Evaluación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría

Evaluación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría triestímulo y

análisis de imagen como herramientas para la determinación

de carotenoides en ahuyama

Yazmín Natalia Quijano Ortega

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos

Bogotá, Colombia

2020

Evaluación de espectroscopía

FTIR-ATR, colorimetría triestímulo y

análisis de imagen como

herramientas para la determinación

de carotenoides en ahuyama

Yazmín Natalia Quijano Ortega

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencia y Tecnología de Alimentos

Director (a):

Profesor Carlos Alberto Fuenmayor Bobadilla, Ph.D.

Codirector (a):

Profesor Carlos Mario Zuluaga Domínguez, Ph.D.

Línea de Investigación:

Calidad de los alimentos

Análisis instrumental de las propiedades sensoriales de alimentos

Grupos de Investigación:

Bioalimentos - Aseguramiento de la Calidad de Alimentos y Desarrollo de nuevos Productos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos

Bogotá, Colombia

2020

Dedicatoria

A mis padres por su apoyo incondicional, sin

ustedes esto no sería posible.

A Jorge por sus consejos, amor y paciencia

en este proyecto de vida.

A mi familia entera por enseñarme que con

amor y perseverancia todo es posible.

Agradecimientos

Al profesor Carlos Fuenmayor, mi director, por su amistad, por darme la oportunidad de

trabajar en este maravilloso proyecto y por compartir sus conocimientos conmigo.

Al profesor Carlos Zuluaga, mi codirector, sus valiosos aportes han sido de suma

importancia para la construcción de este trabajo.

A la profesora Consuelo Diaz Moreno, por pensar en mi para llevar a cabo este proyecto e

invitarme a ser parte de su magnífico semillero de investigación.

A Silvia Grassi, experta internacional, por su valiosa colaboración en distintas etapas de

mi trabajo.

A Maribel García y Sandra Ballesta, por su amistad y valiosa ayuda, que fueron

indispensables para lograr desarrollar con éxito mi trabajo experimental.

A todo el personal del ICTA, su gentileza y amabilidad me acompañaron en el transcurso

de mi trabajo experimental.

A cada una de las personas que de una u otra forma contribuyeron con su conocimiento y

pusieron un grano de arena en la construcción de este trabajo.

En cuanto a las entidades e instituciones, debo agradecer:

A MinCiencias por el apoyo económico, que fue clave para el desarrollo de este proyecto

de investigación.

A la Facultad de Ciencias Agrarias por el apoyo económico para mi proyecto de tesis.

Al Centro de Investigación y Extensión Rural (CIER) de la Universidad Nacional de

Colombia por el apoyo económico para ser ponente en modalidad poster en un congreso

internacional en la ciudad de Sevilla, España.

Resumen 7

Resumen

Las ahuyamas son hortalizas consideradas como productos de alto potencial agroindustrial

en Colombia. No obstante, su caracterización es incipiente y la información relacionada

con compuestos bioactivos (como los carotenoides) es escasa. Esto se debe en parte a

factores como el alto costo y la complejidad de las técnicas de análisis empleadas para

cuantificar dichos compuestos. En este contexto, han surgido herramientas como la

espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier con reflectancia total atenuada

(FTIR-ATR), la colorimetría instrumental y el análisis de imagen, que, en conjunto con

análisis estadístico multivariado, permiten determinar el contenido de analitos de interés.

Esta tesis presenta modelos de predicción de compuestos carotenoides totales y

específicos realizados a partir de la combinación de espectroscopía FTIR-ATR,

colorimetría y análisis de imagen con análisis estadístico multivariado. Para lograrlo, se

trabajó en dos etapas: en una primera etapa 63 ahuyamas de ocho cultivares distintos,

fueron procesadas de tal forma que se obtuvieron tres tipos de muestra, cada una de estas

con diferente grado de aislamiento del analito (compuestos carotenoides): (A)

homogenizadas con licuadora, (B) liofilizadas, y (C) extractos en hexano:acetona. A partir

de diferentes experimentos realizados con (A), (B) y (C) fue posible obtener una serie de

matrices de datos obtenidos con técnicas espectroscópicas: coordenadas L*a*b* por

medio de colorimetría triestímulo en el espacio CIELAB, espectros de absorbancias en el

infrarrojo medio (400 – 4000 cm-1) por medio de FTIR-ATR y valores RGB por medio de

análisis de imagen digital, que mediante algoritmo de mínimos cuadrados parciales (PLS)

se correlacionaron con el contenido de carotenoides totales determinados por

espectrofotometría UV-Vis. En una segunda etapa, 25 ahuyamas de cuatro cultivares

provenientes de Palmira (Valle del Cauca) fueron procesadas de igual forma para obtener

los tres tipos de muestra con diferente grado de aislamiento del analito: (A) (B) y (C), así

como las matrices de datos de coordenadas colorimétricas, espectros de FTIR-ATR y

valores RGB, las cuales mediante PLS se correlacionaron con el contenido de

8 Evaluación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría y análisis de imagen como

herramientas para la determinación de carotenoides en ahuyama

carotenoides específicos determinados por cromatografía líquida acoplada a detección

UV-Vis con arreglo de diodos (HPLC-DAD).

En la primera etapa, se encontraron valores de carotenoides totales cuantificados por la

metodología convencional muy variables (155,8 – 2137,3 µg/g μg β-carotenoeq/g – base

seca) asociados con la procedencia geográfica o el cultivar. Al desarrollar los modelos de

correlación multivariada entre el contenido de carotenoides totales y las variables

espectroscópicas por PLS, se encontró que, al emplear las absorbancias del FTIR-ATR en

la región 920-3000 cm-1 como matriz predictora, la bondad de ajuste del modelo fue

bastante alta (R2PRED=0,93) con un error asociado de 193,1 μg β-carotenoeq/g (base seca),

únicamente cuando se trabajó con muestras liofilizadas (B), dado que para las muestras

homogenizadas (A) y los extractos (C) se obtuvieron coeficientes de determinación muy

bajos (0,66 y 0,30, respectivamente) y por ende los modelos en estos casos no fueron

confiables. Al modificar la matriz predictora combinando los datos de FTIR-ATR con datos

de color (coordenadas L*a*b*), el valor de R2PRED de los modelos para la muestra

homogeneizada (A) mejoró ligeramente (0,84) y aquellos de los modelos para la muestra

liofilizada disminuyó ligeramente, manteniendo un valor aceptable (0,88). Al reemplazar los

datos de color por datos de imagen RGB, la bondad de ajuste entre los datos

experimentales y datos predichos por el modelo fue aceptable cuando se trabajó con la

muestra liofilizada, no obstante, tampoco en este caso el coeficiente de determinación

(0,85) fue mejor que el obtenido empleando únicamente datos de FTIR-ATR.

En la segunda etapa, la realización de análisis cromatográficos permitió conocer el perfil

de carotenoides de cuatro cultivares colombianos de ahuyama de importancia

agroindustrial. El análisis reveló que los carotenoides predominantes en estas muestras

fueron luteína y β-caroteno, seguidos de violaxantina y α-caroteno. Los rangos

encontrados para el cultivar Mandarino, Dorado, Bolo Verde y Abanico 75 respectivamente

fueron en mg/100 g (base seca): luteína (6,51-15,05), (2,57-11,1), (5,55-28.29), (12,74-

33,87); β-caroteno (2,41-5,51), (2,03-5,25), (2,44-6,25), (3,28-8,76); violaxantina (0-6,24),

(2,46-11,66), (1,11-5,98), (0-5,36) y α-caroteno (1,21-2,98), (0-4,65), (0,38-16,47), (0-

8,76). Al desarrollar los modelos de correlación por PLS entre los datos espectroscópicos

y los datos de composición, los resultados obtenidos haciendo uso únicamente de las

absorbancias del infrarrojo (región 920-3000 cm-1), indican que fue posible obtener

modelos con buena capacidad de predicción solo para la luteína (R2PRED=0,94), el

Resumen 9

carotenoide que estaba presente en mayor concentración en las muestras estudiadas. Al

incluir en la matriz predictora los datos de colorimetría triestímulo, se mantuvieron los

resultados para la luteína, y se logró una mejora en los coeficientes de predicción para el

β-caroteno (R2PRED=0,91). En este caso, los modelos para el α-caroteno y la violaxantina

(carotenoides minoritarios) mantuvieron una bondad de ajuste muy baja, por lo cual se

infiere que, al mezclar la información espectroscópica y colorimétrica, no se logran

resultados aceptables cuando los compuestos carotenoides no están presentes en todas

las muestras estudiadas o se encuentran en bajas concentraciones, ya que esto afecta la

robustez de la matriz independiente. Finalmente, al modificar la matriz predictora e incluir

datos de infrarrojo con datos de imagen RGB, los modelos no mejoraron, con problemas

de under-fitting y validación cruzada, lo cual sugiere que la inclusión de datos RGB altera

negativamente el comportamiento de los modelos PLS.

En general, de las tres técnicas estudiadas, la que mejor presentó capacidad predictiva al

ser acoplada con estadística multivariada es la espectroscopía FTIR-ATR para el caso de

determinación de carotenoides totales (R2PRED=0,93), y la espectroscopía FTIR-ATR

combinada con colorimetría triestímulo para el caso de carotenoides específicos, con

buena capacidad predictiva de los dos carotenoides predominantes: luteína (R2PRED=0,94)

y β-caroteno (R2PRED=0,91). Es de resaltar que, en comparación con las técnicas de análisis

convencional, el uso de métodos basados en la combinación de técnicas espectroscópicas

y análisis estadístico multivariado, disminuirían notablemente los tiempos de análisis y

adicionalmente eliminarían la necesidad del empleo de solventes orgánicos. Se puede

concluir que estas técnicas son promisorias y deben seguir siendo exploradas como

herramientas para la evaluación de la calidad y la descripción de la presencia de

compuestos bioactivos en esta y otras hortalizas.

Palabras clave: Carotenoides, ahuyama, análisis multivariado, mínimos cuadrados

parciales, espectroscopía infrarroja, colorimetría triestímulo, HPLC.

Abstract 10

Abstract

Pumpkins are vegetables considered as products of high agroindustrial potential in

Colombia. However, its characterization is incipient and the information related to bioactive

compounds (such as carotenoids) is scarce. This is due in part to factors such as the high

cost and complexity of the analysis techniques used to quantify these compounds. In this

context, tools have emerged such as Fourier transform infrared spectroscopy with

attenuated total reflectance (FTIR-ATR), instrumental colorimetry and image analysis,

which, together with multivariate statistical analysis, allow determining the analyte content

of interest.

This thesis presents prediction models of total and specific carotenoid compounds made

from the combination of FTIR-ATR spectroscopy, colorimetry and image analysis with

multivariate statistical analysis. To achieve this, two stages were carried out: in a first stage,

63 pumpkins from eight different cultivars were processed in such a way that three types of

sample were obtained, each one with a different degree of isolation of the analyte

(carotenoid compounds): (A) homogenized with a blender, (B) freeze-dried, and (C)

extracts in hexane: acetone. From different experiments carried out with (A), (B) and (C) it

was possible to obtain a series of data matrices obtained with spectroscopic techniques:

L*a*b* coordinates by means of tristimulus colorimetry in CIELAB space, spectra of infrared

absorbances in the middle infrared (400 - 4000 cm-1) by means of FTIR-ATR and RGB

values by means of digital image analysis, which by means of partial least squares (PLS)

algorithm were correlated with the determined total carotenoid content by UV-Vis

spectrophotometry. In a second stage, 25 pumpkins from four cultivars from Palmira (Valle

del Cauca) were processed in the same way to obtain the three types of sample with

different degrees of analyte isolation: (A) (B) and (C), as well as colorimetric coordinate

data matrices, FTIR-ATR spectra and RGB values, which were correlated by PLS with the

Abstract 11

specific carotenoid content determined by liquid chromatography coupled to UV-Vis

detection with diode array (HPLC-DAD).

In the first stage, very variable total carotenoid values were found by the conventional

methodology (155.8 - 2137.3 µg/g µg β-carotenoeq/g - dry basis) associated with geographic

origin or cultivar. When developing the multivariate correlation models between the total

carotenoid content and the PLS spectroscopic variables, it was found that, when using the

absorbances of the FTIR-ATR in the region 920-3000 cm-1, the goodness of fit of the model

was quite high (R2PRED = 0.93) with an associated error of 193.1 μg β-carotenoeq/g (dry

basis), only when working with freeze-dried samples (B), since for the homogenized

samples (A) and the extracts (C) it was obtained very low determination coefficients (0.66

and 0.30, respectively) and therefore the models in these cases were not reliable. By

modifying the predictor matrix by combining the FTIR-ATR data with color data (L*a*b*

coordinates), the R2PRED value of the models for the homogenized sample (A) improved

slightly (0.84) and those of the models for the freeze-dried sample decreased slightly,

maintaining an acceptable value (0.88). When replacing the color data with RGB image

data, the goodness of fit between the experimental data and the data predicted by the

model was acceptable when working with the freeze-dried sample, however, in this case,

the coefficient of determination (0,85) was not better than that obtained using only FTIR-

ATR data.

In the second stage, the performance of chromatographic analyzes allowed knowing the

carotenoid profile of four Colombian pumpkin cultivars of agroindustrial importance.

Analysis revealed that the predominant carotenoids in these samples were lutein and β-

carotene, followed by violaxanthin and α-carotene. The ranges found for the cultivar

Mandarino, Dorado, Bolo Verde and Abanico 75 respectively were in mg/100 g (dry basis):

lutein (6.51-15.05), (2.57-11.1), (5 , 55-28.29), (12.74-33.87); β-carotene (2.41-5.51), (2.03-

5.25), (2.44-6.25), (3.28-8.76); violaxanthin (0-6.24), (2.46-11.66), (1.11-5.98), (0-5.36) and

α-carotene (1.21-2.98), (0-4.65), (0.38-16.47), (0-8.76). When developing the PLS

correlation models between the spectroscopic data and the compositional data, the results

obtained using only the infrared absorbances (region 920-3000 cm-1), indicate that it was

possible to obtain models with good predictability only for lutein (R2PRED = 0.94), the

carotenoid that was present in the highest concentration in the samples studied. By

including the tristimulus colorimetry data in the predictor matrix, the results for lutein were



maintained, and an improvement in the prediction coefficients for β-carotene (R2PRED = 0.91)

was achieved. In this case, the models for α-carotene and violaxanthin (minority

carotenoids) maintained a very low goodness of fit, so it is inferred that, when mixing the

spectroscopic and colorimetric information, acceptable results are not achieved when the

carotenoid compounds they are not present in all the samples studied or are in low

concentrations, since this affects the robustness of the independent matrix. Finally, by

modifying the predictor matrix by replacing the tristimulus colorimetry information with RGB

data from the image analysis, an acceptable predictive capacity was maintained in the case

of lutein (R2PRED = 0.81), but this was lower for the other carotenoids, except for violaxanthin,

which improved markedly (R2PRED = 0.88).

In general, of the three techniques studied, the one that best presented predictive capacity

when coupled with multivariate statistics is the FTIR-ATR spectroscopy for the case of total

carotenoid determination (R2PRED = 0.93), and the combined FTIR-ATR spectroscopy. with

tristimulus colorimetry for specific carotenoids, with good predictive capacity of the two

predominant carotenoids: lutein (R2PRED = 0.94) and β-carotene (R2

PRED = 0.91). It is

noteworthy that, compared to conventional analysis techniques, the use of methods based

on the combination of spectroscopic techniques and multivariate statistical analysis, would

significantly reduce analysis times and additionally eliminate the need for the use of organic

solvents. It can be concluded that these techniques are promising and should continue to

be explored as tools for evaluating the quality and describing the presence of bioactive

compounds in this and other vegetables.

Keywords: Carotenoids, pumpkin, squash, multivariate analysis, partial least

squares, infrared spectroscopy, tristimulus colorimetry, image analysis, HPLC.

Contenido 13

Contenido

Resumen .......................................................................................................................... 7

Lista de figuras .............................................................................................................. 17

Lista de tablas ............................................................................................................... 20

Introducción .................................................................................................................. 24

Objetivo general .............................................................................................................. 29

Objetivos específicos ...................................................................................................... 29

1. Marco teórico .......................................................................................................... 30

1.1 Compuestos carotenoides ................................................................................... 30

1.1.1 Isómeros ópticos y geométricos ....................................................................... 35

1.1.2 Asociación con otras moléculas ....................................................................... 36

1.1.3 Propiedades fisicoquímicas .............................................................................. 36

1.2 Distribución y biosíntesis en plantas .................................................................... 37

1.3 Fuentes alimentarias de carotenoides ................................................................. 39

1.3.1 La ahuyama ...................................................................................................... 39

1.3.2 Importancia agroindustrial de la ahuyama en Colombia ................................. 40

1.4 Determinación de carotenoides en alimentos por medio de técnicas

convencionales ................................................................................................................ 40

1.5 Técnicas espectroscópicas con potencial para la evaluación de carotenoides:

generalidades .................................................................................................................. 45

1.5.1 Espectroscopía infrarroja ................................................................................. 45

1.5.2 Colorimetría triestímulo .................................................................................... 47

1.5.3 Análisis de imagen ........................................................................................... 49

1.6 Antecedentes del uso de técnicas espectroscópicas en la determinación de

carotenoides para diferentes matrices alimentarias ....................................................... 49



1.6.1 Antecedentes con espectroscopía FTIR-ATR ................................................. 49

1.6.2 Antecedentes con otras técnicas espectroscópicas ........................................ 53

1.7 Quimiometría para la predicción del contenido de carotenoides ........................ 54

1.7.1 Aplicación de métodos quimiométricos en el análisis de alimentos ................ 55

1.8 Bibliografía............................................................................................................ 62

2. Espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría y análisis de imagen combinadas con

modelamiento de regresión multivariante como enfoque para la determinación de

carotenoides totales en muestras de ahuyama (Cucurbita spp.) .............................. 74

2.1 Introducción .......................................................................................................... 74

2.2 Materiales y métodos ........................................................................................... 75

2.2.1 Material vegetal ................................................................................................ 75

2.2.2 Adquisición de las imágenes ............................................................................ 77

2.2.3 Procesamiento de las muestras ....................................................................... 78

2.2.4 Determinación de propiedades fisicoquímicas ................................................ 78

2.2.5 Determinación del color por colorimetría triestímulo ....................................... 78

2.2.6 Determinación del contenido de carotenoides totales por espectrofotometría

UV-Vis .......................................................................................................................... 78

2.2.7 Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier con reflectancia total

atenuada (FTIR-ATR) .................................................................................................. 79

2.2.8 Análisis estadístico ........................................................................................... 79

2.2.9 Análisis de componentes principales (PCA) .................................................... 80

2.2.10 Modelado de regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS) ................... 80

2.3 Resultados y discusión ........................................................................................ 81

2.3.1 Contenido de carotenoides totales e índices de calidad fisicoquímica de

muestras de Cucurbita spp. ........................................................................................ 81

2.3.2 Análisis de imagen digital ................................................................................. 84

2.3.3 Análisis colorimétrico ........................................................................................ 87

2.3.4 Análisis espectral .............................................................................................. 91

2.3.5 Regresión PLS: predicción del contenido de carotenoides totales mediante

datos espectrales IR .................................................................................................... 94


datos espectrales IR y datos de color. ........................................................................ 97

Contenido 15


datos espectrales IR y datos de imagen RGB .......................................................... 100

2.4 Conclusión .......................................................................................................... 102

2.5 Bibliografía.......................................................................................................... 103

3. Espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría y análisis de imagen combinadas con

modelamiento de regresión multivariante como enfoque para la determinación de

carotenoides específicos en muestras de ahuyama (Cucurbita spp.) ..................... 107

3.1 Introducción ........................................................................................................ 107

3.2 Materiales y métodos ......................................................................................... 108

3.2.1 Material vegetal .............................................................................................. 108

3.2.2 Adquisición de las imágenes .......................................................................... 108

3.2.3 Procesamiento de la muestra ........................................................................ 109

3.2.4 Determinación del color por colorimetría triestímulo ..................................... 109

3.2.5 Determinación de carotenoides específicos por HPLC ................................. 109

3.2.6 Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier con reflectancia total

atenuada (FTIR-ATR) ................................................................................................ 111

3.2.7 Análisis estadístico ......................................................................................... 111

3.2.8 Análisis de componentes principales (PCA) .................................................. 111

3.2.9 Modelado de regresión con mínimos cuadrados parciales (PLS) ................. 111

3.3 Resultados y discusión ...................................................................................... 112

3.3.1 Contenido de carotenoides específicos por HPLC ........................................ 112

3.3.2 Análisis de imagen digital de las ahuyamas y de colorimétría triestímulo de

sus pulpas .................................................................................................................. 118

3.3.3 Análisis espectral IR ....................................................................................... 123

3.3.4 Regresión PLS: predicción del contenido de carotenoides específicos por

datos espectrales IR .................................................................................................. 124

3.3.5 Regresión PLS: predicción del contenido de carotenoides por datos

espectrales IR y análisis colorimétrico ...................................................................... 127

3.3.6 Regresión PLS: predicción del contenido de carotenoides mediante datos

espectrales IR y datos de análisis de imagen .......................................................... 129

3.4 Conclusión .......................................................................................................... 131

3.5 Bibliografía.......................................................................................................... 132



4. Conclusiones generales y trabajo futuro ........................................................... 137

Contribuciones científicas ......................................................................................... 140

Lista de figuras 17

Lista de figuras

Figura 1.1 Estructura de los carotenos .............................................................................. 31

Figura 1.2. Estructura de las xantofilas .............................................................................. 33

Figura 1.3. Isómeros geométricos del β-caroteno ............................................................. 35

Figura 1.4. Ruta de biosíntesis de carotenoides ................................................................ 38

Figura 1.5. Espectro UV del licopeno en n-hexano ........................................................... 42

Figura 1.6. Espectros del licopeno (---), ɣ-caroteno (- - -) β-caroteno (- • - • - •), y -caroteno

(...) en éter de petróleo. ...................................................................................................... 44

Figura 1.7. Métodos quimiométricos empleados en el análisis cuantitativo de alimentos

(Granato & Ares, 2014) ....................................................................................................... 55

Figura 1.8. Descripción del primer componente en PCA ................................................... 57

Figura 1.9. Descripción del primer componente en PCA, rotación en el origen ............... 57

Figura 1.10. Descripción general del algoritmo PLS en las etapas de calibración y

predicción (Romía & Bernàrdez, 2009) ............................................................................. 62

Figura 2.1 Ahuyamas Cucurbita spp. seleccionadas para el estudio. Esta fotografía se

obtuvo posterior a la desinfección de las ahuyamas y previo a su congelación. 1: Valle del

Cauca; 2: Tolima; 3: Huila; 4: Meta; 5: cv. Dorado; 6: cv. Mandarino; 7: Abanico 75; 8: . 76

Figura 2.2 Score plot para valores RGB en muestras de Cucurbita spp., donde

DO=Dorado; AB=Abanico75; MD=Mandarino; BV=Bolo verde; LL=Llanera; VL=Valluna;

MQ=Mariquiteña. ................................................................................................................ 86

Figura 2.3 Loading plot para las variables RGB en muestras de Cucurbita spp. V1, V2 y V3

son R, G y B, respectivamente. .......................................................................................... 87



Figura 2.4. Espectros característicos de FTIR-ATR de las muestras de Cucurbita spp. (n =

63) con diferentes protocolos de procesamiento de muestras: (A) pulpa fresca (licuadora-

homogenizada); (B) pulpa liofilizada; (C) extractos en hexano:acetona (1:1) .................. 92

Figura 2.5. Espectros FTIR-ATR para β-caroteno y luteína .............................................. 93

Figura 2.6. Comparación entre el contenido de carotenoides totales determinado por

espectrofotometría UV-Vis y el modelo PLS basado en espectroscopía FTIR-ATR obtenido

de muestras liofilizadas. En círculos grises, el conjunto de entrenamiento; en rombos rojos,

el conjunto de predicción. ................................................................................................... 97


espectrofotometría UV-Vis y el modelo PLS basado en datos de colorimetría triestímulo y

FTIR-ATR obtenidos de muestras liofilizadas. En círculos grises, el conjunto de

entrenamiento; en rombos rojos, el conjunto de predicción. ............................................. 99


espectrofotometría UV-Vis y el modelo PLS basado en imágenes RGB y datos FTIR-ATR

obtenido de muestras liofilizadas. En círculos grises, el conjunto de entrenamiento; en

rombos rojos, el conjunto de predicción. .......................................................................... 101

Figura 3.1 Cromatogramas característicos de muestras hidrolizadas: (1) cv. Mandarino; (2)

cv. Dorado; (3) cv. Abanico 75; (4) cv. Bolo Verde. Los picos señalados corresponden a:

A: Anteraxantina; L: Luteína; Z: Zeaxantina; B: β-Caroteno; V: Violaxantina. Los picos

señalados como “u” corresponden a compuestos no identificados o desconocidos. ..... 114

Figura 3.2 Score plot para carotenoides cuantificados mediante HPLC, donde DO=Dorado,

MD=Mandarino, AB=Abanico 75, BV=Bolo verde. .......................................................... 117

Figura 3.3 Loading plot para carotenoides específicos cuantificados mediante HPLC. V1:

luteína; V2: β-caroteno; V3: α-caroteno; V4: violaxantina; V5: anteraxantina; V6:

zeaxantina; V7: “desconocidos”. ...................................................................................... 117

Figura 3.4. Score plot realizado para valores RGB en muestras de Cucurbita spp., donde

DO=Dorado, AB=Abanico 75, MD=Mandarino, BV=Bolo verde. ..................................... 120

Figura 3.5 Loading plot para valores RGB en muestras de Cucurbita spp., donde V1=R,

V2=G, V3=B. ..................................................................................................................... 120

Figura 3.6 Espectros característicos de FTIR-ATR de las muestras de Cucurbita spp. (n =

25) de las variedades Mandarino, Boloverde, Dorado y Abanico 75, con diferentes

protocolos de procesamiento de muestras: (A) pulpa fresca (licuadora-homogeneizada);

(B) pulpa liofilizada............................................................................................................ 124

Lista de figuras 72

Lista de tablas

20

Lista de tablas

Tabla 1.1 Valores de absorbancia de carotenoides acíclicos. .......................................... 43

Tabla 1.2. Bandas asociadas a carotenoides en estudio 1 en tomate .............................. 50


Tabla 1.4.Bandas asociadas a carotenoides en estudio 3 en tomate ............................... 51


Tabla 1.6. Bandas asociadas a carotenoides en estudio en pimiento .............................. 52

Tabla 1.7. Bandas asociadas a carotenoides en estudio en frutos cítricos ...................... 52

Tabla 1.8. Índices de color de rodajas de ahuyama .......................................................... 53

Tabla 1.9. Índices de color encontrados en ahuyama en el periodo de almacenamiento 54

Tabla 1.10. Métodos de regresión empleados en análisis cuantitativo ............................. 58

Tabla 2.1 Codificación de las ahuyamas seleccionadas para el estudio .......................... 77

Tabla 2.2 Contenido de carotenoides totales y parámetros de calidad fisicoquímica de

muestras de Cucurbita spp. ................................................................................................ 82

Tabla 2.3. Valores RGB obtenidos a partir de imágenes de los cultivares de Cucurbita spp.

