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UNIVERSITE DE REIMS1I1I "."•• II " ".ff .
UNITE D'ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHES DE PHARMACIE
•••
ETUDE BlOCH IMIQUE
DES GLYCOPROTE INES MEMBRANAIRES
DES CELLULES CANCEREUSES CULTIVEES IN VITRO
ANALYSES ELECTROPHORETIQUES ET
PERSPECTIVES
le 30 NOVEMBRE 1981
JURY :
Professeur J.C. JARDILLIER,
Professeur J. AGNERAY,
Professeur J.P. BOREL,
Professeur A. DESPLACES.
Président
Examinateurs
A MON PERE,
A MA MERE,
Ce travaLL est Le tLen et représente ma modeste
et faLbLe contrLbutLon au souLagement de tes
peLnes. Tu as su me faLre découvrLr et aLmer
Les scLences natureLLes. Toute ton exLstence a
été au servLce des tLens, et j'entends encore
tes mots: IIALLez Le pLus LoLn possLbLe dans vos
études, et surtout soyez justes, honnêtes et
Lntègres, avec vous-mêmes, votre entouraqe et
avec. tou t ce que vous en treprenez Il.
Je t'en remercLe.
Pour ton dévouement de tous Les Lnstants, tes
prLêres, et surtout pour L'amour dont tu nous
entoures, reçoLs LcL toute mon affectLon et,L'assurance, que je seraL tpujours pres de toL.
•
ABIGAELE,
FRANCO ISE,
La route est encore Longue et pavée d'embûches,
mals je sals que nous tlendrons bon, car "L'arbre
de La douceur et de La vle ne peut produLre que
La douceur et La vLe".
Vous êtes !Aol et je suls Vous.
A MES JUGES,
Vous me faLtes L'honneur de juger ce travaLL.
D'avance je récLame votre LnduLqence, et je
vous en remercLe vLve~ent.
A MES BEAUX-PARENTS,
A MA NOUVELLE FAMILLE,
A TOUS LES MIENS,
Toute mon affection.
A TOUS MES AMIS, et en particulier à
- Eliane
- Dominique (Chevassut)
- Dominique (Sivrière)
- Félix
- Nadine
- Phi lippe
- Raymond
En témoignage de mon amitié et de mon affection.
A MARTINE et MICHELE
Avec mes remerciements et en témoignage de monamit i é.
" ., .
A MES BEAUX-PARENTS,
A MA NOUVELLE FAMILLE,
A TOUS LES MIENS,
Toute mon affection.
A TOUS MES AMIS, et en particuLier à
ELiane
- Dominique (Chevassut)
- Dominique (Sivrière)
- FéLix
Nadine
- PhiLippe
- Raymond
En témoignage de mon amitié et de mon affection.
A MARTINE et MICHELE
Avec mes remerciements et en témoignage de monamitié.
A MARYLENE,
Sans quL ce t~avaLL ne se~aLt pas ce Qu'LL est.
Mon affectLon et ma ~econnaLssance La pLus p~ofonde.
A CAR PEN T1ER, Y., DES 0 1ZE, B., J EANNES Sm~, P., KOU AMOU 0 , J.,
TRENTESSAUX,
Pou~ Leu~ coLLabo~atLon scLentLfLque et technLque.
En témoLqnage de mon amLtLé.
A MARIE-CLAIRE,
CHRISTINE,
CHRISTIANE,
DIDIER,
RAYMOND,
Pou~ Leu~ a Ld e.
En témoLqnooe de mon omLtLé.
l
SOMMAIRE
INTRODUCTION ET PRESENTATION GENERALE •••••••••••••••• p. 1
PREMIERE PARTIE : ETUDE THEORIQUE ET GENERALITES.
- GLYCOPROTEINES DE MEMBRANE ET TRANSFORMATIONMALIGNE.
l - Introduction •••••••••••••••••••••••••• P. 5II Place des çlycoprotéines •••••••••••••• p. 10
III - Rôle biologique des ~lycoprotéines•••• p. 19IV - Pertu~ba~on3 1es glycoprotéines •••••• p. 23
membranaires liées à la transformationmaligne.
V - Méthodes d'approche ••••••••••••••••••• P. 39VI - Conclusion •••••••••••••••••••••••••••• p. 42
DEUXIErlfE PARTIE : MATERIELS TECHNIQUES ET HE'IHODOLOGIES.
l - Produits chimiques ••••••••••••••••••••II - Matériels cellulaires •••••••••••••••••
III - Récolte des constituants membranaires.
3.1. - Trypsination •••••••••••••••••••3.2. - Marqua~e des g,lycoprotéines ••••
3.2.1. - narquage métabolique •••••••3.2.2. - Marquage externe •••••••••••
3.3. - Trypsination suivie d'un •••••••marquage ex terne·
3.4. - Dosage des protéines •••••••••••IV - Techniques d'électrophorèse •••••••••••
4.1. - Introduction •••••••••••••••••••4.2. - Electrophorèse en gel ••••••••••
de polyacrilamide-sodiumdodecyl sulfate (ACRY/SDS).
4.3. - Isoel~ctrofocalisation (I.E.F.)4.4. - Electrophorèse bidimensionnelle
V - Méthodes de révélation ••••••••••••••••5.1. - Méthodes chimiques •••••••••••••5.2. - Méthodes utilisant des •••••••••
radioéléments.5.3. - Ouantification •••••••••••••••••
VI - Techniques de conservation ••••••••••••6.1. - En milieu liquide ••••••••••••••6.2. - Sur support solide •••••••••••••
p. 44p. 45p. 46
p. 47p. 51p. 51p. 52p. 58
p. 58p. 63p. 63p. 72
p. 90p. 102p. 107p. 107p. 114
p .. 117p. 119p. 119p. 119
TROISIF.rŒ PAR TIE : RESULTATS EXPERlJiIENTAUX.
l - rUses au point sur des sérum de....... p. 124veau foetal.
II - Glycoprotéines de membrane ••••••••••••
2.1. Approche pénérale ••••••••••••••2 • 2 • L1210 •••••• 0 •••• 0 •••••••••••• 0 •
2.3. 1<562 •••••;••••••••••••••••••••••III - Applications pharmacolo~iques•••••••••
3.1. Introduction •••••••••••••••••••3.2. Descriotfon des droRues ••••••••
(rIfTX-RA) .:3.3. Action dJ méthotréxate sur •••••
les ~lycdprotéines membranairesde L1210.
3.4. - Action du RA 233•••••••••••••••IV - Différenciation !et K562 •••••••••••••••
4 0 1. Introduction •••••••••••••••• o ••
4.2. - Inductiori de la synthèse •••••••d'hémoçlobine en présenced 'h' .emlne oj
4.3. - Variation des glycoprotéines•••membranaires au cours del' induc tion par l' hémine.
V - Applications cl{niques ••••••••••••••••i
QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION niTERPRETATION.
l - Techniaues-Méthddolo~ies •••••• o •••• o••1.1 0 ·Trypsination.~ •••••• o••• o ••••••1 0 2. - r-1arquagemétabolique 0 •• 0 ••••• 0 •
1 0 3. - Marquage :externe •••••••••••••••II - Ré sul tats ••••• 0 .i • 0 ••• 0 •• 0 ••••••••• 0 • 0 •
2.1. L1210•••••••• o ••••••••• o •••••••
2 • 2. - K56 2 0 •• 0 0: ••••• 0 ••••••••••••••••
2.3 0 - Effecteuns pharmacologiqueso •••2.3.1 0 L1210 - HTX ••••••••••••••••2.3.2. L1210 - RA•• o••••••••••••••2 0 3.3. K562- Différenciation •••• 0
CINQUIEME PARTIE: CONCLUSION G~NERALE.o ••••••• o•••• o.
BIBLIOGRAPHIE ••••••••' •••••••••••••••• o•••••
II
p. 133
p. 133p. 133p. 165p. 179p. 179P. 179
p. 180
p. 184p. 190p. 190p. 191
po 195
p. 199
Po 206p. 206Po 208P. 213P. 215P. 215p. 219p. 223p. 223P. 226P. 227
p 232
P. 235
INTRODUCTION ET PRESENTATION GENERALE
La membrane plasmique des cellules tumorales est de
venue un des champs d'investigation les plus fertiles où se
rencontrent de nombreuses et diverses disciplines de la
Biologie. L'intérêt que suscite cette membrane cellulaire
ne cesse de grandir pour plusieurs raisons
Une des principales raisons est due "au comportement
soc i al" des ce Il u les: en e f f et, plu sie urs au te urs (82, 8~ 201) .
pensent que les interactions normales des cellules entre
elles sont directement liées à leur surface membranaire.
En outre, le déséquilibre constant de l'hom~ostasie tissu
laire dans les cancers, provient certainement, d'une "dévia
t ion" des f 0 n c t ion s me mb ra nair es.
- De nombreux travaux commencent maintenant à proposer
la membrane, aussi bien en tant que premier site d'action
des drogues en chimiothérapie, que cible en immunothérapie.
On peut donc espérer que l'élucidation des anomalies de la
membrane des cellules tumorales apportera de nouvelles stra
tégies thérapeutiques dans cette lutte contre le cancer.
C'est donc dans ce canevas de recherche que se situe
le travail qui va être présenté.
Nous pensons comme beaucoup d'autres, qu'une approche
moléculaire des phénomènes de transformation néoplasique
passe nécessairement par l'acquisition d'une bonne technique
de base pour la séparation et l'identification des consti
tuants membranaires.
2
C'est dahs cet esp~it que nous avons essayé dans ce
travail, de mettre au point et d'exploiter des techniques
de séparatirlw èt de·réVélation des protéines·et glycopro
téines membranaires des cellules L 1210 et K 562 cultivées
"in vitro".
Nous avons choisi l'électrophorèse en gel de polya
crylamide avec toutes ses variantes (Isoélectrofocalisa
tion, électrophorèse en gel d'acrylamide, électrophorÀse
bidimensionnelle) .
La prépondérance de cette technique aussi bien ana
lytique que préparative, dans la littérature (17,31,42,
44,141,142 ), est directement liée à son excellent
pouvoir de résolution.
-Nous avons donc utilisé cette technique pour frac
tionner les constituants membranaires (glycoprotéines)
des cellules L 1210 et K 562, et pour étudier l'action
d'effecteurs exogènes (drogues anticancéreuses) sur ces
mêmes constituants membranaires.
Le travail se présente comme suit
- Oans la première partie consacrée aux généralités,
nous rappelons l'importance des glycoconjugués dans l'or
ganisation de la membrane cellulaire, et les rôles multi
ples joués par ces constituants membranaires. Nous décri
vons ensuite les désordres caractéristiques de la trans
formation maligne, et les différentes techniques d'appro
che mises en oeuvre pour mieux comprendre ces mécanismes
complexes.
- La sesonde partie, qui représente l'ossature même
de ce travail est la plus longue.
3
En effet, nous avons porté toute notre attention sur
les aspects et les détails pratiques des techniques d'élec
trophorèse et de révélation.
Oans cette partie, nous regroupons toutes les métho
des que nous utilisons. Les techniques que nous avons mises
au point ou que nous avons modifiées sont décrites en dé
tail avec les considérations qui nous ont guidés dans ce
travail. Pour les autres techniques, nous donnons les élé
ments pratiques nécessaires ainsi que les références de
base. Cette partie pourra paraître au lecteur fastidieuse,
sinon ennuyeuse par ses détails; nous nous en excusons d'a
vance car face è la "paillasse", du ~oins en ce qui concer
ne l'électrorhorèse, la qualité des résultats dépend étroi
tement du "petit détail technique".
- Oans la p3rtie expérimentale, nous exposons nos
résultats comme suit
1- La mise au ooint technique sur du sérum de veau
foetal.
2- ~'étuue des ~lycoprotéines membranaires des
cellules L 1210 et K 562.
3- Les applications pharmacologiques, c'est-è-diru
l'étude de l'effet des drogues sur ces glycopro
téines.
4- L_3S problèr1es de la différenciatioll et de la
1<' 562.
5- L'application clinique de ces techniques fonda
~enta18s è l'étude de myélomes.
Chaque fois oue cela sera nécessaire, nous indiquerofls
le chapitre de lA partie technique 00 le lecteur pourra trou
ver les indications de technologie qui nous ont permis d'é
tablir nos résultats.
4
- Dans la quatrième partie, nous exposons les inter
prétations et les discussions qu'entrainent nos résultats.
- Dans la cinquième partie qui est la conclusion
générale, nous proposons une suite du travail.
PRE MIE R E PAR T l E
5
ETUDE THEORIQUE
et
GENERALITES.
1 Il r' ' 1. '
6
GLYCOPROTEINES DE MEMBRANE ET TRANSFORMATION MALIGNE
l - INTRODUCTION
La membrane qui entoure une cellule vivante est plus
qu'une simple enveloppe ou qu'une barrière. En effet, non
seulement elle définit les limites de la cellule mais elle
contribue également à maintenir une différence entre le mi
lieu intérieur de la cellule et l'extérieur (10).
De plus, la cellule, élément de base des organismes pluri
cellulaires, ne vit pas isolément.
Les cellules sont en effet capables de s'associer en
tissus, de se reconnaitre entre elles, de se défendre con
tre des agresseurs tels que les virus. Ce sont là des mani
festations d'une "vie sociale" qui implique une participa
tion de la surface cellulaire, car c'est par leur surface
que les cellules vont être en relation avec le milieu ex
térieur.
La sur+~ce cellulaire va donc jouer un rôle primordial
dans les interactions entre cellules et dans les réponses
de ces cellules à des agents extérieurs tels que certaines
drogues, des hormones. des antigènes, des toxines ou des
agents infectieux.
Ces interactions entre cellules sont primordiales dans l~s
phénomènes de régulation de la croissance cellulaire
Les cellules cancéreuses se caractérisent par ce qu'on
appelle la perte de l'inhibition de contact, se multiplient
de façon anarchique et sont capables d'envahir d'autres
tissus par métastase 1,~! 3 7 ).
7
Dans un excellent schéma, ROBBINS ET NICOLSON (15l)
( Fig . ont rassemblé toutes les perturbations "possibles"
au niveau de la membrane cellulaire. On peut résumer les
principales d'entre elles de la façon suivante:
-diminution de, l'adhésivité cellulaire,
-abolition du contrôle de la multiplication cellulair
-perturbation de la perméabilité membranaire,
-apparition de nouveaux antigènes membranaires,(ou perte d'antigènes),
-altérations biochimiques au niveau des glycoconjugués membranaires.
La nature chimique des sites de reconnaissance exis-
tants à la surface cellulaire et responsables de la commu-
nication intercellulaire est maintenant connue: les sucres
présents à la surface des cellules vont jouer un rôle im
portant dans leur vie sociale.
Deux types de molécules présentes à la surface cellulaire
et renfermant des sucres serviront de signaux de reconnais
sance: il s'agit de lipides ou de protéines de la membrane,
substitués par un certain nombre de résidus de sucres.
On les désigne sous les noms de glycolipides et de glyco-
protéines ou plus généralement sous le terme de glycocon
jugués. Ces molécules sont en contact avec le milieu extra
cellulaire et sont ainsi accessibles aux molécules exogènes.
Les sucres constituant la partie glucidique de ces
glycoconjugués sont au nombre de 6ou7 il s'agit du glu-
cose, du galactose, du mannose, du fucose, de la N-acétyl
glucosamine, de la N-acétyl-galactosamine et de l'acide
sialique Il apparait donc que le nombre des com-
binaisons possibles de ces différents sucre est considéra
ble et peut constituer un des facteurs conférant à la sur
face d'une cellule sa spécificité (3J)
fluidité membranairemod ifi ée
perrnéabili té
transport
de surfacemodifiées
nouveaux antigènes
d'antigènes
perte ou modificationdes glycolipides
perte ou modificationdes glycoprotéines.
phagocytose ou endocytosemodifiées
adhésitivité et inhibition necontact de mouvement modifiées
8
FIG. 1 - PRINCIPALES MODIFICATIONS AFFECTANT LA CELLULEAPRES TRANSFORMATION MALIGNE SELON ROBBINS ETNICOLSON (15-::),
Des altérations au niveau de ces glycoconjugués se
traduiraient par une incapacité de la cellule cancéreuse
à répondre aux facteurs de régulation externe (1 1Q).
Avant d'aborder le problème de ces altérations, et
principalement celles qui concernent les glycoprotéines,
il est nécessaire d'introduire les théories et les modè
les qui cherchent à expliquer l'organisation et le com
portement dynamique de la membrane.
9
i n
II PLACE DES GLYCOPROTEINES DANS L'ORGANISATION DE LA
~EMBRANE CELLULAIRE:
~'.1. - Org~I_sation de la membrane
L e 5 me mb r a Il I=; spI a 5 mi que 5 d,! dive r 5 e s cellules a n j : ! a --
les 0 n t p U ê t r e j:3 0 l é e s dan.s u n [; t a t d e pur- e té:: a t i s f aL, El ri 1: •
Elle5 renfarment 50 è 70% de pro~éine5, 30 ~ 50% de lipides,
et ',eulement 2 à 10% cie 5uc;es, constitLan~-5 des glycoccnju-
gU'3S.
fJ n 5 CI i t q 1J 8 l a rT e mbr a :1 13 des LI l' fa cee '" t d~" 1/ m é t [' i q u c
et:] u <3 sa f ace e x I~ e r n e est cil i mi (' u l,: IT, 8 Il t et f' [; ri [ t i 'J il Il El 11 -
mie :-1 t IJ if f é r en t e Cl! sa fa C e :i I-l ter r - 8 (1 -, -) : .
: ,J li j cl' éJ b C! rd c,: q 1 j 13 SIN Gr R 2 t :1iI CJ LS ~l ~ êJ PP éc; l ] '0, rd. l e :=. p r C! -
t é :L l' 8 S CJ LI 1 2 S g l YI: CJ .:J ,- [J -~ el il e ,; i n t (, g r 3 les. q ij i S IJ rie des rn [ l E!
qu:' :j 8 -: [- Lis 8 n t l .".c,. in t ,0, r a (' t j 0 Il:3 h 'j ci [' iJ r: Il I_j J ,-" se,: i :' .- cl ri t
cJ éJ ri sIe C éJ :,. c'': c ,0, 5 P ~ (1 t (; i l, e '.] i, Li g l l' C :J -
Gly,:::cl:;Jide
\\
"-
'"p:iOëÉ~r,e
......
\\•
Rés .dus glycanniqU85
1 1
1Intéracticn avec
.. ~ p ~ '" ... ... '-.... '"' .l ~ ~ e lem e n t 5 e x l. ,.c; r:
du "glycocalyx "
2
lipidioue
111k_.Systèrne
r Contractile1i
F J'. '" 2 .. ~.'J '-,' L<, ,r.· " ,'l, I~.I 'f·.·.'. c·.,,, LI L" '1' L' ,0 E ,', ~ " ,,, .. r';" -' .. [- c r, ~1 """ l ", . • :, L, " ..:J "" '1 i:! r: (, !V ~,~ LJ i::. S
C [ L 'e 1.:: Sil, i ; =:'1 ALE::: S '= 1 0 i'~ r~ l 1: 0 l '.: fJ ~j ( 1 7 ii ) .
12
ROTHr1A~J el: LE~JARD (15 0 ) proposent d'ailleurs une dis
tinction entre !Jeux types dr~ protéines intégrales: (Fig. <)
Les ectoprotéines, glycoprotéines fortément hydro
philes, localisées sur la face externe de la cellule. A
cette classe appartiendraient la glycophorine, glycoproté-
i n e ma jeu r e d u g lob u 1er 0 LI g e e t les a Il t i (2: è n e s d 1 il i s toc 0 mp éJ -
tibilité.
Les end~protéines, prottines in~égrales associées
à la face cytop'"JSmiquE de lêl IflE,mbrane.
D'autre~; protéin,:ls Oll gJ'jcoprotéines men:!Jrana1res
in ter Ci gis s 8 n taI/ e c laI' É g ion P [J l él ire dt! 5 mo l écu les l i pi di -
que s E! t pou r r en:: ê t r e dis soc j. é l~ E; ci e l a m''3 mb r ,3 n e par r.: lj G -
mentation de la Force ionique! ou du pH du milieu: il s'a-
git ,jes cCJnstit,Jants extrin!~èquE?5 ou püriphÉ-riques de Ir]
membrane, en particulier des protéines du système contrac
tile de la cellljle
Il," s t do Il C i mp [1 r t 'J n!: cl e il0 ter C; LI El t QI.: s l 8 seo n s t i -
t LI an t~, Glu c ici i q IJ c; s des sI Y CCl COll ~i LI gué s mc~ III br ê na ire s " [1 il t
s i tué s sur l a f ,1 C 8 '0 >: tel' ne, CJ n f ë! i S <3 Il t c,· 0 j EC t i Ci n c! e ri', l 8
miliell extra-ceilulaire.
r e ô c tue Ile e~, t. l agI YC Ci P r CJ:~ (; il: F: rn a j fc, U [' e deI a ri. Q rli b r a l, e [1 u
g lob U :'. e r Cl LI g e , ': g a ] e mE? fi t a l' [J C!] ':. é! [~l Yc Cl P il IJ r j 1 e (F i g. cf) •
e Ile j" e il f (~ r m'" <1 3 Î r 0;; s i (j u s .j'a C j cl e s a ln i ri [',) ete s l -::: r Èi sri chu
en s LI cre s (6 G~; !.' ,., V j r 0 ri). L d G 1 :; c; Cl :J h c' l'i ri 8. C CJ minE V r 6 i se cr. b 1 a -
blem811t Ip.s éJut:'ss glyccjJf'iJt:éiIH:s in~n"b[''''nailesJ est UllB mo-
cul e c: ste 0 n Co t. i': LJ é e cl 1 él c.: i (] 1'- E; a rri '., é s, P CJ lE' r 8 set e s 1: rie h co.
en r85:Ldus de Sll;.~r8::,.
=CT:JP~OTEI~!ES
FACE CYTOPLASMIQUE
( b )
ri;.:3 - ~ =S P J S :::: - ::: ~,~, oc" I\~ S ~ il, r", Er'Î =P.,~ :~ E J:: S :: CT 0 PRO ï El :~ ES
1 4
Double
couc~e
liPidiQ7
CDDH
Phase cytoplasmique
Chaine protéique
Glvcannes
Fig. 4 - SCHEMA fVJDNTRANT L' INTEGR,l\TIDN DE LA
GLYCOPHORINE DANS LA MEMBRANE DU
GLOBULE ROUGE SELON MARCHESI ET COL. (1~7).
1 5
Cette région hydrophile est externe. Puis, l'on
l' e n cori t re une s RCI u e n c e d e 2 3 a cid e sam i nés à car a c t ère
hydropllobe qui pcrmut à la glycophor:ine :de s'ancrer dan~;
la double couche lipidique hydrophobe de la membrane.
Enfin, la réGion carboxylique terminale est également ri
che en acides aminés polaires et émerge de la face cyto
plasmique de la membrane.
La région NH2-t~rminale externe pqssède deux types
de chaînes glycanniqu8s
Les unes constituées d'acide sialique, de galacto
se et de N-acétyl-galactosamine, sont liées à la partie
protéique par l'intermédiaire d'une liaison o-glycosidique
entre un résidu de N-acétyl-galactosami~e et un résidu de
sérine ou de thréonine.
Les Butres, constituées d'acide sialique, de fucose,
de mannose, de galactose, et de N-acétyl-glucosamine sont
liées ~ la partie protéique par l'intermédiaire de liaisons
N-glycosidiqu8s entre un résidu de N-acétyl-glucosamine et
u n rés j. d u (j 1 a spa l' agi. ne.
l l Y Cl IJ ra i t qui n z e cha î n e s rJ u t YP e D- glu cos id i que
pour une chaine de type N-glucosidique par molécule ue
8; l Yc 0 p h 0 l' i n e ( 'j :'. 1? ':J, 1 2 7 J •
Bien que très variables dans leur composition, les
chaînes glycannes des glycoprotéines se classent assez
facilement par un certain nombre de structures typiques
Dans les glycoprotéines à liaison N-osidyle, on trOll"
ve constamm(~nt. la structure générale schématisée (r::ig. 5 J.
Dans ]a partie centrale de ]a molécule à partir de la liai
son N-osidy]e. on tr·ouve deux résidus de fi N-acétyJ -gJUCU"
samine, et trois résidus de mannose pour former un penta
saccharide ramifié.
1 6
Dans certains cas, sur les mannoses de ce pentasaccharide
de base, viennent se greffer un nombre variable de chaînes
composées de galactosylfi 1-4-1'J-acétylglycosaminyl.
Enfin, un certain nombre de résidus sialyls ou fucosyls
représentent l'extrêmité non réductrice de ces chaînes gly
cannes. Ces structures sont dites de type "N-acétyllactosa-
minyl".
Dans d'autres cas, le pentasaccharide central est
substitué par un' nombre variable de chaînes mannosidyles
plus ou moins longues. Ces substances sont dites de type
"oligomannosyl" (135,121)' (Fig. 6.) ..
Dans ces deux types de structure, les différences entre gly
coprotéines portent surtout sur le nombre, sur la position et
sur la longueur des substituants sur le pentasaccharide de
base. Les mêmes types se rencontrent dans les glycoprotéines
sériques.
Parmi les structures à liaisons O-osidyles. les glyco
protéines de groupe sanguin présentent également une struc
ture typique (Fig. 7 ). Chaque groupe sanguin peut se carac
tériser par un résidu glycannique: par exemple, le groupe A
correspond à une chaine glycannique avec un N-acétylgalacto
samine~-1-3 supplémentaire sur le galactose terminal. Dans
l e g r 0 u p e B, 0 n t r 0 U v e à l a mê ITJ e pla c e u n gal a c t 0 s e (1 R 1 , ? '1 (1 ) •
La différence héréditaire entre les individus des groupes A
et B correspond à la présence chez les premiers d'une N-acétyl
galactosaminyl-transférase et chez les seconds d'une galacto
syl-transférase.
La séquence de très nombreux oligasaccharides de l'u
rine normale ou de sujets déficients en diverses glycosidases
a été établie (~75,17~. Ces oligosaccharides correspondent au
produit de dégradation partielle des glycoprotéines, et pra
tiquement toutes les structures correspondent à des fragments
provenant des modèles généraux décrits plus haut.
'_0t}:.
· 1 7
Fig. 5 - STRUCTURE DE TYPE N-ACETYl-lACTOSAMINE
SELON MONTREUIL (135).
Fig. 6 - STRUCTURE DE TYPE OlIGOMANNOSIOE.
NANA
FUC
Gal
GleNAC
Man
Asn
Acide Sialique
Fucose
Galactose
N-acétyl glucosamine
Mannose
Asparagine
CHAINE DE GROUPE CHAINE DE GROUPE
TYP E l SANGUIN TYPE II SANGUIN
Gal (?;(;!-.-.~) .,..GLcNAC-R Gal (3(;!--+4) ..GLcNAC-R
Fuc F uc(I\(~~l)t ( ) ~(A-'~\ @>CA.--> 4)(3 .l~~
.. GLcNAC-R 0 al lPGLcNAC-R 0al
Fuc Fuc
o("'>t d-- (A-+~)
GalNAC o((A~~) al (3(.~~~)...GLcNAC-R A GalNAC o({h~~al (3(A."+u)
~GLcNAC-R AJJ>-'
Fuc Fuc
ol("'\ ol(A-+l)~
Gal "'(..(~3\~, al (3(.A_3) ~LcNAC-R (3(-t _4)B Ga l d(A~;) Ga l ..GLcNAC-R B...
Fig. 7 - DETERMINANTS GLUCIDIQUES DES ANTIGENES DE GROUPE SANGUIN A B 0 SELON HUGGES (82 J.
-"CD
1 9
III - ROLE BIOLOGIQUE DES GLYCOCONJUGUES DE LA MEMBRANE
CELLULAIRE :
La présence à la périphérie d'une molécule de structu
res spécifiques, dont les positions relatives sont con
ditionnées par le type de structure glycannique, peut être
à l'origine d'activité biologique tout comme la position
relative de quelques résidus aminoacyls dans une structure
tertiaire de protéines réalise le centre actif d'une enzy
me et crée l'activité enzymatique ( 4 ).
End' a u t r est e r mes, les 0 ses peu v e ri t se r vi r deI e t
tres dans un vocabulaire biologique où les mots se forment
en faisant varier la nature des oses présents, la position
et la configuration 0<. ou ft des liaisons glucosidiques
la présence ou l'absence de chaines latérales (1S7).
3.1 Antigénicité des g:ycoconjuguéy de la surface
cellulaire:
La présence sur la surface externe d'une hématie de
glycoconjugués de groupe sanguin offre au système immuni
taire un moyen de reconnaitre le "non soi" (,~ ).
A_ la surface des globult"s rouges se trouvent des gly
coconjugués, déterminants des groupes sanguins A, B, 0 (2-='C,
Il s'agit essentIellement de glycolipides portant des sé
qUE! nces g l Yc a n n i que s car a c -c é ris t i que s d' u n g r 0 u p e don né.
Cep end a nt, l 8 S g l Yc 0 pro t é i Il es deI a m8 mb j'a n e deI' hé mat i e
semblent comport'3r également des déterminants antigéniques
du système A, B, 0 ( 181).
La glycophorine, et plus particulièrement les chaines gly
canniques de type O-glycosidique, serait responsable de
l'expressiGn de l'antigènicité. MN.
Les antigènes d'~istocompatibilité constItuant le système
HLA chez l'homme sont des glycoprot~lne~ membranaires (17R
conférant aux tissus de chaquH indi\ljdLJ .Oa propre spécifi
cité.
20
3.2.- Rôle de récepteurs
Des glycoprotéines telles que la glycophorine, qui
traversent toute la membrane, semblent être impliquées
dans le transfert d'une information reçue à la surface cel
lulaire vers le cytoplasme.
Ainsi, des récepteurs de l'insuline ont été isolés
à partir de membranes plasmiques d'hépatocytes ou de cel
lules adipeuses (90 ). Il s'agit de glycoprotéines intégra
les, selon la nomenclature de SINGER et NICDLSON, qui ne
peuvent être extraites qu'après solubilisation de la mem
brane par des détergents. Lorsqu'on détruit la partie gly
cannique de ces molécules par digestion enzymatique, leur
capacité à fixer l'insuline est abolie.
De même, Id neuraminidase abolit la production de
sté r D ï des par les cel Iules a d r é n 0 c.o.r-l.i cal 8 s s t i mu l é 13 par..... ; ,-' " ' .. ':·r~"'''''",
l' hormone adrénocorticotropiqu·.~'>~ÀC·TH:-':/f"~6). Cela démon-.... ~---. .. "t rel a n a t ure g]. y C 0 pro t 8 i n i q t,j ~/~ 13 c 13 ie,c ê:~: t e u l'ho r mon al.
