REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA P. C. R.

INTRODUCCIÓN

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica enzimática que permite la amplificación in vitro de una región específica del ADN dando como resultado la obtención de millones de copias.

¿ Qué es PCR?

•Se desarrolló a principios de ´80s por el Dr. Kary Mullis.

•El gran poder del PCR reside en su elevada especificidad, sensibilidad y a la vez versatilidad.

•La especificidad y la versatilidad del PCR permiten que cualquier secuencia de ADN pueda ser detectada utilizando un corto oligonucleótido

ESTRUCTURA DEL ADN

FUNDAMENTO

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamenteInicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. como: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), 

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Necesaria para cada etapa de la reacción.

Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción

PROCESO DE P. C. R.

COMPONENTES PARA EL P.C.R.

¿ QUÉ ES UN OLIGONUCLEOTIDO, PRIMER O CEBADOR?

•Un oligonucleotido es un muy pequeño fragmento de ADN

• El oligonucleótido puede ser tan corto como 10 bases de longitud.

CÓMO ELEGIR LOS PRIMERS??

18-30 bases de largo Complementarios a ADNFlanquean la región a amplificar

•No deben formar estructuras secundarias solos o con su par (Ej. Horquillas, dimeros)

•La temperatura de fusion (Tm) de los primers deben ser similares

• Tm: Temperatura a la cual los primers estan 50% unidos a la hebra molde.

• % G-C deben ser similares entre ambos primers

ETAPAS DEL P. C. R.

•Denaturación inicial

• Denaturación

• Hibridación o Anillamiento

• Extensión

• Extensión final

¿Como se descontamina una superficie de DNA?

- Detergentes o jabones

- NaOCl - Calor- Acidos - Bases - Luz

ultravioleta - Radiación

actínica - DNAsas

Perfil tipico de temperaturas en el PCR

94oC

72oC

55oC

94oC

72oC

55oC

Perfil tipico de temperaturas en el PCR

94oC

72oC

55oC

Perfil tipico de temperaturas en el PCR

5’

5’

3’

3’

Primer ciclo de amplificación

2 ADN moldes

5’

5’

3’

3’

El segundo ciclo de amplificación produce 4 ADN molde