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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDA NTE Y EL EFECTO CITOTOXICO
DE LOS EXTRACTOS ETANOLICOS, ETÉREOS Y FRACCIONES DE LAS
INFLORESCENCIAS Y HOJAS DE Achyrocline bogotensis (Kunth) DC (ASTERACEAE)
JULIÁN ESTEBAN CONTRERAS PATIÑO
UNIVERSIDAD DISTRITAL “FRANCISCO JOSE DE CALDAS”
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2015
2
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y EL EFECTO CITOTOXICO
DE LOS EXTRACTOS ETANOLICOS, ETÉREOS Y FRACCIONES DE LAS
INFLORESCENCIAS Y HOJAS DE Achyrocline bogotensis (ASTERACEAE)
Presentado por: Julián Esteban Contreras Patiño
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Licenciado en
Química
Realizado en el grupo de investigación Productos Naturales de la Universidad de Ciencias
Aplicadas y Ambientales U.D.C.A.
Director: Ruben Dario Torrenegra Guerrero
Químico
Codirector: Josue Anselmo Garcia
Químico
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2015
3
Nota de aceptación:
________________________________
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________________________________
________________________________
________________________________
Firma del Jurado
________________________________
Firma del Jurado
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Fecha:
_____________________________
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Dedicatoria
A mis abuelas, mi padre y mi hermano por su recuerdo estén donde estén
A mi madre y mis hermanas por su compañía y ser mi motor
A mi abuela Gladys por guiarme en este camino
A mi abuelo Santiago por enseñarme tanto de la vida
A mi tio Felipe por ser mi ejemplo y ayuda
A mi padrino por cumplir su promesa
A mis amigos de Universidad por sus consejos y palabras de aliento
A mis amigos de colegio por su incondicionalidad
A todos los allegados que me acompañaron en este camino
Julián Esteban Contreras Patiño
5
Agradecimientos
A los docentes Rubén Darío Torrenegra y Josué García por su orientación y paciencia con la
realización de este trabajo.
A la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A. especialmente a la decana de la
Facultad de Ciencias Cheyron Castellanos por su colaboración al facilitarme el espacio de
trabajo en los laboratorios de la Universidad.
A la docente Gina Méndez Callejas de la Facultad de Medicina, por su orientación y ayuda en los
ensayos citotóxicos y sus aportes en mi formación personal, académica y profesional.
A la docente Jeanet Rodríguez Mayusa de la Facultad de Ciencias por la ayuda en la recolección,
procesamiento del material vegetal, ensayos de actividad antioxidante y sus aportes en mi
formación personal, académica y profesional.
A las docentes Clara Rincón y Andrea García por su colaboración y aportes a mi formación
personal, académica y profesional.
Al Profesor John Jairo Gómez Piedras por su colaboración en los análisis estadísticos.
A la Universidad Distrital “Francisco José de Caldas” y su planta docente por brindarme los
conocimientos y habilidades necesarias para culminar mi carrera profesional.
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Contenido
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................13
1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN .................................................................................15
2. OBJETIVOS ........................................................................................................................16
2.1. Generales .....................................................................................................................16
2.2. Específicos ...................................................................................................................16
3. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................17
3.1. Familia ASTERACEAE (COMPOSITAE, DICOTILEDONEAS) .......................................17
3.1.1. Generalidades ........................................................................................................17
3.1.2. Estudios fitoquímicos y usos etnobotánicos de la familia ASTERACEAE .....................18
3.2. Genero Achyrocline .......................................................................................................18
3.2.1. Generalidades ........................................................................................................18
3.2.2. Estudios fitoquímicos y usos etnobotánicos del genero................................................19
3.3. Especie Achyrocline bogotensis ......................................................................................19
3.3.1. Generalidades de la especie .....................................................................................19
3.3.2. Caracterisiticas morfológicas de la especie ................................................................20
3.3.3. Clasificación de la especie .......................................................................................20
3.3.4. Estudios fitoquímicos y usos etnobotánicos de Achyrocline bogotensis .........................21
3.4. Efecto antioxidante. .......................................................................................................21
3.4.1. Los antioxidantes ...................................................................................................21
3.4.2. Medición del efecto antioxidante. .............................................................................23
3.4.3. Método del DPPH* (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo) .....................................................24
3.5. Efecto Citotóxico ..........................................................................................................26
3.5.1. Citotoxicidad .........................................................................................................26
3.5.2. El cáncer, datos y cifras actuales ..............................................................................27
3.5.3. Método del MTT para cuantificar la viabilidad celular ................................................28
3.5.4. Lineas Celulares .....................................................................................................29
3.5.5. Cultivo de células ...................................................................................................29
4. METODOLOGÍA ................................................................................................................31
4.1. Recolección de material vegetal ......................................................................................31
4.2. Extracción y fraccionamiento ..........................................................................................31
4.3. Cromatografía en capa delgada (CCD) .............................................................................31
4.4. Determinación de la actividad antioxidante 1,1- difenil2-picrilhidracil (DPPH) .....................31
4.5. Cultivo y tratamiento de las células, efecto citotóxico sobre líneas celulares. ........................32
4.6. Tratamiento Estadistico. .................................................................................................33
7
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................34
5.1. Actividad Antioxidante. .................................................................................................34
5.2. Efecto Citotóxico frente a Líneas Celulares Tumorales ......................................................36
5.2.1. Efecto sobre la Linea PC-3: Adenocarcinoma de Próstata ............................................39
6. CONCLUSIONES ................................................................................................................41
7. RECOMENDACIONES .......................................................................................................42
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................................43
9. ANEXOS ............................................................................................................................47
8
Indice de Figuras
Figura 1 Achyrocline bogotensis .................................................................................................. 20
Figura 2 Estructuras de algunas especies relacionadas con los efectos antioxidantes ................. 23
Figura 3 Reacción del DPPH con el antioxidante ........................................................................ 25
Figura 4 Métodos de cuantificación de citotoxicidad, según el área celular afectada ................. 27
Figura 5 Reacción de viabilidad celular por el método MTT. ..................................................... 28
Figura 6 Comparación entre las fracciones FAcOEtETOHH, FAcOEtETEH y FAcOEtETEF
contra los controles Quercetina y Trolox y su correspondiente línea de tendencia. ..................... 34
Figura 7 Comparación entre las fracciones ETOHF, ETOHH y FAcOEtETOHF contra los
controles Quercetina y Trolox y su correspondiente línea de tendencia. ..................................... 34
Figura 8 Comparación IC50 entre extractos y controles .............................................................. 35
Figura 9 Gráfico de agrupación Test de Duncan para la Actividad Antioxidante ....................... 36
Figura 10 Comparación entre fracciones para el Efecto Citotóxico para la Linea Celular MDA-
MB-231 ......................................................................................................................................... 36
Figura 11 Comparación entre fracciones para el Efecto Citotoxico para la Linea Celular MDA-
MB-231 ......................................................................................................................................... 37
Figura 12 Comparación IC50 entre extractos para la Linea Celular MDA-MB-231 ................... 37
Figura 13 Gráfico de agrupación Test de Duncan para el Efecto Citotóxico de los Extractos y
Fracciones sobre la Línea Celular MDA-MB-231 ........................................................................ 38
Figura 14 Comparación entre fracciones para el Efecto Citotóxico para la Línea Celular PC-3 . 39
Figura 15 Comparación del IC50 entre fracciones y extractos del Efecto Citotóxico para la
Línea Celular PC-3 ....................................................................................................................... 40
Figura 16 Gráfico de agrupación Test de Duncan para el Efecto Citotóxico de extractos y
fracciones sobre la Línea Celular PC-3 ........................................................................................ 40
9
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Clasificación de los métodos para determinar Actividad Antioxidante .......................... 24
Tabla 2 Ecuaciones de regresión para la Actividad Antioxidante de los extractos y controles con
el IC50 calculado para cada caso ± la desviación estándar .......................................................... 35
Tabla 3 Ecuaciones de regresión para el Efecto Antioxidante de los extractos con el IC50
calculado para cada caso ± la desviación estándar para la Linea Celular MDA-MB-231 ........... 37
Tabla 4 Ecuaciones de regresión para el Efecto Antioxidante de los extractos con el IC50
calculado para cada caso ± la desviación estándar para la Linea Celular PC-3 ........................... 39
10
INDICE DE ANEXOS
11.1. Test de Normalidad Shapiro-Wilk para la Actividad Antioxidante frente al DPPH
11.2. Prueba ANOVA de un solo factor para la Actividad Antioxidante frente al DPPH
11.3. Prueba de Duncan para las Varianzas de los Extractos frente a la Actividad Antioxidante
frente al DPPH
11.4. Test de Normalidad Shapiro-Wilk para el Efecto Citotóxico frente a la Línea Celular
MDA-MB-231
11.5. Prueba ANOVA de un solo factor para el Efecto Citotóxico frente a la Línea Celular MDA-
MB-231
11.6 Prueba de Duncan para las Varianzas de los Extractos contra el Efecto Citotóxico frente a la
Línea Celular MDA-MB-231
11.7. Test de Normalidad Shapiro-Wilk para el Efecto Citotóxico frente a la Línea Celular PC-3
11.8. Prueba ANOVA de un solo factor para el Efecto Citotóxico frente a la Línea Celular PC-3
11.9. Prueba de Duncan para las Varianzas de los Extractos contra el Efecto Citotóxico frente a
la Línea Celular PC-3.