, f ,-.., " \ >'
! : '.' f\ f.'l r- . \ : ;
Parmi ces glYCOprotéin~~\~~p1:j~l~k;~il faut encore<. \. ,Yi!
c i ter 1er é cep t eu l'me mb l'an air e/ d,zA S H.W-E '-0l;:""/( 1 2 J: ils 1 agi t",:"r 1" • S').'5<';-;-·
d'une glycoprotéine présente dà"r-i~~~~g~mémbrane plasmique
des hépatocytes, capable de fixer des glycoprotéines d'o
rigine sérique, telles que l'orosomucoïde ou la céruléo
plasmine, partiellement dégradées. Ces glycoprotéines sont
ensuite endocytées par la cellule hépatique et complètement
catabolisées au niveau des lysosomes. En effet, la céruléo
plasmine marquée au 64 CU , désialidée et injectée en intra
veineux au Rat est très rapidement éliminée de la circula
tion sanguine par le foie et on retrouve le 64 CU au niveau
de~3 lysosomes (69 ).
Cette clairance rapide d'une glycoprotéine sérique
désialidée a été confirmée pour l'orosomucoide, la fétuine,
l'haptoglobine, la macroglobulineoC.2' la gonadotrophine
chorionique et la F.S.H. mais non pour la transferrine. De
plus, il s'agit d'un phénomène actif saturable: une forte
concentration en glycoprotéines désialidées peut inhiber
la clairance d'une autre glycoprotéine désialidée ( 137
Les glycannes privées de l'acide sialique présen
tent un galactose terminal, et c'est ce résidu saccharidi
que qui est reconnu par un récepteur membranaire.
Cette "Hépatic-Binding-Protein" (HBP) a été isolée à partir
des membranes plasmiques d'hépatocytes de Lapin. C'est une
glycoprotéine de type N-acétyllactosamine (13. BD. 100).
Par le même processus, ce récepteur membranaire serait
également capable de reconnaître les globules rouges et les
lymphocytes circulants §gés, permettant ainsi, leur élimi
nation.
En fait, ce récepteur reconnait des résidus de galac
tose démasqués sur ces glycoprotéines ou des cellules ~gées.
Mais, curieusement, si on soumet ce récepteur à l'ac
tion d'une neuraminidasB, cette glycoprotéine réceptrice
n'est plus capable de reconnaître les glycoprotéines sé
riques désialidées (13,80 l, d'où l'importance de l'a-
cide sialique souvent terminal sur les chaînes glycanniques.
Un système du même type permet l'excrétion puis la réabsorp
tion intracellulaire des enzymes lysosomales de nature gly
coprotéique.
22
3.3.- Rôle dans les phénomènes d'adhésion intercellu
laire
De nombreux auteurs ont pu isoler à partir de milieux
de culture de divers types cellulaires, des macromolécules
de nature glycoprotéinique ayant pour origine la surface
cellulaire. Ces glycoprotéines purifiées sont capables d'in
duire la réassociation de cellules préalablement dispersées
( 70) ,
Ainsi, Mc CLAY et MOSONA (131) ont réussi à isoler
à partir de cellules de la rétine une glycoprotéine de
masse moléculaire de 50.000 daltons qui semble intervenir
dans ces phénomènes d'adhésion intercellulaire. Ces gly
coprotéines auraient les mêmes propriétés que certaines
protéines ou glycoprotéines d'origine diverses appelées
lectines, capables de reconnaitre spécifiquement certains
sucres présents à la surface cellulaire et capables de
provoquer l'agglutination des diverses cellules (1j6).
On voit donc le rôle important joué par ces glyco
protéines de surface dans le contrôle de la "sociabilité"
des cellules.
23
IV - PERTURBATIONS DES GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES LIEES
A LA TRANSfORMATION MALIGNE
Les glycoprotéines localisées à la surface de la cel
lule animale jouent un rôle important dans les activités
biologiques de cette surface, comme par exemple le transfert
actif à travers la membrane (154 l, l'inhibition de contact
de mouvement décrit par ABERCROMBIE et HEAYSMAN 2 l, le
rejet des greffes et la suppression des facteurs antigéni
ques (93 l.
- En outre, le fait que la surface de la cellule soit
riche en hydrates de carbone, et que la plupart des glyco
protéines soient localisées dans des sites tels qu'elles
sont directement en contact avec le milieu extracellulaire,
a incité de nombreux travaux à s'orienter vers les modifi
cations que subissent ces glycoprotéines, au cours de la
transformation maligne, et par conséquent les différentes
altérations des activités biologiques liées à la présence
de ces mêmes glycoprotéines.
On sait que la contamination par un virus ou la trans
formation tumorale entrainent des modifications de la com-
position des glycoprotéines de membrane 21); or, au même
moment, les cellules perdent un certains nombres de proprié
tés (comme par exemple: l'inhibition de contact ... )
De nombreux rapports ont été faits sur l'augmentation
ou la diminution (et parfois disparitionl de polypeptides
spécifiques, associées à la transformation des fibroblastes
(86, 140, 191, 153).
24
4.1 - Protéoglycannes et glycoprotéines de la matrice
extracellulaire
Les protéoglycannes (acides hyaluroniques, chondroi
tines sulfates, héparan sulfate) font partie du glycocalyx
ou " cell coat", sorte de matrice extra-cellulaire pauvre en
lipides mais très riches en sucres.De nombreux auteurs ont décrit
les variations du taux de certains protéoglycannes associés
à la transformation. Ainsi, de nombreuses cellules transfor
mées par des virus, synthétisent plus d'acide hyaluronique
que les cellules normales mais semblent synthétiser moins
d e pro t é 0 g l yc a n n e s sul fat e 3 ( 1 6 2 ). Cep end a n t une g é né raI i
sation reste délicate, car les résultats expérimentaux sont
souvent très hétérogènes et trop peu de systèmes cellulaires
ont été étudiés.
-Il semble également que la biosynthèse du collagène,
autre constituant de cette matrice extra-cellulaire, soit
diminuée après transformation 45 ) .
- Eni 9 73, d i Il ers g rOll p e s der e che r che déc r i v ai e n t
simultanément ~ la surface de fibroblastes en culture une
glycoprotéine de haut poids moléculaire (210 - 270.000 dal
ton s s 8 l 0 Il lep roc é d é d e d é t e c t ion u t il:; s é), t r è s sen s i b l e
aux protéases et disparaissant après transformation.
Il s'agit de l'antigène de surface du fibroblaste
( S FA) (1 ~<) ), de J a gal a ct 0 pro t é i ri e a de HA K0 MOR l
de la LETS protéine (large external transformation sen-
sitive proteinl de HYNES ~7 l, de la protéine de sur-
face ceLlulaire (CSF') de YAMADA ( 21.4), ou du facteur Z
deR 0 BBl NS ( 1:=i 51 .
Inutes ces glycoprotéines possédaient des caractéris
t i que sel) rn mu Il es, c' i n s i rj' ail leu r s q upd' a u t r e s g l Yc 0 pro t é i
nes plasmatiqu3s, d'oG la suggestion faite en 1976 par le
g r 0 u p e f :i Il l a 1-1 d ais cl e F< U0 S '- AHTIde l 3 S r éi s sem b 1er sou sIe
nom de fibroller:tir es -d:J latin nfibra' (fibre) et "nectere"(lier)
25
Ce sont donc des protéines capables de se lier. de
s'associer à des protéines fibreuses. Au niveau des mem
branes cellulaires. cette fibronectine est un autre élé-
ment du glycocalyx.
La structure (fig. et les propriétés de ces
fibronectines ont fait l'objet de deux revues récentes
101, ?1?-
Cette glycoprotéine qui existe chez la cellule nor
male. est largement diminuée ou disparait chez la cellule
transformée ;~C, 140, l(H, 154, 85
C'est une glycoprotéine de haut poids moléculaire, (210
270.000 daltons), trouvée dans le sang et les tissus des
vertébrés, et dans les cultures cellulaires adhérentes
-L.'utilisation d'anticorps antifibronectine fluores
cents a permis de montrer que cette fibronectine constituait
à la surface des fibroblastes en culture un réseau complexe
de fibrilles et d'agrégats particulièrement abondants aux
points de contact entre deux cellules ou entre la surface?1'l
cellulaire et le substrat .. '-) l d'oL l'hypothèse d'un
rôle important joué par ces glycoprotéines dans les phéno
mènes d'adhésion intercellulaire ou d'adhésion au substrat
dans le cas de cellules en culture.
Le point de départ de l'intérêt porté à ces protéines 8St
l'observation d'une diminution de la quantité de fibronectine
associée à la surface cellulaire des cellules transformées
par un virus oncogène ou par un cancérigène chimique.
Cependant, il faut noter qu'il existe de nombreuses excep
tions à cette règle. et YAI'1ADA et DL DEN ( 212) ont noté que
sur 89 espèces de cellules transformées. 12 ne présentaient
pas cette diminution du taux de fibronectine.
26
~A[a"'[GfOYr ln
lys
A
_ COOli1
51
S.~ COOH
B
/-1
\ f""ll( ,
1 1......c>"
F j g. G, -- seri 1': r'! A U t ..è, T .~ LI C ~. 1 J R [ 0 E L 1\ F~: f\ R0 NEC T [ 1\1 E
A - SE LI Ir·' 'v A'-1 [R l ( J. :'1 ) .
El - ': ELli [\1 (A '1/\ 0 fi (? 12 ) •
27
De même, le pouvoir oncogène d'une lignée cellulaire
ne semble pas lié de façon absolue à son taux de fibronectine
membranaire, c'est-à-dire qu'une cellule possédant peu de
fibronectine n'est pas forcément oncogène. Par contre, à cet
te diminution du taux de fibronectine, serait plutôt associée
la tendance qu'ont les cellules transformées à métastaser
( 30 ). Cette observation semble compatible avec un rôle im
portant de ces fibronectines dans les phénomènes d'adhésion
ce Il u lai r e ( 120, 1 0 1, ? 12, ':;~), :? (,
-Cette fibronectine présente d'ailleurs une grande af
finité pour le collagène natif, l' héparine et les surfaces
cel luI air e s ( ;'1 n , 1 Cl:1J, e t l' i ncap a c i t é des cel luI est ra n s for
mées à synthétiser ou à lier la fibronectine est parallèle
(du moins dans cQrtains systèmes) à l'incapacité de ces mê
mes cellules à synthétiser ou à lier le collagène et les
protéoglycannes ( 1()1 )
-Cette glycoprotéine adhésive, de haut poids moléculaire
jouerait un rôle important dans l'adhésion cellulaire, les
fonctions du système réticulo-endothélial et la différencia
tion embryonnaire ( ?l? ).
En effet, l'addition de LETS protéine purifiée dans un mi
lieu contenant des cellules transformées, entraine l'adhé
sion des cellules entre-elles et le regain de fibres d'ac-
tine ?~). Elle s'attache aux cellules en un réseau fibril-
laire et ce lien est plus important avec les cellules norma-
les qu'avec les cellules transformées 00).
En conclusion, cette fibronectine semble être une gly
coprotéine jouant un rôle important dans les interactions
cellule-cellule ou les interactions cellule-substrat dans
le cas des cellules en culture. Sa disparition de la surfa
ce des cellules transformées serait due à une diminution au
28
niveau de la biosynthèse de mRNA spécifique de cette protéine
:2 ), ou à une dégradation par les protéases, en particulier
par la plasmine présente à la surface des cellules transfor
mées ou encore à une diminution du nombre de récepteurs mem
branaires pour cette glycoprotéine, ces récepteurs pouvant
être du collagène ou ses précurseurs associés à la membrane
de surface; cette disparition peut également être la consé
quence d'une glycosylation imcomplète de la protéine lors de
la biosynthèse. On sait en effet que cette forme de fibronec
tine incomplète est très sensible à l'action des protéases
( 145 ) .
Si l'absence de cette fibronectine, ne semble pas re
présenter un marqueur absolu de transformation maligne, il
faut cependant remarquer que dans tous les nombreux articles
qui traitent de la LETS glycoprotéine, les auteurs sont una
nimes sur le fait que sa disparition ou sa diminution est
un phénomène lié à la transformation.
4.2.- Modifications affectant les glycopeptides mem
branaires
Les travaux de WARREN et al. en 1978 ont bien démontré
que les glycopeptides du type N-glycosidique, obtenus après
"protéolyse", ont toujours une masse moléculaire moyenne,
légèrement supérieure à celles des cellules normales (MM 4500
pour les cellules cancéreuses: 3700 pour les cellules normales)
lorsqu'on les analyse en chromatographie de tamisage molécu
laire ( :::?Ol ). Cette différence disparait lorsque les glyco
peptides des cellules transformées sont préalablement soumis
à l'action d'une neuraminidase ou d'une hydrolyse acide ména
gée. Donc, l'hypersialylation des glycoprotéines membranaires
semble être un facteur constant dans la cellule transformée
(in vivo et in vitro) quel que soit le type cellulaire étudié
et l'agent transformant.
29
Il faut é8alement signaler que les glycopeptides prépa
rés à partir de noyaux, des mitochondries,des lysosomes et du ré
ticulum endoplasmique des cellules transformées, présentent
tous cette hypersialylation ?3). Une autre étude récente
lqO) des comportements chromatographiques des glycopeptides
isolés à partir de 24 glycoprotéines membranaires différentes
de cellules normales et transformées montre que dans vingt
glycoprotéines isolées de cellules transformées, on retrouve
ces glycopeptides de plus grande masse moléculaire.
On les retrouve également chez des cellules non trans-
formées en mitose (196 );cependant VAN BEEK [194 a mon-
tré qu'ils étaient absents de la surface des lymphocytes nor
maux, de lymphoblastes prelevés à des malades atteints de mo
nonucléose infectieuse et surtout de lymphocytes normaux sti
mulés par les phytoagglutinines (ou lectines), alors qu'ils
son t pré sen t s ~" (l :;) à las Ij r f ace deI e u c 0 c Ytes hum a i n s pré-
leucémiques ou prélevés à un stade précoce de la maladie.
Il semble surtout très important de noter qu'il existe une
relation très étroite entre la présence de ce type de glyco
peptides à la surface d'une cellule et son pouvoir oncogène
1q r" G3) et selon VAN BEE K :- :"i !:,) , leu r r e che r che, à la
surface des lymphocytes humains aurait ainsi valeur de diag
nostic.
Les résultats semblent également prouver que cette
altération des structures glycanniques des glycoprotéines
de la membrane représente bien une modification fondamen
tale primaire associée à la transformation maligne. Oans
d'autres expériences, l'utilisation de ces glycopeptides
dés i a l y lés a p e r mis à WARR E ~J (:c u:~ ) d e met t r e e n é v ide n c e
chez les cellules transformées une sialyltransférase capa
ble de transférer activement de l'acide sialique à partir
du CMP-acide sialique sur ces glycopeptides désialylés.
30
Quelques exceptions ê cette règle ont cependant été décrites
.17), mais dans ce cas, l'oncogénicité d[~s cellules ne sem
ble pas avoir été établie avec certitude.
Ces glycopeptides de grande taille lenv.4500 daltons)
ainsi que leurs hCJrnologues "norrnaux" (env. 3/00 daltons) re
présentent en fait, des populations très hét0rogènes pouvant
être sous-fractionnées rlar chromatographie d'échange d'ions,
par électrophorèse à halJt voltage ou paf' chrc,matographie
d'a f fin i tés u r div 8 r 3 e s colon n e s d E: l,~ c: tin f~ sinsol u b il i sée s
40 ).
Ces g l Yc 0 ppp t:i a e s p ù s S f: der aie n t ai n si P lu~) cJ e br an che~:; ex-
ter ne s que les g l Yc 0 pep i ide s d e cel l u 1:: ~, n [) r n: ale s. 0 GAT A
1/1.3) a d' ai lleur's, SUI' la basl3 du C[J!llportenent de ce~; gly
co pep t ide s sur co] 0 ri ne cl e S 8 P ha d e x [. ~j:l etc t: rom a t 0 g ra phi e
d' affi ni té. sur concélnavali-!e A , avant et après action d'exogly-
cos i d a ses, p ['op 0 s É! las c h é ma des t rue t J r e
figure 'l.
r t: pré sen t é par la
A c [j t é de CEl S :~ l y c: 0 pep t i d [~ s r~·· g.l Ycos j d j q LJ es, u n au t r e
t y p e des t f LJ (; tu l'e g l Ycar, n i que est r:: l" é ~>:: n t fi J a :> u l'fa c e cel-
luI air e. l l ~,' a g :L t d I~ g J Yc 0 pro t [~ i n e s p ,:' s s é cl a rit des g l YL: a n n e s
ê lia i son (j - g l YC 0 é; i d i qu': e n t r e li n rés i ,j u d [, ~I - a ,~ é t Yl g ü lac t 0
sam in e et II n rés i cl u rJ e é. é l'in e 0 IJ th r I~! 0 '·1 in e J
liaison tri!3 la!.li]e ,"n 'Ililieu alcalin. CI3S strLJ!~tures unt été
mises en évidence:':lu ni.eau de la g.lYI;.'pllorire, glycopr'otéine
majeur" de J d rTIerntJI,:;nl~ dl., globule :-cugn (lB? ), '3t CODHJGTDN
et Coll. o ri t i s 0 ] é, à pal' t Lr d n cel] u 1 es as ci t i que s
TA 3 Ha, une g l Yc Cl pro t i~ i Cl ": qu' ils a p p n l J,:, n t {, P i g] :1 c a n i ne, t l'Ès
ri che en g J Yc a n n e é, l L P. s 0 - g l Yc 0 ~; i d i q lJ El rfl e Il t SI. r l a p r' 0 tÉ, i ne.
6 HAV f, IJ A I~ 0 rI r'J 1 ç~ ] su g g 8 r [~, que l:J P r' é é: e fi ,; e sur ] a par-
t i e pep t id j q l! 8 cl e ri 0 rrl bru x g l YC cl n Il e s li·? l Y[: 0 ~: i cJ Lque s s i a l y lés.
pro t è g E' rai t C 8 l ] El - cidel' a c t i 0 ! 1 d 8 S P:J t é éJ S f: s, d' 0 Ù l 8 U r r e
lative grorllJe taiJ lu
Branches
Pentasaccharide de base
1.- _ _ _ _ _ __ __ _ __ _ _ _ ... ~
Fig. ~\ - '3 CHE '''1 A D [ sn JeT Il R E [] E.:· G '1. '( C !~I P EF TI 0 ES IJ E
31
32
Bien que ces structures aient été retrouvées à la surface de
nombreuses cellules normales (40, 46, 13:-J ), elles semblent
être plus abondantes à la surface des cellules cancéreuses,
en particulier au niveau des tumeurs ascitiques ( 33, 199 ).
Co mm e les ug gère SAN FOR 0 (163). l'a bon dan ce de ces g l Yc 0 pro
téines O-glycosidiques, à la surface de la cellule cancéreuse
masquerait certains antigènes de surface, en particulier
certains antigènes d'histocompatibilité.
BRAI'1WELL et HARRIS (22 ), utilisant, récemment une
.;echnique de fusion cellulaire ( 20~ entre diverses cellules
tumorales et normales, ont permis de suivre les caractères
restant associés de façon spécifique à la transformation ma
ligne. Ces caractères doivent exister chez la cellule tumorale
d'origine, disparaître chez des cellules hybrides, et réappa
raître chez les sous-populations cellulaires présentant un
pouvoir oncogène. Gr~ce à cette technique, BRAMWELL et HARRIS
constatent que la seule modification associée à la transfor
mation maligne, touche une glycoprotéine membranaire, ayant
une masse moléculaire de l'ordre de 100.000 daltons et un
point isoélectrique égal à 4,0. Cette glycoprotéine, chez les
cellules transformées, fixe plus de concanavaline A et moins
de lectine de germe de blé (W.G.A.) que la même glycopro
téine présente chez des cellules normales. Sur cette base, les
auteurs concluent à une glycosylation anormale de cette glyco
protéine 100.000 K et établissent une relation entre le récep
teur insulinique isolé par le groupe de CUATRECASAS (qO
qui possède une masse moléculaire de 135.000 K et un point
isoélectrique égal à 4 et qui fixe également à la fois la
concanavaline A et la lectine de germe de blé (W.G.A.).
BRAMWELL et HARRIS ( 22 ) émettent l' hypothèse qu'une
anomalie structurale au niveau de ce récepteur serait respon
sable de la perte des mécanismes de régulation de la crois
sance caractérisant la cellule maligne.
33
4.3.- Autres altérations de surface où sont impliquées
les glycoprotéines membranaires
4.3.1.- REACTIVITE AUX LECTINES.
On sait que la contamination par un virus ou la trans
formation tumorale entrainent des modifications de la composi
tion des glycoprotéines de membrane (201; 140, 4, 21); or.
parallèlement. les cellules perdent un certain nombre de pro
priétés comme. par exemple. l'adhésion sur des substrats. et
l'inhibition de contact. La concanavaline A (Lectine) ajoutée
au milieu de culture peut rétablir l'inhibition de contact
(~, 165, 166).Par ailleurs. les cellules transformées sont
agglutinées par certaines lectines à des concentrations beau
~oup plus faibles que les cellules normales.
C'est cette observation de AUB 14 ) qui fut le point
de départ de toutes les recherches actuelles sur les lectines
-Les lectines sont des (glyco) protéines que l'on a d'a
bord extraites des végétaux. mais on en trouve un peu partout:
dans les extraits de cellules animales. des champignons. des
levures (165, 160, 116)· Ces lectines possèdent la propri-
été de se lier spécifiquement à des sites récepteurs de la
membrane cellulaire. Et. l'interaction de ces lectines avec
les cellules. dans plusieurs cas peut être inhibée spécifique
ment par de simples sucres (165,lG6 ).
Ceci prouve donc que les lectines se lient spécifiquement à
des saccharides présents à la surface de la cellule (165 ).
Les lectines se li8nt aussi aux mono et oligosaccherides et
elles précipitent spécifiquement les polysaccharides et les
glycoprotéines. Cette précipitation est aussi inhibée par
l'addition de sucres (lG~, 91 ).
-L'agglutination des cellules par certaines lectines
est plus forte chez des cellules transformées par des virus
oncogènes, par des agents chimiques carcinogènes ou trans
formées spontanément, que chez les cellules normales.
( 140, 14, 165, 166 ).
Ces faits renforcent l'idée que la surface des cellules
transformées diffère de celle des cellules normales, et en
particulier au niveau de la répartition des glycoprotéines.
En effet, les analyses chimiques, ont démontré la nature gly
coprotéinique des récepteurs qui contiennent des sucres neu
tres,de l'acide sialique, et de la glucosamine (91 ).
La microscopie électronique a été utilisée pour loca
liser les récepteurs de lectines, et pour déterminer leur
répartition, et leur relative mobilité, à la surface des
cellules transformées et normales (140 ).
NICDLSDN (lLlO ) avec de la concanavaline A marquée à
la ferritine, a démontré que comparativement aux récepteurs
de concanavaline A des cellules 3T3 qui sont plus dispersés
les récepteurs de concanavaline A à la surface des cellules
SV 3T3 ont une distribution plus regroupée.
MICHAEL INBAR et LED SACHS (P8 ) ont démontré que
environ 85% des sites liant de la concanavaline A, sont exposé~
à la surface des membranes des cellules transformées alors
que ces mêmes sites sont comme "voilés" chez la cellule nor
male.
Les changements dans les mécanismes de régulation cel
lulaire associés à la transformation, résulteraient
de changement de structure de la surface membranaire
qui"dé'Joilerait" ses sites récepteurs chez des cellules trans-
formées
35
Comme nous venons de le décrire. l'augmentation de
l'agglutinabilité chez la cellule transformée. n'est pas
due à une augmentation du nombre des sites récepteurs pour
la lectine: ceux sont présents en nombre sensiblement égal
à la surface des cellules normales et transformées. Par
contre. il existe une plus grande mobilité de ces sites chez
la cellule transformée. Ces résultats ainsi que d'autres sem
blent reflèter une plus grande fluidité de la membrane can
céreuse par rapport à la membrane normale 105, 1Gb ).
Il faut cependant noter que l'enthousiasme provoqué
par la découverte des lectines a un peu diminué.
On s'est rendu compte en effet qu'il était extrèmement dif
ficile d'identifier les modifications de la structure de la
surface cellulaire pendant la transformation des cellules
normales en cellules malignes. En outre. l'augmentation de
l'agglutination par les lectines, n'est pas une propriété
commune à toutes les cellules malignes.
Malgré ces aléas, l'utilisation des lectines représente une
technique précieuse pour l'étude de la structure des glyco
protéines de membrane.
4.3.2.- Glycoprotéines et antigènes de surface
L'apparition de nouveaux antigènes associés à la
transformation maligne est un phénomène important. car ces
antigènes peuvent permettre in vivo à la cellule maligne
d'échapper à l~ surveillance du système immunitaire (75 ).
Ces néoantigènes présenteraient des structures différentes.
des spécificités antigéniques nouvelles. des localisations
différentes. dES mobilités .variables et des rôles différents
dans les phénomènes de rejet (l~O ).
36
Ces antigènes peuvent être des antigènes embryonnaires
tel l'antigène carcinoembryonnaire (C.E.A.) de nature glyco
protéinique, qui réapparait à la surface des cellules tumo
rales du colon (je). et aussi de nombreuses autres tumeurs.
Les antigènes nouveaux (néoantigènes) spécifiques aux
transplantation, apparaissent à la surface des cellules trans
formées par des virus oncogènes ou des cancérigènes chimiques.
Ce sont les T.S.T.A. (Tumor spécifie transplantation antigen)
ou encore appelés T.A.T.A. (Tumor associated transplantation
antigens) .
L'immunogénicité de ces néoantigènes, en particulier
des T.S.T.A. induits par les virus oncogènes a fait l'objet
de nombreux travaux, en particulier ceux de KURTH et BAUER
( lir)). La propriété la plus importante de ces T .S. T .A. sem
ble être leur rôle dans la protection d'hôtes syngéniques
contre la prolifération tumorale: des animaux immunisés par
ces antigènes sont ainsi capables de rejeter une tumeur trans
plantée renfermant cet antigène.
Un autre exemple du mode d'action de ces T.S.T.A. nous
est donné par ]a régression, chez le ~hat, des tumeurs indui
tes par l'inoc~lation du virus du sarcome félin (FeSV) et
par la résistance naturelle de ces animaux au lymphosarcome
induit par le virus de la leucémie féline (FeLV). Cette résis
tance est liée à la présence dans la membrane d'un antigène
appelé F.O.C.M.A. (Feline Oncornavirus associated cell mem-
b r a n e a n t i g e,,) (," ::' ). Cet a n t i g è n e est den a t ure g l Yc 0 pro
téinique et possède une masse moléculaire de 65.000 daltons.
D'autres 1.S.T.A. ont été caractérisés: en particulier
une glycoprotéine, de masse moléculaire 100.000, présente
à la surface des cellules de Poulet infectées par le virus
du sJrcome de ROUS
37
De toutes ces observations qui sont loin d'être exhaus
tives, il apparait que les processus tumoraux, sont caracté
risés aussi par l'apparition de nouveaux antigènes, ou l'élé
vation d'antigènes déjà préexistants à la surface cellulaire;
et ces observations sont en accord avec les modifications
observées au niveau des glycoprotéines, lors de la transfor
mation maligne.
4.3.3.- Problème de l'acide sialique
La pl~part des cellules en culture, contiennent un
taux important d'acide sialique étroitement lié aux glycopro
téines et localisé en priorité sur la surface membranaire
( GSt 2 O':) ).
Par suite, de l'intérêt que représente la membrane des cel-
lules, dans le processus de transformation, de nombreux tra
vaux ont été effectués sur les modifications de l'acide sia-
lique et des sialoglycoprotéines après la transformation.
De tous ~es travaux, il ressort u~e discordance encore
inexplicable en ce qui co~cerne les variations de l'acide
sialique.
En effet. DHTA et coll. (1968) ( 144 ), ont observé
que les cellules 3T3 ou BHK transformées par un virus onco-
gène, contiennent moins d'acide sialique que leurs homologues
non transformées. Ca résultat est en accord avec les obser-
vations de GRIMES (1973) [71 qui trouve qUE les cellules
en culture transformées par un virus contiennent généralement
moins de sialyJtransférase5 que les cellules non transformées.
Par ·:lilleurs. f:AL/~L1T et CDll. trouvent que les cellu-
les cJ E-l S tu me LI r ~i ci' hé pat 0 m8 deR a tind LI i tes par le rH ami no a Z 0 .
b e ri Z ~ [18, con ~~ i e n [1 f-l r1 t plu s d' a cid e s i a l i que que les cel l LI les
n 0 r mol les d e T 0 j. e cJ e Rat. \j AI~ BEE K e t [: 0 J. l . ( :i. SI 2) () n t cor r 0 -
bo['f~ une expér ic·:r1ce préalable de INARREN et Coll( 2'02)
38
dans laquelle, les cellules transformées in vitro en culture,
possédaient une fraction glycoprotéinique plus riche en acide
sialique que les cellules normales. Dans une série d'expérien
ces sur les glycolipides des cellules normales et cancéreuses,
de nombreux auteurs ont observé, chez la cellule transformée,
de nombreux exemples de délétion en acide sialique dans la
f r a c t ion g l Yc a n n i que (73. 74. 136)
Il est tentant de relier les modifications de l'acide
sialique, des sialoglycoprotéines et des sialyltransféreses
avec le stade néoplasique des cellules en culture, mais
les discordances dans les résultats ds nombreuses expériences
doivent prévenir de conclusions trop hatives.
Ain s i do 1-, c, les var i a t ion sen cl cid e s i al i que n' a p par a i ci
sent pas comme une propriété générale du stade néoplasique
(140 ).
39
v - QUELQUES METHODES D'APPROCHE
Une bonne connaissance de la nature, de la réactivité
biologique, voire de la structure chimique des glycoprotéines
impliquées dans les interactions cellule-cellule et cellule
substrat, devrait être la base de toute approche rationnelle,
dans l'investigation des phénomènes biologiques complexes,
tels l'inhibition de contact, la reconnaissance tissulaire,
le rejet de greffe et les métastases.
De nombreuses méthodes d'extraction et d'études des
glycoprotéines de membrane ont été proposées abondamment
dans la littérature. Mais chacune d'entre elles possédait
ses limites. La fraction "membrane de surface" obtenue. varie
en fonction de la technique utilisée, à cause des contamina
tions possibles par les autres fractions subcellulaires, et
des pertes des constituants membranaires.
Il est donc important d'utiliser différentes techniques
de fractionnement basées sur différents principes.
