2015.02.14.

1

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEMÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR

www.aok.pte.hu

Fluoreszcencia spektroszkópia(Nyitrai Miklós; 2015 február 3.)

www.aok.pte.hu

Hogyan készültek ezek a képek?

www.aok.pte.hu

Lumineszcencia - elemi lépések

� Energia elnyelése (abszorpció)

� Gerjesztés

� A többletenergia fény formájában történõ kibocsátása

www.aok.pte.hu

Abszorpció, emlékeztetõ

- az abszorpció jelensége, értelmezése;

- az abszorpció definíciója;

- az abszorpció mérése;

- az abszorpció alkalmazásai.

www.aok.pte.hu

Lumineszcencia

� Definíció: Egyes anyagok spontán fénykibocsátása, a termikus fényemissziótól függetlenül, elektrongerjesztést követõen.

� Lumineszcens anyag – energia átalakító

www.aok.pte.hu

A lumineszcencia típusai

� Fotolumineszcencia• Fénnyel valõ gerjesztés esetén (pl. fénycsõ)

� Katódlumineszcencia• e- -ok mozgási energiája átalakul látható fénnyé (katódsugárcsõ)

� Elektrolumineszcencia• Elektromos tér energiája átalakul fénnyé

� Kemilumineszcencia• Kémiai energia átalakul fénnyé

� Termolumineszcencia• Hõ által indukált lumineszcencia

� Tribolumineszcencia• Mechanikai munka átalakulása fénnyé

(az elektrongerjesztés módja szerint)

2015.02.14.

2

www.aok.pte.hu

Kemilumineszcencialuciferin + ATP oxyluciferin + AMP

+ fény

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Leuchtk%C3%A4fer_-_Firefly.JPG

luciferázwww.aok.pte.hu

Tribolumineszcencia

� Látható fény és röntgensugárzás kibocsátása átlátszó ragasztószalag letekerése során.

Photos by Carlos Camara, Juan Escobar and Seth Putterman. http://www.nytimes.com/2008/10/28/science/28xray.html?_r=2&partner=rssnyt&emc=rss

www.aok.pte.hu

http://www1.lsbu.ac.uk/water/vibrat.html

Az állapotok jellemzése

www.aok.pte.hu

OCO

OCO

OOC

szimmetrikus vibráció

asszimetrikus vibráció

„hajlításos” vibráció

Az állapotok jellemzése

www.aok.pte.hu

Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs

Az egyes energia típusok megváltozása független. A megváltozás írható mint:

∆Eösszes = ∆Eelektron + ∆Evibrációs + ∆Erotációs

Az energia felbontása

www.aok.pte.hu

Vibrációs szintek

Elsõ gerjesztett állapot

Alapállapot

Elektron

energia

szintek

Az energia szintek felhasadása

De mit jelent az S vagy szingulett állapot?

2015.02.14.

3

www.aok.pte.hu

Szingulett és triplett állapotokA spinállapothoz rendelt mágneses momentumnak amágneses tér irányához képest lehetséges orientációsállapotainak a száma (multiplicitás):

M = 2S+1

Szingulett → S=0; M = 1

Triplett → S=1; M = 3

szingulettalapállapot

gerjesztett szingulett állapot

gerjesztett triplett állapot

www.aok.pte.hu

Színképek – atomok és molekulák

www.aok.pte.hu

Színképek és értelmezésük –emissziós színkép

hullámhossz

folytonos színkép

emissziós színkép

abszorpciós színkép

www.aok.pte.hu

Emissziós színképek –vonalas és sávos

hullámhossz

atomok

molekulák

atomok emissziós színképe

molekulák emissziós színképe

vonalas színkép

sávos színkép

www.aok.pte.hu

Fluoreszcencia

www.aok.pte.hu

Aleksander Jablonski1898 február 26 -

1980 szeptember 9

S0

S1

alapállapot

gerjesztett állapotok

hν

T1

012345

A Jablonski diagram

Az energia szintek közötti átmenetek értelmezése, ábrázolása.

2015.02.14.

4

www.aok.pte.hu

Kasha-szabály

A fluoreszcencens fény kibocsátása (emisszió) mindig az elsõ gerjesztett állapot

legalacsonyabb vibrációs szintjérõl (S1) történik meg.

Michael Kasha1920 december 6 -

2013 június 12

www.aok.pte.hu

Jablonski diagram - fluoreszcencia

vibrációs szintek

S0

S1

Alapállapot

S0 – S1 S1 – S0 (10-8s)

Gerjesztett állapot Belsõ konverzió v. vibrációs relaxáció – hõ (10-12s)

gerjesztés (10-15s)

hν

012345

Kasha-szabály!

