昭和46年３月20日

ヒト表皮におけるウロン酸経路の酵素

福　井 清　美＊

Ｅｎ°ymesof the Uronic Acid Pathway in the Human Epidermis

　　　　　　　　　　　　　Kiyomi　Fukui

　　　　　　　　　　　Ｌ　緒　　言

　1962年Jacobson and Davidsc�）は幼若家兎皮膚から

uridine diphosphoglucose dehydrogenase(UDPGDH)を

分離精製し，本酵素はuridine diphosphoglucose(UDPG)

と補酵素nicotinamide adenine dinucleotide(NAD)と

の反応を触媒し, UDP-D-glucuronic acid を形成するこ

とを証明した. UDPGはglycogen合成においてglycosyl

donorとして重要であるが，一方ＵＤＰＧＤＨによって

酸化されてuronic acid を供給することはよく知られて

おり，形成されたuronic acid はamino sugar　と結合

して, mucopolysaccharide chainを産生し，かっ炭水化

　Fig. 1. Interrelationshipsof the Uronic Acid, Am-

　　ino Sugar, and Pentose Shunt Pathways of Carb-

　　ohydrate Metabolism

　*Mucopoしysaccharides = Chains of re eating unitsよ昌謳昌訟何回に回頌昌，

　　is linked to G pep tide or protein z glycoprotein.

(DUDりこ沿扁図昌び

(豚霖忿謡,ａ。t。　(3) L-xylaしosereductaseM) XyLitoldehydrogenase.

物代謝の五炭糖回路へ直接導かれる(Fig. 1 )・

　ヒト表皮，特に細胞間隙にmucopolysaccharideが存

在することは，組織化学的に証明されているが2)｀5)，

Flesch^',Flesch and Esoda"-"は正常ならびに病的角層

中にもこれが存在することを生化学的に証明した．一方

Braun-FaicoらならびにBarkerらはヒト表皮がradio-

active sulfateを取り込むことを観察しacid mucopoly-

saccharideを形成するだろうとしている'≪"≫. Mucopoly-

saccharideは表皮細胞間の“cement"物質として重要で

あるが, 1968年Mercerら12)13)は電子顕微鏡的組織化学

の手技を用い，きわめて美麗にその存在を示している.

　Uronic acid pathway における各酵素について，基礎

的研究がなされているかI4)-19)表皮細胞によるいわゆ

る“生物学的糊状物質"の産生に必要な一連の酵素活性

に関する生化学的研究は未だ見出すことができない．表

皮におけるβ-glucuronidase活性にっいての組織化学的

証明20)~23)ならびに生化学的証明24)にっいては数多くの

報告に接するが, uronic acid 代謝に必要な酵素にっい

ては, UDPGDH活性の組織化学的゛)ならびに生化学

的26137)研究か発表されているに過ぎない．

　本研究の目的はヒト表皮における炭水化物代謝のuro-

nic acid pathwayに属する４個の酵素について，定量的

ならびに動力学的に分析し，この分野の情報をさらに拡

大し，あわせて文献的考察を行なうも０である.

　　　　　　　11･　実験材料および方法

　６例の正常成人男子の背部をアルコールで清拭後，無

麻酔のもとでCastroviejo electrickeratome を用い表

皮を採取した．採取した表皮は2 Cm〉く5cm, 厚さ約０,２

謁であり，これらの表皮片は5～20％の真皮を含んでい

る．　さらに純粋な表皮片は，表皮と真皮を分離するた

め, suction blisterdevice を用いて腹壁から採取され

*北海道大学医学部皮膚科教室（主任　三浦砧晶教授）

　昭和45年６月19日受付

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　－209－

210 目本皮膚科学会雑誌　第81巻　第３号

Table 1. Optimal Reaction Mixtures for Enzymes of the Uronic Acid Pathway

EnzymepH* of

Buffer ｕ洗 　　　＊＊D-glucu-

　ronate

Xylttol x届 χA訃 　　　　**NADPHj

UDPGDH 8.7 4.5 ２

D-glucuronateReductase

８．８ 40 0.03

L-χyluloseReductase

9.6 100 O｡1

XylitolDehydrogenase

８,８ 50 ０,５

　＊

＊＊

Buffer is 0.05 M Tris buffercontaining MgCI^ (3 mM) and EDTA (1 mM)

SubstrateConcentration (Micromoles/Milliliter)