Pour éviter les problèmes de fractionnement de membrane,
certains auteurs ont utilisé, des techniques différentes pour
définir, et localiser des glycoprotéines de membrane. Une des
méthodes utilisées, pour déterminer les variations dans la com
position des glycopeptides, est de soumettre les cellules à
l'action non-lytique des protéases et ensuite d'analyser les
glycopeptides extraits. En effet, il a été fréquemment obser
vé, que les glycopeptides extraits des membranes des cellules
transformées étaient de plus "grande taille" que leurs homo
logues normaux (201,86,193,202)
C'est ainsi
40
donc que entre autres exemples, la trypsine
a été utilisée pour extraire les glycoprotéines porteurs d'an
t i g è ne s p é ci fi que Mou N deI a sur f ace d' é r y t hroc y tes (36, 185)
KDRNFELD S. et KORNFELD R. ont trypsinisé des érythro
cytes intacts pour extraire des glycoprotéines comportant
des sites actifs récepteurs de la phytohémagglutinine (106,107)
BUCK et Coll. ont étudié des glycoprotéines extraites
par la trypsine
ques (24)
des cellules en culture et poussant en pla-
CDDINGTON et Coll. ont extrait par la trypsine des
glycoprotéines de la surface de cellules d'ascite d'adenocar
cinome mammaire de TA3. Ils ont montré que l'utilisation
d'incubations courtes avec la trypsine TPCK, dans laquelle
l'activité chymotrypsique est inhibée, permettait d'extraire
des glycoprotéines de composition et de longueurs différentes
(32,172,33)
D'autres méthodes d'approche qui ont été utilisées
pour l'étude des (glycol protéines de membrane peuvent être
résumées de façon suivante
1-Digestion par des protéases et glycosidases, avec
l'hypothèse que les enzymes étant des macromolécules, ne tra
versent pas la double couche lipidique de la membrane.
2-Méthodes d'extraction chimique par le lithium
di i 0 dos al i cyl a t e (L l S let 1 e ph é n 0 l (64 1 9 9)
3- Méthodes de marquage externe, comme par exemple
l'iodinatiorl catalysée par la lactoperoxidase (129,148)
ou l'oxydation par la galactose-oxydase suivie d'une réduc-
t ion par 1 [3 lJ 0 r 0 h Ydru l'et rit i é (53, 57]
41
4-Des techniques immunologiques, comme l'immunofluo
rescence de cellules en culture ou fixées, et l'immunopréci
pitation.
5-Des méthodes de marquage métabolique, par incorpo
ration de sucres radioactifs (glucose, fucose, glucosamine ... J.
Toutes ces méthodes citées plus haut, aboutissent à
un dénominateur commun, qui est l'analyse des molécules iso
lées ou marquées par l'électrophorèse en gel de polyacrylamide
en présence de sodium dodecylsulfate (S.O.S. J. Cette techni
que avec toutes ses variantes (Isoélectrofocalisation, élec
trophorèse bidimensionnelle) est actuellement très utilisée
comme méthode analytique car elle possède un
excellent pouvoir de résolution.
42
VI - CONCLUSION
La transformation maligne d'une cellule s'accompagne
de troubles profonds au niveau de sa membrane plasmique
Ces troubles affectent la physiologie cellulaire: perte de
l'inhibition de contact, adhésivité réduite, apparition d'an
tigènes nouveaux, augmentation de la fluidité membranaire.
A ces troubles fonctionnels de la membrane sont asso
ciées de nombreuses altérations structurales touchant les
glycoconjugués membranaires protéoglycannes, glycolipides
et glycoprstéines
Un problème important est de savoir quelles sont parmi
ces modifications structurales et fonctionnelles de la mem
brane, la ou les modifications associées de façon irréfutable
à la transforrnation r;',aligne, c'est à dire à la propriété
acquise par UI18 cellule dl? se multiplier indéfiniment sans
contrôle et d'être fortemGnt oncogène.
L'utili~ation de techniques lourdes telles qua l'isole
ment des mutants cellulaires, ou la création d'hybrides pro
d u i t spa r +u s ~L 0 n cel l u 1air e , sem b ] e p 8 r met t r e der é p 0 nd r e ij
ce premier prublème. Ainsi, l'isolement d'une cellule ne
possédant ~as l'enzyme capable d'acétyler la glucosamine-6-
pr,osphate 149 ), absence. se traduisant par une biosynthèse
altérée d~s glycoprotéines, a permis de démontrer que cette
CEllule, ~ion que possédant des caractéristiques de cellules
melir,nes. Il'e!,: pas oncogène. De plus. l'addition au milieu de
c Le l t ure d a r'J - il C é t y 1glu cos cl min e r é t a b lit t 0 u tes ces f 0 net ion s
alté,~ées.
43
De même, l'étude des propriétés restant associées à la
transformation maligne, étudiée selon la technique de fusion
cellulaire de HARRIS (22 semble permettre l'élimination
de certaines caractéristiques retenues jusqu'ici comme mar
queurs tumoraux; en particulier, la vitesse de croissance des
cellules, leur capacité de se multiplier sur milieux gélosés,
l'inhibition de contact, la production d'enzyme activateur
de plasminogène et l'organisation du système contractile ne
semblent pas représenter des marqueurs spécifiques du stade
néoplasique (175,205).
Selon BRAMWELL et HARRIS ( 22 ), la seule anomalie, donc
le seul indicateur de malignité serait la glycosylation modi
fiée d'une seule glycoprotéine membranaire de 100.000 daltons.
Selon WARREN et VAN BEEK (201,195 ), la seule anomalie
associée de façon permanente au pouvoir oncogène des cellules
malignes se situe au niveau de certaines structures glycanni
ques N-glycosidiques des glycoprotéines membranaires.
C'est donc au vue de l'importance des glycoprotéines
de membrane dans la transformation maligne, que nous avons
essayé dans ce travail de mettre au point et d'exploiter des
techniques de séparation (principalement électrophorèse)
et de révélation des (glyco) protéines membranaires, appli
quées à l'étude des cellules L 1210 et K 562 cultivées in
vitro.
DEUXIEME PARTIE
MATERIELS TECHNIQUES ET METHODOLOGIES
44
1 - PRODUITS ChI~IOUES.
- Acrylamide (MERCK/SIGMA)
- Ampholines (LKE)
- Ampholines-Pag-Plate (LK8)
- Bis-Acrylamide (N.N'~éth~16n-Diacrylamid) (MERCK)
- Bleu de Brcmophenol (SIGMA)
- Bleu dE [cGmassie R 250 (SIGMA)'<
- Boro~vdrure dB K/Na-~H (K~B4/ Na HB n ) (CEA)
- Dimethyl Sulfoxyds (DMSO) (MERCK)
- D i P h {~ ri yI? - 5 Gx êJ Z CJ l 8 ( F PO) ( MER CK)
- Ether-Mono-P (TETFiA~ETHY-1.1.3.3. BUTYL)
Phénylioue cie Pclyetr:ylène glycol (TRITON >: 1CO)
(MERCK~
- L.Fuccse 14 C [L,) (CEA)
- Galactose Oxydase El 11.3.9. (SI[jf''1P\~
O r; l . 1 4 C (L'I) (' CEP, )- .~ ucosamlne '
- Glycércl qectep~r (PROLARO)
- Inhibiteur de Trypsine (SETI) (SIGMA)
- Mercentc-2-Ethanol (PROLABO)
- M~taperiod6te dG Sodium (ME~CK)
- Neura~iniGaSB [Vibric-Cholér§a) (KOCK-LICHT)
- Non i d et NP - 4 0 (F 1_ U ~.i\ )
- Persulfate d'Ammonium (ME~CK)
- Sodium Dor:iéc~il Sulfate (SDS~ (SIr,MA)
- TRIS-Base: Tris (Hydroxvméthyl) Aminométhane (MERCK)
- T EIV] E0 (~J. ~l • ~; • N. Té t r a n' é n y 1 - Eth Yl 2> n e [j i él min e ) ( M F r~ U', ~
- Try~sin8 -TPeK (WORTHINGTON)
- UrÉ!8 RP (~,IGnfl,)
45
II - MATERIEL CELLULAIRE.
Au cours de ce travail, nous avons utilisé 2 souches
cellulaires cultivées IN VITRO.
2.1. La L1210lyt:
C'est une leucémie murine induite par administration
de 3-~éthyl cholantrène à des souris DBA/2.
J:;:l:j..2.2. La K562 :
Elle est obtenue à partir du liquide pleural d'un
patient 3tteint d'une leucémie myéloide chronique
en crise blastique. ( 123)
Elle a été décrite comme un stade précoce de dif
férenciation de la lignée granulocytaire (104)
mais à la suite des travaux de i\NDERSON (9) et
RUTHERFORD/( 160) elle s'est révélée être une lignée
érythroleucémique.
2.3. CULTURES.
Ces souches cellulaires sont entretenues en suspension
dans le ~ilieu de EACLE DULBECCO (GIBCD) additionné
de :
'10 ~ de sérum de veau foétal (GIBCO)
- 500 000 unités/L de péniciline (SPECIA)
- 40 mg/L de streptomycine (SARBACH)
- 3 mg/L de fungizone (SQUIBB)
- 50 mg/L de kanamycine (THERAPLIX)
lyt Don du p r ZAGURY, Faculté des Sciences Universi-
taire Pierre, Marie Curie, PARIS
ctDon du 0 C8PPEY, Institut Curie, PARIS.
46
Les cultures sont effectuées en flacons de ROUX,
de 75 ou 150 cm 2 Les volumes de milieu de culture
utilisées, sont respectivement de 30 et 80 ml.
Les cellules sont incubées ~ une concentration de
100 OOrr~~ur les K562 et 200 ooo/ml pour les L121o,
dans une atmosphère saturée en humidité, contenant
5 ~ de CO2
(Etuvg NAPCOl et è 37°[.
Ces deux souches sont des modèles expérimentaux
intéressants en raison de leur cycle de division
rapide: 2 è 2,5 divisions pour la souche L1210, et
1 division pour la souche K562 par 24 heures.
2.4. NUMERATIONS.
Elles sont effectuées au microscope ~ contraste de
phase avec des hématimètres de MALASSEZ.
Les cellules vivantes sont réfringentes. Celles qui
sont rondes et de la même taille, mais non réfringen
tes, sont comptées comme cellules mortes.
Les numé.rations sont aussi faites è l'aide d'un
compteur de cellules (HYCELl. Cet appareil a l'avan
tage d'une grande reproductibilité; cependant, il
n'indique pas le nombre de cellules mortes. Pour
apprécier la létalité, nous effectuons une numération
è la cellule de MALASSFZ.
III - RECOLTE DES CONSTITUANTS MEMBRANAIRES.
Notre but étant d'isoler puis d'étudier des (glycol
protéines (ou des fragments de (glycol protéines) de me~-
brane, avant ou aprss action des drogues, nous avons abor
dé le problème de plusieurs façons
47
- Trypsination douce (4°C) de la membrane cellulaire
et analyse du trypsinat.
ou
- Marquage métabolique "In Situ" par la glucosamine
le fucose marqué au 14 C, et ensuite trypsination douce
1 8
- Marquage externe des glycoprotéines, et étude du
lysat cellulaire après centrifugation.
- Trypsination douce, et marquage externe du trypsinat.
Toutes ces méthodes d'approche sont résumées dans le
schéma général de la Fig.l0.
3.1. TRYPSINATIDN.
L'attaque de la membrane de cellules par des enzymes
protéolytiques nous a semblé au début, la méthode
la plus logiqu~ Dour en libérer les glycoprotéines.
CDDINGTDN et JEANLOZ (32), ont en effet, démontré
qu'une incubation de courte durée n'avait pas d'effet
sur la viabilité des cellules TA3 Ha lorsqu'elles
sont incubées avec une trypsine modifiée pour éliminer
l'activité chymotrypsine, à une concentration de 12 à
rg/ml et à 4°C pendant 20 minutes.
La trypsine est une endopeptidase spécifique qui
hydrolyse les liaisons amides, esters ou peptidiques
impliquant le carboxyle de la L-arginine ou de la
L- lysine.
Nous nous sommes donc inspirés de la méthode de
CDDINGTDN (32) que nous avons modifiée selon le
protocole suivant qui est résumé dans le schéma
de la Fig. 11.
48
0°C/30'
TPCK : 50 ~I/ml
1
1Â.
14C
3, H
GLNH2,FUC
---ï
1111
1
1
TRYPSINATION DOUCE
OXYDASE
~
~TeRo 1L.-__C_E_L_L_U_L_E_s~__I_TT_Re__---,..~MARQUAGE1. . METABOLIQUE
r---'------ ----:; j: NEURAMINIDASE (-), ~.-- - - -- - - - .....- - -- - -
L---T-----T
l Il--------,NaI04 ~ GALACTOSE
~OX
RED
---- -- - .. -----_.
lTRYPSIN.l\T.
,
Cm1PTAGE
LYSE DES CELLULES
~
...•.. ··EnOSAGE
1 \\ PROTEINES-1-/-1----....J
, 1, /, /~ r
r--- -- - - --'"------11 1
: CHRO~ffiTOGRAPHIE i1 11 1
L D~ A..fEIliI_T,f: .. :1
y
~I ANALYSE ELECTROPHORETIQUE
lieIEF, ACRY/SDS, BIDIM,
METHODES DE REVELATION ___
Bi. de ~oomassie AUTOI~DIOGRAPHI~.~ 'COMPTAGE
Fig. 10 - SCHEMA GENERAL DES METHODES D' APPROCHE POUR L' ETUDE DES
GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES.
49
PROTOCOLE.
- Centrifuger la suspension cellulaire dans des
tubes coniques (30 mlJ à 400 g (~ 1000 rpmJ pendant
1 0 mn.
- Laver les culots 2 à 3 fois par du tampon Tris PH 7,4,
et rassembler dans des tubes à hémolyse ou des tubes
coniques.
- Centrifuger le "pool" cellulaire à 1000 rpm
pendant 10 mn.
- Relaver par du tampon, compléter ~ 5 ~l, prélever
une partie aliquote pour une numération cellulaire.
- Centrifuger à 1000 rpm pendant 10 mn.
- Reprendre le culot par le tampon Tris QSP 1 ml
pour 50 x 106
cellules et transférer le tout à DoC
dans la glace pilée fondante.
- Ajouter la trYPsine1y!..: 50 ~·11/~1 d'une
solution ~ 7e ~f': /ml (c.a.d. 4 rnU/ml de
suspension cellulaireJ.
- Agiter en continu pendant 30 mn à DOC.
- Ajouter l'inhibiteur trypsique S.B.T.I. (soybeôn
trypsin inhibitorJ à raison de 50 ~l/ml dlune.
solution ~ ~n8 ~~/~l
- Ajouter 3 ml de tampon phosphate PH 7,2 (P.B.S.J
goutte à goutte en agitant au VORTEX.
Centrifuroer à froid (o°CJ à 400 x g pendant 10 ~n.
- Recueillir le surnageant (trypsinatJ.
- Dialyser contre de l'eau distillée et congeler.
- Lycphiliser.
~: TRYPSINE-TPCK (WORTHINGTONJ dont l'activité chy
motrypsique a été inhibée par la L (1-Tosylamido-2
phénylj Ethyléhloro~éthyl kétone ou TPCK.
SUSPENSION CELLULAIRE50
centrifugationl, 400 g [1000 rpm x 10 mnl
(dans la glace)
TRIS OS. 1 ml/50 x 10 6 cellules
Surnageant
(à jeter)
Cl..JtoT
lr+ TRYPSINE (50
....._---------------'~ Culot
+Remise en suspension et lavage
2 à 3 x par 'RIS (pH 7,4)
NUM ERA TI 0 N...--------1t
Centrifugation
1000 r1m x 10 mn
surn'ageant
(à jeter)
~l/ml de suspension cellulaire d'une solution
à 70 pg/ml = 4 mU/ml)
agitation 30 mn dans la glace
pg/ml
7 , 4 )
par tamoon adequat
200
[TRYPSINAT r
DIALYSE/eau distillée
1 LYOPHILISAT lI__~Repris,
~l/ml d'une solution à
(3 ml de tampon ohosphate pH
50 ~l)(20 à
dosage protéines
,+ S.B.T.I. (50
~+ P.B.S.
1
Centrilugation à froid 10nn rpm x 10 mn
......---_1-·_------------,+ ,CULOT SURNAGEANT
(à jeter) ~ADI.A.LYSAT
.-------~LOWRY LYOPHILISATION
t
ANALYSE ELECTRoPHORETIQUE ET REVELATION
Fig. 11 - SCHEMA DE LA TRYPSINATION.
51
3.2. MARQUAGE DES GLYCOPROTEINES.
3.2.1. MAR~IUAGE METABOLIQUE.
Une méthode utile d'identification des glycopro
téines est représentée par le marquage spécifique
résult~nt de l'incorporation par les cellules de
pré c urs e u rs rad i 0 ma r q u é s
fucose) .
(14 C_ slucosamine 1 4ou C-
Nous avons utilisé comme précurseur
- La glucosamine qui est un précurseur spécifique
de la N-acétylglucosamine, de la N-acétylgalacto
samine et de l'acide sialique (101,114)
qui sont incorrprés dans 19s glyccprotéines.
- Le L-fucose qui est un sucre terminal de la
chaine glycannique et qui a été largement uti-
lisé pour l'étude de la biosynthèse des glycopro
téines chez les cellules eucaryotes (94,113,134
En outre des études ont montré que le fucose n'est
jamais métabolisé ou converti en d'autres sucres.
mais cu'il est ircorporê. inchangé sous forme de
r~sidus fucoeyls dans les glycoorotéins2
INCUBATION.
94 )) .
Les cellules sont cultivées
présence de 1-5 microcuries
samine ou L- 14 C_ fucose.
en suspension, en1 4
Iml de 0- C- gluco-
Les glycoprotéines radiomarquées sont étudièe5
au bout de 24 heures selon la technique de trypsi
nation décrite plus haut.
52
3.2.2. MARQUAGE EXTERNE DE GLYCOPROTEINES.
3.2.2.1. oEFINITIIJN.
L'analyse des glycoprotéines de surface, a été
r~cemment facilitée par la "méthode de marquage
externe" qui introduit des éléments radioactifs
spécifiques, dans les fragments oligosacchari
diques des glycoprotéines et glycolipides exposés
à la surface cellulaire.
Les techniques de marquage galactose oxydase
NaB3
H4
et périodate - NaB3
H4 sont relativement
aisées à utiliser, car elles nécessitent peu de
cellules, et il n'est pas nécessaire d'isoler
la membrane cellulaire pour étudier les glyco-
conjugués 53,57 )
Cette technique a été employée avec succès pour
l'analyse des glycoprotéines de surface de nom-
breux types cellulaires (54,55,58)
Par exemple, chez les fibroblastes normaux, la
fibronectine (galactoprotéine al est fortement
marquée par la méthode à la galactose oxydase3
NaB H4
, tandis que les fibroblastes transformés
n'incorporent pas de radioactivité au niveau de
la fibronectine ( 27,83 ).
3.2.2.2. P~INCIPES.
3.2.2.2.1. GALACTOSE oXyoASE-BOROHyoRURE (GAO-KB 1 H4l.
- wuand des cellules intactes, sont traitées
par la galactose oxydase, les résidus terminaux
de galactose ou de N-acétyl galactosamine de la
chaîne des glycoprotéines de membrane, sont
oxydés au niveau du carbone 6 en l'aldéhyde cor-
respondant (55) (Fig.12) •
A
a
CHOH
OR
Galactose
Oxydaset n 0
53
H OH
GALACF)~E
CHa
H OH
8orohydrur8
H OH
OR
B
0COH 1°41
HÇOH JI'H C~OH H OR Pêriodate
H
OH H
A.CIIJE S!ALIOUE H
CH CO3
OH H
'f'3orohydrure
OH
AC. C7 HEPTULOSDNIQUE
R,A.c:;:rJ MARr;JUE
",II AL:" 'i r, c: f" - f J X-l", 8 " h
4
* r L ~,J.! i- fj T P ,Ii., C:' l [lA, c.: T l i
54
La masse moléculaire de la galactose oxydase
(75000d.) empêche la pénétration de
l'enzyme dans la cellule. Donc seuls les
glycoconjugués exposés à la surface cellulaire
sont oxydés.
- A cause de la présence fréquente de l'acide
sialique, lié aux résidus galactosyl, un trai
tement préalable des cellules par la neurami
nidase (qui désialide les ch~lnes glycanniques)
permet d'obtenir une oxydation efficace (54).
Les cellules sont ensuite lavées, et les aldé-
hydes formés sont réduits par le borohydrure
tritié (Na/KB 3 H4
) pour redonner le sucre de
départ [Fig.12).
REMARQUE.
A ch3que marquage effectué, nous réalisons
sur un lot de cellules un témoin borohydrure
tritié seul, car ce dernier peut provoquer la
réduction de liaisons insaturées de certains
glycolipides ( 53 / 57). Et ce témoin
perMet de vérifier les marquages aspécifiques.
3.2.2.2.2. PERIDDATE-BDRDHYDRU~E.
Sous l'action de faibles concentrations en
periodate [0.1- 2mM) à DoC, et pendant des temps
d'incubation très courts [10 mn), les acides
sialiques des chaines glycanniques sont préfé
rentiellement et spécifiquement oxydés.
Il se forme un radical aldéhydique qui est
ensuite réduit par le borohydrure tritié pour
former un acide heptulosonique (acide 5 acéta
mido 3,5 - didéoxy-l- arabino - 2 - heptuloso
nique) ou un acide octulosonique (54,82)
selon le schéma de la Fig. 12 •
- Ce tra1temBnt par le per1odate-B3
H4
peut-être
précédé par l'act1on de la neuram1nidase qu1
démasquerait d'autres acides s1a11ques de la
chaine glycanniq~e, et qu1 pourront è leur tour
être oxydés.
3.2.2.3, REf\CTH:i.
- Tar'pon PBS (OUi_BECCO) PH = 7,4
- CaCl.)
- K Cl
- K H P (l 6.?
- Mr,r', 61-1 0. r ..J ~ --:~ , 2
- Na C l
F' 0 l.
100 mg/l
200 mg/l
200 mg/l
100 mg/l
BODO mg/l
1150 mg/l
- Gal a c t. 0 S 8 () >: y Ci e] S e (E C . 1 1 3 9 • ) Typ" \} (Sr::;I"IA) 1\ 0
Repre~dre le fle~on de galactose oXJdase (150 U]
::J al' 1, 0 Li 0 rD l [J e ;) BSet ré par t 1 r dan.' 1 3 tub~; s
(ec) iUL/TubE: 1 , 5!J U / Tub e ). 0 nuL lis e 4]~I L
5 U) par [);'vr:Jtion. Donc un tube ciécollge:.é
.3 e r t à =' D X Yri G t : Ij n~; .
- I\J 8 u rd T 1 nid cl s "'" X V 1 b l' 10 c ho l é r a e 1 i<, CJ c: K- L :: GHT ) •
Las 0 lut 1 0 r f) r, 2. " l'; a t 1 que (2 5 0 0 U / ml) 8 s t r é J cl l' t 1 e
::J a raI i [1 u 0 t e ~; L fo' 1 [) tt-l (2 5 U) dan s
.=PP:=:\mOC:~F •
E: S tub 3 ~j
Chaqu r:! tube (!{e·: 19Edé sert ij 2 tra11 ElmE,nts.
S tt:. / T r c 1'. P 'C, '; l t = 1 2 , 5 U / Tl' a 1 t e m.'· ri t ) .
+ +- [3 [J l' 0 ri y d l' l! r f) C 1: Na / K
3( NaB H
4ou
, 3\J 0 usa If c n sui. i li ',e aIt e l' n a t 1 v e men t u rj aB' -i ,
L,
'JU du l'::']H .. LE lorohydrure de pota.:E,ium se~lblE:'i
,3 \/ 0 i. l' l.J I! e fT e:. j .L '. J r est a b i 11 té que s ri ho ['10 ICi f. i..J:
30dr:.
56
Ce radio-élément nous est fourni par les dépar
tements des radioéléments du C.E.A.SACLAY.
- Activité totale
- Activité spécifique
5 mCI;,I''I!Tlnoule
20 CI;~mole
Chaque ampoule est reprise par 1 ml de NaOH
0,01 N et est répartie dans 10 tubes par fraction
de 100 ~l
congélés.
0,5 mCi) qui sont immédiatement
tube décongelé sert à une réduction
réduction.
- Feriodate (NaI04) (MERCK).
Nous préparons de façon extemporanée une solution
mère 0,1 M dans du tampon PBS.
10 ~l de cette solution sont ajoutés dans le
milieu réactionnel pour obtenir une concentra-
tion finale de 1mM.
- Tampon d8 lyse.
- Triton X 100_ S BT l
- P BS
3.2.2.4. MODE OPERATOIRE.
250
QSP
3.2.2.4.1. GALACTOSE OXYDASE-KB3
H4
.
- Pour chaque expérience de marquage nous utili
sons un nombre total de cellules variant de6
20 à 50 x 10 cellules.
- Les cellules sont lavées 3 fois par du P.B.S.
et remises en suspension dans 1 ml de P.B.S.
- Dans la plupart des cas, 5 ~l de neuramini
dase et 40 ~l de galactose oxydase sont ajoutés
à la suspension cellulaire
57
3(expérience N+ GAo+ H).
Pôêfois seule la galactose oxydasE est ajoutée
au milieu (E.xp. 6-r3H).
- Les cellules sont ensuite incubées à 37°C
p8ndant 30 minutes. relavées 3 fois par du PBS
e~ remises en suspension dans 0,5 ml de PBS.
- Ensuite 0.5 mei de
d l~ I\J a 0 HO, 0 1 rJ, son t
3KB H
4contenus dans 100 pl
ajoutés au milieu et la
suspension cellulaire est incubée à température
élrrbiante (sous la hotte) pendant 30 mn.
- Les cellules sont relavée3 3 fois par du PBS.
et le culot cellulaire est repris Dar 0.2-0,5 ml
de tampon lyse à OOC pendant 15 m~.
- Le lysat cellulaire est c~ntrifugé à 2000 rpm
p 8 r1 dan t 5 - 1 0 ;,~ net les u r nage a ntes t r ecu e i IIi .
Pprès avoir prélevé des aliquots ca 10 ~l pour
le compta2e et le dosage des protéines, le
:C' L' l' n age a nt est con gel é e t s e ras 0 u 71 i s à des
E¶tions électrophorétiques ultérieures.
::. ;).2.4.2. PERIOOATE - KB3
H------'-----4
- ~o à 50 x ~~6 cellules sont mises en suspension
d ë r1 s ml de PBS.
- Ajouter 10 ~l d'une solution de métaperio
oele de sodium pour obtenir une co~centration
fir:ale de 1 mITlo:'./l.
- La suspgnsion est incubée dans l~ glace pen
d 6 r; t 1 0 mnet à l' 0 b s c uri té.
- Arrêter l'action du perio1ate pa~ du glycérol
[:.1 rnmol/l de P:3S).
- Les cellules soot ensuite lavées 3 fois par
du PBS et resus~endues dans 0.5 ml de PBS.
- La réduction ESt réalisée par O,S ~Ci de
KB 3 H et les cellules sont traitées de la4
même façon que dans le marquage à la galactose3oxydase-KB H
4.
REMARQUE.
- A chaque étape du marquage il est nécessaire
de vérifier l'état des cellules e~ microscope
- Ce type de marquage est résumé dans le schéma
de la Fig.13
3.3. TRYPSINATION DOUCE SUIVIE D'UN MARQUAGE
EXTERNE DES GLYCOPROTEINES.
Pour diversifier nos techniques d'approche, car
chacune d'entre elles possède ses avantages et
58
ses inconvénients cf . Ch. Discussion), nous
avons mis au point, en outre, une méthode d'étude
qui est l'amalgame des techniques citées plus haut.
Elle consiste en une trypsination douce à DOC
suivie de la technique de marquage externe des
glycoprotéines ~galactose-OXYdaSe-KB3H4 (G+ 3 H),
neuraminidaSe-galactose-OXYdaSe-KB3
H4 (N+G+3
H),3 3
periodate-KB H4 (P+ Hl.
Chacune des étapes techniques, ayant été vue en
détail dans les chapitres correspondants, nous
avons résumé la technique de trypsination-marquage
externe dans le schéma de la Fig. 14 .
3.4. DOS.~GE DES PROTEINES.
Le dosage des protéines est effectué selon la
méthode de LOI.JRY (122).
59
CELLULES6
20-50x10
Lavage 3 x 5 mn ptS. PH
2000'RPM.,7,4
BOROHYDRURE FROID CULOT
1 mM en conc. fi. repris par 1 ml de PBS (O°C si PERIODATE)
oOXYDAT O
11,11,
r- - - - - -'- - - - - - - ---1 ;1 NEURAMINIDASE (12,5 U) 11 1
: 30 mnl 37 0 C :.,~------- - - - -- ----- ---{
GALACTOSE OXYDASE
(5 U)
30 mnl 37 0 C
METAPERIODATE DE Na
10 mnl 0 0 1 OBSCURITE
1 mM en Co FINALE
Lavage 3 x 5 mn PBS.L.-----t~
2000 RPM.
tCULOT
LYSE
CELLULAIRE
0,5 mL de PBS.
+ +BOROHYDRURE Na 1 K
0,5 mci
30 mnl T O LABO
..Lavage 3,x 5 mn,
CULOT
0,2 - 0,5 ml de TPON LYSE
5 - 15 mnl 0 0
10 mn
.. SURN1-'_GEANT
300 _. 400 ~L
l ---......MPTAGE DOS. DES PROTEINES
ANALYSES ELECTROPHORETIQUES
REVELATION ( FLUOROGRAPHIE)
3000+.
RPM/
1..........------VCulot
ANALYSE CO
Fig.13 - SCHEMA DU MARQUAGE EXTERNE DES GLYCOPROTEINES DE MEMBRANES.
60
CELLULES
r.f.
Ch.
TrypsinatO
r---------------,1 11 11 TRYPSINATION 11 11 DOUCE 11 11 11 OOC/30-40mn 11 1----------------~ j
1 SURNAGEANT
~Dialyse /PBS/EAU/24-48H
l
cf . Ch. ----.r1 a r q. Ex t .
Dosage des
1- (LOI-JRY)
Protéines
r------------------~---------------------ï
1 MARQUAGE EXTERNE sur 1 ml DE SURNAGEANT 11 333 11 N + G + H G + H, P + H, 1l ' 1
~--_-------------------------------------4
o
Comptage (Scintillation
Liquide)
SEPARATION ELECTROPHORETIQUE
REVELATION
FLUOROGRAPHIE
() Après chaque traitement, dialyser exhaustivement contre
du PBS et ensuite contre de l'eau distillée.
Fig. 14 - TRYPSI NA TION [] 0 UCES UIV l E D' UN MA RQUA GEE XTER NE.
61
3.4.1. PRINCIPE.
La solution de protéines est dosée à la fois
par son pouvoir biurétogène (CUS0 4 en milieu
alcalin) et par le pouvoir réducteur des restes
tyrosyls et tryptophyls sur le réactif phospho
tungsto-molybdique de FQLIN-CIDCALTEU.
