Eukariotske karakteristike izoleucil-tRNA-sintetaze iz bakterije … · vii 2.2.2. Metode rada s proteinima 33 2.2.3. Kinetičke metode 36 2.2.4. Testiranje osjetljivosti na antibiotik

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Mirna Biluš

Eukariotske karakteristike izoleucil-tRNA-sintetaze iz bakterije Streptomyces griseus

Diplomski rad

Zagreb, 2013.

ii

Ovaj rad, izrađen na Zavodu za biokemiju Kemijskog odsjeka pod neposrednim vodstvom dr. sc. Morane Dulić i mentorstvom prof. dr. sc. Ite Gruić Sovulj, predan je na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra molekularne biologije.

iii

ZAHVALE

Najiskrenije zahvaljujem mentorici prof. dr. sc. Iti Gruić Sovulj na ukazanom povjerenju,

brojnim savjetima, uloženom trudu i velikoj podršci za vrijeme izrade ovog rada.

Neizmjerno sam zahvalna dr. sc. Morani Dulić na vodstvu u eksperimentalnom radu, velikom

strpljenju, mnogobrojnim korisnim savjetima, prijateljskoj atmosferi u zajedničkom radu i

podršci u pisanju rada.

Hvala svim članovima Zavoda za biokemiju na vrlo ugodnoj atmosferi te savjetima i pomoći u

eksperimentalnom radu.

Hvala mojoj obitelji na razumijevanju i pruženoj podršci tijekom studija.

iv

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek Diplomski rad

Eukariotske karakteristike izoleucil-tRNA-sintetaze iz bakterije Streptomyces griseus

Mirna Biluš

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb

Izoleucil-tRNA-sintetaze (IleRS) su enzimi koji kataliziraju nastajanje Ile-tRNAIle. Eukarioti posjeduju IleRS koja se po svojoj primarnoj strukturi, osjetljivosti na antibiotik mupirocin i supstratnoj specifičnosti razlikuje od prokariotskih homologa. Mupirocin snažno inhibira IleRS brojnih bakterija, ali ne i eukariota. Međutim, postoje prokariotske vrste, među njima Streptomyces griseus, čiji se aminokiselinski sljedovi IleRS sravnjuju s eukariotskim. Gen za IleRS iz S. griseus ukloniran je u ekspresijski vektor i eksprimiran u bakteriji Escherichia coli. Funkcionalan protein pročišćen je afinitetnom kromatografijom. Kinetička karakterizacija pokazala je da IleRS iz S. griseus heterologno aminoacilira kvaščevu i E. coli tRNA. Budući da prokariotski tip IleRS (E. coli IleRS) ne aminoacilira kvaščevu tRNAIle, rezultati upućuju da IleRS iz S. griseus nalikuje kvaščevom homologu koji aminoacilira E. coli tRNA. Difuzijski test je pokazao neosjetljivost IleRS iz S. griseus na mupirocin i time ga grupirao s eukariotskim IleRS. Također, pokazano je da IleRS iz S. griseus omogućuje rast E. coli u prisutnosti mupirocina.

(68 stranica, 32 slike, 8 tablica, 41 literaturni navod, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici.

Ključne riječi: aminoacil-tRNA-sintetaze, elementi identiteta, komplementacija mupirocin, tRNA

Voditelj: Dr. sc. Ita Gruić Sovulj, izv. prof.

Ocjenitelji: Dr. sc. Ita Gruić Sovulj, izv. prof.

Dr. sc. Ivana Ivančić Baće, doc.

Dr. sc. Željka Vidaković-Cifrek, izv. prof.

Rad prihvaćen: 17.09.2013.

v

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Department of Biology Graduation Thesis

Eukaryotic features of isoleucyl-tRNA synthetase from bacteria Streptomyces griseus

Mirna Biluš

Roosevelt square 6, 10000 Zagreb

Isoleucyl-tRNA synthetases (IleRS) catalyze the formation of Ile-tRNAIle. Eukaryotic IleRSs differ from prokaryotic homologues by primary structures, resistance to antibiotic mupirocin and substrate specificity. Mupirocin strongly inhibits IleRS from numerous bacteria, however it does not affect eukaryotes. However, IleRS from some prokaryotes, including Streptomyces griseus, align with the eukaryotic enzymes. The gene for IleRS from S. griseus was cloned and expressed in Escherichia coli. The protein was purified by affinity chromatography. Kinetic characterization established the ability of S. griseus IleRS to heterologously aminoacylate yeast and E. coli tRNAs. As prokaryotic IleRS (E. coli IleRS) does not aminoacylate yeast tRNAIle, the results indicate that S. griseus IleRS resembles the yeast homologue which aminoacylates E. coli tRNA. Diffusion tests showed that like the eukaryotic homologue from yeast, S. griseus IleRS is resistant to mupirocin. Additionally, S. griseus IleRS was able to complement the growth of E. coli in the presence of mupirocin.

(68 pages, including 32 figures, 8 tables, 41 references, original in Croatian)

Thesis deposited in the Central Biological Library

Key words: Aminoacyl-tRNA synthetases, complementation, identity elements, mupirocin, tRNA

Supervisor: Dr. sc. Ita Gruić Sovulj, Assoc. Prof.

Reviewers: Dr. sc. Ita Gruić Sovulj, Assoc. Prof.

Dr. sc. Ivana Ivančić Baće, Asst. Prof.

Dr. sc. Željka Vidaković-Cifrek, Assoc. Prof.

Thesis accepted: 17.09.2013.

vi

SADRŽAJ

1. Uvod ................................................................................................................................... 1

1.1. Biosinteza proteina ...................................................................................................... 1

1.2. Transfer RNA .............................................................................................................. 3

1.2.1. tRNAIle .................................................................................................................. 7

1.3. Aminoacil-tRNA-sintetaze ........................................................................................ 11

1.3.1. Izoleucil-tRNA-sintetaza .................................................................................... 15

1.4. Streptomyces griseus ................................................................................................. 20

1.5. Cilj istraživanja .......................................................................................................... 21

2. Materijal i metode ........................................................................................................... 22

2.1. Materijali ................................................................................................................... 22

2.1.1. Standardne kemikalije ........................................................................................ 22

2.1.2. Aminokiseline i nukleotidi ................................................................................. 22

2.1.3. Boje .................................................................................................................... 22

2.1.4. Markeri veličine ................................................................................................. 22

2.1.5. Enzimi, proteini i nukleinske kiseline ................................................................ 23

2.1.6. Početnice ............................................................................................................ 23

2.1.7. Komercijalni kompleti za pročišćavanje DNA .................................................. 23

2.1.8. Hranjive podloge i medij za uzgoj bakterije E. coli i S. griseus ........................ 23

2.1.9. Hranjive podloge i medij za uzgoj kvasca S. cerevisiae .................................... 23

2.1.10. Sojevi i plazmidi E. coli ................................................................................. 24

2.1.11. Soj S. cerevisiae .............................................................................................. 25

2.1.12. Soj S. griseus .................................................................................................. 25

2.1.13. Ostali materijal ............................................................................................... 25

2.2. Metode ....................................................................................................................... 26

2.2.1. Metode rada s nukleinskim kiselinama .............................................................. 26

vii

2.2.2. Metode rada s proteinima ................................................................................... 33

2.2.3. Kinetičke metode ................................................................................................ 36

2.2.4. Testiranje osjetljivosti na antibiotik mupirocin .................................................. 39

3. Rezultati ........................................................................................................................... 40

3.1. Kloniranje gena za IleRS iz bakterije S. griseus ....................................................... 40

3.1.1. PCR .................................................................................................................... 40

3.1.2. Ligacija ............................................................................................................... 41

3.1.3. Provjera ugradnje inserta u ekspresijski vektor .................................................. 42

3.2. Prekomjerna ekspresija IleRS iz S. griseus u stanicama E. coli ................................ 43

3.2.1. Pročišćavanje, koncentriranje i dijaliza SgIleRS ............................................... 44

3.3. Aktivacija aminokiseline mjerena ATP/[32P]PPi izmjenom ..................................... 45

3.4. Određivanje akceptorske aktivnosti tRNA ................................................................ 48

3.5. Aminoaciliranje uz [14C]aminokiselinu ..................................................................... 49

3.5.1. Aminoaciliranje s IleRS iz E. coli ...................................................................... 50

3.5.2. Aminoaciliranje s IleRS iz S. cerevisiae ............................................................ 51

3.5.3. Aminoaciliranje s IleRS iz S. griseus ................................................................. 51

3.6. Difuzijski test osjetljivosti na antibiotik mupirocin .................................................. 52

3.7. Test komplementacije ................................................................................................ 55

4. Rasprava .......................................................................................................................... 57

5. Zaključak ......................................................................................................................... 63

6. Literatura ......................................................................................................................... 64

viii

POPIS KRATICA I SIMBOLA

Popis aminokiselina

Simbol Aminokiselina

Ala (A) Alanin

Cys (C) Cistein

Asp (D) Asparaginska kiselina

Glu (E) Glutaminska kiselina

Phe (F) Fenilalanin

Gly (G) Glicin

His (H) Histidin

Ile (I) Izoleucin

Lys (K) Lizin

Leu (L) Leucin

Met (M) Metionin

Asn (N) Asparagin

Pro (P) Prolin

Gln (Q) Glutamin

Arg (R) Arginin

Ser (S) Serin

Thr (T) Treonin

Val (V) Valin

Trp (W) Triptofan

Tyr (Y) Tirozin

ix

Popis kratica

aa-AMP: aminoacil-adenilat

aaRS: aminoacil-tRNA-sintetaza. Za aaRS specifične za određenu aminokiselinu koristi se

kratica sastavljene od troslovne kratice pripadne aminokiseline i dodatka RS

aa-tRNA: aminoacil-tRNA

acp3U: 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin

AMP: adenozin-5'-monofosfat

APS: amonijev persulfat

ATP: adenozin-5'-trifosfat

BSA: albumin goveđeg seruma, eng. bovine serume albumine

cAMP: 3'-5'- ciklički adenozin-monofosfat

CP1: eng. connective peptide I

D: dihidrouridin

DNA: deoksiribonukleinska kiselina

DTT: ditiotreitol

EcIleRS: izoleucil-tRNA-sintetaza iz Escherichia coli

EctRNA: tRNA iz Escherichia coli

EDTA: etilendiamintetraoctena kiselina

EF: elongacijski faktor

GTP: gvanozin-5'-trifosfat

GDP: gvanozin-5'-difosfat

Hepes: N-(2-hidroksietil)piperazin-N'-2-etansulfonska kiselina

I: inozin

x

Ile-AMS: 5´-N-[N-(L-izoleucil)sulfamoil]adenozin

IPTG: izopropil-β-tiogalaktozid

kcat: obrtni broj

kobs: primijećena konstanta brzine reakcije

Km: Michaelisova konstanta

L: lizidin

LB: Luria-Bertani medij

m1A: 1-metiladenozin

m1G: 1-metilgvanozin


m5U: 5-metiluridin


mRNA: glasnička ribonukleinska kiselina

Ni-NTA: nikal-nitrilotrioctena kiselina

PCR: lančana reakcija polimeraze, eng. polymerase chain reaction

PEG8000: polietilenglikol 8000

Pi: ortofosfat, PO43-

PMSF: fenilmetilsulfonil-fluorid

PPi: pirofosfat, P2O74-

RNA: ribonukleinska kiselina

RF: (eng. release factor) faktor otpuštanja

rRNA: ribosomska ribonukleinska kiselina

ScIleRS: izoleucil-tRNA-sintetaza iz Saccharomyces cerevisiae

xi

SctRNA: tRNA iz Saccharomyces cerevisiae

SDS: natrijev dodecilsulfat

SDS-PAGE: elektroforeza na poliakrilamidnom gelu u prisutnosti natrijevog dodecilsulfata

SgIleRS: izoleucil-tRNA-sintetaza iz Streptomyces griseus

SgtRNA: tRNA iz Streptomyces griseus

t6A: N6-treonilkarbamoil-adenozin

tRNA: transfer RNA

tRNAaa: tRNA za određenu aminokiselinu

TCA: trikloroctena kiselina

Tris: Tris(hidroksimetil)-aminometan

Vmax: maksimalna brzina reakcije

v0: početna brzina reakcije

YPD: mediji za uzgoj kvasaca

Ψ: pseudouridin

UVOD

1

1. Uvod

1.1. Biosinteza proteina Prevođenje genetičke upute zapisane u molekuli deoksiribonukleinske kiseline (DNA) u

obliku slijeda nukleotida, u proteine, građene od aminokiselinskih jedinica, jedan je od

najvažnijih staničnih procesa.

Biosinteza proteina dijeli se na dva koraka: transkripciju i translaciju. Transkripcijom tj.

prepisivanjem slijeda nukleotida s lanca kalupa DNA u slijed nukleotida molekule glasničke

ribonukleinske kiseline (mRNA) započinje proces biosinteze proteina. Sintezu molekula

mRNA katalizira enzim RNA-polimeraza. Na većini prokariotskih mRNA proces translacije

započinje prije nego što je proces transkripcije završen, dok se gotovo sve eukariotske mRNA

prije translacije posttranskripcijski dorađuju: dolazi do izrezivanja introna, dodavanja 7-

metilgvanozinske kape na 5'- krajeve, a na 3-' krajeve dodaje se poliadenilatni rep.

U procesu translacije dolazi do prevođenja slijeda nukleotida u molekuli mRNA u slijed

aminokiselina, građevnih jedinica proteina. Do translacije dolazi na staničnim kompleksima

ribosomima (Slika 1.1). Ribosomi su makromolekularni kompleksi građeni od dvije

nejednake podjedinice koje kod prokariota čine manja podjedinica sedimentacijskog

koeficijenta 30S koja sadrži molekule 16S ribosomske RNA (rRNA) i 21 polipeptid, i veća

podjedinica 50S koju čine molekule 23S i 5S rRNA i 31 polipeptidni lanac. Eukariotski

ribosom je nešto veći kompleks: manju podjedinicu od 40S čine molekula 18S rRNA i 33

polipeptida, a veća podjedinica 60S se sastoji od molekula 28S, 5,8S i 5S rRNA, te 49

polipeptida (Voet i Voet 2011). Podjedinice su u stanici razdvojene, a spajaju se tek kada

započne proces translacije.

UVOD

2

Slika 1.1. Struktura ribosoma iz bakterije Escherichia coli. Označene su podjedinice 30S (žuto) i 50S (plavo).

Molekule tRNA se nalaze u mjestima A, P i E i označene su ružičastom, zelenom i smeđom bojom. mRNA i

novosintetizirani peptid su označeni ljubičastom i žutom bojom. Preuzeto i prilagođeno iz Voet i Voet 2011.

Sam proces translacije se može podijeliti na 3 faze: inicijacija, elongacija i terminacija

translacije. Preduvjet za početak translacije je vezanje aminokiselina potrebnih za sintezu

peptidnog lanca na 3'- kraj odgovarajućih molekula transfer RNA (tRNA). Enzimi koji su za

to zaduženi su aminoacil-tRNA-sintetaze (aaRS, detaljnije opisane u nastavku).

Opis translacije u tekstu koji slijedi odnosi se uglavnom na prokariote, kod kojih je proces

najbolje opisan. Premda postoje izvjesne razlike među različitim domenama života, glavne

karakteristike procesa su očuvane u čitavom živom svijetu.

Proces inicijacije započinje vezanjem proteina inicijacijskih faktora IF-1 i IF-3 na malu

podjedinicu ribosoma. Slijedi vezanje mRNA, na koju se uz pomoć inicijacijskog faktora 2

pozicionira inicijacijska formilmetionil-tRNAfMet (samo kod prokariota) koja antikodonom

komplementarno odgovara startnom kodonu AUG. Formilmetionin (fMet) je modificirana

aminokiselina koja nastaje dodavanjem formilne skupine na aminoskupinu metionina vezanog

na tRNAfMet (Nelson i Cox 2005). Vezanjem velike podjedinice ribosoma na malu završava

faza inicijacije. Kao izvor energije u ovoj fazi koristi se GTP koji se hidrolizira na GDP i Pi.

Od čitavog procesa translacije, upravo se faza inicijacije najviše razlikuje među prokariotima,

arhejama i eukariotima.

Faza elongacije podrazumijeva produljenje polipeptidnog lanca na ribosomu. U ovoj fazi

sudjeluje nekoliko elongacijskih faktora: EF-Tu, EF-Ts i EF-G. I u ovom slučaju GTP se

hidrolizira na GDP i Pi i osigurava energiju. U svakom koraku elongacije EF-Tu u kompleksu

UVOD

3

s GTP-om dovodi aminoaciliranu tRNA do ribosoma gdje se antikodon veže na odgovarajući

kodon mRNA, nakon čega se novopridošle aminokiseline kovalentno vežu na rastući peptidni

lanac. Elongacija kod arheja i eukariota događa se na vrlo sličan način. U organizmima tih

domena života postoje proteini s analognim funkcijama kao i elongacijski faktori prokariota.

Terminaciju translacije signaliziraju „stop“ kodoni UAG, UAA ili UGA. Uz pomoć 3 faktora

otpuštanja RF-1, RF-2 i RF-3 (eng. release factor) dolazi do otpuštanja sintetiziranog

peptidnog lanca, odvajanja podjedinica ribosoma i oslobađanja molekule mRNA.

Da bi došao u biološki aktivnu formu peptidni lanac se mora smotati do odgovarajuće

trodimenzionalne strukture. Smatanje može započeti i prije nego je translacija potpuno

završena, a po završetku protein poprima nativnu formu stvaranjem brojnih vodikovih veza, te

uz pomoć van der Waalsovih, ionskih i hidrofobnih interakcija.

Poznate su brojne posttranslacijske modifikacije kojima se može promijeniti konačna

trodimenzionalna struktura proteina. Dodavanje acetilne, metilne, fosforilne, karboksilne i

drugih skupina na bočne ogranke aminokiselina, proteolitičko cijepanje, vezanje oligosaharida

i prostetičkih skupina neki su od primjera posttranslacijskih modifikacija koje se mogu naći

na proteinima (Nelson i Cox 2005).

1.2. Transfer RNA Nakon otkrića da je DNA nositelj genetičke informacije brojne hipoteze su pokušale objasniti

na koji način dolazi do sinteze proteina na temelju slijeda nukleotida zapisanog u DNA. 1955.

godine F. Crick je predložio hipotezu „adaptora“, molekule posrednika, koja bi se

komplementarno sparivala s kodonom na mRNA, i na sebi imala vezanu aminokiselinu. Zbog

potrebe za komplementarnim sparivanjem s mRNA pretpostavio je da „adaptor“ sadrži RNA.

Pokazalo se da su „adaptori“ koje Crick predložio molekule tRNA. tRNA su jednolančane

RNA molekule, čija veličina može varirati od 54 do 100 nukleotida. Na nukleotidima

molekula tRNA vrlo su česte posttranskripcijske modifikacije, pa čak do 25% nukleotida

može biti modificirano (Voet i Voet 2011).

Sekundarna struktura gotovo svih molekula tRNA, koja nastaje kao posljedica Watson-

Crickovog sparivanja baza, tvori prepoznatljivu strukturu oblika djeteline. U strukturi se

mogu razlikovati akceptorska peteljka, gdje se nalaze 5'- i 3'- krajevi tRNA, D-ruka, TΨC-

ruka, antikodonska ruka, te varijabilna ruka (Slika 1.2).

UVOD

4

Slika 1.2. Sekundarna struktura tRNA. Puni krugovi povezani točkicama označuju Watson-Crickove parove, a

prazni krugovi ne-Watson-Crickove parove baza. R i Y su neizmjenjivi nukleotidi purina i pirimidina prisutni

kod svih molekula tRNA. Zvjezdicom su označeni nukleotidi koji su često modificirani. Preuzeto iz Voet i Voet

2011.

Akceptorska peteljka sadrži 5'- i 3'- kraj molekule. Kod većine tRNA sadrži 7 parova baza.

Među parovima baza mogu biti i ne-Watson-Crickovi parovi, primjerice G-U par. Ova

peteljka sadrži CCA 3'- terminalni triplet nukleotida, na koji se u procesu aminoaciliranja

veže aminokiselina. D-ruka se sastoji od peteljke duge 3 do 4 parova baza na koju se nastavlja

omča koja se sastoji od 5 do 7 nukleotida. U omči se često nalazi modificirani nukleotid

dihidrouridin, po kojem je ruka dobila ime. Antikodonska ruka se obično sastoji od 5 parova

baza, na koje se nastavlja omča. Središnja tri nukleotida u omči čine antikodon – triplet

nukleotida koji se komplementarno sparuje s tripletnim kodonom na molekuli mRNA. TΨC-

ruka se sastoji od 5 parova baza i završava omčom u kojoj se nalazi slijed nukleotida T-Ψ-C,

gdje je T nukleotid ribotimidin, a Ψ modificirani nukleotid pseudouridin. Između

antikodonske ruke i TΨC-ruke nalazi se varijabilna ruka, element sekundarne strukture koji se

najviše razlikuje među molekulama tRNA. Može sadržavati 3 do 21 nukleotida, koji mogu

formirati do 7 baznih parova (Voet i Voet 2011).

U stanici je lanac tRNA smotan u preciznu trodimenzionalnu strukturu u obliku slova L (Slika

1.3). Jedan kraj takve strukture tvore TΨC-ruka i akceptorska peteljka koje zajedno čine

UVOD

5

zavojnicu, a drugi kraj čine D i antikodonska ruka (Nakanishi i Nureki 2005). Stabilnost

trodimenzionalne strukture se održava pomoću brojnih vodikovih veza i stacking interakcija

(Voet i Voet 2011).

Slika 1.3. Tercijarna struktura molekule tRNA. Preuzeto iz Nelson i Cox 2005.

Za svaku od 20 standardnih aminokiselina u stanici postoji skupina izoakceptorskih tRNA.