11
ABREVIATURAS
AcOEt: Acetato de Etilo
ANOVA: Análisis de Varianzas.
CCD: Cromatografía en Capa Delgada.
DMSO: Dimetilsulfóxido
DPPH: 2,2 –difenil -1-picrilhidracilo
EC50: Concentración efectiva que induce una respuesta citotóxica a la mitad de la población
celular después de un tiempo de exposición.
EROs: Especies Reactivas Oxidativas
Et: Eter de Petroleo
ETETF: Extracto Etereo de Flores
ETETH: Extracto Etereo de Hojas
EtOH: Etanol
ETOHF: Extracto Etanolico de Flores
ETOHH: Extracto Etanolico de Hojas
FAcOEtETEF: Fracción Acetato de Etilo del Extracto Etereo de Flores
FAcOEtETEH: Fración Acetato de Etilo del Extracto Etereo de Hojas
FAcOEtETOHF: Fracción Acetato de Etilo del Extracto Etanolico de Flores
FAcOEtETOHH: Fracción Acetato de Etilo del Extracto Etanolico de Flores
FEtOHETEH: Fracción Etanolica del Extracto Etereo de Hojas
FEtOHETOHH: Fracción Etanolica del Extracto Etanolico de Hojas
IC50: Concentración efectiva a la que el 50% de la molécula radical se estabiliza por acción de
un antioxidante.
MTT: 3-(4,5-dimeriltiazol-2-il)-2,5-difenil bromuro de tetrazolio
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RESUMEN
El estudio fitoquímico de las hojas y flores de la especie de Achyrocline bogotensis permitió
obtener extractos y fracciones en orden de polaridad creciente, algunas con una promisoria
actividad antioxidante y citotóxica.
A partir del material vegetal colectado en la zona de Guasca e identificado preliminarmente in-
situ y posteriormente por el Herbario Nacional del Instituto de Ciencias Naturales de la
Universidad Nacional de Colombia, se molieron hojas y flores y se obtuvieron los extractos
mediante la técnica Soxhlet. El estudio previo de este espécimen nos permitió enfocarnos en la
búsqueda de los Flavonoides, responsables de las actividades antioxidantes de varias especies. El
fraccionamiento de los extractos también se realizó por método Soxhlet y empleando técnicas
cromatográficas con solventes de polaridad creciente.
La investigación se direcciono evaluando cada extracto, y fracción determinando en cuales de
estas se encontraban las mayores actividades biológicas objeto de estudio de este documento,
seleccionando las que superaron los umbrales del 50% tanto en Actividad Antioxidante como en
Viabilidad Celular.
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INTRODUCCIÓN
El estudio de los productos naturales, ya sea por su interés industrial, médico o farmacéutico, día
a día toma más fuerza a nivel mundial dado que encontramos que los principios activos de
algunos especímenes resultan mucho más potentes y efectivos que los obtenidos a nivel
industrial, con la ventaja de que son químicamente biodegradables y de bajo impacto ambiental o
en el caso de los metabolitos obtenidos para el estudio farmacéutico no presentan efectos
secundarios sobre el organismo, además en las dosis correctas no presentan toxicidad, es por esto
que el estudio de los metabolitos secundarios presentes en las plantas, árboles o algunos otros
seres vivos constituye uno de los más amplios y aún desconocidos campos de estudio a pesar de
la gran producción científica en torno a este tema. Es por esto que con base a estudios previos de
la misma especie y algunos estudios del mismo género los cuales presentan compuestos de gran
interés medico como el de la A. satureioides del cual se reportó un aquirofurano el cual tuvo un
alto impacto antihiperglicemico en un ratón con diabetes tipo 2 inducida (Carney, Krenisky,
Williamson y Luo, 2002; Sagawa, Takaishi, Fujimoto, Duque, 2004), se realizó el estudio de las
distintas fracciones de la Achyrocline Bogotensis en busca de compuestos con actividad
antioxidante y actividad citotóxica.
El estrés oxidativo surge en sistemas biológicos que han sido sometidos a una prolongada
exposición a oxidantes, o a una disminución de la capacidad antioxidante del sistema, o ambos
casos, este está frecuentemente asociado a la formación de radicales libres como las especies
reactivas oxigenadas (EROs), las cuales tienen gran incidencia en la patología de enfermedades
como el cáncer, enfermedades cardiacas, arterioesclerosis; enfermedades cerebrales y el
envejecimiento prematuro, entre muchas otras (Kohen, Nyska, 2002; Mesa-Vanegas, Gaviria,
Cardona, Sáez-Vega 2009). Estos generan un gran daño en las sustancias vitales como los
carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, además de generar un sinnúmero de
reacciones en cadena. (Velásquez, Prieto y Contreras, 2004; Halliwell, 2008).
Estos radicales libres son átomos o moléculas que tienen un electrón libre desapareado, lo cual lo
hace muy reactivo con otras especies químicas a su alrededor, causando daños muy peligrosos en
los tejidos vivos. (Weiguo, Richardson, Mombourquette y Weil, 1995). Aunque la producción de
las EROs es normal y constante, su incremento excesivo dado por muchos factores, altera su
mecanismo de eliminación causando variaciones a las biomoléculas y disminuyendo la
resistencia a factores medio ambientales en las células, desencadenando un grave impacto en los
procesos biológicos del organismo. Este desorden es conocido como estrés oxidativo y trae
consigo el padecimiento de trastornos y enfermedades degenerativas en los seres vivos (Reuter,
Gupta, Chaturvedi y Aggarwal, 2010; Vaghasiya, Dave y Chanda, 2011; Velázquez et al., 2004).
Uno de los trastornos más comunes provocados por los desórdenes del estrés oxidativo son los
tumores cancerígenos, algunos tratables si se descubren a tiempo y otros irreversibles, afectando
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todo tipo de tejidos. Algunos compuestos aislados en gran parte de especies naturales como
vegetales y microorganismos tienen un alto efecto antineoplásico por lo tanto es importante
detectar productos y compuestos que mediante ensayos biológicos puedan comprobar su
actividad inhibitoria sobre la actividad tumoral inicial.
El hecho de que un compuesto presente una alta actividad antioxidante puede o no estar ligado a
su efectividad citotóxica es por esto que es de suma importancia comprobar por separado dichas
actividades y determinar su relación con el contenido fenólico en la especie objeto de estudio.
15
1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
La diversidad de la flora y fauna colombiana, la cual contiene una diversa cantidad de
ecosistemas, uno de los más importantes en cuanto a diversidad de flora se refiere es el páramo
andino, que está conectado a través de las cordilleras con Perú y Ecuador. Colombia posee
alrededor del 44% de los páramos a nivel de Suramérica; además de ecosistemas como bosques,
sabanas, desiertos, selvas, pantanos, manglares, montañas y llanuras, que permiten la existencia
de cientos de especies endémicas tanto animales como vegetales, de estas últimas, el país cuenta
con unas 45.000 especies, cuyos estudios podrían ser una fuente potencial de sustancias naturales
de gran variedad química, que permitirían encontrar tratamientos eficientes para la cura de
síntomas, enfermedades y otros fines comerciales e industriales (Shi, Noguchi y Niki, 2001;
Proyecto páramo andino, sf.).
Una de las especies andinas del altiplano cundiboyacense es la Achyrocline Bogotensis (HBK),
conocida comúnmente como “vira-vira”, “suso”, “lechuguilla” o “cenizo”, se usa ampliamente
para tratar enfermedades de la piel o prostatitis. De esta planta se han reportado diferentes
compuestos desde flavonoides hasta dímeros de ciclobutano (Sagawa, Takaishi, Fujimoto, y
Ahmed, 2004; García Barriga, 1992; Torrenegra, Escarria, Tenorio, Achenbach, 1982). Así
mismo se han reportado actividades antibacteriana (bacteriostática; S. Aureus y Streptococus B.
Hemolítico, Bactericida; S. Aureus) y anti fúngicas (Fungistática; Microsporum gypseum y
Trichophyton mentagrophytes). (Chitiva, Restrepo y Torrenegra, 1988) y se reportó actividad
antimicrobiana frente a S. aureus (Cárdenas, Sánchez y Torrenegra, 1990).
