Enzimele – catalizatori biochimici

Procesele biologiceReactii chimice

Enzime

Aplicatii in

industrie

alimentara

detergentilorfarmaceutica

Shewale-Enzymes Everywhere-1996

Paradoxul biologiei moleculare

Emil Duclaux (1883)

Prima nomenclatura a enzimelor

Substrat + aza

Enzima

Uree + aza

Ureaza

http://study.com/academy/lesson/

o Gabriel Gustav Valentin (1844)

sucul pancreatic descompune

alimentele in timpul digestiei

http://www.slideshare.net/SECBIO/

digestion-29026783

o Theodor Schwann (1836)

descopera pepsina

“Despre esenta digestiei”

Procesul de digestie

o E.F. Hoppe-Seyler

1862 hemoglobina cristalina

1871 descoperirea invertazei

1875 metoda de clasificare a proteinelor

Cristal de hemoglobina ovina

http://images.nigms.nih.gov/

Cristal de tripsina porcina

L. Pasteur (1876) descoperirea organismelor

anaerobe-Studii asupra berii, alterarea ei si cauzele

care o provoaca

Cai matabolice alternative care

preced procesul de glicoliza

Alba-Lois, L. & Segal-Kischinevzky, C. (2010)

Beer & Wine Makers. Nature Education 3(9):17

www.studyblue.com

Tipuri de microorganisme

Jokichi Takamine (1894)

Aspergillus oryzae

Taka-diastaza, amilaza (1894)

Alfa-amilaza (salivara)

PDB 1smd

o Eduard Buchner (1897)

descopera zimaza care

converteste zaharul in

alcool

o Fratii Buchner

drojdei uscata

fermentatia alcoolica

http://www.preproom.org/practicals

Otto Rohm

Un “detergent” bazat pe enzime

Tabacirea

pielii

Enzime

pancreatice

E. Fischer

Specificitatea

enzimelor

Dezvoltarea enzimologiei mecanistice

-1913-

ecuatia care cuantifica

cataliza enzimei

Leonor Michaelis Maud Leonora Menten

Dezvoltarea enzimologiei mecanistice

o James B. Sumner

1926 cristalizarea

ureazei

1946 premiul

NobelStructura ureazei

(fasole PDB4GY7)

Sir Arthur Harden

Premiul Nobel pentru chimie

fermentatia zaharului (1929)

Hans von Euler-Chelpin

Dezvoltarea enzimologiei mecanistice

o O. H. Warburg (1931)Premiul Nobel pentru fiziologie

si medicina - descoperirea

enzimelor respiratorii

J. D. Bernal (1934)

prima fotografie prin

difractie cu raze X (pepsina)

1924 “On metabolism of tumors,”

stated, “Summarized in a few words, the

prime cause of cancer is the replacement of

the respiration of oxygen in normal body

cells by a fermentation of sugar.”

Dezvoltarea enzimologiei mecanistice

o H. Theorell (1955)

Premiul Nobel pentru

fiziologie si medicina

studiul enzimelor de oxidare

o John H. Northrop (1946)

premiul Nobel

cristalizarea unor enzime

Dezvoltarea enzimologiei mecanistice

G. W. Beadle

Premiul Nobel pentru fiziologie

si medicina

gasirea unor corespondente

intre gene si enzime (1958)

E. L. Tatum

Bacillus licheniformis

Proteaze in industria detergentilor (1960)

o C. B. Anfinsen

1959 Fundamentul molecular

al evolutiei - bazat pe cercetarile

asupra enzimelor

1971 impreuna cu S. Moore si

W. H. Stein premiu Nobel

pentru chimie pentru

cercetarile

asupra enzimelor

1959- Premiul Nobel pentru

fiziologie si medicina

S. Ochoa W. Kornberg

Producerea acizilor nucleici cu ajutorul enzimelor

Premiul Nobel pentru chimie

studiul hemoproteinelor

difractie cu raze X (1962)

J. C. Kendrew M. F. Perutz

o Hamilton Othanel

Smith (1970) izoleaza

prima enzima de

restrictie

Producerea acizilor nucleici cu ajutorul enzimelor

1970 Virusii contin o ADN polimeraza

- dezvoltarea ingineriei genetice

H. M. Temin D. Baltimore

1975 P. Nobel pentru fiziologie si medicina

D. Nathans

1971 obtin diferite enzime de restrictie

1978 Premiu Nobel pentru fiziologie si

medicina

H. Smith

Folosirea enzimelor de restrictie

in ingineria genetica

Enzimele de restricție

H. W. Boyer

(1973)