............................................................................................................................................. 84

Tabla 2.4. Coordenadas L*a*b* para las muestras de Cucurbita spp. (pulpa fresca

homogeneizada). ................................................................................................................ 89

Tabla 2.5. Modelos de regresión PLS para la predicción del contenido de carotenoides

totales en pulpa de Cucurbita spp. a partir de espectros FTIR-ATR ................................. 95

Tabla 2.6. Rendimiento comparativo de métodos basados en técnicas MIR y NIR para la

determinación de carotenoides en muestras de alimentos. .............................................. 96


totales en pulpa de calabaza a partir de espectros FTIR-ATR y valores de color L*a*b*. 98

Lista de tablas 72


totales en pulpa de Cucurbita spp. a partir de espectros FTIR-ATR y valores de imagen

RGB ................................................................................................................................... 100

Tabla 3.1 Masas precisas medidas de los carotenoides objetivo por HR-Orbitrap-MS, con

indicación de la desviación de masa (en ppm) con respecto a la masa teórica calculada.

........................................................................................................................................... 112

Tabla 3.2. Composición específica de carotenoides en muestras de Cucurbita spp. .... 115

Tabla 3.3. Valores RGB para imágenes de Cucurbita spp. ............................................. 118

Tabla 3.4. Coordenadas L*a*b* para las muestras de ahuyama .................................... 122

Tabla 3.5. Modelos de regresión PLS desarrollados para la luteína mediante datos IR 125

Tabla 3.6. Modelos de regresión PLS desarrollados para el β-caroteno mediante datos IR

........................................................................................................................................... 125

Tabla 3.7. Modelos de regresión PLS desarrollados para el α-caroteno mediante datos IR

........................................................................................................................................... 125

Tabla 3.8. Modelos de regresión PLS desarrollados para la violaxantina mediante datos IR

........................................................................................................................................... 125

Tabla 3.9. Modelos de regresión PLS desarrollados para la luteína mediante IR y datos de

color ................................................................................................................................... 128

Tabla 3.10. Modelos de regresión PLS desarrollados para el β-caroteno mediante IR y

datos de color ................................................................................................................... 128

Tabla 3.11. Modelos de regresión PLS desarrollados para el α-caroteno mediante IR y

datos de color ................................................................................................................... 128

Tabla 3.12. Modelos de regresión PLS desarrollados para la luteína mediante IR y datos

de imagen RGB ................................................................................................................ 130

Tabla 3.13. Modelos de regresión PLS desarrollados para el β-caroteno mediante IR y

datos de imagen RGB ...................................................................................................... 130

Tabla 3.14. Modelos de regresión PLS desarrollados para el α-caroteno mediante IR y


Tabla 3.15. Modelos de regresión PLS desarrollados para la violaxantina mediante IR y


Lista de símbolos y abreviaturas

22

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas Símbolo Término Unidad Definición

TCC Contenido de carotenoides totales (𝜇𝑔 𝛽 − 𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛𝑜𝑒𝑞

𝑔)

Eq. 1

Subíndices Subíndice Término

CAL Calibration (Calibración)

CV Cross-validation (Validación cruzada)

PRED Prediction (Predicción)

Superíndices Superíndice Término

2 Exponente, potencia

Abreviaturas

Lista de símbolos y abreviaturas 72

Abreviatura Término

FTIR-ATR Espectroscopía infrarroja con transformada

de Fourier con reflectancia total atenuada.

AB Abanico 75

DO Dorado

BV Bolo verde

MD Mandarino

MQ Mariquiteña

HU Huilense

LL Llanera

VL Valluna

LV Latent variable (Variable latente)

RMSEC Root mean square error of calibration

RMSECV Root mean square error of cross-validation

RMSEP Root mean square error of prediction

SEL Standard error of laboratory

Introducción

24

Introducción

Los compuestos carotenoides han ganado considerable atención en los últimos años

gracias a la amplia gama de beneficios que ofrecen tanto en la industria de alimentos,

como en la salud humana; motivo por el cual son objeto de investigación en la ciencia

moderna. Para llevar a cabo una investigación rigurosa sobre esta clase de compuestos

bioactivos, y adquirir información apreciable, es necesario recurrir al análisis químico

cuantitativo, ya que es una herramienta esencial para evaluar la calidad de los alimentos

en relación al contenido de ciertos constituyentes, en este caso los carotenoides.

En Colombia existen matrices de alto potencial agroindustrial poco estudiadas en cuanto

a estos compuestos bioactivos, como es el caso de la ahuyama, la cual es una hortaliza

proveniente de diferentes especies del género Cucurbita. En Colombia son de particular

interés las especies C. moschata y C. maxima. La importancia de la ahuyama en el mundo

ha sido reconocida gracias a su alto valor nutritivo, y es de hecho una fuente catalogada

como “rica” en carotenoides. Adicionalmente, es una hortaliza de gran versatilidad en

cuanto a su uso como ingrediente en culinaria, destacándose su aplicación para consumo

directo, preparación de sopas, compotas, purés, cremas y jugos, o como materia prima

para la agroindustria de harinas y deshidratados (Toro Sánchez, 2009; Zambrano Blanco,

2010).

La producción de esta hortaliza en Colombia es frecuente en agroecosistemas de

economía campesina y en medianas explotaciones productivas, ya sea como cultivo

principal o transitorio, o en sistemas de producción intercalados y de relevo con frutales,

ornamentales y forestales, por lo cual, sobresale como una especie hortícola de gran

importancia en el contexto de la seguridad alimentaria del país (Zambrano Blanco, 2010).

Este hecho, sumado a la creciente demanda de nuevas materias primas para la

agroindustria, han fomentado de manera progresiva la investigación sobre esta hortaliza.

Muy a pesar de ello, las investigaciones realizadas acerca de la identificación y

cuantificación de compuestos bioactivos son escasas. De hecho, no se conocen estudios

Introducción 72

previos sobre el perfil de compuestos carotenoides específicos en cultivares de ahuyama

colombiana.

Para la cuantificación de carotenoides en diversas matrices alimentarias, se ha recurrido

tradicionalmente a técnicas convencionales como la cromatografía líquida de alta eficiencia

(HPLC) acoplada a espectrofotometría UV-Vis, que presenta algunas desventajas, como

la necesidad de personal especializado, un alto consumo de solventes y estándares

analíticos costosos, así como el requerimiento de protocolos complejos de preparación de

las muestras (Amorim-Carrilho et al., 2014).

El desarrollo de herramientas analíticas alternativas que permitan, de forma confiable,

realizar la caracterización de la composición química de los alimentos en relación a sus

compuestos bioactivos, como los carotenoides, de manera más rápida, sencilla, y con

menores costos asociados, es de gran interés para la ciencia de alimentos. En este

contexto, se ha encontrado que técnicas espectroscópicas, como la espectroscopía de

infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR), en particular con el uso de reflectancia total

atenuada (ATR), la colorimetría triestímulo y el análisis de imagen, son herramientas

potencialmente aprovechables para sustituir parcialmente técnicas más complejas y

costosas, como HPLC.

Por una parte el FTIR, es una técnica que, de acuerdo a diversos autores, permite predecir

la concentración de diferentes constituyentes en alimentos de forma rápida y sencilla

(Anjos et al., 2017; Lucarini et al., 2018). La colorimetría triestímulo, por otra parte, requiere

de equipos relativamente económicos y fáciles de usar, empleando sistemas triestímulo

Hunter y CIE L*a*b* para medir el color. Finalmente, se destaca el análisis de imagen

digital, una herramienta que tiene la ventaja de ser objetiva, no destructiva (permite

reutilizar la muestra tras el análisis) y de respuesta inmediata, con un tiempo de ejecución

del análisis y obtención de resultados de unos pocos segundos (García Cabello, 2016), lo

cual es ideal para el estudio de carotenoides en las matrices seleccionadas. Es necesario

resaltar que las tecnologías anteriormente mencionadas pueden generar grandes

volúmenes de datos por medición que requieren métodos de análisis altamente

sofisticados (Roberts & Cozzolino, 2016). Así, al tratar las matrices de datos obtenidas

mediante estas técnicas con métodos estadísticos quimiométricos como mínimos

cuadrados parciales (PLS), es posible predecir el contenido del analito de interés (los

carotenoides en este caso), permitiendo la posibilidad de prescindir de las complejas



técnicas tradicionales que comúnmente se utilizan para la cuantificación de estos

compuestos.

Este proyecto de investigación tiene como objetivo explorar diferentes combinaciones de

estas técnicas espectroscópicas, junto con análisis estadístico multivariado de datos, en el

desarrollo de metodologías analíticas sencillas que puedan ser utilizada con facilidad en el

laboratorio para cuantificar carotenoides, tanto totales como específicos. Adicionalmente,

busca generar nueva información sobre la composición química de una matriz de gran

importancia agroindustrial en Colombia como lo es la ahuyama, la cual podría ser utilizada

(Rodriguez-Amaya, 2015b) como un indicador de funcionalidad y bioactividad en relación

con los compuestos estudiados, y así dar un valor agregado a este producto.

El presente documento de tesis está dividido en tres capítulos. En el primero de ellos se

presenta una revisión de los conceptos clave que constituyen el marco teórico de la

investigación, así como de los fundamentos y el estado del arte del uso de técnicas

espectroscópicas para la caracterización fisicoquímica de matrices alimentarias. En los

siguientes dos capítulos, se presentan los materiales y métodos, así como los resultados

con su correspondiente discusión, a modo de artículos científicos, de los estudios llevados

a cabo sobre del uso de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría triestímulo y análisis de

imagen, combinadas con modelamiento de regresión multivariante, como enfoque para la

determinación de carotenoides totales en muestras de ahuyama colombiana de distintos

orígenes geográficos (capítulo 2) y de carotenoides específicos en muestras de ahuyama

de distintos cultivares provenientes del Valle del Cauca (capítulo 3). Finalmente, se

presentan algunas conclusiones generales y perspectivas futuras de la investigación.

Cabe mencionar que el presente trabajo fue desarrollado gracias al apoyo financiero de

los proyectos: “ESTUDIO ESPECTROSCÓPICO Y PERFIL DE COMPUESTOS

CAROTENOIDES DE MATRICES ALIMENTARIAS CON ALTO POTENCIAL

AGROINDUSTRIAL PARA LA EXTRACCIÓN Y MICROENCAPSULACIÓN DE

COLORANTES AMARILLO-NARANJA”, financiado por Minciencias, y por otro lado,

“Evaluación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría triestímulo y análisis de imagen,

como herramientas para la determinación de carotenoides en ahuyama y polen apícola”.

Financiado por la Facultad de Ciencias Agrarias, a través de la CONVOCATORIA PARA

EL APOYO A LA FINANCIACIÓN DE PROYECTOS DE TESIS PARA FORTALECER Y

Introducción 72

CONSOLIDAR LOS PROGRAMAS DE DOCTORADO Y MAESTRÍA DE LA FACULTAD

DE CIENCIAS AGRARIAS, SEDE BOGOTÁ.

Objetivos de la investigación 29

Objetivos de la investigación

Objetivo general

Desarrollar una metodología analítica basada en el estudio espectroscópico con FTIR-

ATR, colorimetría triestímulo y análisis de imagen, en conjunto con métodos estadísticos

multivariados, para determinar el contenido de carotenoides en ahuyama.

Objetivos específicos

▪ Estudiar por medio de espectroscopía infrarroja con Transformada de Fourier

con reflectancia total atenuada (FTIR-ATR), colorimetría triestímulo y análisis de

imagen muestras de ahuyama colombianas.

▪ Determinar la concentración de carotenoides totales y del perfil de carotenoides

de estas muestras por medio de técnicas analíticas convencionales.

▪ Generar modelos estadísticos quimiométricos para la predicción del contenido

de carotenoides en la ahuyama a partir de la correlación entre las características

espectroscópicas y composicionales.

30 Evaluación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría y análisis de imagen

como herramientas para la determinación de carotenoides en ahuyama

1. Marco teórico

1.1 Compuestos carotenoides

Los carotenoides son compuestos derivados del isopreno, sintetizados por organismos

fotosintéticos (incluyendo plantas, algas y cianobacterias), algunos hongos y animales

no fotosintéticos. Son compuestos que, en el caso de los sistemas fotosintéticos,

participan en la recolección de luz y juegan un papel esencial en la función de

fotoprotección, mientras que, en tejidos y organismos no fotosintéticos, actúan como

pigmentos, aportando tonalidades en el rango del amarillo al rojo (Rodriguez-

Concepcion et al., 2018). Los carotenoides son los responsables del color de muchas

frutas y vegetales, como el amarillo del maíz, el anaranjado de las zanahorias, la

ahuyama y las naranjas, y el rojo del tomate y la sandía, entre muchos otros (Khoo et

al., 2011). La mayoría de animales (incluidos los humanos) no tienen la capacidad de

sintetizar estos compuestos, motivo por el cual los obtienen a partir de la dieta y los

utilizan para importantes funciones fisiológicas (Berendschot & Plat, 2014)

Químicamente hablando, los carotenoides son hidrocarburos isoprenoides constituidos

por una cadena principal de polieno que contiene un número variable de dobles enlaces

conjugados, una característica que imparte a estos compuestos la propiedad de

absorber luz visible, lo que resulta en su coloración característica en tonalidades amarillo

a rojo (Hurst, 2008). La mayoría de carotenoides derivan del fitoeno (C40), el cual se

biosintetiza mediante la condensación de dos moléculas de difosfafo de geranilgeranilo

(C20). Los carotenoides restantes derivan del fitoeno, cuando experimenta diversas

reacciones enzimáticas (Saini & Keum, 2018). Los carotenoides se dividen en dos

grupos principales: en primer lugar, aquellos constituidos únicamente por carbono e

hidrógeno, denominados carotenos (Figura 1.1).

Capítulo 1 31

Figura 1.1 Estructura de los carotenos

(Fuente: Rodriguez-Amaya, 2015a)



Figura 1.1 Estructura de los carotenos (continuación)

En segundo lugar, se encuentran los derivados oxigenados de carotenoides

hidrocarbonados, denominados xantófilas (Lorenzo & Munekata, 2016). En el grupo de

xantófilas, el átomo de oxígeno puede estar presente en forma de hidroxilo, metoxilo,

epóxido, carbonilo o carboxilo (Meléndez Martínez et al., 2007). Algunos ejemplos de

xantófilas se ilustran en la Figura 1.2. Además de esta clasificación general también

existen otras subclases, como los apocarotenoides y los carotenoides C50. Los

apocarotenoides corresponden a los productos que se generan mediante escisión

oxidativa de los carotenoides, catalizados por una familia de enzimas llamadas

dioxigenasas de escisión de carotenoides (CCD) (Saini & Keum, 2018)

Capítulo 1 33

Figura 1.2. Estructura de las xantofilas

(Rodriguez-Amaya, 2015a)



Figura 1.2. Estructura de las xantofilas (continuación)

Capítulo 1 35

1.1.1 Isómeros ópticos y geométricos

Gracias a la presencia de dobles enlaces en las moléculas de carotenoides, se podrían

formar múltiples isómeros geométricos (cis/trans o Z/E), aunque en la mayoría de casos

existen impedimentos estéricos (Rodriguez-Concepcion et al., 2018). Los isómeros cis

y trans difieren considerablemente en forma, tal como se muestra en la siguiente imagen

Figura 1.3. Isómeros geométricos del β-caroteno

(Fuente: Rodriguez-Concepcion et al., 2018)

Los carotenoides normalmente se encuentran en configuración totalmente trans, que

parece ser la más estable; sin embargo, pueden ocurrir algunas excepciones, como en

el caso de carotenoides acíclicos como el fitoeno o el fitoflueno (Meléndez-Martínez et

al., 2014). Aunque la presencia de isómeros cis en alimentos y otras matrices puede

atribuirse a la isomerización causada por factores como el calor o la luz, se ha

establecido que algunos también pueden ocurrir de forma natural (Rodriguez-Amaya,

1999; Schieber & Carle, 2005)

Ahora bien, es importante recalcar que debe existir al menos una proporción pequeña

de algunos carotenoides en configuración cis, dado que son biológicamente relevantes

para el complejo de recolección de luz, y la formación de hormonas derivadas de

carotenoides.



1.1.2 Asociación con otras moléculas

Los carotenoides tienen la capacidad de asociarse con diferentes clases de

macromoléculas, entre las cuales se incluyen ácidos grasos, azúcares o proteínas

(Meléndez-Martínez, Mapelli-Brahm, et al., 2019), y en cada uno de estos casos se

conocen diferentes ejemplos. En el primer caso se destacan las xantófilas, que

usualmente se encuentran esterificadas con ácidos grasos en muchas frutas u otros

órganos de las plantas, como flores y tubérculos (Breithaupt et al., 2002; Breithaupt &

Bamedi, 2002; Murillo et al., 2013). Es importante aclarar que la esterificación no afecta

las propiedades cromóforas, y sí facilita la integración y almacenamiento de los

carotenoides (de carácter lipofílico) en los plasto-glóbulos.

Se conocen casos de carotenoides asociados a fragmentos de azúcares, como en el

caso de la crocetina (Pfister et al., 1996). Finalmente, algunos carotenoides pueden

formar complejos con proteínas (carotenoproteínas) que tienen la propiedad de ser

solubles en agua y darían estabilidad a los carotenoides (Bhosale & Bernstein, 2007).

1.1.3 Propiedades fisicoquímicas

Exceptuando algunos casos, los compuestos carotenoides son altamente lipofílicos, por

lo cual generalmente se encuentran en ambientes hidrofóbicos (Britton, 1995; Fiedor &

Burda, 2014). El proceso de esterificación con ácidos grasos tiende a aumentar el

carácter lipofílico de los carotenoides, mientras que la unión con proteínas o azúcares

lo reduce (Rodriguez-Concepcion et al., 2018). El sistema de dobles enlaces conjugados

se podría considerar como la característica principal de estos compuestos, siendo dicho

sistema el principal responsable del color (actuando como cromóforo), forma,

reactividad y propiedades fotoquímicas (Britton, 1995; Venugopal, 2008; Young & Lowe,

2018).

La mayoría de carotenoides absorben luz azul y violeta (400-500 nm) y por lo tanto

exhiben colores en el rango del amarillo al rojo (Mercadante, 2019), lo cual depende de

factores como la concentración, agregación o interacción con proteínas. En el último

caso cabe resaltar que las carotenoproteínas pueden presentar colores que incluyen

azul, verde, rojo y púrpura (Decker et al., 2000; Simpson et al., 2019) .

La cadena de dobles enlaces influye en la forma rígida de los isómeros (totalmente

trans) (Gruszecki & Strzałka, 2005; Yahia, 2017). Por ejemplo, las propiedades únicas

del fitoeno y fitoflueno (Figura 1.1) se deben al menor número de dobles enlaces

Capítulo 1 37

conjugados, que los convierte en incoloros y menos rígidos (Meléndez-Martínez et al.,

2015; Meléndez-Martínez, Stinco, et al., 2019).

1.2 Distribución y biosíntesis en plantas

Es importante tener presente que la biosíntesis y almacenamiento de carotenoides se

dan en los plástidos de las células vegetales, específicamente en los proplástidos,

amiloplastos, etioplastos, cloroplastos, y cromoplastos (Hannoufa & Hossain, 2020; L Li

et al., 2016; Shumskaya & Wurtzel, 2013). Todos, a excepción de los proplástidos,

poseen la capacidad de producir carotenoides (L Li et al., 2016). Ahora bien, a pesar de

que los proplástidos no son sitios carotenogénicos, son los precursores de los otros tipos

de plástidos, por lo cual no se puede menospreciar su función (T. Sun et al., 2018)

En cuanto al proceso de biosíntesis, se conoce que en plantas superiores el proceso

inicia con la participación del difosfato de isopentenilo (IDP). A continuación, cuatro

unidades de IDP (C5) se fusionan en diversas reacciones de condensación cabeza a

cola, produciendo el precursor (C20) inmediato de carotenoides, difosfato de

geranilgeranilo (GGPP). Posteriormente, una condensación cabeza a cabeza de dos

moléculas de GGPP genera fitoeno, que es incoloro. Sucesivas reacciones de

deshidratación catalizadas enzimáticamente, conducen desde fitoeno a fitoflueno, -

caroteno, neurosporeno, y finalmente a licopeno (Schweiggert & Carle, 2017). La

posterior ciclación del licopeno por las enzimas licopeno -ciclasa (LycE) y/o licopeno -

ciclasa (LycB) produce y -caroteno, representando la rama y de la ruta

respectivamente (Becerra & Santos-Ruiz, 2012; T. Sun et al., 2018). En la Figura 1.4,

se describe con más detalle el proceso descrito anteriormente. En una etapa posterior,

la hidroxilación del y -caroteno por hidroxilasas conduce a la formación de xantofilas

amarillas (como luteína) en la rama y zeaxantina en la rama (Quinlan et al., 2012; T.

Sun et al., 2018). Ahora bien, si ocurren modificaciones extra para los carotenos o

xantofilas, se generan carotenoides específicos. Un ejemplo de lo anterior es la

segmentación oxidativa catalizada por enzimas CCD (dioxigenasas de escisión de

carotenoides), donde se producen apocarotenoides, que incluyen compuestos como

fitohormonas, o moléculas de señalización (Al-Babili & Bouwmeester, 2015). De esta

manera, las enzimas CCD contribuyen a los niveles estacionarios de compuestos

carotenoides, aunque también se sabe que el “secuestro” de carotenoides afecta la

acumulación total de estos compuestos (Gonzalez-Jorge et al., 2013; Li Li & Yuan, 2013)



Figura 1.4. Ruta de biosíntesis de carotenoides


Capítulo 1 39

1.3 Fuentes alimentarias de carotenoides

Los carotenoides están presentes en diversos alimentos, dentro de los cuales se

destacan las frutas, las verduras y los jugos. Usualmente, la coloración está ligada al

tipo de carotenoides presentes en el alimento, tal como se muestra a continuación:

❖ Las frutas y verduras de color amarillo-naranja, proveen la mayor cantidad de

y -caroteno. Alimentos como la zanahoria, la ahuyama o zapallo, el durazno y

la batata (papa dulce) son fuentes ricas de estos carotenoides (Nagarajan et al.,

2017).

❖ Las frutas de color naranja también se caracterizan por su contenido de

criptoxantina. De esta manera, este compuesto se puede encontrar en

mandarinas, naranjas, ciertos mangos y papayas (Arscott, 2013).

❖ Las verduras de color verde oscuro y las yemas de huevo contienen luteína y

zeaxantina. Así, estos compuestos se pueden encontrar en hojas verdes de

alimentos como la espinaca, cilantro o perejil (Perry et al., 2009; Sommerburg et

al., 1998).

❖ Alimentos de color rojo como los tomates y sus productos derivados, junto a

frutas de color rojo-rosáceo como la sandía y la guayaba, contienen licopeno

(Maiani et al., 2009; Nagarajan et al., 2017).

1.3.1 La ahuyama

La ahuyama, también conocida como zapallo, es un producto originario de América del

Sur perteneciente a la familia de las cucurbitáceas, más específicamente al género

Cucurbita. Entre sus especies más representativas se destacan Cucurbita maxima,

Cucurbita pepo, Cucurbita moschata y Cucurbita mixta, las cuales varían de acuerdo a

la textura y forma de sus tallos (Shi et al., 2013). La mayoría de especies de esta familia

se caracterizan por su tolerancia a climas cálidos y húmedos, motivo por el cual se

cultivan en países tropicales (como Colombia) (Cabrera, 2004; Cervantes, 2007).

Constantemente en todo el mundo se produce un gran número de variedades de

ahuyama, cada una de estas con diferentes niveles de carotenoides, hecho que podría

estar asociado tanto al origen geográfico del producto, como a la variedad o cultivar

seleccionado. Diversos reportes evidencian lo anterior. Por ejemplo, en una

investigación llevada a cabo en Brasil, se determinó la composición de carotenoides de

ahuyamas, donde los resultados indican que los principales carotenoides en C.



moschata son -caroteno y -caroteno, mientras que en C. maxima y C. pepo

predominan la luteína y el -caroteno (Azevedo-Meleiro & Rodriguez-Amaya, 2007).

Así mismo, en otro estudio realizado en Brasil (con un cultivar Baianinha), donde se

estudian las variedades C. maxima y C. moschata, se determinó un contenido alto de

carotenoides totales (2120 µg/100* g) y de β-caroteno (1180 µg/100*g) en la variedad

C. máxima; sin embargo, entre ambas variedades, C. moschata presentó los niveles

más altos de carotenoides totales (47 µg/g de E-α-caroteno y 235 µg/g de E-β-caroteno)

(Carvalho et al., 2014)

Ahora bien, si se trata de ahuyamas que pertenecen a otra zona geográfica, como en el

caso de Cucurbita moschata cultivar Bolo-verde, proveniente de Palmira (departamento

del Valle del Cauca) se han reportado altos contenidos de carotenoides totales, de hasta

427 µg/g, un contenido mucho más pronunciado en comparación al cultivar Baianinha

estudiado en Brasil (Valdés-Restrepo et al., 2013). A pesar de que en Colombia existen

estudios que señalan el contenido de carotenoides totales en ciertas variedades, aun es

bastante escasa la información respecto al perfil de carotenoides individuales.