3.4.2. REACTIFS.
- Une solution d'albumine bovine (SIGMA)
A une concentration de 1 mg/ml est utilisée
pour préparer une gamme d'étalonnage de 10 à
60 pg/ml.
- Solution de travail.
Elle est préparée par mélange extemporané des
solutions A et B suivantes, dans le rapport
10/1 v/V) .
- S 0 lu t i 0 Il A
Tartrate de Na et K, 4H2
0
H20 QSP
- Solution B
CLJ.S0 4 , 5H;;0
H2
0 QSP
20 g
5 g
1000 ml
0,1 g
1000 ml
- Réactif de FOLIN-CIOCALTEU~
A utiliser pur, non dilué.
3.4.3. MODE OPERATOIRE.
Ajouter 2 ml d8 solution de travail à l'échantillon
(10-100 ~l). Agiter vigoureusement et laisS8!'
repo"er.
Après 1D mn. ajouter 0.1 ml de réactif de FOLIN et
CIOCALTEU. agiter énergiquement et lire ~ 72D n m
au bllut de 3[J nln passées à l'obscurité.
Les résultats sont exprimés en microgrammes par
millilitre. puis ramenés au volume de l'échantil
lon.
(;2
63
IV - TECHNIQUES D'ELECTROPHORESE.
4.1. INTRODUCTION.
"Lorsqu'une solution renfermant des particules
chargées est soumise à l'action d'un champ élec
trique, on assiste à un déplacement de certains
éléments contenus dans la solution. La vitesse
et l'ampleur des mouvements dépendent de la taille
et de la charge des particules présentes".
Les lois régissant ces migrations sont décrites
par les théories électrocinétiques, élaborées en
1880 et 1881 par l'Allemand H. VON HELMHOLTZ.
Différentes techniques d'analyse des solutions
aqueuses furent élaborées en utilisant. les pro
priétés des particules chargées. RegrQupées sous
le nom générique d'ELECTROPHORESE ou d'IONOPHORESE,
elles ne devinrent véritablement opérationnelles qu'
en 1931, après la thèse de doctorat du biochimiste
Suédois ARNE TISELIUS qui en définit préci-
sément 18s modalités.
Poursuivant ses travaux, A. TISELIUS perfectionna
l'électrophorèse [Electrophorèse Libre, de Frontière
ou en Veine Liquide) et parvint ainsi à séparer
18s protéines du plasma sanguin juste avant la
s8conde guerre mondiale. Il reçut, en 1948, le
Prix Nobel de chimie pour ses recherches dans ce
domain8.
Depuis l'électrophorèse libre, a été largement
supplantéepar d'autres formes d'électrophorèse
dites de ZONE (les composés se séparent en zones)
64
qui sont beaucoup plus simples, ont des pouvoirs
de résolution plus élevés et sont réalisables
avec de plus petits échantillons.
Dans l'électrophorèse de zone, la solution de
particules (protéines) à séparer est immobilisée
dans une matrice ou support solide, matériel poreux
hydraté qui possède une rigidité mécanique élimi
nant les anomalies dues à la convection ou à la
vibration.
Les plus largement utilisés de ces supports ont été
le papier filtre et les bandes d'acétate de cel
lulose maintEna~t.
Des résolutions électrophorétiques beaucoup plus
élevées sont obtenues quand le support ou la
matrice peuvent retarder ou exclure des modécules
protéiques selon leur taille moléculaire. Dans
ce but des gels d'amidon et principalement d'acry
lamide sont habituellement et de plus en plus
utilisés.
En effet, au cours d'une électrophorèse en veine
liquide ou sur papier, les particules sont séparées
essentiellement en fonction de leur charge et, la
nature du milieu intervient peu dans le processus
de séparation.
Un gel, par contre, crée des forces de friction
très élevées et participe donc activement à la
séparation des particules. L'utilisation d'un tel
système permet d'une part de réduire les phénomènes
de diffusion et d'autre part de séparer les parti
cules en fonction non seulement de leurs charges
65
mais aussi de leur taille. De plus l'importance
relative de ces deux paramètre peut-être modifiée.
4.1.1. SEPARATION SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE.
4.1.1.1. DEFINITION.
Parmi les differents types de gels. le polya
crylamide constitue dans la plupart des cas
le meilleur support. En effet, l'utilisation
de cette substance inerte et très stable vis
à vis des variations de température (182)
permet de contrôler avec précision la taille
des pores du gel qui fonctionne ainsi comme
un véritable "tamis" vis à vis des modécules
à séparer.
L'électrophorèse en gel fut décrite en 1955
par SMITHIES 173 ) qui prenait comme
support le gel d'amidon. De grands progrès
ont pu être réalisés lorsque ORNSTEIN et DAVIS(146,
37) ont proposé le gel de polyacrylamide de
polymères formés à partir de produits chimiques
que l'on peut obtenir à un degré de puretÉ
élevé.
Oepuis ces travaux on distingue en théorie
deux systèmes de fractionnement
Les"systèmes continus" dans lesquels la nature
et le pH du tampon sont identiques dans 18s
différents compartiments de l'appareil, et
les"systèmes discontinus" constitués de deux
types de gels superposés
1)- "Un gel de concentration" dans lequel existe
un gradient de voltage et de pH au niveau de
l'échantillon et qui permet ainsi de concentrer
celui-ci en une fine zone de départ.
2)- "Un gel de séparation". plus concentré en
acrylamide. et de pH plus élevé dans lequel les
modécules se trouvent séparées essentiellement
en fonction de leur taille. En toute rigueur.
le terme d'électrophorèse "en disque" doit être
réservé aux systèmes discontinus (37, 186).
Néanmoins en pratique. on emploie souvent ce
ter8e pour désigner les deux types d'électropho
rèse.
En ce qui concerne l'appareillage on distingue
deux techniques l'électrophorèse en plaques
et l'électrophorèse en tubes. le verre ou le
plastique pouvant être utilisés dans les deux
cas. Le verre permet d'obtenir un meilleur refroi
dissement alors que le plastique présente l'avan
tage de ne pas adhérer au gel ce qui permet de le
manipuler plus facilement.
66
Dans les deux cas.
donne de meilleurs
horizontale ( cf
l'électrophorèse verticale
résultats que l'électrophorèse
Ch. Résultat discussions).
Le choix de l'une ou l'autre technique est par
fois conditionné par la nature du problème à
résoudre et est aussi souvent fonction des pré
fèrences personnelles.
67
LE GEL DE POLYACRYLAMIDE
Le gel de polyacrylamide est le résultat d'une
poly~érisation du monomère l'acrylamide avec
une réticulation due à la présence du comonomère
le bisacrylamide.
On prépare le gel à partir de ces deux monomères
l'acrylamide qui est une petite modécule organique
se terminant par un groupe amide (-CDNH2
) et le
bisacrylamide qui comporte deux monomères acryla
mides liés par leur groupement amide. Les monomères
sont dissous dans l'eau. puis on ajoute à la solu
tion deux substances supplémentaires pour induire
une réaction de polymérisation en chaîne.
Ces catalyseurs sont le persulfate d'ammonium,
et une modécule organique, le tétramétyl éthylène
diamine (TEMED).
Après la première étape de polymérisation. où le
persulfate d'am~onium réagit avec le TEMED. celui
ci possède un électron de valence non apparié.
Le T~MED ainsi activé se combine alors avec un
monomère acrylamide ou bisacrylamide dans ce
procéssus, l'électron non apparié est transféré
à l'unité acrylamide. laquelle est alors activée.
Un autre monomère s'y attache et est activé à son
tour. Le polymère continue à croître jusqu'à ce
que le stock de monomères soit épuisé. le centre
actif se déplaçant continuellement à l'extrémité
libre de la chaîne.
Si la solution contenait seulement des monomères
acrylamides. la chaîne serait toujours linéaire
et sans ramifications en revanche. une modécule dB
bisacrylamide peut appartenir à deux chaînes et
les relier de façon permanente.
Le polyacrylamide croit ainsi en un réseau
imbriqué de boucles et de branches plus ou
moins anastomosées en fonction de la quantité
en bisacrylamide (Fig .15 J.
On définit généralement par concentration en
acrylamide (TJ la somme des concentrations en
acrylamide et bisacrylamide. Elle s'exprime en
pourcentage
a + b
68, ;
Tm
x 100
a quantité d'acrylamide (g)
b quantité de bisacrylamide (gJ
m volume du tampon (ml)
b
On définit par ailleurs ca + b
x 100
La quantité de bis par rapport à la quantité
totale en acrylamide + bis.
Le gel d'acrylamide est une matière inerte et
neutre. Il n'y a pas de phénomènes d'électro
endosmose ni d'interaction entre molécules à
séparer et le support. Ceci a été avancé pour
expliouer l'obtention de bandes étroites et
symétriques, l'asymétrie d'une bande permet
donc de suspecter une hétérogénéité dans sa
composition.
La séparation des protéines est uniquement
basée sur un effet de "crible". La possibilité
pour des molécules de passer à travers un tel
"tamis" dépend d'une part de la taille et de
la forme des pores de ce tamis, et d'autre part
69
BISACRYLAMIOE
==H
'C=C-H/ 1
H CcY 'N-H
1H- C-H
1o N-H~ /
H C, 1C=c-H
/H
II1II
H,C=C-H
/ 1H C-'/ ,
o NH2
ACRYLAMIOE
tLECTRON, H HNON-APPARlt 1 1
• --------C=C1 1H C-'/ ,o NH2
Tt TRAMt THYL t THYL~ NEOIAMINE ITEMEOI
CJ
HJC HHHHHH, 1 1 1 1 1 1N-C-C-C-C-C-C.
/ 1 1 1 1 1 1HJC H N H C H C
/, -'/, -'/,HJC H,C 0 NH2 0 N - H
1H-C-H
1o N- HH ~C/
, 1C-C-H
/H
HJC H H H H H H, 1 1 1 1 1 1N-C-C-C- C 0 ------------C =C
/ 1 1 1 1 1 1HJC H N H ,C H C
/, ij' -'/,HJC HJC 0 NH2 c:::J-ti!!I:!l. 0 N - H
1H-C-H
1o N-HH ~/
, 1C=C -H
/H
HJC H H, 1 1
N-C-C/ 1 1
HJC H N/ ,
HJC CH,CJo
HJC H H CHJ, 1 1 /N-C-C-N
/ 1 l ,HJC H H CHJ
+( NH.12 (50,)2
PERSULFATE O"AMMONIUM
+
Fig.15 - Structure et Polymérisation
(type vinyle) du gel de Polyacrylamide
selon TANAKA (182 J.
70
de la taille et de la configuration spatiale
des molécules la taille c'est-à-dire la masse
moléculaire paraissant être le facteur le plus
important.
Pour une structure spatials donnée, on considère
que la mobilité est inversement proportionnelle
a u log 1 0 deI a ma a s e.m 0 l É: cul air e (2 061 207) .
Nous verrons qu'il y a certains amendements à
apporter à cette notion. Le diamètre des pores
dépend essentiellement de la concentration totale
en acrylamide (T), la concentration en bis n'in
tervenant que pour une faible part.
Le gel de polyacrylamide présente une certaine
élasticité car l'on constate qu'au cours de
l'électrophorèse, des molécules de diamètre su
périeur à celui des pores pénètrent dans le gel.
On peut donc supposer qu'il a une certaine "ouver
ture" des pores au cours de la migration. Ce
phénomène d'élasticité a été rendu responsable par
ailleurs de l'absence de diffusion, après arrêt
de l'électrophorèse, les pores se ressérant sur
les molécules.
4.1.1.2.PRII\JCIPES.
- Le pouvoir de séparation dans un tel système
repose sur un double principe
+ séparation par électrophorèse,
+ et effet de tamisage des molécules.
Les forces de friction dépendent du rapport
entre la dimension de la molécule et le diamètre
des pores du gel.
Ouand le diamètre apparent de la molécule est
petit par rapport à celui des pores du gel, la
résistance de freinage est faible quand le
71
diamètre est voisin de celui des pores, elle
devient pratiquement infinie. Or, pour un gel
à 7,5 ~, le diamètre des pores est d'environo
50 A ( 186 ) et l'on connait le
diamètre et la longueur de la plupart des pro-
téines.
Pour séparer les molécules, on peut jouer sur
deux paramètres
+ la porosité du gel,
+ le tampon dont l'ajustage du pH permet de
modifier la charge des molécules à séparer.
- L'effet de tamisage des molécules est valorisé
par l'emploi d'un gel à gradient continu de
concentration. Ainsi, les protéines migrent pro
gressivement des pores les plus larges vers les
por8S de plus en plus petits.
L'électrophorèse aide ainsi la migration. ~ais
la séparation terminée, les molécules se trouvent
arrêtées au niveau des pores dont la taille cor
respond à leur dimension moléculaire.
SLATER ( 171 ) proposa le premier ce pro-
cédé de neilleurs résolution dans la sépdration
des protéines. Il faisait polymériser, entre deux
plaques de verre, un gel de polyacrylamide dont
la concentration suivait une progression linéaire
entre 5 et 20 %.
MARGOLIS et KENRICK 128 utilisent une
conc9ntration de gel croissant de 4 à 20 % ou
de 4 à 24 % et décrivent un procédé de prépara
tion du gradient de concentration de gel.
72
Pour notre part, nous avons choisi de travailler
en gradient d'acrylamide avec différents interval
les de concentration selon la nature du problème
à résoudre.
4.2. ELECTROPHORESE EN GEL DE POLYACRYLAMIOE - SODIUM
OODECYL - SULFATE (ACRY /SOS).
4.2,j. OEFI~JITION.
De nombreuses protéines sont oligomériques et contien-
nent plus d'une chaîne polypeptidique. Grâce à une
variante de l'électrophorèse en gel de polyacrylamide,
appelée électrophorèse en polyacrylamide - SOS, une
protéine oligomérique peut-être dinociée en sous-unités
et la masse moléculaire de ses sous-unités déterminée
( 206, 207 ) .
Les protéines à séparer sont traitées avec un détergent,
le sodium dodécyl-sulfate (SOS) qui les dissocie en
sous-unités et déroule complètement chaque chaîne
polypeptidique pour former un complexe entre le poly
peptide et le SOS. Dans ce complexe, la chaîne poly
peptidique est recouverte d'une couche de mo!êculs5 de
SOS, dont les chaînes hydrocarbonées sont solidement
liées par des liaisons hydrophobes à la chaine poly
peptidique ; ainsi, les groupements (sulfate) chargés
(-) du détergent sont exposés au milieu aqueux. Dans
ces complexes existe un rapport constant entre SOS et
protéines (environ 1,4 : en poids). Ces complexes
ne diffèrent donc que par leur masse. Ouand une proté-
ine monomérique traitée par le SOS est soumise à une
électrop~orèse dans un gel contenant du SOS, sa vitesse
de migration n'est fonction que de la masse de l'en
semble polypeptide-SOS.
73
Pour calibrer le gel, des protéines 6talons
de masse moléculaire connue sont soumises au même
processus.
C'est sur la base de ce principe largement décrit
et utilisé, depuis les premières publications faites
par SHAPIRO et Coll. en 1967 [164 ), !~EBER et
OSBORN en 1969 [ 206 ), LAEMI'1LI en 1970 111 J.
que nous avons choisi de travailler.
4.2.2. TECHNIQUES.
l),u début" nous avons essayé la rrise
au point de cette technique avec du matériel
déjà préexistant au laboratoire. C'est-à-dire
des cassettes de gel de oolyacrylamide déj~ orêtes
~ l'emploie [cassetes PAA 4/30 de chez PHARMACIA).
Cette mise au point s'est avérée peu concluante
cf . Ch. Résultats Discussion}. Nous nous sommes
donc inspirés d'autres méthodes, qui consistaient
en la préparation des gels et au montage des plaques,
sur place au laboratoire.
4.2.2.1. TECHNIQUE COMMERCIALE Electrophor~se
sur gel de oolyacrylamide, gradient de 4 ~ 30
SOS 0,2 ';, PH = 7,4 (PA.A 4/30).
4.2.2.1.1. PL,A,DUES Dt VERRE.
Nous avons utilisé des Dlaques de verre de gel
dont le gradient va de 4 à 30 '; [PAA 4/l0), et
elles sont délivrées toutes prêtes dans le com
merce [PHARMACIA). Le gel est emDrisonné entre
deux plaqUES de verre garantissant une épaisseur
74
uniforme de 4,9 mm. Leur dimension est de
82 x 82 mm. Elles sont limitées latéralement
par de petites baguettes de caoutchouc maintenues
par de l'adhésif.
4.2.2.1.2. REACTIFS.
TRIS
Acétate de Sodium ..
E D TA .
S D S •••••••••••••
TRIS - HeL .
E D T A.
S D S ...
PM ercapto E ·i::h~nol. ..
0,04fVJ
0,02 M,pH 7,4
2 mM
o, 2 ;
10 mM, pH 8,0
m"1
2 , 5
5
4.2.2.1.3.PREPARATION ET DEPOT DES ECHANTILLONS.
Les échantillons sont solubilisés dans le tampon
échantillon, et chauffés pendant 15 mn à BO°C
ou 3 mn à 100°C. Après voir ajouté quelques
gouttes de saccharosa ou da glyc6rol p des dépots
de, 10 à 30 fI (en fonction de la concentration
en protéines), sont effectués à la micropipette
directement à la surface du gel.
4.2.2.1.4. MIGRATION ELECTROPHORETIOUE.
Les cassettes de gel "PAA 4/30 gradient gel"
75
sont "démoulées" et les gels sont déposés sur
un MULTIPHDR 2117 LKB, alimenté par le généra
teur LKB type 3371 C,
Des bandes découpées dans du papier filtre sont
appliquées à chaque bord du gel, et assurent le
contact entre le gel et le tampon d'électropho
rèse.
Après une préélectrophorèse à 70 volts pendant
une heure, les échantillons sont déposés du
côté du pôle négatif (côté du gel le moins con
centré) et l'électrophorèse est conduite à
150 volts pendant 2 heures 30 minutes.
4.2.2.1.5. REMARQUES.
Il est à noter que les kits PHAR~ACIA (PAA 4/30)
n'ont pas été utilisés dans les conditions ores
cri tes par le fabricant. C'est-à-dire, l'utili
sation d'une cuve à électrophorèse verticale
adaotée aux cassettes, d'un appareil Dour déco
lorer les gels (par plectrophère), et d'un des
sècheur De plaques. Tous ces accessoires prove
nant du même fabricant cité plus haut.
Les techniques de fixation, coloration, décolo
ration des plaques seront vues olus en détail
dans le chapitre qui leurs est consacré (cf"
Ch. Révélation), car gUEl. que soit le tyr:e d'p-
l e c t r 0 0 h è:: se, 0 n r e t r 0 u v e d e plu sen plu s, les
mêMes procédés de révélation.
76
4.2.2.2. TECHNIQUE ADOPTEE.
Nous avons suivi et ~odifié la technique pro
posée en premier nar LAEMMLI (111] qui elle
même était une Modification des systèmes décrits
par ORNSTEIN (146) et DAVIS (37 J. Elle consiste
en une électrophorèse en système discontinu et
en présence de SOS.
4.2.2.2.1. FORMULE DES REACTIFS.
TRIS - Bi:l!:',p •••••••••••••••••••••
Glycine .
SOS . °,1
Glycérol..................... 10
f->. M 8'" r. a IJ t 0- Eth i3 n <:1 1. • • . . • • . • • • • •. 5
SOS ..........................• 2,3
Oc; ( P IV ]
Oc; (V IV)
TR l S - H rl .
C = ACRY-STOCK :
0,0625 M pH 6,8
Acrylamide 29,2
Bisacrylamide................... 0,8
Eau Distillée Q.S.P 100 ml
TR l S - H rl .
SOS .
0,5
0,4
fVJ pH 6,8 .l:i
\
TRIS - Hel ...
S D S •••••••.
1 , 5
0,4
77
M pH B,B li-
';
10 ~ dans de l'eau distillée.
Cette solution doit-être préparée toutes les
semaines et conservée à 4°C à l'abri de la lumière.
~ 0,1 ; (PlV) dans de l'eau distillée.
H Solution de fixation
~ ét ha n 0 1 .
Eau Distillée .
Acide Sulfosalicyque.
Acide Trichloroacétique ....
150 ml
350 ml
17,25 g
57,50 g
0,1 '; de Bleu de coomassie R 250 dans 100 ml
de solution de décoloration J.
J "Solution de décoloration
Ethanol ..................•..•
Ac i de Ac é t i qu e .
500 ml
1 60 ml
Eau distillée Q.S.P 2000 ml
JfTE~EO : ê utiliser non dilué.
li-: A conserver à 4°C.
li- li-: Ces formules ne sont données qu'à ti tre
indicatif, car elles peuvent varier comme nous
le verrons dans le"chapitre Révélation':
78
4.2.2.2.2. MATERIEL.
Nous avons utilisé un appareil classique pour
électrophorèse en plaque verticale 179 ).
Nous avons modifié et fait construire cet ap
pareil par les Usines PLASTIMARNE. La cuve a
été modifiée de telle sorte que nous puissions
utiliser des plaques de hauteur différente
(Réservoir du haut mobile), et faire migrer
simultanément deux plaques d'acrylamide
Fig.16 ).
La présence d'un joint en plastique, sur le
pourtour de l'encoche du réservoir du haut as
sure l'étanchéité. En effet, les plaques de
verre viennent écraser le joint, et nous évite
l'adjonction d'agarose, comme dans les appareil
lages de type classique.
Les plaques de verre utilisées pour couler les
gels d'acrylamide ont été découp8es p~r les Ets.
PONSINET selon nos indications, et les dimensions
suivantes (Fig. 17 ).
- Plaque avant 160 x 180 x 5 mm, avec
une encoche profonde de 30 mm et longue de 140
ou 138 mm en fonction du type d'électrophorèse
(10 ou 20).
Dans le cas d'une plaque servant à une séparation
en double dimension 20), l'encoche de la plaque
79
A
B
Fi". 16 - A
S
APPAREIL !-\ F:LECTROPI~onESE En PLAnUE VEHTIC:ALE.
?RESE-,;TATIOiI CEJ.JEHALE DFS APPAHEILLP.{'-ES U'llILHiES.
80
_ 5 'T, rTi
+,m~t
1,1
+..11
4-- --_._.. 4-- •••..-.r---
1-~O rr,['",4-- -------- •. _....
+1,1
1 5 C, :'1"'\ rn ,n"1
1
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1111,
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~ - _.1 6 iJ fTl cr, - - - - - -~
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o [) ]~ l; .1-- j l t, t Cl C 5 j t i [, fi l , B rrl E ri t d El l a 1 ''': r E r) 5 U c l Cl ;- r.: rr, S :--,
81
avant est biseautée à 45°. [comme nous le verrons
plus loin le biseau n'est pas toujours nécessaire,
(cf. Ch. Discussion).
- Plaque arrière 160 x 180 x 5 mm.
P . l:f- elgnes à 12 dents
à 16 dents
à "1 dent"
1 30 x 1,5 mm
1 0 x 1, 5 mm
- Intercalaires l:f. 180 x 10 x 1,5 mm
3 - Générateurs.
Nous avons utilisé deux types de redresseur
- Le générateur LKB type 3371 C.
- Le générateur SEBIA GD 2200 la tension
est règlable de 0 à 2000 volts de façon continue,
le débit de 0 à 200 mA et la puissance maximum est
de 100 VA..
L'appareil peut fonctionner en tension stabilisée,
en courant stabilisé ou en puissance constante.
Dans tous les cas, les paramètres non stabilisés
·peuvent être limités à une valeur déterminée par
l'utilisateur.
l:f Les peignes et les intercalaires sont en plexiglas
et sont fournis par PLASTIMARNE [Epernay) ou
ASSISTA.I\ICE LABO [Orsay).
82
4.2.2.2.3. ~ODE QPERATOIRE.
Les Dlaques propres ~ sont assemblées (Fig. 18
après disposition des "intercalaires". et mainte
nues solidement en place par des pinces'
Pour obtenir une bonne étanchéité du "moule"
ainsi réalisé. nous procédons de plusieurs façons
- Soit. comme il est décrit dans la littérature.
en coulant de l'agarose chaude è 1ou2 ~ tout
autour du moule. De façon empirique. nous nous
sommes rendus compte. que pour que ce procèdé
soit efficace il est nécessaire et même conseil-
lé. d'aménager lors de la pose des intercalaires.
une ~8tite riEole sur le pourtour du moule. dans
laque~le l'agarose sera coulée
- Soit. comme nous procèdons le plus souvent. en
coulant directement. et raoidement environ 2 ml
d'aç;:lrose. dans le fond du moule. L'agarose s'in
filtre dans les fissures. et elle se solidifie en
l'esp~ce de ~ 2 mn
Dans Le cas. les précautions ~ prendre. sont de
travailler rapidement. et de veiller ~ ce que la
surface sur laquelle repose le moule soit bien
plane.
~ Les plaques sont nettoyées de façon classique comme
pour la verrer~e de Laboratoire. c'est-à-dire avec un
détergent et r~ncées ~ l'eau distillée.
r---l. -.._... i .
Pistor',.... ---_ ..
( no u r I~ rCl [1 i E"t e >. :J ,J r '0 r: LiE l J
83
l.
1
! \ II. / \...
..- }L·~~):=~=·.-J::,,::'::=::::===~ll~.'.
A
.. Gco l Cl' i\ [: f=, '.
.~ éj." l. F:: '3! l' i ~:: r ei\
+
8
P""tq'iE-' "
c
riEnt"
f\(~arOSfé
G l ,1 1 lE!
13 " ,'~ c y ;' C; 'j C; 'J ') U r 1 r, r le LI.
84
Des solutions de gel en concentration uniforme
d'acrylamide pouvent être coulées. Pour notre
part, les meilleures résolutions (cf Ch. résul
tats-discussions) ont été obtenues, après sépa
ration dans des gradients de gel de polyacrylamide.
Les solutions et les proportions des composants
du gel sont données dans le tableau ci-dessous.
GEL DEGELS DE RESOLUTION CONCENTRATION
5% L 7,5% L 10% L 16% D 4,5%
au distillée 11 ,67 ml 10 ml 8,37 ml 12 ml
~olution C 3,35 ml 5 ml 6,60 ml 10,BO m 3 ml
::iolution E 5 ml 5 ml 5 ml 5 m(pH B,8)
Solution 0 5 ml(pH 6,8)
Glycérol 4,20 mà 75 %
TEMED 10 ~ l '1 0 ~ l 10 ~l 10 fJ 5 ~ l..Persulfate
50 ~ l 50 ~l 50 IJ l 50 P 50 ~ld' NH4+
Volumes 20 ml 20 ml 20 ml 20 m 20 ml
~ Le TEMEDet surtout le persulfate d'ammonium doivent êtretoujours ajoutés en dernier.
L = Solution "légère"
D Solution "dense" contenant du glycérol.
85
Nous avons utilisé des gammes variées de 8radient
A titre d'exemple. nous citerons les gradients
5 -1 6 7 • 5 - '1 E ~ et 10-16 ; que nous avons 18
plus souvent employés.
Le dispositif utilisé pour la réalisation de ces
gradients Est rG~r~senté d6ns la Fi~. 18 •
Il s'agit d'un formateur de gradient (vol. 30 ml de
chez PLASTIMARNE). Deux chambres l et II sont A~ cummu
nication par un mince canal inférieur muni d'un
robinet ~ deux voies. La chambre II communique
avec l'extérieur par un canal étroit et contient
un tJarre.3u méJco;nétique
lanEe.
c'est la chambre de m~-
Les volumes ~ utiliser sont déterminés par la
dimAnsion du gal et la forme du gradien~ (exoo-
nentiel ~u linéaire1.
Four un ~81 dB dimension
". Gra d i el tex p 0 n 8 Il t i e l------------------._-
1 1 0 x 1 4 0 X '1. 5 fT) ITI
on utilise 8 rn l d e3 Cl J. LI .-
tion dense (0) et 16 ml de solution légère (~J.
Les 8 ml de solution dense sont transvasés I:J ans
la chamb0e de mélange. qui est aussitôt obturée
par un piston. de façon è maintenir le volume
constant.
Le rob i n ,~t s? p a r:Hl t les de u x cha mb r es est 0 u 'i e" t
de façon ~ chasser l'air contenu dans le cana~ dB
cornmunic~tion et à permettre le remolissage de
ca n ë l pj' } a s ,0 l ut i r. nIa p l us d en se. L es 1 E ri, l.
ci e sol u tL Cl n 1 [~ g è r f, : 0 n t :Tl 0 n tés dan s l 2 C Cl am brel •
l'32itation est mis2 en route. st la connection
avec l'extérieur est faite. La soluticn de gB1
est cou1 6 e 30 ?ond des plaoues avec un débit
car un r'o:Jinetest ver '; :-: ~j j U :3 qu' ~1
de 3 ml/cr, n.
,-, n v i r 0 n 3 cm d u
La scdutil;rl
bas ci e l a f 8 r' le,
- Gradient linéaire----------------- dans ce cas on utilise
85 bi s
12 ml de solution "dense" (0) et 13 ml de solution
"légère" [L). Nous procèdons de la même façon
que précèdemment. mais sans obturer la chambre
de mélange.
Le gel de résolution est ensuite, recouvert par
un mince film d'eau ou par de l'isobutanol satu
rée en eau, et laissé à polymériser à température
ambiante. (environ 1 heure).
Après la polymérisation, qui est marquée par
lê formation d'un interface eau/isobutanol, le
mince film est aspiré, et la surface du gel qui
doit-être bien plane est rincée abondamment à
l'eau distillée.
La solution de gel de concentration est alors
coulée [environ 5 ml) et le "peigne" nécessaire
à la formation des puits de dépot est introduit
tout doucement en évitant d'emprisonner des bul-
les d'air. La polymérisation a lieu au bout dei
30 mm environ.-,
Après la polymérisation du 'gel de concentration,
la plaque peut-être immédiatement soumise à élec
trophère, ou alors être conservée dans une enceinte
humide [réfrigération 4°C) pendant au moins 2 se~
maines avant d'être utilisée. Nous préfèrons
couler le gel de résolution, la veille de son
utilisation.
De nombreuses méthodes de préparation des échan-
86
tillons. sont valables dans ce genre d'électro-
phorèse 207 l. Elles ont en commun. le
fait de travailler en milieu dénaturant. par
l'introduction du mercaptoéthanol qui rompt les
ponts disulfures des protéines.
Les protéines dissoutes dans le tampon échantillon
doivent-être immédiatement soumises à électro-
phorèse.
Nous utilisons des échantillons, qui ont été
déssalés et lyophilisés. Les lyophilisats sont
repris par le tampon échantillon (solution Bl
à une concentration finale variant de 2 à 5 mg/ml.