Antikodon izoakceptorske tRNA komplementaran je jednom ili više kodona za odgovarajuće

aminokiseline. Kako u stanici obično postoji po jedna aaRS za svaku aminokiselinu, jedna

aaRS mora prepoznavati sve izoakceptorske tRNA za pojedinu aminokiselinu.

Točno sparivanje aminokiselina i odgovarajućih molekula tRNA ključno je za odvijanje

procesa sinteze proteina. Interakciju između aminoacil-tRNA-sintetaza i pripadnih molekula

tRNA omogućavaju određeni strukturni elementi prisutni na molekulama tRNA koji se

nazivaju elementi identiteta tRNA. Postoje pozitivni elementi identiteta, koji omogućavaju

sparivanje pripadnog enzima i tRNA, i negativni elementi identiteta čija je zadaća spriječiti

interakciju aaRS i nepripadnih molekula tRNA. Iako se elementi identiteta mogu značajno

razlikovati između pojedinih molekula tRNA, često su to nukleotidi iz antikodona,

akceptorske peteljke i diskriminatorska baza na položaju 73 molekule tRNA (Giege i sur.

1998). Elementi identiteta mogu biti i posttranskripcijski modificirane baze tRNA

(Muramatsu i sur. 1988).

Transkripcijom gena za tRNA enzimom RNA-polimeraza nastaje prekursor molekule s 5'- i

3'- dodatnim sljedovima. Posttranskripcijska dorada tRNA započinje endonukleolitičkim

cijepanjem 5'- dodatnih sljedova, što katalizira enzim ribonukleaza P. Prokariotska

UVOD

6

ribonukleaza P je ribozim kojeg čine mala peptidna podjedinica i RNA podjedinica, koja se

sastoji od tRNA-specifične domene i katalitičke domene. Struktura enzima iz arheja i

eukariota se razlikuje od prokariotske: mogu sadržavati 4 do 10 proteinskih podjedinica, koje

su nužne za funkcioniranje nukleaze (Nakanishi i Nureki 2005). Dorada 3'- kraja se može

dogoditi na dva različita načina. Terminalni triplet CCA nije zapisan u genima za sve

molekule tRNA. Ako u prekursoru molekule tRNA ne postoji CCA, tRNaza Z

endonukleolitički cijepa tRNA iza nukleotida na položaju 73, a enzim tRNA-nukleotidil-

transferaza nadodaje CCA kraj. Ako u prekursoru postoji triplet CCA proces cijepanja

dodatnih sljedova obavlja RNaza E i egzonukleaze (Hartmann i sur. 2009). Nakon cijepanja

slijede modifikacije nukleotida tRNA. tRNA je građena od četiri nukleotidne baze prisutne u

svim molekulama RNA A, U, G, C i mnoštva baza slabije učestalosti, a koje nastaju kao

posljedica posttranskripcijskih modifikacija četiri osnovne baze, ili rjeđe, zamjenom baza. Na

Slici 1.4 su prikazani neki modificirani nukleotidi prisutni u tRNAIle iz bakterije E. coli

(EctRNAIle) i eukariota Saccharomyces cerevisiae (SctRNAIle).

Slika 1.4. Strukture nekih modificiranih nukleotida. Prikazani modificirani nukloetidi su prisutni u tRNAIle iz E.

coli i S. cerevisiae. D - dihidrouridin, t6A - N6-treonilkarbamoil-adenozin, m7G - 7-metilgvanozin, acp3U - 3-

(3-amino-3-karboksipropil)uridin, Ψ - pseudouridin, m5U - 5-metiluridin, m1G - 1-metilgvanozin, m2G - 2-

metilgvanozin, I - inozin, L – lizidin, m1A – 1-metiladenozin.

UVOD

7

Kao što je ranije spomenuto posttranskripcijske modifikacije su relativno česte u strukturi

tRNA. U prosjeku modificirani nukleotidi čine 11,6% svih nukleotida 561 sekvencirane

molekule tRNA (Phizicky i Alfonzo 2010). Modifikacije nukleotida na molekulama tRNA

imaju značajan utjecaj na strukturu i funkciju mnogih molekula tRNA. Strukturno utječu na

formiranje elemenata sekundarne i tercijarne strukture. Četiri osnovne baze koje grade

molekule RNA mogu zauzimati brojne konformacije, pa slijed takvih nukleotida teško može

formirati jedinstvenu tercijarnu strukturu. Smatra se da je jedna od uloga modifikacija

nukleotida termička stabilizacija i smanjenje dinamičnosti strukture (Helm 2006).

Modifikacije koje utječu samo na strukturu molekula tRNA češće su lokalizirane u središnjem

dijelu L-strukture, tj. u dijelu koji čine D-ruka i TΨC-ruka. Modifikacije na nukleotidima na

antikodonskoj ruci uglavnom imaju funkcionalnu zadaću. Utječu na sparivanje antikodona,

interakcije s ribosomima te na točno prepoznavanje od strane pripadnih aminoacil-tRNA-

sintetaza. Modifikacije nukleotida na mjestu 34 i 37 u antikodonskoj omči su posebno

zanimljive, obzirom da su navedene pozicije često element identiteta koji prepoznaje aaRS.

Važnost tih mjesta potvrđuje i to da se na tim mjestima može naći do 100 različitih

modifikacija. Ipak, ne utječu sve modifikacije na navedenim pozicijama na funkciju. Kod

tRNAPhe iz E. coli modifikacijom nukleotida A37 u i6A37 dolazi do značajne promjene u

sekundarnoj strukturi – formira se karakteristična omča na antikodonskoj ruci, pa unatoč tome

što se radi o nukleotidu na antikodonskoj ruci, ova modifikacija utječe na strukturu molekule

(Helm 2006). Unatoč velikoj zastupljenosti modifikacija u strukturi, pokazalo se da nisu sve

modifikacije neophodne za funkciju svih tRNA u kojima se mogu naći. Razlog za to bi moglo

biti nespecifično djelovanje pojedinih enzima koji vrše modifikacije, pa osim molekula tRNA

kojima su modifikacije nužne, modificiraju i druge molekule tRNA (Phizicky i Alfonzo

2010).

1.2.1. tRNAIle

Aminokiselinu izoleucin kodiraju tri kodona: AUU, AUA te AUC. U stanicama E. coli i S.

cerevisiae postoje po dvije izoakceptorske tRNA koje prepoznaju ove kodone.

Strukture dvaju izoakceptora kod E. coli dijele 68% identičnih nukleotida, s najvećim

razlikama u antikodonskoj omči (Slika 1.5). Glavni izoakceptor ima antikodon GAU i sparuje

se s kodonom AUU i AUC. Drugi, sporedni izoakceptor prepoznaje kodon AUA. Gen za

drugi izoakceptor kodira za antikodon slijeda CAU, koji je svojstven tRNAMet, i veže se na

kodon AUG. Posttranslacijskom modifikacijom dodavanja ε-amino skupine lizina na C-2

UVOD

8

položaj pirimidinskog prstena nastaje modificirani nukleozid lizidin (Slika 1.4), pa antikodon

sporednog izoakceptora čini slijed LAU (Nordin i Schimmel 2005).

Slika 1.5. Sekundarne strukture glavnog (a) i sporednog (b) izoakceptora tRNAIle iz E. coli. Uokvireni su glavni

identitetni elementi. Preuzeto iz Nordin i Schimmel 2005.

Usporedbom aminoacilacijske aktivnosti, zabilježena je smanjena aktivnost in vitro

transkripta glavne izoakceptorske tRNAIle, čiji nukleotidi nisu modificirani u odnosu na

nativnu tRNAIle. Eksperimentima u kojima se uspoređivala aktivnost aminoaciliranja nativne

tRNA, potpuno nemodificiranog transkripta i transkripta s modifikacijama na određenim

pozicijama EctRNAIle određeni su elementi identiteta važni za interakciju tRNA s izoleucil-

tRNA-sintetazom (IleRS). Najvažniji elementi identiteta za interakcije IleRS iz E. coli

(EcIleRS) s EctRNAIle, su lokalizirani u antikodonskoj omči (Slika 1.5) (Nureki i sur. 1994).

Baze koje se nalaze na položaju 34 tRNAIle, a koje se sparuju sa zadnjom bazom kodona

prepoznate su kao važni elementi identiteta. Eksperimenti u kojima je G34 iz antikodona

zamijenjen bazama A, U i C su pokazali drastično smanjenje aminoacilacijske aktivnosti.

Kako enzim IleRS također uspješno aminoacilira sporedni izoakceptor tRNA, koja na mjestu

34 ima modificirani nukleotid lizidin, određene zajedničke karakteristike obje baze odgovorne

su za interakciju s enzimom. Usporedbom strukture Muramatsu i sur. (1992.) su zaključili da

su –NH skupine prisutne na C2 atomu gvanozina i lizidina, a koje ne postoje na adeninu,

citozinu i uracilu, identitetne determinante za EcIleRS (Slika 1.6).

UVOD

9

Slika 1.6. Nukleotidne baze iz antikodona tRNAIle iz E. coli i S. cerevisiae. Uokvirene su skupine zajedničke

svima bazama. Strelice označavaju donore i akceptore vodikovih veza uključenih u kodon-antikodon sparivanje.

Preuzeto iz Senger i sur. 1997.

Analize kinetičkih parametara in vitro transkribiranih molekula tRNA mutiranih na

određenim položajima su pokazale da su osim položaja 34, A35 i U36 (iz antikodona),

modificirani nukleotid t6A37 i A38 iz antikodonske ruke također važni elementi identiteta u

sustavu EcIleRS i EctRNAIle. Osim njih, elementi identiteta su i parovi baza C29-G41 iz

antikodonske petlje, U12-A23 iz D-ruke, C4-G69 kao i diskriminatorska baza A73 (Nureki i

sur. 1994, Nordin i Schimmel 2005).

Antikodoni eukariotske SctRNAIle se razlikuju od onih u E. coli. Kao i E. coli, S. cerevisiae

ima dvije izoakceptorske tRNAIle, glavnu i sporednu, čije strukture su prikazane na Slici 1.7.

Obje izoakceptorske tRNA imaju modificirane nukleotidne baze u antikodonskom tripletu.

Glavna izoakceptorska tRNA s antikodonom IAU, koji je u genomu zapisan kao AAT sadrži

modificiranu bazu inozin na mjestu 34. Sporedna izoakceptorska tRNA s antikodonom ΨAΨ,

u genomu zapisana kao TAT sadrži pseudouridine na mjestu 34 i 36. Kao i lizidin kod E. coli

tRNA, modificirane baze su važne za aminoacilacijsku aktivnost molekula SctRNA.

UVOD

10

Slika 1.7. Sekundarne strukture glavne (a) i sporedne (b) izoakceptorske tRNA iz S. cerevisiae.

Posttranskripcijske modifikacije su označene kao na Slici 1.4. Preuzeto iz Senger i sur. 1997.

Eukariotska IleRS je sklona heterolognom aminoaciliranju, što nije svojstveno za prokariotski

enzim (Racher i sur. 1991). Senger i sur. (1997.) su pokazali da transkript tRNAIle kojem je na

mjestu 34 gvanin može biti supstrat S. cerevisiae IleRS, s nešto slabijom aminoacilacijskom

učinkovitošću u odnosu na transkript kojem je na istom mjestu inozin, iz čega je zaključeno

da enzim interagira sa skupinama koje su prisutne na gvaninu i inozinu. Uspoređujući

strukture baza, vrlo vjerojatno se radi o skupinama N-1 i O-6 u strukturi inozina i gvanina

(Slika 1.6). Na pseudouridinu, uracilu i lizidinu također postoje analogne skupine (Slika 1.6).

Transkripti tRNAIle kojima je na mjestu 34 uracil, adenin i citozin su lošiji supstrati za S.

cerevisiae IleRS. Između tri navedena transkripta, onaj sa uracilom na 34 mjestu je najbolji

supstrat za S. cerevisiae IleRS. Smatra se da je modifikacija antikodona UAU u ΨAΨ

potrebna radi sprječavanja sparivanja antikodona UAU s metioninskim kodonom AUG, što je

po hipotezi kolebljive baze moguće. Mutacija druga dva mjesta kodona pokazala je da je čitav

antikodonski triplet važan identitetni element tRNAIle. Za razliku od E. coli sustava, par baza

C4-G69 nije se pokazao kao važan identitetni element za interakciju S. cerevisiae IleRS

(ScIleRS) i pripadne SctRNAIle: Senger i sur. (1997) pišu da taj par vjerojatno nije identitetni

element za ScIleRS, jer ubacivanjem tog para u transkript tRNAMet ona nije postala bolji

supstrat za navedeni enzim. Na Slici 1.8 je prikazana struktura tRNAIle na kojoj su označeni

nukleotidi koji su po do sada poznatim informacijama bitni identitetni elementi za ScIleRS

(Senger i sur. 1997).

UVOD

11

Slika 1.8. Konsenzusna sekvenca nukleotida koji su prisutni u svim molekulama tRNA koje enzim ScIleRS

uspješno aminoacilira. N je bilo koji nukleotid, a točke su nukleotidi uključeni u formiranje tercijarne strukture

tRNA. Preuzeto iz Senger i sur. 1997.

1.3. Aminoacil-tRNA-sintetaze Aminoacil-tRNA-sintetaze (aaRS) su enzimi koji kataliziraju stvaranje esterske veze između

karboksilnog ugljikovog atoma aminokiseline i 3'-OH skupine riboze terminalnog adenozina

na molekuli tRNA.

Reakcija aminoaciliranja se događa u dva koraka:

ATP + aa ⇄ aa-AMP + PPi

aa-AMP + tRNA → aa-tRNA + AMP

Aktivacija aminokiselina podrazumijeva nukleofilni napad atoma kisika iz α-karboksilne

skupine aminokiseline na α-fosfatnu skupinu adenozin-trifosfata (ATP). Produkti ove reakcije

su miješani anhidrid karboksilne i fosfatne kiseline – aminoacil-adenilat (aa-AMP) i pirofosfat

(PPi). Korak prenošenja aminokiseline uključuje nukleofilni napad 2'- ili 3'-OH skupine

riboze terminalnog adenozina A76 molekule tRNA na α-karbonilni ugljikov atom aminoacil-

adenilata, čime dolazi do pucanja veze između α -karbonilne i α -fosfatne skupine miješanog

anhidrida i molekula AMP-a se otpušta. Konačni produkt reakcije aminoaciliranja je

aminoacil-tRNA (aa-tRNA) (First 2005, Ibba i Soll 2000).

UVOD

12

U većini stanica postoji 20 aaRS, po jedna za svaku standardnu aminokiselinu, no pojedini

organizmi posjeduju i dodatne, netipične aaRS, primjerice pirolizil-tRNA-sintetazu (PylRS) i

fosfoseril-tRNA-sintetazu (SepRS). Aminoacil-tRNA-sintetaze za pojedine aminokiseline

mogu postojati u više različitih formi u različitim organizmima (npr. LysRS i GlyRS). Na

temelju strukturnih i funkcionalnih karakteristika aaRS se dijele u dva razreda (I i II), s 11,

odnosno 13 članova u pojedinom razredu (Perona i Gruic-Sovulj 2013). Enzimi razreda I

obično su monomeri, dok su enzimi razreda II uglavnom homo- ili heterodimeri (Tablica 1.1).

Tablica 1.1. Podjela aminoacil-tRNA-sintetaza na razrede I i II. Podjela na razrede prema Perona i Gruic-Sovulj

2013.

Razred I Kvaterna struktura Razred II Kvaterna struktura

MetRS α, α2 SerRS α2

LeuRS α ProRS α2

IleRS α ThrRS α2

ValRS α GlyRS α2

CysRS α, α2 HisRS α2

GlnRS α AspRS α2

GluRS α AsnRS α2

TyrRS α LysRS α2

TrpRS α2 PheRS (αβ)2, α

ArgRS α2 GlyRS (αβ)2

LysRS α AlaRS α2, α

SepRS α4

PylRS α2

Enzime razreda I karakteriziraju motiv HIGH (slijed histidin-izoleucin-glicin-histidin) i

KMSKS (slijed lizin-metionin-serin-lizin-serin). Aktivno mjesto enzima čine dva uzastopna

motiva β-α-β koji zajedno čine Rossmannovu strukturu (Slika 1.9 A). S obzirom na sličnosti u

nukleotidnim sljedovima, ovaj razred se dijeli na tri podrazreda: Ia, Ib i Ic. Kao i drugi

proteini koji posjeduju Rossmannovu strukturu, enzimi ovog razreda ATP vežu u izduženoj

konformaciji, a riboza zauzima C2' endo konformaciju (First 2005). Još jedna specifičnost

enzima ovog razreda je prilaženje molekuli tRNA smotanoj u karakteristični L-oblik sa strane

malog utora. U reakciji prijenosa aminokiseline na tRNA, kod aaRS razreda I nukleofil je 2'-

UVOD

13

OH skupina terminalnog nukleotida tRNA, pa se aminokiselina prvotno veže na 2'-OH

skupinu 3'- kraja tRNA, nakon čega se reakcijom transesterifikacije prenosi na 3'-OH skupinu

3'- kraja (Arnez i Moras 1997, Nelson i Cox 2005).

Za razred II specifični strukturni elementi su motivi 1, 2 i 3. Za aktivno mjesto ovog razreda

svojstvena je anti-paralelna β ploča omeđena trima α zavojnicama (Slika 1.9 B). Motiv 1

sudjeluje u interakciji između monomera enzima, a motivi 2 i 3 su dio aktivnog mjesta (Arnez

i Moras 1997). S obzirom na sličnosti u nukleotidnim sljedovima i kvaternoj strukturi, enzimi

razreda II se također dijele na tri podrazreda: IIa, IIb i IIc. Za razliku od razreda I, enzimi

ovog razreda ATP vežu u savijenoj konformaciji, a riboza zauzima C3' endo konformaciju

(First 2005). AaRS razreda II prilaze molekulama tRNA sa strane velikog utora. Uz iznimku

PheRS, nukleofil u koraku prijenosa aminokiseline na tRNA je 3'-OH skupina, pa se

aminokiseline odmah vežu na 3'-OH skupinu 3'- kraja molekula tRNA (Arnez i Moras 1997).

Slika 1.9. Strukture aktivnih mjesta aminoacil-tRNA-sintetaza u kompleksu s krajem akceptorskih peteljki

pripadnih molekula tRNA i ATP-om. (A) Glutaminil-tRNA-sintetaza, predstavnik razreda I. Žuto je označena

Rossmannova struktura. Karakteristični motivi HIGH I KMSKS su označeni crvenom i tamno-plavom bojom.

(B) Aspartil-tRNA-sintetaza, predstavnik razreda II. Crvenom, zelenom i tamno-plavom bojom su označena 3

karakteristična motiva. Preuzeto iz Arnez i Moras 2009.

Osim navedenih, između dva razreda enzima postoje određene razlike i u mehanizmu

aminoaciliranja. Kinetička istaživanja predustaljenog i ustaljenog stanja na aaRS razreda I

pokazala su da se kod ovih enzima produkt akumulira u sintetskom mjestu, a otpuštanje

produkta s enzima je najsporiji korak u cjelokupnoj reakciji. Kod enzima razreda II to nije

UVOD

14

primijećeno, već se u slučaju ovih aaRS najsporiji korak događa prije otpuštanja produkta, a

vrlo vjerojatno je to korak aktivacije aminokiselina u prisutnosti tRNA (Zhang i sur. 2006).

Tijekom čitavog procesa biosinteze proteina dolazi do pogrešaka. Na razini aminoaciliranja,

zbog relativno male razlike u strukturi pojedinih aminokiselina, neke aaRS povremeno

aktiviraju i neke nepripadne aminokiseline. Dodirna površina između enzima i tRNA je

znatno veća, pa je prepoznavanje pripadne molekule tRNA lakše i rjeđe dolazi do pogrešnog

prepoznavanja. Aminoacil-tRNA-sintetaze su razvile složene mehanizme prepoznavanja i

popravka pogrešaka kako bi održale stopu pogrešnih aminoaciliranja na razinama koje su

prihvatljive stanici (1 na 1000-10000) (Ling i sur. 2009).

Do popravka može doći nakon aktivacije nepripadne aminokiseline, a prije prijenosa na

tRNA, ili nakon prijenosa nepripadne aminokiseline na tRNA. Popravak prije prijenosa

podrazumijeva hidrolizu veze između aminokiseline i AMP-a. Do popravka ove vrste može

doći enzimskom hidrolizom, koja se može podijeliti na tRNA-neovisnu i tRNA-ovisnu

hidrolizu, ovisno o tome stimulira li dodatno molekula tRNA ovu vrstu popravka ili ne, ili

selektivnim otpuštanjem nepripadnog aminoacil-adenilata u otopinu, gdje se neenzimski

hidrolizira. Ako dođe do prijenosa nepripadne aminokiseline na tRNA te nastane misacilirana

tRNA, dolazi do popravka pogreške nakon prijenosa, koji podrazumijeva hidrolizu

misacilirane tRNA. (Ling i sur. 2009). Na Slici 1.10 su shematski prikazane reakcije koje

kataliziraju aaRS: crnom bojom su označene reakcije s pripadnom aminokiselinom, aktivacija

i prijenos, a u boji su označene dodatne reakcije s nepripadnim aminokiselinama, popravak

pogreške prije i nakon prijenosa.

UVOD

15

Slika 1.10. Shematski prikaz reakcija aaRS. Crnom bojom su prikazane reakcije s pripadnom aminokiselinom,

aktivacija i prijenos. Dodatne reakcije s nepripadnim aminokiselinama označene su u boji: plavom bojom tRNA-

neovisni popravak pogreške prije prijenosa, zelenom bojom tRNA-ovisni popravak pogreške prije prijenosa, a

ljubičastom popravak pogreške nakon prijenosa. Prilagođeno iz Dulic i sur. 2010.