た28)29)採取した表皮はただちに液体窒素中で凍結し，

酵素測定に際しては凍結のまま重量を測定，次の術式に

よってhomogenateを作製した．

　　凍結表皮………………………………………100曜　1

0.05M Tris buffer pH 7.4 (3mM Mgclj お

　　よび１ mM EDTA　を含む）………………l.Occ

　動力回転ガラスhomogenizerを用い，0°Ｃで１分間

摩砕する．表皮片をよく摩砕するためhomogenizerを

できるだけ上下に運動させる，

　酵素活性はTurner's fluorometer Model 111を用い

て測定した．その原理は還元型nicotinamide adenine

dinucleotide PhosPhatｅ（ＮＡＤＰＨこ）あるいは還元型nicoti-

namide adenine ｄｉｎｕｃｌｅｏtide（ＮＡＤＨ２）の産生あるい

は消失を測穴することである30)すなわち，これ,らの

nucleotideは多くの酵素反応の補酵素であり，光源（水

銀灯あるいはXenon灯）が第１次Filter ( 340 mμ）を

通過し，これらのnuclcotideを照射した後，第２次Filter

　( 460mμ）を通過させることにより最大の蛍光を得る

ことができる．モの蛍光量は反応溶液中に出現する還元

型nucleotideの量にまったく比例するため，これを自

動式ペン書きrecorderに記録させる．これらのnucleotide

の酸化型，すなわちＮＡＤＰあるいはＮＡＤは上記波長

の光源によって決して蛍光を発しないし，また吸収もし

ない．

　Table 1 は種々の酵素活性測定に必要な至適反応系を

示す．すべての反応は室温で行なわれた．

　1. UDPG Dehy(lrogenase(UDPGDH)

　木酵素はUDP glucoseおよびＮＡＤの反応に関与し，

UDPglucuronic acid ならびにNADH, :

μIの表皮homogenate (新鮮表皮組織２噌に相当する）

を1.0cc0.05M tris buffer pH 8.7 (3 mM Mgcl,およ

び! mM ＥＤＴＡを含む．以下同じ）に加え，続いてNAD

　（２μｍ）を加えた．この反応系において生ずる蛍光が

安定した後，基質UDPG ( 4.5μｍ）を付加することに

よりＮＡＤＨバこよる蛍光量が記録され，これからUDP

ＧＤＨ活性の測定が行なわれた.

　2 D-Gluciironate reductase

　本酵素はD-glucuronic acid およびNADPHバ

あずかりL-gulonic acidならびにＮＡＤＰを形成する.

20μIの表皮homogenateをl.Occ 0.05M trisbuffer pH

　8.8に加え，さらにＮＡＤＰＨ２（0.03μｍ）を付加した．

この補酵素による蛍光が安定した後，基質D-glucurotiic

acid (40μｍ）を加えることにより生ずる蛍光の消失，

すなわちNADPの形成が記録され，これからＤ-かucuro-

nate reductase 活性が測定された.

　3. L-χylidose reductase

　本酵素はL-XyluloseおよびNADPHバ

し, xylitolならびにＮＡＤＰを産生する．この反応系

は可逆的であるため，著者はxylitolからL-xylulose

を産生する方向におトてこの酵素活性を測定した．す

なわち20μIO表皮homogenateをl.Occ 0.05M tris

buffer PH 9.6に加え，続いて　ＮＡＤＰ（0.1μｍ）が加

えられた．この反応は基質xylitol (100μｍ）を付加

することにより開始され，ＮＡＤＰＨ，の形成による蛍光

が記録された.

　4. Xylitol DehydrogenaseCXylitol ＤＨ）

　本酵素はxylitolおよびＮＡＤからD-xyluloseなら

びにＮＡＤＨ２の形成を可逆的に触媒する．すなわち2叩l

の表皮homogenateを1.0cc0,05M tris buffer pH 8,8

に加え，続いてNAD ( 0.5μｍ）を加えた．この反応

系におトで生ずる蛍光が安定した後，基質xylitol (50

μｍ）を加えることによって反応は開始され, NADHjに

よる蛍光が記録された．

　以上４種の酵素のうち，その反応においてＮＡＤを補

昭和46年３月20日

Table 2. Enzyme Activitiesin Normal Human Epidermis

Enzyme

Epidermis with 5－20％

Dermal Contamination Pure Epidermis

Range Average Range Average

UDPGDH 0.053 ― 0.113ﾎ 0.084 0.013 － 0.020 0.017

D-GIucuronateReductase

0.042 ― 0.056 0.049 0.030 ~ 0.035 0.033

L-χyluloseReductase

0.017 － 0.030 0.025 0.010 － 0.013 0.012

Xylitol DH 0.035 － 0.058 0.047 0.033 － 0.040 0.037

＊　Activities in nanomoles ot substrate turned over/min/mg fresh tissue.