Con base a estos estudios previos de esta especie y a la obtención de compuestos de tipo
flavonoide en esta, se realizó el estudio de las diferentes fracciones de los extractos etéreos y
etanolicos de la Achyrocline Bogotensis, en busca de compuestos similares, evaluandolas para
determinar su actividad antioxidante frente a un patrón ampliamente usado como el DPPH, así
como su citotoxicidad frente a diferentes líneas celulares, determinando si estos efectos pueden
llegar a causar un efecto positivo en la combatividad del estrés oxidativo y sus diferentes efectos
en los seres vivos.
16
2. OBJETIVOS
2.1. Generales
2.1.1. Evaluar la acción antioxidante y citotóxica de los extractos de hojas e inflorescencias
de la Achyrocline Bogotensis y determinar la(s) fracción(es) polar o apolar que
generan estas actividades.
2.2. Específicos
2.2.1. Separar mediante cromatografía en capa delgada los extractos que puedan contener
un único compuesto o varios mayoritarios y que puedan ser de interés y útiles para el
estudio.
2.2.2. Determinar las fracciones de distintas polaridades de Achyrocline bogotensis con
una alta actividad antioxidante
2.2.3. Cuantificar las actividades antioxidantes de las fracciones de Achyrocline bogotensis,
frente al DPPH.
2.2.4. Determinar la citotoxicidad de los diferentes extractos, frente a líneas celulares sanas,
y enfermas por cáncer (Seno y Próstata).
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3. MARCO TEÓRICO
3.1. Familia ASTERACEAE (COMPOSITAE, DICOTILEDONEAS)
3.1.1. Generalidades
La familia Asteraceae también llamadas compositae por muchos autores pertenece al orden de
las Asterales, esta familia denominada de malas hierbas, incluye los géneros Achillea, Anacylus,
Anthemis, Arctium, Artemisia, Bidens, Calendula, Centaurea, Chamaemelum, Chondrilla,
Chrysanthemum, Cichorium, Cirsium, Cnicus,Conyza, Cotula; Erigeron, Galinsoga, Lactusa,
Mantisalca, Picris, Scorzonera, Senecio, Silybum; Sonchus, y Taraxacum (Villarías, 2006). El
origen etimológico del nombre de la familia proviene del termino del latín “áster” que significa
“estrella” y que se refiere a la forma de las inflorescencias, (Freire Fierro, A. 2004) son
clasificadas como DICOTILEDONEAS MONOPETALAS, con flores hermafroditas, regulares o
irregulares, unisexuales o neutras, sésiles y reunidas sobre un receptáculo o capitulo, rebordeado
por un involucro compuesto de foliolos herbáceos o espinosos, dispuestos en varias filas, siendo
las exteriores más cortas que las interiores. Receptáculos de formas muy variadas, desnudos o
provistos de escamas o pajitas (bractéolas) entre las flores, que casi siempre son persistentes.
Cáliz monosépalo formado por sedas, aristas, pelos, escamas y raramente no tienen. Corola
monopétala tubular con cuatro o cinco dientes, irregular y prolongada en lengüeta que es
generalmente plana. Androceo con cuatro o cinco estambres, concrescentes insertados en el tubo
que es atravesado por el estilo. Gineceo formado de dos carpelos con ovario ínfero unilocular.
Estilo filiforme y bífido. Fruto en aquenio, provisto generalmente de pelosidades por medio de
los cuales son fácilmente diseminados por el viento, que se denomina vilano (Villarías, 2006).
Está familia está ampliamente distribuida por todo el mundo (cosmopolita), pero se halla mejor
representada, en regiones semiáridas, tropicales y subtropicales.
Para la flora colombiana esta familia comprende numerosas especies que crecen desde el páramo
de 4000 m.s.n.m. hasta 0 m.s.n.m. sobre el nivel del mar. Sin embargo la mayor distribución esta
entre los páramos y los subpáramos de las tres cordilleras. Son muchas las especies que la gente
del común considera como medicinales dentro de esta familia, esto también se debe a que los
campesinos e indígenas de la zona no reconocen las especies por aparte si no que les dan un
valor “medicinal” debido a su parecido entre unas y otras. (García Barriga, 1975).
18
3.1.2. Estudios fitoquímicos y usos etnobotánicos de la familia ASTERACEAE
La familia Asteraceae, es una de las más grandes de angiospermas, y es donde se ubica el género
Achyrocline. Varias especies de esta familia contienen compuestos poli acetilénicos y tiofenicos
los cuales se emplean como marcadores quimio taxonómicos, y cuya fototoxicidad actúa como
mecanismo de defensa de la planta. Algunos aceites esenciales de este tipo de plantas como el de
la Mikania micrantha tienen una actividad antiinflamatoria y antibacterial efectiva. Otras
especies como la Ambrosia spp., la Artemisia sp. y la Matricaria chamonilla poseen un
glucósido llamado azuleno, que es de gran valor en el mercado farmacológico, otras especies de
esta familia contienen absintol, ácido angélico y antémico que se emplean como
antiespasmódicos y estómaquicos. La Sphilantes americana L, contiene spilantina, spilantol,
fotosferina y cholina, que se usan para adormecer los órganos bucales, disminuir los dolores
dentales y combaten el Herpes.
El diente de león (Taraxacum officinale), contiene taraxina, alcohol cerilico, lacturecina, taninos,
inulina, colina, taracerina, para tratar el cáncer estomacal, también contiene saponinas, caroteno,
xantofila, glucósidos, flavonoides, alcoholes, ácidos salicílicos y mucílago.
Las especies del genero Tagetes, son altamente aromáticas y se usan para combatir cefaleas,
neuralgias y como antiséptico. La ruda Amarilla y la ruda de castilla, poseen aceites esenciales
que según los estudios fitoquímicos realizados a estas están ligados con metil-nonilcetona, rutina
(un glucósido flavonico), bergapteno y diversos alcaloides, estos últimos encontrados
mayormente en sus partes aéreas.
Algunas otras como la Chemodium ambrossioides (paico) tiene saponinas, quenopodio, geraniol,
ácidos orgánicos y ascaridiol, que tienen una alta actividad antiparasitaria. Las chenopodiaceas y
piperáceas poseen ascariol y geraniol la primera y piperacina la segunda, también usados
ampliamente para combatir los parásitos intestinales y las hemorroides.
Así mismo se encuentran en esta familia la malva, la escorbadura, él te de huerta el encenillo y el
llantén usados como expectorantes, emolientes y refrescantes contra las hemorroides, la sábila
(aloe vera) que contiene algunos glucósidos como la aolina el cual es bastante útil como
purgante, en algunos estudios realizados en México, se encontró una fuerte actividad cicatrizante
y desinfectante en heridas post operatorias. (Restrepo de Fraume, Romeo Quintero, Julio Fraume
y Palomino Torres, 2005)
3.2. Genero Achyrocline
3.2.1. Generalidades
En su mayoría son plantas herbáceas de alrededor de 1 m de altura, bien ramificadas sobre todo
en las partes ascendentes, de tallos erectos y pubescentes en su gran mayoría, de hojas alternas
sésiles de lineares a linear-lanceoladas de puntas agudas, lanuginosas o de pelos cortos los cuales
19
le dan una coloración blanquecina. Las inflorescencias se denominan capítulos, casi siempre de
color amarillento, con flores marginales femeninas con la corola filiforme y flores centrales
hermafroditas con la corola tubulosa. (García Barriga, 1975; Davies, Villamil, Ashfield, 2004).
En Colombia es frecuente en climas fríos y terrenos secos, crece a una altura de 2600-3300
m.s.n.m. (Chitiva, 1988).
3.2.2. Estudios fitoquímicos y usos etnobotánicos del genero
La mayoría de las plantas de este género tienen usos en forma de cataplasma o en decocción para
tratar enfermedades de la piel (ulceraciones, dermatitis, etc.), en el caso de la Achyrocline
Lehmannii, para tratar ulceraciones cancerosas o la Achyrocline Satureioides, para tratar tumores
malignos. (García Barriga, 1975).
De la Achyrocline Satureioides, se han reportado diversos flavonoides como la quercetina, 3-Ο-
metilquercetina y luteolina, las cuales desempeñan un papel importante en la actividad anti-
inflamatoria, obtenida a partir de sus extractos etanolicos. (De Souza, Bassani y Schapoval,
2007). Otro estudio revelo que infusiones de Achyrocline Satureioides comparados contra
infusiones de otras especies, si bien no presento la actividad antioxidante más alta, si presento un
efecto cito protector sobre células PC12 atacadas con H2O2, propiedad que se debe a la mezcla
de flavonoides no glicosilados. (Arredondo, Blasina, Echeverry, Morquio, 2003). Así mismo se
ha demostrado que tiene un alto efecto citotóxico en altas concentraciones, estudio realizado
sobre células Sertoli, demostrando que tiene un efecto cito protector, también en altas dosis por
las altas concentraciones de flavonoides presentes. (Polydoro, de Souza, Andrades, Da Silva,
2004).