Les échantillons sont incubés à 100 o[ pendant
2 à 3 minutes. Pour les protéines fragiles,il
est préférable de les incuber à 37°[ pendant 3 h.
Après l'incubation, agiter les solutions au
VORTEX, et ajouter 5 à 10 pl de solution de
Bleu de b romophénol à 1 L en guise de marqueur
de front.
"L'intercalaire" du bas et le "peigne" sont
retirés et les plaques de verre sont montées
dans l'appareil à électrophorèse, en veillant
à ce que le contact entre les plaques et le
joint d'étanchéité soit parfait. Les réservoirs
sont remplis par le tampon d'électrophorèse (so
lution A, environ 500 mll en évitant d'emprison
ner des bulles sous le gel dans la cuve du bas.
87
Les solutions d'échantillon sont déposées dans
les puits à l'aide d'une seringue HAMILTON. Les
volumes à appliquer sont fonction de la concen
tration en protéine, et de la quantité de radio
activité présente dans le cas des gels qui seront
soumis à autoradiographie ou à une fluorographie.
En général, nous déposons des volumes variant de
10 ~ 30 ~l (50 à 150 ~g/5oo0 à 10000 cpm).
La connection entre les électrodes et le généra
teur est effectuée (Pôle négatif en haut) et l'é
lectrophorèse est conduite à 30 mA/gel (ampérage
constant) jusqu'à ce que le front de migration
(matérialisé par le Bleu de bromophénol) atteigne
le bas de la plaque (environ 3 heures). Si le
voltage n'est pas stabilisé, il oscille entre 90
et 180 volts.
5 - Fixation - Coloration - Décoloration.------------------------------------
Après l'arrêt de l'électrophorèse, le gel est
démoulé avec précaution. Le gel de concentration
et le joint d'agarose sont découpés à l'aide
d'un scalp81,Après avoir réalisé une entaille en
bas et à droite du gel, celui-ci est transféré,
en prenant soin de le tenir par le côté le plus
concentré (bas du gel), dans une cuvette conte
nant le fixateur et le colorant.
Les techniques de fixation coloration et décolora
tion seront vues en détail plus loin dans le
chapitre consacré à cet e~fet (Ch. Révélation).
88
4.2.2.2'4' RESULTATS ET EXPLDITATIDI\J.
- Après coloration et décoloration, les fractions
protéiques apparaissent sous forme de fines ban
des colorées, dont le nombre et l'intensité dé
pendent de la nature et de la concentration de
l'échantillon à analyser.
- L'exploitation première de cette technique est
la dstermination des masses moléculaires relati-
ves des différentes fractions orotéiques. En
effet , SHAPIRO et Co l 1. [164 ont démontré qu'il
existait une relation linéaire entre le loga
rithme de la masse moléculaire et la mobilité
électrophorétique de chaque chaIne polypeptidique
[expsrience faite sur 11 protéines), lorsque des
protéines sont séparées dans un gel de polyacry
lamide -- SOS.
La F,énéralisation de ce principe par \<JEBER et
QSBDRN (206), laisse apparaître que par cette
technique, les masses moléculaires oes polypep
tide peuvent être déterminées avec une précision
de plus ou moins 10 ~o •
Nous proc§dons à la détermination des masses
moléculaires de la façon suivante
Lors de toute migration électrophorétique, des
protéin8s étalons de masse moléculaire connue
sont traitées de la même façon que les échantillons
é analyser. Nous disposons de deux "Kits"dont les
comD~sitions sont les suivantes
89
- Etalons de haute masse moléculaire (PHAR~ACIA)
Thyroglobulin~. 330 000
Ferritine 220 000
Albu-nine. 67 000
Catalase. 60 000
Lactate deshydrogénase 36 000
Ferritine ............ 1 8 500
Phosphorylase B. 9 4 000
Albumine ... 67 000
Ovalbumine. 43 000
Anhydrase carbonique. 30 000
Inhibiteur de trypsine. 20 1 00
Lactalbumine ........... 1 4 400
~ans un premier temps, on déter~ine la mobilité
relative des protéines étalons (= Rf).
Distance de migration
RfHauteur du front de migration
ou avec plus de précision
Distance de mi~ration
RfLon~ueur de gel apr8s décoloration
LCJllgueur avant colorationx
Hauteur du front
Dans un deuxième temps, nous reportons sur un
papier semi-logarithmique en ordonnée coordonnées
logarithmiques) les masses moléculaires, et en
abscisse les "Rf".
supports
en plaque
90
Une fois la droite d'étalonnage établie, on mesure
les distances de migration des polypeptides de
masse moléculaire inconnue et on calcule leurs
Rf. en se reportant à la droite d'étalonnage, on
détermine la masse moléculaire inconnue.
Lors de la mesure des distances de migration, nous
prenons comme point de repère le milieu de la
bande à déterminer.
4.3. L'ISOELECTROFOCALI5ATION (I.E.F.).
4.3.1. DEFINITIDN.
Le processus d'électrophorèse, peut-être le plus
ingénieux et le plus efficace pour séparer les
protéines, est la focalisation isoélectrique ou
électrofocalisation. En effet, depuis les travaux
de SVE'JSSON 180), et de VESTEBERG 197
qui ont défini les principes généraux des gradients
"naturgls" de pH, cette technique est devenue une
méthodg de séparation des plus utilisées-
L'I.E.F. peut-être réalisé sur différents
(liquide, ap;arose, sephadex, acrylamide),
horizontale, ou en tube vertical.
4.3.2. PRI',ICI;:JE.
Si on applique un courant électrique continu à un
milieu non soumis 3 des courants de convection, et
contenant des substances ampholytes (c'est-à-dire
possédant en même temps des charges positives et
négatives) de masse moléculaire faible, il en
résulte la formation d'un gradient de oH.
91
En même temps, les substances ampholytes (ou ampho
tères) de masse moléculaire élevée (par exemple
les protéines) migrent jusqu'à ce qu'elles aient
atteint la zone de pH égale à leur pH iso&lectrique.
A ce moment leurs charges électriques sont nulles
et elles ne migrent plus.
Cette ~éthode permet donc de séparer les protéines
exclusivement en fonction de leur pH isoélectrique.
Les ampholytes porteurs, utilisés sont des mélanges
d'un grand nombre d'acides polycarboxyliques et de
polyamines la récartitio~ des groupes aminés et
carboxyliques dans la molécule définit le pH iso
électrique de chaque ampholyte.
On utilise donc toujours un mélange de produits qui
recouvrent ainsi tout un intervalle de pH. et permet
tent de ce fait la réalisation d'un gradient.
4.3.3. I.E.F. sur plaque commerciale (LKB).
Nous avons utilisé les "ampholines PAG plates"
pH 3,5 - 9,5 prêtes à l'emploi. Ce sont des gels
de polyacrylamide prêts à l'emploi contenant
l'ampholine porteuse d'ampholytes pour l'électro
focalisation analytique.
Chaque Amoholine PAG plate est dotée de son propre
film support en plastique. Il est possible d'analyser
24-28 échantillons en une seule fois sur une ~laque
entière ou bien de découper la quantité nécessaire
pour analyser un plus petit nombre d'échantillons
et de conserver le reste pour la prochaine manipu
lation.
92
4.3.3.1. ~ATERIEL.
L'électrofocalisation est réalisée à l'aide
du ~ultiphor LKB 2117 dont les différentes
parties sont schématisées dans la Fig. 19
L'alimentation électrique est assurée par le
générateur LKB type 3371 C.
4.3.3.2. REACTIFS.
H3P04 1 ~
l\JaoH 1 ~
solution de fixation
&olution de coloration
Solution de décoloration
4.3.3.3. MODE OPERATOIRE.
(Anode)
(Cathode)
cf. Ch. Révélation
L'échantillon peut-être déposé à n'importe quel
endroit du gel. Il suffit de plonger un papier
applicateur d'échantillon (petits carrés de
papier filtre) dans la solution échantillon
et de l'étaler sur le gel.
L'échantillon peut-être déposé sous forme de
gouttelettes à l'aide d'une seringue HA~ILToN
(5 ) 20~1) directe~ent à la surface du gel.
Les ~êches d'électrodes sont tremoées dans des
A 8
93
Fig.19- SCHEMA OU IYJULTIPH[IR LKB 2117.
A I.E.F. dans le sens de la largeur (10 cm)
et 2 fils de platine (anode et cèt~ode)
1 supoort des ~lectrodes et c~~vercle du gel
5 plaque de gel de polyacrylamide (1~m d'épaisseur)
6 réfrigération
7 cable de connection au générateur
B couvercle de sécurité
B 1. E. F .
3 et 4
9 et 1 0
dans le sens de la longueur (24 cm)
bandes de papier filtre (anode et cathode)
fils de platine (anode et cathode)
solutions d'électrolytes (H3
P04
1MG. et
NaOH 1MB) et posées le long du gel.
94
Pour obtenir un champ électrique uniforme.
les électrodes en platine sont maintenues
parallèles sur le couvercle d'électrofocali
sation qui maintient également une humidité
constante à la surface du gel.
Après la mise en route de la réfrigération.
l'électrophorèse est conduite selon le pro
tocole suivant
o1 0
20
3,l
40
58
68
70
80
91]
200
340
540
900
111 0
11 50
11 80
11 80
11 80
1 1 80
La s~paration est donc effectuée en 1 heure
et 30 minutes.
4 - Fixation. coloration. décoloration.
Après l'arrêt de l'r.E.F .• les plaques sont
fixées. colorées. et décolorées selon les
méthodes que nous exposerons dans le chapitre
"Révélation".
95
4.3.3.4. DETERMINATION DU pH AMPHDLINE.
Il faut connaître avec précision le gradient
de rH contenu dans le gel pour déterminer exac
tement les pHi. et pour comparer les différentes
bandes de protéines.
Avec l'électrode de surface (LKB) nous mesurons
directement les pH à la surface du gel sans le
retirer de la plaque réfrigérante. immédiatement
après la focalisation et à température égale à
celle de la migration. Les parties actives de
la microélectrode ont un diamètre de 3 mm seu
lement. ce qui permet de mesurer le pH à des
intervalles de quelques millimètres.
4.3.4. ELECTRDFDCALISATIDN VERTICALE EN TUBE.
Si l'électrofocalisation en plaque offre de nombreux
avantages et notamment. celui de pouvoir faire migrer
simultanément de nombreux échantillons sur la même
plaque; son utilisation comme 1ère dimension. dans
une électrophorèse bidimensionnelle soulève de nom
breux problèmes (cf. Résultat Discussion).
Nous avons donc choisi l'I.E.F. en tube qui est certes
plus longue. quant à sa réalisation. mais qui est
beaucoup plus maniable. Les protocoles de D'FARRELL (141)
de M'lES et NIKAIDD ( 6 J. et de RIGHETTI et DRYSDALE (151,
152 J. nous ont guidé dans la mise au point et la
réalisation de cette technique.
4.3.4.1. REACTIFS.
Ur é 8 •••••••••••••• 9 ,5 M
NP 40 ............. 2 \. (P /V)0
~ 1, 6\. pH 5 - 7Ampholines ........ 2 1;D
0,4 ~ pH 3 1 0D -
,8Mercapto éthanol 5 \.D
96
Acrylamide .....•..
Bisacrylamide ... , .
28,38 ~ (P/V)
1 1 62 ;
M Solution stock de Nonidet P40 :
NP4D , .. 1 0
40 ~ (P/V)
H3
PO 4' •••••••••••
Na 0 H•.......•...•
0,0:l M
0,02 M
Ur é e ••••••.•.••••
Ampholines •.....•
9 M
\.D
97
4.3.4.2. APPAREILLAGE.
L'I.E.F. est réalisé dans un appareil classique
pour électrophorèse en tube vertical : cet ap
pareil a été modifié par RIGHETTI et DRYSDALE
(lS1) pour obtenir une réfrigération suffisante,
et l'utilisation de petits volumes d'électrolytes
(Fig. 20 ).
Nous utilisons un appareil similaire (BUCHLER
INSTRUMENT] composé de deux compartiments dont
celui du bas est réfrigéré par une circulation
d'eau (Fig. 21 ).
4.3.4.3. MODE OPERATOIRE.
Les solutions de gel sont coulées dans des
"cannas de verre" (130 mm x 2,5 mm de diamètre
intérieur). Les tubes sont hermétiquement bou
chés en bas par du ~arafilm~ et disposés verti
calement sur portoir plan.
- Pour préparer 10 ml de solution de gel (envi
ron 0,5 ml par tube), mettre dans Un Erlen de
50 ml :
Urée. ... . .... .. . .. .. 5 ,5 g
Solution L . .... . . . .... 1 ,33 ml
1\1 P 40 •.• . . ... . ... . . . .. 2 ml
H2 0 .• .+1 .97 ml• • Il • ••••••••••••• 1
Ampholine ( 5 - 7) ••• .. 0,4 ml
Ampholine ( 3 - 10) ... . o, 1 ml
98
Fig.20 - Appareil pour électrophorèse
en tube selon RIGHETTI et
ORYSOALE (151,152 )
- Compartiment cathodique ---- ---
2 - Enceinte refrigérée _
3 - Tub e s d e gel d' l . E . F . - - - _
4 - C0 mpar t i men tan 0 d i que - __ -- -
-- --
----
-~---- -----4 - Réservoir anodique~
---- ---
Fig.21 - Appareil commercial
(BUCHLER INSTRU~ENT)
3 - Tubes d'I.E.F. _
1 Electrodes-
2 - Rés e r v 0 i r ca t ho d i que - - - - ---- - -
99
- Dissoudre l'urée par agitation douce à 37°[.
- Ajouter T Er1 ED 7 iJ.l\
persulfate d'NH + 1 0 ~l ( 1 0 S)4
et mélanger rapidement.
- Après addition du persulfate d'ammonium, la
solution de gel est immédiatement coulée dans
les tubes. La solution est coulée 3 l'aide d'une
seringue sur laquelle a été adaptée un fin
capillaire.
Les tubes sont remplis (en évitant de faire
des bulles) jusqu'~ environ 1 cm du bord supérieur.
- Recouvrir délicatement le gel d'un mince film
d'eau et laisser la polymérisation complète du
gel s'effectuer pendant 1 heure.
- Après la oolymérisation complète du gel (inter
face eau/gel visible et bien net), aspirer tou
jours délicatement l'eau, et recouvrir les gels
par 20 à 25 (LI de solution K, qui sont à leur
tour recouverts par un peu d'eau.
- Laisser équilibrer pendant 1 heure.
2 - ~~~~_~~_e!~~~_~~~_~~~~~_~~_~!~~~~~
l2t2Q!::§~§'
- Après avoir retiré le parafilm (extrémité des
tubes), les tubes sont disposés dans l'apoareil
à électrophorèse de telle sorte que la hauteur
maxi~um des gels soit contenue dans la chambre
de réfrigération. LEls emplacements non occupés
sont oblit~rés soit par des bouchons (en plastique)
ou par des tubes de verre.
100
- La chambre inférieure de l'appareil est
complètement remplie par la solution 0 (H 3 P0 4 ).
La solution au-dessus des gels est aspirée et
remplacée par 20 ~l de solution K, eux-mêmes
recouverts par la solution P (NaoH).
- Pré-électrophorèse
200 volts ..
300 volts ..
400 volts ..
15 minutes
30 minutes
30 minutes
Après la
rejetée,
aspiré.
pré-électrophorèse, la solution Pest
et le liquide recouvrant les gels est
- Les échantillons (lyophylisés) sont repris
par la solution K, et des dépots de 10 à 50 ~l
sont effectués à l'aide d'une seringue HAMILTON.
Une goutte de Bleu de Bromaphénol est ajoutée
dans chacun des dépôts ainsi réalisé.
- Les échantillons sont recouverts par 10 ~l
de solution Q, eux-mêmes recouverts oar la solu
tion P.
- Le réservoir du haut est ~ nouveau rempli par
la solution P, et la connection électrique est
effectuée (cathode en haut et Anode en bas).
- L'électrophorèse est réalisée pendant
14 heures à 400 volts ou
18 heures à 300 volts
et la focalisation est cornplètée par une heure
:3 800 volts.
1 01
- Ce protocole d'électrophorèse peut-être varié
sans que la qualité des gels soit affectée. Mais
néanmoins le produit du voltage et du temps
[en heure), doit-être supérieur à 5000 et inférieur
à 10000 volts heures pour des gels de cette di
mension, tandis que le voltage d'électrophorèse
doit-être au maximum égal à 400 volts (141,142 ).
La focalisatior achevée (anneau jaune en bas),
les gels sont aussitôt démoulés après avoir
décollé délicatement les extrémités du gel avec
une ~iguil18 fine, le5 gels sont expulsés par
pression lente et continue à l'aide d'une serin-
gue spéciale [20 ml).
Les gels démoulés seront traités des façons sui-
vantes
- Fixes et colorés (cf. [: h. Révélation)
- Equilibrés (dans la solution B) en vue
d'une seconde dimension (cf. Ch. Bidimensionnelle)
- Equilibres et congelés (pour 2 D. ultérieure)
- Montés directement sur une seconde dimen-
sion sans traitement préalable.
4.1.4.4. RESULTATS ET EXPLOITATIONS.
- Aorès la coloration-décoloration, les protéines
apparaissent sous forme de disques dont l'inten-
sité de coloration est Çonction de la concentration.
A l'extrémité acide du gel appara~t toujours une
bande jaune bisn nette, qui est due à la disso-
ciation du Blgu de Bromoohénol (bleu en zone basi-
que et iaune en zone acide).
102
Cette bande jaune, revêt toute son importance,
quand on pense, aux difficultés qu'il y a à
reconnaître les extrémités du gel, quand il
est démoulé. Cette bande jaune, nous sert donc
comme "indicateur de l'extrémité acide" point
de repère important, pour l~ séparation
ultérieure en électrophorèse bidimensionnelle
(2 [J).
- En ce qui concerne la détermination du ~ra
dient de pH, l'utilisation d'électrode de surface
(cf. tech. commerciale) étant impossible, nous
procèdons de la façon suivante
Lors de toutes les expériences, deux "gels con
trôles" ou "boudins blancs" sont "isoélectro-
focalisés" pour la détermination des pH.
Après l'électrofocôlisation, ces gels sont dé
COUP9S en sections de 5mm, qui sont disposées
individuellement dans des flacons contenant 2 ml
d'eau distillée (dégazée) ou d'urée 9,2 M (pré
parés extemporanément). Ces flacons sont bouchés
et agités pendant 5 ou 10 minutes (141,142 )
ou 2 heures 147 À température ambiante.
Les ~H sont alors mesurés à l'aide d'un pHmètre,
et une courbe d'étalonnage est tracée avec en
ordonnée les pH mesurés et en abscisse, les sec
tions en millimètres.
4.4.L'ELECTRDPHORESE BIQIMENSIDNNELLE.
4.4.1. Définition.
Dans l'étude électrophorétique de la structure
des protp-ines, l'étape suivante qui
103
s'impose est le coupla~e des différentes techniques
que nous venons de décrire.
Nous avons donc utilisé l'électrophorèse bidimen
sionnelle. avec en première dimension la sépara
tion des protéines en fonction de leurs pHi (I.E.F.
en tube) et en seconde dimension. leur séparation
en fonction de leur masse moléculaire (ACRY-SOS en
plaque verticale).
Cette technique hautement résolutive. est de plus
en plu sut i lis é e (17, 3 1( 16, 7 8, 21 1 ) •
Elle permet d'attribuer simult~n6m8nt à une pr~téine
donnée, son pnint isoélectrinue et sa masse mnl~cu
laire.
Elle est bas~e essentiellement sur les travaux de
IJ ' FAR REL L ( 14 1 ); Arvl ESet 1\] ICA l 0 0 6 ).
L'adaptation et les modifications que nous y avons
apDort~es. ont déj3 ~té décrites dans un travail
préicérlerit (35).
dLa première dimension est ef+ectuée enrtube ( cf.
Ch. Electrofocalisation verticale en tube). et la
seconde dimension est réalisé en olaque verticale
( cf. Ch ..A,CRY /SOS technique adoptée), avec dif-
férents gradients de gels de polyacrylamide (10-16
7.5-16 5 -15 ,, . 5-20 ;, 5-25 ; ) J et l'utilisation
parfois de gels homog~nes en concentration (7.5
10 ;.12.5 ';).
4.4.3. ~OOE OPERATOIRE.
Elle est identique ~ la technique décrite plus
haut (cf.
suivante
Ch. ACRY/SnS). ~ la seule différence
104
Le gel da concentration est coulé jusou'~ la
base de la fente biseautée et dans un coin on
i nt r 0 d u i t le" pei g n e à u nad a nt" pou l~ d 'n é na l! e r
un 'f-pu l L , lequel seront déposés des ét~lons
de masse moléculaire.
l_ a s gal s d' l • E • F. qui s e rOll t sou mis Fi u n 8 ,-1 (3 L! :< i ème
dimension. sont démoulés dans un tube à essai con-
tenant environ 10 ml de solution B [cont~nent du
S.O.S. et du ~erc3ptDét~a~ol auxquels on ~1Dute
quelques gouttes de Aleu de 6romophénol.
Les sels sont ainsi a.~ i tés '3 t 8 mp é rat ure arl Dia n t e
pendant au moins 30 minutes de meilleurs résul-
tats sont obtenus lorsque l'agitation d~r8 aL! moins
~z heures.
Aorès ce temos d'équilibration, les gel~ p~uv8nt
('; t r e d ire c t 8 'Tl E, r: t SOU en i S l LI 'l e d eux i è rl e ,j i m·: :1 S ion ,
ou être congelés tel quel pour une s~paratinn
u l t ér i e LI r 8 •
3 - Transfert de la 1ère dimension SUI la
2 ème d i ITI e ri S ion .
- Après l'équ:ilibratior;, le gel d'I.l:.!'. 8':1: étalé
sur une feuille de plastique rigide.
- 0,5 ml d'a~arose ~ 2 ~ dans la solution S, sont
cou l É; s da rl s l co ri go 1 e am é n a g é eau - d 8 :; sus d, g ,0 1 de.) ,._ 8 r~ e
- Le" b (J u d i ri" d' l . E . F. 8 S t t r éJI 2 f é r r! r él 'J ide 1·1 f'! rit
d a l' s l a f E' nt'?, a t Fi n li LJ V eau 0, 5 rn l ci 1 éJ fi .:0 r [J .-: le? S (J n t
cou]~s par-dessus.
105
- L'agarose se gélifie très rapidement, et main
tient en place la 1ère dimension'
Les plaques de verre sont montées dans l'appareil
à électrophorèse (PLASTI~ARNE).
Les cuves sont remplies par le tampon A et l'élec
trophorèse est conduite à 30 ou 40 mA/olaque
(ampérase constant), jusqu'à ce que le front de
migration attei~ne le bas de la plaque (environ
4 heures).
- Pour matérialiser le front de migration, de nom
breux auteurs de la littérature, ajoutent quelques
gouttes de Bleu de Bromophénol ~ 0,1 ; dans le
réservoir du haut. Nous préférons équilibrer nos
1ères.dimensions en présence de quelques gouttes
de Bleu de Bromophénol.
Le "boudin" avant son transfert sur la 28me dimen
sion est donc légèrement coloré en Bleu, et nous
obtenons Binsi dans ]a 2è~e migration, un front
plus ho~og~ne et plus fidÀle à la vitesse de migra
tion.
- Lors du transfert de la 1ère dimension, il est
préfèrable de disooser le bout basique du gel
(pauvre en orot~ines) contre le Duit orévu pour le
dépôt des étalons de masse moléculaire.
106
- Le "boudin" peut-être disposé en contact étroit
avec le gel de concentration, et ensuite seulement
être recouvert par 1 ml d'agarose à 2 ; dans la
solution B.
4.4.4. RESULTATS ET EXPLOITATION.
- Après la révélation des plaques (cf. Ch. Révélation],
une multitude de taches apparaissent avec des ré
partitions plus ou moins homogènes (en fonction des
ampholines utilisÉes], sur toute la surface du
gel.
Bien ou'il n'existe aucune corrélation entre la
charge d'une protéine et sa masse moléculaire, le
nombre maxi. des taches qu'on paut révéler en théorie
est égal au
par chacur-)e
59 , 141,
produit des bandes mises
des dimensions utilisées
142 ] .
en évidence
toutes seules
En oratique, et en fonction de la techni~ue d'ex
traction des protéines, utilisée nous nous trouvons
en présence de 200 è 300 taches de polypeptides
(cf. Résultats-Discussion].
- Pour individualiser ces taches, nous avons établi.
un système de "q;rille de lecture". Les coordonnées
de cette grille sont en abscisse, les PHi déterminés.
et en ordonnée les masses moléculaires étalons.
Cha~ue tache s'insère donc dans une case délimitée
par la grille, et 00 on peut lui attribuer, et son
point isoélectriqu8 et sa masse moléculaire.
1 07
v - METHODES QE REVELATION.
Le choix de la méthode de révélation dépend naturellement
du but de l'expérience et de la nature chimique (orotéique
ou ~lycoprotéiau8) des comoosants à révéler,
5.1. METHODES CHIMIQUES.
5.1.1. REVELATIof\1 GENER.A.LE DES PROTEINES PAR LE
gLEU DE COOMASSIE.
Nous avons choisi le Bleu de Coomassie è cause de
son extrème sensibilité vis ~ vis des protéines.
Nous avons utilisé plusieurs méthodes de coloration
et décoloration, lar~ement décrites dans la lit
térature.
lJ.. Méthode 1 selon Il! EBER e t 0 S 90 R f\1 [207).
- Solution de coloration.
Bleu de Coomassie R 250 .. 2,5 mg
Mé t ha n 0 1 .
Acide Acétique ...
Eau Distillée Q.S.P.
- Solution de décoloration.
5 [J 0
70
10CI[J
ml
ml
ml
Mé t han 0 l . . . . . . . . . . . . . . . . 400 ml
Acide Acétique.......... 7[J ml
Eau Distillée Ci.S.P 1000 ml
Après l'électrophorpse. les ~els sont immergés
dans la solution de coloration (les "boudins"
d'I.E.F. sont démoulés dans des tubes à essai
contenant déjà le colorant. et les plaques dans
des bacs ~ coloration). pendant 3 heures sOUs
agitation.
108
Les gels sont ensuite décolorés par la solution
de décoloration. avec des changements répétés
de la solution jusqu'à ce que le fond des plaques
soit transparent (environ 6 à 12 heures).
~ Méthode 2 selon VESTEBERG (198) ~EIS~JE~ et Coll. (150).
Dans cette technique qui présente plusieurs va
riantes, les fixations et les colorations sont
effectuées à 60° C. Les solutions et les variantes
sont exposées dans le tableau de la Fig. 22 •
- Oans les variantes A et E, il est préférable
de dissoudre le Bleu de Coomassie, d'abord dans
le méthanol.
- Dans les protocoles B,C et 0, dissoudre d'abord
le Bleu de Coomassie (G 250) dans environ 800 ml
d'eau, et ajouter l'acide perchlorique ~outte ~
goutte en agitant vigoureusement la solution.
- Il est ~ noter que la variante B est très raoide,
car elle ne nécessite OAS de temos da j 6 coloration J
et dans cette procèdure, pour éviter que les bandes
ne s'estompent trop rapide~ent, immerger les gels
dans la solution de coloration à 1 ; dans de l'eau
distillée.
J1. "1éthode 3 selon LAEM:Yï!~I (111).
- Les gels sont immédiatement fixés et colorés
pendant 20 minutes dans une solution de Bleu de
Coomassie à 0,1 ; dans 50
acétique.
d'acide trichloro-
- Ils sont ensuite décolorés par agitations répé-
tées dans de l'acide acétique à 7 ", .
109
VARIAI\JTES
r-- 11
1SOlUT Iû i~ [JE FIXATION A B C 0 E
'~
Ac. Trichloroacétique [ g ) - 147 1 47 1 147 -
Ac. Sulfosalicylique [ g ) - 44 44 44 -
Eau [m l ) - 910 910 910 -
Temps d'incubation en mn 30 :30 J LI
t----'--f--SOLUTION DE COLORATION
11
1
1
11
Coomassie G 250 [ g J - 0,4 0,4 IJ.4
1
-Bleu de
Bleu Coomassie R 250 [ g ) 0,9 - - - 0,9de1Trichloroacétique [ g ) 32 - - - 32Ac.
[ g ) 107 - - - 1 n 7Ac. Sulfosalicylique- - - 39 -
Urée [g)
[ rn l ) 268 - - - 268frlf~thanol
E'au [m l ) 664 970 970 932 664
- 3D 30 29 -li c . Perchlorique [ 70 > F' IV ml),
Temps d'irlcubation en mn :30 30 30 3D :'\0
1SOLUTION DE DECOLO~ATION
Ac. Acstioue [m 1) 50 - 50 50 80
Ethanol [ ml J 70 - 70 70 255
Ethylacétete (m 1) '100 - 1 00 1 00 -Eau [m 1) 780 - 780 780 665
--f------
iTemps total Heure s 24-481 en 6H3o 1 7 -24 5-23
148 H
Fig.22 Tableau des différentes procèdures de la
méthode 2.
~ Méthode 4 Note d'aoplication LKB 250 (117:,.
110
- Solution de fixation.
Ac. Sulfosalicylique ..
Ac. Trichloroacétiau8.
1 7 ,5 g
57.5 g
r1éthanol .
Eau distillée 8.S.P.
- Solution de coloration.
150
500
ml
Ml
0.115 g de Bleu de Coomassie dans 100 ml de
solution de décoloration.
- Solution de décoloration.
Eth a n 0 l . . . . . . .
Ac. Acétique ..
Eau distillée Q.S.P.
500 ml
1 60 ml
2000 Illl
Les gels sont incubés dans la solution de coloration
toute une nuit, et décolorés par changement répétés
de la solution d8 décoloration.
- Chacune de ces méthodes de coloration donnant
de bons résultats, nous les avons utilisées alter-
nativement sans altération dans la reproductibilité
des e x ri é rie n c es le choix de l'une ou l'autre de
ces techniques étant surtout conditionné oar le
temps qui nous est imparti.
- Les ~els décolorés avec les protéines apperais
sant e~ Bleu, sont photographiés et traités en vue
d'une conservattor1 (cf Ch. Technique cons~rvation).
5 . ') . ;:. R EVE LAT l 0 ~J 0 ES GLye 0 p RCl TEl NES •
L fi t (ê! c h n i que ,j e col 0 r él t ion cJ E-! S g lys 0 p r CI t é i ne:; est
1 1 1
cel18 décrits par FAIRBANKS 44 techn::que
al: P.A.S. (Pg,iodic-Acid-Scl1iff).
':; .i . 2 . 1 R E il, CTIF S .
Solution de fixation.
fI é -;..:. han 0 J. • • • • • • • • • • .. • •
~c. Su~fosalicyliqu8.
