FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN NEUROBIOLOGIA

CLASSE DI LAUREA MAGISTRALE IN BIOLOGIA (6S)

TESI DI LAUREA

STUDIO DELLE CORRENTI STRETCH-ATTIVATE NELLE CELLULE MICROGLIALI: PROPRIETA’ ELETTRICHE E CARATTERIZZAZIONE

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA ‘‘LA SAPIENZA’’

Candidato: Giordano Caterina Relatore Interno: Prof. De Stefano Maria EagleN. Matricola: 678843 Dip. Di Biologia Cellulare e dello Sviluppo

Relatore Esterno: Prof. Ragozzino Davide Dip. Fisiologia umana e Farmacologia

Anno Accademico 2012-2013

Nicola J. Allen and Ben A. Barres : Glia - more than just brain glue Nature,2009

LE CELLULE GLIALI

--- MACROGLIA

--astrociti--oligodendrociti e cellule di Schwann

--- MICROGLIA

cellule responsabili della risposta immunitaria che si ha in seguito ad un’infezione o insulto a carico del SNC.

FUNZIONI DELLE CELLULE MICROGLIALI

Le cellule microgliali sono dei guardiani attivi e dinamici del parenchima cerebrale

--- movimento tramite il riarrangiamento dei processi citoplasmatici--- stato di resting (forma ramificata) e stato attivato (forma ameboide)--- produzione e rilascio di citochine, chemochine, mediatori del processo infiammatorio

Il flusso dello ione cloro partecipa a diverse attività microgliali:

--- regolazione del volume cellulare

--- ramificazione, attivazione, migrazione, proliferazione, fagocitosi, apoptosi. Nilius B, Eggermont J, Voets T, Droogmans G. (1996): Volume activated Cl- channels. Gen. Pharmacol.; 27: 1131–1140.Eder C, Klee R, Heinemann U. (1998): Involvement of stretch-activated Cl- channels in ramification of murine microglia. The Journal of Neuroscience; 18(18):7127–7137.

IL RUOLO FUNZIONALE DEI CANALI DEL CLORO NELLA MICROGLIA

Cl-IAA-94FFADIDS

ClC-3?

IL CLORO PARTECIPA AL MANTENIMENTO DEL POTENZIALE DI MEMBRANA NELLE CELLULE MICROGLIALI

--- canali ionici aperti in condizioni passive

--- trasportatori

ECl = RT/zF ln [Cl-]i /[Cl-]e. Equazione di Nernst

Equazione di Goldman-Hodgkin e Katz Gli ioni sono sollecitati da due forze che tendono a farli spostare da un lato all’altro della membrana, una forza motrice chimica (gradiente di concentrazione) e una forza motrice elettrica (ddp ai due lati della membrana). Il valore del potenziale di membrana al quale queste 2 forze si eguagliano, viene definito potenziale di equilibrio per quello ione.

I CANALI IONICI PER IL TRASPORTO DEL CLORO

1) ---- canali attivati da ligandi extracellulari (GABA-R e glicina-R) 2) ---- canali attivati da ligandi intracellulari (CaCC)3) -----canali voltaggio-dipendenti4) ---- CFTR (cAMP-activated cystic fibrosis trans membrane conductance regulator)5) ---- canali attivati da stimoli sensoriali (attivati dallo stiramento (stretch)

della membrana)

La natura molecolare dei canali ionici stretch-attivati permeabili al cloro non è ancora chiara. Tra le proteine che potrebbero essere considerate come dei probabili candidati ci sono:

---Mdr o glicoproteina-P (Pgp), ---la proteina FXYD1, ---le proteine ClC (D’Anglemont et al,. 2003).

--canali ionici

--trasportatori

Nei mammiferi si distinguono nove geni ClC divisi in tre gruppi in base all’omologia di sequenza. I canali ClC-2 e ClC-3 sono stati proposti come possibili candidati dei canali del cloro stretch-attivati.

CANALI DEL CLORO STRETCH-ATTIVATI: FAMIGLIA GENICA ClC

ClC-2--conduttanza anionica--voltaggio-dipendente

ClC-3--costitutivamente aperto--conduttanza anionica--assenza di un’identità molecolare per la mancanza di inibitori farmacologici specifici.

D’Anglemont et al., (2003): Structure and pharmacology of swelling sensitive chloride channels, ICl,swell . Fundamental & Clinical Pharmacology.; 17: 539–553.