Producerea

ADNului

in Ecoli

Exemple de inhibitori (medicamente)

Inhibitor/

Medicament

Boala/

contextul

Enzima

Inhibată

Acyclovir

Ciclosporina

DuP450

Fluorouracil

Phenelzine

Zileuton

herpes

transplant

de organe

SIDA

cancer

depresie

alergie

ADN polimeraza

Ciclofilina/

Calcineurina

proteaze HIV

timidilat sintaza

monoamin-oxidaza (creier)

5-lipoxigenaza

phenelzine

Monoamin oxidaza A

Inhibitori folositi drept medicamente

Ramsey, R.R:, Tipton, K. H.

Molecules 2017, 22(7), 1192aadrenalina

Viagra inhiba fosfodiesteraza PDE5

Inhibitori enzimatici - medicamente

Guazzi, M., Circ Heart Fail. 2008;1:272-280

Sildenafil

(Viagra)

Inhibitori enzimatici - medicamente

Inhibitia acetil-colin esterazei

Situs activ – chimotripsină

En = in zima = drojdie

Enzime -Terminologie

Enzima + Substrat Enzima + Produs

25000 de enzime

3000 caracterizate

300 cristalizate

https://cdn.thinglink.me/

Enzimele Proteine

Proprietati importante

Puterea catalitica

Specificitate

Activitate controlata

Compusi naturali

http://book.bionumbers.org/

Puterea catalitica

Cresterea vitezei de reactie Ordin de

magnitudine

Creatin kinaza 4

Alcool dehidrogenaza 8

Hexokinaza 10

Fosforilaza 11

Ureaza 14

Orotidin-5-fosfat decarboxilaza 17

Canavalia ensiformis

Ureaza

Ureaza este prima enzimă izolată în stare

pură cristalină;

J.B. Sumner (1926) a izolat ureaza din

fasole (Canavalia ensiformis)

Helicobacter pyloriPhaseolus vulgaris

este produsă de o serie de plante, fungi şi bacterii:

Ureaza

• Obtinerea extractelor enzimatice

Sursa Mojarare Sonicare

CentrifugareFiltrareExtractul

enzimatic

Tampon

1,3- control;

2-extract din fasole verde;

4-extract din seminţe de pepene roşu;

Ureaza

Specificitatea

1. Specificitate asupra unei legaturi

http://www.easybiologyclass.com/

Specificitate

Fosforilarea

aldozelor

de grup

Hexokinazele

absoluta

endonucleazele

GAATTC

CTTAAG

5’

5’

3’

3’

EcoR I

AGGCCT

TCCGGA

5’

5’

3’

3’

Stu I

http://www.namrata.co/ http://hawaiireedlab.com/

Stereospecificitatea

Recunoastere

Izomer optic

Izomer geometric

Lactobacillus plantarum

Ecoli LDHDym et al., PNAS, 2000

Lactat dehidrogenaza

distributia izoenzimelor in organe/tesuturi

Stereospecificitatea

http://vignette3.wikia.nocookie.net/

Metalul Enzima

Na

K

Mg

Fe

Zn

Mo

Cu

-D-glucohidrolaza din intestin

Piruvat kinaza

Hexokinaza, Piruvat-kinaza,

Adenozintrifosfataza

Catalaza, Peroxidaza,

Nitrogenaza

Alcooldehidrogenaza,

Carboxipeptidaza

Xantinoxidaza, Nitrogenaza

Citocrom c oxidaza, Amin-

oxidaza

Influenta unor factori asupra activitatii catalitice

Ionii metalici

Centru catalitic al

Carboxipeptidazei A

http://www.mun.ca/biology

Cofactorii organici

biotina

piridoxal

Acid lipoic

Tiamin difosfat

Structura succinat dehidrogenazei

https://openi.nlm.nih.gov/

Clasificarea enzimelor

3 paliere

Denumire uzuala

Denumire stiintifica

EC

1. Denumire uzuala

enzima “galbena”

catalaza

papaina

tripsina

rodanazaStructura 3D a enzimei “galbene”

Williams & Bruce, Microbiology,

2002, 148, 1607

1. Denumire uzuala

Enzima “galbena”

Situsul activ al enzimei “galbene”

Aox + Bred Ared + Box

donor:acceptor-oxidoreductaza

Oxidoreductazele

Gliceraldehidfosfat-dehidrogenaza

2. Denumire stiintifica

PDB:2CZC

vLCAD-2 (ACAD-9)

C16:0 ; cis-9-C16:1 ; cis-9,12-C18:2

Gel filtrareDimer

Ensenauer, R. et al.

