmente, a absorbancia cero.

g) Linealidad

La linealidad a menudo se considera importante para verificar el rendimiento. Pero debido a que depende mucho de la muestra, creemos que se mide mejor durante un test de idoneidad del sistema, como se describe posteriormente.El problema principal en la verificación del rendimiento es que todos los parámetros listados anteriormente dependen de la longitud de onda y, en el caso de la luz dispersa, de la muestra. Como no es práctico realizar todos los tests a todas las λ, deben seleccionarse algunas representativas para el propósito pretendido. Los resultados de estos tests deben compararse con las especificaciones absolutas de rendimiento para los métodos en uso. La verificación demostrará, entonces, eficazmente, si las características de rendimiento han cambiado de manera que pudiera afectar ala bondad de los resultados analíticos.

Cumplir los criterios anteriores (determinados utilizando patrones de referencia) no garantiza, sin embargo, que un deteminado análisis pueda realizarse con la exactitud y linealidad requeridas. Debido a que muchos parámetros dependen de la muestra, la exactitud y linealidad deseadas sólo pueden lograrse con un test apropiado de idoneidad del sistema, realizado sobre la propia muestra.