Otras especies como la Achyrocline Hyperchlora, la cual es usada comúnmente en Argentina
como antiespasmódico, tónico y antihistamínico, reporto gran cantidad de flavonoides,
cariofileno, butirofenona y 6-metil-5-hepte-2-ona (Liendro, Uriburu, Viturro, Gil, 2007), la
Achyrocline Flaccida, natural de la Argentina reporto en sus aceites esenciales obtenidos por
hidrodestilación gran cantidad de α-pineno y β-cariofileno (Retta, Gatusso, Gatusso, Di Leo Lira,
2009). Por otra parte la Achyrocline Alata planta común de la región de Mato Grosso del sur en
Brasil, la cual se usa como anti-inflamatorio y sedante, reporto flavonoides y derivados de
fenilpropanoides, los cuales reportaron una gran actividad anti-inflamatoria y la inhibición del
crecimiento de edemas, en ensayos in-vivo e in-vitro. (Toffoli-Kadri, Carollo, Dias Lourenço,
Lousada, 2014).
3.3. Especie Achyrocline bogotensis
3.3.1. Generalidades de la especie
También conocida como suso, vira-vira, cenizo o lechuguilla, esta especie se ubica
principalmente en el altiplano cundi-boyacense ubicado en las laderas en hábito de hierba. Sus
20
usos más comunes son la aplicación tópica para tratar enfermedades de la piel como barros y
espinillas y en decocción para el tratamiento de la prostatitis. (Vademécum Colombiano de
Plantas Medicinales, 2008)
3.3.2. Caracterisiticas morfológicas de la especie
La Achyrocline bogotensis es una hierba con tallos erecto pubescentes o lanuginosos con
tricomas blancos; hojas alternas sésiles, linearlanceoladas, agudas en el ápice y con la base
angostada, enteras, con solo el nervio principal diferenciado, lanuginosas o densamente blanco-
pubescentes por las dos caras, 2-3,5 cm de largo, 1-6 mm de ancho; inflorescencia amarilla, en
glomérulos laxos, pedunculados, dispuestos en el extremo de las ramitas; cabuzuelas
heterógamas de 8 mm de largo; sésiles, con unas 18 flores; involucro cilíndrico; brácteas en
varias series, imbricadas, escoriáceas, las exteriores gradualmente más cortas, glabras, amarillas;
flores marginales femeninas con la corola filiforme, glabra, 4 mm de largo, flores centrales
hermafroditas, con la corola tubulosa y de unos 3 mm de largo; aquerios glabros, comprimidos
papo misereado blanco, formado por pelos numerosos, largos (Garcia Barriga, 1975). La especie
se encuentra entre los 2100 y los 3600 msnm en los departamentos de Cundinamarca, Boyaca,
Magdalena, Nariño, Norte de Santander, Santander y Quindío. (Pombo, 2003).
3.3.3. Clasificación de la especie
La clasificación sistematica de Achyrocline bogotensis es la siguiente:
Reino: Plantae
Phylum: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Asterales
Familia: Asteraceae
Género: Achyrocline
Epiteto/Especie: bogotensis
Figura 1 Achyrocline bogotensis
21
3.3.4. Estudios fitoquímicos y usos etnobotánicos de Achyrocline bogotensis
La Achyrocline bogotensis, tiene usos en forma de cataplasma o en decocción para tratar
enfermedades de la piel pero también para tratar la prostatitis. El efecto curativo en
enfermedades de piel fue comprobado mediante ensayos in-vivo, en la aplicación del extracto
total Etanolico por vía tópica sobre la lesión causada por la inoculación con S. Aureus,
comparados frente a un antibiótico tópico como la Oxacilina, el extracto etanolico mostro
actividad contra bacterias Gram positivas y hongos de igual manera mostro actividad contra la S.
Aureus el extracto acuoso. Los extractos totales etanolicos de hojas mostraron actividad
bacteriostática y Fungistática así como poder bactericida frente al S. aureus. (Chitiva etal. 1988)
Otro estudio comprobó la actividad del extracto etéreo de flores y hojas contra el S. aureus y S.
epidermis el extracto etanolico de flores presento actividad contra S. aureus y S. epidermis,
específicamente la fracción AcOEt del extracto etanolico (Cárdenas etal 1990).
Así mismo se encontró una alta actividad inflamatoria sobre tejido de musculatura liso en ratones
en el extracto acuoso de dicha especie por el profesor Javier Rincón y colaboradores.
3.4. Efecto antioxidante.
3.4.1. Los antioxidantes
Los antioxidantes son sustancias que previenen el daño por el estrés oxidativo, generado por
diferentes sustancias que ingresan al cuerpo liberando radicales libres que afectan el
comportamiento celular. Los antioxidantes pueden ser cualquier tipo de molécula: enzimas,
proteínas o compuestos químicos que por su naturaleza tienen la capacidad de captar estos
radicales libres o especies reactivas oxigenadas, estos pueden ser un mecanismo natural o pueden
provenir sintéticamente de alimentos, suplementos o fármacos. (Shi et al., 2001)
Dentro de los antioxidantes podemos encontrar diversas moléculas que se dan como defensa
natural del cuerpo frente a los EROs, como el sistema micro vascular que se encarga de mantener
los niveles de O2 regulados a nivel muscular, a nivel bioquímico la defensa puede ser enzimática
o no enzimática o puede constituirse como un sistema reparador de moléculas. (Gil del Valle,
2011). (Tovar del Rio, 2013).
Dentro de los procesos enzimáticos se destacan las glutatión peroxidasas, las catalasas y las
superóxido dismutasas entre otros, estos se consideran primarios, la vitamina C y E, el β-
caroteno, las ubiquinonas, el ácido úrico y la bilirrubina, considerados como secundarios; otro
22
grupo encargado de la reparación de las biomoléculas dañadas. En este grupo se incluyen las
enzimas endonucleasa apurinica/apirimidínica y polimerasa β, reparadoras del ADN (Page,
Salmon, Leiser, Robb, 2009) y la metionina sulfóxido reductasa. (Tovar del Rio, 2013).
En algunos casos los antioxidantes encontrados en los diferentes extractos de especies naturales,
son incorporados en suplementos alimenticios o medicamentos, para potenciar la defensa del
organismo frente a este tipo de daños oxidativos.
Sin embargo como en todas las sustancias que presentan un beneficio potencial para la salud
humana, hay que tener en cuenta que una sobredosis de este tipo de compuestos no va a
representar un efecto mayor al de la ingesta normal, que generalmente no debe superar 1 g en
una dieta balanceada, esto por el contrario puede llevar a fallas renales o hepáticas asi como
dolor de cabeza o vértigo también están asociados a la sobredosis. (Youngson, 1994).
A continuación algunos de los grupos de antioxidantes más usados (Hall, 2001; Tsao et al.,
2004).
Compuesto R1 R2
5 Ácido p-
hidroxibenzoico
H H
6 Ácido vanílico H OCH3
7 Ácido siríngico OCH3 OCH3
8 Ácido dihidrobenzoico OH H
9 Ácido gálico OH OH
Compuesto R1 R2
10 Ácido p-cumárico H H
11 Ácido felúrico OCH3 H
12 Ácido sinápico OCH3 OCH3
13 Ácido cafeico H OH
Derivados del ácido benzoico Derivados del ácido cinámico
Flavonoles
23
Figura 2 Estructuras de algunas especies relacionadas con los efectos antioxidantes
3.4.2. Medición del efecto antioxidante.
La medición del efecto antioxidante no se puede determinar de una manera directa, pero si se
puede determinar midiendo el efecto sobre otra sustancia que emita radicales libres, valorando
una especie intermedia o el producto final de una oxidación controlada. (Tovar del Rio, 2013).
La actividad antioxidante de una muestra puede ser determinada basándose en varios ensayos de
pruebas, según su naturaleza hay métodos más exactos que otros, sin embargo esto también es un
problema a la hora de comparar los resultados de los ensayos. Esta medición se puede clasificar
según el mecanismo de reacción, por la transferencia de átomos de hidrogeno (HAT) o la
transferencia de electrones (TE). (Huang et al., 2005)
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5
14 Kemferol H OH H OH OH
15 Quercetina OH OH H OH OH
16 Miricetina OH OH OH OH OH
Licopeno
Astaxantina
Carotenoides
18
17
24
ENSAYO CATEGORIA
Ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico (ABTS++
)
Ensayos basados en la
transferencia de electrones
(ET)
1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH+)
Poder de reducción antioxidante del hierro (FRAP)
N,N-dimetil-ρ-fenilendiamina (DMPD)
Capacidad de reducción antioxidante del cobre (CURRAC)
Capacidad de absorción del radical oxigeno (ORAC)
Ensayos basados en la
transferencia de átomos de
hidrógeno (HAT)
Parámetro antioxidante de captura de radicales (TRAP)
Inhibición de la oxidación del ácido linoleico
Inhibición de la oxidación de los lípidos de baja densidad (LDL)
Tabla 1 Clasificación de los métodos para determinar Actividad Antioxidante
Los ensayos basados en la transferencia de electrones (ET) involucran una reacción redox con el
oxidante como un indicador del punto final de la reacción. La mayoría de los ensayos basados en
HAT moniorean una reacción cinética competitiva, generalmente están compuestos de un
generador de radicales libres sintético, una prueba molecular oxidable y un antioxidante. Los
ensayos basados en HAT y ET fueron desarrollados para medir la capacidad de atrapar radicales
libres, en lugar de la capacidad preventiva antioxidante de una muestra. (Huang et al., 2005;
Tovar del Rio, 2013).