1.3.1. Izoleucil-tRNA-sintetaza

Izoleucil-tRNA-sintetaza (IleRS) je aminoacil-tRNA-sintetaza razreda I, podrazreda Ia, čiji je

pripadni supstrat izoleucin. Kao i većina enzima razreda I, IleRS je monomerni protein,

veličine od oko 105 do 120 kD (ovisno o organizmu) i dimenzija 100 Å x 80 Å x 45 Å

(Nureki i sur. 1998). Kao i svi drugi pripadnici ovog razreda, aktivno mjesto IleRS čini

Rossmannova struktura, a sadrži i dva svojstvena motiva HIGH i KMSKS. U modularnoj

građi enzima razlikuju se N-terminalna katalitička domena, insercijske domene CP1 i CP2

(eng. connective peptide) i C-terminalna RNA-vezujuća domena. Dok se u katalitičkoj

domeni nalazi aktivno mjesto enzima gdje dolazi do aktivacije aminokiselina i prijenosa na

tRNA, CP1 domena sadrži drugo aktivno mjesto, odgovorno za popravak pogreške nakon

prijenosa. C-terminalna domena sadrži determinante za interakciju s antikodonskom petljom

tRNAIle (Nordin i Schimmel 2005).

Iz strukture IleRS u kompleksu s Ile-AMS (analog Ile-AMP koji se ne može hidrolizirati; jaki

inhibitor svih IleRS) iz prokariota Thermus thermophilus vidljivo je da prilikom vezanja u

aktivno mjesto enzima ATP stupa u interakcije s bočnim ograncima aminokiselina iz dva

karakteristična motiva za aaRS razreda I: His54, Val55, Gly56, His57 (HVGH) i Lys592, Met593,

Ser594 Lys595 (KMSK) (Nureki i sur. 1998). Hidrofobni bočni ogranak izoleucina se van der

Waalsovim interakcijama pozicionira u hidrofobni džep građen od bočnih ogranaka Gly45,

Pro46, Trp518, Glu 550 i Trp558. NH3+ i COO- skupine izoleucina stvaraju vodikove veze s Asp85

UVOD

16

i Gln554. Navedene aminokiseline su očuvane u svim do sada sekvenciranim IleRS (Fukai i

sur. 2000). Aminokiseline s većim bočnim ogranicama zbog steričkih smetnji ne mogu se

pozicionirati u ovo aktivno mjesto. Međutim, valin, aminokiselina čiji se bočni ogranak

razlikuje od izoleucinskog samo po nedostatku jedne metilenske skupine se veže u aktivno

mjesto i sposoban je formirati van der Waalsove interakcije s Pro46 i Trp558, iako je

hidrofobna dodirna površina nešto manja nego kod bočnog ogranka izoleucina. Osim u

sintetsko mjesto, kristalna struktura je pokazala da se valin pozicionira i u drugo aktivno

mjesto na enzimu koje se nalazi na CP1 domeni i udaljeno je 34 Å od prvog aktivnog mjesta

(Nureki i sur. 1998). Zbog steričkih smetnji izoleucin se ne može smjestiti u ovo aktivno

mjesto, pa se smatra da je ovo mjesto optimirano za smještanje valina, tj. Val-tRNAIle i tu

dolazi do deacilacije misacilirane tRNA. Ovakav model popravka odgovara modelu

dvostrukog sita (Fersht i Dingwall 1979), koji predlaže da se aktivno mjesto enzima ponaša

kao prvo, grubo sito, koje zbog steričkih ograničenja odbija aminokiseline većih bočnih

ogranaka, a propušta pripadnu i aminokiseline manjih ogranaka. Drugo, finije sito, mjesto je

za popravak, u koje pripadna aminokiselina zbog steričkih smetnji ne može ući. Supstrati za

popravak su aminokiseline manjih bočnih ogranaka koje se ovdje mogu smjestiti te dolazi do

hidrolize veze između tih aminokiselina i misacilirane tRNA.

Kao i nekoliko drugih aaRS, IleRS je metaloprotein (Xu i sur. 1993, Nureki i sur. 1993). U

strukturi EcIleRS su prisutna dva iona cinka: jedan Zn2+ ion na N-terminalnoj domeni,

koordiniran s četiri cisteinska bočna ogranka, dva iz katalitičke domene, i dva iz CP1 domene,

a drugi cinkov ion smješten u C-terminalnoj domeni također je koordiniran s četiri cisteinska

bočna ogranka. IleRS iz prokariota T. thermophilus također u strukturi ima dva iona cinka,

prvi kao i EcIleRS u N-terminalnoj domeni, ali u ovom slučaju nema ion cinka unutar C-

terminalne domene, već se drugi ion nalazi u Zn2+-veznom mjestu u CP2 insercijskoj domeni

(Nordin i Schimmel 2005). Unatoč tome što se ne nalazi u aktivnom mjestu, uklanjanje iona

Zn2+ iz strukture enzima ima drastične posljedice na aktivnost enzima iz obje vrste, što govori

u prilog njegovoj važnoj ulozi u funkcioniranju IleRS (Nureki i sur. 1993).

1.3.1.1. Tipovi IleRS

Motivi HIGH i KMSKS su očuvani u svim aaRS razreda I. Osim navedenih motiva, na

temelju sličnosti u drugim sljedovima, članovi ovog razreda podijeljeni su u tri podrazreda.

IleRS iz svih vrsta pripada podrazredu Ia, kojeg osim nje čine i ValRS, LeuRS, CysRs i

MetRS (podjela po First 2005). Unatoč sličnostima u sljedovima, enzimi ovog podrazreda u

E. coli variraju veličinom od 461 aminokiseline do 951 aminokiseline. Razlike u veličini

UVOD

17

velikim se dijelom mogu pripisati varijabilnim insercijskim domenama: većoj CP1 domeni,

koja može varirati od 61 aminokiseline u CysRS do 277 aminokiseline u IleRS, i manjoj

domeni CP2 (Shiba i sur. 1994). Međusobnim sravnjenjem većeg broja IleRS iz drugih

prokariotskih, te nekih eukariotskih i arhejskih vrsta dobiveni su zanimljivi rezultati. Domene

CP1 i CP2 koje variraju veličinom među članovima podrazreda Ia izrazito su očuvane u IleRS

iz različitih vrsta, gotovo kao motivi karakteristični za ovaj razred enzima (Shiba i sur. 1994.).

Za razliku od njih, C-terminalne domene IleRS su pokazale značajne strukturne razlike među

vrstama. Na temelju primijećenih razlika IleRS se mogu podijeliti na dva tipa. U enzime tipa

1 se ubrajaju IleRS iz bakterija i eukariotskih mitohondrija. Strukturna specifičnost ove

podskupine izoleucil-tRNA-sintetaza je C-terminalna domena relativno očuvana slijeda

Cys902-Pro-Arg-Cys. . . Cys921-Gly-Arg-Cys (slijed u E. coli; u drugim prokariotskim vrstama

umjesto Pro903 i Gly922 mogu biti druge aminokiseline) s četiri cisteina koja koordiniraju atom

cinka (Jenal i sur., 1991, Sassanfar i sur., 1996). Vezno mjesto za ion cinka je esencijalno za

aktivnost enzima (Sassanfar i sur. 1996). Tip 2 čine IleRS prisutne u citoplazmi eukariota.

Enzimi tipa 2 na svojim C-terminalnim domenama ne posjeduju C-terminalni strukturni motiv

s cinkom koji je svojstven enzimima tipa 1. IleRS iz arheja također ne posjeduju C-terminalni

motiv, međutim za razliku od enzima tipova 1 i 2, sljedovi ovih enzima na drugim mjestima u

strukturi pokazuju elemente koji bi mogli činiti vezno mjesto za ione cinka. Sljedovi Cys184-

Pro-Arg-Cys i Cys503-Gly-Arg-Cys iz arheje Methanobacterium thermoautotrophicum

Marburg su identični veznim mjestima na E. coli, no nije poznato veže li se zaista atom cinka

u ta vezna mjesta (Jenal i sur. 1991).

Primijećeno je da postoje vrste prokariotskih enzima koje i strukturom svojih C-terminalnih

domena, to jest nedostatkom motiva s cinkom, te sveukupno boljim poravnanjem s

eukariotskim nukleotidnim sljedovima, odstupaju od uobičajene forme prokariotskih IleRS

enzima tipa 1. Jedan takav prokariot je bakterija Pseudomonas fluorescens, iz koje je izoliran

antibiotik mupirocin, i koja je dakako otporna na djelovanje tog antibiotika. Pokazalo se da

ova bakterija posjeduje gene za dva tipa IleRS, uz uobičajeni prokariotski enzim tipa 1, ima i

IleRS koja nalikuje eukariotskom tipu 2, a koji je zaslužan za otpornost ovog organizma na

mupirocin (Yanagisawa i Kawakami 2003).

Uz P. fluorescens, još neke prokariotske vrste čiji enzimi se grupiraju s eukariotskim IleRS

tipa 2 su Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium smegmatis,

T. thermophilus (Sassanfar i sur. 1996, Nakama i sur. 2001).

UVOD

18

Još jedna razlika između prokariotskih i eukariotskih IleRS je sposobnost za heterolognu

aminoacilaciju. Istraživanja su pokazala da eukariotski ScIleRS jednako uspješno

aminoacilira EctRNA kao i pripadni prokariotski enzim. Naprotiv eukariotski EcIleRS nije

uspio aminoacilirati SctRNA (Racher i sur. 1991).

1.3.1.2. Mupirocin

Smatra se da se sljedovi aaRS u aktivnom mjestu enzima od prokariota do viših eukariota

mogu razlikovati i do 70%. Takva raznolikost ove enzime čini potencijalnom metom za

razvoj antibiotika, u obliku vrsno-specifičnih inhibitora. Najpoznatiji primjer inhibitora aaRS

koji se koristi kao antibiotik je pseudomonična kiselina A (mupirocin) (Slika 1.11.). Ova

molekula koju proizvodi bakterija P. fluorescens je inhibitor mnogih izoleucil-tRNA-sintetaza

Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija (Sassanfar i sur. 1996). Mupirocin se

nekovalentno veže u aktivno mjesto enzima i kompetitivni je inhibitor vezanja izoleucina i

ATP-a (Nordin i Schimmel 2005).

Slika 1.11. Struktura antibiotika mupirocina. Preuzeto i prilagođeno iz Nakama i sur. 2001.

Uspoređen je način vezanja molekula Ile-AMS (analog Ile-AMP) i antibiotika mupirocina na

enzim. Iz riješene kristalne strukture IleRS iz T. thermophilus s vezanim mupirocinom

vidljivo je da se antibiotik pozicionira unutar katalitičkog aktivnog mjesta Rossmannove

strukture (Slika 1.12). Dio strukture mupirocina koji nalikuje hidrofobnom bočnom ogranku

izoleucina veže se u hidrofobni džep građen od bočnih ogranaka Pro46, Trp518 i Trp558 te se,

kao i aminokiselina, tamo pozicionira van der Waalsovim interakcijama. Međutim,

orijentacija hidrofobnog lanca mupirocina je nešto drugačija od orijentacije bočnog ogranka

izoleucina. Razlog tome može biti hidroksilna skupina na C-13 atomu mupirocina.

Šesteročlani piranski prsten mupirocina stvara stacking interakcije s His581. Vodikove veze se

formiraju između Gly551 i hidroksilne skupine na atomu C-6 mupirocina, Asp553 i hidroksilne

skupine na atomu C-6 mupirocina, i Glu550 i hidroksilne skupine na atomu C-7 mupirocina. Iz

UVOD

19

strukture enzima u kompleksu s Ile-AMS poznato je da na isti način enzim veže ribozu iz

adenozina. Atomi C-1 do C-3 funkcionalno imitiraju prsten adenina iz AMP-a: van der

Waalsovim interakcijama reagiraju s bočnim ogrankom Leu583, a formira se i vodikova veza

između kisika karbonilne skupine C-1 na mupirocinu i amidne skupine Ile584 iz polipeptidne

okosnice. Stvaranjem navedenih interakcija mupirocin onemogućava vezanje Ile-AMP na

enzim (Nakama i sur. 2001).

Slika 1.12. Struktura IleRS iz Staphylococcus aureus u kompleksu s mupirocinom i tRNAIle. Ljubičastom bojom

označen mupirocin nalazi se u sintetskom mjestu. Rossmannova struktura označena je zeleno, CP1 domena

narančasto, CP2 domena tamno-plavo, tRNA-vezna domena ljubičasto i svijetlo plavo, crvenom bojom je

označeno vezno mjesto za Zn2+. Preuzeto i prilagođeno iz Silvian i sur. 1999.

Osim mnogih Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija, mupirocin inhibira i IleRS arheja,

ali ne djeluje na IleRS eukariotskih vrsta, pa tako ni na ljudski enzim. Moguće objašnjenje za

ovo je postojanje nekih aminokiselina u strukturi enzima koje prepoznaju mupirocin, ali nisu

potrebne za prepoznavanje Ile-AMP kompleksa. Istraživanja na mutantima T. thermophilus

kojima se osjetljivost na mupirocin smanjila za jedan red veličina sugeriraju da su

aminokiseline na mjestu 48, 518 i 548 (numerirano po IleRS iz T. thermophilus) važne za

rezistenciju na ovaj antibiotik (Nakama i sur. 2001).

UVOD

20

1.4. Streptomyces griseus Streptomyces griseus je Gram-pozitivna bakterija iz roda Streptomyces. Kao i druge bakterije

iz roda raste uglavnom u tlu. Za ovaj rod bakterija je svojstven visok udio GC parova baza od

71,2% u genomu. S. griseus je prepoznatljiv po „mirisu zemlje“ koji je posljedica proizvodnje

metabolita plina geosmina. Rod je poznat po proizvodnji brojnih sekundarnih metabolita,

među kojima su najzanimljiviji antibiotici, primjerice neomicin, kloramfenikol i streptomicin

(Cruz-Morales i sur. 2013). S. griseus je jedna od bakterija koja, premda je prokariot,

posjeduje IleRS (SgIleRS) koja se prema primarnoj strukturi grupira s eukariotskim IleRS tipa

2.

UVOD

21

1.5. Cilj istraživanja Primijećeno je da postoji skupina prokariotskih enzima koji strukturom svojih C-terminalnih

domena, to jest nedostatkom motiva s cinkom, te sveukupno boljim poravnanjem s

eukariotskim nukleotidnim sljedovima, odstupaju od uobičajene forme prokariotskih IleRS

enzima tipa 1. S. griseus je jedna od bakterija čija se prokariotska IleRS prema primarnoj

strukturi grupira s IleRS tipa 2. Cilj ovog istraživanja je klonirati gen za IleRS iz vrste S.

griseus, te pročistiti veće količine proteina nadeksprimiranog u bakteriji E. coli. Daljnjom

karakterizacijom pokazat će se posjeduje li navedeni enzim eukariotske karakteristike, što se

očekuje iz njegove primarne strukture. Kao prvo, usporedit će se katalitička učinkovitost

IleRS iz S. griseus s enzimima iz vrsta E. coli (IleRS prokariotskog tipa) i S. cerevisiae (IleRS

eukariotskog tipa) u aktivaciji pripadnog izoleucina i nepripadnog valina, te heterolognom

aminoaciliranju molekula tRNA iz ovih triju vrsta. Nadalje, usporedit će se učinkovitost

antibiotika mupirocina u inhibiranju rasta stanica bakterija E. coli, S. griseus i eukariota S.

cerevisiae. Poznato je da mupirocin inhibira IleRS brojnih Gram-pozitivnih i Gram-

negativnih bakterija, a ne utječe na rast eukariota. Istraživanje će pokazati kako navedeni

antibiotik utječe na rast bakterije S. griseus čija IleRS nalikuje eukariotskoj.

MATERIJAL I METODE

22

2. Materijal i metode

2.1. Materijali

2.1.1. Standardne kemikalije

Agar (Sigma), agaroza (Sigma), akrilamid (Sigma), amonijev klorid (Kemika), amonijev

peroksodisulfat (APS) (Serva), dimetilsulfoksid (DMSO) (Sigma), ditiotreitol, DTT (Sigma),

etanol, (Kemika), etilendiamintetraoctena kiselina, EDTA (Sigma), fenilmetilsulfonil-fluorid

(PMSF) (Sigma), fenol (Kemika), glicerol (Kemika), glicin (USB Corporation), glukoza

(Kemika), N-(2-hidroksietil)piperazin-N'-2-etansulfonska kiselina (Hepes) (USB

Corporation), imidazol (Sigma), izopropil-β-tiogalaktozid (IPTG) (Sigma), izopropanol

(Kemika), kalijev dihidrogenfosfat (Kemika), kanamicin (Sigma), kloridna kiselina (Kemika),

kloroform (Kemika), kvaščev ekstrakt (Difco), magnezijev klorid (Fluka), magnezijev sulfat

(Kemika), β-merkaptoetanol (Serva), mupirocin (Applichem), N,N'-metilenbisakrilamid

(Merck), natrijev acetat (Kemika), natrijev dodecilsulfat (SDS) (Merck), natrijev klorid

(Kemika), Nonidet P-40 (NP-40) (USB Corporation), octena kiselina (Kemika), pepton

(Sigma), polietilenglikol 8000 (PEG8000) (Sigma), 1,4-bis(2-(4-metil-5-fenil)oksazolil)benzen

(POPOP) (Kemika), 2,5-difeniloskazol (PPO) (Kemika), N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin

(TEMED) (Serva), toluen (Kemika), trikloroctena kiselina (TCA) (Kemika), tripton (Sigma),

Tris(hidroksimetil)-aminometan (Tris) (Sigma), ureja (Kemika).

2.1.2. Aminokiseline i nukleotidi

ATP (Sigma), dNTP (smjesa dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Sigma), izoleucin (Sigma), [14C]-

izoleucin (Amersham biosciences), valin (Sigma), [α-32P]ATP (Perkin Elmer), ukupna tRNA

iz E. coli (Roche), ukupna tRNA iz S. cerevisiae (Roche).

2.1.3. Boje

Bromfenol plavo (Serva), Coomassie Brilliant Blue R-250 (Merck), etidijev bromid

(Boehringer Mannheim), ksilencijanol fluorofosfat (XCFF) (Serva), toluidinsko modrilo

(Sigma).

2.1.4. Markeri veličine

1 kb DNA Ladder (NEB), Precision Plus Protein Standards, Unstained (Bio-Rad).

MATERIJAL I METODE

23

2.1.5. Enzimi, proteini i nukleinske kiseline

Albumin iz goveđeg seruma (eng. bovine serum albumin; BSA) (NEB), DNaza I (oslobođena

od RNaza) (NEB), RNaza A (Sigma), lizozim (USB), Phusion DNA-polimeraza 5× GC pufer

(NEB), restrikcijske endonukleaze s pripadnim puferima (NEB), T4-DNA-ligaza (Fermentas).

Korištena je laboratorijska preparacija Phusion DNA-polimeraze, koju je ustupio dr. sc.

Marko Močibob. Gen za enzim je ukloniran u ekspresijski vektor kojim su transformirane

stanice E. coli. Stanice su inducirane IPTG-om, enzim je izoliran i pročišćen. Izoleucil-tRNA-

sintetaze iz S. cerevisiae i E. coli ustupila je dr. sc. Morana Dulić.

2.1.6. Početnice

Početnice korištene u lančanoj reakciji polimeraze naručene su od komercijalnog proizvođača

(Sigma).

2.1.7. Komercijalni kompleti za pročišćavanje DNA

QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) za izolaciju plazmidne DNA, QIAquick Gel Extraction

Kit (Qiagen) za izolaciju DNA iz agaroznih gelova.

2.1.8. Hranjive podloge i medij za uzgoj bakterije E. coli i S. griseus

Tekuća hranjiva podloga Luria-Bertani (LB): 5 g/L kvaščev ekstrakt, 10 g/L tripton, 10 g/L

NaCl.

LB ploče: 5 g/L kvaščev ekstrakt, 10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 15 g/L agar.

Gornji agar: 5 g/L kvaščev ekstrakt, 10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 6 g/L agar

Hranjive podloge se steriliziraju autoklaviranjem i u njih se po potrebi dodaje antibiotik.

Antibiotik kanamicin se dodaje do konačne koncentracije 0,030 mg/mL, a antibiotik ampicilin

do 0,050 mg/mL.

2.1.9. Hranjive podloge i medij za uzgoj kvasca S. cerevisiae

Medij za kulture YPD: 20 g/L glukoza, 20 g/L pepton, 10 g/L kvaščev ekstrakt.

Ploče YPD za rast S. cerevisiae: 20 g/L glukoza, 20 g/L pepton, 10 g/L kvaščev ekstrakt, 20

g/L agar.

Hranjive podloge se steriliziraju autoklaviranjem.

MATERIJAL I METODE

24

2.1.10. Sojevi i plazmidi E. coli

2.1.10.1. Sojevi E. coli

BL21 (DE3) (F- ompT hsdSB (rB- mB

-) gal dcm (DE3); Novagen) je soj za prekomjernu

ekspresiju gena ukloniranih u ekspresijski vektor koji sadrži T7-promotor (pET serija vektora)

Soj sadrži gen za T7-RNA-polimerazu integriran u bakterijski kromosom koji je pod

kontrolom inducibilnog promotora lacUV5, koji se inducira dodatkom IPTG-a. Soj je

deficijentan za proteaze Lon i OmpT.

DH5α ((supE44 ΔlacU169 (Φ80 lacZ) ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi1 relA1): soj

koji se koristi za umnožavanje plazmidne DNA i za kloniranje. Zbog mutacije recA1 gena

onemogućena je homologna rekombinacija i popravak molekule DNA što je pogodno za

stabilnost transformirane DNA. Mutacijom endA1 gena koji kodira za endonukleazu I

izbjegava se nespecifična razgradnja DNA. α-komplementacija s amino-krajem β-

galaktozidaze iz pUC vektora moguća je zbog mutacije Φ80lacZ ΔM15.