酵素として必要とするもの，すなわちUDPGDHおよ

びxylitol DH においては，それぞれの基質を加えるこ

となしに，表皮homogenate自体によってＮＡＤかNADH2

に還元される．従って　UDPGDH　およびxylitol DH

を含めて，ＮΛＤを補酵素とするすべて０酵素活性０測

定においては, homogenate自体によるＮＡＤＨ２の形成

が完了した後（約10分間を要する）,それぞれの基質を加

えなければならない．基質を加えることなく組織自体に

よってＮＡＤが還元されるのは，“nothing” dehydrogenase

の作用によるものと考えられており，この事実はStarch

gel electrophoresis の実験においても見出されている

力？肌これは組織自体のendogenous lactate ならびに

lactic dehydrogenaseによる反応と考えられる．がＣに

おいて48時問dialysisを試み,すこ力≒この活性を除去する

ことはできない.

　　　　　　　　　III･実験成績

　1. Io vivo における酵素活性

　Table 2 はkeratome slice ( 5～20％の真皮を含む）

およびsuction blister top ( 100%一大皮）から作製さ

れた衣皮homogenateにおける４種の酵素活性値であ

る．これらの酵素活性は，解糖系酵素の活性に比較する

と著明に低く，およそ1/1。ないし1/1．の低値を示してい

る．さらに純粋表皮における活性は，若干の真皮を含む

keratome sliceから作製されたhoraogenateに比較する

と均一的に低値を示しUDPGDH, D-glucuronate redu-

ctase, L-xyluIose reductase およびxylitol DH の値はそ

れぞれ80％，30％，50％および20％の減少を示す.

　2. In vitro におけるKinetics

　ａ）至適rfl

　Fig. 2は測定された４種の酵素の至適出を衣わす．こ

れらの至適溺はすべてpH 8.6― 9.6のアルカリ側におい

て急峻なpeakを示し，いずれも非生理的範囲である．

　　　C~

≪O

lD0　40　30

AiW　ｉＯＶ　ＩＶΣ一×くΣち次

Fig. 2. pH Activity Curve

／リぶ丿

゜

　　／／／／／ｙ心

211

･=一一^ UDPGDH

o-゜ D-gliicuranate

　　　　　　　　reductase

゛一一■'■l-XYはose reductase

°-一口χylitol DH

pH

至適lilにおけるこれらの酵素の活性他を100％とした場

合，生理的pll 7.4ではUDPGDH:50％，Ｄ-glｕｃｕrｏｎａtｅ

reductasc : 33％，Ｌ.ｘylｕlosｅ reductase : 63%, xylitol

ＤＨ:26％の活性を示すに過ぎない．

　ｂ）酵素活性に及ぼす各種基質ならびに補酵素の濃度

の効果

　４種の酵素について，その活性に及ぼすそ牡ぞ牡の

基質ならびに補酵素の濃度の効果を　Lineweaver-Burke

の方法に従い，Ｙ軸に丿活性，Ｘ軸に1/濃度をとり，

おのおのの成績を記録した．これからMichaelis-Menten

Constant (Km),すなわち最大酵素活性の1几を与えるに

必要な基質ならびに補酵素の濃度を決定した.