JBC 90, Jun (2005)

vLCAD-1 / >C16

Gel filtrareDimer

Zhang, J. et al, BBRS

297, 1033-1042

ETF

ETF

DH

Lant respirator

i2VD (SBCAD) / iLeuCOSCoA

Uman+aceto-acetil-CoA

Tetramer, Res 2.6 Å

Preliminary data

i3VD / i3vCOSCoA

Tiffany, K. A. et al.

Biochemistry 36,

8455 (1997)

Tetramer, Res 2.6 Å

iBD / iBuCOSCoA

Uman + iBD-CoA

Battaile, K. P. et al.

JBC 279,

16526 (2004)

Tetramer, Res 1.8 Å

GD / GCOSCoA

Uman +4-NBCoA

Fu, Z et al.

Biochemistry 43,

9674 (2004)

Res 2.1 Å

e-

e-

2

e-

R3

|

R1— C=C—COSCoA

|

R2

+2H+

MCAD/C6—C10

S.s. +C8CoA

Kim, J.-J. et al.

PNAS 90, 7523

(1993)

Res 2.4 Å

SCAD/C4—C6

M.e. + 3-keto-C4CoA

Djordjevic, S et al.

Biochemistry 34,

2163 (1995)

Res 2.5 Å

LCAD/C10—C18; C12

Eder, M. et al, EJB,

245, 600-607

Gel filtrareTetramer

-oxidarea

mitochondriala

Catabolismul

aminoacizilor

Oxidarea acizilor grasi

Oxidoreductazele

0

20

40

60

80

100

120

4 6 8 10 12 14 16 18

rela

tive

activ

ity

substrate chain length

LCAD VLCADMCADSCAD

MCAD tetramer (D = 90 Å)

MCAD – enzima care catalizeaza prima

etapa din cadrul oxidarii acizilor grasi cu

lant mediu (C4-C16)

Mutatii punctiforme G985A sau K304E

la interfata dintre monomeri

Fro

m K

im, J.-J., S

., Miu

ra, R,

Eu

r. J.B

ioch

em.2

71

, 48

3-4

93 (2

00

4)

Proprietati selectate ale MCAD

Oxidoreductazele

Ghisla, S.& Thorpe, C.,J. Biochem. 271, 496 (2004)

Lehman, S.& Thorpe, C., Biochemistry 29, 10594 (1990)

Mecanismul de reactie si determinarea

activitatii enzimatice

Oxidoreductazele

CYP 1A1

Citocrom P450

familia

subfamilia

Primul membru

al subfamiliei

Nomenclatura

citocrom P450

Shewale – Enzyme everywere - 1996

Transferazele

Aminotransferazele

30% din totalul enzimelor

Alanil-aminotrasferaza umana 1 (EC 2.6.1.2) + piridoxal fosfat

http://www.thesgc.org/structures/3ihj

Aspartat-aminotransferaza

L-aspartat: -cetoglutarat- aminotransferaza

sau glutamat-oxaloacetat-trasaminaza, TGO

TGO: forma citozolica

forma mitocondriala

TransferazeleAminotransferazele

www.med4you.at

Atac de cord– TGO

Injurii musculare

alanin-aminotransferaza

(L-alanin--cetoglutarat- aminotransferaza

glutamat-piruvat transaminaza, TGP)

ficatul afectat – TGP

în sistemul sangvin

TransferazeleAminotransferazele

http://www.medicinenet.com/

liver_blood_tests

Hidrolazele-Fosfolipazele

Hidrolazele-Amilazele

-amilaza salivara

umana

PDB 1SMD

E.C. 3.2.1.1

Ionul de Cl- (verde)

-amilaza

PDB 1BYA

EC 3.2.1.2

Hidrolazele-Amilazele

Iso-amilaza

PDB 1bf2

EC 3.2.1.68

www.plospathogens.org

Hidrolazele

www.mun.ca

Izomerazele

Izomerazele

Racemaze

Epimeraze

Cis-Trans Izomeraze

Tautomeraze

Catalizeaza rearanjarea unor legaturi dintr-o molecula

Racemazele

Amino-acid racemazele

L-aminoacid D-aminoacid

Racemaze

Alanil-racemaza

Metionin-racemaza

Glutamat-racemaza

Structura alanil racemazei (S Aureus)Scaletti, Acta Cryst, D68, 82-92, 2012

Piridoxal

fosfat

Bacillus anthracis

Alanil-racemaza

Racemazele

Amino-acid racemazele

Cis-trans izomeraze

Izomerazele

Protein disulfid izomeraza

• >10 proteine de tip PDI in tesuturile umane

Gruber, CW et al. TIBS, 2006, 31: 455-464.