2.1.10.2. Plazmidi za ekspresiju proteina u E. coli

Korišten je plazmid za prekomjernu ekspresiju proteina pET28b (Slika 2.1). Plazmid za

prekomjernu ekspresiju proteina je pod kontrolom inducibilnog T7-promotora. Eksprimirani

proteini mogu imati histidinski privjesak na N- ili C- kraju, što omogućuje pročišćavanje

afinitetnom kromatografijom na Ni-NTA agarozi. Plazmid nosi gen za rezistenciju na

antibiotik kanamicin.

MATERIJAL I METODE

25

Slika 2.1. Plazmidni vektor pET28.

Korišten je i plazmid za prekomjernu ekspresiju pET22 s ugrađenim genom za izoleucil-

tRNA-sintetazu iz E. coli kojeg je ustupila dr. sc. Morana Dulić. Plazmid nosi rezistenciju na

antibiotik ampicilin.

2.1.11. Soj S. cerevisiae

S2088α (MATα ura3-52 trp1 lys2-801 leu2∆1 his3-∆200 pep4::HIS3 prb-∆1.6R can1 GAL) -

haploidni soj kvasca korišten za prekomjernu ekspresiju rekombinantnih proteina, s

inaktiviranim genima za proteaze prA i prB.

2.1.12. Soj S. griseus

Korišten je divlji tip bakterije Streptomyces griseus griseus.

2.1.13. Ostali materijal

Ni-NTA agaroza (Qiagen), mikrotitarske pločice (Kisker), pločice za tankoslojnu

kromatografiju (eng. TLC plates) (Fluka), zaslon s uskladištenim fosforom (Amershan

Biosciences), filter papir (Whatman 3MM), filteri s promjerom pora 0,2 μm (Whatman),

celulozna membrana za dijalizu (D9277, Sigma), centrikoni Amicon® Ultra centrifugal filters

(Milipore), staklene kuglice veličine 150-212 µm (Sigma), [32P]PPi (Perkin Elmer).

MATERIJAL I METODE

26

2.2. Metode

2.2.1. Metode rada s nukleinskim kiselinama

Metode izolacije genomske DNA, izolacije plazmidne DNA, transformacija stanica

elektroporacijom, PCR, agarozna gel elektroforeza, izolacije ukupne tRNA i ostale metode

rada s nukleinskim kiselinama napravljene kao što je opisano u laboratorijskom priručniku J.

Sambrook i D. Russell-a: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. izdanje, Cold Spring

Harbor Laboratory Press (2001) ili prema uputama proizvođača prilikom korištenja

komercijalnih kompleta, ako nije navedeno drugačije.

2.2.1.1. Izolacija genomske DNA

5 mL zasićene kulture bakterije S. griseus nasađene u LB medij je centrifugirano 15 minuta

na 5000 g. Supernatant je odliven, a talog resuspendiran u 200 μL TE 10× pufera sastava 100

mmol dm-3 Tris-HCl, pH 8,0 i 10 mmol dm-3 EDTA. U suspenziju je dodano 400 μL staklenih

kuglica i 500 μL fenol-kloroforma. Suspenzija je miješana na vorteksu 4 minute. Slojevi su

odvojeni centrifugiranjem suspenzije 6 minuta na 13200 rpm u stolnoj centrifugi. Gornja

vodena faza je odvojena i ekstrahirana jednakim volumenom fenol-kloroforna. Smjesa je

miješana vorteksiranjem i slojevi su odijeljeni centrifugiranjem 6 minuta na 13200 rpm.

Odijeljena je vodena faza i dodan joj je jednak volumen izopropanola, kako bi se istaložila

genomska DNA. Smjesa je centrifugirana 20 minuta na 16000 g. Supernatant je odliven, a na

talog je dodano 200 μL 70 % etanola sobne temperature. Smjesa je lagano miješana, ali talog

nije resuspendiran. Smjesa je centrifugirana 15 minuta na 13200 rpm. Supernatant je odliven,

a talog je posušen u SpeedVac uređaju. Posušeni talog je otopljen u 200 μL TE 1× pufera (10

mmol dm-3 Tris-HCl, pH 8,0 i 1 mmol dm-3 EDTA). Dodana je RNaza, u finalnoj

koncentraciji 100 μg/mL, i smjesa je inkubirana 20 minuta na sobnoj temperaturi. Smjesa je

još jednom ekstrahirana jednakim volumenom fenol-kloroforna, miješana vorteksiranjem i

slojevi su odijeljeni centrifugiranjem 6 minuta na 13200 rpm. Vodena faza je odijeljena i u

nju je dodana smjesa koju čine finalno 10 % PEG8000, 300 mmol dm-3 NaCl, 10 mmol dm-3

MgCl2. PEG8000 se dodaje da bi se u otopini istaložila DNA. Smjesa je centrifugirana 15

minuta na 13200 rpm. Supernatant je odstranjen, a talog resuspendiran u 200 μL 70 %

etanolu. Smjesa je centrifugirana 10 minuta na 13200 rpm, supernatant je odliven, a talog je

posušen u SpeedVac uređaju, te je na kraju otopljen u 100 μL TE 1× puferu. 1 μL izolirane

DNA je naneseno na agarozni gel i provedena je elektroforeza radi provjere čistoće uzorka.

MATERIJAL I METODE

27

2.2.1.2. Gel-elektroforeza na agaroznom gelu

Metodom elektroforeze na agaroznom gelu se odvajaju nukleinske kiseline na temelju

različite veličine i oblika. Kako su sve nukleinske kiseline negativno nabijene pri neutralnom

pH zbog naboja na fosfatnim skupinama, ako se gel s nukleinskim kiselinama stavi u

električno polje, nukleinske kiseline će se gibati prema pozitivnoj elektrodi, anodi. Zbog

umrežene strukture gela manje nukleinske kiseline će putovati brže, dok će veće zaostajati.

Osim o veličini, brzina kretanja ovisi i o obliku molekula. Tako će se superzavijene cirkularne

nukleinske kiseline kretati brže od linearnih molekula iste veličine, a najsporije će se kretati

cirkularne relaksirane nukleinske kiseline.

U ovom radu za gel-elektroforezu na agaroznom gelu koristili su se 1 % agarozni gelovi,

pripremljeni otapanjem 3 g agaroze u 300 mL TAE pufera (40 mmol dm-3 Tris, 20 mmol dm-3

octena kiselina, 1 mmol dm-3 EDTA pH 8) u kojeg je dodan etidijev bromid do koncentracije

50 μg/L. U uzorke je prije nanošenja na gel dodana boja za nanošenje uzoraka (finalno 2,5 %

(w/v) bromfenolno plavilo, 0,01 mol dm-3 EDTA (pH 8,0), 3 % (v/v) glicerol) radi

vizualizacije brzine kretanja uzorka (bromfenolno plavilo) i olakšavanja nanošenja uzorka u

jažice (glicerol). Elektroforeza je provođena u TAE puferu u aparaturi za horizontalnu

elektroforezu (EPS 600, Pharmacia Biotech) pri naponu od 120 V, pri sobnoj temperaturi.

Uzorci su vizualizirani etidijevim bromidom koji se interkalira između baza u molekuli DNA

pri čemu mu se povećava intenzitet fluorescencije pod UV svjetlom (UV zračenje pri

λ = 254 nm apsorbira DNA i prenosi etidijevom bromidu, a zračenje pri λ = 302 i 366 nm

apsorbira sam etidijev bromid) (Sambrook i Russell, 2001). Etidijev bromid emitira tu

energiju kao svjetlost valne duljine 590 nm. Gelovi su analizirani i snimljeni pod UV svjetlom

(λ = 302 nm) transiluminatora (DNR, Bio-Imaging Systems Ltd.) povezanog s računalom. Za

procjenu veličine analiziranih fragmenata korišten je standard poznate veličine 1 kb DNA

Ladder (NEB).

2.2.1.3. Lančana reakcija polimeraze

Lančana reakcija polimeraze (PCR, eng. Polymerase chain reaction) je metoda kojom se in

vitro umnažaju specifični sljedovi molekula DNA. Reakcija se temelji na ponavljanju velikog

broja ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze: denaturacija kalupa da se lanci dvolančane

DNA odvoje, sparivanje početnica na komplementarne sljedove na DNA kalupu, te na kraju

produljenje lanca DNA katalizirano termostabilnom DNA-polimerazom. Kako se u svakom

ciklusu količina molekula DNA specifičnog slijeda poveća dva puta, nakon n ciklusa postoji

2n kopija molekule DNA. PCR se u ovom radu koristio za umnažanje gena za IleRS iz

MATERIJAL I METODE

28

bakterije S. griseus. Kao kalup je korištena ranije izolirana genomska DNA. Korištene su

početnice navedene u Tablici 2.1.

Tablica 2.1. Početnice korištene za umnažanje gena za IleRS iz S. griseus, s dodanim mjestima za rezanje

restrikcijskim enzimima BamHI i NdeI. Mjesta cijepanja su podcrtana: mjesto za BamHI G GATC C, a za

NdeI CA TA TG. Podebljani su start i stop kodoni.

Naziv početnice Nukleotidni slijed (5' 3') IRS_Sg_F GAGAGAGCATATGACATCGCCGCAG IRS_Sg_R GAGAGAGGGATCCCTACTACTACCGCTTGCGCAGGCG

Korištena je Phusion DNA-polimeraza, a zbog visokog udjela GC parova baza u genomu

korišten je GC pufer (NEB) i dimetilsulfoksid (DMSO). Preparativna reakcijska smjesa za

PCR volumena 50 μL sadržavala je sljedeće: 5 μL genomske DNA (kalupa) koncentracije 10

ng/ μL, po 2,5 μL početnica IRS_Sg_F i IRS_Sg_R koncentracija 10 μmol dm-3, 10 μL GC 5×

pufera, 5 μL 2 mmol dm-3 dNTPs, 2,5 μL DMSO, 21 μL ReH2O. U reakcijsku smjesu dodano

je 1,5 μL laboratorijske preparacije Phusion polimeraze, što je određeno optimacijom metode.

Zbog velikog udjela GC parova baza i potencijalnog formiranja elemenata sekundarne

strukture na početnicama (provjereno pomoću programa OligoCalc), uvjeti PCR-a su

optimirani na sljedeći način: za prvih 10 ciklusa od ukupno 30, temperatura pri kojoj se vrši

sparivanje početnica se svakim ciklusom smanjivala po 1 °C, od 72 °C do 63 °C, a zadnjih 20

ciklusa se temperatura sparivanja vratila na početnih 72 °C. Ostali uvjeti nisu znatnije

odstupali od uvjeta koji se inače koriste s Phusion DNA-polimerazom. Program i uvjeti

reakcije su navedeni u Tablici 2.2. PCR se izvodio u uređaju za gradijentni PCR Mastercycler

gradient (Eppendorf).

MATERIJAL I METODE

29

Tablica 2.2. Uvjeti i program lančane reakcije polimareze za umnažanje gena za IleRS iz S. griseus.

Korak Temperatura/°C Trajanje Broj ciklusa Početna denaturacija 98 3 minute 1

Denaturacija 98 10 sekundi

10 Vezanje početnica 72, u svakom ciklusu

1 °C manje 30 sekundi

Produljenje lanca 72 1,5 minuta Denaturacija 98 10 sekundi

20 Vezanje početnica i

produljenje lanca 72 2 minute

Završno produljenje 72 10 minuta 1

Nakon lančane reakcije polimeraze ukupna smjesa je nanesena na agarozni gel. Nakon

provedene elektroforeze, PCR produkt željene veličine (uspoređeno s markerom veličine) je

izoliran iz gela pomoću komercijalno dostupnog kompleta QIAquick Gel Extraction Kit

(Qiagen) za izolaciju DNA iz agaroznih gelova, prema uputama proizvođača.

2.2.1.4. Razgradnja restrikcijskim endonukleazama

Restrikcijske endonukleaze su enzimi koji su dio restrikcijsko-modifikacijskog sustava u

prokariotima. Glavna zadaća u prokariotskim organizmima im je zaštita domaćina od strane

DNA, na primjer one iz bakteriofaga. U znanstvenim istraživanjima se standardno koriste

restrikcijske endonukleaze tipa II. Ovaj tip enzima prepoznaje palindromske sljedove od 4 do

8 nukleotida i u prisustvu iona Mg2+ reže dvolančanu DNA te nastaju ljepljivi ili tupi krajevi

(Pingoud i Jeltsch 2001). U ovom radu su PCR produkt i plazmid za ekspresiju pET28b

razgrađeni restrikcijskim endonukleazama da bi se dobiveni međusobno komplementarni

ljepljivi krajevi zatim ligirali. Korišteni su enzimi NdeI i BamHI HF. Reakcijska smjesa za

razgradnju PCR produkta je sadržavala oko 0,7 ng PCR produkta, pufer NEB4 (sastava

50 mmol dm-3 KOAc, 20 mmol dm-3 Tris-acetat, 10 mmol dm-3 MgOAc, 1 mmol dm-3 DTT,

pH 7.9) i po 20 U oba restrikcijska enzima. Smjesa za razgradnju vektora je sadržavala 0,7 ng

vektora, pufer NEB4 i po 20 U oba restrikcijska enzima. Smjese su inkubirane 4 sata na

37 °C.

MATERIJAL I METODE

30

2.2.1.5. Ligacija

Pocijepani PCR produkt i vektor su pomiješani u molarnom omjeru 3:1, uz 20 U T4-DNA-

ligaze i pufer za T4-DNA-ligazu (Fermentas). Smjesa se inkubira 1 sat na 22 °C. Nakon toga

je slijedila inaktivacija T4-DNA-ligaze 10 minuta na 65 °C. Po 4 μL ligacijske smjese je

elektroporirano u BL21 soj E. coli stanica.

2.2.1.6. Transformacija bakterijskih stanica elektroporacijom

Transformacija je proces unošenje strane DNA u stanicu. Jedan od načina transformacije

stanica je elektroporacija. U ovom procesu jakim električnim pulsom kratkotrajno se

povećava propusnost stanične stijenke za molekule DNA. Za elektroporaciju je korišten

uređaj Gene Pulser (Bio-Rad), čiji su parametri postavljeni na napon 2500V i kapacitet 25 μF,

te uređaj za nadzor pulsa (Pulse Controller, Unit Bio-Rad) s otporom 200 Ω. Nosač kiveta,

kivete i stanice su za proces elektroporacije bile ohlađene, s obzirom da efikasnost tehnike

ovisi o temperaturi. Elektrokompetentnim stanicama E. coli dodano je 1-50 ng DNA te je

primijenjen električni puls od 2,5 kV/cm, pri čemu je vrijeme pražnjenja kondenzatora bilo 4-

4,5 ms. Nakon transformacije u kivete je dodan 1 mL LB medija, i stanice su inkubirane 1 sat

na 37 °C. Nakon inkubacije 100 μL stanične suspenzije iz LB medija je nasađeno na LB

ploče, koje su sadržavale antibiotik kanamicin. Kako su u ovom radu elektroporirani

konstrukti vektora pET28b koji nosi gen za rezistenciju na antibiotik kanamicin, samo stanice

koje su u sebi imale plazmid su narasle na takvim pločama. Ploče su rasle 16 sati na 37 °C.

2.2.1.7. Izolacije plazmidne DNA

Plazmidna DNA je izolirana pomoću komercijalno dostupnog kompleta QIAprep Spin

Miniprep Kit (Qiagen) prema uputama proizvođača. Metoda se temelji na klasičnoj alkalnoj

lizi. Iz otopina plazmidne DNA se uklanjaju proteini i genomska DNA, a plazmidna DNA se

veže na membranu, ispire i na kraju eluira. Izoliran je plazmid pET28b s ugrađenim genom za

IleRS iz S. griseus.

2.2.1.8. Restrikcijska analiza

Radi provjere ugradnje gena u plazmid obavljena je restrikcijska analiza. Plazmid je pocijepan

restrikcijskim endonukleazama BamHI i NdeI, koje cijepaju plazmid s ugrađenim genom na

mjestima ugradnje inserta. Reakcijska smjesa je sadržavala po 10 U svakog enzima,

odgovarajući pufer i 0,75 μg plazmidne DNA. Smjesa je inkubirana 2 sata na 37 °C, zatim je

nanesena na agarozni gel i provedena je elektroforeza.

MATERIJAL I METODE

31

2.2.1.9. Određivanje koncentracije nukleinskih kiselina

Koncentracije uzoraka nukleinskih kiselina su određene na spektrofotometru NanoDrop 1000,

mjerenjem apsorbancije pri 260 nm. Definirano je da kada je uz duljinu puta zračenja 1 cm

apsorbancija pri 260 nm jednaka 1, koncentracija dvolančane DNA iznosi 50 ng/μL, a

koncentracija RNA jednaka je 40 ng/μL (Sambrook i Russell 2001).

2.2.1.10. Analiza nukleotidnih sljedova dobivenih sekvenciranjem

Radi potvrde ugradnje gena za IleRS iz S. griseus u plazmid pET28b, sekvenciran je slijed

inserta u plazmidu. Za sekvenciranje je korištena početnica slijeda 5'-

TAATACGACTCACTATAGGG -3', koja se veže na T7-promotor na plazmidu pET28b.

Nukleotidni sljedovi sekvencirani su u DNA-servisu Instituta Ruđer Bošković na

četverokapilarnom sekvenatoru ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied

Biosystems).

2.2.1.11. Izolacija i pročišćavanje ukupne stanične tRNA

Za potrebe kinetičkih eksperimenata bilo je potrebno izolirati ukupnu staničnu tRNA iz

bakterije S. griseus, dok su ukupne stanične tRNA iz E. coli i S. cerevisiae komercijalno

dostupne (Roche). Nasađeno je 500 mL kulture S. griseus u LB mediju na 30 °C. Kultura je

rasla 3 dana. Stanice su oborene centrifugiranjem 15 minuta na 5000 g, supernatant je

odstranjen, a na talog stanica je dodano 15 mL pufera za izolaciju tRNA (10 mmol dm-3 Tris-

HCl pH 8,0, 10 mmol dm-3 magnezijev acetat). Dodan je jednak volumen fenola zasićenog

vodom, te oko 5 mL staklenih kuglica za razbijanje stanica i smjesa je miješana

vorteksiranjem. Slojevi su odvojeni centrifugiranjem 15 minuta na 10000 g, nakon čega je

vodeni sloj odijeljen i ekstrahiran jednakim volumenom fenol-kloroforma. Smjesa je miješana

potreskivanjem, i ponovno su slojevi odvojeni centrifugiranjem. U donji, fenolni i fenol-

kloroformni sloj dodan je pufer za izolaciju tRNA, te su ponovno ekstrahirani, radi većeg

prinosa tRNA. Vodeni slojevi su spojeni i u njih je dodan PEG8000 u finalnom w/v udjelu od

8 % uz NaCl konačne koncentracije 0,5 mol dm-3, radi taloženja nukleinskih kiselina velikih

molekulskih masa (DNA, mRNA, rRNA). Nakon inkubacije 10 minuta, smjesa je

centrifugirana 15 minuta na 10000 g. Supernatant u kojem je tRNA je odijeljen od taloga u

kojem su veće nukleinske kiseline. Ukupna stanična tRNA je istaložena dodatkom natrijevog

acetata pH 4,8 do finalne koncentracije 0,3 mol dm-3, te zatim 2,5 volumena etanola, na

-20 °C preko noći. Sljedeći dan uzorak je centrifugiran 1 sat na 10000 g, supernatant je

odstranjen, a talog je osušen. Kako je izolirana tRNA vjerojatno aminoacilirana, potrebno ju

je deacilirati. Deacilacija se odvijala u lužnatim uvjetima, otapanjem taloga u 0,125 mol dm-3

MATERIJAL I METODE

32

Tris-HCl pH 8,5 i inkubacijom 1,5 h na 37 °C. Reakcija deacilacije je zaustavljena

zakiseljavanjem octenom kiselinom do konačnog pH oko 5. Nakon toga uzorak je dijalizom

preveden u redestiliranu vodu. Polupropusna celulozna membrana pripremljena je kuhanjem

1 minutu na 100 °C u 1 mmol dm-3 EDTA (kelirajući agens) radi uklanjanja metala s njene

površine. Uzorak je stavljen u crijevo i dijaliziran prema redestiliranoj vodi. Dijaliza se vršila

u 3 obroka po 1,5 L, prvi i treći su trajali 3 sata, a drugi je ostavljen preko noći pri 4 °C.

Koncentracija izolirane tRNA određena je spektrofotometrijski na spektrofotometru

NanoDrop 1000 mjerenjem apsorbancije pri 260 nm.

MATERIJAL I METODE

33

2.2.2. Metode rada s proteinima

2.2.2.1. Prekomjerna ekspresija proteina

Za prekomjernu ekspresiju proteina IleRS iz S. griseus korišten je ekspresijski sustav T7. T7-

polimeraza koja je ugrađena u genom soja BL21 (DE3) stanica E. coli ključna je komponenta

ovog sustava. T7-RNA-polimeraza se veže na T7-promotor i transkribira gene pod njegovom

kontrolom. Plazmid pET28b koji je korišten u ovom radu sadrži T7-promotor uzvodno od

gena koji je ugrađen u njega (Studier i Moffatt 1986). Gen l koji kodira za T7-polimerazu u

genomu BL21 soja je pod kontrolom lacUV5 promotora. Dodatak IPTG-a aktivira ekspresiju

T7-RNA-polimeraze, a time i transkripciju sljedova koji su pod kontrolom T7-promotora. T7-

promotor ispred gena ugrađenog u plazmid također je reguliran dodatkom IPTG-a, pa

dodatkom tog induktora dolazi do prekomjerne ekspresije proteina kodiranog genom koji je

nizvodno od T7-promotora.

