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ヒトマイクロバイオームの解析手法論
須田 亙理化学研究所生命医科学研究センターマイクロバイオーム研究チーム副チームリーダー
2018年7月3日大阪医科大学研究ブランディング事業「健康寿命をのばすたかつきモデル」学内シンポジウム
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Human microbiomeヒト常在細菌叢
次世代シークエンサーとは・・・$1,000 Human Genome Projectをモチベーションとして開発された技術を使用した超並列処理型DNAシークエンサー
2005年に454 GS20が市場に投入され、現在進行形でバージョンアップや新機種が開発されている。
16SデータのOTU（Operational Taxonomic Unit）解析Database類似度検索によるOTU菌種帰属の例:ヒト腸内細菌叢 3000readを用いた場合
)&������������ ����
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1# 5# 9# 13# 17# 21# 25# 29# 33# 37# 41# 45# 49# 53# 57# 61# 65# 69# 73# 77# 81# 85# 89# 93# 97#101#105#109#113#117#121#125#129#133#137#141#145#149#153#157#161#165#169#173#177#181#185#189#193#197#201#205#209#213#217#221#225#229#233#237#241#245#249#253#257#UNDEFINED# Others# Lysobacter# Tetrasphaera# Nesterenkonia# Megasphaera# BlauIa# Acidovorax# Nocardioides# Facklamia#AggregaIbacter# Ideonella# Selenomonas# Dialister# AllochromaIum# Parvimonas# OQowia# Oribacterium# Dermabacter# Cardiobacterium#Bradyrhizobium# Stenotrophomonas# Turicella# Caulobacter# Collinsella# Brevibacterium# Paraprevotella# Massilia# Brachybacterium# Williamsia#Pseudoclavibacter# Brochothrix# Thauera# Faecalibacterium# Lactococcus# Enterococcus# Ruminococcus# Flavobacterium# Aquabacterium# Paracoccus#Aerococcus# Campylobacter# Abiotrophia# Rhodobacter# MethyloversaIlis# TM7# Hydrogenophaga# Gordonia# Thermus# Janthinobacterium#Bifidobacterium# Eubacterium# Haemophilus# Klebsiella# Burkholderia# Cupriavidus# Bacillus# Capnocytophaga# Sphingomonas# Dermacoccus#Lautropia# Peptoniphilus# Bacteroides# Kocuria# Xanthomonas# Atopobium# Gemella# Porphyromonas# Fusobacterium# Mycobacterium#Enhydrobacter# Brevundimonas# Gardnerella# Paenibacillus# Microbacterium# Rhodococcus# Methylobacterium# Arthrobacter# Janibacter# Roseateles#Veillonella# Chryseobacterium# Clostridium# Deinococcus# Granulicatella# Del_ia# Finegoldia# Micrococcus# Pseudomonas# Lactobacillus#Rothia# Leptotrichia# AcInomyces# Anaerococcus# Moraxella# Neisseria# Prevotella# Acinetobacter# Streptococcus# Corynebacterium#Staphylococcus# Propionibacterium#
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~73�→ → 59
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Lozupone C & Knight R. Appl Environ Microbiol. (2005)
各サンプル（■, ■, ■）で形成されたOTU（菌種）の代表配列でTreeを描く。■と■の間の距離の計算は以下Unifrac distance = (２サンプルで固有の枝長[赤+黄色]) / (共通な枝を含む枝長の和[赤+黄+オレンジ])
http://bmf2.colorado.edu/fastunifrac/help.psp
UniFrac 解析
• 唾液細菌叢は腸疾患である炎症性腸疾患(IBD)と関連する• IBD患者と健常者の唾液細菌叢が有意に異なる
解析例炎症性腸疾患と唾液細菌叢の関連
Said HS, Suda W, Nakagome S, Chinen H, Oshima K, Kim S, Kimura R, Iraha A, Ishida H, Fujita J, Mano S, Morita H, Dohi T, Oota H, Hattori M. DNA Res. (2014) 21:15-25.
• PSC=原発性硬化性胆管炎• UCとPSCを見分けられる（腸内細菌叢より有効）
解析例PSC患者の唾液細菌叢変化
(A) (B)
1 - Specificity
Sens
itivi
ty
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
GenusSpecies
1 - Specificity
Sens
itivi
ty
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
GenusSpecies
AUC 0.8056AUC 0.9497
AUC 0.8906AUC 0.9323
PSC versus HC PSC versus UC
Iwasawa K, Suda W, Tsunoda T, Oikawa-Kawamoto M, Umetsu S, Takayasu L, Inui A, Fujisawa T, Morita H, Sogo T, Hattori M. Sci Rep. 2018 8:5480.