LA TECNICA ELETTROFISIOLOGICA DEL PATCH CLAMP

B. Sakmann e E. Neher (premio nobel per la Fisiologia e Medicina 1991)

Cell-attached

Whole-cell

UNO STIMOLO IPOTONICO ATTIVA UNA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI DI FETTINE DI IPPOCAMPO

0 5 10 15 20

100

200

300

Hypotonic medium

I (p

A)

Time (min)

270 mOsm

-200 -150 -100 -50 0 50 100

-300

-200

-100

0

100

200

300

0'

n=77 I (pA

)MP (mV)

15'

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE FETTINE DI IPPOCAMPO VIENE INIBITA DAI BLOCCANTI DEI CANALI ANIONICI

-24 -18 -12 -6 0 6 12 18

100

200

300

400

500

600

I (pA

)

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

I (%

)

IAA-94

FFA IAA-94 DIDS

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA E’ TRASPORTATA DALLO IONE CLORO

-200 -150 -100 -50 0 50 100

-300

-200

-100

0

100

200

300

I -I 0

(pA

)

MP (mV)

Control (n=80)

0 mM Cl- (n=5)

1) -- CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DELLA

CORRENTE DI CLORO STRETCH-ATTIVATA

2) -- MOVIMENTO DEL CLORO NELLE CELLULE BV-2 TRASFETTATE CON IL SENSORE DEL CLORO

LA LINEA CELLULARE MICROGLIALE BV-2

Studio del movimento del cloro tramite tecniche di fluorescenza

---- funzioni cellulari (per es. riarrangiamento dei processi citoplasmatici)

MISURA DELLA CONCENTRAZIONE INTRACELLULARE DEL CLORO MEDIANTE TECNICHE DI IMAGING

La misura diretta della concentrazione intracellulare del cloro nelle cellule , è resa difficile da due caratteristiche: un basso rapporto delle [Cl-] tra l’ambiente intracellulare ed extracellulare, approssimativamente 10:1 e una driving force molto ridotta ,in quanto il potenziale di inversione del cloro si avvicina molto al potenziale di riposo delle cellule.Piotr Bregestovski, Tatyana Waseem and Marat Mukhtarov,(2009); Genetically encoded optical sensors for monitoring of intracellular chloride and chloride-selective channel activity. Front. Mol. Neurosci. 2, 1-15.

Cl-Cl- 1:10

MISURA DELLA CONCENTRAZIONE DI CLORO INTRACELLULARE MEDIANTE SONDE FLUORESCENTI

1) --- fluorofori di derivazione chinolinica (SPQ, MEQ e MQAE).

2) --- espressione endogena di cromofori (GFP e YFP).

3) --- l’indicatore raziometrico Clomeleon (CFP + TFP).

SVANTAGGI

---eccitazione con UV. ---alta sensibilità alle variazioni del pHi.---scarsa sensibilità di legame al cloro.--- tossicità.

Kuner et al., (2000). A genetically encoded ratiometric indicator for chloride: capturing chloride transient in cultured hippocampal neurons. Neuron 27,447-459.

Il Cl-sensor: un indicatore raziometrico e non invasivo

VANTAGGI--- elevata sensibilità di legame al cloro (EC50 = 30 mM). Clomeleon (EC50 = 90 mM)

---Fluorecence ratio (R) = F445/F485

Il Cl-sensor è una proteina di fusione costituita dalla CFP unita, tramite una regione linker di 20 amminoacidi, ad una forma mutata della YFP (YFP-H148Q/ I152L/V163S).

Markova O, Mukhtarov M, Real E, Jacob Y, Bregestovski P., (2008): Genetically encoded chloride indicator with improved sensitivity. Journal of

Neuroscience Methods.; 170 : 67–76.

NELLE CELLULE SOTTOPOSTE AD UNO STRESS OSMOTICO, DOVUTO AD UNA SOLUZIONE IPOTONICA, SI OSSERVA L’ATTIVAZIONE DI UNA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA

ISOTONICA IPOTONICA ISOTONICA

0 5 10 15 20 25 3050

100

150

200

250

300

IPOTONICA 205mOSM

I(pA)

tempo(min)

286 mOsm

205 mOsm205 mOsm

UNO STIMOLO IPOTONICO ATTIVA UNA CORRENTESTRETCH-ATTIVATA, AD ANDAMENTO RETTIFICANTE, NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2

-100 -75 -50 -25 0 25 50 75

-1000

-500

0

500

1000

1500t-test p<0.05; n=9

ctrl ipotonica wash

I(pA)

MP(mV)

-120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60

-600

-300

0

300

600

900

1200I(pA)