1.3.2 Importancia agroindustrial de la ahuyama en Colombia

Se podría decir que el auge de la ahuyama (gracias a su versatilidad en uso y consumo),

ha generado un incremento significativo en su producción. Lo anterior se evidencia en

las cifras reportadas por el ministerio de agricultura; mientras que en el año 2007 se

cosechaban 3729 hectáreas, este valor se duplicó con los años y alcanzó las 8158 ha

para el 2014 (Minagricultura, 2014). Para el mismo año en mención, los departamentos

que generaban la mayor producción incluían Cesar, alcanzando una producción del

17,66%, Caldas (15,39%), Santander (10,29%), Magdalena (6,81%) y Huila (6,28%). No

obstante, los departamentos restantes también cumplen una función importante en este

grupo, generando el 43,57% de la producción nacional restante (Minagricultura, 2014).

1.4 Determinación de carotenoides en alimentos por medio de técnicas convencionales

La estructura química de los carotenoides consta de dobles enlaces conjugados, que le

confieren la característica de que sus formas isoméricas sean comunes (Amorim-

Carrilho et al., 2014). No obstante, estos sistemas de dobles enlaces en la cadena

carbonada hacen que sean susceptibles a ciertas reacciones, como la oxidación e

Capítulo 1 41

isomerización, especialmente por acción de la luz, el calor, los ácidos y el oxígeno

(Provesi et al., 2011). Además de estas reacciones, otros procesos como ciclación,

hidrogenación, deshidrogenación, adición de grupos laterales, entre otras, son algunas

modificaciones que conducen a la existencia de una variedad compleja de compuestos

(Cvetkovic & Nikolic, 2017). Es por ello que, considerando la susceptibilidad de su

estructura química, y factores como la falta de estándares disponibles comercialmente,

bajas concentraciones en muestras biológicas, y la presencia de compuestos que

pueden causar interferencias (van Breemen et al., 2012), se incrementa cada vez más

la dificultad para desarrollar métodos analíticos que permitan identificar y cuantificar

carotenoides en muestras reales (Cacciola et al., 2012); no obstante, la identidad de los

carotenoides puede confirmarse utilizando cromatografía líquida acoplada a diversos

detectores (Amorim-Carrilho et al., 2014).

El análisis con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) ha sido durante mucho

tiempo el método predilecto para separar, identificar y cuantificar carotenoides en

alimentos (Kopec et al., 2012). Dos desarrollos importantes con esta técnica han

evolucionado considerablemente el análisis de carotenoides: (a) columnas que

proporcionan una separación de la línea base para un rango de carotenoides en un

alimento dado hasta la separación de isómeros geométricos y (b) el detector de matriz

de fotodiodos que proporciona espectros de absorción visible de los carotenoides

separados en línea (Rodriguez-Amaya, 2015a).

Durante algún tiempo, la columna más utilizada para la separación de carotenoides fue

la columna con empaque polimérico C18, sin embargo, considerando que no

proporciona una separación adecuada de carotenoides alimentarios, especialmente si

se trata de isómeros geométricos (Gupta et al., 2015), esta columna ha sido superada

en los últimos años por la columna polimérica C30. Gracias a que se han diseñado

especialmente para la separación de isómeros de carotenoides (Sander et al., 1994),

las fases estacionarias C30 han adquirido una gran aplicación en el análisis de alimentos

(Sander et al., 2000).

Como fases móviles para carotenoides, la mayoría de los que utilizan la columna C30

ha utilizado una combinación de metanol y metil-tert-butil éter (Kaiser et al., 2009; Yahia

et al., 2011). Aparte de los solventes primarios, se requieren pequeñas cantidades de

otros solventes para obtener la retención deseada, aumentar la solubilidad y mejorar la

resolución (Rodriguez-Amaya, 2015a). A menudo se usan para este propósito los

solventes clorados, como una forma efectiva de separar los carotenoides (Cortés-



Herrera et al., 2019). Otros disolventes utilizados como modificadores son el

tetrahidrofurano, acetato de etilo, hexano, y acetona (Craft et al., 1992).

▪ Espectrofotometría UV-VIS

Gracias a la presencia de dobles enlaces conjugados, la mayoría carotenoides absorben

en el rango de 400-500 nm (Zaghdoudi et al., 2017). La información espectral es una

herramienta útil para distinguir e identificar diferentes especies de carotenoides; sin

embargo, es importante tener en cuenta que, para los carotenoides comunes, los

espectros UV-Vis únicamente proporcionan información sobre el grupo cromóforo del

carotenoide (Xu & Howard, 2012). Por ejemplo, el -caroteno y la luteína no pueden

identificarse entre sí únicamente por los espectros, y se deben considerar otros factores

como el tiempo de retención para distinguir entre estos dos compuestos (Kopec et al.,

2012). Además, los espectros de carotenoides pueden verse influenciados por

diferentes clases de solventes y también pueden interactuar con proteínas y lípidos,

afectando así las características espectrales (Britton, 1995).

Los carotenoides generalmente tienen tres picos más o menos distintos en lugar de una

sola banda (Kohler, 1995). De esta manera, la característica principal de los espectros

de carotenoides es la presencia de tres máximos de absorción (Figura 1.5). Así, la

relación del pico III con el pico II puede ser útil para distinguir entre isómeros de

carotenoides y carotenoides (Kopec et al., 2012).

Figura 1.5. Espectro UV del licopeno en n-hexano

(Fuente: Finkel’shtein, 2016)

Capítulo 1 43

Para un solvente dado, cuanto mayor sea el número de dobles enlaces conjugados del

compuesto, mayores serán los valores de absorción (λmax) (Mahindru, 2000). Esto se

puede apreciar en la serie de carotenoides acíclicos presentados en la Tabla 1.1.

Tabla 1.1 Valores de absorbancia de carotenoides acíclicos.

Compuesto carotenoide Numero de insaturaciones Picos de absorbancia (nm)

Licopeno 11 444, 470 y 502

Neurosporeno 9 414, 439 y 467

-Caroteno 7 378, 400 y 425

Fitoflueno 5 331, 348, y 367

Fitoeno 3 276, 286 y 297

Nota: los valores listados corresponden al éter de petróleo.


En el caso de los carotenoides cíclicos, el fenómeno de ciclación produce un

impedimento estérico entre el grupo metilo del anillo en posición C-5 y el hidrógeno en

posición C-8 de la cadena de polieno, sacando de plano los electrones π del doble

enlace en el anillo junto a los de la cadena de polieno. En consecuencia, se producen

distintos fenómenos: un desplazamiento hipsocrómico (desplazamiento de λmax a una

longitud de onda inferior), efecto hipocrómico (disminución de la absorbancia) y pérdida

de estructura fina (espectro con picos menos definidos) (Rodriguez-Amaya, 2015a). De

acuerdo a esto, el β-caroteno, que es bicíclico, aunque posee el mismo número de

dobles enlaces conjugados que el licopeno, absorbe a 450 nm, 425 y a 477 nm,

corroborando lo anteriormente dicho (Figura 1.6) (Godinho & Bhosle, 2008). En el caso

del ɣ-caroteno monocíclico, la mitad de su estructura se parece al licopeno y la otra

mitad se asemeja a la del β-caroteno. Por lo anterior, exhibe un espectro intermedio

entre los de estos compuestos tanto en λmax como en forma (Figura 1.6) (Machmudah

& Goto, 2013). El doble enlace en el anillo del α-caroteno está fuera de conjugación,

dejando 10 dobles enlaces conjugados (9 en la cadena de polieno y 1 en el anillo β). En

consecuencia, su espectro de absorción está más definido con λmax en longitudes de

onda ligeramente más cortas (422, 445 y 473 nm) que las del β-caroteno (Rodriguez-

Amaya & Kimura, 2004) (Figura 1.6).



Figura 1.6. Espectros del licopeno (---), ɣ-caroteno (- - -) β-caroteno (- • - • - •), y -

caroteno (...) en éter de petróleo.


▪ Espectrometría de masas

La mayoría de técnicas basadas en cromatografía liquida (CL) para el análisis de

carotenoides se utilizan acopladas a un detector de arreglo de diodos o UV-Vis

(Galanakis, 2019), y aunque la CL acoplada a instrumentos UV-Vis ha sido muy

utilizada en la determinación tanto cualitativa como cuantitativa de carotenoides, los

espectros obtenidos resultan muy similares, por lo que muchos investigadores han

optado por complementar la identificación de carotenoides con otras formas de

detección, como por ejemplo la espectrometría de masas (MS) (Amorim-Carrilho et al.,

2014).

Los instrumentos MS se utilizan con diferentes fines, para superar interferencias

espectrales del UV-Vis, lograr una alta sensibilidad en mezclas complejas y

adicionalmente para obtener información estructural en base al patrón de masa y

fragmentación molecular obtenido con MS Tándem (Caballero et al., 2015). Ahora bien,

aunque este patrón depende de la técnica de ionización y la composición de la fase

móvil utilizada, se han identificado fragmentos característicos de compuestos

carotenoides empleando diversas técnicas de ionización. Este enfoque se puede usar

para distinguir carotenoides con la misma masa molecular pero diferentes patrones de

Capítulo 1 45

fragmentación, como en el caso de los isómeros estructurales y geométricos (Kao et al.,

2012)

En este sentido, el estudio de los isómeros geométricos de los carotenoides está

adquiriendo una gran importancia, ya que sus propiedades (actividad de la vitamina A,

susceptibilidad a la oxidación y biodisponibilidad) difieren de las de sus compañeros

(Meléndez-Martínez et al., 2007). El HPLC acoplado a masas también se ha utilizado

para distinguir entre moléculas estructuralmente relacionadas y sus formas epoxidadas,

productos de la oxidación de carotenoides, que son marcadores potenciales de estrés

oxidativo y difíciles de perfilar debido a sus pequeñas cantidades y a la dificultad que

representa separarlas de compuestos hidroxi-carotenoides (Caballero et al., 2015). Los

métodos de ionización conocidos para el estudio de carotenoides con esta técnica

incluyen, equipos de impacto de electrones (EI), bombardeo de átomos rápidos (FAB),

desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI), ionización por

electropulverización (ESI), ionización química a presión atmosférica (APCI),

fotoionización a presión atmosférica (APPI) y sonda de análisis de sólidos atmosféricos

(ASAP) (Rivera et al., 2014).

1.5 Técnicas espectroscópicas con potencial para la evaluación de carotenoides: generalidades

Los métodos tradicionalmente empleados para el análisis de carotenoides totales

(espectrofotometría UV-Vis) y de carotenoides específicos (HPLC) son considerados

como eficientes en la separación y cuantificación de estos compuestos, sin embargo,

presentan ciertos inconvenientes relacionados con el alto costo, o bien, requieren un

protocolo de preparación complejo de la muestra. Es por ello que, el presente

documento describe a continuación los principios de tres técnicas (espectroscopía

infrarroja, colorimetría triestímulo y análisis de imagen) potencialmente aprovechables

para el análisis de carotenoides, y que podrían brindar una alternativa mucho más

accesible para el estudio de estos compuestos bioactivos en matrices alimentarias.

1.5.1 Espectroscopía infrarroja

La espectroscopía infrarroja (IR) se define como una técnica vibracional que estudia la

interacción de la radiación con la materia (Coleman, 1993) en aquella región del

espectro electromagnético que está más allá de lo visible (390–700 nm). La región

infrarroja se clasifica o divide en las regiones cercano (NIR), medio (MIR) y lejano; De

esta manera, la región NIR está comprendida entre 14,000–4000 cm−1 (o 714–2500 nm),



MIR está comprendida entre 4000–400 cm−1 (o 2500–25000 nm) y la región del infrarrojo

lejano está definida entre 400–10 cm−1 (o 25,000–1 × 106 nm) (Lin et al., 2009). En la

región IR, las muestras se pueden analizar mediante una serie de técnicas

complementarias, bien sea, espectroscopia NIR, MIR o Raman; que se diferencian por

los tipos de vibraciones moleculares que detectan (Larkin, 2018). NIR y MIR son las

regiones que contienen el mayor número de aplicaciones relacionadas con frutas,

hortalizas y sus productos procesados (Bureau et al., 2019).

En el caso de NIR, se sabe que este tipo de radiación puede penetrar mucho más en

una muestra que la radiación MIR (Jessica J Roberts et al., 2018), por lo cual NIR

permite el uso de longitudes de trayecto largas en la adquisición espectral de diversas

muestras. Además, el uso de espectroscopía NIR con fibra óptica permite a los usuarios

obtener el espectro completo de una muestra alimenticia que esté intacta (Lin et al.,

2009). A pesar de esta capacidad de penetración, la espectroscopia NIR posee varias

limitaciones. La mayoría de los instrumentos NIR proporcionan una selectividad limitada

y no se pueden emplear para realizar mediciones de constituyentes de alimentos con

un contenido inferior al 1%. Además, los métodos NIR requieren calibración de datos

usando valores de referencia recolectados con métodos químicos tradicionales, y cada

componente del alimento requiere de calibración por separado (Barcelo et al., 2018)

En cuanto al MIR, es claro que a partir del año 2000 ha habido un aumento constante

en estudios hortícolas y agronómicos mediante el uso de esta tecnología. Lo anterior

podría estar relacionado con diversas ventajas asociadas al uso de la espectroscopia

MIR; tiempos de análisis rápidos en relación a métodos estándar tradicionales como

HPLC, se requiere poca cantidad de muestra, sensibilidad, preparación simple de

muestras en pocos pasos y con pocos productos químicos tóxicos o carcinogénicos, es

una técnica económica (en comparación con otros instrumentos de laboratorio) y tiene

la capacidad de analizar muestras en múltiples estados físicos (gases, líquidos, sólidos,

materiales amorfos, películas, polvos y polímeros) (Bureau et al., 2019).

Para el MIR se utilizan dos tipos de equipos básicamente: instrumentos dispersivos e

instrumentos con transformada de Fourier (FT). Prácticamente todos los instrumentos

nuevos son del tipo FT (Gauglitz & Moore, 2014). En estos últimos, la radiación no se

dispersa, sino que todas las longitudes de onda llegan al detector simultáneamente y se

utiliza un tratamiento matemático llamado FT, para convertir los resultados en un

espectro infrarrojo típico (Wehling, 2010). Además, en lugar de un monocromador

(utilizado en los instrumentos dispersivos), el instrumento emplea un interferómetro. Las

Capítulo 1 47

técnicas de manejo de la muestra en MIR dependen básicamente de si la muestra es

sólida o líquida. Los líquidos pueden medirse por espectroscopia IR de transmisión;

dado que los coeficientes de absortividad en el MIR son altos, se utilizan comúnmente

celdas con longitudes de trayectoria de 0.01-1.0 mm. El cuarzo y el vidrio absorben en

la región IR media, por lo que las ventanas de las celdas están hechas de materiales no

absorbentes como sales de haluro o sulfuro (como KBr) (Nielsen, 2017)

Los equipos FT-MIR pueden acoplarse con celdas de reflectancia total atenuada (ATR),

ya que permiten obtener espectros para muestras sólidas que son demasiado gruesas

u opacas para aplicar mediciones de transmisión como en los casos anteriores (D.-W.

Sun, 2008). Por tal motivo es común encontrar investigaciones donde se analiza con

FTIR-ATR muestras de miel o sólidos duros como cereales de desayuno (Anjos et al.,

2017; Y. Kim et al., 2007).

De esta manera, el ATR mide la cantidad total de energía reflejada desde la superficie

de la muestra en contacto con un cristal transmisor de IR (Daramola & Ayeni, 2020). La

radiación infrarroja pasa a través del cristal a la muestra, donde la radiación penetra una

corta distancia en la muestra antes de que se refleje nuevamente en el cristal transmisor

(Kress-Rogers & Brimelow, 2001). Por lo tanto, la intensidad de la radiación reflejada

disminuye a longitudes de onda en las que la muestra absorbe radiación, lo que permite

obtener un espectro similar al espectro de transmisión (Nielsen, 2017)

1.5.2 Colorimetría triestímulo

El color es un atributo de calidad importante en la industria de alimentos que influye en

la elección y preferencias del consumidor, siendo un parámetro que se rige por los

cambios fisicoquímicos, bioquímicos y microbianos que ocurren durante el crecimiento,

maduración, el manejo y el procesamiento poscosecha (Ekinci, 2015; Varzakas & Tzia,

2015). Por tal motivo la medición de color se ha utilizado como medida indirecta de

determinados atributos, como el contenido de ciertos pigmentos, dado que es un

procedimiento simple y sencillo (Pathare et al., 2013).

Lo anterior es importante, teniendo en cuenta que el color de muchos alimentos deriva

de pigmentos naturales, muchos de los cuales cambian a lo largo del proceso de

maduración, tal y como sucede con los pigmentos carotenoides, que son los de interés

para este trabajo (Hussmann, 2018). El color de un producto puede evaluarse mediante

diferentes sistemas de coordenadas de color. Entre los sistemas más populares se

encuentran RGB (rojo, verde y azul), Hunter Lab, (CIE) L*a*b*, CIE XYZ, CIE L*u*v*,



CIE Yxy y CIE LCH (Jafari, 2020). Estos sistemas difieren en la simetría de espacio de

color y en el sistema de coordenadas utilizado para definir puntos dentro de ese espacio.

Según los conceptos del CIE (comisión internacional de iluminación), el ojo humano

tiene tres receptores de color: rojo, verde y azul, y todos los colores en general son

combinaciones de estos (Ladanyia & Ladaniya, 2010). Las cantidades de rojo, verde y

azul necesarias para formar un color en particular se denominan valores triestímulo y se

denominan X, Y, y Z, respectivamente (Joshi, 2018).

Los sistemas más utilizados en la industria alimentaria son las escalas de color Hunter

Lab L*a*b* y el sistema CIE modificado denominado CIELAB, para el cual las

coordenadas (L*a*b*) se leen directamente. En el caso de este último sistema, lo que

se miden son dos coordenadas de color, a* y b*, y un índice de luminosidad L* (Pathare

et al., 2013). El parámetro a* toma valores positivos para colores rojizos y negativos

para los verdosos, mientras que b* toma valores positivos para los amarillentos y

negativos para los azulados. L* representa una medida aproximada de la luminosidad,

que es la propiedad según la cual cada color se puede considerar equivalente a un

miembro de la escala de grises, entre blanco y negro (Meléndez-Martínez et al., 2005) .

El croma (C*), considerado como el atributo cuantitativo del color, se utiliza para

determinar el grado de diferencia de un matiz en comparación con un color gris con la

misma claridad. Cuanto más altos son los valores del croma, mayor es la intensidad de

color de las muestras percibidas por los humanos (Granato & Masson, 2010). Dicho lo

anterior, el croma se calcula usando la siguiente ecuación:

𝐶 ∗= √𝑎 ∗2+ 𝑏 ∗2

Por otra parte, el parámetro ángulo de tono (h*) es considerado como el atributo

cualitativo del color según el cual los colores se han definido tradicionalmente como

rojizo, verdoso, etc., y se usa para definir la diferencia de un determinado color en

comparación al color gris con la misma claridad Este atributo está relacionado con las

diferencias en la absorbancia a diferentes longitudes de onda (Fernández-Vázquez et

al., 2014; Fernández‐Vázquez et al., 2011).. Se podría decir que un ángulo de tono

mayor representa un carácter amarillo menor en los ensayos realizados:

ℎ ∗= tan−1 (𝑏 ∗

𝑎 ∗)

Un ángulo de 0° o 360° representa el tono rojo, mientras que ángulos de 90°, 180° y

270° representan tonos amarillos, verdes y azules, respectivamente. Esta información

Capítulo 1 49

se ha utilizado ampliamente en la evaluación de parámetros de color en productos como

vegetales, frutas y carnes (Barreiro et al., 1997).

Entre los instrumentos utilizados para medir el color, se encuentran los colorímetros y

espectrofotómetros (Jafari, 2020).

1.5.3 Análisis de imagen

Es posible medir el color empleando cámaras digitales y llevando a cabo un posterior

tratamiento de la imagen. Lo anterior consiste en que una cámara digital recibe las

imágenes en un dispositivo CCD (en inglés charge‐coupled device), circuito que

contiene un número de condensadores que son estimulados por la radiación y registran

gradaciones de luz en tres colores básicos: rojo, verde y azul (RGB en inglés). Cada

píxel de la imagen contiene un valor para cada uno de los canales RGB (García Cabello,

2016).

El espacio de color RGB no es continuo, cada canal toma un valor entero entre 0 y 255,

lo que hace un total de más de 16 millones de colores. Para la adquisición de imágenes

se utilizan sistemas DigiEye®, que están especialmente diseñados para medir el color

según las directrices de la CIE y para la evaluación de otras características relacionadas

con la apariencia, como la heterogeneidad cromática o el calibre del fruto (Gil, 2014).

Este sistema incluye una cámara digital, un monitor, una impresora o un software gráfico

y un espacio iluminado, que asegure consistencia en el color y la iluminación, para la

captura de la imagen (Delmoro et al., 2010).

1.6 Antecedentes del uso de técnicas espectroscópicas en la determinación de carotenoides para diferentes matrices alimentarias

1.6.1 Antecedentes con espectroscopía FTIR-ATR

El creciente interés en los carotenoides como compuestos bioactivos ha incentivado el

desarrollo de métodos rápidos para su determinación en diversas matrices. Técnicas

como infrarrojo medio o cercano se han propuesto como alternativas al HPLC para llevar

a cabo análisis simples, de alto rendimiento y no menos importante, de bajo costo. No

obstante, la elección del método espectroscópico depende del objetivo de análisis, las

características de la muestra, y la precisión y especificidad esperadas.



Teniendo en cuenta lo anterior, y que se deben tener en cuenta las características de la

muestra para elegir el método espectroscópico, es necesario considerar el siguiente

apartado; diferentes estudios señalan que los espectros de diferentes carotenoides se

superponen fuertemente en la región electromagnética UV-vis (Pflanz & Zude, 2008).

Sumado a lo anterior, el análisis de matrices con perfiles complejos de carotenoides en

diversas configuraciones isoméricas requiere métodos con mayores grados de

especificidad. Es precisamente por ello que el análisis infrarrojo y la información

disponible para asignar bandas espectrales a grupos químicos presentes en la muestra,

hacen que las técnicas espectroscópicas vibracionales sean muy buenas candidatas

para el estudio de carotenoides.

En este sentido, las técnicas de infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR)

combinadas con un análisis multivariante constituyen una técnica fiable, precisa, simple

y rápida para el análisis de diversas matrices agrícolas y alimentarias. La región IR

media (4000-700 cm-1) produce bandas de absorción para casi todos los grupos

funcionales, que pueden correlacionarse directamente con entidades químicas

específicas. Más específicamente, cuando el FTIR se combina con ATR (reflectancia

total atenuada) es posible llevar a cabo un análisis tanto cualitativo como cuantitativo de

matrices que no requieren mayor preparación de la muestra.

▪ Tomate:

Una de las matrices que más se ha estudiado respecto al contenido de carotenoides y

haciendo uso de esta técnica es el tomate. Múltiples reportes evidencian este hecho.

Por ejemplo, en el estudio realizado por Rubio-Diaz et al., (2011), se analizó una

variedad de tomates “baja en carotenoides” empleando un cristal ATR de selenuro de

zinc (ZnSe). Para la adquisición de los espectros se suspendieron alícuotas del extracto

lipídico seco (previamente obtenido) en cloroformo y a continuación se aplicaron dos

gotas sobre el cristal ATR. Los resultados de las bandas espectrales se describen en la

Tabla 1.2.

Tabla 1.2. Bandas asociadas a carotenoides en estudio 1 en tomate

Banda espectral Compuesto o enlace asociado

950-980 cm-1 Enlace -C=C-

964 cm-1 Banda asociada al β-caroteno

957 cm-1 Banda asociada al licopeno

Capítulo 1 51

De la misma manera se realizó un estudio del contenido de β-caroteno y licopeno (De

Nardo et al., 2009), pero en este caso en jugo de tomate, para lo cual se realizó, además

de una medición de muestra directamente (sobre un cristal ATR de diamante), una

medición del extracto lipídico (utilizando un cristal ATR de ZnSe). Los resultados del

espectro ATR se describen en la Tabla 1.3.



1380-1370 cm-1 Doblamiento de enlaces C-H

3000-2800 cm-1 Estiramiento de enlaces C-H

960 cm-1 Vibraciones fuera del plano de -C=C-

1200-700 cm-1 Región de huella digital

968 cm-1 Banda característica del β-caroteno

957 cm-1 Banda característica del licopeno

En otro estudio relacionado con la misma matriz (Rubio-Diaz, Santos, et al., 2010), se

realizó un seguimiento a los cambios químicos tanto en carotenoides como lípidos

totales durante la producción y almacenamiento del jugo de tomate en conserva

utilizando espectroscopia IR-ATR complementada con HPLC. Las bandas espectrales

características se observan en la Tabla 1.4.

Tabla 1.4.Bandas asociadas a carotenoides en estudio 3 en tomate

Banda espectral Compuesto asociado

964 y 961 cm-1 Vibraciones del enlace-C=C-

3026 cm-1 Enlaces -C-H

3006 y 960 cm-1 Bandas asociadas a isomerización de carotenoides trans

De la misma manera, un estudio realizado por Rubio-Diaz, De Nardo, et al., (2010) en

24 variedades de tomate con la misma técnica arrojó las siguientes bandas espectrales:



1358-1362 cm-1 Anillos beta ionona del β- caroteno

960 cm-1 aproximadamente Enlaces vinílicos cis o trans -C=C-del β-caroteno

▪ Pimiento y frutas cítricas:



Para matrices como el pimiento rojo se han desarrollado modelos quimiométricos con

espectroscopia FTIR-ATR, con el propósito de realizar un seguimiento a la degradación

de compuestos bioactivos (carotenoides amarillos y rojos, fenoles totales, ácido

ascórbico y capacidad antioxidante). En el estudio realizado por Castañeda-Pérez et al.,

(2013) los espectros se obtuvieron a partir de muestras en polvo obtenidas previamente,

y a continuación se realizaron 64 lecturas con una resolución de 4 cm-1 en la región

espectral de 700 a 4000 cm-1. Los resultados se presentan en la Tabla 1.6.