Genus AUC 0.8056Species AUC 0.9497
Genus AUC 0.8906Species AUC 0.9323
解析例ヒト唾液細菌叢の時系列変動
Firmicutes Bacteroidetes
0 12 24 36
Aut
o-co
rrel
atio
n co
effic
ent 1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0 0 12 24 36
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0-0.2-0.4-0.6-0.8
Subject 1 Subject 2 Subject 3 Subject 4 Subject 5 Subject 6
Time lag (hr)
Subject 1
0
20
40
60
80
100
12:0
0
Rel
ativ
e Abu
ndan
ce (%
)
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020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
Subject 2
0
20
40
60
80
100
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Subject 3
0
20
40
60
80
100
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Subject 4
0
20
40
60
80
100
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Subject 5
0
20
40
60
80
100
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Subject 6
0
20
40
60
80
100
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Firmicutes Bacteroidetes Spirochaetes SR1Proteobacteria TenericutesActinobacteria SynergistetesFusobacteria TM7 Others
Subject 1
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Subject 2
0
20
40
60
80
100
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Subject 3
0
20
40
60
80
100
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Subject 4
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Subject 5
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
10012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
Subject 6
0
20
40
60
80
100
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
0012
:00
16:0
020
:00
0:00
4:00
8:00
12:0
016
:00
20:0
00:
004:
008:
00
Streptococcus HaemophilusGemella AggregatibacterEubacterium PeptostreptococcusMegasphaera AbiotrophiaBergeyella Tannerella
Prevotella VeillonellaFusobacterium AlloprevotellaSolobacterium OribacteriumParaprevotella SelenomonasLachnoanaerobaculum Mycoplasma
Neisseria ActinomycesPorphyromonas LeptotrichiaCampylobacter LautropiaAtopobium CatonellaDialister Peptococcus
Rothia GranulicatellaCorynebacterium CapnocytophagaParvimonas TreponemaFilifactor KingellaCardiobacterium Synergistes
Others
0
20
40
60
80
100
a
b
Rel
ativ
e Abu
ndan
ce (%
)R
elat
ive A
bund
ance
(%)
Rel
ativ
e Abu
ndan
ce (%
)
0.1
0.2
0.3
0.4
Wei
ghte
d U
niFr
ac d
istan
ce
ST DT0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Subject 1
0.100.150.200.250.300.35
Subject 2
0.100.150.200.250.300.35
Subject 3ST DT ST DT
* *
a
b
唾液細菌叢は概日周期を持って変動している
0
2 00
4 00
6 00
8 00
1 00 0
1 20 0
1 40 0Read #
Errors/read0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
20 0
40 0
60 0
80 0
10 00
12 00
14 00
16 00
18 00Mock 3Read #
Errors/read0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
NGSによる16Sアンプリコンシークエンスのエラー率
N=3,000 reads
N=3,000 reads
Mock2
Mock1
エラー率は0.5%程度
Roche�454�������
Mock:���~10���� �����
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
OTU
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000G
ood'
s cov
erag
e
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
chao
10
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
Shan
non
A B
C D0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
OTU
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
Goo
d's c
over
age
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
chao
1
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
Shan
non
A B
C D
����OTU�
Good’s�coverage��
16S シークエンスエラーによる菌種(OTU)数のOverestimation
Good’s coverage index:1 - (F1 / N)F1 : the number of singleton OTUs N : sum of abundances for all OTUs
��104����� ��16S���
����
…ACGCGCAT……CGATTCAG……GATGCAGC……CCGTAACG……AATAGCAT……CGCGCTAG…