　Fig. 3はＵＤＰＧＤＨに及ぼすＵＤＰＧならびにNAD

の効果, Fig. 4 はD-glucuronate reductasc活性に及ぼす

D-glucuronateならびにＮＡＤＰＨ２の効果, Fig.5はＬ-

xylulose reductase 活性に及ぼすxylitolならびにNADP

の効果, Fig. 6 はxylitol DH 活性に及ぼすxylitolな

らびにＮＡＤの効果を表わす．これらの成績を至適俐と

212

Fig. 3. Lineweaver｡Burke plot of the effect of

　UDPG and NAD concentrationson UDPGDH

　activity

0.05

1/s‰4Ｍ

Figi. 4. Lineweaver-Burke　plot of 書ｈｅeffect of

　D-Glucuronate　and NADPHj concentrations on

　D-Glucuronate reductase activity

Km(D-Glucuronate)=U×IO"'M

Km(NADPH2)=1.0×10“5M

びS^IO^M

ともに総括するとTable 3 の通りである．これら４種の

酵素の至適活性を得るには比較的高濃度の基質を要する

ことが明らかである．

　Table ４はこれら４種の酵素についてすでに報告され

日本皮膚科学会雑誌　第81巻　第３号

Fig. 5. Lineweaver-Burke plot of the effect of χy-

　　litoland NADP concentrations on L-Xylulose

　　reductase activity

NADP

Fig. 6. Lineweaver-Burke plot of the effect of χｙ-

　litol and NAD concentrations on Xylitol dehyd-

　rogenase activity

,01　　0.02

.0　　2.0

びSxlO'M

ＫｍＯくylitoD=3.5xがＭ

Km(NAD)=1.3×IO''M

た至適溺ならびに補酵素のKni(Michaelis-Menten Con-

stant)を一括したものであるが，ヒト皮膚については見

出すことができない．

　著者が得たUDPGDH　の至適pH 8.7はcalf liver,

rabbit skinのそれとよく一致し，またＮＡＤりＫｍも同

Table 3. Kinetic Data for Each Enzyme （ａtRoom Temperature)

Enzyme 　　PHOptimum

ApparentKm (MichaelisConstant)

For Substrate For Coenzyme

UDPGDH 8.7 １．５×１０’３Ｍ（ＵＤＰＧ） 7.2×10｀4M（NAD）

D-GlucuronateReductase

８．８ 1.3χlO-'M (D-Glucuronate) １．０×１０’５Ｍ（ＮＡＤＰＨ２）

L.χyluloseReductase

9.6 2､5×1PM（xylitol） 8,7×10‘6M（NADP）

XylitolDehydrogenase

８．８ 3.5×10‘3M（xylitol） 1.3×lO-'M (NAD)

昭和46年３月20ロ

Table 4. Kinetic Data for Each Enzyme Reported in References

213

Enzyme 　　PHOptimum

Km (Michaelis Constant)

Tissue Buffer RefFor Substrate 　　ForCoenzyme

UDPG DH

８．７２．５×lO-'M

(ＵＤＰＧ)7.1×lO-'M

　(NAD)Calf Liver Diethanolamine (32)

9.0２．４×１０゛４Ｍ

(ＵＤＰＧ) Rabbit Skin 0.1 M Glycine （1）

9.02.0×10゛5M

(UDPG) CalfLiver (33)

D-GlucuronateReductase

8.6―9.37.3×10゛3M

(L-gulonate)2.0×10-5M(NADP) Pig Kidney

0.067MTris-GIycine

(16)

L.χylulose

Reductase9－10

2.9×10゛2M(Xylitol)

ＧＬ

nea Pigver

0.04 M Tris (18)

XylitolDH 9―106.6×10゛3M(XylitoO

Ｇ

Ｌnea Pig

ver0.04 M Tris (18)