MP(mV)

n=9

IPOTONICA

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE BV-2 VIENE INIBITA DALL’ ACIDO FLUFENAMICO

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80

-1000

-500

0

500

1000

1500

2000

FFA = 200 M

t-test p<0.05

ipotonica+FFA ipotonica isotonican=4

MP(mV)

I(pA)

0 2 4 6 8 10 12 14 160

500

1000

1500

2000

2500

3000

I(pA)

tempo(min)

IPOTONICA

FFA=200M

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2 E’ TRASPORTATA DALLO IONE CLORO

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60

-300

-200

-100

0

100

200

300

400INTRA KGluconato 287 mOsm

I(pA)

MP(mV)

n=7

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

t-test p<0.05I(pA)

MP(mV)

n=6

isotonica ipotonica wash

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2 E’ TRASPORTATA DALLO IONE CLORO

-140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

intra KCl 0.5 EGTA 287 mOsmintra KGluconato 0.5 EGTA 287 mOsm

intra KCl (n=6) intra KGluc. (n=7)

I ipo-

I iso(p

A)

MP(mV)

[Cl-]i = 144 mM

[Cl-]e = 100 mM

[Cl-]i = 0 mMX

1) --- potenziale di riposo delle cellule BV-2

2) --- potenziale di equilibrio del cloro delle cellule BV-2

Il valore sperimentale del potenziale di riposo è stato misurato utilizzando la tecnica del patch-clamp nella configurazione di whole-cell, osservando il valore di potenziale a cui si registra una corrente netta uguale a zero.

La media dei potenziali di riposo misurata è stata -40 ± 4 mV (n=27).

IL FLUSSO DEL CLORO NELLE CELLULE TRASFETTATE CON IL Cl-SENSOR

Parametri importanti per vedere l’ingresso del cloro nelle cellule:

Cl- Sensor

--Proteina di fusione tra CFP e YFP***

--Indicatore raziometrico (R=F445/F485 )

MISURA DELLA CONCENTRAZIONE DI CLORO INTRACELLULARE

1 10 1000.5

1.0

1.5

n=4n=5

n=5

n=9

n=14

n=9n=5

Flu

ore

cen

ce r

atio

(F

445/

F48

5)

[Cl mM]i

0 5 10 15 20 25 300

2

4

6

8

10

Num

ber o

f cel

ls

[Cl-]i (mM)

0 5 10 15 20 25 300.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

165 mM Cl-

50 mM Cl-

20 mM Cl-3 mM Cl-

Flu

ore

cen

ce r

atio

(F

445/F

485)

time (min)

ESCINA 80 M

Equazione di Nernst

ECl = RT/zF ln [Cl-]i /[Cl-]e. Ecl = 58 log 10,3/150 = -67 mV

Allo scopo di ottenere un segnale di fluorescenza più chiaro del movimento del cloro, indotto dallo stimolo ipotonico, abbiamo utilizzato delle soluzioni extracellulari ad alta concentrazione di potassio (60 mM), per depolarizzare le cellule, aumentare la driving force che agisce sullo ione e vedere l’entrata del cloro.

[K+]i = 140 mM [K+]e = 4 mM

[K+]e = 60 mM

Cl-

LA DEPOLARIZZAZIONE DELLE CELLULE BV-2, PERMETTE DI VEDERE UN FLUSSO DI CLORO INTRACELLULARE

0 2 4 6 8 100.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Time (min)

Flu

orec

ence

rat

io (

F44

5/F

485) 205 mOsm

NELLE CELLULE TRASFETTATE CON IL SENSORE DEL CLORO SI OSSERVA UN MOVIMENTO DI CLORO INTRACELLULARE

0.4

0.5

0.6

0.7 60 mM K+

**

n=6

**

Fluo

rece

nce

ratio

(F44

5/F

485)

0 10 20 30 40 50

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

60 mM K+

time (min)

Flu

orec

ence

rat

io (

F44

5/F

485)

6 mM Cl-

60 mM K+

SOLUZIONE IPOTONICA (205 mOsm)

CONCLUSIONI

Cl-

Stiramento

1) Le cellule BV-2 presentano una corrente attivata da stimoli ipotonici tipica della microglia:• trasportata da ioni Cl-

• inibita dall’acido flufenamico, un bloccante dei canali anionici

2) In cellule che esprimono il sensore del Cl-, si osservano direttamente i flussi di Cl-.associati all’attivazione della corrente

Cl-Cl-sensorDistribuzione locale e dinamica del cloro