AC. Trichloro,3c~;tique.
tau [Jist·lll~~e .
F3:srosanil1~a [FUSCHINE GURR)+
:/'!.',=j~liSLJlfi~:(? cJ;,> ~,Ja /K
1 r 1 C 0 fi C e n t r ,S • • • • • • • • • • •
1 58 ml
1 7 , ;'5 'J6
5 7 , ~; a",
35D ml
ml
,~. r;,: t El r ~: 1J ~o:i u l ,3 U c h él n g 8 mg rl i: d 8 t e i n te.
[h~rbon 3ct1f . U, 2 G
;. il t r E r S i) lut ion i ,n col 0 :' ~~ ) ,
-- 'i >: e r l 8 3 ;:, <0) l~, cJ;, "1 5 l a :i C 111 t i 0 ri (! 8 fi>' =j t :L 0 n
:Jp,ndant '~c 'J,n"
,- l'ince)":J l'2fl!.i eJ:Lc:cill IJc 2 )<' 1(1 G:n.
J3in (J'Hf'], ,°1 1"
dans l'acide aC:F:ti'~1ue à
Cj r! l'n,~ 2' LOC El t ,j l' Cl b s c uri t {~ .
l ' ? ci 1,1 dis t i l l 2 E-, , U '1 qu',~ c: e q!j' i ln' y
p l IJ~; cJ CCl ::' r r:: c :i pit § ,3 'J ,_ C 'AgNO]
- Ajouter le réactif de SCHIFF
et à l'obscurité.
50 mn à 4° C
1 1 2
- Rincer avec du Na2
S2
05
à 1 ~. 3 à 4 fois et
conserver dans cette solution ou dans le SCHIFF.
5.1.2.3. GELS CONTENANT OU S.O.S.
Les difficultés de coloration des gels contenant
du S.O.S .• avec la méthode ci-dessus. nous ont
contraint à modifier celle-ci de la façon sui
vante
- Fixer les gels pendant 24 heures. dans la so
lution de fixation sous agitation. et en renou
velant 3 à 4 fois la solution.
- Laver abondamment à l'eau du robinet. en continu.
et vérifier la diminution du sodium au photomètre
de flamme (vérification de l'élimination du S.O.S.).
- Oxydation par HI0 4 à 1 ~ dans l'acide acétique
à 7 ~ pendant 1 heure à l'obscurité.
- Laver à l'eau du robinet en continu pendant
48 heures et continuer avec de l'eau distillée
jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de pré~iDiLé des
eaux de rinçage par l'AgN03
.
- Ajouter le réactif de SCHIFF. 1 heure à l'obs
curité et à 4° C.
- Laver 3 à 4 fois par Na 2S 205
à 1 ~ dans Hcl
0.1 N et conserver dans cette solution ou dans
le réactif de SCHIFF.
Après ces traitements. les glycoprotéines appa
raissent colorées en rouge-orangé.
5.1.3. REVELATIol\J SIMULTANEE DES PROTEINES ET DES
GLYCOPROTEINES EN ACRY/S.D.S. : COLORATION
AU " STAINS-ALL" ( SA"~h.
La technique utilisée est celle décrite par
L.E. KING Jr. et M. MoRRISol\J (119).
113
Fixation des gels dans l'isopropanol 10-25 ~o •
- Lavage intensif avec de l'isopropanol à 25 ~
18 - 36 heures. On peut chauffer à 56° C pendant
1 - 2 heures pour éliminer le S.O.S. (bien élimi-
ner le S.O.S. car des traces supérieures à 0,001
P811v'8nt inhiber la coloration).
- Coloration :
- Solution mère
rnamide.
SA 0, 1 ; ( P IV) dan s For-
- Solution de coloration:
Solution mère. .. 2,5 ml
Formamide. · . . . 1 0 ml
Isopropanol. · . . . . . 50 ml
TR IS .. . . . . . . ·. . . . . 1 5 mM
Ajuster le pH à 8,5
Coloration 12-18 heures à l'obscurité.
- Décoloration dans l'isopropanol à 10 ;, 18
36 heures à l'obscurité.
Les protéines apparaissent colorées en rouge, et
les glycoprotéines en bleu (si elles contiennent
au moins 10-100 ng d'acide sialique) .
• SA 1 - ETHYL - 2 - 3 - 1 - ETHYLNAPHToL (1,2 d)
THIAZoLINE - 2 - YLIoENE - 2 METHYLPRoPENYL
NAPHTO (1,2 d - BRolVIURE DE THIAZoDIUI"I)
(KODAK) .
114
5.2. METHODES UTILISANT DES RADIOELEMENTS.
Devant les difficultés de détection des glycopro
téines par les procédés de coloration chimiques
(cf. Ch. Résultats discussion), nous avons mis au
point et adopté les techniques d'autoradiographie
et de fluorographie décrites par SONNER et LASKEY (20,112).
5.2.1. AUTORADIOGRAPHIE-FLUOROGRAPHIE.
Les radioisotopes que nous avons utilisés sont
le carbone 14 (14 C) et le tritium (3 H). Les deux
isotQoes sont émetteurs de particules ~, avec
14 .. d 5730 'pour 19 C, une demle-vle e . annees et une
énergie maximum (I: max ) de 156 KeV, et pour le 3 H,
une demie-vie de 12 années et une Bnax de 18.6 KeV.
5.2.1.1. PRINCIPES.
Les particules ~ émises par des radioisotopes
sont capables d'impressionner une émulsion pho
tographique lorsque leur Emax est suffisante.
14Lorsque des gels d'acrylamide contenant du C
sont mis en contact avec un film sensible aux
rayons X, les particules @ émises impressionnent
directement l'émulsion photographique: dans ce
cas il3du H,
s'agit d' AUTORADIOGRAPHI5 Dans le cas
la trop faible énergie (E max : 18,6 KeV)
des oarticules ~, ne permet pas une imoression
satisfaisante des films, lorsqu'ils sont mis
directement en contact.
Par contre, la converBion des particules ~ en
photons lumineux, par l'intermédiaire d'un li
quide scintillant (PPO), permet d'obtenir une
impression satisfaisante des films dans ce
115
cas il s'agit d' AUTORADIOGRAPHIE EN SCINTIL
LATION ou FLUORoGR~pHIE.
Pour notre part, quel que soit le type de
radioélément présent dans les gels (14 C ou 3 H),
nous procédons ~ une fluorograpnie, ce çci nous
pernet de racourcir le temps de contact.
5.2.1.2. REACTIFS.
- oiméthyl Sulfoxyde (D.~.S.o.) pur
- Diphényl 2-5 oxazole (PPO) à 20 ; (P/P) ou
à 22,2 ; (P/V) dans du D.M.S.O.
5.2.1.3. MODE OPERATOIRE.
- Juste aorès l'électrophorèse ou après la
décoloration, tremper le gel dans environ 20 fois
son volume en D.M.S.o. pur (1er bain) 30 mn.
2 - 2ème bain de D.M.S.o. pur, 30 mn.
3 - Tremper le gel dans 4 volumes de P.P.O. à
20 ; (P/P) dans D.M.S.o. pendant une nuit ou
3 h e lJ r e s a u 'Tl i ni fTl um.
4 - Tremper le gel dans un bain à 50 ; d'eau
et 50 ; de D.M.S.o. pendant environ 10 mn.
5 - Immerger le gel dans de l'eau pure pendant
heure.
6 - Dessécher le gel sous vide ( voir"technique
de conservation").
'116
7 - Mettre le film en contact et placer le tout
è - 20° C ou - 70° C (voir "~ise en contact").
5.2.1.4. MISE EN CONTACT.
Nous avons testé différent films è RX, et nous
utilisons couramment le"X-OMAT-R" de chez
KODAK. La mise en contact étroit du gel et du
film s'opère dans un système de presse.
- !~~_~l~~~~~ le gel desséché sur un support
solide (WHATMAN 3), et le film sont pris en
"sandwich" entre deux plaques de verre épaisses
(découpées à la dimension du gel), et mainte
nus solidement en place par du sparadrap
Le tout est emballé dans une feuille d'alumi
nium, puis dans un cache noir, lui même emballé
è nouveau dans de l'aluminium.
- ~~~~_~~~~~~~ Le gel et le film sont maintenus
étroitement en contact dans une "cassette spéciale
film radiologique" (COMPAGNIE GENERALE DE
RADIOLOGIE) 13 x 18 cm, munie d'écrans renfor-
9ateurs (Micron 5,13 x 18 CGR). Le tout
est emballé dans 2 ou 3 feuilles d'aluminium.
Les systè~es de contact ainsi formés, sont
entreposés ~ - 20° C ou - 70° C. Les délais
d'expDsition pour obtenir des fluorogrammes
corrects varient de 3 à GO jours, en fonction
de la nature du radioélément, et de la quan
tité de radioactivitR déposée.
Toutes ces manipulations peuvent être effectuées
en éclairage inactinique. Pour des raisons de
définition de l'image (Résultats-Discussion)
nous avons choisi d'opérer dans le Œ~!~_~~~~!~t.
117
5.2.1.5. REVELATION.
Après les délais d'exposition, les films sont
révélés comme en photographie classique à 20° C.
1 - Révélateur (KODAK LX 24) 5 mn
2 - Bain d'arrêt [Ac. Acétique 1 ~/H20) 30 sec.
3 - Fixateur (KODAK AL 4) 1 0 mn
4 - Lavage abondant à l'eau du robinet 20 à ~o mn.
5 - Séchage à température ambiante.
- Les deux premières étapes sont effectuées
dans l'obscurité la plus complète. A partir
de la 3ème étape, on allume la lampe inacti
nique (orange), et le film n'est exposé à la
lumière du jour, qu'après un premier rinçage
à l'eau (10 mn).
- Lors des manipulations, il faut éviter de
toucher la surface du film avec les doigts.
Il faut le prendre toujours par les extrémités.
- Après la révélation du film, le gel peut-être
reexposé à nouveau (voir "mise en contact"),
si l'on estime que la définition de l'image
n'est Das suffisante.
5.3. QUANTIFICATION.
5.3.1. DETECTION DE LA RADIOACJIVITE.
Après électroDhorèse et décoloration, les gels
décoUDPS en sections fines ~ l'aide d'un scalpel
( Les "boudins" d'I.E.F. en section de 5 mm, les
plaques en sections de 10 x 5 mm).
Les sections de gel sont traitées des façons
suivantes
- Introduire les sections de gels dans des
fioles et les traiter suivant l'un ou l'autre
des procédés suivants
a - Ajouter 1 ml de Soluène 350 (PACKARD) et
laisser dissoudre à 50° C, puis ajouter le mélan
ge scintillant (5 ml).
b - Dissoudre les gels dans 1,5 ml d'ammoniaque
à 10 ; et ajouter le mélange scintillant.
Les préparations en milieu alcalin (Soluène,
Ammoniaque) ont tendance à donner de la chimi
luminescence. Pour l'éviter ou la réduire, neu-
lU
tralissr par 0,1 ml d'Hel 1 N, ou bien utiliser
un mélange scintillant comme le Dimilune (PACKARD)
bien adapté aux échantillons basiques (169 ).
2 - Dissoudre les gels à 37° C dans un mélange
(1 ml) constitué par 19 volumes de H2
02
à 30
et volume d'ammoniaque à BB ~o •
Ajouter ensuite le liquide scintillant (5 ml)
( 1 1 2 ).
- Le 'Tl é l a n g e sei nt i lIa nt est le" REA 0 Y- S 0 1_ V EP "
de chez BECK,I'1,l\N.
- La radioactivité est déterminée par passags
dans un compteur à scintillateur liquide type
SL 400~ INTERTECHNIOUE.
5.3.2. ENREGISTREMENT DENSITOMETRIOUE.
Des essais de quantification ont été réalisés par
119
passage des gels décolorés, desséchés sur un support
transparent (voir "technique de conservation") ou
des fluorogrammes sur un densitomètre (CELLDMATIC 2
SEBIAJ.
VI - TECHNIOUES DE CONSERVATION.
Les besoins d'exploitation ultérieure des gels d'acryla
mide nécessitent des méthodes de conservation bien adap
tées à la nat~re du gel.
6.1. CONSERV~TION EN MILIEU LIQUIDE.
Les gels en tube (I.E.F.) après décoloration suf
fisante, sont introduits dans des tubes en verre
(150 x 5 mm de diamètre intérieur),
l'eau pure ou du glycérol à 3 ou 10
contenant de
~o •
Les tubes sont bouchés aux deux extrémités et le
gel peut être conservé ainsi plusieurs mois sans
altération de la coloration.
6.2. CONSERVATION SUR SUPPORT SOLIDE.
La nécessité d'avoir des gels bien secs, lors des
techniques d'AUT~RADIDGRAPHIE et de FLUOROGRAPHIE,
nous a poussé ~ rechercher des techniques de sécha
ge [qui sont en même temps des techniques de con
servation) .
6.2.1. METHODE LI<B (117 ).
* Apr~s la décoloration, le gel (en plaque) est
immerf,é pendant 1 heure dans la solution de con
servation qui est du glycérol à 10 ; dans la solu
tion de décoloration (voir méthodes de Révélatioll
méthode 4).
1 20
- Poser le gel sur une plaque de verre et le
laisser sécher à température ambiante pendant
une nuit, ou pendant 3 à 5 heures à 50° C. Le
gel doit présenter alors une surface collante.
- Prendre une feuille de plastique, et l'appli
quer sur la surface collante du gel, en évitant
toute bulle d'air entre le plastique et le gel,
à l'aide d'un rouleau de caoutchouc (tels ceux
utilisés en photographie).
~ Le sel est immergé dans une solution de gly-
eérol à 3 ( V IV ) , et déposé sur une plaque de
verre entre deux feuilles de cellophane. La pla
que est mise à 40° C (étuve) pendant 1 nuit.
Les feuilles de cellophane sont retirées le len
demain, et on obtient un film dracrylamide rigide.
Les procédp.s que nous venons de décrire sont très
bien adaptés à des gels en plaque, très fins en
épaisseur (type LKB "PAG PLATE").
L'application de ces méthodes, à des gels plus
épais 1ue nous préparons nous mêmes (type gels
d'AC~Y/SDS, 1,5 mm d'épaisseur), nous a conduit
à des déconvenues. En effet, les gels rigidifiés
par le glycérol, craouent, se recroquevillent et
deviennent complètement inutilisables.
6.2.2. ~ETHODE MISE AU POINT AU LABORATOIRE.
Par cette technique, le gel sans traitement pré
alable est désséché sous vide, dans un sac en
plastique, et sur un support solide (WHATMAN 3 ~M
ou CELLOPHANE). L'ooération de séchage dure entre
et 2 heures.
1 21
6.2.2.1. MATERIEL.
- Rouleau de plastique (souple)
- Soude-sac (CALOR)
Papier WHATMAN 3
- Feuille de Cellophane
- Trompe à vide
- Support rigide poreux (150 x 150 x 20 mm)
- Sèche-cheveux (CALOR)
6.2.2.2. PROTOCOLE.
- A l'aide du soude-sac, réaliser une enceinte
en plastique (300 x 300 mm) ouverte sur un côté.
2 - Réaliser sur une face de l'enceinte, une
petite entaille, par laquelle sera introduit
un -embout en plastique rigide dirigé vers l'ex
térieur.
3 - Disposer le gel sur une pile (environ 10-20
feuilles) de papier WHAT~AN 3 (150 x15D mm) et
ajuster la pile sur le suoport rigide poreux.
Si l'on veut obtenir un gel sur support trans
parent, la première feuille de papier, en con
tact avec le gel, sera enveloppée dans 2 feuilles
de Cellophane (mouillées au préalable et bien
te nd U2 S ) •
4 - Introduire délicatement le support rigide
dans l'enceinte en plastique et souder l'extré
mité béante.
5 - Poser le tout sur un support, et brancher
la trompe à vide sur l'embout en plastique (Fig. 23).
Enceinte en
Plastique
souple
122
.~ SECHE-CHEVEUX
GEL
Pile de Papier
h/H,I'lTMA N 3
Support Rigide
Poreux
Embout en
Plastique rigide
Vide Poussé
(vers trompe à vide)
Fig.23 - SCHE~A OU SECHAGE DES GELS D'ACRYLAMIDE
EN PLAqUE.
1 2 3
6 - Mettre en route le vide (le plastique s'écrase
contre le gel), et chauffer la surface du gel à
l'aide d'un sèche-cheveux disposé à environ 20 cm
au-dessus.
7 - Vérifier l'absence de fuite (sifflements) et
laisser sécher pendant 1 à 2 heures. On peut lais
ser aussi le gel se déssécher ô temoérature du
laboratoire toute une nuit (sans sèche-cheveux).
8 - Arrêter le séchage lorsque le gel et la pre-,mière feuille de WHATMAN ou de Cellophane, ne
font qu'un. C'est-g-dire lorsqu'on passe la main
sur la surface du gel, on doit sentir une surface
plane, uniforme et sans aspérités sur les bords.
- Les gels traités par le P.P.O. en vue d'une
autoradiographie, ne nécessitent pas de précau
tions particulières. En effet, la présence de
P.P.O. rigidifie le gel qui se déssèche très bien.
- Par contre, pour des gels classiques non traités,
l'on devra vérifier que les bords sont réguliers
car la moindre fissure sur l'un des bords, se
transforme lors du sécha~e, en véritable réseau
de failles qui parcourt tout le gel, et le fait
éclater.
6.2.2.3. RESULTATS.
Les gels traités ainsi se présentent sous forme
de film très fins, montés sur un support solide
(WHAT~AN ou CELLOPHANE). Ils peuvent se conserver
indé-finiment.
TRDISIEME PARTIE
R~SULTATS EXPERI~ENTAUX
124
l - MISES AU POINT TECHNIQUES SUR DU SERUM DE VEAU FOETAL
(S.V.F.l.
Nous avons choisi le sérum de veau foetal (SEROMED-BIOPROl
à cause de sa richesse en protéines, et de la facilité
d'approvisionnement.
1.1. - UTILISATION DE PLAQUES COMMERCIALES.
1 . 1 . 1. - 1. E . F. 0 ES. V . F. ( Am ph 0 lin e sPA G-P lat e LKB1 •
Le S.V.F.dilué au 1/5 e est utilisé comme échantillon
et des dépôts de 15 à 20 l sont effectués sur les
papiers filtres.Après électrophorèse, la révélation
au Bleu de Coomassie nous montre une multitude de
bandes inégalement réparties avec une forte concen
tration dans les zones de pH de 4 à 6 (Fig. 24
donnant lieu à une interprétation difficile.
L'utilisation de concentrations moins élevées en
protéines dans les dépôts, nous donne toujours le
même profil électrophorêtique avec une disparition
des bandes qui s'étalent entre les zones de pH de
5 à 7.
Cette technique présente un avantage certain, qui
est celui de la rapidité d'exécution (1 h 3ol,
très aooréciable en biochimie clinique. Mais le
tout est de savoir si la rapidité d'exécution
d'une technique doit primer sur la qualité d'in
terprétation des résultats.
Dépôts
pH
4 .2
5.6
6.7
8.00
8 .5
9.2
pH
125
Fiç.r,. 24 - I.E.F. DU S.V.P. (l/S) SUn. N1PHOLINES (3,5-9,5)
PAG PLATE L.K.B.
126
1.1.2. - PREMIERS ESSAIS DE DOUBLE DIMENSION.
Les premiers essais de séparation en double di
mension utilisant en 1ère dimension l'I.E.F.
(PAG-Plate LKE) et en 2éme dimension l'ACRY/SDS
(PAA 4/30 PHARMACIA), nous ont donné des résultats
plus que décevants. En effet, la séparation du
S.V.F. selon la première technique de double di
mension ((.hOf.Mél-hode,)nous donne 3 grosses taches
ininterprétables (Fig.25 ) et de nombreuses trai-
nées.
Il est à noter aussi que la décoloration du gel
PAA 4/30 est extrêmement longue (2 semaines).
Ces résultats peu encourageants nous ont poussé
à rechercher des méthodes de séparation plus per
formantes.
1.2. - UTILISATION DE GELS COULES EN LABORATOIRE.
1.2.1. - I.E.F. EN TUBE.
L'isoélectrofocalisation en tube nous a donné de
meilleurs résultats. quart à la séparation des
protéines et à la reproductibilité de la méthode.
les m8mes conditions de séparation (voir matériels
et méthodes) étant bien entendu respectées.
En effet. la séparation des différents constituants
du S.V.F. nous donne 4 groupes de protéines dont
les pHi approximatifs sont les suivants
- 1er groupe : de 7,00 à 6.40 : 3 bandes
2ème groupe de 6.30 à 5.60 10 bandes
- 3ème groupe de 5.50 à 5.30 5 bandes
- 4ème groupe de 5.20 à 4,80 1 0 bandes
(voir Fig. 26 ) .
127
------t
l".". ; FiQ. 25 1er ESSAI de
SEPARATION endouble di~ension
du S.V.F.
.. l.... •\
41 8..l . S (j
pli
1. E. F. en tubedu S.V.F. et coloration Dar le B.C.
Fip,. 26:, . ~,( .
/1 • .'1'
,',,.~.
i 1,: , ,," J 'C- l
P' rl
Fir"':. 27 I.E.F. comoaratifdu S.A.B. , S.V.f.et S.H.Coloration Dar len.c.
1 28
1.2.2. - DETERMINATION DU pHi.
Un des problèmes sur lequel nous avons longuement
discuté est celui de la détermination précise des
pHi selon la méthode décrite (Matériels et méthodes).
En effet, les fractions du S.V.F. (groupe 2) ayant
la même mobilité électrophorétique que les fractions
de sérum-albu~ine bovine cristallisée (SIGMA) ont
des pHi nettement supérieurs à ceux rencontrés dans.la litt 6 rature ou la sérum_albumine a un oH, de
4. 9 1 1 5 (Fic:>;. 27).
La sérum albumine bovine pure cristallisée sou~ise
à l'électrofocalisation en tube, révèle après co
loration au Bleu de Coomassie, 5 bandes dont les
pHi sont respectivement de 5.8 - 5.8 - 5,75 -
5,45 - 5,40. La bande majeure en intensité de
coloration se trouve dans la zone de pHi 5 • 8 n .
Il est donc difficile de faire une détermination
précise du gradient de pHi à cause de la forte
concentration en urée ~ 10 M) qui entraîne de
grandes variations dans les pHi des protéines (141)
( Fig. 2 B, 29, COLe r b e!l CE 0 H,
). Ces variations peu-
vent aller jusqu'à 1 unité de pH.
La mesure du ~radiEnt de pH au pôle acide du gel
est moins précise. à cause de la diffusion de l'urée
hors du gel et à cause de la forte influence de
l'urée sur le oka des groupements carboxyliques (19).
Par contre l'introduction d'une solution d'acide
aspartique 0,05 M + acide glutamique 0,05 M dans
la préparation des ~els, entraîne une stabilisation
du gradient de pH (147) mais n'entraîne pas d'amé
lioration sensible de la résolution mais au contraire
pH
12 9
7
6
5
4
o 2 4 6 8 10 12 Cm
Fi~.2 8 - Courbe "1oyenne de néter"lination du Gr"!dient de
OH (I.E.F. en Tube)
A~PH1LI~ES : pH 5 -
0-0 '1esures effectuées dans l'eau distillée.
............ "1 ''; 5 U r F. s e f f e c t u P e 5 dan 5 l' ur 6 ~ q', 2 IYI
~ hal.t ou "gel" est ~ ~Bcc~le.
pH
9
8
7
6
5
4
130
o 2 4 6 8 10 12 cm
Fig.29 - CDURB~ MnYE~~E DU GRADIENT DE pH (I.E.F. TU~El
- AMPHlLI~ES : pH 0,5 - 1n
- ~ESURES EFFECTUEES DANS L'EAU DISTILLEE.
1 3 1
un tassement des bandes, (35)
En dépit de ces désagréments, il est clair que le
pouvoir de résolution de la technique d'I.E.F. en
tube est nettement supérieur à celui obtenu avec
le Kit LKB (PAG-Plate AMPHOLINE), tout au moins
en ce oui concerne la séparation du S.V.F.
Nous ne parlerons donc dans l'exposé, que de "point
isoélectriques apparents".
1.2.3. - SEPARATION EN DOUBLE DIMENSION.
Alors 1ue la séparation du S.V.F. en électrophorèse
unidi~ensionnelle en gel d'acrylamide et en pré
sence de SOS, n'apporte que peu de renseignements
3 5 ) la séparation en double dimension, ré-
vèle une multitude de taches (Fig.30 ) dont l'in
terprp.t~tion devient, à la limite, extrêmement
difficile.
Une approche a été faite par l'établissement d'une
grille de lecture (Matériels et Méthodes).
1.2.4. - ESSAIS Of DETERMINATION C1UANTITATIVE DES
PROTEINES APRES I.E.F. EN TUBE.
Des essais de détermination quantitative ont été
effectués par passage des gels sur un densitomètre
(CELLOMATIC 2 SE8IA).
On retrouve biEn les 4 groupes de bandes décrites
précédemment, mais l'appareil ne détecte pas les
bandes rapprochées [ 3 5 ) .
Pour un rendement optimal, il faudrait des gels
parfaite~ent d~colorés et un densitomètre ~ réso
lution plus fine.
Etalons de PM
!1. E. F. -----~)
132
---- --- -
S.D. s.
l
--"r:IIP_-- -
---.- ". ~-.=-"":;':::':-.-="_ ..._""':":".,--
I-------- ~ _J'I/
- Fi·~. 20
Electrophorèse bidi~ensionnelle
du S.V.F., selon la ~éthode adoptée (141)
~radient d'Acry : 10-16 ~
- coloration par le B.C.
133
II - GLYCOPROTEINES DE MEMBRANE.
2.1. - APPROCHE GENERALE.
Avant d'entreprendre l'étude de l'action des effecteurs
exogènes sur la membrane plasmique,il était nécessaire
et primordiale de localiser les (glyco)protéines à la
surface de cette même membrane. Ces déterminations,
comme nous le verrons seront variables, en fonction
du système d'approche utilisé (trypsinat ou lysat cel
lulaire] .
C'est dans cette ootioue que nous avons essay?' d'obtenir
le profil général des (~lyco)protéines de membranes,
des cellules L121D et K562, en fonction des différen
tes mRthodes d'aoproche (trypsinat ou lysat cellulaire)
et des diverses techniques de sRparation et de révéla
tion (I.E.F., ACRY/SDS, 9idimensionnelle).
:~.2. - L121 rJ.
2.2.1- S~PARATIOI'J OU TRYPSINAT ME"1BRANI\IRE OES
CELLULES L121D PAR I.E.F. EN TU8E.
- L'I.E.F. est réalisée selon la technique décrite
plus haut (Ch. Matériel, Technioue et ~éthodolo~ie).
- Après la reprise du trypsinat lyophilisé par le
tampon échantillon (solution K) des déoôts de 10 ~
15 ~l (soit environ 100 ~g de orotéines) sont ef
fectués au-dessus des gels.
- Après la séparation électrophorétique et coloration
par le Bleu de Coomassie (cf. Ch. Révélation), le
trypsinat de L1210 révèle de façon reproductible( 35
une série de bandes. Ces handes sont au nombre de
32 (Fig. 31
4,80.3 7,10.
~vec des n~i aonarents qui varient de
. ._•..__.---_.- P Hi 7 , 1 ni--·--·- 2 7 , 013
3 7 ,1J54 7 , on5 6 , 139
.~ 6 6 , 8n7 6 , 713
--_. - R 6 , 72-._ .... - - ...... :'1 6, 65- - - ----*-----_ ... 1 IJ Fi Sil,
1 1 " 6 5 11,
1 2 " f3 55- - - --- ,1 l 6 .50
- - - -- - -- 1 4 6 , 40,~:1..~._. 1 5 6 40,-------- 1 6 " 5 ,q 0
1 7 5 ,q n-- _. - - _.- - .. - ... - - 1 !3 5 135,
1 q 5 , SR20 " 5 B6.
C....,
--" .. -._- 21 5 , 130,~') 5 ,q nL'. '..
21 5 , 70-"--- .- 24 5 , 6 ri- -- ---
25 5 45- - - -- -- ,26 S , /n27 5 , ;;n211 5 , 1 r;--.2q 4 ,90_. - -- - - --".3n 4 ,0, R,
__'1:- ~ .;t.. .;;a.:.- 11 4 AS,
+ "'~ 4 , 13 [}'/.
Fi~.31 - I.E.~. DU T~YPSINAT DE L121n.
134
134 bis
1 f
Il
1
1
I~1
130
~ . iIl 1
fJ1 i(
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\ r~1i1 -
1
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V 14.15 1~
1
l!'vl~ 17.18
1 \ .1 \ 1
1J \ \ (
1 V1
1
S 11 /
~V
7.8
i11
1
1
1
~ .. _.. ~. ... __ . __ . L_UIO._ LE.F._.~ __ __ _ __ ._. _._._ .. __ ._~ 1
1 Re.1 pH = 7.10 ~ 4,801. ---·t··· -.----- ---- --- .------.- -- _o. -- ...- -- ..-.
1
1
l. .-........- .- --.1
i 1 2 ~41i
. 1 . \ 5 6
1
FIG 31 bisiiii
. 1
13 5
Les bandes majeures (intensité de coloration au B C)
sont les bandes nO 1,8,13,14,15,23,24,25,26.
29, 32 ayant deS p~i apparents de 7,10 - 6,72 - 6,50
6,48 - 6,40 - 5,70 - 5,60 - 5,45 - 4,90 - 4,80
(Fig.31).
On remarque que dans un tel système de séparation,
la majorité des protéines se focalise dans une zone
acide vericnt de 6,72 à 4,80.
2.2.2. - SEPARATION EN GEL O'ACRYLA~IOE/SOS.
Les électrophorèses sont conduites selon les pro
tocoles déjà décrits (~atériels Techriques 8t Mé
thodologies) .
Pour avoir des résolutions plus fines nous avons
utilisé différents gradients de gel d'acrylamide
les plus usités étant les 5-15 "o , 7,5-15 ';, 10-15
2.2.2.1. - PROFIL DU TRYPSINAT APRES COLORATION
AU BLEU DE COOMASSIE.
Le orofil électrophorétique du tryosinat de
L121D révèle plus d'une cinquantaine de bandes
polypeptidiques (Fio;.32. 33).
L'utilisation d'étalons de masses moléculaires
connues (KITS PHARMACIA) nous a permis d'attri-
buer une masse moléculaire apparente (voir ré-
sultat et exploitations Ch. ACRY-SOS) ~ chacune
de ces fractions polypeptidiques.
L'étude comparative de cinq gels, résumée dans
le tableau de Fig.34 révèle 3 groupes de po
lypeptides
136
A B
~94
Fir'. 32 Trypsinat deL1210 - ACI~Y/S.D.S.
