Expression du Expression du GGéénomenome

Le transcriptomeLe transcriptome

Déchiffrage de l’Information Déchiffrage de l’Information GéniqueGénique

L’information est encodée dans la L’information est encodée dans la séquence de nucléotides contenus séquence de nucléotides contenus dans des unités discrètesdans des unités discrètes Les gènesLes gènes

L’information contenue dans les L’information contenue dans les gènes est transcrite pour générer gènes est transcrite pour générer les ARNs puis décodée pour les ARNs puis décodée pour générer les protéinesgénérer les protéines

Les GènesLes GènesSite d’initiationde la transcription

Séquence de terminaison

3’

Promoteur/Region régulatrice

5’

Introns

Transcrit d’ARN

Region 5’ nontraduiteRegion 3’ nontraduite

Exon 2 Exon 3Int. 2Exon 1 Int. 1

Exons

Seulement un des deux brins d’un gène est codant!

CodantCodant

Brin CodantBrin Codant Brin positifBrin positif Brin sensBrin sens Brin complémentaire à la matriceBrin complémentaire à la matrice Brin dont la séquence est Brin dont la séquence est la mêmela même

que celle de l’ARN transcritque celle de l’ARN transcrit Brin sur lequel se retrouve le Brin sur lequel se retrouve le

promoteurpromoteur4

Non CodantNon Codant

Brin non CodantBrin non Codant Brin négatifBrin négatif Brin anti sensBrin anti sens Brin matriceBrin matrice Brin dont la séquence est Brin dont la séquence est

complémentairecomplémentaire à celle de l’ARN à celle de l’ARN transcrittranscrit

5

Codant Vs Non-codantCodant Vs Non-codant

ADN: 5’ TAG 3’3’ ATC 5’

Traduction

LeuProtéine:

Code génétique: CUA = Leu UAG = Arrêt

Transcription

ARN: ?5’ 3’

GénomeGénome

TranscriptomeTranscriptomeRépertoire d’ARN des gènes qui

codent pour des protéinesRépertoire d’ARN qui représente la fraction du génome qui est exprimée

ProtéomeProtéomeRépertoire de protéines dérivées

du transcriptome

Un Génome

Le transcriptome est-il le même dans toutes les cellules d’un organisme?

Le transcriptome est-il toujours le même dans une cellule donnée?

Est-ce qu’une Séquence Est-ce qu’une Séquence Code pour un Transcrit?Code pour un Transcrit?

Analyse d’hybridations Northern : Analyse d’hybridations Northern :  RT-PCR RT-PCR 

9

Comparaison des Comparaison des MéthodesMéthodes

10

Northern RT-PCR Séquence doit être connue

Présence ou absence d’un transcrit

Permets de déterminer la taille

Sensibilité

Comparer l’abondance relative

Obtenir la séquence du transcrit

Déterminer quel brin d’ADN est transcrit

Déterminer combien de transcrits sont fait à partir d’une séquence

Non Oui

Oui Oui

Oui Non

Faible Élevée

Oui Oui

Non Oui

Oui Oui

Oui Non

LA SÉQUENCE DOIT ÊTRE EXPRIMÉE OUI OUI

Analyse NorthernAnalyse Northern

Isoler l’ARN total de cellules ou Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissud’un tissu

Séparer les ARN d’après leurs Séparer les ARN d’après leurs grosseurs sur gel d’agarose grosseurs sur gel d’agarose dénaturantdénaturant Formaldéhyde + FormamideFormaldéhyde + Formamide

Hybridation avec une sonde Hybridation avec une sonde complémentairecomplémentaire

ARNr

ARNt

Hybridation NorthernHybridation Northern

Nécessite une sondeNécessite une sonde Hybridation = la sonde possède Hybridation = la sonde possède

des séquences d’un gène des séquences d’un gène La séquence est expriméeLa séquence est exprimée

Intensité du signal d’hybridation Intensité du signal d’hybridation = abondance relative = abondance relative

Nombre de signaux d’hybridation Nombre de signaux d’hybridation = nombre de transcrit = nombre de transcrit

Possiblement nombre de gènesPossiblement nombre de gènes12

Hybridation NorthernHybridation Northern

Permet de comparer la quantité Permet de comparer la quantité relative d’un transcritrelative d’un transcrit Sensibilité faibleSensibilité faible Requiert un témoin interneRequiert un témoin interne

Gène dont l’abondance est constante Gène dont l’abondance est constante sous les différentes conditions examinéessous les différentes conditions examinées

– Témoin pour les variations de la quantité Témoin pour les variations de la quantité d’ARN chargéd’ARN chargé

– Utilise des gènes domestiques :Utilise des gènes domestiques : Gènes qui assurent les fonctions Gènes qui assurent les fonctions

indispensables à la vie de tous les types indispensables à la vie de tous les types de cellules de cellules

Expression constitutiveExpression constitutive

13

La NormalisationLa Normalisation

14

ProblèmeProblème

Un Northern d’ARN isolé de Un Northern d’ARN isolé de différents tissus a été sondé avec différents tissus a été sondé avec le gène Fos et le gène domestique le gène Fos et le gène domestique actine. Expliquer les résultats actine. Expliquer les résultats obtenusobtenus

15

Tissus: F C R P Tissus: F C R P

ActineActine

FosFos

RT-PCRRT-PCR

Permets d’amplifier une séquence Permets d’amplifier une séquence d’ARNd’ARN Isoler l’ARN total de cellules ou d’un Isoler l’ARN total de cellules ou d’un

tissutissu Transcrire les ARN en ADNc avec Transcrire les ARN en ADNc avec

transcriptase inversetranscriptase inverse Amplifier par PCR la séquence Amplifier par PCR la séquence

d’intérêtd’intérêt

16

Réaction de Transcriptase Réaction de Transcriptase InverseInverseGène Non-SpécifiqueGène Non-Spécifique

17

AAAAAAATTTT

AAAAAAATTTT

AAAAAAATTTTAAAAAAATTTTAAAAAAATTTT

Appariement d’amorce polyT

CollectionCollection d’ADN complémentaire aux ARNm exprimés à un temps donné sous une condition donnée

AAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAA

AAAAAAA

ARNm

AAAAAAATTTT

AAAAAAATTTT

AAAAAAATTTTAAAAAAATTTTAAAAAAATTTT

Transcription d’ADNc

T.I.

Réaction de Transcriptase Réaction de Transcriptase InverseInverseGène SpécifiqueGène Spécifique

18

AAAAAAA

AAAAAAA

AAAAAAA

AAAAAAA

AAAAAAA

Synthèse d’ADNc

T.I.

ADN complémentaire à unun ARNm d’intérêt

AAAAAAA

AAAAAAA

AAAAAAA

AAAAAAA

AAAAAAA

Appariement d’une amorce gène spécifique

AAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAA

AAAAAAA

RTRT PCR PCR

19

Collection d’ADNc ADNc d’ARN d’intérêt

Analyse sur gel

PCR avec des amorces spécifiques à une séquence d’intérêt

RT-PCRRT-PCR

La séquence doit être connue pour la La séquence doit être connue pour la conception d’amorcesconception d’amorces Produit d’amplification =Produit d’amplification =

Les séquences des amorces font partie d’un gèneLes séquences des amorces font partie d’un gène La séquence est expriméeLa séquence est exprimée

Intensité du produit d’amplification Intensité du produit d’amplification = abondance relative = abondance relative

La taille du produit d’amplification n’est pas La taille du produit d’amplification n’est pas égale à la taille du transcritégale à la taille du transcrit

20