糞便検体 菌体の回収 ゲノムDNAの調整 メタゲノムデータ
Wet ����
Microbial profileSpecies A Species B Species C
Assembly・gene information Functional profileGene A Gene B Gene C
情報解析工程
NGS
Functional gene DB�KEGG/COG�Ref genome DB (6,200 genomes; 2,373 clusters )
Whole genome shotgun sequencingDNA��
0%10 %20 %30 %40 %50 %60 %70 %80 %90 %
10 0%
O the r gene ra @Er ys ip elo tr i chaceae_ge nus Pr evot el la Do re a Col li nsel laPar abact er oi des Cl ost ri di um Faecal ib acte ri um Eub acte ri um Bl aut iaRum i nococcu s Bi fi dob acte ri um Bact er oi des
0%10 %20 %30 %40 %50 %60 %70 %80 %90 %
10 0%
Cel l m ot il it y Secondar y m etabo lit es b iosynt hesi s , tr anspor t and cat abol ism Cel l cycl e cont ro l, cell di vis io n, ch rom osome par ti t ioni ngI ntr acell ular t r aff i cki ng, secr et ion, and ves icul ar tr anspor t Lipi d t r ansport and m et aboli sm Funct ion unknownNucl eoti de t r anspor t and m et aboli sm Post tr ans lat io nal m odi fi cati on, pr otei n t ur nover , chaperon es Coenzym e t ran spor t and m etabol ismSignal t r ansducti on m echanism s Ener gy pr oduct ion and conver s ion Def ense m echanism sCel l w all / mem br ane/ envelope biogenes i s Tr ans lat ion, r ib osom al s tr uct ur e and biogenes i s I norgani c i on t r ansp ort an d m etabol ismTr anscr i pti on Am ino acid tr anspor t and met aboli sm Repl icat ion, r ecom binat ion and r epai rGener al f uncti on pr edi cti on onl y Car bohydr ate t ranspor t and met abol ism
���� ����
����������
日本人腸内細菌叢メタゲノム解析例
20
種数
遺伝子機能数（KEGG）
0.9
0.92
0.94
0.96
0.98
1
100 1,00010,0
00100
,000
1,000,00
0
10,000,0
00
00.10.20.30.40.50.60.70.80.91
100 1,00010,0
00100
,000
1,000,00
0
10,000,0
00
相関係数（KEGG）
相関係数（種組成）
0200
400600800
1,0001,200
100 1,00010,0
00100
,000
1,000,00
0
10,000,0
00
0500
1,0001,5002,0002,5003,0003,5004,0004,5005,000
100 10,000
1,000,00
0
0.990.999
0.9990.99
a
b
c
d
メタゲノムデータ量と菌種/機能組成との関連
������!��" !��#
����� �/������� 10M !��������� (person)
KYIQYF;+$�
0
20
40
60
80
100
KYIQYF*�:��:NJL4>
TI
16SKYI;��[Z\
RBF NLPI RYUGJL
NL�� #8<2007�:�-DXHYEAS81>International Human Microbiome Consortium (IHMC)2�(37�,.��%�8VO@WXFCMS*�;��?)=6/5;!�.��8<.�;KYI2VO@WXFKYIQYF:hit4>
�09�;"� #�;TI16S&�!�
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
apr 01. 1 apr 02. 1 apr 03. 1 apr 09. 1 apr 12. 1 apr 16. 1 apr 17. 1 apr 39. 1 apr 40. 1
Bacteria Unknown Virus Fungi Human
���9 ;TICMSKYI;�'
Wet 8:4/9( �
• DNA����7=2���$���>�"Kit)$#����
• ���<�������(-80℃)$ �$����>��*?
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����-371�+462075��
8���#�� ������+ �,��8.'(!��)371�+�,������+ ���
IHMC Protocols(ビーズ法)
熱処理(Qiagen kit)
酵素法
Beads破砕 ●
酵素反応 ●
SDS ● ● ●フェノクロ処
理●
カラム精製 ● ●
PEG処理 ●
Gram − :���#�$�* �&/Gram + :���#�$ �%*$"
再現性 16Sリージョン(V12 vs V34)
16Sリージョン(V12 vs V68)
16Sリージョン(V34 vs V68)
シークエンサー(454 vs MiSeq)
抽出法(酵素法 vsBeeds法)
個人内 個人間(日本人健常者)
個人間(UC患者)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
個人間(日本人健常者vs UC患者)
��8<4-?;�5:3+$���>���5:3+' �
�� 16S V12 vs V34
16S V12 vs V68
16S V34 vs V68
/?,*=.?454 vs MiSeq
��
! 6?0
��� ���
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Short-read NGS data with ≤150 bp read-length
�.;8��� �>75:="�� 06?C8@C9NGS (#12��&150base��)4�)+)3
FPacBio RS II (SMRT sequencing)→�AE8�~10 kb.F��AE8�(��&���)4D=B �����%���0D6*.��$'&F;7����" ������!2� #
Tota
l bas
es/r
un
100Mb
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10Gb
100Gb
1Tb
100bp 1,000bp 10,000bp0bp Read-length
HiSeq
IonPGM
PacBioIonProton
454
��NGS :<,E>D3��
MiSeq
CD.AE82E-+D1E(���@5/9?��
F�'$ ���!�AE8��~3kb
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