7,5-15 S;Coloration par leB.C.A dépôt de 150 ::JB: " "100 ~
~M ,." §
AWi",43
..-30
.. 20-14
E:'JFŒGlS TRE':El'f'l'DEHS l 'rOi TE 'rH IOUF.
(C~LLO~hTIC-2-SEBIP
+
1
\~
~1
, j1 1
1
{\
P42
P 37
P 30
P20
l, r
i94. !
A.! ;!;f:i
i 11 1
1
P84
1
1
, 1!
L 1210
TRYP. SENSIBUE
(ACRY) B. C.
67.
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P 68
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111
11
1i1
__- -----J
N° M• M. AP- N° 1'1. M• AP-
BANDES PARENTES B C BA 1\10 ES PAREI\JTES B C
( x 10- 3 J ( x 10- 3 )
1 21 0 + 32 61 +-2 180 + 33 60 +-3 1 70 + 34 57 +-4 1 60 + 35 53 2 +-5 155 + 36 52 2 +-6 140 + 37 49 2 +-7 1 35 + 38 47 +-8 130 + 39 45 +-9 128 + 40 42 3- +
1 0 1 25 +41 41 +
1 1 1 23 + 42 3g +
1 2 1 20 + 43 38 +
1 3 11 7 + 44 37 3 +
1 4 11 0 + 45 36 +
1 5 1 00 2 + 46 34 +
1 6 96 2 + 47 3;; 3 +
1 7 g4 2 + 48 31 3 +
1 8 9fJ'J +) 49 3[1 3 <-
1 9 84 3 + 50 28 +
20 81 3 + 51 27 2 +
21 80') + 52 25 +
22 78 2 + 53 24 +
23 76 + 54 23,5 +
24 75 + 55 22,5 +
25 74 + 56 21 , 5 +
26 73 + 257 20 +
27 68 3 + 258 1 9 , 5 +
28 67 2 + 59 21 9 +
28 65 + 60 1 8 +
30 64 + 61 1 5 +
31 62 + 62 1 4 +
Fig.34 - TABLEAU DES M.M. MOYENNES DES CONSTITUANTS
DU TRYPSINAT DE L121D.
INTENSITE DE COLORATION AU BLEU DE COOMASSIE
(B C).
137
138
- Le 1er groupe constitué de protéines de haute
masse moléculaire (210 000 à 128 000 daltons)
est plus ou moins + -(-) colore par le BC et
parfois non détectable.
- Le 2ème groupe constitué des ~.M. de 125 000
à 110 000 daltons est faiblement coloré par+
le f=\C (-).
- Le 3ème groupe de polypeptides dont les M.M.
varient de 100 000 À 14 000 daltons est tou
jours détectable par le RC, et oeut-être sub
divisé en sous-~roupes d'intensité de colora
tion variable (3+, 2+ ou +).
De ces groupes de protéines, il ressort inva
riablement quel que soit le type de ~radient
utilisé, q protéines majeures (3+) dont les M.M.
sont de 90 000,84 000,R1 000, 6R 000, 42 000,
37 000, 32 000, 31 000, et 30 000 daltons.
Ce pro~il au BC ne reorésente qu'un asoect ~ua
litatif de la répartition des chaines polvoep
tidi1ues extraites de la membrane par la trypsine.
Nous avons essayé de quantifier ces bandes oar
lecture sur un densitomètre (Fi~. 33 ) classique
(CELLm"ATIC- SEBIA).
Nous nous sommes heurtés 3 des problèmes dus au
pouvoir de résolution trop moyen du densito~ètre.
En effet, la multiplicité des bandes obtenues
par ACRY/SDS nécessite pour leur intégration
quantitative des lecteurs de ~el olus oerformants.
1 3 9
2.2.2.2. - PROFIL OU TRYPSINAT APRES MARQUAGE
METABOLIQUE.
Les résultats peu encourageants de détermination
des glycoprotéines Dar la méthode de coloration
au P.A.S. et au S.A. nous ont conduit à recher
cher des techniques basées sur l'utilisation de
radioéléments.
La première approche de caractérisation des
glycoprotéines, s'est donc effectuée par marquage1 4 1 4
métabolique au C - GlcNH 2 ou au C-fucose,
suivi d'une trypsination douce. (~atériels Tech-
ninU8S et M~thorlnlo~ies).
Après révélation par autoradiographie, le profil
électrophorétique laisse apparaître un nombre de
bandes et un marqua~e plus intense avec la GlcNH 2qu'avec le Fucose. (Fig. 35).
Nous avons mis en évidence 12 fractions ~lyco
protéiniques dont les M.M. vont de 140 000 à
28 000 daltons. Ces 12 fractions incorporent1 4
toutes de la C - G1 cNH2
avec des intensités de
marquage différentes [Fig. 36).
De ces ~lycoprotéines extraites par la trypsine,
6 fr~ctions ressortent nettement sur l'autoradio-
gramme par leur richesse en GlcNH2
(3+).
Ces ~lycoprotéines ont une M.M. de 120 000, 60 000,
56 OOQ, 47 000, 32 000 et 28 000 daltons.
Les fractions 135 000, 120 000, 60 000, 56 000,
47 800, 32 000 et 28 000 présentent à la ~ois
dans leur structure, de la glucosamine et du
Fucose (cf. Fig. 36)
Il est à noter que les glycoprotéines 60 000,
56 000 et surtout 47 000 révèlent une intensité
de ~arquage équivalente en glucosamine et en
Fucose (2+ ou 3+).
1 L1(' '" l . r~._I•. , n; 12
14 -C-:fucose
14C ~l l'-1.T n12
(C)O x ::'
(C) 0 x 2
140
Tr:rDsinat de LJ)IOft ' ,.pres ~araun-c netRholique
A Lysat cellulairen Trypsinat
C Il
D Idem B
E Idenî C
Ec 0A B
94
220
60433020
A B
ACRY == 5-20%
A ::::
B =
14Trypsinat:::: C-fuc.
Il :::: 14C GlnH2 94
67
. 43
..1
3020
141
----
N° MASSf fV] [j LEe ULP, IRE1
14C-GlcNH 14 JC-fucoseAPPARENTE 2
1 GP 14[I.OOD + +
2 GP 135.000 + + +
3 GP 120.000 + + + +
4 GP 90.000 +
5 GP 77.000 +
6 GP 68.00C', +
7 GP 60.['00 + + + + +
B GP 56. rlOCi + + + + +
9 GP 52. DOC! + +
1 0 GP 47.000 + + + + + +
1 1 GP 32.00n + + + +
~_2__LGp 29.00[J + + + +
Fig. 36 - Tableau des M.M. Moyennes des constituar,tE
du Tryosjnat de L1210 après "1arouage Métabolique.
GP = Glycoprotéines.
142
On remarquera aussi par comparaison avec le
profil Bleu de Coomassie, que plus la oartie
glycamique est importante (G l cNH2
+ ou Fuc +)
et moins les fractions sont détectables par+
le BC (- ou +) de façon générale.
Il existe cependant des exceptions comme par
exemple la fraction 32 nno qui est fortement
marquée ~ la G1 cNH2
(3 +), faiblement au Fucose
+ et fortement colorée au BC (3 +).
2.2.2.3. - MARQUAGE EXTERNE OES GLYCOPROTEINES.
Les tehniques fines de GAHMBE~G et HAKOMORI
[53.57) nous ont permis d'aborder, l'identifica
tion des glycoprotéines membranaires sous un
autre aspect.
le lysat cellulaire
Techniques 8t Mét~odclog15s) les3
in situ (N+G+ H.glvcoprotéines sont mar~uées
G + 3H ou P + 3H) t 'te enSUl e
En effet, comme nous l'avons décrit plus ~aut
(cf. Matériels.
est soumis ~ l'lélectrophor~se. et révélé par
fluoro~raphie.
Donc, dans l'exposé ~ui va suivre, il aooaraitra
r~rement des profils Bleu de Coomassie, car nous
opérons sur des lysats cellulaires où toutes
les nrotéines cellulaires sont présentes.
1 - I~CORPORATION DE RADIOACTIVITE.
L'incorporation de la radioactivité dépend du
traitement par la galactose oxydase. Le trai
tement préalable des cellules par la neuramini
dase, multiplie cette incorporation par un fac-
teur de 2 .~ 3 (Fig. 37) c..a r 0 n lib pre
de nOuveaux résidus r-~lactosyls accessibles ~
la galactose oxydase.
TYPE CELLULAIRE ET corn/ ~P.; PROTEINE JTRAITEMENTEXP. 1 EXP. 2 EXP.3 EXP. 4 EXP. 5
L1 21 0 + N + G + 3 H 800 1362,3 1347,75 1314,21 1056,89
L1 21 0 + G + 3 H 250 640,28 657,30 796,51 662,33.
L1210 + P + 3H 1453,88 1556,21 1661,71 - -
L1 71 0 + 3 H 289,70 438,71 280,30 302,20 440,13
Fig.37 - TABLEAU OU MARQUAGE EXTERNE DES CELLULES L121o.
N + G + 3H
1G + H
P + 3H
3H
NEURAMINIDASE + GALACTOSE OXYDASE +BOROHYDRURE TRITIE.
GALACTOSE OXYDASE + BOROHYDRURE TRITIE.
PERIODATE + BOROHYDRURE TRITIE.
CELLULES TEMOIN TRAITEES UNIOUEMENT PAR LE BOROHYDRURE TRITIE.
~
CA)
144
Aprés l'action du periodate, la radioactivité
incorporée, est supérieure à celle obtenue
après action de la neuraminidase plus la galac-
tose oxydase (Fig. 31 J. Et sans traitement
enzy~atique, on observe oue les cellules incor
porent une certaine ouantité de radioactivité
en présence de borohydrure tritié seul.
2 - FLUOROGRAMME DES GLYCOPRnTEINES APRES
'3 G 3N+G+ H et + H.
Sur la me~brane de la cellule L1210, nous avons
mis en évidence 22 glycoprotéines nettement
marquées après traitement N+G+3
H (Fig. 3839 J.,Les ~lycoprotéines majeures (]+J ont une masse
moléculaire de 86000, 80000, 760nO, 7nOOO, 54000,
50000 et 23000 daltons.
Ces glycoprotéines sont faiblement ou presque
pas marquées après traitement G+ 3 H.
3 - FLU~ROGRAMME APRES P+ 3 H.
L'action du periodate révèle 20 ~lycoprotéines
1
[ Fig;. 40! 40 parmi lesquelles 5 sont majeures,
ce s~nt les ~lycoprotéines
4600'] et 31["lOO.
86000, 68000, 54000,
On observe aussi que les ~lycoprot§ines ont des
M.M. infprieures à celles des glycoDrotéines
révélées aprps traitement N+G+3
H. Ce ~arouage
Dar le periodate révèle une richesse des glyco
protéines en radicaux sialyls.
Dans toutes les expériences effectupes, on ob
serve une incorporation de radioactivité dans
les cellules traitées uniquement par Na/K8 3 H4.
14 5
A 8 C 0
3 30
~, -,
... 20..
6744
60 4
4
*' 4 4
4 4
36
4
18 'j
v v X1 -3
T'arquag;e ex terne des .--;. p.de 1210
ft. n + '" + H= \:-
'1 = '::'e3
H~
C = G + \-iF-I
ACHY = 7t5-15~;
EoB_1l'lIIIIl-1VPJ~···....~•• ".,- ~" •. ,.'
A
ACRY = 5-15%
" 6Î
A = rJ + G + ')H
-:J.
C = r; + '-'rI 60
D = G + 3Lj
E Te 3'1= r
36
18.:5
V~. 1
lU - J -- ' ..
MASSES MOLECULAIRES
APPARENTES N + G +3 H G +
3 H Te 3 H
( x 1 0 '-3)
GP 1 35 2 + -
GP 1 25 2 + -
GP 120 2 + +
GP 105 2 + +
GP 96 2 + -
GP 90 2 + +
GP 86 3 + +
GP 80 3 + +
GP 76 3 + +
GP 70 3 + +
GP 62 + +
GP 60 + +
GP 54 3 + -
GP 50 3 + -
GP 48 3 + 3 + 3 +
GP 45 3 + 3 + 3 +
GP 36 2 + +
GP 3Cl + +
GP 26 + +
GP 23 3 + -
GP 20 2 + -
Fig.39 - TABLEAU DES M.M. MOYENNES DES GLYCOPROTEINES
MEMBRANAIRES DE L1210 APRES MARQUAGE EXTERNE
Te 3H : TEMOIN BOROHyoRURE SEUL.
1 4 6
147
20
:::0
4]
')4
67
1" - 3
-1.•~ 1
_1
~""I"-
""1;0. ·0
.<1
•, .. '.' 'x~ ::
:,..,.'..'.
-43
67
31 -2. .0li;l&
14 .......1.
94
Fi,:> • 40 L 1210 = P + 3"II
((auche = f3.C.
droi te = fluororrarr.me
ACRY = 7,5-157:;
'~arouaR;e a;pécifioue
A = p2 + 3)-J
F' i r~. 41 : L 1210
A c-~
DMMX
1() - 3
B "1 + r; + 31-J, ,J
C (' 3° 1= .:1 + l'
D = Te 3H
ACHY = 7,5-15 (!f,
7 Jours a - ~oor.
94
68
30
2014
148
MASS ES MOLECULAIRES
APPARENTES P +3
H BC
( x 1 0 - .j )
GP 97 + +
GP 96 + +
GP 90 + +
GP eE 2 + 2 +
GP 68 3 + 2 +
GP fJ3 + +
GP 60 + +
GP :: 4 l + 2 +
GP 50 + +
GP 49 + +
GP 46 2 + 2 +
+GP 4 ~l +
+GP 40 +
GP 31 2 + +
GP 28 + 2 +
GP 26
GP 2:1 +
+
1
GP 23 +
+
1GP 21 7 +
L:-~~+
2 +
----
Fig.40: TAfO'Ll,AU DE'3 l''.M. J\PF'M'UJTES DES GLYCOPROTEINES
MEMBRANAIPES DE L121D APRES ~AROUAGE EXTERNE
AU PERIOOATE (F' + ~'H).
BC : INTENSITE DE CCLDRATIDN AU BLEU DE COOMASSIE.
149
Ce marquage asoécifique porte sur des fractions
de 48000 et 45000 daltons (Fig. 39 et sur
des fractions probablement lipidioues qui se
confondent avec le front de miqration.- .,
On retrouve toujours les fractions 48000 et
45000 qui sont fortement marquées aorÀs traite
ment N+G+3
H. G+ 3 H ou 3 H. Ce marquage aspécifique
est ~oins intense après trAitement p+3 H• en
effet. la fraction 45000 n'existe plus et la
fraction 48000 est faiblement perceptible.
(Fig. 41).
2.2.2.4. - ~AROUAGE EXTERNF DU TRYPSINAT.
Fort de la technique du marquage externe. nous
avons dans une série d'expériences. soumis les
cellules L1210 à une tryosination douce (cf.
Ch. Tryosination). suivie du marqua~e externe3
du trypsinat obtenu pôr la ~6thode N+G+ H et
G+ 3 H.
Le profil radioactif du tryosinat sché~atisé
dans la Fig. 421
43 ~ontre une incorpo-
ration de radioactivité très forte quand le
trypsinat est traité par la neuraminidase plus
galactose oxvdase.
Ce qui laisse supposer que les fractions déta
chées de la ~embrane sont tràs riches en acide
sialique. ~ais néanmoins. le nombre de fractions
glycoorotéiniques extraites Dar la tryosine est
inférieur ô celui obtenu lorsqu'on ~arque direc
tement les cellules in situ.
En effet. sur le fluorogramme du trypsinat. nous
avons mis en évidence 8 glyconrotfines dont les
'0 • '"1 son t de 1 '35 00 O. 1;/ fl [lO n. 9 [1000; 6 8000. 6 [l" n n •
30n O'], 20fll""l et 19rJrin.
94
67
43
30
20
·A
/Il."'1,... " 1
f;'i~. 42
B
Marqua~e Externe
du Try~sinat de L 1210
3A = N + r; + H
3R = G + Il
1 5 0
dpm)(
10.394.v
67.v
43.v
3),.. 20. 14.
v , -3.. MM x 10
1 5 1
3.
2.
1. v v
l~ P 20
13119751
'------1- -4----- --+---+--+---+---+---.---I-------1I--~f_____t-__+-_+I-~
sect ionscm
0--0 ,Co:', '( ~ : Ï\~ A T L Î / Î l' f, + G + H
- C<e-----e T ;) 'i le cc l "~iI
r 1 .!- 1 ' , H" L, ,
152
Il est intéressant de noter que ces mêmes gly-3
coprotéines marquÉes par la N+G+ H, sont aussi
mises en évidence après marquage métabolique
suivi d'une trypsiration douce (cf. Fig. 44 ).
Les glycoprotéines 135000,120000, 60000 et
30000 qui sont des fractions majeures après mar
cuage ~étabGliqu8. sont aussi des fractions pré
dominantes lorsoue le trypsinat de me~brane est
marqué par la méthode N+G+3
H. Cette observation
laisse donc supposer. que les glycoprotéines ont
des structures ~lyc6nniques ramifiées et finies
car elles contiennent de la glucosamine (~-acétyl
glucosamine) du fucose. Gu galactose (N-acétyl
galactos3~ine) 8t des 9cides sialiques.
La glycoprotéine 60000. comporte dans sa struc
ture, une partie peptidioue importante (BC 3+),
de la glucosamine [1+), du fucose (2+) et des
restes galactosyls liés ~ des restes sialyls
[ 3 + ) •
Le fucose et l'acide sialique qui sont des sucres
terminaux, se trouvent simultanément, en intensi_
té importante dans la glyccorotéine 60000.
On p8ut conc penser que cette glyco~rot8ine
60nG~, possède une structure complexe et très
ramifiée.
Les glycoprotéines mises en évidence dans le
trypsinat sc nt très peu marqu~es par le m~thode
3G+ H, à l'exception des glycoprotéines 68000,
30ncr, 20000 et 19000, qui ~rés8ntent tans leur
structure ces restes galactosyls libres, et des
restes galactosyls liés à des restes sialyls.
M. M. x10- 3 BC 14C-GLcNH 1 4 32 C-LFucose N+ G+ G
G+ 3 H
+GP 135 - 2+ + + -
GP 120 + 3+ + + -GP 90 + + - 2+ -
GP 68 3+ + - 3+ 2+
GP 60 3+ 3+ 2+ 3+ -
GP 30 3+ 3+ + 2+ +
GP 20 3+ - - 2+ +
GP 19 3+ - - 2+ +
Fig.44 - TABLEAU CUMULATIF DES GP D~ L1210 EXTRAITES
PAR LA TRYPSINE APRES DIFFERENTS MARQUAGES.
1 5 3
154
2.2.3. - SEPARATION BIDIMENSICNNELLE.
Pour accroître notre capital d'informetion sur
la structure des (glycoJprotéines de membrane,
nouS avons sssôyé de correler les cHi et les M.M.
par électroohorèse bidimensionnelle.
Après des dépôts de 100 à 300 ~g de protéines
dans la 1ère dimension (cf. I.E.F. en tutsJ, les
protéines sent soumises è une 2à,me séparation en
ACRY/SDS (cf. ~atériels Techniques et MéthoGologiesJ.
2.2.3.1. - CARTE BIDIMENSIONNELLE DU TRYPSINAT
APRES COLORATION AU BC.
La s§paration du trypsinat membranaire de cel
lules L121Q, après coloration par le 9C nous
~et en pr~sence de très nombreuses fractions
peptidinues, dont la description et la classi
fication deviennent très difficiles. (Fig. 4 5).
L'établissement d'une grille de lecture nOGS
permet 08 constater qUE la majorité des prct~ines
se rpparti[sent dans des zones de pHi de 4,7 à
7,0f], et de l'l.M. de 94000 à 14000 (Fig. 45 J.
L'étude comparative de olusieurs gels nous a
per~is de mettre en évidence plus de 200 taches
détectables par le BC.
De cette multitude de taches, il ressort inva
riablement quel que soit la quantité de protéines
déposées dans la 1ère dimension, les protéines
majeures suivantes
- I1
pHi 6, 7 - 6, B, ~ . M. 68000
K1
pHi 5 , 6 - 6 , 1 , M. M. 90000
- R1 pHi 4, 7 5 , 6 , "1. M. 60000
155
7 • 1 7 . n 6 . fJ 6. 7 6. 1 5 . 6 4. 7
A c o • E 1 F
..
~--I~,
-,---- ..-..--, - - -
1
-....,-,-.....:~1 -__ ...J _
•,1
11
11 Z h1
Zf
- -~-1-.ZB
G - - -- '-ri- - T l -- r j -.--.:~-... -'-L ------l ' ''"'' -1 1 1 J '
1 - - ---- ......---~~~-- -1- -- ---,- -------• .. - 1-- - 1- 1.'.1'18 N-t tJ '0 --p. · [J .R'... ,.' __ • '- 'll. 1._ J..:.,~..::.'\ Jo - .... - 1 .. _ _1 -?"._ •. '. ........ - _ .......__ .l... _ ,~A.' 1. _
___ .. __ -------'lItl-. __ '. _.J I_~__
- 1 _ 1 pa -- ~ C _S - 1 1.-. -, u - .. 1 v# L~ ~_~ '" - '"_ ~_.,. .... 1 -1a..1 ~
- -, 1 r - .. ", _ 1 - ., .. J.- 1" '10 .: 1-::"-- :
• -1- __ ...: - L -- =-- -t - - - - ~I- __~ "'-4 -- ••-.a;; -
r 'L -: ~ ~ :-Zb 1~ _ 1 Zd 'l
1 1 _ ,.:- ., ~,111
- .....1.-.
. .., z!?;...______ : ~ J_I 11 1
43
14
30
68
-3"'1"1x1G
7 . 1 7 • fJ 6.8 6.71
6 .11
5 . 61
4.7
.4 5 -
1 56
M1 pHi 7 , 1 M. M. 56000
- P1 pHi 6 , 1 6, 7 , M. M. 47000
Zq = pHi 6 , 7 6 , 8 , M. M. 200001
Il est à noter que dans les cases W et X, se
répartit un ensemble de protéines acides, dont
les pHi sont compris entre 4,7 et 6,1, et les
M.M. entre 43000 et 30000 daltons.
Il est indéniable, que cette technique apporte
beau COUD plus de renseignements, que chacune
des dimensions séparées. En effet, si on consi
d ère les pro t é i n e s Wl' W2' W3' \>J 4' e Ile s s e
focalisent (1ère 0) au même pHi, alors qu'elles
ont des M.M. différentes (20). De même les pro
téines N1
, N2
, N3
qui ont la même rv'J.M., ont des
pHi différents.
La richesse de la double dimension, en fait
paradoxalement toute sa difficulté d'interpré
tation.
2.2.3.2. - PROFIL BIDIMENSIONNEL OU TRYPSINAT
APRES MARQUAGE METABOLIQUE.
1 4Apr~s ~arquage métabolique au C - GLcNH
2,
1 4 C-L-+uc0se, le fluorogramme révèle un profil
pauvre en glycoprotéines. Nous avons mis en évi
dence 7 à B glycoprotéines dont la majorité se
situe dans des zones de pHi de 4,7 à 5,6 (Fi~.46/47)
GP F ;JHi 5 , 6 - 6 , 1 , M. M. 135000-1GP F pHi 4, 7 - 5 , 6 , M. r'1. 120000
1GP L1
pHi 4 , 7 5 , 6 , M. r'1. goooo- GP R
1pHi - 4, 7 - 5 , 6 , M • M. 60000
- GP X1oHi 4, 7 - 5 , 6 , M. r'1. 47000
1 5 7
7 • 1 7 .0 6.8 6 . 7 6. 1 5 . 6 4 • 7pH
A 9 i.1
1 FQi :.. ',
_ _ .t_
I\j
11
---.- ----,------K ~ ~ ca. l '1.
11
__ .1 __ -
- - ... 1 __
;.::
-1.
11
- - _.... -HG
-------------1
6'3
94
43 _ .. _---_.- - - - - -T
11 J 'i "1 xII;S
30 - - - - -1- - - - - ~ -i\-1
Y 1 l 7 Zb le,_ é3 , .'1.1
1
20 . 1~- - - - ,- - -1
lB lf Z~ 1 7h 7' 7'1 _ l~.l
1 1 1
1 4 -- - - -1- - - -I- I- - -1-
-3 ï 1 1
"1"1x10,. •
7 • 1 7 .0 6. B 6. 7 6. 1 5 .6 4. 7
Ge '
~.t; .'
,1
158
7 • 1 7 . n f3 • P- 6. 7 6 . 1 5 . S 4 -;1
pH
19 C 1 'J E B F
-, 11
1 1 11 1 11 1......
1 1 ,1q4 - _l_ ' .2- ___ J __ - J _ - - '- - .,_ ..-
1 1 1r :i l 1 r<- ILJ 1 1 -
1 1 1 L.... '.
68 ------ -- - - - - ,- - - "j1'1 !~
11:.) F 1
CJ R1 1
J~1 11 1
"1 , - ,43 ,- - - - - - - 1- - -1 1
~-.:: 1 ,-,1 1
1 1 1 11
130 - - - . _L - - - - - - ., - - 1 - - - - - -
1 1
Y Z 1 Za Zb Ze Zd
1
1 1, 1 ,2LJ - - - - - - -,- -I- ,- - - - - .-
1
Ze Z.,:- 1Z~ 1 Zh li 7 .
1... J
1
1 4 1 1- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -1 , 11
1
-3,
!"IMx10 ,
17 . 1 7 . 0 6 . '1 6 . 7 6 . 1 5 . 6 4 . 7
1
-' .47
1 5 9
Les ~lvconrot6ines A1
(oHt 7.nn.~.M. 14nnnn,
et Zd 1 (oHi. 4,7 - 5.6. M.~. 28000) ne sont
mises en évidence qu'après marquage métabolique1 4
au C - GlcNH2
.
Cette approche de révélation bidimensionnelle
des glycoprotéines est ardue et nécessite une
lon~ue incubation (environ 2 à 3 mois de contact
à 80°) pour avoir des taches. pas toujours inter
prétables (cf. Ch. Discussion).
2.2.3.3. - PROFIL BIDI~ENSIDNNEL APRES MARQUAGEl 3
EXTERI\IE. (N+G+ H - G+ H).
Apr~s un marquage externe par les méthodes déjà
décrites (~atériels Techniques et Méthodologies)
le lysat cellulaire après centrifugation est sou
mis à une électrophor~se bidimensionnelle avec
des dépôts dans la 1ère 0 (I.E.F. tubes) de l'or
dre de 100 à 300 ~g de protéines/10~000 à
200000 cpm.
Le p!'ofil ~31eu de Coomassie (Fig.48 ) qui révèle
toutes les protéines nous sert de témoin de bonne
répartition.
Après 2 mois d'exposition à-70° C. le fluoro
gra~me (Fig.49 ) ne révèle que très peu de taches
dont la majorité se situe dans les zones de pH
4.7 à 6,B et de M.M. 94000 à 43000 daltons.
D'apros la nomenclature que nous avons adootée.
les taches majeures sont les suivantes
160
7 • 1 7.0 6.FJ 6. 7 6 • 1 5 . 6•
4. 7oH
, 9 fJ-
r F
-copo
•
o
-1-,.. -1 ~
- -1--L~
11
1
....
- '-1o.,
1o
7b
1
11
~ 14bJo~ '" -=:::::. 1-;. ClIlIIJoo"'" - - - - -, -o. c;J 1 ~ C7
<,.:' 1 014
c::::> "'1'"1
1
f IJ
1
1
1
- /-01·
~
-1--1
•
l
'01
1"
7
1
(---- - - - ~
s
30
43
94
68
20
1 4
"1l'1x1G
Ze1
1__ L
1
7 F
11 ~a-
-' -1 Zn1
1 2',J
11
-, ,1 • 1 7 • 5.8 6. 7
,6 • 1
i
S .6•
4 • 7
. 48 -
161
7 . 1 7 • n 6 • B 6.7 6. 1 5.6 4. 7ph
9 l: 1)
6
Z i
x
Zd
1
1 -
1
4d R1
1
- - - -, Z i1
1 7 c1
1
1- - -
1- - =...1.- -4 .c:::r k',
.t C=t-'1- - - -
Zl,Za,
- -,Za Zb
11 1_ ...J _ -
y 1 Z 1
1
- 1- -Ze Zf
,
'~1 L:-1- -- -,- -
',J n 1 l1 1- 11 ----.,
c;; - ,- - - - - - -:=-=---=-_1 _ -1
--=:~'1 1 ~J 1r-J
~~ 1
RF" 1~ -:, 1 ,
1 1~-4 -cCIf1 -~ "1 T 1 Il \1
-11
_ _ 1 __
7 • Î 7 . 0 il . B D.7 5 . 6 4. 7
.. 49 -
1 6 2
GP M pHi ~ , F\ - 7 , n "'l. M • f=;rnnr1
,
r,p 1"12
pHi 7 , 0 , fvl.M. 54000
GP 01
pHi 6, 7 - 6, B , M. f'Il. 48000
GP S 1 pHi 7 , 0 - 7 , 1 , fvl. M. 45000
La ~lycoDrotéine f'Il1
(ou N1
) se sépare en une
tache allon~ée qui recouvre plusieurs zones de
pHi.
Après action de la neuraminidase, et 1 mois
d'exposition à -70 0 C, le fluorogramme est plus
riche en taches. Elles se répartissent pour un
premier ~roupe dans les zones pHi 5,6 - 6,8,
M.M. 94000, 30000, et pour un deuxième groupe
dans les zones pHi 7 - 7,1, M.M. 6BOOO, 41000.
On assiste aussi à une altération dans les pHi
des slycoorotéines. En effet, les glycoprotéines
qui apparaissent sous forme allongée aorès
G + lH, se retrouvent sous forme circulaire dans
la plupart des cas.
La glycoprotéine la plus représentative de ce
phénomène, est la GP f'Il1
, qui après marquage
G + 3 H se situe dans les zones pHi 6,8 - 7,1,
alors qu'après N + G + 3 H, elle se situe à pHià
7 , 1 •
f'Ilalgré ces aléas inéran~s à la tecQnique même
de marqua8e (N + G + 3 H) nous avons réussi, par
comoaraison avec des profils monodimensionnels
(ACRY/SDS) à attribuer des M.M. et pHi aoparents
aux glycoprotéines ainsi révélées.
Les glycoorotéines Majeures que l'on retrouve
fré~uemment avec des positions constantes sont
les suivantes
163
ï . 1 6 . P, 6, 7 6 • 1 5 , fi 4, 7
A 9 L o E F
1
1 ~~t. 1-GE:> , ~
.. 5,~ ...