En los últimos años se han adaptado un amplio rango de ensayos espectrofotométricos para
medir la capacidad antioxidante de los productos naturales. Usualmente los ensayos
antioxidantes in vitro utilizan un captador de radicales libres y son relativamente sencillos de
realizar. Dentro de estos ensayos uno de los más usados es el del DPPH*, es muy rápido y no
incluye muchos pasos, lo cual disminuye el error. (Tovar del Rio, 2013).
3.4.3. Método del DPPH* (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo)
Este método fue propuesto por Blois (1958) en el cual se demostró por primera vez la capacidad
del radical libre DPPH+ para aceptar un átomo de hidrógeno (H
+) preveniente de una molécula de
cisteína.
La molécula DPPH+ es conocida como un radical libre estable debido a la deslocalización de un
electrón desapareado sobre la molécula completa, por lo cual la molécula se dimeriza, como es el
caso de la mayoría de los radicales libres. La deslocalización del electrón también intensifica el
color violeta intenso típico del radical, el cual absorbe al estar disuelto en metanol a 517 nm.
Cuando la solución del DPPH+ reacciona con el sustrato antioxidante que puede donar un átomo
25
de hidrógeno, el color violeta se desvanece convirtiéndose en un color amarillo-ocre. El cambio
de color es monitoreado espectrofotométricamente y es directamente proporcional a la propiedad
antioxidante de la sustancia objeto de estudio. (Ojha et al., 2012).
1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (radical libre) 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (no radical)
Morado Amarillo-Ocre
Figura 3 Reacción del DPPH con el antioxidante (Alam et al., 2012)
Los resultados del ensayo DPPH+ se han presentado de diferentes maneras. La mayoría de los
estudios expresan los resultados como el valor de la concentración máxima de la media
inhibitoria (IC50), definido como la cantidad de antioxidante necesario para disminuir la
concentración inicial de DPPH al 50%. Este valor se calcula graficando el porcentaje de
inhibicón contra la concentración del extracto. (Deng et al.,2011).
Este método presenta algunas desventajas que limitan su aplicación:
La diferencia en el mecanismo de reacción que normalmente ocurre entre antioxidante y
radicales peroxilo.
El DPPH es un radical del Nitrogeno de larga vida, lo cual no guarda similitud con los
radicales peroxilo altmente reactivos y transitorios involucrados en la peroxidación
lipídica. Muchos antioxidantes que reaccionan rápidamente con radicales peroxilo,
reaccionan lentamente o son inertes al DPPH. Esto se evidencia en el tiempo necesario
para determinar el IC50 que van en un rango de 1,15 min (Ácido Ascorbico) a 103 min
(Rutina).
La reacción de DPPH+ con eugenol fue reversible, lo que puede resultar en lecturas falsas
para sustancias que contengan eugenol o estructuras fenólicas similares a este. (Vondet et
al., 1997)
26
3.5. Efecto Citotóxico
3.5.1. Citotoxicidad
La definición de citotoxicidad tiende a variar dependiendo de la naturaleza del estudio, si las
células mueren o simplemente tienen su metabolismo alterado. Estos ensayos son empleados
porque son baratos, fácilmente cuantificables y reproducibles. Muchos de los experimentos in
vitro, tienen el propósito de determinar la potencial citotoxicidad de los compuestos estudiados,
porque ellos van a ser usados como fármacos, cosméticos y deben demostrar que no son tóxicos
o porque van a ser usados con agentes anticancerígenos y la citotoxicidad es crucial para su
acción. (Freshney, 2000)
La configuración de los modelos experimentales empleados in vitro para valorar la toxicidad de
los compuestos químicos se fundamenta en dos pilares básicos, que son el sustrato biológico y
los indicadores de toxicidad. El sustrato es el material generalmente orgánico, vivo o no, sobre el
que se aplica in vitro el xenobiótico. Estas alteraciones se valoran para cuantificar las
modificaciones producidas en la estructura o fisiología de los componentes del sustrato de
ensayo. (Repetto, 1995)
En la década de los 90’s el descubrimiento de agentes antitumor de origen natural estuvo basado
en tests de actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer usando modelos in vitro o in
vivo. Muchos agentes anticancerígenos descubiertos usando tales ensayos han mostrado ejercer
su acción citotóxica a través de la interacción con la tubulina o de la inhibición de la
topoisomerasa. Con la identificación de un número creciente de blancos moleculares asociados
con cánceres particulares, el descubrimiento de drogas anti cáncer está basado ahora en el alto
rendimiento de tamizar compuestos contra un rango de dichos blancos. (Cragg y Newman, 2003)
Los ensayos de citotoxicidad se pueden clasificar en ensayos de viabilidad y ensayos de
supervivencia, los primeros se emplean para determinar la proporción de células que
inmediatamente después de un tratamiento significativamente traumático, se mantienen intactas.
Mediante estos ensayos se puede evaluar la citotoxicidad de un tratamiento en términos de
concentraciones letales (LC). (Freshney, 2000)
La concentración letal 50 (LC50) es la concentración de la sustancia de tratamiento que causa la
muerte al 50% de las células presentes, evaluadas inmediatamente después del tratamiento.
(Cordero, 2003).
27
Los ensayos de viabilidad que se basan en la capacidad que tienen las células para excluir
sustancias a las que son impermeables, ofrecen una interpretación instantánea. Estos tests de
viabilidad son para medir la tasa de supervivencia directamente, las células que al ser expuestas
al colorante no desarrollan color, se consideran viables y son de particular importancia para
agentes tóxicos los cuales ejercen su efectos primarios sobre la integridad de la membrana.
(Freshney, 2000)
Figura 4 Métodos de cuantificación de citotoxicidad, según el área celular afectada. Recuperado de
http://www.bioantares.com/uploads/Cyto_test.jpg
3.5.2. El cáncer, datos y cifras actuales
Cáncer es un término genérico designado a un amplio grupo de enfermedades que pueden afectar
a cualquier parte del organismo; también se habla de “tumores malignos” o “neoplasias
malignas”. Una característica del cáncer es la multiplicación rápida de células anormales que se
extienden más allá de sus límites habituales y pueden invadir partes adyacentes del cuerpo o
propagarse a otros órganos, proceso conocido como metástasis. Las metástasis son la principal
causa de muerte por esta enfermedad. (OMS, 2014).
Según datos de la OMS, el cáncer es la principal causa de muerte a escala mundial. Se le
atribuyen 8,2 millones de defunciones ocurridas en todo el mundo en 2014. Los principales tipos
de cáncer son los siguientes:
Pulmonar (1,59 millones de muertes)
Hepático (745.000 defunciones)
Gástrico (723.000 defunciones)
Colorrectal (694.000 defunciones)
Mamario (521.000 defunciones)
Cáncer de esófago (400.000 defunciones)
28
En Colombia según datos de la OMS los muertos en el último año por esta enfermedad llegaron
a 202.000, siendo los índices más altos para el cáncer de estómago en hombres (17,5%) y de
mama en mujeres (15,3%). (OMS, 2014) A pesar de que en el país existen programas de
prevención públicos respecto a la enfermedad, factores de riesgo como el consumo de tabaco y
alcohol y la inactividad física son los que más influyen en el desarrollo de esta enfermedad.
3.5.3. Método del MTT para cuantificar la viabilidad celular
Muchos ensayos biológicos requieren medir la supervivencia y/o proliferación de las células de
mamífero, esto puede lograrse por varios métodos, para esto se desarrollo un ensayo
colorimétrico, rápido, versátil y cuantitativo, basado en una sal de tetrazolio MTT (metil tiazol
tetrazolio), mide sólo células vivientes y puede medirse espectrofotométricamente leyendo la
absorbancia entre 540 y 570 nm. (Mossman, 1983)
El MTT es una sal de tetrazolio de color amarillo que se utiliza para medir la actividad y
viabilidad celular por el rompimiento causado por la reducción del anillo de sal de tetrazolio
MTT por acción de las enzimas deshidrogenasas mitocondriales: succinato-deshidrogenasas,
para formar unos cristales violeta de formazán insolubles en agua, pero solubles en dimetil
sulfoxido (DMSO). La viabilidad celular es proporcional a la absorbancia, que presentan los
cristales de formazán. Angel (1999).
Este método está basado en la capacidad de las enzimas mitocondriales de las células viables de
transformar la sal de tetrazolio MTT en cristales de formazán. El método ha sido usado
exitosamente para monitorear la sensibilidad de las células tumorales en humanos a agentes
quimioterapéuticos. (Ferrari et al, 1990).