Tabla 1.6. Bandas asociadas a carotenoides en estudio en pimiento


2900 Estiramiento simétrico grupos CH3

1600-1700 cm-1 Estiramiento simétrico enlace -C=C-

1000 aprox. Estiramiento simétrico enlace C-C

Además de vegetales o frutos como el tomate, esta técnica también ha sido aplicada en

frutas cítricas. Por ejemplo en el estudio realizado por S. W. Kim et al., (2015) se

midieron los espectros de FT-IR de cítricos tanto en cáscara como pulpa a intervalos

mensuales durante el desarrollo de la fruta. En este caso se empleó un cristal ATR de

ZnSe (donde se cargaba el extracto de la muestra) y para obtener los espectros se

realizó un barrido de 4000 a 400 cm-1 usando una resolución espectral de 4 cm-1.

Tabla 1.7. Bandas asociadas a carotenoides en estudio en frutos cítricos


1525 cm-1 Estiramiento enlace -C=C- de carotenoides

1155 cm-1 Estiramiento enlace C-C de carotenoides

Los autores señalan que la evolución de las bandas espectrales durante el desarrollo

de la fruta indica un incremento en el contenido carotenoides.

▪ Ahuyama:

Los análisis respecto a la caracterización de la pulpa aún son escasos. Los estudios

realizados para esta matriz se han enfocado en estudiar principalmente el aceite

extraído a partir de las semillas. Un ejemplo de lo anterior es el estudio realizado por

Saucedo-Hernandez et al., (2011) donde la técnica FTIR-ATR acompañada de un

tratamiento multivariante para los datos espectrales, permitió clasificar aceites de

semillas del género Cucurbita (C. maxima, C. pepo y C. moschata). Los espectros de

Capítulo 1 53

las muestras se obtuvieron utilizando un cristal de ZnSe realizando un barrido en el

rango de 3200 a 600 cm-1, con una resolución de 2 cm-1, y realizando 15 lecturas. A

pesar de que los espectros fueron bastante similares entre sí, los autores hacen énfasis

en que las diferencias espectrales observadas podrían atribuirse a: diferencias en la

genética, en las condiciones de crecimiento o en los sistemas de procesamiento

utilizados para obtener los aceites, ya que las muestras de aceite C. pepo y C. maxima

estaban disponibles comercialmente, y los aceites de C. moschata fueron producidos

en el laboratorio.

1.6.2 Antecedentes con otras técnicas espectroscópicas

▪ Colorimetría

En el estudio realizado por Song, Wang, Li, Meng, et al., (2017) se realizó un

seguimiento al cambio de color de rodajas de ahuyama (Cucurbita maxima) en función

del tratamiento realizado con microondas al vacío. Los parámetros obtenidos se

muestran en la siguiente tabla:

Tabla 1.8. Índices de color de rodajas de ahuyama

Índice de color Secado con frío Secado con

aire caliente

Secado

microondas-vacío

L* 80.1 73.1 78.5

a* 21 28 22

b* 55.4 57.3 56.4

C 59.4 64 60.6

H 69 64 68.7

ΔE --- 10 2.1

La muestra de chips de ahuyama más seca y oscura dio lugar al valor más bajo de L*,

lo cual indica que el valor L* tuvo una mayor influencia del tratamiento donde se empleó

secado con aire caliente. Este resultado se correlacionó con una mayor pérdida de

carotenoides en las rodajas de calabaza, considerando el hecho de que el color amarillo

y/o rojo del producto se atribuye en gran parte a la presencia de estos compuestos.

De la misma manera, en otra investigación realizada por Song, Wang, Li, & Liu, (2017)

también se evaluó el cambio de color en función del tratamiento de secado sobre rodajas

de Cucurbita maxima, y esto se correlacionó con el contenido de carotenoides. En este

caso se encontró que, con el aumento de la potencia y tiempo de secado del



microondas, las rodajas de calabaza se tornaban más oscuras, lo cual implicaba una

disminución en el valor L*. Al final del secado, el valor Hunter L* de la rodaja disminuyó

exponencialmente. Sin embargo, no se evidenciaron cambios en los valores a* y b* con

el aumento de la potencia y el tiempo. Los autores atribuyen este fenómeno al hecho de

que el β y α-caroteno, los pigmentos más abundantes de la ahuyama, son carotenoides

“amarillentos”, y su degradación produce un mayor impacto en L* en comparación a los

valores a* y b*.

Para el caso de Cucurbita moschata, se han realizado estudios donde se evalúa el

cambio de color durante el periodo de almacenamiento (Muzzaffar et al., 2016). A pesar

de que en este caso los autores no correlacionan los resultados con el contenido de

carotenoides de la ahuyama, sí concluyen que hay una disminución significativa del beta

caroteno, pasando de 8.85 a 6.67 mg/100 g durante el tiempo de almacenamiento,

hecho que puede evidenciarse en el descenso de los índices de color (Tabla 1.9),

especialmente en el parámetro L*.

Tabla 1.9. Índices de color encontrados en ahuyama en el periodo de

almacenamiento

Índice de

color

Pulpa

fresca

0 meses 1 mes 2 meses 3 meses

L* 66.49 49.43 48.84 48.11 46.57

a* 8.31 7.19 7.36 7.8 8.7

b* 51.96 16.2 15.2 14.96 12.25

1.7 Quimiometría para la predicción del contenido de carotenoides

La ICS define la quimiometría de la siguiente manera: “La quimiometría es la ciencia de

relacionar las mediciones realizadas en un sistema o proceso químico con el estado del

sistema a través de la aplicación de métodos matemáticos o estadísticos". La

quimiometría se está convirtiendo rápidamente en un conjunto común de herramientas

utilizadas en muchos entornos industriales y de investigación. Su aumento en las últimas

dos décadas se puede atribuir a dos factores principales (Swarbrick & Westad, 2016):

▪ La velocidad de los computadores ha mejorado exponencialmente, y pueden

almacenar grandes cantidades de datos para su análisis.

Capítulo 1 55

▪ Las tecnologías analíticas, como los espectrómetros, pueden generar grandes

volúmenes de datos por medición que requieren métodos de análisis altamente

sofisticados.

1.7.1 Aplicación de métodos quimiométricos en el análisis de alimentos

El análisis cuantitativo en alimentos involucra distintas etapas y métodos

quimiométricos. Normalmente se emplea como punto de partida el análisis de datos

exploratorio, seguido de métodos de regresión/calibración. Lo anterior se resume en la

Figura 1.7.

Figura 1.7. Métodos quimiométricos empleados en el análisis cuantitativo de alimentos

(Granato & Ares, 2014)

▪ Análisis de datos exploratorio

El EDA es típicamente el primer paso en cualquier problema de análisis de datos.

Permite obtener un panorama general para un conjunto determinado de datos,

particularmente la distribución de los datos para cada una de las variables. Dentro del

EDA el método más usado es el análisis de componentes principales, un método no

supervisado, es decir, donde no existen variables respuesta o variables de salida (Y),

solamente existe un conjunto de variables de entrada o independientes (X) (Granato &

Ares, 2014).



El análisis de componentes principales es un método de compresión de variables que

reduce el conjunto de datos de la matriz X (K x N) a un número mucho menor de

variables (A) llamadas componentes principales (CP). El modelo matemático

correspondiente se construye a partir de la expresión:

X = TPT + E

donde T (N X A) es una matriz que contiene los scores, P (K X A) corresponde a los

loadings y E (K X N) representa la matriz de residuos del modelo. Los scores son las

intensidades de las nuevas variables A para las muestras y los loadings las nuevas

variables obtenidas a partir de las originales. Las CP son ortogonales entre sí, por lo

que ambos vectores no están correlacionados. Una consecuencia importante de la

ortogonalidad en los vectores de las CP es que la correlación se elimina por completo

al usar las nuevas variables en lugar de las originales (Romía & Bernàrdez, 2009).

El objetivo de PCA es permitir que la matriz de datos original se reduzca a una más

simple mientras se elimina la información inútil. El algoritmo inicialmente determina la

dirección de máxima variabilidad en los datos, luego el siguiente en importancia y así

sucesivamente. Para este fin, utiliza cualquier vector en el espacio K-dimensional y lo

gira alrededor del origen para alcanzar la posición que mejor se ajuste a la dirección

principal de los datos (Figura 1.8). Los puntos se proyectan en el nuevo eje P1 y se

calcula su varianza. Existe un ángulo donde la varianza es máxima; en esa posición, el

vector P1 será la primera CP (es decir, el vector que mejor describe la posible dirección

principal de variabilidad en los puntos). Los cosenos directores del vector serán los

loadings y reflejarán la posición del nuevo eje en el espacio K-dimensional (Figura 1.9).

Al proyectar los puntos en el espacio de K dimensiones en este vector, se pueden

calcular las coordenadas de los puntos respecto a la primera CP (es decir, los scores).

Así, el primer vector scores-loadings identifica el primer CP y es equivalente a

seleccionar el vector propio con el valor propio más grande en la matriz de covarianza

(Romía & Bernàrdez, 2009)

Capítulo 1 57

Figura 1.8. Descripción del primer componente en PCA

(Swarbrick & Westad, 2016)

Figura 1.9. Descripción del primer componente en PCA, rotación en el origen

(Swarbrick & Westad, 2016)

Ahora bien, para decidir el número de componentes principales, existen ciertos criterios

como (Otto, 2016): porcentaje de varianza explicada, criterio de valor propio uno, prueba

de Scree, validación cruzada.

▪ Modelos de regresión

La calibración es el proceso mediante el cual se establece la relación matemática entre

los valores proporcionados por un instrumento o sistema de medición y los conocidos

para el objeto material medido. La expresión matemática que relaciona las respuestas

analíticas o las señales con las concentraciones se conoce como ecuación de



calibración o modelo de calibración. La mayoría de las técnicas analíticas utilizan una

línea recta para la calibración debido su capacidad para ilustrar una relación directa

entre las señales medidas y las concentraciones (calibración univariada). Sin embargo,

un modelo de calibración lineal solo puede ser útil para fines de cuantificación si la señal

analítica depende exclusivamente de la concentración del analito específico para el que

se ha desarrollado el modelo. Las mediciones espectroscópicas se utilizan para

establecer una relación lineal entre la absorbancia o la absorbancia aparente y la

concentración a través de la ley de Beer-Lambert. Los modelos de calibración para estas

técnicas generalmente se construyen mediante regresión de mínimos cuadrados (LSR)

de los valores de absorbancia para un conjunto de estándares frente a sus

concentraciones. En aplicaciones del mundo real, donde los datos son típicamente

ruidosos, es muy poco probable que las variables estén completamente

correlacionadas; sin embargo, un grado sustancial de correlación entre variables puede

conducir a una matriz invertida inestable. Otros algoritmos comunes utilizados para

realizar regresión incluyen mínimos cuadrados parciales (PLS) y regresión de

componentes principales (PCR). Estos métodos de regresión están diseñados para

evitar problemas asociados con el ruido y las correlaciones (colinealidad) en los datos.

La Tabla 1.10 resume los algoritmos más comunes empleados para realizar regresiones

(Granato & Ares, 2014):

Tabla 1.10. Métodos de regresión empleados en análisis cuantitativo

Método Características

Mínimos cuadrados (LS) Fácil de calcular y comprender, se utiliza para

conjuntos de muestras simples (por ejemplo,

compuestos puros). Requiere variables

aisladas (como bandas espectrales), grandes

errores de predicción.

Mínimos cuadrados clásico (CLS) Basado en la Ley de Beer, utiliza una gran

cantidad de variables, no adecuadas para

mezclas de compuestos, susceptibles a

efectos de línea base.

Mínimos cuadrados inverso (ILS) Es un método flexible utilizado solo para

calibración indirecta y sin restricciones en

cuanto al número de variables, es la base de

la regresión multivariada.

Mínimos cuadrados parciales (PLS) Método flexible, de espectro completo, de

compresión de variables, combina ILS y CLS,

Capítulo 1 59

las calibraciones son robustas, efecto de

colinealidad.

Regresión de componentes principales

(PCR)

Es un método flexible de espectro completo.

Compresión de variables, utiliza regresión

inversa, requiere conocimiento de PCA.

Análisis de redes neuronales Método de compresión flexible que utiliza un

número restringido de variables de entrada y

es compatible con calibración inversa e

indirecta.

La construcción de un modelo de calibración multivariante es un proceso complejo y

lento que requiere una cuidadosa selección de variables para garantizar una predicción

precisa de muestras desconocidas. Esto requiere el conocimiento no solo de las

muestras objetivo sino también de las técnicas quimiométricas, a fin de obtener un

modelo que conserve su capacidad predictiva a lo largo del tiempo y que sea fácil de

actualizar. Debido a que el modelo generalmente será aplicado por operadores no

calificados, debe entregar información analítica de una manera fácil de interpretar

(Blanco y Bernardez, 2009). El proceso para obtener un modelo robusto implica los

siguientes pasos:

▪ Elegir las muestras para incluir en el conjunto de calibración

▪ Determinar la propiedad a predecir utilizando un método apropiado

(composición)

▪ Obtener la señal instrumental analítica (espectros)

▪ Preprocesamiento de los datos

▪ Construcción del modelo

▪ Validación interna (Cross-validation)

▪ Predicción de muestras desconocidas.

La selección de muestras de calibración es uno de los pasos más importantes para

construir un modelo de calibración e implica elegir una serie de muestras, que

idealmente debería abarcar todas las fuentes posibles de variabilidad física y química

en las muestras que se preverán posteriormente (Blanco y Bernardez, 2009). El modelo

solo funcionará con precisión si tanto las muestras de calibración como las muestras de

predicción pertenecen a la misma población. Por lo general, el conjunto o población de

muestras disponibles se divide en dos subconjuntos, llamados conjunto de calibración



(utilizado para construir el modelo) y conjunto de validación (Næs et al., 2002; McClure,

2003; Cozzolino et al., 2006a, 2011a, 2011b; Nicolai et al., 2007; Walsh y Kawano, 2009)

Como se describió anteriormente, antes de construir un modelo de calibración para un

analito dado empleando espectros (NIR y MIR), se debe realizar el preprocesamiento

de la información espectral. Las técnicas de preprocesamiento se utilizan para eliminar

cualquier información irrelevante que las técnicas de regresión no puedan manejar. Esto

puede incluir funciones como el promedio de espectros, que se utiliza para reducir el

número de longitudes de onda; o para suavizar el espectro (Nicolai et al., 2007), filtros

de media móvil y el algoritmo Savitzky-Golay (Næs et al., 2002; Mark y Workman, 2003;

Nicolai et al., 2007; Blanco y Bernardez, 2009). Otra técnica de preprocesamiento

comúnmente utilizada es la estandarización. La estandarización quiere decir que se

divide el espectro en cada longitud de onda por la desviación estándar del espectro en

esta longitud de onda. Por lo general, las variaciones de todas las longitudes de onda

se estandarizan a uno, lo que resulta en una influencia igual de las variables en el

modelo. También son posibles otros procedimientos de estandarización (Næs et al.,

2002; Mark y Workman, 2003; Blanco y Bernardez, 2009). La estandarización se usa

comúnmente cuando las variables se miden en diferentes unidades o tienen diferentes

rangos. Si bien la mayoría del software de quimiometría ofrece varios métodos de

normalización, la corrección de dispersión múltiple (MSC) y la corrección de variación

normal estándar (SNV) son las dos técnicas de normalización más populares (Dhanoa

et al., 1994; Næs et al., 2002; Mark y Workman, 2003; Blanco y Bernardez, 2009). La

MSC se usa para compensar los efectos aditivos (cambio de línea de base) y

multiplicativos (inclinación) en los datos espectrales, que son inducidos por efectos

físicos (dispersión, tamaño de partículas y el índice de refracción) (Mark y Workman,

2003; Nicolai et al., 2007; Blanco y Bernardez, 2009). Con SNV, cada espectro individual

se normaliza a promedio cero y varianza unitaria (Dhanoa et al., 1994). Por otro lado, la

derivación se utiliza para eliminar los cambios de línea base y los picos superpuestos

(Duckworth, 2004; Næs et al., 2002; (Granato & Ares, 2014)).

Una vez que se ha desarrollado el modelo de calibración, se debe evaluar su capacidad

para predecir muestras desconocidas que no están presentes en el conjunto de

calibración (que no se utilizaron para construir el modelo). Esto implica aplicar el modelo

a un número limitado de muestras no incluidas en el conjunto de calibración, para las

cuales se conoce previamente la propiedad objetivo que va a predecir el modelo. Los

resultados proporcionados por el modelo se comparan directamente con los valores de

Capítulo 1 61

referencia; si los dos son esencialmente idénticos, el modelo proporcionará predicciones

precisas y será útil para determinar la propiedad objetivo en el futuro. Para evaluar la

precisión del modelo de calibración y evitar problemas de sobreajuste, se deben aplicar

procedimientos de validación, ya que un modelo de calibración sin validación no tiene

sentido. En este sentido, la validación cruzada es un método práctico para demostrar

que la espectroscopía puede predecir algo, no obstante, la precisión real debe estimarse

con un conjunto de prueba o conjunto de validación apropiado (Otto, 1999; Brereton,

2000; Næs et al., 2002). De esta manera, la capacidad predictiva del método debe

demostrarse utilizando un conjunto de validación independiente.

Diferentes parámetros estadísticos se reportan en la literatura para interpretar una

calibración. Por ejemplo, el error de predicción de un modelo se define como el error

cuadrático medio de raíz para la validación cruzada (RMSECV) cuando se utiliza

validación cruzada o el error cuadrático medio de predicción (RMSEP) cuando se utiliza

validación externa (Næs et al., 2002; Walsh y Kawano, 2009). El coeficiente de

determinación (R2) representa la proporción de la varianza explicada de la variable

respuesta en los conjuntos de calibración o validación. El número de variables latentes

(componentes o factores) en el modelo de regresión generalmente se determina como

aquel que minimiza el RMSECV o RMSEP. La calidad del modelo también se puede

determinar asegurando que el valor de RMSEP no exceda el doble del error estándar

del laboratorio (SEL) (Granato & Ares, 2014).

▪ Mínimos cuadrados parciales

El método PLS, que fue introducido por Wold (1975), se ha utilizado como una

alternativa a la regresión de mínimos cuadrados ordinarios para resolver problemas que

involucran alta colinealidad o la necesidad de calcular variables Y correlacionadas.

Desde su formulación original, PLS se ha asociado con otros métodos y algoritmos

matemáticos. Los algoritmos más utilizados para implementar PLS son NIPALS

(mínimos cuadrados parciales iterativos no lineales) y SIMPLS. Algunos recientes, sin

embargo, se apartan del procedimiento clásico iterativo y facilitan una regresión global

y rápida. En cualquier caso, las variables y están relacionadas con las variables x a

través de variables auxiliares llamadas variables latentes, o factores o componentes,

que son combinaciones lineales de las variables x1, x2, ..., xK, y son muy similares a las

CP calculadas por PCA. De esta manera, cada componente se obtiene maximizando la

covarianza entre 𝑦 y cada posible función lineal de X (Romía & Bernàrdez, 2009).



El esquema general del método PLS para las etapas de calibración y validación se

describe en la Figura 1.10:

Figura 1.10. Descripción general del algoritmo PLS en las etapas de calibración y

predicción

(Romía & Bernàrdez, 2009)

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2. Espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría y análisis de imagen combinadas con modelamiento de regresión multivariante como enfoque para la determinación de carotenoides totales en muestras de ahuyama (Cucurbita spp.)

2.1 Introducción

Una de las técnicas más utilizadas para la cuantificación de carotenoides es la

espectrofotometría UV-Vis, que exige un alto consumo de solventes y un extenso

protocolo de preparación de muestras. En este contexto, ha surgido un interés especial

en la espectroscopia vibracional, más específicamente en la espectroscopía infrarroja

por transformada de Fourier (FTIR), una poderosa herramienta para el análisis y

cuantificación de compuestos carotenoides en matrices alimentarias, cuando se

combina con métodos estadísticos multivariados (Karoui et al., 2010).

La región del infrarrojo medio (MIR) ubicada entre 4000 cm-1 y 450 cm-1 contiene

información que surge de las vibraciones moleculares sensibles a los estados químicos

y físicos de la muestra. Por lo anterior, se han desarrollado varios métodos basados en

FT-MIR para discriminar y determinar diversas propiedades de matrices alimentarias

(Bassbasi et al., 2014; Anjos et al., 2015; Mellado-Mojica et al., 2016; Biancolillo et al.,

2020), teniendo como ventajas la reducción del consumo de productos químicos y de

tiempo. Además, el uso de dispositivos de reflectancia total atenuada (ATR) simplifica

enormemente la aplicación de FTIR para el análisis cualitativo y cuantitativo de

materiales y de alimentos.

La capacidad de esta técnica para la determinación de carotenoides en matrices

alimentarias ha sido demostrada en matrices como el tomate, obteniendo buen

rendimiento en la cuantificación de licopeno (De Nardo et al., 2009).

Capítulo 2 75

Ahora bien, si la combinación de espectroscopía infrarroja con análisis multivariante no

permite obtener resultados satisfactorios, existe otra alternativa que consiste en

complementar la espectroscopía IR, con técnicas como colorimetría y análisis de

imagen, acopladas con análisis multivariante. En el caso de la colorimetría triestímulo

se sabe que los colorímetros, que miden y describen objetivamente el color visible, son

relativamente económicos y fáciles de usar. No obstante, una porción de ahuyama

puede presentar una gran área superficial, con variaciones internas de color, por lo cual

la colorimetría de triestímulo convencional no puede proporcionar mayor información a

una simple medición de un área pequeña, hecho que motiva a explorar otras técnicas

adicionales (Salazar-González et al., 2018). Además de la colorimetría triestímulo, se

han empleado metodologías como el análisis de imagen digital para evaluar el color en

matrices no uniformes como la ahuyama. Mediante el uso de cámaras digitales, es

posible obtener información de cada píxel. Estos sistemas adquieren información

colorimétrica en el espacio de color rojo, verde, azul (RGB). En este sentido, el análisis

de imagen se ha utilizado ampliamente en diversos alimentos como vinos, semillas de

uva, entre otros (Salazar-González et al., 2018; Rodríguez Pulido et al., 2017)

Actualmente no existen estudios previos de FTIR-ATR para la evaluación de

carotenoides en pulpa de ahuyama cuando se utiliza como única herramienta, ni

tampoco cuando se complementa con colorimetría o análisis de imagen. Por lo tanto, el

objetivo de esta primera parte del trabajo fue verificar la efectividad de técnicas como

espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría triestímulo y análisis de imagen digital,

combinadas con algoritmo de mínimos cuadrados parciales, como herramientas para la

cuantificación de carotenoides totales en muestras de Cucurbita spp. provenientes

de distintas regiones geográficas de Colombia.

2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Material vegetal

Para el estudio se seleccionaron 63 muestras de ahuyama de diferentes fuentes (Figura

2.1).



Figura 2.1 Ahuyamas Cucurbita spp. seleccionadas para el estudio. Esta fotografía se obtuvo posterior a la desinfección de las ahuyamas y previo a su congelación. 1: Valle del Cauca; 2: Tolima; 3: Huila; 4: Meta; 5: cv. Dorado; 6: cv. Mandarino; 7: Abanico 75; 8:

De estas, 31 se recolectaron en el centro experimental de la Universidad Nacional de

Colombia en Palmira (Valle del Cauca) [3 ° 32′05 ″ N 76 ° 17′44 ″ O; 1001 m.s.n.m.], un

proceso que tomó 3-5 meses (según el cultivar), y correspondieron a muestras de los

cultivares de Cucurbita moschata: cv. Boloverde (n = 6), cv. Dorado (n = 8), cv. Abanico

75 (n = 9); y de Cucurbita maxima: cv. Mandarino (n = 8). Estos cultivares han sido

descritos genética, morfológica y fisiológicamente (Baena García et al., 2010). Las

restantes 32 muestras fueron adquiridas directamente de proveedores locales, más

específicamente de la Corporación de Abastos de Bogotá S.A. (Corabastos). Estas

fueron muestras sanas de ahuyama, enteras y en su grado de maduración comercial,

cosechadas en los departamentos de Huila (n = 8), Tolima (n = 8), Valle del Cauca (n =

8) y Meta (n = 8), todas identificadas como pertenecientes a la especie Cucurbita

moschata, y fueron adquiridas el mismo día de llegada a Bogotá. Una vez que las

ahuyamas se cosecharon o adquirieron del mercado, dentro de un período máximo de

2 días, se desinfectaron en una solución de hipoclorito de sodio y luego se mantuvieron

en un cuarto de congelación a -30 °C hasta su procesamiento y análisis. La codificación

que se empleará en este capítulo para las ahuyamas seleccionadas se presenta en la

Tabla 2.1.

Capítulo 2 77

Tabla 2.1 Codificación de las ahuyamas seleccionadas para el estudio

Tipo de ahuyama

Código Especie Origen geográfico

Número de muestras recolectadas para el

estudio

cv. Dorado DO Cucurbita moschata

Duch

Palmira, Valle del Cauca (Colombia)

8

cv. Bolo verde

BV Cucurbita moschata

Duch


6

cv. Abanico 75

AB Cucurbita moschata

Duch


9

cv. Mandarino

MD Cucurbita maxima


8

Valluna VL Cucurbita moschata

Duch

Valle del Cauca (Colombia)

8

Mariquiteña MQ Cucurbita moschata

Duch

Mariquita, Tolima (Colombia)

8

Huilense HU Cucurbita moschata

Duch Huila (Colombia) 8

Llanera LL Cucurbita moschata

Duch Meta (Colombia) 8

2.2.2 Adquisición de las imágenes

El proceso consistió en fotografiar las ahuyamas con una cámara Canon EOS Rebel T3i

empleando a la vez un Colorchecker clásico X-rite (también conocido como cuadro de

calibración fotográfica), que permitió la calibración de la imagen. Así mismo, se utilizó

un espacio para garantizar condiciones de iluminación estándar para todas las

fotografías. Las imágenes se adquirieron con una dimensión de 5184x3456 pixeles y se

almacenaron en formato jpg. Debido a su extensión, proyección de sombras y alta

luminosidad, las imágenes se recortaron, para finalmente tener archivos con tamaños

entre 148 y 370 pixeles. El principio de la técnica consiste esencialmente en obtener los

parámetros R, G y B de las imágenes adquiridas, a partir de una validación previa con

datos modelados en una escala de color CIELAB (L*a*b*). La conversión de las

imágenes en valores RGB se realizó empleando el software MATLAB (The MathWorks,

EE. UU.).