Bakterijske stanice E. coli, soja BL21 (DE3) transformirane elektroporacijom pET28b

plazmidom s ugrađenim genom za IleRS iz S. griseus nasađene su u LB medij s antibiotikom

kanamicinom (jer ovaj plazmid nosi gen za rezistenciju na taj antibiotik) i 0,5 % glukozom na

30 °C, i ostavljene rasti preko noći. Ujutro je predkultura razrijeđena 100 puta, i 5 mL je

inokulirano u 500 mL LB medija s kanamicinom na tresilicu na 30 °C. Rast je praćen

mjerenjem optičke gustoće kulture na spektrofotometru Evolution 60S, Thermo pri valnoj

duljini od 600nm (OD600). Nakon što je kultura dosegla optičku gustoću od OD600 = 0,6 dodan

je IPTG finalne koncentracije 250 μmol dm-3. Kultura je ostavljena preko noći na tresilici na

15 °C nakon indukcije. Sljedeći dan bakterijske kulture su centrifugirane 15 minuta na 5000 g

pri 4 °C. Supernatanti su uklonjeni, a bakterijski talozi spremljeni na -20 °C.

2.2.2.2. Afinitetna kromatografija

Stanični talog je resuspendiran u 5 mL pufera A za pročišćavanje proteina afinitetnom

kromatografijom (20 mmol dm-3 Hepes pH 7,0, 500 mmol dm-3 NaCl, 5 mmol dm-3 MgCl2,

10 mmol dm-3 β-merkaptoetanol) pri 4 °C. Suspenziji je dodan 1 mmol dm-3 PMSF, inhibitor

serinskih proteaza, 3 ng/μL DNaza i 50 ng/μL lizozim, radi boljeg liziranja stanica. U dio

uzoraka je prije soniciranja dodan deterdžent Nonidet P-40 (NP-40), 2 μL na ukupno 2 mL

suspenzije. Stanična suspenzija je sonicirana u sonikatoru High Intensity Ultrasonic

Processor, Bioblock Scientific, 6 puta po 1 minutu, uz pauze od 1 minute između svakog

soniciranja, pri 4 °C. Lizat je centrifugiran 1 sat na 10000 g pri 4 °C. Supernatant u kojem se

nalaze otopljeni proteini je odvojen i profiltriran kroz filter veličine pora 0,22 μm (Whatman).

MATERIJAL I METODE

34

Tako pripremljeni uzorci spremni su za afinitetnu kromatografiju. Afinitetna kromatografija

na Ni-NTA agarozi je relativno jednostavna metoda pročišćavanja proteina koji na sebi imaju

privjesak od 6 aminokiselina histidina. Stacionarnu fazu u ovoj kromatografiji čini NTA-

agaroza, pri čemu je NTA nitrilotrioctena kiselina, tetradentatni kelirajući adsorbens koji

okupira četiri od šest koordinacijskih mjesta niklovog iona (Ni2+), vezana na Sepharose® CL-

6B (Qiagen 2003). Preostala dva koordinacijska mjesta interagiraju s atomima dušika iz

imidazolnog prstena histidina iz histidinskog privjeska proteina. Za eluciju proteina s kolone

se koristi sam imidazol koji može interagirati s ionima nikla. Da bi se spriječilo vezanje

drugih staničnih proteina koji u sebi imaju histidin u sve pufere za pročišćavanje se dodaje

mala koncentracija imidazola, što ne utječe na vezanje proteina s privjeskom od 6 histidina.

Za pročišćavanje su korišteni puferi A, B i C sastava 20 mmol dm-3 Hepes pH 7,0, 500 mmol

dm-3 NaCl, 5 mmol dm-3 MgCl2, 10 mmol dm-3 β-merkaptoetanol, koji se međusobno

razlikuju samo po rastućoj koncentraciji imidazola, koja je 10 mmol dm-3 kod pufera A,

20 mmol dm-3 kod pufera B, i 200 mmol dm-3 kod pufera C. U otopine je dodan β-

merkaptoetanol konačne koncentracije 10 mmol dm-3. 1 mL Ni-NTA agaroze je ispran s

10 mL sterilne redestilirane vode i uravnotežen propuštanjem 10 mL pufera A. Uzorak je

nanesen 3 puta, radi što boljeg vezanja. Slijedilo je ispiranje s puferom A (30 mL) i puferom

B (10 mL). Protein je eluiran s kolone pomoću pufera C. Sakupljeni uzorci su naneseni na

SDS gel, a kolona za afinitetnu kromatografiju je regenerirana ispiranjem s 2 mL 2 mol dm-3

imidazola, 30 mL redestilirane vode, i 10 mL 20 % etanola. Čitav postupak afinitetne

kromatografije na Ni-NTA agarozi se izvodio na 4 °C, u ledenici.

2.2.2.3. Poliakrilamidna gel-elektroforeza u prisustvu natrijevog dodecilsulfata

Poliakrilamidna gel-elektroforeza u prisustvu natrijevog dodecilsulfata (SDS-PAGE) je

metoda za analizu proteinskih uzoraka. SDS-PAGE je vrsta denaturirajuće elektroforeze, u

kojoj se negativno nabijeni SDS ravnomjerno veže na proteine, zbog čega svi proteini imaju

jednak omjer mase i naboja. Zbog toga se različita pokretljivost proteina u poliakrilamidnom

gelu temelji na razlikama u masi, dok naboj koji je bio prisutan na proteinima ne bi trebao

imati utjecaja. U ovom radu korišteni su diskontinuirani gelovi – razlikuju se gornji gel za

sabijanje i donji gel za razdvajanje. Donji gel je za razdvajanje bio je sastava 9 % akrilamid-

bisakrilamid (29:1), 0,375 mol dm-3 Tris-HCl pH 8,8, 0,1 % (w/v) SDS, 0,7 μg/mL APS,

0,05 % TEMED, a gornji gel za sabijanje sastava 4 % akrilamid-bisakrilamid (29:1),

0,125 mol dm-3 Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 % (w/v) SDS, 0,7 μg/mL APS, 0,05 % TEMED.

Nakon izlijevanja donjeg gela, na gel je dodana voda, radi sprječavanja interakcije s

MATERIJAL I METODE

35

atmosferskim kisikom koji inhibira polimerizaciju i poravnavanja površine gela. Nakon

polimerizacije, voda je odlivena i izliven je gornji gel. Uzorci su prije nanošenja pomiješani s

bojom za nanošenje uzoraka sastava 62,5 mmol dm-3 Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mmol dm-3

β-merkaptoetanol, 6,25 % (v/v) glicerol, 1,25 % (w/v) SDS, 0,002 % bromfenolno plavilo, te

su grijani 5 minuta na 100 °C. Uz uzorke na gel je nanesen marker veličine Precision Plus

Protein Standards, Unstained (Bio-Rad). Elektroforeza se odvijala u puferu pH 8,3 sastava

14,4 g/L glicin, 3,03 g/L Tris, 0,1 % (w/v) SDS na sobnoj temperaturi, u uređaju PROTEAN

TETRA (Bio-Rad). Uzorci su se sabijali 15 minuta pri 120 V, a razdvajali su se sljedećih

45 minuta pri 180 V.

Gel je inkubiran pola sata u otopini boje Coomassie Brillant Blue R-250 (2,5 g/L boja, 10 %

octena kiselina, 45 % etanol) radi vizualizacije proteina, nakon čega je uslijedilo odbojavanje

u vrućoj vodi.

2.2.2.4. Ultrafiltracija

Ultrafiltracija je metoda kojom se pomoću centrifugiranja kroz filter povećava koncentracija

proteinske frakcije. Djelovanjem centrifugalne sile dolazi do ultrafiltriranja čestica manjih

molekulskih masa kroz anizotropnu membranu, dok proteini zbog veće mase, tj. veličine ne

mogu proći. Postupno se smanjuje volumen uzorka koji ne može proći kroz filter pa dolazi do

povećanja koncentracije proteina u tom volumenu. Korišteni su Amicon® Ultra centrifugal

filters (Milipore) s porama kroz koje prolaze samo čestice manje od 30 kDa. Uzorci su

centrifugirani na 10000 g pri 4 °C.

2.2.2.5. Dijaliza

Polupropusna celulozna membrana pripremljena je kuhanjem 1 minute na 100 °C u 1 mmol

dm-3 EDTA (kelirajući agens) radi uklanjanja metala s njene površine. Proteinski uzorak je

stavljen u crijevo i dijaliziran prema puferu za dijalizu sastava, 20 mmol dm-3 Tris-HCl

(pH 7,5), 50 mmol dm-3 NaCl, 5 mmol dm-3 β-merkaptoetanol, 10 % (v/v) glicerol. Dijaliza se

vršila u 3 obroka po 1,5 L, prvi i treći su trajali 3 sata, a drugi je ostavljen preko noći.

2.2.2.6. Određivanje koncentracije proteina

Koncentracije uzoraka proteina su određene na spektrofotometru NanoDrop 1000, mjerenjem

apsorbancije pri 280 nm. Za određivanje koncentracije su korištene molekulska masa proteina

i molarni apsorpcijski koeficijent. Kako je određeno pomoću programa ExPASy, molekulska

masa IleRS je 117 kDa, a molarni apsorpcijski koeficijent je 222940 mol-1 dm3 cm-1.

MATERIJAL I METODE

36

2.2.3. Kinetičke metode

Dijelove eksperimenata koji uključuju rad s radioaktivnim materijalom izvodila je

dr. sc. Morana Dulić.

2.2.3.1. Aktivacija aminokiselina mjerena ATP/PPi izmjenom

ATP/PPi izmjena je enzimski test kojim se mjeri brzina prvog koraka reakcije

aminoaciliranja, aktivacije aminokiseline:

ATP + aa ⇄ aa-AMP + PPi

aa-AMP + [32P]PPi → [32P]ATP + aa

Metoda se temelji na ugradnji [32P], koji je prvotno prisutan u molekuli PPi, u ATP povratnom

reakcijom pirofosforolize. Do povratne reakcije dolazi zbog visoke koncentracije PPi u

reakcijskoj smjesi. Brzina nastajanja radioaktivno obilježenog ATP funkcija je brzine sinteze

aminoacil-adenilata i pirofosforolize.

U ovom radu mjerena je izmjena ATP/PPi u ustaljenom stanju za aktivaciju pripadne

aminokiseline izoleucina i nepripadne aminokiseline valina, kataliziranu enzimom SgIleRS.

Reakcijsku smjesu čine 57,5 mmol dm-3 Hepes pH 7,5, 20 mmol dm-3 MgCl2, 4 mmol dm-3

ATP, 1 mmol dm-3 Na[32P]PPi (specifična radioaktivnost 0,2-0,4 μCi/μmol), 5 mmol dm-3

DTT, 0,15 mg/mL BSA te aaRS i aminokiselina. Enzim je razrijeđen do željene koncentracije

u puferu sastava 1 mg/mL BSA, 50 mmol dm-3 Hepes pH 7,5 i dodavano je uvijek 3 μL

razrijeđenog enzima na ukupno 20 μL, pa je s njim dodano 7,5 mmol dm-3 Hepes pH 7,5 i

0,15 mg/mL BSA. Finalna koncentracija enzima je bila 0,1 μmol dm-3 za reakciju s obje

aminokiseline. Koncentracije aminokiselina su se kretale od 0,1 Km do 10 Km, prema

procjenama iz probnih reakcija. Reakcije su se odvijale pri 30 °C. Reakcija je započinjala

dodavanjem aminokiselina u reakcijsku smjesu. Nakon određenih vremenskih perioda

reakcija se zaustavljala dodatkom 1,5 μL reakcijske smjese u 3 μL otopine za zaustavljanje

koja je sadržavala 500 mmol dm-3 natrijev acetat i 0,1 % SDS. 1,5 μL te smjese je naneseno

na aktivirane pločice za tankoslojnu kromatografiju (Fluka). Pločice se aktiviraju razvijanjem

u redestiliranoj vodi i sušenjem. Na pločici se vršilo razdvajanje [32P]PPi, [32P]ATP i [32P]Pi u

puferu za razvijanje sastava 750 mmol dm-3 KH2PO4, pH 3,5 i 4 mol dm-3 ureja. Nakon

razdvajanja, pločice su posušene i preko noći izložene na zaslonu s uskladištenim fosforom,

koji je potom snimljen na uređaju Phosphor Imager Typhoon 9410. Rezultati su kvantificirani

u programu ImageQuant 5.2. Iz rezultata su određene početne brzine nastanka ATP-a, v0, pri

MATERIJAL I METODE

37

različitim koncentracijama aminokiselina. Iz toga su uz pomoću programa GraphPad Prism 4

određeni parametri Km i kcat nelinearnom regresijom prema jednadžbi Michaelis-Menten.

Jednadžba Michaelis-Menten vrijedi u uvjetima ustaljenog stanja kada su koncentracije

međuprodukta stalne i glasi: 𝑣0 = 𝑉max × [S]𝐾m + [S]

, gdje je v0 početna brzina, Vmax je maksimalna

brzina, [S] je početna koncentracija supstrata (ovdje aminokiseline), a Km je Michaelisova

konstanta. kcat je obrtni broj enzima i definira se kao maksimalni broj molekula supstrata koje

se pretvore u produkt po aktivnom mjestu enzima u jedinici vremena u uvjetima zasićenja

enzima supstratom.

Kako se izmjena ATP/PPi mjeri u odsutnosti tRNA, parametri dobiveni ovom metodom ne

moraju odgovarati brzini aktivacije u prisutnosti tRNA.

2.2.3.2. Aminoaciliranje uz [14C]aminokiselinu

Mjerenje brzine aminoaciliranja podrazumijeva mjerenje brzine ukupne reakcije. Za

određivanje aminoacilacijske aktivnosti koriste se radioaktivno obilježeni supstrati. U ovom

radu korištena je radioaktivno obilježena aminokiselina izoleucin, [14C]Ile. Produkt

aminoaciliranja s [14C]aminokiselinom je radioaktivno obilježena aminoacil-tRNA, u ovom

slučaju [14C]Ile-tRNAIle:

ATP + [14C]Ile + tRNAIle → [14C]Ile-tRNAIle + PPi + AMP

Za aminoaciliranje je korišten pufer sljedećeg sastava: 20 mmol dm-3 Hepes pH 7,5, 100 μmol

dm-3 EDTA, 150 mmol dm-3 NH4Cl, 10 μg/mL BSA, 10 mmol dm-3 MgCl2, 2 mmol dm-3

ATP. Reakcije su se odvijale na 30 °C. Ako nije drugačije navedeno, koncentracije tRNAIle su

bile 5 ili 10 μmol dm-3, određeno prema akceptorskoj aktivnosti ukupne stanične tRNA

(opisano u poglavlju 2.3.3.3.). Za E. coli i S. cerevisiae su korištene komercijalno dostupne

ukupne stanične tRNA (Roche), dok je ukupna tRNA iz S. griseus izolirana prema opisanom

protokolu (poglavlje 2.2.1.11.). Koncentracije enzima su odabrane tako da se u željenom

vremenskom rasponu pratio linearni porast koncentracije produkta. Ovisno o tome je li

mjerena brzina heterolognog ili homolognog aminoaciliranja korištene su različite

koncentracije enzima. Finalne koncentracije su se kretale od 25 nmol dm-3 do 1 μmol dm-3 za

EcIleRS, 50 nmol dm-3 do 1 μmol dm-3 za ScIleRS i 50 nmol dm-3 do 1 μmol dm-3 za

SgIleRS. Enzimi su do željenih koncentracija razrijeđeni u puferu sastava 10 mmol dm-3

Hepes pH 7,5 i 25 mmol dm-3 NaCl, čime je njihova ukupna koncentracija u reakciji bila

MATERIJAL I METODE

38

22,5 mmol dm-3 za Hepes pH 7,5 i 5,6 mmol dm-3 za NaCl. U svakoj reakciji korišten je

finalno 30 μmol dm-3 [14C]Ile, specifične aktivnosti 50 μCi/umol.

Reakcije aminoaciliranja su započinjale dodavanjem enzima u reakcijsku smjesu, a

zaustavljene su nanošenjem alikvota reakcijske smjese na komadiće filter-papira (Whatman

3MM), koji su zatim uronjeni u hladnu trikloroctenu kiselinu (TCA) koncentracije 100 g/L.

TCA uzrokuje taloženje makromolekula. Da bi se uklonili ostaci radioaktivne aminokiseline s

filter-papira, a ostala samo aa-tRNA, papirić se ispirao 10 minuta u 100 g/L TCA, zatim dva

puta po 5 minuta u 50 g/L TCA. Isprani papirići su posušeni, te su uronjeni u scintilacijsku

otopinu sastava 5 g/L PPO (2,5-difenil oksazol) i 0,3 g/L POPOP (1,4-bis(2-(4-metil-5-

fenil)oksazolil)benzen u toluenu. Količina radioaktiviteta, koja je proporcionalna količini

nastale aa-tRNA je izmjerena u scintilacijskom brojaču. Da bi se odredila koncentracija

nastale radioaktivno obilježene aa-tRNA, napravljen je baždarni pravac s poznatim

količinama radioaktiviteta. Slijepa proba, reakcijska smjesa bez tRNA, služila je kao kontrola

ispiranja radioaktivnih aminokiselina (nevezanih na tRNA) s papirića. Količina radioaktiviteta

koja se dobila u slijepoj probi oduzima se od izmjerenih vrijednosti za druge reakcije.

2.2.3.3. Određivanje akceptorske aktivnosti tRNA

Određivanje akceptorske aktivnosti tRNA se vršilo u svrhu određivanja udjela tRNAIle u

ukupnoj staničnoj tRNA. Radi se o modificiranoj verziji aminoaciliranja, gdje se dodaje veća

količina enzima, kako bi se sva tRNAIle aminoacilirala. Reakcija se prati nakon izlaska iz

ustaljenog stanja, kad se količina obilježene tRNA ustalila. U ovom radu koristio se 2 μmol

dm-3 enzim, a koncentracija tRNAIle se kretala oko 1 μmol dm-3 (procijenjeno na temelju

probnih određivanja akceptorskih aktivnosti ukupne tRNA). Korišten je finalno 30 μmol dm-3

[14C]Ile, specifične aktivnosti 100 μCi/umol i pufer sastava: 20 mmol dm-3 Hepes pH 7,5,

100 μmol dm-3 EDTA, 150 mmol dm-3 NH4Cl, 10 μg/mL BSA, 10 mmol dm-3 MgCl2,

2 mmol dm-3 ATP (zbog prisutnosti 10 mmol dm-3 Hepes pH 7,5 i 25 mmol dm-3 NaCl u

puferu za razrjeđenje enzima konačna koncentracija u reakciji je bila 22,5 mmol dm-3 za

Hepes pH 7,5 i 5,6 mmol dm-3 za NaCl. Osim duljine vremena reakcije, reakcija se izvodila

kao ranije opisana reakcija aminoaciliranja.

MATERIJAL I METODE

39

2.2.4. Testiranje osjetljivosti na antibiotik mupirocin

2.2.4.1. Difuzijski test osjetljivosti na antibiotik mupirocin

Kulture E. coli (soj DH5α), S. griseus (divlji tip) i S. cerevisiae (soj S2088α) su nasađene u

tekuće hranjive medije, koji je za bakterije E. coli i S. griseus bio LB medij, a za S. cerevisiae

YPD medij. Kultura E. coli je rasla 16 sati na 37 °C do zasićenja, a kulture S. griseus i S.

cerevisiae po 3 dana na 30 °C. Po 50 μL zasićenih kultura nasađeno je na krute hranjive

podloge, E. coli i S. griseus na LB ploče, a S. cerevisiae na YPD ploče. U središtu nasađenih

ploča izbušen je bazenčić promjera ~5 mm u koji je dodana otopina s mupirocinom.

Mupirocin je otopljen u 96 % etanolu do koncentracije 0,5 mol dm-3. Otopina koja se koristila

za difuzijski test je sadržavala: 200 mmol dm-3 Tris pH 8,0, 10 % etanol i 50 mmol dm-3

mupirocin. Radi kontrole potencijalne toksičnosti etanola na rast stanica, napravljeni su

eksperimenti gdje je u bazenčić dodana otopina sastava 200 mmol dm-3 Tris pH 8,0, 10 %

etanol, bez mupirocina. U bazenčiće je dodano po 100 μL otopine. Ploče s E. coli su

inkubirane 16 sati na 37 °C, ploče s S. griseus 16 sati na 30 °C, a ploče S. cerevisiae su

inkubirane na 30 °C i ostavljene su rasti nekoliko dana.

2.2.4.2. Komplementacijski test

Ekspresijski vektor pET28b s ugrađenim SgIleRS elektroporiran je u soj BL21 bakterije E.

coli. Radi kontrole u isti soj je elektroporiran vektor pET22 s ugrađenim EcIleRS. U po 5 mL

tekućeg LB medija nasađene su stanice E. coli s elektroporiranim SgIleRS, stanice E. coli s

elektroporiranim EcIleRS, i stanice E. coli u koje je elektroporiran vektor bez ugrađenog gena

za IleRS. Mediji sa stanicama su ostavljeni rasti preko noći na 37 °C. Po 100 μL noćnih

predkultura je dodano u 3,5 mL tekućeg gornjeg agara. U tekući gornji agar je dodan i IPTG

finalne koncentracije 10 μmol dm-3. U smjesu sa stanicama koje imaju elektroporiran vektor s

ugrađenim IleRS iz S. griseus dodan je antibiotik kanamicin konačne koncentracije

0,030 mg/mL. Kanamicin je u ovom slučaju u istoj koncentraciji bio prisutan i u donjem

agaru. Smjese su promiješane, i izlivene na LB ploče. Nakon hlađenja u središtu ploča

izbušen je bazenčić promjera ~5mm u koji je dodana otopina s mupirocinom, kako je opisano

u prethodnom poglavlju.