Sugárzásmentes átmenet

pl. belsõ konverzió = hõ (10-7 – 10-5 s)

www.aok.pte.hu

Foszforeszcencia

www.aok.pte.hu

Jablonski diagram - foszforeszcencia

S0

S1

Alapállapot

S0 – S1

Gerjesztett állapotVibrációs relaxáció (10-12s)

gerjesztés (10-15s)

hν

T1

T1 → S0 (10-3 – 10-1s )

Vibrációsszintek0

12345

S1 → T1: rendszerek közötti átmenet(10-10 – 10-8 s)

www.aok.pte.hu

gerjesztés

alapállapot

fluoreszcencia

10-9 s

foszforeszcencia

10-3 s

gerjesztettállapot

10-15 s

relaxáció

fl. kioltás

FRET

„belsõ konverzió” (hõ)

Milyen idõskálán?

gerjesztési energia

www.aok.pte.hu

S

T

S

S

A „ns” tartomány

A „> ms” tartomány

A fluoreszcencia és foszforeszcencia összevetése

2015.02.14.

5

www.aok.pte.hu

A fluoreszcencia alapvetõ paraméterei

� Fluoreszcencia spektrum; intenzitás

� Kvantumhatásfok

� Élettartam

� Polarizáció

www.aok.pte.hu

Definíció!

a. Emissziós spektrum

b. Gerjesztési spektrum (ld. abszorpciós sp.)

Mi a fluoreszcencia spektrum?

www.aok.pte.hu

Emissziós spektrum

� Grafikon (függvénykapcsolat), mely a kisugárzott fény intenzitásának hullámhossztól (λ(em)) való függését jellemzi.

� Reprezentálja az alapállapot vibrációs szintrendszerét (S0).

� λ(ex)=állandó → λ(em)=változó

www.aok.pte.hu

Gerjesztési spektrum

� Grafikon (függvénykapcsolat), mely az elnyelt fényintenzitásának hullámhossztól (λ(ex)) való függését jellemzi.

� Reprezentálja a gerjesztett állapot vibrációs szintrendszerét(S1, S2..).

� λ(ex)=változó → λ(em)=állandó

www.aok.pte.hu

Melyik a hosszabb; a gerjesztési vagy az emissziós hullámhossz?

www.aok.pte.hu

Tükörkép-szabályA gerjesztési és emissziós spektrumokáltalában tükör-szimmetrikusak.

fluoreszcencia emissziós sp.flu

ores

zcen

cia

gerj

eszt

ési s

p.

hullámhossz (nm)

2015.02.14.

6

www.aok.pte.hu

Stokes-féle eltolódási törvényAz emissziós spektrum maximuma eltolódik a nagyobb hullámhosszak irányába (energiaveszteség!).

fluoreszcencia emissziós sp.

fluor

eszc

enci

a ge

rjes

ztés

i sp.

hullámhossz (nm)

Stokes

www.aok.pte.hu

Jablonski diagram

vibrációsszintekS0

S1

Alapállapot

S0 – S1 S1 – S0 (10-8s)

Gerjesztett állapot

belsõ átalakulás - hõ (10-12s)

gerjesztés (10-15s)

hν

012345

Kasha-szabály!

Stokes-féle eltolódási törvény!

Tükörkép szabály!

www.aok.pte.hu

A fluoreszcencia alapvetõ paraméterei

� Fluoreszcencia spektrum; intenzitás

� Kvantumhatásfok

� Élettartam

� Polarizáció

www.aok.pte.hu

Kvantumhatásfok (Q )

� Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra.

számafotonok t abszorbeál

számafotonok emittált =Q

www.aok.pte.hu

A fluoreszcencia alapvetõ paraméterei

� Fluoreszcencia spektrum; intenzitás

� Kvantumhatásfok

� Élettartam

� Polarizáció

www.aok.pte.hu

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

t

F0

e

F0

τ

A gerjesztett állapot élettartama; az az idõtartam, mely alatt a gerjesztett molekulák száma e -ad részére csökken.

Fluoreszcencia élettartam (τ )

F = F0 e-kt = F0 e- t / τ

ha F = F0 / e

akkor t = τ

2015.02.14.

7

www.aok.pte.hu

Nem lineáris elrendezés !!!

Hogyan mérünk fluoreszcenciát?

www.aok.pte.hu

A spektrofluorométer felépítése

Nem lineáris elrendezés !!!

F M S

M

D

90o

fényforrás gerjesztési monokromátor

emissziós monokromátor

detektor

mintatartó

www.aok.pte.hu

- jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhetõ

- a fluoreszcencia érzékeny a környezetre

A fluoreszcencia alkalmazásának elõnyei

www.aok.pte.hu

- a lumineszcencia meghatározása;

- a lumineszcencia típusai;

- spektrum, hatásfok és élettartam;

- a fluoreszcencia mérése

- a fluoreszcencia elõnyei

A lényeg

www.aok.pte.hu

Köszönöm a figyelmet!