2.2.3 Procesamiento de las muestras

Para el procesamiento de las muestras, inicialmente se retiraron la cáscara y las

semillas, y posteriormente la pulpa se porcionó y se procesó con ayuda de una licuadora

(SharkNinja, Canadá). Pequeñas porciones (20-30 mg) de la pulpa homogenizada

obtenida se usaron para el análisis con FTIR-ATR, y se denominaron “pulpa fresca”, que

corresponde al grado de aislamiento de analito más bajo (A). La porción restante de la

ahuyama homogenizada obtenida se liofilizó (-50 °C en el condensador, 30 °C en la

cámara de calentamiento, 1 mbar, 48 h) para también ser analizada con FTIR-ATR, y

se denominó “pulpa liofilizada” que corresponde al grado intermedio de aislamiento de

analito (B). Finalmente, las muestras liofilizadas se sometieron al protocolo de extracción

con hexano: acetona (1: 1) descrito en la sección 2.2.4; estos extractos (~ 50 µL) fueron

analizados por FTIR-ATR, correspondiente al grado de aislamiento más alto del analito

(C).

2.2.4 Determinación de propiedades fisicoquímicas

Las muestras de Cucurbita spp. (de la pulpa fresca homogenizada, A) se caracterizaron

mediante contenido de humedad (AOAC 934.06), sólidos solubles totales (AOAC

932.12), pH y acidez titulable (AOAC 942.15) (AOAC, 2012).

2.2.5 Determinación del color por colorimetría triestímulo

Las muestras (de la pulpa fresca homogeneizada, A) se midieron directamente

utilizando un colorímetro HunterLab ColorQuestXE (Hunter Associates Laboratory, Inc.).

De esta manera, las coordenadas triestímulo del espacio CIELab se determinaron en

coordenadas rectangulares como luminosidad (L*), a* (verde-rojo) y b* (azul-amarillo).

2.2.6 Determinación del contenido de carotenoides totales por

espectrofotometría UV-Vis

Se transfirieron 100 mg de muestra liofilizada y molida a un tubo Falcon de 10 mL y a

continuación se añadió la mezcla extractiva de solventes (1 mL de hexano: acetona en

relación 1:1) (Merck, EE. UU.). Luego, la mezcla se agitó en vortex durante 20 s y se

centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Este procedimiento se realizó varias

veces hasta la desaparición del color en la mezcla de solventes; luego, los extractos se

filtraron utilizando Whatman 4. Finalmente, se añadió de la misma mezcla extractiva

Capítulo 2 79

para completar un volumen de 10 mL en matraces volumétricos. La absorbancia de los

extractos se leyó en un espectrofotómetro Genesys 10S (Thermo Scientific, EE. UU.) a

454 nm. Para la curva de calibración, se realizó el siguiente procedimiento: se preparó

la solución madre pesando 0,005 g del estándar de β-caroteno (Sigma-Aldrich, 99%), y

se transfirió a un matraz volumétrico de 50 mL para luego ser llevado a volumen con la

mezcla de solventes hexano: acetona (relación 1: 1). Se prepararon soluciones estándar

de concentración 0.5, 1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5 y 7.5 µg/mL, y su absorbancia se leyó a

454 nm. La curva de calibración, a partir de 13 repeticiones, se calculó por regresión de

mínimos cuadrados, de la siguiente manera: intercepto 0.0222 u.a.; pendiente 0.1592

u.a./µg/mL; R2> 0,99; El contenido total de carotenoides se expresó como µg de

equivalentes de β-caroteno /g, calculado de acuerdo con la siguiente ecuación:

𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 (𝜇𝑔 𝛽 − 𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛𝑜𝑒𝑞

𝑔) = (

𝐴𝑏𝑠454 𝑛𝑚 − 𝑏

𝑚 ) ∗

𝑉

𝑊∗ 𝐷𝐹

Donde 𝐴𝑏𝑠454 𝑛𝑚 es la absorbancia medida a 454 nm; b y m son el intercepto y la

pendiente de la curva de Calibración, respectivamente; V es el volumen del extracto

(mL); W es el peso de la muestra liofilizada (g); y DF es el factor de dilución

correspondiente. El contenido de carotenoides totales se corrigió a base seca o base

húmeda, de acuerdo con el contenido de humedad de la muestra (liofilizada o fresca),

determinada como se describe en la sección 2.1.4

2.2.7 Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

con reflectancia total atenuada (FTIR-ATR)

Los datos espectrales se obtuvieron con un equipo FTIR (Jasco, Japón) utilizando un

dispositivo de reflectancia total atenuada (ATR) de reflexión única de diamante. Se

adquirieron un total de 24 espectros por muestra con 24 scans por espectro con una

resolución espectral de 4 cm-1 en el intervalo espectral de 4000 a 450 cm-1. Los

espectros medidos se registraron y pretrataron con los procedimientos incorporados

para la eliminación de agua y CO2, con el software Spectra Manager (Jasco, Japón).

2.2.8 Análisis estadístico

Para las matrices de datos obtenidas a partir de las secciones 2.2.2, 2.2.4, 2.2.5, y

2.2.6 se efectuó el respectivo análisis ANOVA y la prueba de Tukey para identificar las

diferencias entre cultivares, a un nivel de significación de p <0,05. Dicho análisis se



realizó utilizando el software XLSTAT (Addinsoft, Francia), trabajando en el entorno de

Microsoft Excel (Microsoft, EE. UU.).

2.2.9 Análisis de componentes principales (PCA)

Haciendo uso del software MATLAB (The Mathworks, EE. UU.), se llevó a cabo el

procedimiento de análisis de componentes principales. Esto con el fin de determinar las

variables latentes o componentes principales que describan la máxima variabilidad de

los datos de imagen (variables R, G y B) y así poder visualizar posibles patrones de

agrupamiento, mediante la visualización del scoreplot. Adicionalmente, a través del

loading plot, fue posible observar la contribución de cada variable a las componentes

seleccionadas.

2.2.10 Modelado de regresión por mínimos cuadrados

parciales (PLS)

Los modelos de regresión para predecir el contenido de carotenoides totales se

desarrollaron mediante algoritmo de mínimos cuadrados parciales, que combina la

información espectral, colorimétrica y de imagen (X) con la información dependiente (Y),

es decir, el contenido de carotenoides totales determinado por espectrofotometría UV-

Vis. Los espectros se redujeron en el rango espectral (1300-3000 o 920-3000 cm-1) y se

dividieron en dos conjuntos de datos mediante el algoritmo de Kennard-Stone; un

conjunto de datos, que contiene alrededor del 70% de los espectros, se utilizó para la

calibración del modelo, y el 30% restante de los datos se utilizó para probar la

predictividad del modelo. Se utilizaron las siguientes técnicas de preprocesamiento

espectral (además de eliminación de agua y CO2), cada una por separado o en

combinación: sin preprocesamiento espectral, standard normal variate (SNV), suavizado

(Savitzky-Golay con ancho de filtro 15), primera derivada (Savitzky-Golay con ancho de

filtro 15), segunda derivada (Savitzky-Golay con ancho de filtro 15), siempre seguidos

de mean centering. La dimensionalidad del modelo, también conocida como el número

de variables latentes, se evaluó mediante estrategia de validación cruzada empleando

venetian-blinds. Para identificar el modelo más apropiado, se utilizaron parámetros

estadísticos como root mean square error of calibration (RMSEC) y root mean square

error of prediction (RMSEP), sumado al coeficiente de determinación (R2) de la

calibración y la predicción. Además, la capacidad de predicción de los modelos

obtenidos se evaluó comparando el RMSEP con el Error estándar de laboratorio

Capítulo 2 81

(RMSEL) de acuerdo con el procedimiento propuesto por Shenk & Westerhaus (1996),

empleando la siguiente ecuación:

𝑆𝐸𝐿 = ∑ (𝑦1 − 𝑦2)2𝑁

1

2𝑁

Donde 𝑦1 es la primera medida obtenida en el laboratorio; 𝑦2 es la segunda medida; N

es el número total de muestras.

Los modelos fueron desarrollados haciendo uso de PLS toolbox (Eigenvector, EE. UU.)

en el entorno MATLAB (The Mathworks, EE. UU.)

2.3 Resultados y discusión

2.3.1 Contenido de carotenoides totales e índices de calidad

fisicoquímica de muestras de Cucurbita spp.

El contenido de carotenoides totales de las 63 muestras de pulpa de Cucurbita spp. se

presenta en la Tabla 2.2, junto con sus parámetros de calidad fisicoquímica (contenido

de humedad, pH, acidez titulable y sólidos solubles totales). A partir de estos resultados,

es posible resaltar que este vegetal cultivado en Colombia es una fuente importante de

compuestos carotenoides, presentando una gran variabilidad en su contenido total

(155,8 μg/g – 2137,3 μg/g en base seca), según el cultivar u origen geográfico,

garantizando una representación robusta de carotenoides totales para el desarrollo del

modelo de regresión. C. moschata de Tolima presentó el mayor contenido de

carotenoides, con valores que exceden los 1000 μg/g (base seca), lo cual

probablemente está asociado con un índice de madurez más alto, como lo indica el pH

promedio más alto y una acidez más baja (Sharma and Rao, 2013). El cultivar Dorado

presentó el contenido de carotenoides más bajo, con valores comprendidos entre 155,8

y 291,8 μg/g (base seca).



Tabla 2.2 Contenido de carotenoides totales y parámetros de calidad fisicoquímica de muestras de Cucurbita spp.

Origen o cultivar TCC (Base seca) (µg/g)

(X ± σ [mín. – máx.] (n))

pH (X ± σ [mín. –

máx.] (n))

Acidez titulable (g ácido málico eq/100 g) (X ± σ [mín. – máx.] (n))

Sólidos solubles totales (°Brix)

(X ± σ [mín. – máx.] (n)) Código Descripción

AB C. moschata D. (cv.

Abanico 75) 517,7 ± 173,3BC

[292,1 – 749,0](9) 6,070 ± 0,199CD

[5,830 – 6,500] (9) 0,295 ± 0,064A

[0,194 – 0,403] (9) 10,561 ± 1,521A

[8,100 – 13,400] (9)

LL C. moschata D. (origen: Meta)

1065,4 ± 616,1AB

[614,2 – 2081,3] (8) 6,349 ± 0,368AB

[5,990 – 7,030] (8) 0,136 ± 0,017BCD

[0,127 – 0,200] (8) 5,475 ± 1,705D

[3,700 – 8,000] (8)

MD C. maxima D. (cv.

Mandarino) 388,2 ± 127,0BC

[263,5 – 597,7] (8) 6,026 ± 0,138D

[5,800 – 6,270] (8) 0,107 ± 0,027CDE

[0,066 – 0,142] (8) 5,094 ± 0,812DE

[3,900 – 6,400] (8)

BV C. moschata D. (cv.

Bolo verde) 399,1 ± 192,3BC

[205,7 – 729,6] (6) 6,259 ± 0,264BCD

[5,910 – 6,650] (6) 0,149 ± 0,032BC

[0,115 – 0,214] (6) 7,775 ± 0,990C

[6,500 – 9,500] (6)

DO C. moschata D. (cv.

Dorado) 207,0 ± 55,0C

[155,8 – 291,8] (8) 6,301 ± 0,184ABC

[6,050 – 6,630](8) 0,178 ± 0,064B

[0,111 – 0,280] (8) 9,313 ± 1,063B

[7,400 – 11,300] (8)

VL C. moschata D.

(origen: Valle del Cauca)

744,3 ± 394,2ABC

[247,1 – 1299,7](8) 5,740 ± 0,166E

[5,560 – 6,020] (8)

0,101 ± 0,035DE

[0,062 – 0,135] (8) 5,688 ± 1,148D

[3,700 – 7,200] (8)

HU C. moschata D. (origen: Huila)

754,2 ± 266,2ABC

[453,600 – 1096,9] (8) 6,424 ± 0,291AB

[5,900 – 6,700] (8) 0,065 ± 0,003E

[0,057 – 0,059] (8) 4,100 ± 0,825E

[2,700 – 5,200] (8)

MQ C. moschata D. (origen:Tolima)

1203,1 ± 880,3A

[229,8 – 2137,3] (8) 6,554 ± 0,225A

[6,250 – 6,960] (8) 0,067 ± 0,001E

[0,063 – 0,068] (8) 5,206 ± 0,713DE

[4,200 – 6,500] (8)

General 659,9 ± 345,0

[155,8 – 2137,3] (63) 6,215 ± 0,259

[5,560 – 7,030] (63) 0,295 ± 0,064

[0,057 – 0,403] (63) 6,652 ± 2,298

[3,700 – 13,400] (63)

Capítulo 2 83

X=promedio, σ=desviación estandar, n=número de muestras. Las medias en la misma columna seguidas de una letra distinta indican diferencias

estadísticamente significativas (P <0.05).



Hay diferentes rangos reportados de carotenoides totales tanto de C. moschata como

de C. maxima; en general, el contenido de carotenoides de las muestras colombianas

de Cucurbita spp. analizadas en este estudio concuerda con reportes anteriores. Ortiz

(2009) encontró que el contenido varía de 490,1 – 1365,8 μg/g en C. moschata de

Colombia (Valle del Cauca). En un estudio con ahuyamas brasileñas de la misma

especie, el contenido total de carotenoides varió entre 404,98 y 234,21 μg/g (Carvalho

et al., 2014). Azevedo-Meleiro & Rodriguez-Amaya (2007) reportaron contenidos de

118,7 μg/g y 105,1 μg/g para dos cultivares de C. moschata, y contenidos de 152,8 μg/g

y 123,4 μg/g para dos cultivares de C. maxima de Brasil (como la suma de β-caroteno,

α-caroteno, luteína, violaxantina y neoxantina, en base húmeda). (Murkovic et al., 2002)

encontraron contenidos de 30 μg/g y 205 μg/g en C. maxima, y de 42 μg/g y 130 μg/g

en C. moschata de diferentes variedades de Austria (como la suma de β-caroteno, α-

caroteno, luteína y zeaxantina, en base húmeda).

2.3.2 Análisis de imagen digital

El algoritmo propuesto básicamente implicaba dos etapas importantes, primero el

parcelamiento de la imagen y, segundo, el cálculo de los valores RGB. A partir de este

procedimiento se podría decir que el algoritmo fue capaz de identificar la muestra en

toda la imagen, reconocer los píxeles y extraer los valores RGB. Los resultados

obtenidos se muestran en la Tabla 2.3.

Tabla 2.3. Valores RGB obtenidos a partir de imágenes de los cultivares de

Cucurbita spp.

Origen o cultivar R

(X ± σ [mín.-máx.] (n))

G (X ± σ [mín.-máx.]

(n))

B (X ± σ [mín.-máx.] (n))

Código Descripción

AB C. moschata D. (cv. Abanico 75)

102,792 ±13,984C [80,17-118,83]

(7)

89,789 ±5,209 C [80,76-96,91]

(7)

68,413 ±6,877 B [61,06-80,23]

(7)

LL C. moschata D. (origen: Meta)

155,411±28,774B [122,394-92,117]

(8)

112,079±24,573BC [81,318-148,369]

(8)

68,510±17,692 B [41,128-97,483]

(8)

MD C. maxima D.

(cv. Mandarino)

191,606±15,323A

[162,565-205,724] (8)

122,614±12,978AB

[109,893-146,264] (8)

61,120 ±9,260B [41,552-69,993]

(8)

Capítulo 2 85

BV C. moschata D. (cv. Bolo verde)

89,983 ±21,588C [47,101-105,859]

(6)

83,478±19,216C [49,339-105,185]

(6)

60,945±12,484B [45,645-80,590]

(6)

DO C. moschata D.

(cv. Dorado)

166,385 ±6,654AB [159,593-74,776]

(8)

141,628±6,922A [132,293-153,428]

(8)

98,379±10,333A

[80,565-116,369] (8)

VL C. moschata D.

(origen: Valle del Cauca)

89,825 ±20,787C [52,595-108,315]

(8)

90,557±16,716C [58,638-103,033]

(8)

77,750±15,996AB [54,423-98,598]

(8)

HU C. moschata D. (origen: Huila)

87,400 ±23,901C [37,113-105,945]

(8)

93,485±27,656C [35,960-115,115]

(8)

72,313±20,652B [31,371-96,908]

(8)

MQ

C. moschata D. (origen:

Mariquita,Tolima)

104,706 ±17,417C [86,233-129,192]

(8)

106,171±11,657BC [95,231-128,431]

(8)

81,074±15,649AB [56,456-95,212]

(8) Promedio ± σ

(n)

123,514±18,553 (61)

104,975± 15,616 (61)

73,563± 13,618 (61)

X=promedio, σ=desviación estándar, n=número de muestras. Las medias en la misma

columna seguidas de una letra distinta indican diferencias estadísticamente

significativas (P <0.05).

El análisis de varianza revela las similitudes y diferencias entre cada cultivar descrito en

la Tabla 2.3. Para las tres variables R, G y B cabe destacar que la diferencia entre

cultivares “VL”, “HU” y “MQ” no es estadísticamente significativa, lo cual podría estar

relacionado con el hecho de que estos cultivares presentaban coloración verde. Lo

anterior queda demostrado con el PCA presentado en la Figura 2.2, donde se puede

apreciar que estos tres cultivares no están ni del lado positivo ni del lado negativo del

scoreplot, compartiendo la posición intermedia del gráfico. Por su parte, los cultivares

“DO” y “MD” están del lado positivo del scoreplot y los cultivares “AB” y “BV” están del

lado negativo. La similitud en este último par es consistente con los resultados del

ANOVA, lo cual indica que, si bien las unidades experimentales presentaban distinta

coloración, el fragmento analizado de la imagen de cada cultivar contenía pixeles con

cantidades similares de R, G y B.

De acuerdo a los resultados, una única componente fue suficiente para describir

prácticamente el 70% de la varianza, por lo cual dicha componente constituye el vector

propio con el valor propio más grande en la matriz de covarianza, siendo la componente

que captura la mayor parte de la información de las tres variables estudiadas (R,G,B).



Figura 2.2 Score plot para valores RGB en muestras de Cucurbita spp., donde DO=Dorado; AB=Abanico75; MD=Mandarino; BV=Bolo verde; LL=Llanera; VL=Valluna; MQ=Mariquiteña.

Los resultados sugieren que los cultivares Dorado, Abanico 75, Mandarino y Mariquiteña

tienen la menor variación intraclase, y contrario a esto, las ahuyamas de origen Llanera,

Huilense, Valluna y Bolo verde poseen una gran variación intraclase. Como se puede

observar, los cultivares con menor variación intraclase son en su mayoría aquellos que

se cultivaron en condiciones controladas en el centro experimental, mientras que

aquellos que poseen una alta variación intraclase son en su mayoría adquiridos

directamente del comercio. Según esta observación, al no tener la certeza de que se

han aplicado condiciones estrictas durante el cultivo de las ahuyamas obtenidas del

comercio, esto podría conducir a unidades experimentales heterogéneas, que difieren

entre sí en cuanto a su apariencia. Dicha variación intraclase concuerda con algunos

informes, que sugieren que ahuyamas pertenecientes al género Cucurbita, poseen

variabilidad en su coloración. (Balkaya et al., 2010; Grumet et al., 2017; Rodríguez et

al., 2018; Schaffer & Paris, 2003).

Al igual que el ojo humano, una cámara digital tiene sensores sensibles a tres colores.

En un chip CCD (dispositivo de carga acoplada) se diferencian por un filtro de Bayer.

Cada área del sensor Bayer de 2x2 píxeles contiene un píxel rojo, un píxel azul y dos

Capítulo 2 87

píxeles verdes. Por lo tanto, en el espacio de color RGB (Rojo Verde Azul), cada píxel

se describe por la intensidad de rojo, verde y azul que contiene (Sharma, 2018).

Cada uno de los componentes individuales R o G o B son normalmente valores de 8

bits (8 bits de resolución), cada uno en el rango de 0-255, siendo 255 el mayor valor

posible para almacenar en 8 bits (28 = 256 valores de [0-255]) (Zamojski et al., 2019).

En este contexto, considerando que el espacio de color RGB es un sistema de color

aditivo donde el proceso de reproducción aditiva mezcla varias cantidades de luz roja,

verde y azul para producir otros colores, y considerando que los componentes

predominantes son, rojo (R) y verde (G), la adición de estos dos componentes daría

lugar al color amarillo, lo cual es consistente con el hecho de que la mayoría de muestras

de Cucurbita spp. poseen una apariencia verde o amarilla en la superficie/cáscara. Lo

anterior queda demostrado con el loading plot, donde se corrobora el hecho de que las

variables R y G son las que mayor participación tienen en la componente seleccionada,

y por ende en la coloración de las unidades experimentales estudiadas, tal como se

observa en la Figura 2.3

Figura 2.3 Loading plot para las variables RGB en muestras de Cucurbita spp. V1, V2 y V3 son R, G y B, respectivamente.

2.3.3 Análisis colorimétrico

Los resultados obtenidos para el análisis colorimétrico realizado a la pulpa

homogeneizada de Cucurbita spp., se muestran en la Tabla 2.4.

A partir de estos resultados se puede apreciar que tanto a* como b* tienen valores

positivos, lo cual indica que todas las muestras analizadas presentan tonalidades

comprendidas en la gama de colores amarillo-rojo-naranja. Adicionalmente se puede



apreciar que los valores del croma oscilan entre 51 y 64, hecho que se traduce en

diferencias en la intensidad de color de las muestras (X-rite, 2016), unas con mayor

saturación que otras, lo cual podria ser una evidencia de la diferencia en composición

de los pigmentos de las diferentes muestras (carotenoides). Para evaluar los resultados

del Croma, se efectuó el respectivo análisis de ANOVA y la prueba de Tukey para

identificar las diferencia entre cultivares, a un nivel de confianza del 95%. Los resultados

sugieren que no hay diferencias significativas entre los cultivares Abanico y Mandarino,

al igual que entre las ahuyamas de origen Llanera y Mariquiteña. Por su parte las

ahuyamas Dorado, Huilense, Valluna y y Bolo verde son significativamente diferentes

de las demás.

Las observaciones subjetivas del color de la pulpa (última columna de la Tabla 2.4)

fueron consistentes con el valor de matiz obtenido (ángulo de tono), en que los valores

alrededor de 60° corresponden a tonalidades rojo-naranja, lo cual además es

consistente con los valores reportados en la literatura (Boscarol, 2007). Teniendo en

cuenta que en la mayoría de los casos el valor del ángulo de tono se encuentra alrededor

de 60°, se podría asegurar que los distintos cultivares tienen una tonalidad similar entre

sí. Lo anterior es consistente con el análisis ANOVA (nivel de confianza del 95%), donde

se encontró que no hay diferencias significativas entre las muestras analizadas.

Los valores anteriormente mencionados para Croma y matiz coinciden con reportes

literarios para C. moschata, donde los valores de Croma y matiz oscilan entre 60-70 y

70°-90° respectivamente (Itle & Kabelka, 2009). No obstante, existen reportes del

cultivar Bolo verde (C. moschata), cuyos valores varían entre 30-40 y 30°-50°,

respectivamente, que indican una saturación de color mucho menor, y una tonalidad

más rojiza en comparación a las muestras del presente estudio (Suarez et al., 2016).

Capítulo 2 89

Tabla 2.4. Coordenadas L*a*b* para las muestras de Cucurbita spp. (pulpa fresca homogeneizada).

Origen o cultivar L (claridad)

(X ± σ [mín. – máx.] (n))

a* (X ± σ [mín. –

máx.] (n))

b* (X ± σ [mín. – máx.]

(n))

C (Croma) (X ± σ [mín. –

máx.] (n))

Matiz (ángulo de tono)

(X ± σ [mín. – máx.] (n))

Imagen ilustrativa de

valor promedio de

color* Código Descripción

AB C. moschata

D. (cv. Abanico 75)

62,612±3,822BC

[55,303-67,370] (9)

27,494±1,643A

[24,290-29,707] (9)

57,298±5,666 A

[45,993-64,687] (9)

63,623±4,986 AB

[53,094-69,726] (9)

64,196±2,842 A

[60,027-69,421] (9)

LL C. moschata D. (origen:

Meta)

55,219±2,888D

[50,023-58,997] (8)

25,976±2,725 A

[21,270-28,463] (8)

50,038±9,353ABC [42,933-72,627]

(8)

56,509±8,873BCD [47,917-77,221]

(8)

62,192±3,670 A

[58,764-70,040] (8)

MD C. maxima D.