REZULTATI

40

3. Rezultati

3.1. Kloniranje gena za IleRS iz bakterije S. griseus Genomska DNA iz bakterije S. griseus koja je poslužila kao kalup za lančanu reakciju

polimeraze izolirana je kako je opisano u poglavlju 2.2.1.1. Materijala i metoda. Slika 3.1

prikazuje elektroforezu na agaroznom gelu izolirane genomske DNA.

3.1. Elektroforeza na agaroznom gelu izolirane genomske DNA iz S. griseus (G) uz marker veličina (M)

(veličine vrpci: 500 pb (parova baza), 1000 pb, 1500 pb, 2000 pb, 3000 pb, 4000 pb, 5000 pb, 6000 pb, 8000 pb,

10000 pb).

Koncentracija izolirane genomske DNA je bila 124 ng/μL, a za potrebe PCR-a je razrijeđena

na 10 ng/μL.

3.1.1. PCR

Gen za SgIleRS željeli smo ugraditi u plazmid pET28b. Plazmid pET28b je ekspresijski

vektor i omogućuje ekspresiju proteina s His-privjeskom na N-kraju ugrađenog proteina.

Prilikom osmišljavanja početnica pazilo se da gen za IleRS bude ugrađen u vektor u točnom

okviru čitanja i u pravilnoj orijentaciji. Gen za SgIleRS je specifično umnožen lančanom

reakcijom polimeraze uz pomoć početnica i u uvjetima navedenim u poglavlju 2.2.1.3.

Materijala i metoda. Početnice koje su se koristile za PCR su osmišljene s dodanim mjestima

za razgradnju restrikcijskim endonukleazama BamHI i NdeI, a na svaku početnicu je dodano i

7 nukleotida slijeda GAGAGAG. Slijed je dodan da bi se restrikcijske endonukleaze lakše

vezale na PCR produkt koji trebaju pocijepati. Zbog nepoznate točne koncentracije

laboratorijske preparacije Phusion polimeraze i nadprosječno visokog udjela GC parova baza

u genomu koji je služio kao kalup u reakciji, bilo je potrebno pronaći optimalne uvjete za

REZULTATI

41

uspješnost lančane reakcije polimeraze (Slika 3.2). Unatoč dodatku DMSO (dimetilsulfoksid)

do 5 ili 10 % finalno, koji se standardno dodaje u reakcije gdje kalup ima veći udio GC

parova baza, reakcija nije uspijevala u uvjetima inače preporučenim za Phusion DNA-

polimerazu. U pokušajima optimiranja reakcije uspješnim se pokazalo postupno smanjivanje

temperature vezanja počenica na kalup tijekom prvih 10 ciklusa, od 72 °C do 63 °C. Točni

uvjeti za PCR su su navedeni u poglavlju 2.2.1.3. Materijala i metoda. Smjesa je nakon PCR-a

nanesena na agarozni gel, provedena je elektroforeza, a fragment odgovarajuće veličine je

izoliran iz gela pomoću komercijalno dostupnog kompleta.

Slika 3.2. Elektroforeza na agaroznom gelu produkata PCR-a. Prikazan je gel iz finalne faze optimacije reakcije.

U reakcijama 1-3 dodano je 0,9 μL polimeraze na 30 μL ukupne smjese, a u reakcijama 4-6 bilo je 0,6 μL

polimeraze na ukupno 30 μL smjese. Korištena je različita temperatura za vezanje početnica, pa je taj korak za

reakcije 1 i 4 bio 60 °C, za 2 i 5 66 °C, a za 3 i 6 je bio 72 °C. Prvih 10 ciklusa od ukupno 30 temperatura pri

kojoj se vrši sparivanje početnica se svakim ciklusom smanjivala po 1 °C, a zadnjih 20 ciklusa se temperatura

vratila na početnu vrijednost. Kako je najviše PCR produkta bilo u reakciji 3, uvjeti korišteni za tu reakciju su

korišteni u preparativnim reakcijama. PCR produkti su označeni strelicama, marker veličine je označen s M

(veličine vrpci: 500 pb (parova baza), 1000 pb, 1500 pb, 2000 pb, 3000 pb, 4000 pb, 5000 pb, 6000 pb, 8000 pb,

10000 pb).

Enzimi BamHI i NdeI čija mjesta prepoznavanja su dodana na početnice za PCR ne cijepaju

gen za IleRS, a plazmid pET28b, u koji je gen ubačen, cijepaju svaki na jednom mjestu.

Rezanjem ovim enzimima nastali su ljepljivi krajevi na insertu i plazmidu.

3.1.2. Ligacija

Pocijepani PCR produkt (insert) i plazmid s komplementarnim ljepljivim krajevima ligirani su

kako je opisano u poglavlju 2.2.1.5. Materijala i metoda. Radi kontrole ligiranja plazmida bez

inserta napravljena je ligacijska reakcija u koju nije dodan insert. Plazmidi s ugrađenim

insertom elektroporirani su u elektrokompetentne stanice E. coli BL21 (DE3) koje su

nasađene na LB ploče s kanamicinom, i rasle su preko noći na 37 °C. Iz naraslih kolonija su

izolirani plazmidi na kojima je zatim izvršena provjera ugradnje inserta u plazmid. Slika 3.3

REZULTATI

42

prikazuje izolirani plazmid za koji je po veličini pretpostavljeno da ima ugrađen insert. Na

kontrolnim pločama kolonije nisu narasle.

3.3. Elektroforeza na agaroznom gelu izoliranog plazmida (P) uz marker veličine (M) (veličine vrpci: 500 pb

(parova baza), 1000 pb, 1500 pb, 2000 pb, 3000 pb, 4000 pb, 5000 pb, 6000 pb, 8000 pb, 10000 pb). Različite

pruge predstavljaju različite razine superzavijenosti plazmida, od superzavijene cirkularne molekule koja najbrže

putuje, do relaksirane cirkularne forme koja je najsporija. Prema veličini plazmida usporedbom s markerom

veličine procijenjeno je da se insert ugradio u plazmid.

3.1.3. Provjera ugradnje inserta u ekspresijski vektor

3.1.3.1. Provjera ugradnje restrikcijskom analizom

Ugradnja inserta u plazmid je provjerena za plazmid izoliran iz kolonije na ploči. Pravilna

ugradnja inserta u ekspresijski vektor prvo je provjerena razgradnjom restrikcijskim

endonukleazama BamHI i NdeI, pomoću kojih je insert ugrađen u vektor, pa cijepaju vektor s

ugrađenim insertom na mjestima ugradnje inserta. Smjesa je nakon razgradnje restrikcijskim

enzimima nanesena na agarozni gel i provedena je elektroforeza radi analize veličine

dobivenih fragmenata. Veličine dobivenih fragmenata trebale bi otprilike odgovarati veličini

vektora bez inserta i samog inserta. In silico razgradnja plazmida s ugrađenim insertom

napravljena pomoću alata NEBcutter pokazala je da bi dobiveni fragmenti trebali imati točno

5329 i 3154 parova baza, a plazmid bez inserta bi bio vidljiv kao fragment veličine 5329

parova baza, dok drugi nastali fragment od 39 parova baza ne bi bio vidljiv na agaroznom

gelu. Usporedbom veličine fragmenata razdvojenih elektroforezom s markerom veličine

potvrđeno je da plazmid ima ugrađen gen za SgIleRS (Slika 3.4).

REZULTATI

43

Slika 3.4. Elektroforeza na agaroznom gelu provjere ugradnje inserta u plazmid restrikcijskom analizom (R) uz

marker veličine (M) (veličine vrpci: 500 pb (parova baza), 1000 pb, 1500 pb, 2000 pb, 3000 pb, 4000 pb, 5000

pb, 6000 pb, 8000 pb, 10000 pb).. Crnim strelicama su označeni fragmenti nastali razgradnjom restrikcijskim

endonukleazama BamHI i NdeI, veličine 5329 i 3154 parova baza, a plavom strelicom je označen ostatak

nerazgrađenog plazmida, veličine 8483 parova baza.

3.1.3.2. Provjera ugradnje sekvenciranjem slijeda nukleotida

Na plazmidu za koji se restrikcijskom analizom potvrdilo da ima ugrađen insert provedeno je

sekvenciranje nukleotidnog slijeda inserta, kako je opisano u poglavlju 2.2.1.10. Materijala i

metoda. Korištena je početnica koje se veže na T7-promotor na plazmidu točno prije početka

ugrađenog gena. Potvrđeno je da je insert ugrađen na točno mjesto u plazmid (Slika 3.5).

Također, potvrđeno je da u prvih ~600 nukleotida nije došlo do mutacije prilikom provođenja

PCR-a. Ostatak inserta nije dohvaćen sekvenciranjem, no kako je korištena DNA-polimeraza

visoke točnosti, može se pretpostaviti da ni u ostatku gena nije došlo do mutacija.

Sekv 141 ATGACATCGCCGCAGTACCGCCAGGTACCCGCCCAGGTCGACCTGCCCGCGCTGGAACAC 200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| IleS 1 ATGACATCGCCGCAGTACCGCCAGGTACCCGCCCAGGTCGACCTGCCCGCGCTGGAACAC 60 Sekv 201 GCCGTTCTGGACTTCTGGCAGGAGAACAAGGTCTTCGCCAAGAGCCTGGAGCGGTCCGAG 260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| IleS 61 GCCGTTCTGGACTTCTGGCAGGAGAACAAGGTCTTCGCCAAGAGCCTGGAGCGGTCCGAG 120 Slika 3.5. Prikaz sravnjenja početnog dijela gena za SgIleRS (IleS) i sekvenciranog inserta (Sekv). Označeni su

redni brojevi nukleotida.

3.2. Prekomjerna ekspresija IleRS iz S. griseus u stanicama E. coli Plazmid s insertom čiji nukleotidni slijed je provjeren sekvenciranjem elektroporiran je u soj

BL21 (DE3) bakterije E. coli. Stanice su nasađene u LB medij s kanamicinom i 0,5%

glukozom preko noći, a zatim su inokulirane u LB medij s kanamicinom, kako je opisano u

poglavlju 2.2.2.1. Materijala i metoda. Kako veća količina cikličkog AMP-a (cAMP) potiče

REZULTATI

44

ekspresiju s lac operona, unatoč tome što induktor IPTG još nije dodan, a glukoza smanjuje

količinu cAMP, glukoza se dodaje u prekonoćnu predkulturu da se spriječi ekspresija.

Ekspresija proteina u ovoj fazi nije poželjna zbog eventualnog sporijeg rasta stanica uslijed

proizvodnje veće količine određenog proteina u stanici.

Dodatkom IPTG-a u eksponencijalnoj fazi rasta bakterijskih stanica inducira se prekomjerna

ekspresija proteina IleRS. Probnim eksperimentima indukcije se pokazalo da se protein

optimalno prekomjerno eksprimira na 15 °C preko noći. U tom slučaju je bio najveći prinos

proteina u topljivoj frakciji staničnog ekstrakta, dok je indukcijom pri višoj temperaturi, 30 °C

veći dio proteina bio u netopljivoj frakciji. Dodatak deterdženta Nonidet P-40 (NP-40) u

sonikacijsku smjesu je povećao prinos proteina u topljivoj frakciji (Slika 3.6).

Slika 3.6. SDS-PAGE s uzorcima taloga i supernatanta nakon sonikacije. M je marker veličine Precision Plus

Protein Unstained Standards (Bio-Rad) (Veličine izraženijih vrpci su 25, 50, 75 150 i 250 kD). Lijevo od

markera su uzorci iz stanica koje su nakon indukcije inkubirane na 15 °C, a desno od markera uzorci iz stanica

koje su inkubirane na 30 °C. S je supernatant, a T talog stanica nakon sonikacije i centrifugiranja. U polovicu

uzoraka je prilikom sonikacije dodan NP-40. Položaj proteina IleRS je označen strelicama.

3.2.1. Pročišćavanje, koncentriranje i dijaliza SgIleRS

Eksprimirani IleRS na svom N-kraju ima His-privjesak, pomoću kojega se protein može

pročistiti afinitetnom kromatografijom, kako je opisano u poglavlju 2.2.2.2. Materijala i

metoda.

REZULTATI

45

Paralelno su afinitetnom kromatografijom pročišćeni enzimi iz staničnog ekstrakta sa i bez

dodatka NP-40 u sonikacijsku smjesu. Kako su rezultati pročišćavanja pokazali da dodatkom

NP-40 u sonikacijsku smjesu na kraju ipak nije ostvaren veći prinos proteina (Slika 3.7),

korištene su frakcije iz uzorka u koji deterdžent nije dodan pri sonicirnaju.

Slika 3.7. SDS-PAGE proteinskih frakcija nakon pročišćavanja afinitetnim kromatografijom. 1A – 4A su

kromatografske frakcije elucije uzorka kojem prilikom sonikacije nije dodan NP-40, a 1B – 4B su

kromatografske frakcije elucije uzorka koji je sadržavao NP-40 prilikom sonikacije. Kako je količina proteina

podjednaka u oba slučaja, korištene su frakcije uzorka bez NP-40 u sonikacijskoj smjesi.

Dobivene frakcije uzoraka u koje nije dodan NP40 (1A – 4A, Slika 3.7) su spojene, uzorak je

ukoncentriran ultrafiltracijom, nakon čega je protein dijaliziran prema puferu za dijalizu.

3.3. Aktivacija aminokiseline mjerena ATP/[32P]PPi izmjenom Kinetička aktivnost izoliranog enzima SgIleRS provjerena je ATP/PPi izmjenom u prisutnosti

pripadne aminokiseline izoleucina i nepripadne aminokiseline valina. ATP/PPi izmjena je

enzimski test kojim se mjeri brzina aktivacije aminokiseline. Reakcija se prati preko povratne

reakcije, pirofosforolize, gdje se [32P] iz PPi ugrađuje u ATP. Uvjeti reakcije i način izvođenja

su opisani u poglavlju 2.2.3.1. Materijala i metoda. Reakcija se prati u odsutnosti tRNA, pa

parametri dobiveni na ovaj način ne moraju odgovarati brzini aktivacije u prisutnosti tRNA.

[32P]Pi, [32P]ATP i [32P]PPi prisutni u reakcijskoj smjesi se razdvajaju na pločicama za

tankoslojnu kromatografiju. Na Slici 3.8 je prikazan reprezentativni kromatogram razdvajanja

[32P]ATP, [32P]Pi i [32P]PPi.

REZULTATI

46

Slika 3.8. Reprezentativni kromatogram razdvajanja [32P]PPi, [32P]ATP, [32P]Pi. Koncentracija ortofosfata Pi se

ne mijenja kroz vrijeme reakcije, pa se u slučaju lošeg odvajanja kvantificira zajedno s ATP-om.

Rezultati razdvajanja su kvantificirani pomoću programa ImageQuant 5.2.

Za obje aminokiseline napravljeno je 8 reakcija aktivacije s različitim koncentracijama

aminokiseline, koje su se kretale od oko 0,1 Km do 10 Km, kako je određeno iz probnih

eksperimenata. Za svaku pojedinu koncentraciju napravljen je graf vremenske ovisnosti

porasta količine ATP-a (produkta) u vremenu.

Za svaku koncentraciju aminokiseline porast količine produkta se pratio u 5 točaka, svakih

30 sekundi, ukupno 2,5 minute. Reprezentativni prikaz ovisnosti o vremenu prikazan je na

Slici 3.9.

Slika 3.9. Reprezentativni prikaz vremenskih tijekova za reakciju aktivacije aminokiseline, kataliziranu enzimom

SgIleRS, pri različitim koncentracijama aminokiseline izolrucina navedenim sa strane. Iz nagiba vremenskih

tijekova određene su početne brzine reakcija.

REZULTATI

47

Iz vremenski tijekova prikazanih na Slici 3.9 izračunate su početne brzine reakcije, v0.

Ovisnost početnih brzina reakcija o koncentraciji aminokiselina analizirana je nelinearnom

regresijom u programu GraphPad Prism 4, prema jednadžbi Michaelis-Menten koja glasi

𝑣0 = 𝑉max × [S]𝐾m + [S]

, gdje je v0 početna brzina, Vmax je maksimalna brzina, [S] je početna

koncentracija supstrata (ovdje aminokiseline), a Km je Michealisova konstanta. kcat je obrtni

broj enzima, a može se izračunati iz Vmax, jer je Vmax = kcat × [E]0, gdje je [E]0 početna

koncentracija enzima.

Na Slici 3.10 je reprezentativni Michaelis-Mentenin prikaz ovisnosti početnih brzina reakcija

o koncentraciji aminokiseline izoleucina. Nelinearnom regresijom određeni parametri kcat i Km

su prikazani u Tablici 3.1. Mjerenja su ponovljena 3 puta, u tablici su navedene srednje

vrijednosti i standardna pogreška.

IleRS + Ile

0 50 100 150 200 2500

5.0×10 -4

1.0×10 -3

1.5×10 -3

2.0×10 -3

c(Ile) / µM

v 0/ (

mM

s-1)

Slika 3.10. Reprezentativni prikaz ovisnosti početnih brzina reakcija aktivacije aminokiseline, kataliziranih

enzimom SgIleRS, o koncentraciji supstrata izoleucina.

Tablica 3.1. Aktivacija pripadnih i nepripadnih aminokiselina s SgIleRS mjerena ATP/[32P]PPi izmjenom.

Km / μmol dm-3 kcat / s-1 kcat/Km / s-1 μmol dm-3 IleRS + Ile 17± 3 21 ± 1 1,2 IleRS + Val (1,8 ± 0,1) ×103 19,3 ± 0,5 0,01

REZULTATI

48

Km, Michaelisova konstanta je funkcija svih pojedinačnih koeficijenata brzina reakcije, može

je se promatrati kao ukupnu konstantu disocijacije svih kompleksa enzima u reakciji. Po

iznosu je jednaka koncentraciji supstrata pri kojoj se postiže polovica maksimalne brzine

reakcije Vmax. kcat, obrtni broj enzima je sveukupna konstanta brzine katalize. Definira se kao

maksimalni broj molekula supstrata koje se pretvore u produkt po aktivnom mjestu enzima u

jedinici vremena u uvjetima zasićenja enzima supstratom. Parametar kcat govori o

procesivnosti enzima. Omjer kcat/Km je konstanta specifičnosti i mjera je učinkovitosti enzima

s obzirom na određeni supstrat.

Usporedbom vrijednosti dobivenih parametara vidljivo je da se kcat ne razlikuje značajno u

reakcijama s pripadnom i nepripadnom aminokiselinom, dok se parametar Km razlikuje za dva

reda veličine. Zbog razlike u Km konstanta specifičnosti kcat/Km se također razlikuje za dva

reda veličine u reakcijama s pripadnom i nepripadnom aminokiselinom. Omjer konstanti

specifičnosti (kcat/Km) za pripadnu i za nepripadnu aminokiselinu naziva se diskriminacijski

faktor i u ovom slučaju iznosi 120.

3.4. Određivanje akceptorske aktivnosti tRNA Akceptorska aktivnost tRNA se određivala s ciljem određivanja udjela, a zatim i koncentracije

biološki funkcionalnih molekula tRNAIle u ukupnoj tRNA. Detaljan postupak određivanja

akceptorske aktivnosti opisan je u poglavlju 2.2.3.3 Materijala i metoda.

Za enzim iz svake vrste je pretpostavljeno da potpuno aminoacilira vlastitu tRNAIle. Na

temelju toga se odredila koncentracije tRNAIle u uzorku tRNA koji će se koristiti za kinetička

istraživanja. EctRNAIle čini 1,9% ukupne EctRNA, što je u ovom slučaju 40 μmol dm-3.

SctRNAIle čini 0,72% u ukupnoj SctRNA, što je ovdje 15,8 μmol dm-3. Udio SgtRNAIle u

izoliranoj ukupnoj SgtRNA je 1,17 %, a koncentracija SgtRNAIle je 7,4 μmol dm-3.

Napravljene su reakcije određivanja akceptorske aktivnosti pri heterolognom aminoaciliranju

tRNA iz svih triju vrsta, te su uspoređene s akceptorskom aktivnošću pri aminoaciliranju s

homolognom tRNA. Rezultati su prikazani u Tablici 3.5. U svim reakcijama se koristila

1 μmol dm-3 tRNAIle, kako je maloprije određeno, i enzim koncentracije 2 μmol dm-3.

Rezultati su prikazani tako da su vrijednosti akceptorske aktivnosti tRNA normirane s

akceptorskom aktivnošću homolognog aminoaciliranja, a kombinacije tRNA s drugim

enzimima su prikazane relativno u odnosu na tu vrijednost.

REZULTATI

49

Tablica 3.2. Usporedba akceptorskih aktivnosti pri homolognom i heterolognom aminoaciliranju za IleRS iz E.

coli, S. cerevisiae i S. griseus s tRNA iz svih triju vrsta.

Enzim

tRNA E. coli S. cerevisiae S. griseus E. coli 1* 1,26 1,09

S. cerevisiae 1,06 1 0,70 S. griseus 1 0,95 1

*Vrijednosti za svaku tRNA i pripadni enzimi su uzete kao maksimalne 1, a kombinacije tRNA s drugim

enzimima su prikazane relativno u odnosu na tu vrijednost.

Reakcije određivanja akceptorske aktivnosti se prate nakon izlaska iz ustaljenog stanja, kada

se količina aminoacilirane tRNA ustalila. Reakcije se gledaju u 3 vremenske točke, nakon 5,

15 i 30 minuta. Za sve reakcije 5 minuta je bilo dovoljno da se dostigne krajnja vrijednost, tj.

između 5 i 30 minuta nije došlo do značanijeg porasta količine aminoacilirane tRNA, ali ni do

deacilacije aminoaciliranih molekula tRNA, pa su vrijednosti navedene u tablici dobivene kao

srednje vrijednosti količine aminoacilirane tRNA u svim vremenskim točkama. Jedina

iznimka je kombinacija S. cerevisiae tRNA i E. coli enzima. U ovom slučaju zbog vrlo niske

brzine aminoaciliranja količina aminoacilirane tRNA je rasla i u dugim vremenskim

rasponima. Vrijednost navedena u Tablici 3.2 je ona koja se dobije nakon dulje od 30 minuta

reakcije.

