Extraktion von Nukleinsäuren mit der Phenol/ …illumina-chemie.de/extraktion-von-nukleinsaeuren-(phenol-chloroform... · EDTA-Na (Dinatrium-ethylendiamin-tetraacetat). In der Molekularbiologie

Extraktion von Nukleinsäuren (Phenol/Chloroform Methode)

Illumina-Chemie.de - Artikel Biologie

Extraktion von Nukleinsäuren mit der Phenol/ ChloroformMethode

Auf diesem Verfahren basieren Reagenzien für die Nukleinsäurenextraktion wie z.B. TRIzol Reagent® derFirma Invitrogen (Life Technologies™) oder TriFast™ der Firma peqLab. Heutzutage werden vermehrt DNA-/RNA-Isolationskits verwendet. Diese basieren auf einem anderen System.

Geräte:

Zentrifuge, Vortexer oder Radschüttler (je nach gewünschter Größe der Nukleinsäuremoleküle), PCRReaktionsgefäße, Mikroliterpipetten (100 - 1000 µL, beim späteren Trennen der Phasen bietet sich auch einePipette von 2 – 20 µL an), Pipettenspitzen in Racks

Chemikalien:

Probe (aus Escherichia coli) (B)

(von der isolierten Nukleinsäure geht keine biologische Gefahr mehr aus)

Phenol (C, N, T, Xn)

Tris- bzw. TE- gepuffert (*)

Chloroform (T, Xn)

3-Methyl-1-butanol (F, Xi)

2- Propanol (F, Xn)

oder Ethanol (F, Xi)

Artikel im Web: http://illumina-chemie.de/extraktion-von-nukleinsaeuren-%28phenol-chloroform-methode%29-t3115.html

Copyright illumina-chemie.de, Autor: Dimethylsulfoxid, Geschrieben am 02.01.2012 1 von 6


(*) Der TE-Puffer inhibiert keine an der PCR beteiligten Enzyme wie z.B. Polymerasen, inhibiert aberNukleasen und eignet sich daher besonders gut zur Pufferung von Lösungen die Nukleinsäuren enthaltenund für die PCR/ Sequenzierung erstellt wurden. Der TE-Puffer besteht aus TRIS(Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), oft auch das NatriumsalzEDTA-Na (Dinatrium-ethylendiamin-tetraacetat). In der Molekularbiologie ist der TE-Puffer Standard um denAbbau von DNA und RNA zu verhindern. Er sollte nicht mit dem für die Agarosegelelektrophoreseerforderlichen TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA) verwechselt werden.

Anleitung für einen 1X TE-Puffer: 10 mM (1.21 g/L) TRIS1 mM (0,372 g/L) EDTA

Der pH-Wert wird mit Natronlauge und Salzsäure auf 8,0 eingestellt (bzw. auf den angegebenden Wert).

Hinweis:

Phenol ist giftig. Chloroform steht im Verdacht Krebs zu erzeugen! Versuche sollten unter dem Abzugdurchgeführt werden. Für den Versuch sollte nur Phenol genommen werden, welches keine Oxidationaufweist. Alle Arbeitsgeräte und Einmalartikel sollten steril, Ribonuklease und Desoxyribonuklease frei sein(z.B. Eppendorf Biopur). Bei Bedarf kann man aber entsprechende Enzyme hinzugeben um entweder DNAoder RNA zu erhalten.

Durchführung:

Zunächst wird eine 1:1 Mischung aus Phenol und Chloroform erstellt. Dabei sollte sich alles Phenol in demChloroform lösen. Etwas 3-Methyl-1-butanol (Isoamylalkohol) kann obligatorisch hinzubegeben werden. Man gibt die Nukleinsäure haltige Probe in ein PCR Reaktionsgefäß und gibt 1 Volumen (z.B. 500 μL)der zuvor erstellten Mischung hinzu. Zur Isolation von kleinen DNA/ RNA Molekülen (<100 kb) wird die Probegevortext, mittlere DNA Moleküle (10-30 kb) durch leichtes Schütteln oder durch schnelles Kippen, großeDNA Moleküle (>30 kb) z.B. durch Drehen auf einem Radschüttler. Die Probe wird nun eine Minute bei 80%zentrifugiert, sollte danach keine klare Trennung der Phasen zu erkennen sein, kann weiter bis 10 min. langzentrifugiert werden. An der Grenzlinie zwischen den Phasen müsste nun eine denaturierte weißeAnsammlung von Proteinen zu sehen sein. Die wässrige Phase (meistens oben) kann nun mit einer Pipetteabpipettiert werden und in ein neues PCR Reaktionsgefäß gegeben werden. Die mittlere und untere Phasekann verworfen werden. Die bisher genannten Schritte werden solange wiederholt, bis keine Proteine mehrzu erkennen sind. Zur Reinigung der Nukleinsäure von Phenol wird 1 Volumen Chloroform hinzu gegebenund die Schritte wiederholt. (Sollte nur Phenol verwendet worden sein, sollte dieser Schritt zweimal erfolgen!)

Rückgewinnung der Nukleinsäure durch Präzipitation mit 2 Volumina 2- Propanol, alternativ Ethanol.

Entsorgung:

Der überstand wird zu den halogenhaltigen organischen Abfällen gegeben. Die gereinigte Nukleinsäure kannfür weiter molekularbiologische Zwecke (z.B PCR oder Sequenzierung) verwendet werden.




Erklärung:

Da für Molekularbiologische, Biochemische und Gentechnische Verfahren möglichst reine Nukleinsäurenbenötigt werden, müssen diese von den Proteinen aus der lysierten Zelle deaktiviert und getrennt werden.Einer der wichtigsten Verfahren zur Trennung von Proteinen und Nukleinsäuren ist diese Extraktion. DieProteine werden durch das Phenol denaturiert. Die DNA bzw. auch RNA sammelt sich in der wässrigenPhase an und kann leicht von der Zwischenphase getrennt werden.

Die Phenol Extraktion ist hocheffizient, da schon nach 3 Phenol Extraktionen sehr reineNukleinsäure-Fraktionen erhalten werden können. Das Phenol sollte für eine DNA Extraktion Tris- bzw. TE-gepuffert sein und ein pH-Wert von 7,8 haben. Für die RNA Aufreinigung wird in Aqua. Dest. gelöstes Phenolverwendet, dass einen pH-Wert von 4,8 besitzt. Bei diesem pH-Wert wird die DNA gezwungen, sich in derorganischen und der Protein- Interphase anzureichern, dies verringert eine Kontamination der RNA durchDNA. Meistens befindet sich die wässrige Phase oben, allerdings können sich auch beide Phasen mischen,sogar invertieren (Wenn große Mengen gelöste Stoffe enthalten sind z.B. Salze oder Zucker. Das Invertierenkann durch eine 1:1 Mischung aus Phenol und Chloroform verhindert werden, da aufgrund der höherenDichte des Chloroforms eine klare Unterscheidung beider Phasen möglich ist. Isoamylalkohol kannhinzugegeben werden um das Schäumen der Organischen Phase zu verhindern, welches das pipettierenstark behindern kann.

Dieses Verfahren, auch „single step“ genannt, war das Erste mit dem DNA und RNA getrennt werdenkonnten. Es wurde von Piotr Chomczynski und Nicoletta Sacchi entwickelt. Oft enthält das Phenol/ Chloroform Gemisch ein Denaturierungsagent wie Guanidiniumthiocyanat. DasGuanidiniumthiocyanat kann Zellen lysieren und RNasen sowie andere Enzyme inaktivieren.

Bilder:




Zugabe von Phenol/ Chloroform zur Probe.

Vortexen zum gewinnen von kleinen DNA/ RNA Molekülen.




Zentrifugieren zum trennen der Phasen.

Die weiße Phase enthält die denaturierten Proteine.




Zugabe von Chloroform um die Nukleinsäure von Phenol zu reinigen.

Rückgewinnung der Nukleinsäure.



Documents

Extraktion von Nukleinsäuren mit der Phenol/ …illumina-chemie.de/extraktion-von-nukleinsaeuren-(phenol-chloroform... · EDTA-Na (Dinatrium-ethylendiamin-tetraacetat). In der Molekularbiologie