(cv. Mandarino)

64,196±2,580B

[60,457-67,060] (8)

26,460±1,517 A

[25.093-29,180] (8)

55,589±1,924AB [52,757-57,787]

(8)

61,599±1,145 AB

[60,014-63,046] (8)

64,515±2,028 A

[61,046-66,430] (8)

BV C. moschata

D. (cv. Boloverde)

61,760±4,395BCD

[55,877-65,923] (6)

27,645±2,567 A

[23,910-31,260] (6)

54,662±7,627 AB

[43,343-64,217] (6)

61,378±6,858 ABC

[50,685-70,344] (6)

62,872±3,966 A

[58,772-67,945] (6)

DO C. moschata

D. (cv. Dorado)

71,090±2,849A

[67,657-76,140] (8)

27,682±2,707 A

[21,630-30,357] (8)

58,409±3,228 A

[53,343-62,360] (8)

64,709±2,786 A

[59,801-69,305] (8)

64,593±2,795 A

[62,170-70,873] (8)

VL

C. moschata D. (origen: Valle del Cauca)

57,281±4,611CD

[51,787-64,387] (8)

25,701±2,969 A

[20,457-30,147] (8)

44,338±3,021C

[38,707-49,030] (8)

51,329±2,959 D

[45,478-55,571] (8)

59,879±3,365 A

[55,557-66,481] (8)



HU C. moschata D. (origen:

Huila)

56,915±1,146CD

[55,213-58,060] (8)

24,460±1,946 A

[22,600-27,770] (8)

47,490±4,303BC

[42,587-55,847] (8)

53,425±4,649 CD

[48,212-62,372] (8)

62,720±0,897 A

[61,092-63,689] (8)

MQ

C. moschata D. (origen: Mariquita, Tolima)

56,777±6,501CD

[47,160-66,127] (8)

26,029±2,814 A

[22,913-30,297] (8)

50,173±5,773ABC

[44,270-62,423] (8)

56,659±4,968 BCD

[49,849-66,701] (8)

62,347±3,908 A

[57,975-69,173] (8)

*Color converter (Nix Sensor, Estados Unidos) disponible en: https://www.nixsensor.com/free-color-converter/

X=promedio; σ=desviación estandar; n=numero de muestras

https://www.nixsensor.com/free-color-converter/

Capítulo 2 91

2.3.4 Análisis espectral

La Figura 2.4 (A) muestra el espectro característico de la pulpa fresca (cada uno

corresponde al promedio de 24 espectros). En general, los espectros son similares

respecto a la posición de los picos característicos. Sin embargo, la intensidad de varios

picos, en particular aquellos entre 1200 y 500 cm-1, varía mucho, lo que sugiere la

posibilidad de obtener información cuantitativa de la composición química de las

especies de Cucurbita a partir de estos espectros. En el espectro de la pulpa fresca, las

bandas del β-caroteno y la luteína podrían estar solapadas con los picos de otros grupos

funcionales. No obstante, es posible distinguir algunos picos característicos de estos

compuestos, como 960,1 cm-1 y 963,1 cm-1 (Figura 2.5). De acuerdo con la literatura, el

pico alrededor de 1550-1600 cm-1 correspondería a vibraciones de estiramiento de

dobles enlaces C=C en la cadena de polieno del β-caroteno. La región de

aproximadamente 450 cm–1 estaría asociada a vibraciones de deformación antisimétrica

de los grupos CH3 (cambio en los ángulos HCH) y grupos CH2 (vibraciones de tijera).

De la misma manera, las bandas de intensidad débil-media ubicadas alrededor de 1360-

1390 cm–1 estarían formadas por las vibraciones tipo “sombrilla” de los grupos CH3. El

pico más intenso del espectro, ubicado entre 950-980 cm-1 correspondería a las

vibraciones de deformación de los enlaces C-H en la cadena de polieno. Por otro lado,

la banda ubicada a aproximadamente 520-530 cm-1 estaría asociada con el cambio en

los ángulos y la deformación de la cadena de polieno (Berezin & Nechaev, 2005;

Schlücker et al., 2003). Es interesante notar la similitud de los espectros con los

reportados para muestras de pectina de C. maxima (Torkova et al., 2018), donde el pico

con un máximo de 3000-3600 cm-1 corresponde a las oscilaciones de los grupos O-H.

Otra banda asociada por estos autores con pectina de C. maxima, corresponde a 2926

cm-1, que corresponde a la oscilación de grupos funcionales que contienen enlaces C-

H. En el espectro FTIR de las muestras estudiadas de Cucurbita spp., también es

posible encontrar una banda alrededor de 1100 cm-1 que correspondería al estiramiento

C-O de alcoholes; banda que probablemente surge de compuestos carotenoides como

la luteína (Prabhu et al., 2015) (esta banda se puede apreciar también en la Figura 2.5),

o también de otros compuestos bioactivos con grupos alcohol que hacen parte de la

composición química de la pulpa de Cucurbita spp.(Kulczyński & Gramza-Michałowska,

2019a, 2019b). Según esto, además de compuestos carotenoides, los espectros

característicos de pulpa de Cucurbita spp., también están determinados por la presencia

de pectina y diferentes compuestos bioactivos.



Figura 2.4. Espectros característicos de FTIR-ATR de las muestras de Cucurbita spp. (n = 63) con diferentes protocolos de

procesamiento de muestras: (A) pulpa fresca (licuadora-homogenizada); (B) pulpa liofilizada; (C) extractos en hexano:acetona (1:1)

Capítulo 2 93

Figura 2.5. Espectros FTIR-ATR para β-caroteno y luteína



En los espectros de la pulpa liofilizada que se muestran en la Figura 2.4 (B), se puede

ver que el pico amplio e intenso con un máximo de 3200 a 3600 cm-1 corresponde a las

oscilaciones de los grupos OH en la molécula de agua, cuya intensidad se reduce debido

al proceso de liofilización. En estos espectros, es posible apreciar las mismas bandas

características de los espectros de la pulpa fresca: 2926 cm-1 que corresponde a la

oscilación de grupos con enlaces C-H, 1550 cm-1, asociada a dobles enlaces de la

cadena de polieno del β-caroteno. También se puede observar una de las bandas típicas

del β-caroteno, que se ubica alrededor de 968 cm-1 (De Nardo et al., 2009).

La Figura 2.4 (C) muestra los espectros de los extractos en hexano:acetona. En este

caso (al comparar con el espectro de la Figura 2.5) es posible identificar la banda

característica del β-caroteno a 3000 cm-1, sin embargo, se superpone con la banda típica

del hexano que también está alrededor de 3000 cm-1 (asociada a enlace C-H). Así

mismo, en estos espectros se observan las bandas características de la acetona, que

incluyen la banda intensa de aproximadamente 1720 cm-1 (asociada a enlace C=O), y la

banda alrededor de 1220 cm-1 que corresponde a la flexión C-C-C (Walton & Reyes,

1983; Weininger & Stermitz, 1988). El β-caroteno también produce una banda

característica alrededor de 968 cm-1, sin embargo, la absorbancia de la mezcla de

solventes es muy fuerte, por lo tanto, "ocultan" la del analito y no se observa la banda

correspondiente del carotenoide.

2.3.5 Regresión PLS: predicción del contenido de carotenoides

totales mediante datos espectrales IR

Se investigaron diferentes rangos espectrales y pretratamientos para desarrollar

modelos PLS con el fin de predecir el contenido de carotenoides totales en muestras de

Cucurbita spp. Posteriormente, se desarrollaron modelos para todos los protocolos de

preparación investigados (homogenización con licuadora (A), liofilización (B) y

extracción con hexano: acetona (1: 1) (C). Finalmente, se realizó procedimiento de

validación cruzada para cada modelo con el fin de confirmar la solidez de la calibración

y para seleccionar el número de variables latentes que minimizaban el error de

calibración y validación cruzada (RMSEC y RMSECV). Los detalles de los mejores

modelos desarrollados se presentan en la Tabla 2.5. Para cada preparación de muestra,

se seleccionó el mejor modelo teniendo en cuenta el error más bajo en la predicción

(RMSEP) y el mayor coeficiente de determinación en la predicción (R2PRED).

Capítulo 2 95

Tabla 2.5. Modelos de regresión PLS para la predicción del contenido de

carotenoides totales en pulpa de Cucurbita spp. a partir de espectros FTIR-ATR

Tratamiento de muestra

Rango espectral

(cm-1)

LV TCC rango de variación (µg/g)

Calibración Predicción

min máx. S.D. R2CAL RMSEC R2

PRED RMSEP

Pulpa fresca (A)

1300-3000

8 21,0 230,1 57,1 0,93 12,8 0,425 42,5

4 21 230,1 57,1 0,72 23,26 0,66 25,66

Pulpa liofilizada

(B) 920-3000 8 182,8 2137,3 522,6 0,95 109,8 0,93 193,1

Extracto (C) 920-3000 7 162,1 2563,4 600,1 0,61 296,9 0,3 491

LV, variables latentes; TCC, contenido de carotenoides totales; min, valor mínimo del conjunto de

predicción; máx., valor máximo del conjunto de predicción; S.D., desviación estándar del conjunto de

predicción; R2, coeficiente de determinación; RMSEC, error cuadrático medio de calibración; RMSECV,

error cuadrático medio de validación cruzada; RMSEP, error cuadrático medio de predicción. El error para

la pulpa fresca se expresa como µg/g en base húmeda, mientras que el error para muestras liofilizadas se

expresa como µg/g en base seca.

El modelo obtenido para la pulpa fresca presentó una baja capacidad de predicción

(R2PRED de 0,66 en comparación con el R2

CAL de 0,93), lo que demuestra que el modelo

no es estable al pasar al conjunto de datos de predicción. Esto probablemente se

atribuye al alto contenido de agua, que implica una menor concentración de nutrientes

y, por lo tanto, una menor absorbancia de los compuestos de carotenoides en los

espectros y un mayor efecto de absorbancia ligado al contenido de agua. El RMSEP

obtenido fue 25,66 µg/g en base húmeda, que es más de dos veces el error estándar

de laboratorio (RMSEL) que fue 10,86 µg/g. De acuerdo a Shenk & Westerhaus (1996),

se puede considerar un modelo de predicción para la implementación real cuando el

RMSEP no excede el doble del SEL, por lo tanto, en estas circunstancias el modelo solo

podría ser aplicado con fines de detección de carotenoides, pero en una forma

preliminar. Por otro lado, el modelo de regresión obtenido empleando los espectros de

las muestras liofilizadas mejoró considerablemente (R2PRED de 0,92, RMSEP de 193 µg/g

en base seca), gracias al aumento de las bandas de absorción características, que no

están afectadas por la presencia de agua. En este caso, el valor de 2 x RMSEL fue de

208,09 µg/g en base seca, por lo tanto, el modelo estaría dentro del límite de

confiabilidad para la implementación de la técnica (espectroscopía FTIR-ATR) junto con

regresión PLS, para la determinación de carotenoides en muestras de Cucurbita spp.

liofilizadas. Ahora bien, se pensó que, al aumentar el grado de aislamiento del analito,

es decir, al realizar la extracción de carotenoides totales en hexano: acetona, sería

posible mejorar aún más la capacidad predictiva del modelo. Sin embargo, los grupos

funcionales de los solventes empleados se superponen y atenúan las bandas típicas de



los carotenoides, causando una muy baja predictividad de los modelos de regresión,

incluso cuando se evalúan rangos espectrales diferentes (Tabla 2.5).

El desempeño estadístico de los modelos PLS desarrollados en diferentes estudios para

la determinación del contenido de carotenoides en productos alimenticios frescos o

mínimamente procesados, utilizando datos espectrales MIR y NIR, se muestra en la

Tabla 2.6. En comparación, el modelo PLS desarrollado para las muestras liofilizadas

de este estudio tiene un buen desempeño estadístico, con parámetros comparables a

los de dichos estudios reportados.

Tabla 2.6. Rendimiento comparativo de métodos basados en técnicas MIR y NIR

para la determinación de carotenoides en muestras de alimentos.

Técnica Matriz

Rango de variación

(µg/g) (min –máx.)

Analito R2 RMSE Fuente

MIR Jugo de tomate

92.5-15.22 Licopeno 0,97 0,4

(De Nardo et al., 2009)

MIR Jugo de tomate

1.8 – 6.6 β-caroteno 0,91 0,054

(De Nardo et al., 2009)

NIR Ahuyama 67.1–451.2 Carotenoides totales 0,95 31,7

(Martínez-Valdivieso et al., 2014)

NIR Ahuyama 50.3–434.3 Luteína 0,96 26,8


NIR Ahuyama 0–24 β-caroteno 0,81 2,27


NIR Tomate 26.2 – 6290 Licopeno 0,85 91,19

(Baranska et al., 2006)

NIR Tomate 2.3 – 28.3 β-caroteno 0,8 0,41

(Baranska et al., 2006)

R2, coeficiente de determinación de los modelos reportado; RMSE, raíz del error cuadrático medio

reportado. MIR: espectroscopía de infrarrojo medio; NIR: espectroscopía de infrarrojo cercano.

En resumen, el modelo PLS obtenido con datos espectrales FTIR-ATR de muestras

liofilizadas fue el más apropiado. Este modelo permitió obtener valores de contenido de

carotenoides totales que son comparables a los obtenidos por la técnica

espectrofotométrica UV-Vis utilizada convencionalmente, con un menor consumo de

tiempo y evitando la necesidad de protocolos de extracción y solventes. La comparación

entre ambas técnicas se presenta en la Figura 2.6.

Capítulo 2 97

Figura 2.6. Comparación entre el contenido de carotenoides totales determinado

por espectrofotometría UV-Vis y el modelo PLS basado en espectroscopía FTIR-

ATR obtenido de muestras liofilizadas. En círculos grises, el conjunto de

entrenamiento; en rombos rojos, el conjunto de predicción.


totales mediante datos espectrales IR y datos de color.

Para investigar si los modelos PLS de la sección 2.3.5 podrían mejorarse, se pensó

que al mezclar datos de espectroscopía IR con valores de color triestímulo obtenidos

mediante análisis de colorimetría, sería posible lograr un mejor rendimiento en la

regresión PLS. En este caso, no se desarrollaron modelos para los extractos en hexano:

acetona, teniendo en cuenta la pobre capacidad predictiva obtenida para estas muestras

en la sección anterior. Primero, se aplicó preprocesamiento para eliminar el ruido y las

señales interferentes, y luego, el procedimiento de validación cruzada permitió

determinar el número de variables latentes con el mayor porcentaje de varianza

explicado. Los resultados de los modelos con el mejor rendimiento para los protocolos

de muestra: homogenización con licuadora (A) y liofilización (B) se presentan en la

Tabla 2.7.




carotenoides totales en pulpa de calabaza a partir de espectros FTIR-ATR y

valores de color L*a*b*

Tratamiento de

muestra

Rango espectral (cm-1)

LV

TCC rango de variación (µg/g)


min máx. S.D. R2

CA

L

RMSEC

R2PRE

D

RMSEP

Pulpa fresca (A)

1300-3000

8 21,0

3 230,1

4 57,0

7 0,91 10,48 0,84 15,02

Pulpa liofilizada

(B)

1300-3000

6 21,0

3 230,1

4 57,0

7 0,9 16,16 0,88 20,55

Es posible apreciar que, a diferencia de la sección 2.3.5, el modelo para pulpa fresca

(homogenización con licuadora) mejoró considerablemente, presentando un coeficiente

R2 de 0,91 µg/g para calibración y 0,84 µg/g para predicción, lo que demuestra que el

modelo es estable al pasar del conjunto de calibración al conjunto de predicción. El valor

de RMSEP se comparó con el error estándar de laboratorio (SEL), para evaluar en qué

medida el modelo tiene una capacidad predictiva suficientemente buena dada la

aplicación real (Kutz, 2016). En este caso, el valor de RMSEP (15,02 µg/g) no excede

el doble del SEL (2 x SEL= 21,73 µg/g), por lo cual podría decirse que el modelo puede

considerarse para su implementación real. No obstante, el coeficiente de determinación

en la validación cruzada es relativamente bajo (0,62), denotando una estimación no

confiable del número de variables latentes, lo cual a su vez puede afectar la estimación

de la predictividad del modelo. Por otro lado, el modelo realizado con los espectros

infrarrojo de las muestras liofilizadas conduce a valores altos para los coeficientes de

calibración (0,90), validación cruzada (0,77) y predicción (0,88). De acuerdo a esto, la

comparación entre la técnica estándar (UV-Vis) y las técnicas propuestas (Color + FTIR-

ATR) para las muestras liofilizadas se presenta en la Figura 2.7.

Capítulo 2 99


por espectrofotometría UV-Vis y el modelo PLS basado en datos de colorimetría

triestímulo y FTIR-ATR obtenidos de muestras liofilizadas. En círculos grises, el

conjunto de entrenamiento; en rombos rojos, el conjunto de predicción.

En este caso el valor de RMSEP (20,55) tampoco excede el doble del valor de SEL (2 x

SEL= 21,73 µg/g), por lo cual, de acuerdo con Shenk & Westerhaus (1996) el modelo

puede considerarse para su implementación real.

De acuerdo a lo anterior se podría decir que, si bien las muestras frescas poseen un

buen RMSEP (que no excede el valor de SEL), las estadísticas de validación cruzada

son deficientes y, por lo tanto, el modelo no es confiable. Por otro lado, las muestras

liofilizadas conducen a un buen rendimiento en calibración, validación cruzada y

predicción, con un valor aceptable de RMSEP, que no excede el límite del SEL. No

obstante, el valor de R2PRED no es superior al obtenido empleando información

exclusivamente del infrarrojo en la matriz predictora (R2PRED = 0.93) por lo cual se podría

decir que, no es necesario recurrir a la combinación de absorbancias FTIR-ATR con

valores de colorimetría triestímulo para la determinación del contenido de carotenoides

totales, es decir, basta con emplear información obtenida mediante espectroscopía

FTIR-ATR.




totales mediante datos espectrales IR y datos de imagen

RGB

Como otra alternativa de mejora de los modelos de regresión obtenidos con datos de

FTIR-ATR, se exploró la combinación de estos datos espectrales con datos de imagen

RGB. Los datos de imagen RGB tienen una ventaja, y es que contienen información que

surge de toda la superficie de la ahuyama, por lo cual, podría esperarse que esta nueva

combinación de datos permita mejorar los modelos tanto para la muestra fresca como

liofilizada. En este caso, los datos RGB se procesaron con la función de auto escalado

antes de mezclarse con la matriz de datos IR, y los datos IR se procesaron con mean

centering. Los resultados de los modelos con el mejor rendimiento se presentan en la

Tabla 2.8.


carotenoides totales en pulpa de Cucurbita spp. a partir de espectros FTIR-ATR

y valores de imagen RGB


Rango espectral

(cm-1) LV

TCC rango de variación (µg/g)



PRED RMSEP

Pulpa fresca (A)

1300-3000

7 21,03 229,42 52,8 0,87 18,82 0,85 23,96

Pulpa liofilizada

(B)

1300-3000

6 21,03 229,42 52,8 0,93 14,63 0,85 27,94

En este caso, el rango espectral de 1300-3000 cm-1 corresponde a la región de

absorción de carotenoides, y fue la región utilizada para desarrollar los modelos PLS

correspondientes a cada tipo de muestra. Cuando se usan datos de imagen combinados

con absorbancias de infrarrojo, se obtienen modelos que, si bien no exceden la

eficiencia de los modelos reportados en la sección 2.3.5 (usando solo datos de

infrarrojo), mantienen valores aceptables para R2CAL y R2

PRED. En ambos modelos, el

valor de RMSEP no excede el doble del error estándar de laboratorio en base seca (2 x

SEL = 208,09 µg/g). Sin embargo, el modelo de la pulpa fresca tiene un R2CV

relativamente bajo (0,70), lo que podría indicar una estimación incorrecta de la

dimensionalidad del modelo. De esta manera, se consideró que siete variables latentes

describían el modelo de la muestra fresca, lo cual sugiere que, dichos factores utilizados

Capítulo 2 101

para desarrollar el modelo no son correctos, y, por lo tanto, podría existir un problema

de sobreajuste.

La ligera mejora en el procedimiento de validación cruzada para las muestras liofilizadas

(R2CV = 0,77) permite establecer que, en este caso, la estimación del número de

variables latentes es correcta, lo que evita problemas de sobreajuste. De esta manera,

se puede evidenciar que el proceso de eliminación del contenido de agua en las

muestras de Cucurbita spp. favorece la predicción del contenido de carotenoides totales

mediante el uso de valores RGB y absorbancias IR como matriz predictora, lo que

denota que el análisis de imagen digital es una herramienta potencial para predecir

compuestos carotenoides cuando se utiliza junto a técnicas espectroscópicas y métodos

multivariados, al menos para muestras liofilizadas. En la Figura 2.8 se presenta la

comparación entre la técnica estándar y FTIR-ATR con datos de imagen.


por espectrofotometría UV-Vis y el modelo PLS basado en imágenes RGB y datos

FTIR-ATR obtenido de muestras liofilizadas. En círculos grises, el conjunto de

entrenamiento; en rombos rojos, el conjunto de predicción.

A partir del gráfico se puede afirmar que el modelo es preciso, por lo tanto, existe una

fuerte correlación entre los resultados medidos y los pronosticados. Esto es consistente

con los altos valores de R2CAL y R2

PRED, que indican que la bondad de ajuste del modelo

es aceptable. No obstante, los valores de R2PRED no son superiores a los obtenidos

mediante el uso de información del FTIR-ATR como matriz predictora.



2.4 Conclusión

Se desarrollaron con éxito modelos de regresión PLS para la evaluación del contenido

de carotenoides totales de Cucurbita spp., con valores de R2 de 0,95 y 0,93 para

calibración y predicción, respectivamente, basados en uso de espectros FTIR-ATR. La

región MIR comprendida entre 900 cm-1 y 3000 cm-1 fue la más apropiada para los

modelos de regresión, que incluye bandas como 950-980 cm-1 que proporcionan

información cuantitativa útil, probablemente asociada a grupos trans C=C de

isoprenoides como el β-caroteno y la luteína, que se sabe son carotenoides abundantes

en la ahuyama. Aunque en los extractos en hexano: acetona hay un mayor grado de

aislamiento del analito, los modelos de regresión presentaron una pobre capacidad

predictiva, que puede atribuirse a la superposición de bandas de carotenoides con las

bandas de los solventes empleados. En el caso de los modelos PLS obtenidos mediante

la combinación de datos IR con información colorimétrica, los resultados sugieren que,

el modelo de las muestras liofilizadas tiene coeficientes de determinación y errores

asociados a la predicción aceptables, sin embargo, la eficiencia del modelo no es

superior a la del modelo obtenido empleando únicamente información del infrarrojo, por

lo cual se puede concluir que no es necesario recurrir al uso de colorimetría triestímulo,

basta con el uso de las absorbancias del FTIR-ATR para la predicción de carotenoides

totales. De igual manera, los modelos PLS logrados mediante el uso de imágenes RGB

y absorbancias IR como matriz predictora indican que esta combinación funciona para

muestras liofilizadas, en cuanto conduce a una bondad de ajuste aceptable para

calibración, validación cruzada y validación externa, no obstante, el coeficiente de

determinación para la predicción no es superior en comparación al coeficiente obtenido

empleando únicamente información de FTIR-ATR. En suma, respecto a los modelos

multivariados de predicción del contenido de carotenoides totales obtenidos con

solamente información espectral de FTIR-ATR, la capacidad predictiva disminuye

ligeramente cuando son combinados con información de colorimetría y análisis de

imagen. Mediante la aplicación de modelos de regresión PLS y empleando regiones

espectrales como 920-3000 cm-1 y 1300-3000 cm-1, se pueden determinar carotenoides

totales en muestras de Cucurbita spp. a través de una metodología rápida que no implica

el uso de solventes o protocolos de extracción, y que requiere un entrenamiento mínimo,

lo cual representa una ventaja en términos de simplicidad, costo e impacto ambiental.

Capítulo 2 103

2.5 Bibliografía

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Capítulo 2 107

3. Espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría y análisis de imagen combinadas con modelamiento de regresión multivariante como enfoque para la determinación de carotenoides específicos en muestras de ahuyama (Cucurbita spp.)

3.1 Introducción

La importancia del análisis cuantitativo de carotenoides en los alimentos es ampliamente

reconocida como un indicador de biodisponibilidad y funcionalidad de estos compuestos

(Rodriguez-Amaya, 2015). En este contexto, la cromatografía líquida de alta eficiencia

(HPLC) se ha utilizado tradicionalmente como la herramienta preferida para la

determinación de estos compuestos. Sin embargo, han surgido técnicas novedosas que

podrían usarse para simplificar y mejorar la cuantificación de carotenoides, cuando se

combinan con análisis estadístico multivariado. Estas técnicas incluyen la

espectroscopía FTIR-ATR, que puede usarse sola o combinada con colorimetría de

triestímulo o análisis de imagen digital para tal propósito. La espectroscopía infrarroja

por transformada de Fourier (FTIR) es una técnica que ha permitido el desarrollo de

metodologías aceptadas para evaluar diferentes componentes de los alimentos, en

particular cuando se usa en combinación con análisis multivariado y quimiometría,

mejorando la velocidad de análisis, dado que en general no necesita una preparación

de muestra que consuma mucho tiempo o reactivos costosos y/o contaminantes (Anjos

et al., 2015). La región del infrarrojo medio ubicada entre 4000 cm-1 y 450 cm-1 contiene

información que surge de las vibraciones moleculares y es sensible a los estados

químicos y físicos de la muestra, lo que permite discriminar diferentes muestras con

diferentes concentraciones y composiciones; por lo tanto, constituye una técnica

poderosa para el análisis no destructivo (Anjos et al., 2015). Por otro lado, la colorimetría

triestímulo ha llamado la atención debido a su capacidad para predecir la concentración

de compuestos relacionados con la pigmentación de los alimentos, como los



carotenoides, en diferentes matrices, entre las cuales se destaca la ahuyama (Itle &

Kabelka, 2009). Los colores de la pulpa de ahuyama generalmente incluyen una amplia

gama de amarillos y naranjas, lo que las convierte en buenos candidatas para el análisis

colorimétrico. Finalmente, el análisis de imagen digital, es una técnica atractiva que,

mediante el empleo de solo una cámara, permite extraer información colorimétrica y

morfológica, no solo de un área pequeña (a diferencia del análisis de color), en el

espacio de color RGB (rojo, verde y azul) a partir de cada píxel en una imagen. La

información espectroscópica obtenida a través de estas técnicas puede ser

correlacionada con la composición química de las matrices alimentarias determinada a

través de técnicas analíticas convencionales, como HPLC, mediante el uso de métodos

quimiométricos, con el fin de explorar el potencial de predicción de las primeras en

relación a la presencia y concentración de analitos de interés, y así reemplazar métodos

tradicionales más complejos. Por todo lo anterior, el objetivo de esta parte del trabajo

fue evaluar el potencial de técnicas como espectroscopía FTIR-ATR sola o en

combinación con colorimetría y análisis de imagen como herramientas para predecir el

contenido de carotenoides específicos en muestras de ahuyama (Cucurbita spp.)

3.2 Materiales y métodos

3.2.1 Material vegetal

Las 25 muestras seleccionadas para el estudio fueron recolectadas en el centro

experimental de la Universidad Nacional de Colombia en Palmira (Valle del Cauca)

[3 ° 32′05 ″ N 76 ° 17′44 ″ O; 1001 m.s.n.m.], un proceso que dio lugar a tres cultivares

de Cucurbita moschata: Boloverde (n = 6), Dorado (n = 8), Abanico 75 (n = 7), y uno de

Cucurbita maxima: Mandarino (n = 4). Una vez que se cosecharon, las muestras fueron

enviadas al Insitituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA), de la Universidad

Nacional de Colombia (Bogotá), dentro de un período máximo de 2 días, se

desinfectaron en una solución de hipoclorito de sodio (200 ppm) y luego se mantuvieron

en un cuarto de congelación a -30 °C.