ox

red

Izomerazele

https://www3.nd.edu/

Sintetaze (ligaze)

Acetil-CoA sintetaza

fiecare molecula ARNt

un aminoacid

Aminoacil-adenilat

(anhidrida mixta)

Aminoacil-ARNt

Aplicatii ale enzimelor in industrie

Enzimele din detergenti

Avantajele folosirii enzimelor

Concentratii

reduseActioneaza

la T mica

Biodegradabilitate

Amestecuri adaptate

de enzime hidrolitice

Marirea performantei

detergentilor moderni

Atuurile enzimelor

Activitate hidrolitica ridicata

Specificitate redusa

Functionali la pH alcalin/

prezenta inalbitorilor

Enzimele modificate:

activitate mare 20 – 40 C

www.kaolaundry.com.sg

ww

w.b

uyk

ore

a.o

rg

Enzimele in industria detergentilor

Conditiile de spalare

o Parametrii (T, pH, c)

Actiunea sinergetica a enzimelor + alte ingrediente

Amestecul

enzimatic

Proteaze

Amilaze

Lipaze

Indepartarea

particulelor de sol

murdariei din produsele naturale

http://biology-igcse.weebly.com/

Enzimele in industria detergentilor

Hidrolaze din detergenti

Proteazele alcaline

M ~ 24 KDa

Efectul: hidroliza legaturilor peptidice

indepartarea proteinelor de pe fibra

pHoptim = 10-11

Toptima = 60 oC

Functia: îndepărtarea resturilor de iarbă, mucus,

excremente, sânge, sos, spanac,

produselor alimentare (gălbenușului de ou)

Shawale-Enzyme Everywhere-1996

Enzimele in industria detergentilor

Hidrolaze din detergenti

Proteazele alcaline - subtilizina

Bacillus licheniformis

Structura cristalina a proteazei alcaline (B. lentus)

Triada catalitica Asp 32-His62-Ser215 (cian)

Galben: ioni de calciu

Goddette et al., J. Mol Biol. (1992) 228: 580-595

Enzimele in industria detergentilor

Hidrolaze din detergenti

Proteazele alcaline – subtilizina- serin proteaze

Reactia de hidroliza mediata de serin proteaze

Reactia de acilare – etapa determinanta de viteza

Reactia de dezacilare – viteza de 33 mai mare decat acilarea

Branden & Tooze (1999) Introduction to protein structure. Garland Publishing, Inc.

Enzimele in industria detergentilor

Hidrolaze din detergenti

-Amilaze

M ~ 40-50 KDa

Efectul: hidroliza legaturilor -1,4-glicozidice (polizaharide)

indepartarea amidonului

pHoptim = 8

Toptima > 60 oC

Functia: îndepărtarea pastelor, sosurilor (de carne),

budincii, cacao (ciocolată), alimentelor pentru

copii, cartofi

-Amilaza microbiana

de Souza, Br. J. Microbiol. (2010) 41: 850-861

Enzimele in industria detergentilor

Hidrolaze din detergenti

Celulazele

M ~ 52 KDa

Efectul: hidroliza legaturilor -1,4-glicozidice (din celuloza amorfa)

descompunerea microfibrilelor, îndepărtarea murdăriei solide

pHoptim = 7-10

Toptima = < 60 oC

Functia: Obtinerea de fibre fine proeminente;

Intensificarea culorii, previne albirea

Joana L. A. Brás et al. PNAS 2011;108:5237-5242

Enzimele in industria detergentilor

Hidrolaze din detergenti

Celulazele

descompunerea

microfibrilelor

Lanturi de celuloza (galbena) aflate in exteriorul microfibrilelor de celuloza cristalina

http://www.viostel.ro/pics/

Enzimele in industria detergentilor

Hidrolaze din detergenti

Lipazele

M ~ 52 - 67 KDa

Efectul: hidroliza gliceridelor

pHoptim = 10

Toptima = 60 oC

Functia: Indepărtarea uleiurilor, margarinei, grăsimilor, cosmeticelor

(make up, cremelor de soare, rujului)

Lipaza din P. mendocina

http://www.iitg.ernet.in/tldb/ P. mendocina si

particule de hematita

https://microbewiki.kenyon.edu