Kako je vidljivo u Tablici 3.5 gotovo sve tRNA su nakon 30 minuta potpuno aminoacilirane u

reakcijama sa svim enzimima. Iznimka je SctRNAIle sa SgIleRS, koja se aminoacilira samo do

oko 70% maksimane vrijednosti koju postiže s vlastitom IleRS.

3.5. Aminoaciliranje uz [14C]aminokiselinu Napravljene su reakcije aminoaciliranja uz [14C]aminokiselinu katalizirane enzimom IleRS iz

vrsta E. coli, S. cerevisiae i S. griseus. Aminoacilacijska aktivnost je provjerena s ukupnom

tRNA iz pripadne vrste i s ukupnom tRNA iz nepripadnih vrsta, tj. provjerena je aktivnost u

homolognom i heterolognom aminoaciliranju. Metoda koja je detaljnije opisana u poglavlju

2.2.3.2. Materijala i metoda temelji se na zaustavljanju reakcije taloženjem makromolekula na

filter-papiriće pomoću trikloroctene kiseline. Reakcija se zaustavlja u određenim vremenskim

periodima. U ovom radu se svaki eksperiment pratio u 4 vremenske točke, razmaknute

30 sekundi, pa je ukupno vrijeme reakcije bilo 2 minute, osim u jednom slučaju (opisano

kasnije). Paralelne reakcije s 5 i 10 μmol dm-3 tRNAIle su izvedene radi provjere zasićenja

enzima u reakcijskoj smjesi s tRNA. U prvim eksperimentima se pokazalo da nema značajne

REZULTATI

50

razlike u brzinama reakcija ovisno o tome koristi li se 5 ili 10 μmol dm-3 tRNA. Kako je s

5 μmol dm-3 tRNA reakcija u zasićenju s obzirom na tRNAIle, sve su sljedeće reakcije

napravljene s tRNAIle koncentracije 5 μmol dm-3. Koncentracije tRNAIle u ukupnim staničnim

tRNA su određene pomoću određivanja akceptorske aktivnosti kako je opisano u poglavlju

2.2.3.3 Materijala i metoda. Rezultati određivanja akceptorske aktivnosti su predstavljeni u

poglavlju 3.5.

Mjerenjem brzine aminoaciliranja mjeri se ukupna brzina reakcije nastajanja aa-tRNA. Ovako

dobivena konstanta brzine označena je s kobs – primijećena konstanta brzine reakcije.

3.5.1. Aminoaciliranje s IleRS iz E. coli

Za reakcije aminoaciliranja s EcIleRS enzim se koristio u različitim koncentracijama: 25 nmol

dm-3 i 50 nmol dm-3 za homologno aminoaciliranje te 0,5 μmol dm-3 i 1 μmol dm-3 za

heterologno aminoaciliranje. tRNAIle iz E. coli i S. cerevisiae je u reakcijama bila

koncentracije 5 ili 10 μmol dm-3, a SgtRNAIle je bila 5 μmol dm-3. Rezultati aminoaciliranja s

EcIleRS su navedeni u Tablici 3.3. Mjerenja su ponovljena 3 ili više puta, a u tablici su

navedene srednje vrijednosti i standardna pogreška.

Tablica 3.3. Aminoaciliranje tRNA pripadnom aminokiselinom s EcIleRS.

tRNA kobs / s-1 E. coli 0,97 ± 0,07

S. cerevisiae 0,00161 ± 0,00003 S. griseus 0,007 ± 0,001

Zbog izrazito slabog aminoaciliranja SctRNA za ovu reakciju korišteni su dulji vremenski

rasponi. Mjerenja su izvedena na 3, 6, 9 i 12 minuta od početka reakcije.

Iz rezultata je vidljivo da EcIleRS vrlo sporo aminoacilira tRNA iz S. cerevisiae i S. griseus u

usporedbi s aminoaciliranjem vlastite tRNA. Uspoređujući dvije reakcije heterolognog

aminoaciliranja vidljivo je da je brzina s tRNA iz bakterije S. griseus oko 4 puta veća od one s

tRNA iz eukariota S. cerevisiae, ali je to i dalje oko 140 puta sporije od reakcije EcIleRS s

vlastitom tRNA.

Navedeni rezultati govore u prilog slabom heterolognom aminoaciliranju koje je svojstveno

za prokariotski tip IleRS prisutan u ovoj bakteriji.

REZULTATI

51

3.5.2. Aminoaciliranje s IleRS iz S. cerevisiae

Za homologna aminoaciliranja korišten je enzim koncentracije 50 nmol dm-3 i 100 nmol dm-3,

a za heterologne reakcije enzim koncentracije 50 nmol dm-3, 0,5 μmol dm-3 i 1 μmol dm-3.

Kao i kod EcIleRS, tRNAIle iz E. coli i S. cerevisiae je u reakcijama bila koncentracije 5 ili

10 μmol dm-3, a SgtRNAIle je bila koncentracije 5 μmol dm-3. Rezultati aminoaciliranja sa

ScIleRS su navedeni u Tablici 3.4. Sva mjerenja su ponovljena najmanje 2 puta. Rezultati su

prikazani kao srednja vrijednost i standardna pogreška.

Tablica 3.4. Aminoaciliranje tRNA pripadnom aminokiselinom sa ScIleRS.



ScIleRS aminoacilira EctRNAIle vrlo brzo, čak većom brzinom od vlastite tRNA. Već otprije

je poznata sklonost ScIleRS heterolognom aminoaciliranju E. coli tRNA (Racher i sur. 1991).

tRNAIle iz S. griseus, naprotiv, aminoacilira izrazito sporo, oko 20 puta sporije od EctRNA, i

13 puta sporije od vlastite tRNA.

3.5.3. Aminoaciliranje s IleRS iz S. griseus

Koncentracije enzima korištene za reakcije s vlastitom tRNA su 50 nmol dm-3 i

100 nmol dm-3, a za reakcije s tRNA iz drugih vrsta 50 nmol dm-3, 100 nmol dm-3,

1 μmol dm-3. Koncentracije svih EctRNAIle i SctRNAIle su bile 5 ili 10 μmol dm-3, a

koncentracija SgtRNAIle je bila 5 μmol dm-3. Rezultati aminoaciliranja su navedeni u Tablici

3.5. Sva mjerenja ponovljena su najmanje 3 puta, a rezultati su prikazani kao srednja

vrijednost i standardna pogreška.

Tablica 3.5. Aminoaciliranje tRNA pripadnom aminokiselinom sa SgIleRS.



Kao i kod S. cerevisiae enzima, i enzim iz SgIleRS najbrže aminoacilira tRNA iz bakterije

E. coli, dok tRNA iz S. cerevisiae aminoacilira 5 puta sporije nego vlastitu tRNA.

REZULTATI

52

3.6. Difuzijski test osjetljivosti na antibiotik mupirocin Mupirocin je antibiotik koji inhibira izoleucil-tRNA-sintetaze brojnih prokariotskih vrsta.

Ovaj antibiotik selektivno inhibira većinu bakterijskih IleRS, ali ne djeluje na eukariotski tip

enzima koji je, osim u eukariotima, prisutan u nekim bakterijskim vrstama, kako je opisano u

poglavlju 1.3.1.2. Uvoda.

Sravnjenje slijeda aminokiselina IleRS (Slika 3.11) iz nekoliko eukariotskih i prokariotskih

vrsta pokazalo je da SgIleRS kao i neki drugi prokariotski enzimi, koji su rezistentni na

mupirocin, nalikuje eukariotskim IleRS tipa 2.

Slika 3.11. Dio sravnjenja aminokiselinskog slijeda IleRS iz različitih vrsta. Korišteni su sljedovi iz eukariota

Tetrahymena thermophila i S. cerevisiae, i prokariota E. coli, P. fluorescens, Haemophilus influenzae, S. griseus

i T. thermophilus. Prikazan je dio sravnjenja oko HIGH i KMSKS motiva (označeni strelicama), karakterističnih

za aaRS iz razreda I. Prokarioti su grupirani u one koji imaju uobičajeni IleRS tipičan za većinu prokariota, tip 1,

i one koji posjeduju enzime koji nalikuju eukariotskim tipa 2. Kako P. fluorescens posjeduje oba tipa, tip 1 je

označen s 1, a enzim nalik tipu 2 s 2. Plavom bojom su označene aminokiseline koje su potpuno očuvane u

pojedinoj grupi. Sravnjenje je napravljeno pomoću programa MUSCLE, a vizualizirano i analizirano je u

programu Jalview 2.7.

U kinetičkim eksperimentima enzim iz S. griseus pokazao je naznake sličnosti s eukariotskim

enzimom obzirom na sklonosti heterolognoj aminoacilaciji, a sličnost s eukariotskim

enzimima provjerena je i pomoću testiranja osjetljivosti na antibiotik mupirocin. Test

osjetljivosti je napravljen na krutim hranjivim podlogama, bušenjem bazenčića u koje je

dodan antibiotik. Antibiotik difundira iz bazenčića i u slučaju da je vrsta osjetljiva na

antibiotik, oko bazenčića se stvara krug određenog promjera u kojoj organizmi ne mogu rasti,

REZULTATI

53

zona inhibicije rasta. Promjer zone inhibicije rasta proporcionalan je osjetljivosti vrste na

antibiotik. Detaljan opis metode, te koncentracije antibiotika koje su korištene su navedene u

poglavlju 2.2.4.1. Materijala i metoda. Rezultati su prikazani na Slikama 3.12 do 3.14.

Slika 3.12. Ploča s bakterijom E. coli. Na prvoj ploči (A) u bazenčić je dodan antibiotik mupirocin. Druga ploča

(B) je kontrola, tu je u bazenčić stavljena otopina u kojoj nema antibiotika.

Slika 3.13. Ploča s kvascem S. cerevisiae. Na prvoj ploči (A) u bazenčić je dodan antibiotik mupirocin. Druga

ploča (B) je kontrola, tu je u bazenčić stavljena otopina u kojoj nema antibiotika.

REZULTATI

54

Slika 3.14. Ploča s bakterijom S. griseus. Na prvoj ploči (A) u bazenčić je dodan antibiotik mupirocin. Druga

ploča (B) je kontrola, u bazenčiću nema antibiotika.

Rezultati koji su prikazani na Slikama 3.12 do 3.14 govore u prilog tome da S. griseus

posjeduje enzim IleRS koja nalikuje eukariotskim. Antibiotik mupirocin nije djelovao na rast

eukariota, kvasca S. cerevisae. Nema zone inhibicije, već kvasac podjednako ravnomjerno

raste po cijeloj ploči. Kod bakterije E. coli postoji zona inhibicije, što govori u prilog od prije

poznatoj osjetljivosti ovog prokariota na mupirocin (Sassanfar 1996, Yanagisawa i Kawakami

2003). Promjer zone inhibicije za korištenu koncentraciju antibiotika je bio 25 mm. Bakterija

S. griseus se pokazala rezistentnom na isti antibiotik. Zona inhibicije ovdje nije primijećena.

Na slici 3.14.(A) se može vidjeti da oko bazenčića nema rasta stanica S. griseus u promjeru

oko 2 mm od bazenčića, ali vjerojatnije je da se radi o artefaktu zbog neravnomjernog rasta

stanica, a ne o osjetljivosti bakterije na antibiotik. Na temelju nedostatka osjetljivosti ove

bakterije na mupirocin može se zaključiti da S. griseus posjeduje enzim koji nalikuje

eukariotskim enzimima IleRS tipa 2.

Kako je antibiotik mupirocin vrlo slabo topljiv u vodi, napravljena je otopina koncentracije

0,5 mol dm-3 mupirocina u 96% etanolu. Obzirom da bi koncentrirani etanol mogao

inhibitorno djelovati na rast stanica oko bazenčića, napravljene su kontrole gdje je u bazenčić

stavljena ista smjesa, ali bez dodanog antibiotika. Kao što je vidljivo iz slika 3.12(B), 3.13(B)

i 3.14(B) etanol nije imao utjecaj na rast stanica.

REZULTATI

55

3.7. Test komplementacije U soj BL21 (DE3) bakterije E. coli elektroporiran je ekspresijski vektor pET28b s ugrađenim

SgIleRS. Kako je u testu osjetljivosti S. griseus pokazao rezistenciju na antibiotik mupirocin,

elektroporacija plazmida s ugrađenim genom za rezistentni IleRS, i njegova ekspresija

potaknuta dodatkom IPTG-a trebala bi omogućiti elektroporiranim stanicama E. coli rast u

prisustvu antibiotika mupirocina. Preduvjet za to je da se tRNAIle iz E. coli može učinkovito

aminoacilirati s enzimom iz S. griseus, što je potvrđeno u ranijim kinetičkim eksperimentima

(poglavlje 3.4 i 3.5.3. u Rezultatima). Radi kontrole u isti soj je elektroporiran vektor pET22 s

ugrađenim genom za EcIleRS.

Također je napravljena kontrola utjecaja dodatka IPTG-a koncentracije 10 μmol dm-3 na rast

stanica E. coli u koje je elektroporiran vektor bez ugrađenog gena za IleRS. Slika 3.15

pokazuje da IPTG nije imao utjecaj na rast stanica. Stanice E. coli su normalno rasle, osim u

zoni inhibicije promjera 24 mm oko bazenčiće s mupirocinom.

Slika 3.15. Ploča s E. coli stanicama u koje je elektroporiran prazan vektor s dodatkom IPTG-a koncentracije

10 μmol dm-3. U bazenčić je dodan antibiotik mupirocin.

Kontrola s elektroporiranim vektorom za gen s IleRS iz E. coli rasla je slično kao prva

kontrola: oko bazenčića s mupirocinom postoji zona inhibicije promjera 26 mm (Slika 3.16).

Elektroporacija vektora s IleRS iz E. coli i ekspresija enzima potaknuta IPTG-om nije imala

utjecaj na rast stanica, niti je utjecala na osjetljivost na mupirocin. U ovom slučaju u gornji i u

donji agar dodan je antibiotik ampicilin. Kako vektor u koji je ugrađen gen za IleRS iz E. coli

nosi rezistenciju na ampicilin, sve stanice na ploči su imale plazmid.

REZULTATI

56

Slika 3.16. Ploča s E. coli stanicama u koje je elektroporiran vektor s ugrađenim genom za IleRS iz E. coli. U

bazenčić je dodan antibiotik mupirocin.

Slika 3.17 pokazuje da SgIleRS uspješno komplementira stanice E. coli. Kako u ovom slučaju

nije vidljiva zona inhibicije stanice, može se zaključiti da stanice E. coli s ekspresijskim

vektorom u koji je ugrađen gen za SgIleRS pokazuju potpunu rezistenciju na antibiotik

mupirocin.

Vektor pET28b u koji je ugrađen gen za SgIleRS nosi rezistenciju na antibiotik kanamicin. Da

bi se osiguralo da u svim stanicama E. coli bude plazmid s ugrađenim genom za SgIleRS,

korištena je ploča na kojoj je u gornjem i u donjem agaru bio prisutan antibiotik kanamicin

(Slika 3.15 i 3.17.)

Slika 3.17. Ploča s E. coli stanicama u koje je elektroporiran vektor s ugrađenim genom za IleRS iz S. griseus. U

bazenčić je dodan antibiotik mupirocin.

RASPRAVA

57

4. Rasprava Sravnjenjem primarne strukture SgIleRS sa sljedovima IleRS iz drugih vrsta primijećeno je da

enzim posjeduje sličnosti s eukariotskim tipom enzima (Slika 3.11, Rezultati). Cilj ovog rada

bio je istražiti pokazuje li SgIleRS neke karakteristike eukariotskog enzima. Mjerila se

katalitička učinkovitost enzima u homolognom i heterolognom aminoaciliranju, i dobivene

vrijednosti su uspoređene s vrijednostima dobivenim za EcIleRS i ScIleRS u homolognom i

heterolognom aminoaciliranju. Također, istražen je utjecaj antibiotika mupirocina na rast

S. griseus. Poznato je da mupirocin inhibira IleRS brojnih Gram-pozitivnih i Gram-negativnih

bakterija, a ne utječe na rast eukariota. U ovom radu je uspoređena osjetljivost na mupirocin

S. griseus s rezistentnim eukariotom S. cerevisiae i osjetljivim prokariotom E. coli.

Kinetička aktivnost izoliranog enzima SgIleRS izmjerena je ATP/PPi izmjenom u prisutnosti

pripadne aminokiseline izoleucina i nepripadne aminokiseline valina. Mjerenjima su određeni

parametri kcat i Km. Parametri kcat i Km aktivacije enzima EcIleRS u reakcijama s pripadnom

aminokiselinom izoleucinom i nepripadnom aminokiselinom valinom su od ranije poznati

(Dulić i sur. 2010). Za reakciju s izoleucinom kcat je 54,7 s-1, a Km je 4,6 μmol dm-3. Za

reakciju s nepripadnom aminokiselinom valinom kcat je 35,3 s-1, dok Km iznosi 465 μmol dm-3.

Uspoređujući te parametre s rezultatima dobivenim za aktivaciju uz SgIleRS (Tablica 3.1,

poglavlje 3.3 u Rezultatima) vidljivo je da je za obje aminokiseline Km veći oko 3,5 puta, a

kcat manji u prosjeku 2,3 puta u reakcijama s SgIleRS. Kao posljedica toga konstante

specifičnosti (kcat/Km,), za obje reakcije su za otprilike red veličine manje uz SgIleRS.

Diskriminacijski faktor, omjer konstanti specifičnosti za reakcije s pripadnom i nepripadnom

aminokiselinom, je istog reda veličina kao onaj u analognim reakcijama s EcIleRS. Za

EcIleRS iznosi 150, a u slučaju SgIleRS je 120. Iz toga proizlazi da oba enzima s

podjednakom specifičnošću aktiviraju pripadnu u odnosu na nepripadnu aminokiselinu,

unatoč tome što im se parametri kcat i Km značajno razlikuju. Diskriminacijski faktor od 120

kod SgIleRS govori da je konstanta specifičnosti za 120 puta manja za nepripadnu

aminokiselinu u odnosu na pripadnu. Kako bi na temelju ovoga enzim vrlo često aktivirao

nepripadnu aminokiselinu valin umjesto pripadnog izoleucina, slično kao i kod EcIleRS gdje

je diskriminacijski faktor 150, kod ovog enzima potreban je popravak pogreške.

Za usporedbu identitetnih elemenata napravljeno je sravnjenje struktura tRNA iz E. coli,

S. cerevisiae i S. griseus (Slika 4.1). Za E. coli i S. cerevisiae je korišten slijed glavnih

RASPRAVA

58

izoakceptorskih tRNA. Sljedovi su preuzeti iz baze podataka Genomic tRNA Database

(http://gtrnadb.ucsc.edu). Navedena baza podataka sadrži nukleotidne sljedove gena koji

kodiraju za molekule tRNA, pa su posttranskripcijski modificirani nukleotidi naknadno

uneseni u sljedove iz S. cerevisiae i E. coli sljedovima sekvenciranih molekula tRNA sa svim

modificiranim nukleotidima (Pixa i sur. 1984, Nordin i Schimmel 2005). Kako molekula

tRNAIle iz S. griseus nije sekvencirana, u sravnjenju je korišten nukleotidni slijed gena koji za

nju kodira.

Slika 4.1. Sravnjenje sljedova tRNAIle iz S. cerevisiae, E. coli i S. griseus. Crvenom bojom su označeni

nukleotidi koji su isti u sva tri slijeda, a plavom bojom nukleotidi koji su isti u dva slijeda. Žutom bojom su

označeni posttranskripcijski modificirani nukleotidi. D - dihidrouridin, acp3U - 3-(3-amino-3-

karboksipropil)uridin, Ψ - pseudouridin, m5U - 5-metiluridin, m1G - 1-metilgvanozin, m2G - 2-metilgvanozin, I

- inozin, , m1A – 1-metiladenozin, t6A - N6-treonilkarbamoil-adenozin. Preuzeto i prilagođeno iz Pixa i sur.

1984, Nordin i Schimmel 2005, http://gtrnadb.ucsc.edu.

Praćene su reakcije aminoaciliranja uz [14C]aminokiselinu katalizirane enzimom IleRS iz

vrsta E. coli, S. cerevisiae i S. griseus. Uspoređujući učinkovitost EcIleRS u reakcijama s

vlastitom tRNA i s tRNA iz drugih organizama, prema kobs navedenim u Tablici 3.2 u

Rezultatima, vidljivo je da enzim slabo aminoacilira ukupne SgtRNA i SctRNA. Ipak,

primijećena je razlika u brzinama dvije heterologne aminoacilacijske reakcije. Usporedbom

elemenata identiteta tRNAIle važnih za prepoznavanje od strane EcIleRS, navedenih u Uvodu

i označenih na Slici 4.2 A, sa strukturom glavne izoakceptorske SctRNAIle i strukturom

SgtRNAIle, mogu se izdvojiti nukleotidi koji bi mogli biti odgovorni za ovaj efekt.