3.2.2 Adquisición de las imágenes

La obtención de las imágenes se realizó acorde al procedimiento descrito en la sección

2.2.2

Capítulo 3 109

3.2.3 Procesamiento de la muestra

El procesamiento se realizó de la misma forma que se describe en la sección 2.2.3. En

este caso solo se obtuvieron dos tipos de muestra procesada: muestra homogenizada

(A) y muestra liofilizada (B).

3.2.4 Determinación del color por colorimetría triestímulo

La determinación del color se realizó acorde al procedimiento descrito en la sección

2.2.5.

3.2.5 Determinación de carotenoides específicos por HPLC

Esta etapa de la metodología se desarrolló en colaboración con el Laboratorio de

Análisis Químico de la Sección de Nutrición Humana del Departamento de Ciencias de

los Alimentos, el Ambiente y la Nutrición de la Universidad de Milán (Italia).

▪ Reactivos

La astaxantina, luteína, zeaxantina, β-criptoxantina, violaxantina, equinenona (patrón

interno), α-caroteno y β-caroteno fueron proporcionados por Hoffmann-La Roche

(Basilea, Suiza). El metanol, etanol y tetrahidrofurano (THF) se obtuvieron de Sigma-

Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El agua grado HPLC fue obtenida a través de un

aparato Milli-Q (Millipore, Milford, MA, EE. UU.).

▪ Extracción e hidrólisis de carotenoides.

Los carotenoides se extrajeron de 0,2 g de ahuyama liofilizada (B) con 2 mL de una

solución de etanol:THF (80:20, v/v). La extracción se realizó bajo agitación y luz

disminuida. La mezcla se centrifugó a 1600 xg durante 10 minutos y el procedimiento

de extracción se repitió hasta que el residuo se volvió incoloro. Los extractos se

combinaron y el volumen se ajustó a 10 mL con la solución de etanol:THF (80:20, v/v).

Cada extracto (1,8 mL) se saponificó con 0,2 mL de KOH 1 M en etanol, en condiciones

de oscuridad a 30 °C. Después de 2 h, la solución se centrifugó a 1600 xg durante 1 min

y se analizó el sobrenadante.

▪ Análisis cuantitativo de los carotenoides por el método HPLC-DAD

Como sistema cromatográfico se empleó un cromatógrafo Alliance 2695 (Waters,

Milford, USA), acoplado a un detector de matriz de diodos (DAD) modelo 2998 (Waters)

y una columna Develosil C30 de 3 µm (150 × 2,1 mm; Phenomenex, Torrance, CA, USA).

Adicionalmente se utilizó un espectrómetro de masas Orbitrap modelo Exactive (Thermo



Scientific, San José, CA, EE. UU.), equipado con una sonda de ionización química a

presión atmosférica (APCI), que funciona en modo de ionización positiva.

La velocidad de flujo fue de 0,2 mL/min, y se inyectaron 5 μL. La columna y la muestra

se mantuvieron a 25 y 15 °C, respectivamente. Los eluyentes fueron (X)

agua:metanol:THF (4:89:7, v/v/v/) y (Y) agua: metanol: THF (4:6:90, v/v/v/). Las

separaciones cromatográficas se llevaron a cabo en modo de elución en gradiente,

realizadas de la siguiente manera: 0% Y a 80% Y en 60 minutos, y luego 80% Y durante

10 min. Los espectros se adquirieron en el rango de 220-700 nm y los cromatogramas

se integraron a 445 nm. La adquisición y cuantificación se realizaron utilizando el

software Empower (Waters). Las curvas de calibración para violaxantina, luteína,

zeaxantina, β-criptoxantina, α-caroteno y β-caroteno oscilaron entre 0,1 y 2,0 μg/mL.

Las condiciones operativas de APCI fueron las siguientes: descarga en corona +5 µA,

velocidad de flujo de gas de revestimiento 35 au (unidades arbitrarias), velocidad de

flujo de gas auxiliar 10 au, temperatura capilar 275 C, temperatura del vaporizador

400 ° C, voltaje capilar + 40 V, lente de tubo +125 V y skimmer +18 V. Los analitos se

identificaron en modo positivo mediante adquisición de exploración completa (m/z + 200-

2000 u), utilizando una ventana de aislamiento de ± 3 ppm. El objetivo de control

automático de ganancia (AGC), el tiempo de inyección, la resolución de masa y la

energía de colisión fueron 1 × 106, 50 ms, 50 K y 50 eV, respectivamente.

La opción de "fragmentación de todo el ión" usando la célula de disociación de colisión

de alta energía (HCD) solo se usó para investigar el potencial de confirmación de los

fragmentos generados y se apagó durante el análisis real. La calibración inicial del

instrumento se logró infundiendo mezclas de calibración para los modos de iones

positivo y negativo (Thermo Scientific). La mezcla de calibración positiva incluía cafeína,

sal de acetato de Met-Arg-Phe-Ala (MRFA) y Ultramark® 1621, mientras que la solución

de calibración negativa comprendía dodecil sulfato de sodio, taurocolato de sodio y

Ultramark® 1621. Estos compuestos se disolvieron en una mezcla de acetonitrilo, agua

y metanol, y ambas mezclas se infundieron usando una bomba de jeringa Chemyx

Fusion 100 (Thermo Fisher). El control del instrumento y el procesamiento de datos se

llevaron a cabo mediante el software Xcalibur (Thermo Fisher).

Capítulo 3 111

3.2.6 Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

con reflectancia total atenuada (FTIR-ATR)

La adquisición de los espectros se realizó de la misma forma que se describió en la

sección 2.2.7.

3.2.7 Análisis estadístico

Para las matrices de datos obtenidas a partir de las secciones 3.2.2 y 3.2.4 se efectuó

el respectivo análisis ANOVA y la prueba de Tukey para identificar las diferencias entre

cultivares, a un nivel de significación de p <0,05. Dicho análisis se realizó utilizando el

software XLSTAT (Addinsoft, Francia), trabajando en el entorno de Microsoft Excel

(Microsoft, EE.UU).

3.2.8 Análisis de componentes principales (PCA)

Haciendo uso del software MATLAB (The Mathworks, EE.UU.), se llevó a cabo el

procedimiento de análisis de componentes principales. Este método de análisis no

supervisado permitió realizar el análisis de los datos obtenidos para el perfil de

carotenoides y, además, de las variables RGB en el caso del análisis de imagen.

Inicialmente se realizó la determinación del número de componentes óptimos mediante

un gráfico de Scree, donde se tuvieron en cuenta únicamente aquellas componentes

con un valor propio mayor a 1. Una vez seleccionadas las componentes principales,

aquellas que explican la máxima varianza posible, se calculó el PCA, donde se obtuvo

el scoreplot y el loading plot, que permitieron observar patrones o tendencias de

agrupamiento en los cultivares estudiados, así como la contribución de cada variable a

las componentes seleccionadas respectivamente.

3.2.9 Modelado de regresión con mínimos cuadrados parciales

(PLS)

Los modelos de regresión para carotenoides específicos se desarrollaron mediante un

algoritmo de mínimos cuadrados parciales que combina la información espectral,

colorimétrica y de imagen (X) con la información dependiente (Y), es decir, el contenido

de carotenoides determinado por HPLC. Los detalles del procedimiento son similares a

los descritos en la sección 2.2.8



3.3 Resultados y discusión

3.3.1 Contenido de carotenoides específicos por HPLC

Los carotenoides se identificaron comparando el tiempo de retención (RT), los espectros

UV-Vis y la masa exacta (<3 ppm) con los de los estándares auténticos. En este

contexto, inicialmente se determinaron las masas típicas de los estándares de

carotenoides empleados. Los resultados se muestran en la Tabla 3.1

Tabla 3.1 Masas precisas medidas de los carotenoides objetivo por HR-Orbitrap-MS, con indicación de la desviación de masa (en ppm) con respecto a la masa teórica calculada.

Analito Masa medida

(m/z) Masa teórica

(m/z)

Violaxantina

601,4245 601,4251

Anteraxantina

585,4309 585,4302

Luteína

569,4344 569,4353

Zeaxantina

569,4343 569,4353

α-Caroteno

537,4447 537,4454

β-Caroteno 537,4448 537,4454

Cuando se utilizan técnicas de ionización suave, como la ionización química a presión

atmosférica (APCI), que se emplea para ionizar analitos orgánicos térmicamente lábiles

como los carotenoides, generalmente se producen iones sin electrones no apareados y

las especies [M + H]+ resultantes se denominan moléculas protonadas (Steckel &

Schlosser, 2019). Particularmente, cuando se utiliza APCI de iones positivos, como en

esta investigación, dichas moléculas protonadas se forman dependiendo de la

composición del disolvente y, dado que en este caso se empleó un solvente prótico

como metanol, se favoreció la formación de carotenoides protonados en lugar de los

correspondientes iones moleculares (van Breemen et al., 2012). De acuerdo a esto, en

la Tabla 3.1 se presentan las masas de carotenoides protonados, y corresponden a los

picos de mayor relación m/z en los espectros de masas de cada estándar analizado.

Adicionalmente, en la Figura 3.1 se muestran los cromatogramas representativos de

cada cultivar.

Los tiempos de retención de los carotenoides identificados en los cromatogramas

difieren principalmente por el tipo de interacción de los mismos con la fase estacionaria.

Capítulo 3 113

En la fase estacionaria C30, los tiempos de retención son proporcionales a la longitud de

la molécula y la de su cadena de polieno. Pequeñas diferencias en la estructura

molecular dan como resultado diferencias significativas en los tiempos de retención

(Turcsi et al., 2016). No obstante, considerando que la longitud de la cadena carbonada

es igual para todos los carotenoides analizados, se utilizarán otros criterios para explicar

los tiempos de retención.

La fase estacionaria en este caso está constituida por cadenas alquilo de 30 carbonos

que están orientadas de forma paralela unas a otras, lo que da como resultado un mayor

contenido de carbono respecto a otras fases estacionarias como C18 y, por ende, una

mayor retención de los carotenoides (Craft, 2001). En este sentido la polaridad de los

carotenoides juega un papel fundamental en el orden de elución, siendo eluidos de

mayor a menor polaridad; por lo cual, los tiempos de retención serán menores para

alcoholes y mayores para hidrocarburos (Waksmundzka-Hajnos & Sherma, 2010) Lo

anterior se evidencia en los tiempos de retención de la Figura 3.1 donde se observa

para todas las muestras, que primero eluyen las xantófilas (con grupos OH) y por último

los carotenos (que contienen exclusivamente carbono e hidrógeno).

El mecanismo mediante el cual interactúan los carotenoides y la fase estacionaria está

determinado por la estructura de los carotenoides, que pueden contener anillos

aromáticos y cadenas de carbono apolares constituidas por dobles enlaces conjugados.

Por ejemplo, una molécula de luteína contiene grupos hidroxilo polares que podrían ser

responsables de las interacciones de hidrógeno y donor-aceptor con la fase

estacionaria. Los anillos aromáticos condicionan la formación de interacciones π – π,

mientras que las cadenas hidrófobas contribuyen a las interacciones de Van der Waals

(Ligor et al., 2014). Lo mismo se cumple para las demás xantófilas (Violaxantina,

Astaxantina, Zeaxantina). Los carotenos por su parte, al estar constituidos

exclusivamente por cadenas hidrófobas, interactúan mediante fuerzas de Van der Waals

con la fase estacionaria.



Figura 3.1 Cromatogramas característicos de muestras hidrolizadas: (1) cv. Mandarino; (2) cv. Dorado; (3) cv. Abanico 75; (4) cv. Bolo Verde. Los picos señalados corresponden a: A: Anteraxantina; L: Luteína; Z: Zeaxantina; B: β-Caroteno; V: Violaxantina. Los picos señalados como “u” corresponden a compuestos no identificados o desconocidos.

A partir del método de estándar interno, (empleando equinenona como patrón interno)

fue posible calcular la concentración de cada carotenoide. Los resultados obtenidos se

presentan en la Tabla 3.2.

Capítulo 3 115

Tabla 3.2. Composición específica de carotenoides en muestras de Cucurbita

spp.

Cultivar

Concentración (mg/100 g)*

Lut β-Car α-Car Vio Ant Zea Des

MD_1 8,84 3,48 2,14 0 6,2 3,8 2,4

MD_3 8,61 3,97 2,98 0 12,6 3,3 1,7

MD_5 6,51 2,41 1,21 1,21 8,4 2,2 2,2

MD_7 15,05 5,51 1,84 6,24 0,4 1,5 6,2

DO_1 7,00 5,25 0 9,50 0 0 3,3

DO_2 4,97 2,48 0,96 7,64 0 0 3,1

DO_3 6,26 2,83 3,03 5,45 0 0 2,6

DO_4 3,32 3,57 1,60 2,46 0 0 1,4

DO_5 11,1 4,65 4,65 10,74 0 0 4,7

DO_6 4,77 2,45 1,16 2,58 0 0,3 1,7

DO_7 2,57 2,03 0,64 3,85 0 0 1,6

DO_8 10,04 3,89 2,27 11,66 0 0 4,5

BV_1 23,29 6,25 16,47 5,68 0,6 1,7 2,8

BV_2 10,96 4,22 6,18 3,09 0,3 0,8 2,5

BV_3 10,72 2,44 0,38 1,5 0,2 1,3 2,3

BV_4 23,72 5,63 2,01 5,23 0,4 1,2 2

BV_5 5,55 5,74 5,55 1,11 0 0,4 0,2

BV_6 28,29 5,44 11,42 5,98 0 1,1 2,2

AB_1 15,13 4,68 3,85 1,93 0 1,9 0

AB_2 16,64 3,77 2,2 4,71 0 1,6 2,5

AB_3 33,69 8,57 4,57 5,14 0 2,3 2,9

AB_4 18,59 3,65 3,98 2,99 0 1,3 2,7

AB_5 21,84 5,77 4,12 5,36 0 1,6 2,5

AB_6 33,87 8,76 8,76 3,5 0 1,8 1,8

AB_7 12,74 3,28 0 0 14,9 5,1 0,4

X ± σ 13,8±9,0 4,4±1,7 3,7±3,7 4,3±3,1 1,8±4,1 1,3±1,3 2,4±1,3

*Concentración en base seca. X=Promedio; σ=Desviación estándar (n=25); Lut=Luteína;

Car=Caroteno; Vio=Violaxantina; Ant=Anteraxantina; Zea=Zeaxantina; Des=Desconocidos,

MD=Mandarino; DO=Dorado; BV=Bolo verde; AB=Abanico 75.

Los resultados sugieren que el compuesto más abundante en las muestras de ahuyama

es la luteína, seguido de β-caroteno, violaxantina, α-caroteno, y de pequeñas cantidades

de zeaxantina y anteraxantina. Adicionalmente, se encontraron carotenoides cuya

identidad no fue posible determinar; su concentración estimada a través del estándar



interno (equinenona) se encuentra reportada en la Tabla 3.2 como la suma de todas las

concentraciones en la columna correspondiente a “Desconocidos”.

El PCA realizado para los resultados obtenidos (Figura 3.2) indica que el cultivar Dorado

muestra la menor variación intraclase, opuesto a lo que ocurre con los cultivares Abanico

75, Mandarino y Boloverde, que presentan la variación intraclase más alta. Esta

variación intraclase ocurre precisamente debido a la heterogeneidad en composición de

la pulpa de ahuyama, que conduce a tales diferencias en la cuantificación.

El loading plot (Figura 3.3) sugiere que las variables 1, 2 y 3 (Luteína, β-caroteno y α-

caroteno) están correlacionadas de forma positiva, lo cual indica que, si alguno de estos

compuestos presenta un incremento, los demás también aumentarán en la matriz

estudiada. Lo mismo sucede entre las variables 5,6 (anteraxantina y zeaxantina) y 4,7

(violaxantina y “desconocidos”). Por el contrario, se observa una correlación negativa

entre las variables 4,7 y 5,6. Al relacionar el scoreplot con el loading plot se podría decir

que en el cultivar Dorado predominan luteína, β-caroteno, α-caroteno, violaxantina y

“desconocidos” (variables 1,2,3,7 y 4), al igual que en los cultivares Abanico 75 y

Boloverde. En el caso del cultivar Mandarino, las 7 variables están presentes, lo cual es

consistente considerando que este cultivar estaría en todos los cuadrantes del scoreplot.

La composición exacta de carotenoides en la ahuyama varía entre diferentes estudios y

a menudo se relaciona con la especie particular de ahuyama analizada. Así, en algunos

estudios, el β-caroteno es el predominante, mientras que en otros lo es la luteína. En

este caso el carotenoide principal es la luteína, para todas las muestras estudiadas de

Cucurbita spp.; sin embargo, este no es siempre el caso, ya que hay estudios que

revelan diferencias en composición entre las dos especies (C. maxima y C. moschata).

Los resultados obtenidos son similares a los de otros autores que también han trabajado

con ahuyamas de Cucurbita moschata. Por ejemplo, el estudio realizado por (Kulczyński

& Gramza-Michałowska, 2019b) en 6 variedades de esta especie, el perfil de

carotenoides reveló que la molécula más abundante es la luteína, seguida

principalmente de β-caroteno. Del mismo modo, la investigación realizada por

Kulczyński & Gramza-Michałowska (2019a) para 11 variedades de ahuyama mostró que

en la gran mayoría de estas, el carotenoide predominante es la luteína, seguido de

zeaxantina y β-caroteno. En otro estudio realizado en C. moschata por Bergantin et al.

(2018), los resultados indicaron que los principales carotenoides en esta especie son

luteína, β-caroteno y violaxantina, lo cual en general coincide con los resultados

presentados en la Tabla 3.2.

Capítulo 3 117

Figura 3.2 Score plot para carotenoides cuantificados mediante HPLC, donde DO=Dorado, MD=Mandarino, AB=Abanico 75, BV=Bolo verde.

Figura 3.3 Loading plot para carotenoides específicos cuantificados mediante HPLC. V1: luteína; V2: β-caroteno; V3: α-caroteno; V4: violaxantina; V5:

anteraxantina; V6: zeaxantina; V7: “desconocidos”.

En el artículo de Provesi et al. (2011), los autores indican que para C. moschata los

carotenoides principales son el β-caroteno y α-caroteno y para C. maxima los

carotenoides predominantes son luteína y β-caroteno. De igual manera, el trabajo

presentado por Murkovic et al. (2002) para tres especies de ahuyama (C. moschata, C.

maxima, C. pepo), reveló que estos frutos contenían 0-17 mg/100 g de luteína, 0,06-7,4



mg/100 g de β-caroteno y 0-7,5 mg/100 g de α-caroteno. Así mismo, el estudio de Seo

et al. (2005) indica que el carotenoide más abundante en muestras de C. moschata es

el β-caroteno, seguido de pequeñas trazas de α-caroteno, luteína y también compuestos

desconocidos.

3.3.2 Análisis de imagen digital de las ahuyamas y de colorimétría triestímulo de sus pulpas

Se tomaron fotografías digitales de las ahuyamas enteras, las cuales fueron

segmentadas y posteriormente, a través de un algoritmo, se extrajeron los valores RGB

promedio del segmento seleccionado. Los intervalos de variación del RGB promedio

para cada cultivar se muestran en la Tabla 3.3.

Tabla 3.3. Valores RGB para imágenes de Cucurbita spp.

X=Promedio; σ=Desviación estándar; min=mínimo; máx=máximo; n=número de muestras; Las medias en

la misma columna seguidas de una letra distinta indican diferencias estadísticamente significativas (P

<0.05).

Dado que las muestras seleccionadas para esta parte del estudio corresponden a un

subconjunto del conjunto de muestras empleadas en el Capítulo 2, los resultados son

similares a los discutidos en las secciones 2.3.2 y 2.3.3.

El Análisis de varianza revela que no existen diferencias significativas entre los

cultivares Abanico 75 y Boloverde para ninguna de las variables R, G y B. Lo anterior

Origen o cultivar R (X ± σ [mín.-máx.]

(n))

G (X ± σ [mín.-máx.]

(n))

B (X ± σ [mín.-máx.] (n)) Código Descripción


102,792±13,984C [80,172-118,834]

(7)

89,789 ±5,209 C [80,762-96,915]

(7)

68,413 ±6,877B [61,059-80,232]

(7)

MD C. maxima D.

(cv. Mandarino)

191,606±15,323A

[162,565-205,724] (4)

122,614±12,978B

[109,893-146,264] (4)

61,120 ±9,260B [41,552-69,993]

(4)


89,983 ±21,588C [47,101-105,859]

(6)

83,478±19,216C [49,339-105,185]

(6)

60,945±12,484B [45,645-80,590]

(6)

DO C. moschata D.

(cv. Dorado)

166,385 ±6,654B [159,593-74,776]

(8)

141,628±6,922A [132,293-153,428]

(8)

98,379±10,333A

[80,565-116,369] (8)

X ± σ [mín.-máx.] (n)

134,516±43,407 [47,101-205,724]

(25)

109,303±27,266 [49,339-153,428]

(25)

76,013±18,174 [45,645-116,369]

(25)

Capítulo 3 119

implica que los fragmentos de imagen analizados para estos dos cultivares presentan

una coloración similar.

Como se discutió en la sección 2.3.2, las variables predominantes en los cuatro

cultivares son rojo (R) y verde (G), que de acuerdo a la teoría aditiva del espacio de

color RGB, dan como resultado una coloración amarillo-naranja, es decir, el color que

se aprecia subjetivamente en la cáscara. Esta coloración podría estar asociada a la

presencia de compuestos carotenoides, que serían los responsables de impartir

coloración amarilla, además de la pulpa, a la cáscara. En este contexto, de acuerdo a lo

reportado en la literatura, en la cáscara de Cucurbita spp. se encuentran compuestos

como β-caroteno y luteína (Kreck et al., 2006), que absorben la luz en la región azul-

verde y violeta y reflejan colores como amarillo, rojo y naranja.

Utilizando los valores RGB, se realizó un PCA (Figura 3.4) para este conjunto de

muestras, donde se corroboran los resultados obtenidos mediante el ANOVA. Se puede

apreciar que los cultivares Abanico 75 y Boloverde, al no tener diferencias significativas,

se encuentran del mismo lado del score plot, mientras que los demás cultivares, al tener

diferencias significativas están del lado opuesto del gráfico.

Los resultados demuestran que los cultivares Boloverde, Abanico 75 y Mandarino tienen

la menor variación intraclase, mientras que el cultivar Dorado presenta la mayor

variación intraclase, lo cual implica que en este cultivar existe una mayor heterogeneidad

de valores RGB en los fragmentos de imagen analizados con el algoritmo

correspondiente.

Al igual que en la sección 2.3.2, el loading plot (Figura 3.5) revela resultados similares,

siendo la variable “G” la que mayor información aporta a la componente. Por lo anterior,

se infiere que cada pixel de las imágenes obtenidas tiene predominancia de esta

variable.



Figura 3.4. Score plot realizado para valores RGB en muestras de Cucurbita spp.,

donde DO=Dorado, AB=Abanico 75, MD=Mandarino, BV=Bolo verde.

Figura 3.5 Loading plot para valores RGB en muestras de Cucurbita spp., donde V1=R, V2=G, V3=B.

Los resultados obtenidos para el análisis colorimétrico realizado a la pulpa

homogeneizada se muestran en la Tabla 3.4.

Los resultados son muy similares a los de la sección 2.3.3; es decir, se puede observar

que no hay diferencias significativas entre cultivares. La única diferencia significativa se

aprecia en la variable L*, donde el cultivar Dorado presenta un valor superior al de los

Capítulo 3 121

demás cultivares, denotando que la pulpa analizada en este caso es más clara que las

demás. Por su parte, la imagen ilustrativa de color sugiere que el color de la pulpa es

similar entre todas las muestras. Los valores de L*a*b* coinciden con los encontrados

en otros estudios tanto para C. maxima (L= 59,48; a= 26,58; b= 54,45) como C.

moschata (L= ≈ 60; a = ≈ 30; b = ≈ 60) (Gonçalves et al., 2007; Paz et al., 2013). Se

puede apreciar que el valor de b* es superior al de a*, a partir de lo cual se puede inferir

que en los modelos de regresión que se desarrollan más adelante, la variable que tendrá

más peso en los modelos de regresión desarrollados empleando la matriz de valores

triestímulo, será b*.

El valor del matiz en este caso corresponde a amarillo (≈ 60°), mientras que el croma

denota una saturación intermedia (≈ 60). En estudios realizados para ahuyama

Cucurbita moschata del departamento del Cauca se ha encontrado que el matiz oscila

entre 50 y 80, hecho que se traduce en tonos amarillo-naranja que coinciden con el

encontrado en esta investigación (Suarez et al., 2016). En otros estudios colorimétricos

realizados para pulpa de esta misma especie, los autores reportan valores de tono y

cromaticidad cercanos a 60 (F Zaccari et al., 2015), lo cual corrobora que las ahuyamas

de C. moschata tienen un matiz y saturación característicos. De esta manera, el matiz

amarillo está asociado a altos contenidos de luteína (valor promedio obtenido = 13,8

mg/100g), que sería el carotenoide responsable de tal característica; esto teniendo en

cuenta que la luteína puede absorber luz azul, y por lo tanto refleja el color amarillo

(Khoo et al., 2011).

Por otro lado, en ahuyamas híbrido (C. maxima x C. moschata) se han encontrado

valores tanto de matiz como cromaticidad de entre 60 y 70 (Fernanda Zaccari et al.,

2015). De igual manera, en ahuyamas C. maxima se han encontrado valores de croma

alrededor de 60 y de matiz menores a 90° (Gonçalves et al., 2007). La similitud en estos

valores para C. maxima y C. moschata es consistente con lo encontrado en esta

investigación, ya que el cultivar Mandarino (C. maxima) y los demás cultivares (C.

moschata) comparten valores semejantes de Croma y matiz.