Figura 5 Reacción de viabilidad celular por el método MTT. Recuperado de https://nanohub.org/resources/19092/watch?resid=19107
29
3.5.4. Líneas Celulares
Las líneas celulares son células de origen animal o humano que se han adaptado a vivir en
cultivo, poseen capacidad de proliferación ilimitada, debido a que han sufrido un proceso de
transformación, que puede ocurrir espontáneamente, ser inducido por compuestos químicos,
radiaciones o virus; que implica la alteración de las características de crecimiento. (Freshney,
2000)
Las líneas celulares establecidas se pueden dividir en dos tipos principales: adherentes (células
en monocapa) que se fijan al material plástico de un frasco o placa y por lo tanto tienen que
desprenderse de esa superficie antes de utilizarlas y no adherentes (células en suspensión) que
normalmente no se fijan a la superficie del recipiente de cultivo. (Morgan & Darling, 1995)
La células que crecen en cultivo, ya sean adherentes o en suspensión, suelen clasificarse en
primarias, inmortales o transformadas. Las células primarias son aquellas recientemente asiladas
a partir de tejidos u órganos y suelen tener una duración limitada de cultivo. Las células
inmortales o transformadas presentan ambas la propiedad de crecer en forma ilimitada en cultivo
(es decir, no mueren). Las células transformadas están integradas por células que derivan de
tumores o que han sido manipuladas de algún modo. (Morgan & Darling, 1995)
La propagación de líneas celulares requiere que el número de células aumente continuamente, las
condiciones de cultivo han sido seleccionadas para favorecer al máximo la proliferación celular.
Estas condiciones son: baja densidad celular, baja concentración de Ca2+
y la presencia de
factores de crecimiento. Dentro de los requerimientos generales de un cultivo de línea celulares
se cuentan: el medio de cultivo nutritivo, condiciones de pH, temperatura y ambiente controlado.
El medio nutritivo básicamente debe ser un medio líquido, que contenga una fuente de carbono,
aminoácidos esenciales, oligoelementos, un sistema regulador de pH, iones y factores de
crecimientos aportados por el suero fetal bovino (FBS) con el que generalmente se suplementa el
medio. Adicionalmente los medios de cultivo celular contienen rojo de fenol como indicador de
pH, para permitir un monitoreo constante de esta variable. (Freshney, 2000)
3.5.5. Cultivo de células
El cultivo de células tiene su origen en el siglo XIX, cuando se comenzaron a estudiar con cierto
detalle los tejidos y órganos en vasos de vidrio. Tras la incorporación de modificaciones que
dieron lugar a medios más sofisticados, se hizo posible el cultivo de células, tumorales
procedentes de muestras de tejidos malignos tanto del hombre como animales. En un principio el
objetivo principal era el estudio de las propias células, cómo crecen, qué necesitan para su
crecimiento, cómo y cuándo dejan de crecer. Este tipo de estudios todavía tiene hoy un gran
interés científico, por ejemplo, en relación con investigaciones sobre el ciclo celular y el control
del crecimiento de células tumorales. (Morgan y Darling, 1995).
30
El cultivo de células tiene el objetivo de mantener vivas, fuera de su organismo de origen, células
animales para estudiar su comportamiento sin el control normal ejercido por el organismo vivo;
para observarlas, bajo un ambiente experimental controlable. (Freshney, 2000)
El cultivo de células, es la mejor manera de establecer nuevas líneas celulares en cultivo para
estudiar la morfología celular y para comparar el efecto de diferentes agentes, o diferentes
concentraciones de un agente sobre el crecimiento y metabolismo. (Castro, 2006)
31
4. METODOLOGÍA
4.1. Recolección de material vegetal
Los especímenes se recolectaron en las laderas de varias montañas cercanas a la vía Bogotá –
Guasca, a una altura aproximada de 2900 m.s.n.m., bajo el permiso marco de colecta otorgado
por la ANLA en la resolución número 1138 del 15 de Noviembre de 2013. El material fue
identificado en el momento de la recolección y posteriormente rectificado por el herbario de la
Universidad Nacional de Colombia (Ficha de Identificación COL-530), fue empacado en bolsas
y secado a la sombra a temperatura ambiente. Se separaron hojas, flores y tallos.
4.2. Extracción y fraccionamiento
El material seco y separado fue molido y empacado en dedales para realizar la extracción por
método Soxhlet en éter de petróleo, posterior a esto se sometió a evaporación a presión reducida
(rotaevaporación), y se obtuvo el extracto crudo de flores y hojas. Se disolvieron los extractos
crudos en acetona y se mezclaron con silica gel 60 MESH en proporción 1:5, 1g de extracto
crudo con 5 g de silica, se evaporo el solvente y se empacaron por separado (hojas y flores) en
dedales y se sometieron a extracción por el método Soxhlet en solventes de baja a alta polaridad:
Éter de petróleo, Cloroformo, Acetato de Etilo y Etanol en ese orden respectivo. De este
procedimiento se obtuvieron las diferentes fracciones, las cuales se sometieron a rotaevaporación
para obtener la fracción concentrada.
Con la metodología descrita anteriormente se obtuvieron los extractos crudos en Etanol y su
posterior fraccionamiento.
Se realizó cromatográfia en capa delgada (CCD) para establecer similitudes entre estas para
reunir las fracciones obtenidas.
4.3. Cromatografía en capa delgada (CCD)
La cromatografía en capa delgada se realizó en Cromatofolios de aluminio Merck, por sembrado
en punto contra un patrón y en diferentes sistemas de solventes, el revelado se llevó a cabo en
cámara UV de onda corta y larga y por aspersión con vainillina en ácido sulfúrico.
4.4. Determinación de la actividad antioxidante 1,1- difenil2-picrilhidracil
(DPPH)
Para la actividad antioxidante por el método del 1,1- difenil2-picrilhidracil (DPPH) se disuelve
una parte del extracto en metanol (MetOH) para obtener una concentración aproximada de 500
32
ppm y diluciones en serie, adicional se prepara la solución captadora DPPH en el mismo
solvente, la cual a una longitud de 490 nm deberá tener una absorbancia alrededor de 1,000 –
1,100 contra un blanco de MetOH. Para la medición de las absorbancias y el posterior calculo de
las actividades antioxidantes se uso la metodología descrita por Lee, Kim y Cho, así como por
Moein, Ghasemi y Nejati, la cual consiste en preparar una solución 0,4 mM de DPPH en Etanol
Anhidro y fue agitada durante 30 min, y su absorbancia ajustada. Luego se mezclaron 0,2 mL de
la muestra con 0,8 mL de solución de DPPH e incubada por 10 min en la oscuridad a
temperatura ambiente. El decrecimiento de la absorbancia fue medido a 490 nm luego de 1
minuto de agitación en el lector de placas y la actividad antioxidante expresada como porcentaje
usando la formula:
% Actividad Antioxidante = [(Acontrol-Aprueba)/Acontrol)] x 100
Donde Acontrol = Absorbancia de DPPH sin tratamiento y Aprueba = Absorbancia de DPPH
obtenida después de cada tratamiento, a diferentes concentraciones, se calculó el IC50 de los
extractos, salvo aquellos que no llegaron al 50% de Actividad Antioxidante.
4.5. Cultivo y tratamiento de las células, efecto citotóxico sobre líneas celulares.
Para determinar la actividad citotóxica se comenzará por estandarizar las condiciones de cultivo
de líneas celulares, que son conservadas a -196 °C en nitrógeno líquido.
Una vez se descongelan las células, se cultivan según especificaciones de ATCC, y se incuban a
37 °C y a 5 % de CO2, hasta alcanzar el 60% de confluencia, en ese momento se trataran con los
extractos a diferentes concentraciones en placas de 96 pozos, se incubaron los controles positivos
y negativos y las células tratadas por 48 horas, posteriormente se realizaron los bioensayos por
triplicado. El tratamiento se realizó preparando soluciones a diferentes concentraciones del
extracto obtenido disueltos en DMSO, adicionando en todos los casos 100 μL de la solución al
pozo contenedor de las células.
La actividad citotóxica se midió mediante el ensayo MTT para evaluar el porcentaje de
viabilidad de las células que han sido sometidas a los diferentes tratamientos. Este ensayo se basa
en la reducción metabólica del bromuro de 3(4-5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT)
realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto coloreado de
color azul (formazan), permitiendo determinar la funcionabilidad mitocondrial de las células
tratadas. Este método ha sido muy utilizado para medir supervivencia y proliferación celular. La
cantidad de células vivas es proporcional a la cantidad de formazán producido. Con este método
se obtienen cristales de formazán de color violeta que se disuelven en DMSO. La intensidad de
color dependerá de la viabilidad celular, este se determina en un lector de placas a 517 nm, por lo
33
tanto con este resultado se podrá calcular el porcentaje de actividad citotóxica por medio de las
siguientes ecuaciones:
Posteriormente, mediante tratamientos estadísticos se calculará el IC50 para cada extracto y
porcentaje de citotoxicidad, excluyendo aquellos extractos en los cuales su efecto citotóxico no
supero el 50%.
