1

Fluoreszcencia spektroszkópia

2014. február 04-06.

PTE ÁOK Biofizikai Intézet

Huber Tamás

Biofizika szeminárium

A fény: elektromágneses hullám

2

Elekt

romágn

ese

s sp

ektr

um

Lumineszcencia: gerjesztett állapotú rendszer fény kibocsátása.

Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia

Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük.

3

A lumineszcencia típusai

1. Kemilumineszcencia

• olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő

energia adott kémiai reakció során felszabaduló

energiából adódik

pl.: foszfor (P) oxidáció útján való világítása

• alkalmas anyagcsere folyamatok vizsgálatára

• kis intenzitású

• fiziológiás viszonyoktól függő

Kemilumineszcencia - Fotolumineszcencia

4

Biolumineszcencia: a kemilumineszcencia egyik típusa, amikor a gerjesztő energiát biztosító kémiai reakció élő organizmusban játszódik le. pl.: szentjánosbogár, mélytengeri halak, medúzák, polipok, baktériumok, planktonok

1. A luciferáz katalizálja a luciferin oxidációját.

2. Inaktív oxyluciferin és fény (h ) keletkezik.

3. A további luciferin a táplálékból vagy belső szintézisből pótlódik.

2. Fotolumineszcencia • olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott hullámhosszú (frekvenciájú, energiájú) fény besugárzásából adódik • alkalmas molekuláris rendszerek vizsgálatára, mert jelentős információt hordoz a molekula tulajdonságairól, kölcsönhatásairól, környezetével való kapcsolatáról

Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek • két típusa: fluoreszcencia, foszforeszcencia

5

Jablonski-féle termséma

http://www.olympusmicro.com/primer/java/jablonski/jabintro/

Kasha-szabály bizonyítéka: Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik.

Alap és gerjesztett állapot természetétől függően:

Fluoreszcencia: a molekula

szingulett gerjesztett állapotból relaxálódik a szingulett alapállapotba

Foszforeszcencia: a molekula triplett gerjesztett állapotból relaxálódik a szingulett alapállapotba

Megkülönböztetésük: - spektrumuk alakja, - gerjesztett állapot időtartama szerint.

6

Az S1-S0 átmenet A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában: a. Fluoreszcencia Az elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az

alapállapotba Lecsengése: 10-9 - 10-6 s nagyságrendű b. Foszforeszcencia S1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T1 triplett

állapotba kerül ebből sugárzási energia kibocsátásával kerül S0 alapállapotba

(tiltott spin átmenet miatt kisebb valószínűséggel) Lecsengése: 10-6-10 s c. Késleltetett fluoreszcencia T1 állapotból termikus gerjesztéssel S1 állapotba, majd onnan S0-

ba („magas hőmérsékletű foszforeszcencia”)

A lumineszkáló anyagot jellemzi:

Abszorpciós spektruma, valamint fluoreszcencia, foszforeszcencia gerjesztési és emissziós spektruma

Sugárzás kvantumhatásfoka

Gerjesztett állapot élettartama

Emisszió polarizációfoka (anizotrópiája)

7

A fluoreszcencia mérésének alapelvei

Legfontosabb probléma: a gerjesztő fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése.

• A gerjesztési és észlelési irányok célszerű megválasztása

• Három elrendezési lehetőség

1. Az észlelés iránya merőleges a gerjesztés irányára.

2. Az gerjesztés és az észlelés

iránya „párhuzamos”. A minta elülső oldaláról kilépő

fluoreszcenciát érzékeljük.

3. A minta gerjesztésével szemközti oldalon, azaz lineárisan detektálunk.

!! Fényszűrők, monokromátorok!!

8

Hogyan mérünk fluoreszcenciát? (‘steady-state’ eset)

fényforrás

hullámhossz

választás minta

hullámhossz

választás

detektor

A gerjesztési spektrum

• Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk.

• Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük.

• Függvényalakja az abszorpciós spektruméval megegyezik.

Stokes-féle eltolódás, tükörkép spektrumok

Sir George Gabriel Stokes, 1st Baronet

(1819–1903)

Gerjesztés

9

Az emissziós spektrum

Az első szingulett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjéről az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik.

Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszeréről.

Kémiai denaturáció hatása a gerjesztési és emissziós spektrumra

Gu

HC

l

10

• Az első triplett gerjesztett állapotból a szinglett állapotba való átalakuláskor.

• Szobahőmérsékleten csak kristályos anyagokon. (oldatban: kioltók pl. O2)

• A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltolódott.

Foszforeszcencia emissziós spektrum Fluoreszcencia élettartam

Az az időtartam, amely alatt a gerjesztett állapotban található molekulák száma e-ad részére csökken.

= 1 / (kf + kössz) f : fluoreszcencia össz : f + vibr. + rot. (azaz f + non-radiatív)

11

Kvantumhatásfok

Q= Nemitt / Nabsz < 1

Q = kf / (kf + kössz)

- kifejezhető a sebességi állandók hányadosaként is:

fluoreszcencia során kibocsátott és elnyelt fotonok számának hányadosa.

Fluoreszcencia élettartam mérése

• „idő-függő” mérés /time domain measurement/

• rövid gerjesztő impulzusok (~ fs)

• Fotonok detektálása időablakokban

Principles of Fluorescence Spectroscopy_Joseph R. Lakowicz.

12

Időkorrelált egy-foton számlálás /TCSPC/

1

10

100

1000

0 20 40 60 80 1001

10

100

1000

Idő (ns)

Flu

ore

szce

ncia

in

ten

zitá

s (

cp

s)

PEVK11

IAEDANS

PEVK21

IAEDANS

Principles of Fluorescence Spectroscopy_Joseph R. Lakowicz.