様である．ただしUDPGのＫｍは測定された条件，使

用された緩衝液の種類によって大きく異なり, 2.0×

10‘5Mから2.5×lO-'Mの範囲にまたがっている. D-glu-

cutonate reductaseにっいては逆方向において測定され

ているが，至適がＨ，基質ならびに補酵素のＫｍは著者

の成績とほぼ一致する. L-xylulose reductaseならびに

xylitolＤＨにっいては，著者が用いたと同方向において

測定された時，至適岬ならびに基質に対するＫｍはほぼ

同様であるとされている．

　　　　　　　　　工Ｖ●　考　　按

　炭水化物代謝の一分野であるuronic acid 代謝に関係

する４種の酵素が，ヒト表皮homogenateにおいて証明

された. Uronic acid 代謝系は, mucopolysaccharide形

成に関与するものであるから，真皮においては比較的

高い活性を有することは期待できる1).著者の成績が

示すごとく，5～20％の真皮を含むkeratome sliceの

homogenateにおいてはもちろん，100％純粋な表皮

homogenateにおいてもuronic acid代謝系の酵素活性

が証明されたことはきわめて重要である．もちろん純

粋表皮におけるこれら４種の酵素活性は，真皮を含む

keratome sliceに比較するときわめて低い．この事実は

第１に表皮におけるそれよりも，真皮における酵素活性

が一層活溌であると考えられるが，一方純粋表皮片を得

るために用いられたsuction blister形成の過程において，

表皮に損傷が与えられ，従って低い酵素活性を示したと

も考えられる．この推論の正否にっいては次の実験にま

ちたい．

　さてuronic acid代謝はUDPGから開始されるが，

UDPGは本代謝系の最初の酵素である　ＵＤＰＧＤＨに

よって酸化されるとともに, glycogen産生に関与する

glycogen synthetase の基質でもある．モれ故UDPGが

いかなる割合でglycogen合成系に向かうか，あるいは

uronic acid代謝系に移行するかを知ることはきわめて

有意義である. In vitro における測定結果は, glycogea

synthetaseの活性はＵＤＰＧＤＨのそれの４倍強いことを

示す．しかしこの事実からただちにin vivo において

も, glycogen合成がmucopolysaccharide産生よりも

４倍も速かに行なわれると推測することは，いささか危

険をともなう。In vivo における諸種の条件はin vitro

のそれらと大いに異にすることが考えられる．すなわち

in vivo の岬はin vitro のそれと異なり，また細胞内に

おけるUDPGの蓄積もただ１ヵ所にあるとするより

も, glycogen産生側と　uronic acid 代謝系にわかれて

貯臓される可能性もある．またいったん形成されたmu-

copolysaccharideはglycogenのごとく速やかに分解さ

れることなく，従って産生量がきわめて少量であろうと

も，しだいに組織内に相当量に蓄積され，かっこの蓄積

量か多くなるとふたたびmucopolysaccharideがさらに

形成され.ることに対し抑制的に働くという，あたかも過

剰の基質とその酵素活性抑制の関係に類似した推測も可

能である.

　Mucopolysaccharide産生にっいては, UDPGからUDP

glucuronic acidが形成され，ひき続いてglucuronic acid

が，産生されっっあるmucopolysacchaiide鎖と結合す

ることを要する．この機序に関与する酵素はUDP glu-

curonyl transferase であるが，本酵素の活性については

まだ利用し得る報告はない．また本酵素がglucuronate

をbilirubinに結合させるときに作用する酵素と同一一の

ものであるか否かもまだ知られていない．

　一方Fig. 1 に示されるごとくuronic acid 回路は六

214

炭糖リン酸側路と結合する．すなわちuronic acid 回路

の最終産物であるD-xyluIose-5-phosphateはD-ribulose-5-

phosphate eplm eraseの作用によりD-ribulose-5-phosphate

に変換される，かくしてuronic acid 回路は六炭糖リソ

酸側路の１つの機能であるnucleotideと核酸合成のため

のpentoseを供給する点において関与することが考えら

れる．六炭糖リン酸側路の最初の段階においてモの反応

を触媒するglucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PD

Ｈ）ならびに6-phosphogluconate dehydrogenase (6-PGD

Ｈ）の活性は, uronic acid 回路の酵素活性よりもそれぞ

れ50倍ないし10倍強い．この事実からnucleotideと核酸

合成に必要なpentoseの供給は主として六炭糖リソ酸側

路に由来することは明らかであるが，この側路がuronic

acid回路より50倍ないし10倍の量においてpentoseを供

給するとは速断できない．すなわち六炭糖リソ酸側路の

他の１つの機能は, G-6-PDHあるいは6-PGDH (いず

れも補酵素としてＮＡＤＰを要する）がその反応を触媒

するとき生ずるＮＡＤＰＨ.が脂肪酸やsteroidの合成に

使用されることである．活溌なIipogenesisの存在，ま

たはNADPH, ;

溌なglucoseの分解を促進し，外見上G-6-PDHあるい

は6.PGDHの活性が高値を示すものと考えられる．

　一方uronic acid代謝とascorbic acid合成に関して

興味深い報告がある．すなわちD-glucuronate reductase

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文

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日本皮膚科学会雑誌　第81巻　第３号

はD-glucuronateに作用し, L-gulonateを産生する．こ

の物質はヒト，他の霊長類あるいはモルモットを除いた

多くの動物においてはascorbic acid 合成の前駆物質と

して利用されるといわれる．しかしBakerら3゛の研究

によるとascorbic acid の直接の前駆物質はD-glucur-

onateやL-gulonateではなく，これらの物質のlactone

型である．すなわちC14で標識されたD-glucuronolactone

を投与すると，その25％がヒト尿中にascorbic acid と

して出現するが，C14で標識されたgliicuronic acid を

投与したあとでは, ascorbic acid 中にＣ１４がとりこま

れていないことが示されている．おそらくヒトでは，こ

れらO free acid からlactoneを産生することはできな

いものと考えられる16)

　　　　　　　　　Ｖ●　結　　論

　炭水化物代謝のuronic acid 回路に関して４種の酵素

活性がヒト表皮において証明された．しかしこれらの酵

素活性はきわめて低値を示すのみであった．

　この研究は米国フロリダ州，マイアミ大学医学部皮膚

科教室において行なわれたものである．研究の便宜を与

えてくださったDr. K.M. Halprin,ならびに御校閲下さ

った三浦祚晶教授に謝意を表する．なお本論文の要旨は

日本皮膚科学会第198回北海道地方会において報告し

た，

献

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