Razlike između SctRNA i EctRNA su u baznom paru 12-23, koji je kod kvaščeve tRNA C-G,

a u EctRNA U-A, zatim 29-41, koji je kod SctRNA G-C, a u EctRNA je C-G, te nukleotidna

baza inozin u kvaščevom antikodonu. Razlike sa SgtRNAIle su u sljedećim parovima baza: 4-

69, koji je u EctRNA C-G, a u SgtRNA G-C, te par 29-41 koji je u EctRNA C-G, a u SgtRNA

U-A. Prema eksperimentima koje su izveli Nureki i sur. (1994) gdje je određena promjena

kcat/Km kod aminoaciliranja in vitro transkribiranih molekula tRNA mutiranih na određenim

Saccharomyces cerevisiae 1 GGUCUCUUm1Gm2GCCCAGDDGGDDAAGGCACCGUGCUIAUt6AAC 40 Escherichia coli 1 AGGCUUGU A GCUCAGGDGGDDAGAGCGCACCCCUGAUt6AAG 40 Streptomyces griseus 1 GGGGCUAU A GCUCAGUUGGUUAGAGCGCAUCCCUGAU AAG 40

Saccharomyces cerevisiae 41 GCGGGG A Dm5CAGCGGTΨCGm1AUCCCGCUAGAGACCACCA 77 Escherichia coli 41 GGUGAGm2Gacp3U CGGUGGTΨCA AGUCCACΨCAGGCCUACCA 77 Streptomyces griseus 41 GAUGAG G C CACAGGUUCA AAUCCUGUUAGCCCCACCA 77

RASPRAVA

59

položajima vidljivo je da mutacija U12-A23 u C12-G23, što je par baza prisutan u SctRNAIle,

smanjuje konstantu specifičnosti 17 puta. Promjena C4-G69 u G4-C69, koji prisutan u

SgtRNAIle, smanjuje konstatnu specifičnosti 8 puta. Mutacija C29-G41 u G29-C41 (par baza

u SctRNA) smanjuje omjer kcat/Km 24 puta, a mutacijom u U29-A41 (par baza u SgtRNA)

omjer se smanjuje više od 1000 puta (Nureki i sur. 1994).

Slika 4.2. Sekundarne strukture tRNAIle iz E. coli, S. cerevisiae i S. griseus. Za E. coli i S. griseus su prikazane

strukture glavnih izoakceptorskih tRNA. Crvenim i plavim strelicama su označeni nukleotidi važni za

prepoznavanje tRNA od strane EcIleRS (crveno) i enzima iz ScIleRS (plavo). D - dihidrouridin, acp3U - 3-(3-

amino-3-karboksipropil)uridin, Ψ - pseudouridin, m5U - 5-metiluridin, m1G - 1-metilgvanozin, m2G - 2-

metilgvanozin, I - inozin, , m1A – 1-metiladenozin, t6A - N6-treonilkarbamoil-adenozin. Preuzeto i prilagođeno

iz Senger i sur., 1997, Nordin i Schimmel, 2005, Pixa i sur., 1984, http://gtrnadb.ucsc.edu.

Navedeno ukazuje na to da su par baza U29-A41 i G4-C69 glavni razlozi slabog

aminoaciliranja SgtRNAIle s EcIleRS. Razlike između identitetnih elemenata EctRNAIle i

SctRNA C12-G23 i G29-C41 mijenjaju konstantu specifičnosti za 17 odnosno 24 puta, a

moglo bi biti da uz to i drugačija antikodonska baza doprinosi primijećenom slabom

aminoaciliranju SctRNA. Unatoč tome što nije napravljena in vitro transkribirana molekula

tRNA s I na položaju 34, mutacije G34 u U, A i C su napravljene, te su mjerenja pokazala

smanjenje konstante specifičnosti od 140 do 320 puta (Nureki i sur. 1994). Pod

pretpostavkom da bi i mutacija G u I ulazila u taj raspon, razlika u ovoj bazi, zajedno s

navedena dva para baza mogla bi biti razlog četiri puta manje brzine aminoaciliranja kobs s

kvaščevom tRNA u odnosu na SgtRNA, koja se od pripadne EctRNA razlikuje u dva bazna

para.

RASPRAVA

60

Rezultati mjerenja brzine aminoaciliranja ScIleRS pokazuju da ona SgtRNA aminoacilira vrlo

sporo, dok s EctRNA iz E. coli radi izrazito dobro. Uz SgtRNA radi 13 puta sporije nego s

vlastitom tRNA, a brzina aminoaciliranja u prisustvu EctRNA je oko 1,5 puta brža od

homolognog aminoaciliranja. Sklonost ScIleRS prema aminoaciliranju EctRNA je već ranije

primijećena (Racher i sur. 1991). Kao i u ranijim istraživanjima (Racher i sur. 1991),

akceptorska aktivnosti ukupne EctRNA je bila veća uz ScIleRS nego uz EcIleRS. Moguće

objašnjenje za to je da ScIleRS prepoznaje i aminoacilira i neke druge molekule tRNA, osim

tRNAIle. Uspoređujući strukture svih tRNA iz svih triju vrsta (i glavnih i sporednih

izoakceptorskih tRNA), i uzimajući u obzir da ScIleRS vrlo dobro aminoacilira EctRNAIle,

moglo bi se zaključiti da je nukleotid C47 odgovoran za smanjenu brzinu reakcije

aminoaciliranja SgtRNA. SctRNA na tom mjestu ima dihidrouridin, a EctRNA acp3U - 3-(3-

amino-3-karboksipropil)uridin, oba modificirani nukleotidi uridina. Na smanjenu brzinu osim

potencijalno nedostatka pozitivnog elementa identiteta na položaju 47 mogu utjecati i

negativni elementi koji se nalaze na molekuli SgtRNA. Za potvrdu ovih tvrdnji trebalo bi

napraviti aminoaciliranje in vitro transkribiranih molekula tRNA mutiranih na određenim

položajima, kao što je napravljeno za enzim iz E. coli.

Kao i kvaščev enzim, SgIleRS aminoacilira EctRNA brže nego vlastitu tRNA. SctRNA

aminoacilira sporije, ali samo 5 puta. Pod pretpostavkom da SgtRNA i EctRNA imaju

elemente identiteta koji su potrebni za prepoznavanje od strane ovog enzima, razlog za slabije

aminoaciliranje SctRNA bi moglo biti bilo koji od 20 nukleotida koji se razlikuju samo u

SctRNA, prema sravnjenju iz Rezultata, Slika 4.1. Jedan od tih nukleotida bi vjerojatno

mogao biti modificirani nukleotid inozin na položaju 34 u antikodonu, koji je, uz još dva para

baza, odgovoran za slabije prepoznavanje SctRNA od strane EcIleRS.

Kako enzim iz S. griseus EctRNA aminoacilira brže, a SctRNA samo 5 puta sporije od

vlastite tRNA, ovaj enzim bi se mogao okarakterizirati kao najskloniji heterolognoj

aminoacilaciji od tri istraživana enzima. Obzirom da je sklonost heterolognom

aminoaciliranju svojstvenija za eukariotske enzime, po kinetičkim eksperimentima SgIleRS

nalikuje eukariotskom tipu IleRS.

Kako slijed SgtRNAIle nije sekvenciran, za Sliku 4.2 C je korišten slijed gena koji kodira za

tRNA, preuzet iz baze podataka Genomic tRNA Database (http://gtrnadb.ucsc.edu). Zbog

nepoznavanja položaja i prirode modificiranih nukleotida, zaključci izvedeni iz ovakve

strukture ne moraju biti sasvim točni. Još jedan nedostatak analize predstavlja nepoznavanje

RASPRAVA

61

točnih identitetnih elemenata za ScIleRS. Na Slici 4.2.B su plavim strelicama označeni

nukleotidi koji su prema Senger i sur. (1997) označeni kao važni za prepoznavanje od strane

ScIleRS. No kako nije napravljeno istraživanje aminoaciliranja in vitro transkribiranih

molekula tRNA mutiranih na određenim položajima, navedeni nukleotidi su označeni kao

važni jer su očuvani u molekulama EctRNAIle i SctRNAIle, koje su vrlo dobri supstrati za

aminoaciliranje uz ScIleRS.

Kako je i predviđeno iz sravnjenja slijeda aminokiselina i sličnosti s prokariotskim enzimima

koji nalikuju eukariotskim IleRS tipa 2, enzim SgIleRS je rezistentan na antibiotik mupirocin.

Rezistencija je potvrđena difuzijskim testom. Za bakteriju S. griseus nije primijećena zona

inhibicije rasta oko bazenčića s mupirocinom, što je slučaj kod E. coli. Uz to, pokazano je da

SgIleRS komplementira inače osjetljive bakterije E. coli i omogućuje im normalan rast na

antibiotiku mupirocinu.

Iako je u većini slučajeva rezistencija na antibiotik mupirocin posljedica rezistentne IleRS

koja nalikuje eukariotskom tipu enzima, slaba permeabilnost vanjske površine nekih bakterija

mogla bi ih zaštititi od djelovanja ovog antibiotika (Thomas i sur. 2010). Ovo nije slučaj kod

S. griseus. Potvrda za to dolazi iz komplementacijskog testa gdje je sam SgIleRS u stanicama

bakterije E. coli omogućio rezistenciju bakterije.

Smatra se da su bakterije koje posjeduju IleRS koja nalikuju eukariotskom tipu enzima (tip 2),

taj enzim stekle horizontalnim prijenosom gena te im je on omogućio rezistenciju na

mupirocin (Thomas 2010, Yanagisawa i Kawakami 2003). Preduvjet za horizontalni prijenos

gena za IleRS koji nalikuje eukariotskom tipu je sposobnost heterolognog aminoaciliranja. U

ovom radu je pokazano da SgIleRS, koja nalikuje enzimu tipa 2 ima sklonosti heterolognom

aminoaciliranju, pa je ovakav način prijenosa gena bio moguć. Kako neke od bakterija s tim

tipom enzima, primjerice Mycobacterium tuberculosis, žive u eukariotskim domaćinima,

postojali su uvjeti za prijenos gena za eukariotski enzim iz stanice eukariotskog domaćina

(Sassanfar i sur. 1996). U brojnim bakterijama koje posjeduju IleRS koja nalikuje

eukariotskom tipu 2, gen za enzim se nalazi u genomu. Osim u genomu, bakterije mogu gen

za IleRS koja nalikuje eukariotskoj posjedovati na plazmidnoj DNA. Jedan takav primjer je

bakterija S. aureus. Ova bakterija, inače osjetljiva na mupirocin, uz pomoć plazmida koji nosi

gen za alternativnu IleRS koja nalikuje eukariotskoj može razviti rezistenciju na antibiotik

mupirocin (Thomas 2010, Hodgson i sur. 1994). Moguće je da se u ovom slučaju radi o

početnom koraku na putu ugradnje IleRS koja nalikuje tipu 2 u genom prokariota. Ovo bi

RASPRAVA

62

mogao biti način na koji su bakterije kojima je ovaj tip enzima jedina IleRS koju posjeduju, a

među kojima je i S. griseus, primile enzim u stanicu.

ZAKLJUČAK

63

5. Zaključak • Gen za izoleucil-tRNA-sintetazu iz bakterije S. griseus uspješno je umnožen, kloniran

u ekspresijski vektor te je vektor elektroporiran u stanice E. coli. Nakon prekomjerne

ekspresije u stanicama E. coli, enzim je pročišćen afinitetnom kromatografijom.

• Kinetička aktivnost enzima SgIleRS provjerena je ATP/PPi izmjenom u prisutnosti

pripadne aminokiseline izoleucina i nepripadne aminokiseline valina. Određeni su

parametri kcat i Km za aktivaciju obje aminokiseline. Za reakciju aktivacije s

izoleucinom Km iznosi 17 μmol dm-3, a kcat 21 s-1. Za reakciju s valinom Km iznosi

1800 μmol dm-3, a kcat 19,3 s-1. Diskriminacijski faktor, omjer konstanti specifičnosti

za reakcije s pripadnom i nepripadnom aminokiselinom, je istog reda veličina kao onaj

u analognim reakcijama s EcIleRS. Za EcIleRS iznosi 150, a u slučaju SgIleRS je 120.

Na temelju ovoga može se zaključiti da je kod SgIleRS kao i kod EcIleRS potreban

popravak pogreške.

• Reakcije aminoaciliranja uz [14C]izoleucin katalizirane s IleRS iz E. coli, S. cerevisiae

i S. griseus koristeći ukupnu tRNA iz svih triju vrsta kao supstrat pokazale su da je

SgIleRS sklona heterolognom aminoaciliranju.

• U skladu s očekivanjima bakterija E. coli je pokazala osjetljivost na antibiotik

mupirocin, a eukariot S. cerevisae je rezistentan na antibiotik mupirocin.

• Prema sravnjenju sljedova aminokiselina, SgIleRS se grupira s prokariotskim IleRS

koje nalikuju eukariotskom tipu enzima. Sličnost s eukariotskim IleRS se očituje i u

sposobnosti heterolognog aminoaciliranja i u otpornosti na antibiotik mupirocin.

• SgIleRS komplementira E. coli i omogućuje preživljenje stanica u prisutnosti bitno

većih koncentracija mupirocina.

LITERATURA

64

6. Literatura Arnez J.G., Moras D. (2009): Aminoacyl-tRNA Synthetases. In: Encyclopedia of Life

Sciences (ELS). John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.

Arnez J.G., Moras D. (1997): Structural and functional considerations of the aminoacylation

reaction. Trends Biochem Sci 22: 211-216.

Cruz-Morales P., Vijgenboom E., Iruegas-Bocardo F., Girard G., Yáñez-Guerra L.A., Ramos-

Aboites H.E., Pernodet J.L., Anné J., van Wezel G.P., Barona-Gómez F. (2013): The genome

sequence of Streptomyces lividans 66 reveals a novel tRNA-dependent peptide biosynthetic

systemwithin a metal-related genomic island. Genome Biol Evol 5: 1165-1175.

Dulic M., Cvetesic N., Perona J.J., Gruic-Sovulj I. (2010): Partitioning of tRNA-dependent

editing between pre- and post-transfer pathways in class I aminoacyl-tRNA synthetases. J

Biol Chem 285: 23799-23809.

Fersht A.R., Dingwall C. (1979): Evidence for the double-sieve editing mechanism in protein

synthesis. Steric exclusion of isoleucine by valyl-tRNA synthetases. Biochemistry 18: 2627-

2631.

First E.A. (2005): Catalysis of the tRNA aminoacylation reaction. In Ibba M., Francklyn C.S.,

Cusack S. (eds.): The aminoacyl-tRNA synthetases. Landes Bioscience/Eurekah.com,

Georgetown, Texas, 328-347. Fukai S., Nureki O., Sekine S., Shimada A., Tao J. Vassylyev D.G., Yokoyama S. (2000):

Structural basis for double-sieve discrimination of L-valine from L-isoleucine and L-

threonine by the complex of tRNAVal and valyl-tRNA synthetase. Cell 103: 793-803.

Giege R., Sissler M., Florentz C. (1998): Universal rules and idiosyncratic features in tRNA

identity. Nucleic Acids Res 26: 5017-5035.

Hartmann R.K., Gossringer M., Spath B., Fischer S., Marchfelder A. (2009): The making of

tRNAs and more – RNase P and tRNase Z. Z Prog Mol Biol Transl Sci 85: 319-368.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=The+Genome+Sequence+of+Streptomyces+lividans+66+Reveals+a+Novel+tRNA-Dependent+Peptide+Biosynthetic+System+within+aMetal-Related+Genomic+Island

LITERATURA

65

Helm M. (2006): Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA.

Nucleic Acids Res 34: 721-733.

Hodgson J.E., Curnock S.P., Dyke K.G., Morris R., Sylvester D.R., Gross M.S. (1994):

Molecular characterization of the gene encoding high-level mupirocin resistance in

Staphylococcus aureus J2870. Antimicrob Agents Chemother 38: 1205-1208.

Ibba M., Söll D. (2001): The renaissance of aminoacyl-tRNA synthesis. EMBO reports 2:

382-387.

Jenal U., Rechsteiner T., Tan P.Y., Bühlmann E., Meile L., Leisinger T. (1991): Isoleucyl-

tRNA synthetase of Methanobacterium thermoautotrophicum Marburg. Cloning of the gene,

nucleotide sequence, and localization of a base change conferring resistance to pseudomonic

acid. J Biol Chem 266: 10570-10577.

Ling J., Reynolds N., Ibba M. (2009): Aminoacyl-tRNA synthesis and translational quality

control. Annu Rev Microbiol 63: 61-78.

Muramatsu T., Nishikawa K., Nemoto F., Kuchino Y., Nishimura S., Miyazawa T.,

Yokoyama S. (1988): Codon and amino-acid specificities of a transfer RNA are both

converted by a single post-transcriptional modification. Nature 336: 179-181.

Muramatsu T., Miyazawa T., Yokoyama S. (1992): Recognition of the nucleoside in the first

position of the anticodon of isoleucine tRNA by isoleucyl-tRNA synthetase from Escherichia

coli. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 11: 719-730.

Nakama T., Nureki O., Yokoyama S. (2001): Structural basis for the recognition of isoleucyl-

adnylate and an antibiotic, mupirocin, by isoleucyl-tRNA-synthetase. J Biol Chem 276:

47387-47393.

Nakanishi K., Nureki O. (2005): Recent progress of structural biology of tRNA processing

and modification. Mol Cells 19: 157-166.

LITERATURA

66

Nelson D.L., Cox M.M. (2005): Protein metabolism. In Nelson D.L., Cox M.M. (eds.):

Lehninger Principles of Biochemistry. New York, Freeman and Company, 1065-1113.

Nordin B.E., Schimmel P. (2005): Isoleucyl-tRNA synthetases. In Ibba M., Francklyn C.S.,

Cusack S. (eds.): The aminoacyl-tRNA synthetases. Landes Bioscience/Eurekah.com,

Georgetown, Texas, 24-35.

Novagen® (2003): pET system manual, 10th ed.

Nureki O., Kohno T., Sakamoto K., Miyazawa T., Yokoyama S. (1993): Chemical

modification and mutagenesis studies on zinc binding of aminoacyl-tRNA synthetases. J Biol

Chem 268: 15368-15373.

Nureki O., Niimi T., Muramatsu T., Kanno H., Kohno T., Florentz C., Giege R., Yokoyama

S. (1994): Molecular recognition of the identity-determinant set of isoleucine transfer RNA

from Escherichia coli. J Mol Biol 236: 710-724.

Nureki O., Vassylyev D.G., Tateno M., Shimada A., Nakama T., Fukai S., Konno M.,

Hendrickson T.L., Schimmel P., Yokoyama S. (1998): Enzyme structure with two catalytic

sites for double-sieve selection of substrate. Science 280: 578-582. Perona J. J., Gruic-Sovulj I. (2013): Synthetic and Editing Mechanisms of Aminoacyl-tRNA

Synthetases. Top Curr Chem (in press)

Phizicky E.M., Alfonso J.D. (2010): Do all modifications benefit all tRNAs? FEBS Lett 584:

265-271.

Pingoud A., Jeltsch A. (2001): Structure and function of type II restriction endonucleases.

Nucl. Acids Res 29: 3705-3727.

Pixa G., Dirheimer G., Keith G. (1984): Sequence of tRNAIle IAU from brewer's yeast.

Biochem Biophys Res Commun 119: 905-912.

Qiagen (2003): The QIAexpressionistTM: A handbook for high-level expression and

purification of 6xHis-tagged proteins.

LITERATURA

67

Racher K.I., Kalmar G.B., Borgford T.J. (1991): Expression and characterization of a

recombinant yeast isoleucyl-tRNA synthetase. J Biol Chem 266: 17158-17164.

Sambrook J., Russel D.W. (2001): Molecular cloning, a laboratory manual. Spring Harbor

Laboratory Press, New York.

Sassanfar M., Kranz J. E., Gallant P., Schimmel P., Shiba K. (1996): A eubacterial

Mycobacterium tuberculosis tRNA synthetase is eukaryote-like and resistant to a eubacterial-

specific antisynthetase drug. Biochemistry 35: 9995-10003.

Senger B., Auxilien S., Englisch U., Cramer F., Fasiolo F. (1997): The modified wobble base

inosine in yeast tRNAIle is a positive determinant for aminoacylation by isoleucyl-tRNA

synthetase. Biochemistry 36: 8269-8275.

Shiba K., Suzuki N., Shigesada K., Namba Y., Schimmel P., Noda T. (1994): Human

cytoplasmic isoleucyl-tRNA synthetase: selective divergence of the anticodon-binding

domain andacquisition of a new structural unit. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 7435-7439.

Silvian L.F., Wang J., Steitz T.A. (1999): Insights into editing from an Ile-tRNA synthetase

structure with tRNAIle and mupirocin. Science 285: 1074-1077.

Studier F.W., Moffatt B.A. (1986): Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct

selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189: 113-130.

Thomas C.M., Hothersall J., Willis C., Simpson T.J. (2010): Resistance to and synthesis of

the antibiotic mupirocin. Nat Rev Microbiol 8: 281-289.

Voet D., Voet J. G. (2011): Translation. In Voet D., Voet J.G.(eds): Biochemistry. John Wiley

& Sons, Inc., New York, 1346-1347.

Xu B., Trawick B., Krudy G.A., Phillips R.M., Zhou L., Rosevear P.R. (1994): Probing the

metal binding sites of Escherichia coli isoleucyl-tRNA synthetase. Biochemistry 33: 398-402.

LITERATURA

68

Yanagisawa T., Kawakami M. (2003): How does Pseudomonas fluorescens avoid suicide

from its antibiotic pseudomonic acid?: Evidence for two evolutionarily distinct isoleucyl-

tRNA synthetases conferring self-defense. J Biol Chem 278: 25887-25894.

Zhang C.M., Perona J.J., Ryu K., Francklyn C., Hou Y.M. (2006): Distinct kinetic

mechanisms of the two classes of aminoacyl-tRNA synthetases. J Mol Biol 361: 300-311.

Documents

Eukariotske karakteristike izoleucil-tRNA-sintetaze iz bakterije … · vii 2.2.2. Metode rada s proteinima 33 2.2.3. Kinetičke metode 36 2.2.4. Testiranje osjetljivosti na antibiotik