Las células utilizadas para el ensayo son certificadas por ATCC:
MDA-MB-231: Adenocarcinoma de Seno
PC-3: Adenocarcinoma de Próstata
4.6. Tratamiento Estadistico.
El tratamiento estadistico se realizo luego de obtener todas las medidas por triplicado, con el
paquete SPSS de IBM, mediante el cual se comprobaron todos los supuestos de la Estadistica
Parametrica (Test de Normalidad Shapiro-Wilks y Test de Homogeneidad de Varianzas), para
posteriormente realizar la prueba ANOVA Duncan, la cual fue escogida por tener una mayor
potencia con respecto a la Prueba de Tukey ó la Prueba de Scheffe.
34
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Actividad Antioxidante.
Figura 6 Comparación entre las fracciones FAcOEtETOHH, FAcOEtETEH y FAcOEtETEF contra los controles Quercetina y Trolox y su
correspondiente línea de tendencia.
Figura 7 Comparación entre las fracciones ETOHF, ETOHH y FAcOEtETOHF contra los controles Quercetina y Trolox y su correspondiente
línea de tendencia.
35
Extracto Ecuación de la recta (Coeficiente de correlación)2 IC50 ± SD
ETOHF y = 0,1789x + 48,389 R² = 0,7322 9,01 ± 1,04
ETOHH y = 0,2364x + 38,199 R² = 0,962 49,92 ± 0,60
FAcOEtETOHF y = 0,4763x + 42,09 R² = 0,807 16,61 ± 0,48
FAcOEtETEF y = 0,2766x + 43,217 R² = 0,9946 24,52 ± 0,37
FAcOEtETEH y = 0,1789x + 48,389 R² = 0,7322 9,01 ± 0,67
FAcOEtETOHH y = 0,4548x + 39,757 R² = 0,896 22,52 ± 0,53
Quercetina y = 1,29x + 14,83 R² = 0,9912 27,26
Trolox y = 1,0747x + 42,564 R² = 0,9149 6,92
Tabla 2 Ecuaciones de regresión para la Actividad Antioxidante de los extractos y controles con el IC50 calculado para cada caso ± la
desviación estándar
Figura 8 Comparación IC50 entre extractos y controles
En las figuras 6,7 y 8 se observa que los extractos y fracciones evaluados poseen una polaridad
alta y media, todos los datos se distribuyen de forma normal cumpliendo el supuesto para el Test
de Shapiro- Wilk, p > 0,05 (Anexo 11.1). Así mismo tienen un p < 0,05 en la prueba de ANOVA
para un solo factor rechazando la hipótesis nula (Anexo 11.2), indicando que al menos uno de
los extractos tiene diferencias significativas con el resto en su efecto Antioxidante, lo que se
comprueba en la agrupación por sub grupos de acuerdo al test de Duncan representado en la
figura 9, de donde se infiere que el extracto ETOHF y la fracción FAcOEtETEH tienen una alta
capacidad de neutralizar el radical libre DPPH, similar a la del Trolox, ubicados en el tercer
subconjunto. De la misma manera las fracciones FAcOEtETOHF, FAcOEtETEF y
FAcOEtETOH tienen una capacidad antioxidante media-alta frente el DPPH similar a la de la
Quercetina, ubicados en el segundo subconjunto y por último el Extracto ETOHH el cual
36
necesita una alta concentración para neutralizar la mitad de los radicales DPPH, siendo el menos
efectivo ubicado en el primer subconjunto.
Figura 9 Gráfico de agrupación Test de Duncan para la Actividad Antioxidante
5.2. Efecto Citotóxico frente a Líneas Celulares Tumorales
5.2.1. Efecto sobre la Línea MDA-MB-231: Adenocarcinoma de Seno
Figura 10 Comparación entre fracciones para el Efecto Citotóxico para la Linea Celular MDA-MB-231
37
Figura 11 Comparación entre fracciones para el Efecto Citotóxico para la Línea Celular MDA-MB-231
Fracción Ecuación de la recta (Coeficiente de correlación)2 IC50 ± SD
ETOHF y = -0,2854x + 94,628 R² = 0,9424 156,37 ± 0,067
ETOHH y = 0,0004x2 - 0,179x + 86,429 R² = 0,4229 223,75 ± 0,095
FAcOEtETOHF y = -0,3766x + 77,211 R² = 0,8433 72,254 ± 0,031
FAcOEtETEH y = -0,47x + 88,193 R² = 0,9331 81,261 ± 0,035
ETETF y = 0,0006x2 - 0,3236x + 87,08 R² = 0,7342 165,167 ± 0,070
FAcOEtETOHH y = 0,0017x2 - 0,6772x + 76,312 R² = 0,7677 43,633 ± 0,019
FEtOHETOHH y = 0,0022x2 - 0,7617x + 87,301 R² = 0,8984 59,0376 ± 0,025
FEtOHETEH y = 0,0015x2 - 0,5102x + 90,43 R² = 0,8965 125,689 ±0,054
Tabla 3 Ecuaciones de regresión para el Efecto Antioxidante de los extractos con el IC50 calculado para cada caso ± la desviación estándar para la Linea Celular MDA-MB-231
Figura 12 Comparación IC50 entre extractos para la Linea Celular MDA-MB-231
38
En las figuras 10,11 y 12 se observa que los extractos y fracciones evaluados poseen en su gran
mayoria una polaridad alta y media, excepto el extracto ETETF, todos los datos se distribuyen de
forma normal cumpliendo el supuesto para el Test de Shapiro - Wilk, p > 0,05(Anexo 11.4). Así
mismo tienen un p < 0,05 en la prueba de ANOVA para un solo factor rechazando la hipótesis
nula (Anexo 11.5), indicando que al menos uno de los extractos tiene diferencias significativas
con el resto en su efecto Citotóxico, lo que se comprueba en la agrupación por sub grupos de
acuerdo al test de Duncan en la figura 13, de donde se infiere que el extracto FAcOEtETOHF,
la fracción FAcOEtETEH, la fracción FAcOEtETOHH y la fracción FEtOHETOHH tienen un
alto potencial citotóxico sobre la Linea Celular, ubicados en el primer subconjunto. De la misma
manera la fracción FEtOHETOHH y los extractos ETOHF y ETETF tienen un efecto citotóxico
medio ubicados en el segundo subconjunto y el Extracto ETOHH es el menos efectivo ubicado
en el primer subconjunto, junto con 3 extractos del subconjunto 2 lo que indica que su efecto es
similar a pesar de las diferencias en los IC50.
Figura 13 Gráfico de agrupación Test de Duncan para el Efecto Citotóxico de los Extractos y Fracciones sobre la Línea Celular MDA-MB-231
39
5.2.2. Efecto sobre la Linea PC-3: Adenocarcinoma de Próstata
Figura 14 Comparación entre fracciones para el Efecto Citotóxico para la Línea Celular PC-3
Fracción Ecuación de la recta (Coeficiente de Correlación)2 IC50 ± SD
FAcOEtETEH y = -0,0022x2 - 0,058x + 121,79
R² = 0,8898 167,941 ± 0,261
ETOHH y = -0,0025x2 + 0,2294x + 95,821 R² = 0,9837
188,825 ± 0,294
ETOHF y = -0,0009x2 - 0,1519x + 86,172 R² = 0,8832 133,126 ± 0,207
FEtOHETEH y = -0,0015x2 - 0,0567x + 89,09 R² = 0,9258
143,634 ± 0,223
ETETH y = -0,0014x2 + 0,0517x + 78,916 R² = 0,6479
163,362 ± 0,254
ETETF y = -0,0009x2 - 0,1519x + 86,172 R² = 0,8832 133,126 ± 0,207
Tabla 4 Ecuaciones de regresión para el Efecto Antioxidante de los extractos con el IC50 calculado para cada caso ± la desviación estándar para
la Linea Celular PC-3
El efecto citotoxico de los extractos y fracciones de Achyrocline Bogotensis sobre la Linea
Celular PC-3, no fue el esperado, ya que aunque supera el 50% de Viabilidad Celular lo hace en
concentraciones bastante altas, por encima de las 133 ppm (Figuras 14 y 15). Lo que indica que
tal vez al fraccionar y purificar compuestos de dichos extractos y fracciones se pueden encontrar
especies promisorias con un alto efecto citotóxico pero en bajas concentraciones.
La potencia del test de Duncan representado en la Figura 16, permite obtener 3 subgrupos dentro
de los extractos y fracciones evaluadas para el efecto citotóxico que estan caracterizados por 4
fracciones iniciales en el primer subgrupo que tienen un rango de IC50 mayor que 130 ppm pero
menor a 170 ppm, un segundo grupo que ofrece un rango entre las 140 ppm y las 170 ppm y
finalmente el grupo menos potente de todos que oscila entre las 165 ppm y 190 ppm, sin
embargo, frente al IC50 de estas fracciones en otras lineas celulares las cuales necesitan la mitad
o menos de concentración de la misma fracción se infiere que el efecto no es potente por tanto no
es viable su uso como compuesto citotoxico.