Fluoreszcencia élettartam mérése

• „frekvencia-függő” mérés („frequency

domain measurement”)

Inte

nzitá

s

Eltelt idő Modulált gerjesztés (frekvencia ~20 / 80 MHz)

13

Fluoreszcencia élettartam mérése

• „frekvencia-függő” mérés („frequency

domain measurement”)

Inte

nzitá

s

Eltelt idő Emisszió – rövid élettartamé (pl. 1 ns)

Emisszió – hosszú élettartamé (pl. 10 ns)

Modulált gerjesztés (50 MHz)

Demoduláció (modulációs mélység)

Fáziskülönbség

Fluoreszcens festékek

Triptofán, tirozin, fenilalanin

Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét.

• natív vagy intrinsic fluorofórok:

14

Extrinsic (külső) fluorofórok

Direkt jelölés festékekkel: Danzil Rodamin IAEDANS IAF FITC Fluoreszcensen jelölt toxinokkal: Falloidin B-skorpiótoxin A-bungarotoxin

Makrofágok Aktin jelölve falloidin- Alexa 568-cal (Piros)

Magok: DAPI (Kék)

Streptococcus aureus

(Zöld)

15

A fehérjék fluoreszcens jelölése

- A jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető.

- A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk.

- Így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell.

Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémiai

jelölés)

Az antitest nagy affinitással és specifitással kötődik az általa felismert molekula felszínéhez (epitóp)

Monoklonális és poliklonális antitestek

Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens festék van kötve

Indirekt jelölés: az elődleges antitest jelöletlen, a másodlagos antitest van megjelölve

16

Foszforeszcencia mérése

• A gerjesztő fény a foszforeszcencia fénytől időben elkülönüljön

• Az intenzitás időbeli változása is mérhető legyen

• Mindig alacsony hőmérsékleten kell mérni

• Foszforoszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után optikai ernyővel eltakarjuk , ekkor juthat a

detektorhoz az emittált fény.

Az az idő, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete

között eltelik függ: • a forgási sebességtől

• a nyílások számától

Gyakorlatilag elérhető legrövidebb idő: 10-5 s nagyságrendű

A foszforoszkóp A forgó átlátszatlan henger résén

a gerjesztő fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át

Negyedfordulat után a gerjesztő

fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén

17

A minta

• Általában oldat (fehérje, nukleinsav, pigment extraktum, sejtszuszpenzió)

• A küvetta anyaga ne fluoreszkáljon! • Üvegküvetta (látható tartomány) • Speciális üvegküvetta (λ > 300 nm) • Műanyag küvetta • Speciális kvarcküvetta (fluoreszcencia mérésre) • Küvetta tartó berendezések: • Temperálható (több féle módon) • Több (ált. 4) minta, forgatható

Gerjesztő fényforrások A mesterséges fényforrások által kibocsátott fény lehet:

• Folytonos-, (magas hőmérsékletre hevített anyag)

Halogéntöltésű izzószálas lámpák. Nagy nyomású gázokkal töltött lámpák.

• Vonalas-, (atomok) Intenzív, monokromatikus fény állítható elő. Alacsony nyomású higanygőzzel töltött

gázkisülési cső. • Stb.

18

Optikai szűrők

Abszorpciós filterek Általában üvegből készülnek. Szerves vagy szervetlen összetevőket

tartalmaznak, emiatt bizonyos hullámhosszúságú fénysugarakat átengednek, míg másokat nem.

Műanyag (olcsóbb, könnyebb)

Dikroikus tükrök

Szelektivitás bizonyos hullámhosszúságú fényre

Optikai szűrők

Ultraibolya (UV) filterek: Az ultraibolya-fényt nem engedik át, de hosszabb

hullámhosszúakat igen.

Neutrális szűrők: Transzmissziójuk széles színképtartományban a

hullámhosszúságtól független.

A gerjesztő fény intenzitásától függő fotokémiai, fotobiológiai folyamatok tanulmányozhatók.

Interferencia szűrők: Akkor használjuk, ha a folytonos színképű fényből viszonylag

keskeny sávot akarunk kiválasztani.

Vonalas színképű gerjesztő fényből meghatározott hullámhosszúságnál fellépő vonalat kell elkülönítenünk.

Áteresztőképességük a beeső fény beesési szögétől függ.

19

Optikai szűrők Longpass-filterek (Felüláteresztő szűrők) Magasabb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Általában éles csúcs jellemzi őket. Fluoreszcens mikroszkópiában a dikroikus tükrök emissziós filterekként

használatosak. Shortpass filterek (Aluláteresztő szűrők) Optikai interferencia vagy színezett üveg filterek. Rövidebb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Dikroikus tükrök excitációs filterek-ként használatosak. Bandpass filterek (Sáv szűrők) Előző kettő kombinációja. Általában alacsonyabb transzmittancia-érték mint az előzőeknél. A kiválasztott intervallumon kívül teljesen blokkol minden más

hullámhosszú fényt.

Optikai szűrők

20

A: Fényforrás

B: Rés

C: Kollimátor

D: Prizma vagy rács

E: Tükör

F: Excitációs rés

G: Minta

Monokromátorok A detektor

Fotoelektron-sokszorozó cső (Photomultiplier tube)

Nagyon szenzitív érzékelők az ultraibolyától a közeli infravörös tartományig.

A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei:

- jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető

- a fluoreszcencia érzékeny a környezetre

21

Köszönöm a figyelmet!