Tabla 3.4. Coordenadas L*a*b* para las muestras de ahuyama

Origen o cultivar L (claridad)

(X ± σ [mín. – máx.] (n))

a*

(X ± σ [mín. – máx.] (n))

b*

(X ± σ [mín. – máx.] (n))

C (Croma)

(X ± σ [mín. – máx.] (n))

Matiz (Tono)

(X ± σ [mín. – máx.] (n))

Imagen ilustrativa de

valor promedio de color* Código Descripción


62,554±3,729B [55,303-67,370]

(7)

27,572±1,888A [24,290-29,707]

(7)

56,808±5,722 A [45,993-64,687]

(7)

63,223±4,993 A [53,094-69,097]

(7)

63,936±3,047 A [60,027-69,421]

(7)

MD C. maxima D.

(cv. Mandarino)

64,162±2,822B [60,457-67,047]

(4)

26,412±1,436A [25,093-28,453]

(4)

55,263±1,732 A [52,840-56,890]

(4)

61,275±1,029 A [60,014-62,534]

(4)

64,434±1,881 A [61,698-65,839]

(4)


61,760±4,395B [55,877-65,923]

(6)

27,645±2,567A [23,910-31,260]

(6)

54,662±7,627 A [43,343-64,217]

(6)

61,378±6,858 A [50,685-70,344]

(6)

62,872±3,966 A [58,772-67,945]

(6)

DO C. moschata D.

(cv. Dorado)

71,090±2,849A [67,657-76,140]

(8)

27,682±2,707A [21,630-30,357]

(8)

58,409±3,228 A [53,343-62,360]

(8)

64,709±2,786 A [59,801-69,305]

(8)

64,593±2,795 A [62,170-70,873]

(8)

*Color converter (Nix Sensor, Estados Unidos) disponible en: https://www.nixsensor.com/free-color-converter/

X=promedio; σ=desviación estandar; n=numero de muestras; Las medias en la misma columna seguidas de una letra distinta indican

diferencias estadísticamente significativas (P <0.05).

https://www.nixsensor.com/free-color-converter/

3.3.3 Análisis espectral IR

La Figura 3.6 (A) muestra el espectro característico de la pulpa fresca del conjunto de

muestras de los cultivares Mandarino, Boloverde, Dorado y Abanico 75, seleccionadas

para esta parte del estudio. Los espectros obtenidos presentan las mismas frecuencias

características de los espectros descritos en la sección 2.3.4, sin embargo, aquí se

explicarán brevemente las bandas típicas tanto de la muestra fresca como liofilizada.

Considerando que en el análisis por HPLC los compuestos más abundantes fueron la

luteína y β-caroteno, los espectros se describirán en base a estas dos moléculas.

El pico alrededor de 1550-1600 cm-1 correspondería a vibraciones de estiramiento de

dobles enlaces C=C en la cadena de polieno. La región de aproximadamente 450 cm–1

estaría asociada a vibraciones de deformación antisimétrica de los grupos CH3 (cambio en

los ángulos HCH) y grupos CH2 (vibraciones de tijera). De la misma manera, las bandas

de intensidad débil-media ubicadas alrededor de 1360-1390 cm–1 estarían formadas por

las vibraciones tipo “sombrilla” de los grupos CH3. El pico más intenso del espectro,

ubicado entre 950-980 cm-1 correspondería a las vibraciones de deformación de los

enlaces C-H en la cadena de polieno. Por otro lado, la banda ubicada a aproximadamente

520-530 cm-1 estaría asociada con el cambio en los ángulos y la deformación de la cadena

de polieno (Berezin & Nechaev, 2005; Schlücker et al., 2003). También es posible

encontrar una banda alrededor de 1100 cm-1 que correspondería al estiramiento C-O de

alcoholes; banda que probablemente surge de xantófilas (que contienen grupos -OH) como

la luteína (Prabhu et al., 2015) o de otros compuestos bioactivos con grupos alcohol que

hacen parte de la composición química de la pulpa de Cucurbita spp. (Kulczyński &

Gramza-Michałowska, 2019a, 2019b).

En los espectros de la pulpa liofilizada que se muestran en la Figura 3.6 (B), se puede ver

que el pico amplio por encima de 3000 cm-1 corresponde a la absorción de los grupos OH

de la molécula de agua. También es posible apreciar las mismas bandas características

de los espectros de la pulpa fresca, dentro de las cuales se destacan bandas a frecuencias

como 2926 cm-1 que corresponde a la oscilación de grupos con enlaces C-H, 1550 cm-1,

asociada a dobles enlaces de la cadena de polieno, y la banda típica del β-caroteno, que

se ubica alrededor de 968 cm-1 (De Nardo et al., 2009).

124 Evaluación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría y análisis de

imagen como herramientas para la determinación de carotenoides en

ahuyama

Figura 3.6 Espectros característicos de FTIR-ATR de las muestras de Cucurbita spp. (n = 25) de las variedades Mandarino, Boloverde, Dorado y Abanico 75, con diferentes protocolos de procesamiento de muestras: (A) pulpa fresca (licuadora-homogeneizada); (B) pulpa liofilizada.


específicos por datos espectrales IR

Teniendo en cuenta las regiones de absorción IR típicas para compuestos carotenoides,

se probaron diferentes rangos espectrales (920-3000 cm-1, 1300-3000 cm-1 y 450-4000 cm-

1) para determinar con cual era posible predecir los principales compuestos carotenoides

(luteína, β-caroteno, α-caroteno y violaxantina) mediante la correlación del contenido de

carotenoides (HPLC) en base seca con las absorbancias de estos rangos espectrales.

Se utilizaron diferentes métodos de preprocesamiento para transformar los espectros y así

eliminar el ruido y las señales interferentes. El proceso de validación cruzada permitió

determinar el número óptimo de factores y luego se realizó una validación externa para

evaluar la predictividad del modelo. En este contexto, se desarrollaron modelos para

muestras de pulpa fresca (A) y pulpa liofilizada (B). Los modelos con el mejor rendimiento

se eligieron en función de los parámetros estadísticos RMSEC, RMSEP y R2 (Tablas

3.5,3.6,3.7,3.8).

Capítulo 3 125

Tabla 3.5. Modelos de regresión PLS desarrollados para la luteína mediante datos

IR


Rango espectral

(cm-1) LV

TCC rango de variación (mg/100 g)



PRED RMSEP

Pulpa fresca 920-3000 7 4,77 33,69 9,74

0,96 1,71 0,75 6,70

Pulpa liofilizada

920-3000 4 0,89 2,96 0,94 5,96

Tabla 3.6. Modelos de regresión PLS desarrollados para el β-caroteno mediante

datos IR


Rango espectral

(cm-1) LV




PRED RMSEP

Pulpa fresca 920-3000 5 2,44 8,57 1,97

0,86 0,62 0,99 0,56

Pulpa liofilizada

920-3000 6 0,92 0,50 0,99 1,56

Tabla 3.7. Modelos de regresión PLS desarrollados para el α-caroteno mediante

datos IR


Rango espectral

(cm-1) LV

TCC rango de variación (mg/100g)



PRED RMSEP

Pulpa fresca 1300-3000 8 0,38 11,42 3,52

0,97 0,64 1,00 1,40

Pulpa liofilizada 1300-3000 7 0,99 0,48 0,86 0,90

Tabla 3.8. Modelos de regresión PLS desarrollados para la violaxantina mediante

datos IR


Rango espectral

(cm-1) LV

TCC rango de variación (mg/100

g)



PRED RMSEP

Pulpa fresca 450-4000 5 0 10,74 3,32

0,91 1,02 0,72 1,60




ahuyama

La Tabla 3.5 muestra los resultados para las muestras frescas y liofilizadas en el caso de

predicción de luteína. El valor bajo de R2PRED sugiere que los espectros de infrarrojo de las

muestras frescas no representan la matriz ideal para desarrollar un modelo de regresión

PLS, lo que podría estar relacionado con el alto contenido de agua en las muestras, que

atenúa la absorbancia de los carotenoides. En el caso de las muestras liofilizadas, los

valores mejoran considerablemente, un hecho que puede estar influenciado por la

eliminación de agua de las muestras durante el proceso de liofilización, que permite

concentrar los nutrientes (carotenoides) en las especies de Cucurbita estudiadas. Los

resultados muestran que el modelo obtenido para la predicción del contenido de luteína

empleando la información espectral FTIR-ATR de la pulpa liofilizada es confiable, con una

alta bondad de ajuste para calibración (R2=0,89), validación cruzada (R2=0,74) y predicción

(R2=0,94). El modelo posee la capacidad de predecir la concentración de luteina y se

considera estable cuando se pasa del conjunto de calibración/entrenamiento al conjunto

de predicción/validación.

De acuerdo a la teoría propuesta por Shenk & Westerhaus (1996), los valores de RMSEP

no deben exceder el doble del error estándar de laboratorio (SEL) para que el modelo

pueda ser implementado. En este contexto, el valor de RMSEP (5,96 mg/100 g) no excede

el doble del SEL (2 x SEL = 7,67 mg/100 g) y, por ende, está dentro del límite de

confiabilidad para su implementación.

En cuanto a la predicción de los carotenoides restantes, aunque los coeficientes de

calibración y predicción son bastante altos para ambos tipos de muestras (frescas y

liofilizadas), los resultados de la validación cruzada son bastante bajos, por lo cual, los

modelos no son lo suficientemente confiables. Por ejemplo, el modelo del β-caroteno para

muestras liofilizadas posee valores altos de R2CAL y R2

PRED (0,92 y 0,99 respectivamente),

pero un bajo valor de R2 de validación cruzada (0,46). El modelo de α-caroteno para



pero un bajo coeficiente R2 de validación cruzada (0,31). El modelo de violaxantina para



pero un bajo coeficiente de validación cruzada (0,42). De esta manera, se podría inferir

que cuando no se realiza un procedimiento de validación cruzada adecuado, esto podría

Capítulo 3 127

conducir a una estimación incorrecta del número de variables latentes y maximizar el error

RMSEP.

De todos estos compuestos, la luteína fue la única que se detectó por HPLC en las 25

muestras analizadas, mientras que los otros carotenoides estuvieron parcialmente

presentes (algunos en solo unas pocas muestras). Este hecho podría influir en la eficiencia

de los modelos realizados, ya que, si un gran conjunto de muestras no contiene el

compuesto carotenoide, la matriz (Y) utilizada para predecir el modelo pierde robustez,

afectando simultaneamente los valores de R2CAL, R

2CV y R2

PRED.


por datos espectrales IR y análisis colorimétrico

Con el propósito de evaluar si los modelos previamente realizados con solo datos

espectrales IR y valores de referencia de HPLC mejoraban, los modelos para la luteína, β-

caroteno, α-caroteno y violaxantina se desarrollaron nuevamente, pero esta vez

combinando los datos espectrales IR con valores triestímulo L*a*b* obtenidos a partir de

los análisis colorimétricos. Las coordenadas de color L*a*b* se consideraron juntas como

variables predictoras debido a la naturaleza tridimensional del color (Ruiz et al., 2008).

El procedimiento realizado es esencialmente el mismo; se probaron las absorbancias de

diferentes rangos espectrales (450-4000 cm-1, 920-3000 cm-1 y 1300-3000 cm-1)

combinadas con los datos de color para ver cuál conjunto de datos conducía al mejor

rendimiento estadístico, y luego se aplicó validación cruzada para estimar el número de

componentes óptimos. Finalmente, se llevó a cabo la validación externa y el rendimiento

del modelo se evaluó mediante los valores de RMSEC, RMSEP, R2CAL y R2

PRED. Se

desarrollaron múltiples modelos, sin embargo, solo se discuten aquellos con el mejor

rendimiento en esta sección.



ahuyama

Tabla 3.9. Modelos de regresión PLS desarrollados para la luteína mediante IR y

datos de color


Rango espectral

(cm-1) LV


g)



PRED RMSEP

Pulpa fresca 1300-3000 4 4,77 33,69 9,74

0,96 1,18 0,97 2,02


Tabla 3.10. Modelos de regresión PLS desarrollados para el β-caroteno mediante IR

y datos de color


Rango espectral

(cm-1) LV




PRED RMSEP

Pulpa fresca 450-4000 3 2,44 8,57 1,97

0,90 0,43 0,96 0,53


Tabla 3.11. Modelos de regresión PLS desarrollados para el α-caroteno mediante IR

y datos de color


Rango espectral

(cm-1) LV


g)



PRED RMSEP

Pulpa fresca 920-3000 6 0,38 11,42 3,52

0,93 0,61 0,82 2,3


Los resultados obtenidos para la luteína (muestra liofilizada) sugieren que la combinación

de datos espectrales IR con datos de color realmente mejora el rendimiento del modelo

PLS. Esto se puede evidenciar en los valores de R2CAL (0,99) y R2

PRED (0,92), que indican

que el modelo es estable cuando se pasa del conjunto de calibración al conjunto de

predicción. En este caso, el valor de RMSEP (2,15 mg/100 g) no supera el doble del error

estándar de laboratorio (7,67 mg/100 g) y, por lo tanto, puede ser utilizado para su

implementación real (Shenk & Westerhaus, 1996)

Capítulo 3 129

En general, a mayor concentración en las muestras de ahuyama, mayor valor de R2,

aunque las diferencias en estos valores de R2 sean pequeñas. De hecho, los carotenoides

predominantes fueron luteína (13,8 mg/100 g) y β-caroteno (4,4 mg/100 g) y presentaron

valores altos de R2PRED (0,92 y 0,91, respectivamente), mientras que violaxantina y α-

caroteno presentaron valores de R2PRED <0,25. Teniendo en cuenta los bajos resultados

obtenidos para la violaxantina, dichos modelos no se discutirán en este manuscrito.

Los valores de R2 para la luteína y el β-caroteno podrían sugerir que estos carotenoides

juegan un papel importante en las muestras de Cucurbita spp. estudiadas, indicando que

el color de los diferentes cultivares utilizados en esta investigación se atribuye

principalmente a estos compuestos, lo que confirma la relación existente entre una alta

concentración de carotenoides, un R2 más alto y, por ende, una alta contribución del

carotenoide al color de la muestra. En cuanto a la contribución de cada variable predictora

(L*a*b*) a los modelos desarrollados, b* (amarillez) debería ser considerado como el

parámetro con mayor peso, lo cual es consistente con la apariencia de las muestras de

ahuyama y con la predominancia de luteína, que imparte coloración amarilla a las muestras

estudiadas (Kurz et al., 2008).

En suma, respecto al uso de los datos de FTIR-ATR solos, al combinar los datos de FTIR-

ATR de las muestras liofilizadas con los datos de colorimetría triestímulo de las pulpas, se

mejoró el modelo de predicción para el contenido de luteína (disminución del error de

predicción) y se logró obtener un modelo confiable para la predicción del contenido de β-

caroteno (aumento del coefiente de correlación y disminución del error de prediccción).


mediante datos espectrales IR y datos de análisis de imagen

A continuación se probó el desarrollo de modelos PLS con la combinación de los datos

FTIR-ATR con las coordenadas RGB obtenidas a partir del análisis de imagen de las

ahuyamas. En este caso, se probaron los mismos tres rangos espectrales y se utilizaron

varias técnicas de preprocesamiento. En las Tablas 3.12-3.15 se presentan los resultados

de los modelos con los mejores coeficientes estadísticos para la predicción del contenido

de luteína, β-caroteno, α-caroteno y violaxantina.



ahuyama

Tabla 3.12. Modelos de regresión PLS desarrollados para la luteína mediante IR y

datos de imagen RGB


Rango espectral

(cm-1) LV


g)



PRED RMSEP

Pulpa fresca 920-3000 1 4,77 28,29 8,65

0,78 4,88 0,81 9,01


Tabla 3.13. Modelos de regresión PLS desarrollados para el β-caroteno mediante IR

y datos de imagen RGB


Rango espectral

(cm-1) LV


g)



PRED RMSEP

Pulpa fresca 1300-3000 7 2,44 6,25 1,46

0,96 0,41 0,01 3,25


Tabla 3.14. Modelos de regresión PLS desarrollados para el α-caroteno mediante IR

y datos de imagen RGB


Rango espectral

(cm-1) LV




PRED RMSEP

Pulpa fresca 450-4000 1 0,38 8,76 2,84

0,48 3,1 0,02 3,37


Tabla 3.15. Modelos de regresión PLS desarrollados para la violaxantina mediante

IR y datos de imagen RGB


Rango espectral

(cm-1) LV




PRED RMSEP

Pulpa fresca 450-4000 6

0 9,5 3,14

0,89 1,14 0,11 5,91

Pulpa liofilizada

920-3000 1 0,71 3,94 0,88 3,37

Capítulo 3 131

El espacio de color empleado (RGB) se considera rápido y ventajoso en el sentido de que

para CIE Lab es necesario aplicar fórmulas de transformación para convertir datos RGB

en dicho espacio (Fofi & Mériaudeau, 2007).

En este caso, con excepción de la violaxantina, se cumple de nuevo la afirmación de que,

cuanto mayor es la concentración del compuesto carotenoide en las muestras de

Cucurbita, mayor es la capacidad predictiva del modelo. En general, seleccionar

demasiadas variables latentes indica un modelo sobreajustado que no solo describe la

información de los datos sino también el ruido, mientras que elegir muy pocas LV implica

un modelo mal ajustado que incorpora información insuficiente de los datos. En este

contexto, los dos mejores modelos obtenidos (muestra fresca para luteína y muestra

liofilizada para violaxantina) poseen solo una variable latente, hecho que podría denotar

un problema de “under-fitting” o sub ajuste, donde el modelo no es lo suficientemente

grande como para capturar la variabilidad en los datos. (Deng et al., 2015; Gowen et al.,

2011; Granato & Ares, 2014). Además, los coeficientes de determinación para la validación

cruzada son muy bajos para estos dos compuestos, un hecho que corrobora que la

estimación de los factores óptimos de los modelos no es confiable y, por lo tanto, la

estimación de la capacidad predictiva del modelo tampoco lo es. Tales resultados

indicarían que los datos RGB probablemente no sean predictores adecuados de

carotenoides específicos cuando se usan en conjunto con absorbancias del infrarrojo.

3.4 Conclusión

Los resultados obtenidos por HPLC muestran que la luteina es el carotenoide

predominante en las muestras de ahuyama colombiana de los cultivares analizados,

seguida por el β-caroteno, violaxantina, α-caroteno, zeaxantina y anteraxantina. De todos

los carotenoides estudiados, únicamente luteína y β-caroteno se encontraron en todas

muestras de Cucurbita spp. analizadas, y por lo tanto dieron lugar a las matrices más

robustas para el desarrollo de modelos de predicción multivariado a partir de datos de

análisis espectroscópicos.

En cuanto al desarrollo de modelos por medio de PLS para la predicción del contenido de

carotenoides específicos, los resultados indicaron que, al utilizar exclusivamente las

absorbancias del infrarrojo como matriz predictora, solo es posible predecir con precisión



ahuyama

el contenido de luteína, mientras que para los demas carotenoides no es posible, teniendo

en cuenta los bajos coeficientes de determinación para el procedimiento de validación

cruzada, que denotan una pobre estimación de la dimensionalidad del modelo, y por ende

afecta la capacidad predictiva. Al modificar la matriz predictora e incluir esta vez los datos

de infrarrojo con los datos de color (L*a*b*), se logró una mejora en los resultados

obtenidos para la luteina y β-caroteno, obteniendo altos coeficientes de determinación

tanto en calibración, validación cruzada y predicción (R2PRED>0.9) y valores bajos de error

asociados a la predicción, hecho que denota que los datos de color permiten mejorar el

rendimiento de los modelos de regresión. Finalmente, al modificar la matriz predictora e

incluir datos de infrarrojo con datos de imagen RGB, los modelos no mejoraron, con

problemas de under-fitting y validación cruzada, lo cual sugiere que la combinación de

datos RGB alteran negativamente la capacidad predictiva de los modelos PLS.

De acuerdo con estos resultados el perfil de carotenoides de la pulpa está relacionado con

su espectro de absorbancia en el infrarrojo medio y con el color de la pulpa, pero no con

el color de su cáscara. Algunas posibles estrategias para mejorar el rendimiento de los

modelos son: incluir un mayor número de muestras en el set de calibración y modificar el

preprocesamiento de la matriz de datos predictora (X), de modo que se reduzca la

información irrelevante en los datos.

Sin embargo, teniendo en cuenta los resultados y dado que lo que se busca es realizar los

modelos con la menor complejidad posible, es posible concluir que basta con emplear la

información de infrarrojo y colorimetría triestímulo para predecir con precisión el contenido

de los principales carotenoides (luteína y β-caroteno).

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ahuyama

4. Conclusiones generales y trabajo futuro

El presente trabajo fue desarrollado con el objetivo de explorar técnicas novedosas

aplicadas al análisis cuantitativo de compuestos carotenoides en muestras de ahuyama

colombiana, y así generar modelos de regresión que en un futuro puedan ser aplicados

para predecir esta clase de compuestos bioactivos, sin necesidad de recurrir a las técnicas

convencionales que se suelen emplear para dicho análisis, como el HPLC y la

espectroscopía UV-Vis.

En este contexto, el estudio espectroscópico con FTIR-ATR permitió realizar la

caracterización de las muestras de ahuyama, revelando bandas características (960.1,

1550, 1360 cm-1) asociadas a compuestos como β-caroteno y luteína, regiones espectrales

que se emplearon en los modelos de calibración. Por su parte, de los resultados obtenidos

con colorimetría triestímulo cabe resaltar que los cultivares estudiados presentan

características distintivas como: 1) valores positivos de coordenadas a y b, asociados a un

matiz amarillo-naranja en la pulpa, y 2) una gran variabilidad en el croma, que refleja las

diferencias en composición de carotenoides. Finalmente, el estudio de las imágenes de

cada cultivar permitió encontrar que las variables R y G son las que más contribuyen al

color de la cáscara, dando como resultado un color amarillo, característico de la

apreciación subjetiva de la superficie.

La determinación de carotenoides totales permitió determinar que existe una gran

variabilidad en la concentración de estos compuestos (155.8 – 2137.3 µg/g en base seca),

garantizando una representación robusta de todos los cultivares en los modelos de

regresión desarrollados. De estos resultados cabe mencionar que, la ahuyama de origen

Mariquita (Tolima) es la que presenta el mayor contenido de carotenoides totales, con

valores incluso por encima de los reportados para otras ahuyamas colombianas, mientras

que el cultivar Dorado proveniente del Valle del Cauca es el que posee el menor contenido

de carotenoides.



ahuyama

Por su parte, el análisis del perfil de carotenoides reveló que los carotenoides

predominantes en las ahuyamas colombianas de los cultivares analizados son luteína y β-

caroteno, seguidos de violaxantina y α-caroteno. Así, los rangos encontrados para el

cultivar Mandarino, Dorado, Bolo Verde y Abanico 75 respectivamente son: luteína (6.51-

15.05), (2.57-11.1), (5.55-28.29), (12.74-33.87); β-Caroteno (2.41-5.51), (2.03-5.25), (2.44-

6.25), (3.28-8.76); violaxantina (0-6.24), (2.46-11.66), (1.11-5.98), (0-5.36) y α-Caroteno

(1.21-2.98), (0-4.65), (0.38-16.47), (0-8.76) mg/100 g, base seca.

Fue posible desarrollar modelos de regresión mediante algoritmo de mínimos cuadrados

parciales (PLS), empleando 920-300 cm-1 y 1300-300 cm-1 como rangos espectrales para

muestras de ahuyama, y haciendo una correlación entre datos espectroscópicos,

colorimétricos y de imagen con los datos composicionales. Los resultados sugieren que,

al emplear espectros de absorbancias de FTIR-ATR de las pulpas liofilizadas como matriz

predictora en el caso de carotenoides totales, es posible lograr una alta capacidad

predictiva del modelo, hecho que se refleja en una alta bondad de ajuste (R2PRED= 0.93).

Estos modelos no mejoran sustancialmente cuando se combina la información proveniente

de análisis colorimétricos de la pulpa o de la imagen de la ahuyama. De esta manera se

puede concluir que, para predecir el contenido de carotenoides totales en muestras de

ahuyama, sería necesario liofilizar la muestra y trabajar únicamente con las absorbancias

del infrarrojo, sin la necesidad de recurrir al uso de colorimetría triestímulo o adquisición

de imágenes.

Finalmente, en el caso de carotenoides específicos, los resultados indican que, al combinar

absorbancias de infrarrojo con datos de color (L*a*b*) en la matriz predictora, se obtienen

altos coeficientes de determinación tanto en calibración, validación cruzada y predicción,

así como bajos valores de error asociado a la predicción, para luteina y β-caroteno, los

carotenoides más abundantes en las muestras de ahuyama.

Con este estudio exploratorio se confirma que la espectroscopía infrarroja y la colorimetría

son herramientas potenciales para la determinación del perfil de los principales

carotenoides, creando modelos que pueden ser utilizados más adelante para la prediccion

de estos compuestos bioactivos, sin la necesidad de utilizar las complejas técnicas

convencionales.

Conclusiones generales y trabajo futuro 139

Como investigación futura sería interesante descubrir si los modelos de regresión

propuestos se pueden validar empleando un set de muestras completamente diferentes a

las seleccionadas, como ahuyamas de otra ubicación geográfica en el país. Así mismo, se

podría probar si el procedimiento realizado para la predicción de carotenoides, puede ser

empleado en la predicción de otros compuestos bioactivos, y así contribuir a la

caracterización de la ahuyama en Colombia, cuya información es aún incipiente.



ahuyama

Contribuciones científicas

Publicaciones científicas

Quijano-Ortega, N., Fuenmayor, C.A, Zuluaga-Dominguez, C., Díaz-Moreno, C., Ortíz-

Grisales, S., García-Mahecha, M., Grassi, S. (2020). FTIR-ATR Spectroscopy Combined

with Multivariate Regression Modeling as a preliminary Approach for Carotenoids

Determination in Cucurbita Spp. Applied Sciences, 10(11),3722.

DOI: 10.3390/app10113722

Participación en eventos científicos

Quijano-Ortega, N., Fuenmayor, C.A, Zuluaga-Dominguez, C., Díaz-Moreno, C., Ortíz-

Grisales, S., García-Mahecha, M., Grassi, S. (2019). FTIR-ATR spectroscopy combined

with multivariate regression modelling as an approach for carotenoids determination in

pumpkin samples. Presentación en modalidad de poster en el 2nd Food Chemistry

Conference realizado en la ciudad de Sevilla, España. 17-19 de septiembre.

Documents

Evaluación de espectroscopía FTIR-ATR, colorimetría