40
Figura 15 Comparación del IC50 entre fracciones y extractos del Efecto Citotóxico para la Línea Celular PC-3
Figura 16 Gráfico de agrupación Test de Duncan para el Efecto Citotóxico de extractos y fracciones sobre la Línea Celular PC-3
41
6. CONCLUSIONES
La actividad antioxidante de los extractos y fracciones fue mayor en los extractos de
carácter altamente polar (Extractos Etanolicos) y de polaridad media (Fracciones de
Acetato de Etilo extraídas desde los extractos puros.
La actividad antioxidante de este tipo de fracciones, es bastante promisoria sobre todo si
se tiene en cuenta la cercanía de algunas fracciones al valor de IC50 para la Actividad
Antioxidante del Trolox un compuesto puro y el control más potente de los dos usados
(6,92 ppm).
La polaridad del solvente usado para obtener el extracto o fracción, está directamente
relacionado con la Actividad Antioxidante ya que se le atribuye esta capacidad a los
compuestos de tipo Fenólico (Flavonoides), que se caracterizan por tener una polaridad
alta debido a la gran cantidad de electrones en resonancia alrededor de su estructura.
El efecto citotóxico se presentó predominantemente en los extractos y fracciones de alta
polaridad, aunque en el caso del Extracto ETETF el cual a pesar de obtenerse en un
solvente altamente Apolar, presenta un efecto citotóxico medianamente potente a una
concentración de 165,167 ± 0,070 ppm.
Dentro de este estudio se obtuvieron fracciones promisorias para el estudio de las
viabilidades celulares, ya que algunas presentaron un potente efecto citotóxico.
El extracto ETOHF, presenta un efecto singular por sobre las demás fracciones y
extractos para la Línea Celular PC-3, ya que en bajas concentraciones potencia la
reproducción de las células y a medida que esta aumenta se evidencia una disminución en
la viabilidad celular de la Línea, que probablemente se deba a que el extracto aporte
algún tipo de sustrato que permita el normal funcionamiento de la célula y potencie su
reproducción únicamente en bajas concentraciones, aunque esto es una hipótesis que
necesita comprobarse mediante otro tipo de estudios.
Las líneas celulares presentan una respuesta positiva en cuanto al tratamiento con
extractos que implique una disminución en su población, la ventaja de un método que
permite la cuantificación de esta respuesta es que permite descartar extractos o fracciones
que aunque estimulen la disminución de la viabilidad celular lo hacen en concentraciones
muy altas lo cual es poco rentable para aplicaciones por ejemplo de tipo farmacéutico.
A pesar de que la especie Achyrocline Bogotensis, es una especie ampliamente estudiada
por sus efectos antibióticos y paliativos para varias alteraciones de la salud sobre todo
inflamaciones y lesiones de piel, se evidenció en este estudio que algunas de sus
fracciones contienen sustancias altamente efectivas en otro tipo de campos como es la
prevención de enfermedades degenerativas producidas por radicales libres y el “posible”
tratamiento de las mismas.
Los análisis estadísticos se convierten en una herramienta bastante útil, para confirmar la
fidelidad de los datos y permitir su uso para realizar análisis más “robustos” como las
comparaciones ANOVA que soportan estadísticamente lo que se ve a nivel experimental.
42
7. RECOMENDACIONES
Como lo demostró este estudio algunas fracciones tienen sustancias promisorias para su
investigación en la Actividad Antioxidante y el Efecto Citotóxico, por esto se recomienda
ampliar el estudio de esta especie para identificar o elucidar cuáles son y cuál es su
mecanismo de acción.
Se sugiere un estudio más amplio en cuanto a la actividad antioxidante de las fracciones y
extractos obtenidos en este trabajo frente a otras especies, por otros métodos como
ABTS++
, FRAP y ORAC, para determinar si su mecanismo de acción es efectivo frente a
estos.
Se recomienda hacer el estudio de estos mismos extractos contra células sanas, para
evaluar el daño colateral y si es viable el uso de estas sustancias como principios activos
farmacológicos.
43
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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47
9. ANEXOS
11.1. Test de Normalidad Shapiro-Wilk para la Actividad Antioxidante frente al DPPH
Tests of Normality
DPPH Extracto Shapiro-Wilk
Statistic df Sig.
ActIvidad Antioxidante
ETOHF 0,817 12 0,215
ETOHH 0,863 12 0,054
FAcOEtETOHF 0,851 12 0,137
FAcOEtETOHH 0,885 12 0,1
FAcOEtETEF 0,859 12 0,147
FAcOEtETEH 0,848 12 0,235
Quercetina 0,971 4 0,846
Trolox 0,863 4 0,27
*. This is a lower bound of the true significance.
a. Lilliefors Significance Correction
Tabla 2. Datos Test Shapiro-Wilk, para la Actividad Antioxidante
11.2. Prueba ANOVA de un solo factor para la Actividad Antioxidante frente al DPPH
ANOVA
Actividad Antioxidante
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 4369,389 7 624,198 3,175 ,006
Within Groups 14156,164 72 196,613
Total 18525,553 79
Tabla 3. Datos Prueba ANOVA para la Actividad Antioxidante
48
11.3 Prueba de Duncan para las Varianzas de los Extractos frente a la Actividad Antioxidante
frente al DPPH
Actividad Antioxidante
Test Duncan
Extracto N Subset for alpha = 0.05
1 2 3
ETOHH 4 41,1975
Quercetina 12 49,1342
FAcOEtETEF 12 56,0077
FAcOEtETOHH 12 56,662
FAcOEtETOHF 12 58,4032
FAcOEtETEH 12 60,7911
ETOHF 12 64,1207
Trolox 4 78,54
Sig. 1 0,164 0,336
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 8,000.
11.4. Test de Normalidad Shapiro-Wilk para el Efecto Citotóxico frente a la Línea Celular
MDA-MB-231
Tests of Normality
MDA-MB-231 extracto Shapiro-Wilk
Statistic df Sig.
Viabilidad
ETOHH 0,955 18 0,501
ETOHF 0,925 18 0,158
ETETF 0,975 18 0,89
FAcOEtETEH 0,905 18 0,07
FEtOHETEH 0,923 18 0,146
FAcOEtETOHF 0,952 18 0,454
FAcOEtETOHH 0,923 18 0,144
FEtOHETOHH 0,932 18 0,214
49
11.5. Prueba ANOVA de un solo factor para el Efecto Citotóxico frente a la Línea Celular MDA-
MB-231
ANOVA
Viabilidad Celular
MDA-MB-231 Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 19825,389 7 2832,198 4,200 ,000
Within Groups 91715,486 136 674,379
Total 111540,875 143
11.6 Prueba de Duncan para las Varianzas de los Extractos contra el Efecto Citotóxico frente a la
Línea Celular MDA-MB-231
1 2 3
FAcOEtETOHH 18 44,2837
FAcOEtETOHF 18 49,5924
FAcOEtETEH 18 53,7295 53,7295
FEtOHETOHH 18 53,94 53,94
FEtOHETEH 18 69,0376 69,0376
ETETF 18 69,7582 69,7582
ETOHF 18 73,6962
ETOHH 18 77,9902
Sig. 0,316 0,093 0,353
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 18,000.
viabilidad
Duncan
Extracto NSubset for alpha = 0.05
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
11.7. Test de Normalidad Shapiro-Wilk para el Efecto Citotóxico frente a la Línea Celular PC-3
Tests of Normality
PC-3 Extracto Shapiro-Wilk
Statistic df Sig.
Viabilidad
ETOHH 0,848 18 0,208
ETOHF 0,767 18 0,201
ETETF 0,914 18 0,102
FAcOEtETEH 0,914 18 0,102
FEtOHETEH 0,903 18 0,065
ETETH 0,942 18 0,318
*. This is a lower bound of the true significance.
a. Lilliefors Significance Correction
50
11.8. Prueba ANOVA de un solo factor para el Efecto Citotóxico frente a la Línea Celular PC-3
ANOVA
Viabilidad Celular
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 11620,615 5 2324,123 2,954 ,016
Within Groups 80241,125 102 786,678
Total 91861,740 107
11.9. Prueba de Duncan para las Varianzas de los Extractos contra el Efecto Citotóxico frente a
la Línea Celular PC-3.
Viabilidad
PC-3 Extracto N Subset for alpha = 0.05
1 2 3
Duncana
ETETF 18 65,7399
FAcOEtETEH 18 65,7399
ETETH 18 67,9391 67,9391
FEtOHETEH 18 69,6513 69,6513
ETOHF 18 86,475 86,475
ETOHH 18 91,2975
Sig. 0,708 0,063 0,607
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 18,000.