1
l_
x
Zd
1
~
'j
Ze- - -
1lb
-'-
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l"'"t1
:;r.,. 1, --:;a;::::::'î- - -Id 'i~~F&... ~4.
ft \1lI> ..11
1
1 ~6> 1
1-,-_2.-
l
:J
cs:::- -.- -
1 !:l1
1-_l-
I
z
H
~ 1 -;-
- -,--
-'- 1-l '-
. le 1
..... Ilb'i,
20
43
68
30
94
- ,:1l'1x1 Il
7 • 1 7 .' [1 6 " P, 5'.6 4 ,"7
. 50 -
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
- GP
pHi
pHi
pHi
pHi
pHi
pHi
pHi
pHi
oHi
pHi
fJHi
pHi
pHi
6 , 1
6, 1
6, 1 ,
6, 7
5 , 6
7 , 0
7,0,
7 , 0
6 , 7
7 , 0
5 , 6
6 , 7
6, 7
6,7, M. M.
fVI. M.
R , 13, M. M •
6,1, M.i'J.
7 , 1, M. M .
fVI. M•
7 , 1, M. M •
6,13, M. M.
7,1, l''LM.
6,1, M. i'1 .
6,8, fV1.M.
6,13, M.fVI.
86000
80000
76non
63000
60000
54000
50000
4BOOO
45000
41000
36000
31000
164
Cefluorogramme bidimensionnel ( Fig.5 0 ) nous
permet de mettre en évidence une hétérogénéité
dans les glycoprotéines majeures. En effet, la
glycoprotéine 68000 qui apparaissait en une
forte bande homogène, après séparation monodi
mensinnnelle (ACRY/SOS) se répartit, en 2 taches
bien distinctes sur le fluoro~ramme bidimension-
nel, avec la même fV1.fV1. et des pHi différents
GP 02 = pHi = 6,7 - 6,8, M.M. 68000, GP P1
=
pHi = 7,0, M.M. 68000).
Il en est de même pour les GP 02 (pHI = 5,6 - 6,1,
fV1.M. 63000 et GP 04 = pHi = 5,6, i'1.M. 63000).
On note aussi que le marquage aspécifique déjè
rencontré (fluorogramme monodimensionnel) porte
sur des composés à pHi bien distincts :
GP M4
(pHi 7,0 - 7,1, M.M. 450(0) et GP 01
(pHi = 6,7 - 6,8, M.f'1. 48000).
165
2.3. - K562.
2.3.1. - MAROUAGE EXTERNE DES GLYCOPROTEINES
i'1EM8RANAI~ES .
Sur la cellule K562 d'origine humaine, nous avons
basé essentiellement. notre étude sur des sépara
tions en ACRY/SoS. Les cellules sont au préalable
marquées in situ par la méthode N + G + 3 H 1
G + 3 H. et les glycoprotéines sont révélées par
fluorograohie [cf. Méthodes Révélation).
2.3.1.1. - INCORPORATION DE RADIOACTIVITE.
Après comptage de parties aliquotes, les résultats
montrent que l'incorporation de radioactivité dé
pend du traitement par la galactose oxydase. Le
prétraitement des cellules par la neuraminidase
[N + G + 3 H) augmente cette incorporation de radio
activité totale dans des oroportions lé~prement
supérieures au traitement G + 3 H (Fig.51).
Cette différence se confirme lorsqu'on ptablit le
profil radioactif après section du gel d'acryla
mide (Fig.52).
2.3.1.2. - PROFIL ELECTRoPHoRETIOUE APRES3 3
MARQUAGE N + G + H / G + H.
Le fluorogramme (N + G + ~H) après électroohorèse
sur ~el constant à 10 ~. montre une simulitude
frapoante entre le profil des K562. et des Ery-
throcytes normaux (Fig 53). En effet. on
retrouve dans les 2 profils,3 bandes fortement
marquées qui ont des M.M. approximatives de 85000,
54000 et 40000 daltons.
TYP E CELLULAIRE ET cnm / ~g PROTEINE
TRAITEMENTEXP. 1 EXP. 2 EXP. 3 EXP. 4 EXP. 5 EXP. 6
K562 + N + . G +3 H 9112 gn1,46 902,99 940,21 846,83 859,48
K562 + G +3
H 741. f1:'i 736,75 72Cl,84 687,41 6Q7,19 635,33
-+-
Fig. 51 - TABLEAU OU MARQUAGE EXTE~NE DES CELLULES K562.
3N + G + H
lG + H
NEURAMINIDASE + GALACTOSE OXYDASE + BOROHYDRURE TRITIE.
GALACTOSE OXYDASE + BOROHYDRURE TRITIE.
(J')
(J')
2CP" 1< 10 -
16 7
220 '4 51 43 30 20 14
I----J--__'- - _,__ - j - _ J_ - _ J - Y- ----~I'll'l )( 10- 35
4
3
2
1
o 2 4 6 8 10 12 14 S,ct ion. du
C,l en c",
Fig. 52 - PRr]F'IL RAOHJACTIF DES GLYCOPRfJj-EI~~ES DE f~,S62
APRES MAR~UAGE EXTERNE.
*-* <5'32 + N + G +3
H.
3G + H.
~'. .JI!'.
,"
f. é'""fi
,j; i7 ",;-
168
Fig. 53 MarquageExterne des G.P. de K 562
et des Erythrocytes (GR)
ABC--Cll'bilD!5JD
o
ACRY/SOS = 10 %
PAS A, C GR 31 = = N+G+ H
3B, D = K 562 = N+G+ H
';, ,]
PAS2
abc dr
ACRY-SDS = 5-15 %
A,C = K 562 = rI + G + 3i-{
B,D = K 562 = G +3
H-94
- 68
o
.' 30
~.20
.. ,14
U'j......0tx:lCl)
ASP44 ASP53
GP 85
K 562
MARQUAGE EXTERNE DES GP
3 G~9ro u g e = N + G + H3bleu = G + H
GP ~37.39
GP66.62
U'j.-.0
MIf)
GP 291
., 1
GP 115
Â.220
Â9460 67
AA
i
\ r_F
, ~j\\ . \ Î \-'.J - \ r- ;
\,,/\ r F \'\ /'\. .~. ,"-.,..r~-.--._\ "
\
LÂ Â.36 43
.GP34 1. 1
1
1 .)
, VI 1
A' . 1 \1!1 1 1 1
lJ\jJ V
A30
~
Front,
~
•
/;)J)
CoL.,
._ '0*.-
\.. '~/' '~" ' r ~_~-.~J-~-_../
M Mi X 10-3
..•
169
Dans le cas des Erythrocytes. par comparaison
avec les travaux de la littérature (44,126)
la bande 85000 correspond à la bande PAS1
(44
ou glycophorine A. (dimère) qui est la glycopro
téine majeure de l'érythrocyte. La bande 40000
correspond à la bande PAS2
( 44 ) qui est vrai
semblablement le monomère de glycophorine A.
Ces simulitudes observées. nous avons essayé
d'a+finer le profil des glycoprotéines de K562
en les séparant dans un gradient d'acrylamide
de 5 à 15 ;.
Après marquage N + G + 3 H . la K562 révèle ô
sa surface 21 bandes radiomarquées dont les
M.M. calculées. vont de 260 à 16.000.
Parmi ces bandes on compte 8 bandes d'intensité
majeure (3+ ou 2+. Fig. 54). Ce sont les
bandes 115000 (2+), 85000 (3+),53000 (3+),
49000 (2+). 44000 (3+). 39000 (2+). 37000 (2+)
et 29000 (2+).
Apr~s marquage à la G + 3 H seules apparaissent
de f3çon nette (3+ ou 2+) les bandes 53000 (3+).
49000 (2+); 44000 (3+). 39000 (2+), 37000 (2+)
et 29000 (2+). (Fig. 53).
Les bandes 53000 et 44000 sont considérées co~me
des marquages aspécifiques. puisqu'on les retrou
ve toujours en l'absence de tout traite~ent en
zymatique. c'est-à-dire en présence de borohy
drure tritié seul.
Contrairement au profil dans un gel à 10 ~o • la
bande 40000 (PAS2
) n'existe plus dans un gradient
(5-1S ;) plus résoluti+. mais nous avons mis en
évidence 2 bandes d'intensité moyenne avec des
~.~. de 39000 et 37000.
1M. M. APPARENTES
-3 3H
3H( x 1 0 ) N + G + G +
+GP 260 - -
+GP 230 - -
+GP 21 0 - -
+GP 1 60 - -
GP 11 5 2 + -
GP 90 + -+
GP 85 '3 + -+
GP 78 + -+
GP 72 + -+
GP 66 + -+
GP 62 + -
GP 5 '3 3 + 3 +
GP 49 2 + 2 +
GP 44 3 + 3 +
GP 39 2 + 2 +
GP 37 2 + 2 +
GP 34 + +
GP 29 2 + 2 +
+ +GP 22,5 - -
+ +GP 21 - -
+ +GP 1 6 - -
Fig. 54 - TABLEAU DES M.M. MOYENNES DES GLYCOPROTEINES
DE K562 APRES MARQUAGE EXTERNE.
170
1 7 1
Par comparaison avec le profil des Erythrocytes
la hande 85000 correspond au dimère de la gly
coprotéine A, et les bandes 39000 et 37000 aux
monomères.
2.3.2. TRYPSINAT DE ME~BRANE DE K562.
2.3.2.1. - PROFIL BLEU DE COOMASSIE APRES
ACRY !SDS.
Aor8s action de la try~sine dans les conditions
déj~ décrites (cf. Ch. Tryosination) le tryo
sinat de meMbrane est soumis ~ une séparation
électrophorétique en ACRY!SDS (5-15 5).
Le profil Bleu de Coomassie qui ne révèle que
les protéines, met en évidence une soixantaine
de bandes plus ou moins colorées.
Les masses moléculaires des fragments protéiques
détachés
daltons.
oar la trypsine vont de 190 à 15000
Dans le tableau représenté dans la Fig.55,
on peut subdiviser ces bandes en 3 groupes d'in
tensité de coloration variable.
Le 1er groupe constitué de protéines de M.M.
variant de 190 8 132000 daltons est très fai-+
blement coloré par le BC (-).
Le 2éMe ~rouoe qui recouvre les protéines de
130 à 1Q8000 daltons est faiblement coloré par
le RC (+).
Le 3eme groupe qui va de 105 à 15000 daltons,
est toujours détectable par le BC, et rév81e
des bandes d'intensité majeures (3+ ou 2+).
1
--
l'J 0 M. M. N° M. M.
BA l'JO ES APPARENTES B C BA NO ES APPARENTES B C
( x 10 -3) ( x 1 0 - 3 )
1 190 31 61 ++
2 1 80+ 32 5g +-
3 170+ 33 56,5 3 +-
4 160 + 34 54 3 +-5 150
+ 35 52 +-+
6 140 + 36 50 -+
7 135 37 48 -+
8 132+ 38 47 3 +-
9 130 39 43 3 ++
1 0 128 40 40 ++
1 1 1 25 41 39 1+
+
12 11 5 + 42 37 +
1 3 11 0 + 43 36 +
1 4 1 0 P, 44 34 ++
1 5 1 05 2 + 45 32,5 3 +
1 6 1 00 2 + 46 29 3 +
1 7 96 2 47 27 , 5 3 ++
1 8 95 48 26 3 ++
1 9 94 + 49 24 2 +
20 92 2 50 23 2 ++
21 56 3 + 51 22 +
22 82 + 52 21 ,5 +
2'3 80 53 20 ++
24 77 2 + 54 19 2 +
25 76 2 55 1 8 2 ++
26 73 + 56 1 7 ,5 +
27 70 + 57 1 7 +
28 69 2 + 58 1 5 , 5 +
29 67 59 1 5 ++
30 65 +
Fig.55 - TABLEAU DES M.M. MQYENNES DES CONSTITUANTS
O~~TEICUES ~U -R~cI~AT DE K562.
INTENSITE DE COLORATION AU ALEU DE COOMASSIE
(B C).
1 7 2
A
MM X
10- 3
94
67
- .- _.
1 73
43
30 l-e1
~,-,. '''!'à'.... ,.;..wr,
20 "--
14 bD
..... ,
P.1.·
,:'-~i; ..( i-~.·~·~ ':.' << '-.~
'"; .. " : ..~.. ",......... ':
B
... \ l'.
Fip-. 56 Trypsinat de 1-<: 562 (ACRY: 5-15%)
A = Coloration au B.C.
D Enre~istrement densitom~trinue
(CELLOMATIC -SEBIA)
174
Les bandes d'intensité majeure (3+). qui ont étp.
confirmpes par un enregistrement densitométrique
(Fig. 56 ) ont des 1'1.1'1. approximatives de 86000.
56000. 54000. 47000. 43000. 32000. 29000. 28000
et 26000 daltons.
2.3.2.2.3
- FLUOROGRAMME APRES MARQUAGE N+G+ H /
G+3
H ET SEPARATION EN ACRY/SDS.
Nous avons mis en évidence les glycoprotéines
présentes dans le trypsinat. par la méthode de
trypsination douce suivie d'un marquage externe3 3
par N + G + H ou G + H (cf. Matériels. Techni-
ques et ~éthodes).
aussi
Le fluorogramme révèle
(Fig.57 ).
une trentaine de bandes:3
N + G + Hbien marquées après traitement
G + 3 H à l'exception de 3 bandes.que
Les 1'1.1'1. déterminées. montrent qu'on retrouve
des bandes intensément marquées (3+) aussi bien
dans les fragments de hautes M.M .. que dans les
fragments de basses M.M. (Fig. 58 ).
La bande 72000 (GP 72) domine le profil par son
intensité de marquage (4+) aussi bien après3 3N + G + H que G + H. On peut donc supposer que
sa structure gl~cannique contient aussi bien de
nombreux résidus ~alactosyls liés ~ des résidus
sialyls. ~ue des nombreux résidus galactosyls
libres. Cette bande semble correspondre au dimère
de la glycophorine A (PAS,). que nous avons trouvé
à 85000 daltons lorsque les cellules K562 sont
marquées directement in situ (cf. Marquage Externe).
Les bandes 6400Cl (GP 64) et 52000 (GP 52) ne sont
mises en évidence qu'uniquement après traitement
N + S + 3 H. Leur structure glycannique doit com~
porter en majorité des résidus galactosyls liés à
des restes sialyls.
175
A B c D
""'il( 94
"<!( 3 0
-<C 67
,t ~ Gp 57
.-1;.
fi'
1;..,~,'•
-,'b, ~......
Gp64 ~ ,.. '
-<lii( L~ 0
-<il!( , 4
MM X
10 - 3
Fig. 57 i\1arquac;e
A,C
B,D
Externe du Trypsinat de3= N + G + rI
3= G + H
K562
ACHY -SDS = 5-16%
Â94
i
\ r,~j\ 1\
\ 1:\\'1
\1 \ /"\.,'" \.". , 1 v \
\.. ) ''''',,'""'-'\
"'-"', /' /\ '_'- .' \,. ,.' ..f'. , .. \
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_3 \\~ M.M.xlO .
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c.Il
1
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GP64V
GP72y
A67
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G~57);." ,
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GP54,
A43
ASP ...44
A30
~IIl".lili1,lii\~ '1
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GP DE LA
SENSIBLE
Â.20
Â14
Front
l
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.....~j .i
\ 0 !' ",." \ i\ ,. \ :
\.. ....,-, --~"
K 562
. )\... /'
, ....~../
MARQ. EXT. DES
FRACTION TRYP.rouge G + 3 H
3bleu N+G + H
c.Il
.DU'lt-~
1M.M. APPARENTES
-3 N G 3H G +
3H( x 1 0 J + +
GP 125 + +
GP 120 + +
GP 11 5 2 + 2 +
GP 108 2 + 2 +
GP 100 2 + 2 +
GP 96 3 + 3 +
GP 85 ? + " +
GP 79 2 + 2 +
GP 72 4 + 4 +
GP 64 3 + -
GP 60 + +
GP 57 - 2 +
GP 54 + -+
GP 52 l + -
GP Sr) 7 + 2 +
1 GP 46 l + 3 +
1GP 41 , 5 + -
GP 41 + +
GP 40 l + 3 +
GP 33 + -
GP 35 + +
GP 34 2 + 2 +
GP 31 + +
GP 29 + +
GP 28 + +
GP 22 + +
GP 21 , 5 ;;' + 2 +
GP 20 + +
GP 1 9 , 5 + +
GP 1 8, 5 2 + 2 +
Fig. 58 - TABLEAU DES M.M. M'HENNES ["JES r::'-:'L=P~TIEINES
DU TRYPS=~JT DE K562 APRES ~ARQUAGE EXTE~NE.
17 6
La GP 57, n'apparaît qu'après traitement G + 3 H
177
et elle est totalement inexistante après
de la neuraminidase (N + G + 3 HJ , ce qui
action
suppose
une structure ou une réactivité particulière de
ce glycanne (cf. Ch. DiscussionJ.
Le marquage aspécifique porte sur une fraction
de M.M. 46000 daltons (GP 46J.
2.3.2.3. - SEPARATION 8IDIMENSIDNNELLE.
La carte (BCJ bidimensionnelle du trypsinat
révèle environ 200 taches détectables. Elles se
répartissent pour un premier ensemble, dans les
zones de pHi 4,7 À 6,8, et de M.M. Q4000 3
19000 daltons, et pour un 2ème ense~ble dans
les zones pHi 7,0 3 7,1, et de M.M. 100000 è
lOOO'] daltons.
Les taches majeures de ce profil sché~atisé
dans la fiq,.59 sont les suivantes d'après la no-
~enclature adoptée 01
(pHi = 6,7 - 6,8, M.M.
6QnooJ, P1
(oHi = 6,7, '''1.M. 670[]0], 02 (pHi =
6,7 - 6,8, M.M. 3g000J, U2
(pHi = 6,7 - 6,8,
M • r1. 3 7 0 0 [] J •
On re~arqu8 ~ussi que dans les intervalles de
pHi 6,1 à 6,8, se focalisE la majorité des
protéines avec des M.M. variant de 94000 à
20000 daltons.
•'78
7.1 7.[1 u." C. 6.~ 5.6 4.7"". L- ....... .... L· L'__....... pH
1 ._ F
ZD
f"'.-x. _1'-
1-;:..
,1
I_<:"~~~ -
1 7.1
,;• -;.,J..
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2rJ
1 4
T i~ Y '-)3 :;: f\I/', T ij c K5 6 2 - C[j :.. 'J P A. r l fj ~~ f, LJ 9 c.:.
III - APPLICATIONS PHARMACOLOGIQUES.
3.1. - INTRODUCTION.
Nous avons utilisé, les techniques électrophoréti
ques comme moyen d'étude de l'action d'effecteurs
exogènes sur les (glyco)protéines de membrane.
En effet, à la suite des travaux effectués dans le
laboratoire, sur l'action de médicaments anticancé-
reux sur le ~étabolisme énergétique de la cellule
1.:.1210, (26,188,109 ), nous avons basé essentiellement
notre étude sur cette lignée c811ulaire.
Les drogues que nous avons utilisées sont le
METHOTREXATE (MTX) et le RA 233.
3.2. - DESCPIPTIONS DES DROGUES.
3.2.1. - LE METHOTREXATE (MTX).
Le Méthotréxate est un antimitotique utilisé comme
anta~oniste de l'acide folique dans le traitement
des leucémies ly~phordes argues. Ce produit qui
présente aussi un spectre d'action plus large, ap
partient à la famille des dérivés ptérorques et
répond à la formule développée suivante
179
Acide ptéroyl-gluta~ique OH
Acide amino 4, ~éthyl 10,
Ptéroyl gluta~ique.
H Acide Folique
'1éthotréxate
180
Il agit au niveau de la dihydrofolate réductase
en inhibant celle-ci et empêchant ainsi la ré
duction du dihydrofolate en tétrahydrofolate.
La synthèse d'ADN se trouve bloquée par inhibi
tion de la biosynthèse de thymidine monophosphate
à partir de desoxy-uridine monophosphate (Fig.60).
Les effets du ~TX sont antagonisés par la thvmi-
dine exogène avec l'adénosine, l'inosine, l'hy-
poxanthine ou par l'acide folinique (183).
3.2.2. - LE RA 233. (BDEHRINGER INGELHEPlJ.
Ce produit de structure pyrimido-pyrimidique
(voisine du dipyridamole), est
prDposé comme antim~t~stati1ue. Certains de ses ~f
fets sur les cellules cancéreuses ont dé1à été
décrits 60 sans que le mode d'action précis
ait été fSlucidé.
3.3. - ACTION OU MTX SUR LES (GLYCO)PROTEINES
MEMB~ANAIRES DE L121o.
3.3.1. - CONDITIONS DE MISE EN CULTU~E.
Les cellules sont incubées
et Mpthodolor,ies) ~ raison
en prpsence de ~TX à une
(~atériels, Technioues5
de 2 x Hl cell./ml,-8
C )0 d'ertviron 1n mol/l.
Elles sont récoltées au bout de 24 heures.
Pour l'étude des ohénom~nes membranaires les doses
de MTX que nous avons utilisées sont des doses voi
sines de la 0150 (1,5 x 10- Bmol/l) mais inférieures-B
à la en 10 (1 x 10 "loI/l}, (25).
Elles se situent donc entre 10-9
et 10- 8 mol/l.
dUMP
~ TH Y iY1 lU Y L1\ l' r: Sy N·r H E TA SE
+
1 8 1
THY.eXQ.
, ,
(METHYLENE
FH4-
FH Z
AClDEFOLINIQUE
G
MTX
Fig.50 - ~ECA~ISME D'ACTIO~ ou ~TX.
FH 4 TétrahydrofolatB.
FH2
oihvdro+olate.
TH Y ex 0 = Th \1 mi d i n e ex 0 g è ne.
dUMP oésoxy uridine monophosphate.
dTMP oésoxy thymidine monophosohate.
182
3.3.2. - ACTION SUR LES PROTEINES ME~BRANAIRES.
3.3.2.1. - I.E.F. (TUBE).
Après trypsination (cf. Ch. Trypsination) des
membranes. les trypsinats témoins et traités
sont soumis à une isoélectrofocalisation.
La coloration par le BC révèle des modifications
qualitatives quant au profil des cellules témoins
et traitées.
En effet. les cellules soumises au MTX présen
tent dans leur profil. une duplication de la
bande 15 (pHi = 6.4) en faisant apparaître une
nouvelle bande 15 (pHi = 6.2). Parallèlement.
on assiste à une atténuation de la bande 16
(pHi = 5.9) (cf. Fig. 61).
3,3,2,2, - ACRY/SDS.
Après séparation du trypsinat en ACRY/SDS et
coloration par le BC. les différences entre
témoin et traité sont plus nombreuses.
Au delà des protéines de 100000 daltons de M.M.
on observe des modifications qui sont variables.
Par contre. la modification la plus nette et la
plus constante est l'intensification d'une bande
de 53000 daltons de ~.M .. Cette bande à 53000
est très +aiblement colorée ou parfois inexistan
te chez les cellules témoins. (Fig.62).
183
15
16
,__1/---------
1
--~-
----
15
15 ' 16
.. . ll(l
b . 20
5.80
5.30
4.80
pH
Témoinmembrane
~1.T.X.
Fiq;. 61 L 1210 + i.TTX
I.E.F. en tube
A 8 c D
Fig. 62MM x
10 - 3L 1210 + è1TX
ACHY-SOS - (5-15%)
2"0
43
20
14
~ 100 ..~'" 94
A,C = Te
67 B,D r-1'IX
.,53---
"
3.3.3. - ACTION SUR LES GLYCOPROTEINES.
Les études ont été effectuées en ACRYISDS après
marquage ~8tabolique ~ la 14 C GLcNH2
(donc étude
dut r :1 psi n a t) 0 u a p r 8 s ma r qua g e e x ter neau 0 e rio -33)date + KB H
4[P +H .
Le profil après marquage métabolique ne présente
aucune différence aopréciable. En effet, on ob
serve un ~arquage intense dans les témoins et les
traités, dans la zone de M.M. allant de 94000 à
184
43000. [Fig. 63 ).
, P 3Apr8s marqu~ge externe au + H, qui porte sur
les résidus sialyls terminaux, le profil des cel
lules traitées révèle par rapoort aux cellules
témoins, 3 bandes supplémentaires ayant des M.M.
de 105000, 100000 et 45000 daltons.
3.4. - ACTIDN OU RA 233 SUR LES [GLYCO)PROTEINES.
3.4.1. - "1ISE EN CULTURE.
Apr~s 24 heures de culture (2 x 105cell./ml) en
présence ou en absence de RA 233, les cellules
sont récoltées par centrifugation et ramenées ~
. 6une concentratIon de 5Qx10 cell./ml. Elles sont
ensuite soumises à une trypsination douce (cf.
Trypsination), et le trypsinat [dialysé et lyo-
phi lis f, ) est soumis fJ des séparations électronho-
réti1ues. Les-4
doses de Ri\, 233 (10 ['101/1) uti-
lisées sont voisines de la DI 50 ( '2 , 5 x 10- 4 mol/l)
mais inférieurs à la DL 1 0 [ 2 x 1 0 - 4 molill ·
14C-GlnH2
ACHY/SDS = 5-15~;
A = Te r'''Iarquagemétabolique
B = MTX à la
. "c T(. 1'"\,... llt<.l?)"'. ~.....
A B
30
20
14
Fig. 63
185
Action du MTXsur les GP.
A B c D
~araua7e Externe3au P + H
A,C = Te
B,D = ITTX
ACRy/SDS = 5-15%
MM X
'10 - 3
94
67
43
30
20 .,
186
3.4.2. - PR~TEINES LIBEREES.
Avant les sép3rations électrophorétiques. nous
évaluons toujours la quantité des protéines ex
traites par la trypsine (LOWRY).
La quantité des ~rotéines ~g) est ramenée au
nombre de cellules (en million). Dans le cas des
exoériences effectuées avec le RA 233. la quantité
de protéines extraite par la trypsine est 3 à
4 fois supp.rieure dans les trypsinats de cellules
traitées Que dans les trypsinats de cellules té
moins. Ces déterminations effectuées sur 6 exoé
riences sont rÉsumÉes dans le tableau ci-dessous
---Protéines '?n ~g/10 CELLULES
_- \' ::J 1 EXP. 2 EXP. 3 EXP. 4 EXP. 5 EXP, 6
. , ; - f e ~ , 31 2. S 6 1 .46 0,93 1 , 1 3 1 .46
:;: , (1 + '10, -, . 5 S • ~ 6 7. 42 2.88 3.28 1 .59
---
~ig.64 - fABl.EAU UE VARIATION DES PRO, TEIUES APRES
l~AITEMENT PAR LE RA ET TRYPSINATIDN.
18 7
3.4.3. - SEPARATION EN ACRY!SDS.
Après des dépôts équivalents en protéines [150 ~g)
dans les témoins et les traités, les trypsinats
sont soumis à une séparation monodimensionnelle en
ACRY!SDS.
La coloration par le BC révèle un profil bien
particulier. En effet, comparativement aux témoins,
les cellules traitées au RA 233 présentent dans
leur profil, une augmentation générale des produits
de faible ~.M. < 40000 daltons.
Parallèlement, on assiste à une variation quanti-
tative [en intensité de coloration) de certains
constituants de M.M. voisine de 70000 daltons.1
[Fig.64).
3.4.4. - SEPARATION BIDIMENSIONNELLE.
Après focalisation en tube [I.E.F.), les trypsinats
témoins et traités] sont soumis ~ une seconde sépa-
ration e~ ACRY!SDS.
La carte bidi~ensionnelle [BC] établit, accentue
et précise les différences déjô observées entre
témoins et traités. Les différences apprpciables
portent sur les pHi des 3 taches majeures Gue nous
avons Qualifiées de 11
[oHi = 6,7 - 6,8, M.M. 6ôOQO],
M1
[pHi = 7,1, M.M. 5601JO) et P1 [p~i = 6,1 - 6,7,
M.M. 47QOn] [cf. Profil Bidimensionnel du trypsinat
de L1210)
En effet, ce5 taches qui apparaissent bien nettes
dans les témoins, exhibent des taches supplémentai
res adiacentes, rie ~ême M.M. mais de pHi légère~ent
différents [Fig. 65).
a b
188
67
60
36
18
Fi<:1~. 64' L 1210 + RA
SEPARATION en ACRY/SDS
Coloration ~ar le BoC.
A = Te
B = RA
,dJJJ ,.w.r'
fi
..r' •
Il '.\ft.
~'I' •'.40 , -
188 bis
sos, IEF li!>
'-
Fip:. 65 SEPIÜtATIO~J BID IIVlENSIONNELLE
après action du RA 233
189
La superposition des profils bidimensionnels BC3 3
et N + G + H (cf. BIDl L1210 - N + G + H), ré-
vèle que les modifications observées, portent
sur des constituants majeures qui sont de nature
glycoprotéinique. En effet, la tache 11
correspond
à la GP 11
(pHi = 6,7 - 6,8, M.M. 76000), ~1 à la
GP M1
(pHi = 7 - 7,1, ~.~. 60000) et P1
à la GP
P4
(pHi = 6,1 - 6,7, "1.M. 45000).
Ce phénomène semble être général puisque de nom
breuses taches sur le profil traité sont dédoublées
mais de façon moins précise.
189
La superposition des profils oidimensionnels BC3 3
et N + G + H (cf. BIDI L1210 - N + G + H), ré-
vèle que les modifications observées, portent
sur des constituants majeures qui sont de nature
glycoprotéinique. En effet, la tache 1 1 correspond
à la GP 11
(pHi = 6,7 - 6,8, M.M. 76000), i'11
à la
GP M1
(pHi = 7 - 7,1, 1'1.i'1. 60000) et P1
à la GP
P4
(pHi = 6,1 - 6,7,1111.1'1.45000).
Ce phénomène semble être général puisque de nom
breuses taches sur le profil traité sont dédoublées
mais de façon moins précise.
190
IV - DIFFERENCIATION ET K562.
4.1. - INTRODUCTION.
Les érythroleucémies sont utilisées dans de nombreux
travaux comme moyen d'étude des mécanismes de contrô
le de la différenciation cellulaire
La lignée K562, obtenue à partir du liquide pleural
d'un patient atteint d'une leucémie myelofde chro-
nique en crise blastique ( 123) a été décrite
comme un stade précoce de différenciation de la li
gnée granuloytaire (104).
"1ais À la suite des travaux de .t\NDERSSON ( 9 ) et
RUTHERFORD ( 160 ), elle s'est révélée être une lignée
érythroleucémique. En particulier, ces cellules con
tiennent dans leur membrane de la glycophorine et
de la srectrine (95).
De plus, en présence d'agents différenciants comme
l'Hémine et le Butyrate, elles synthétisent de l'hé
moglobine de type embryonnaire et foetale (5).
Alors qu~ ce modèle de différenciation est utilisé
comme un moyen d'étude de la régularisation de la
biosynthp.se de l'hémoglobine, aucune recherche n'a
été entreprise sur l'incidence au niveau des glyco
protéines membranaires d'un tel processus de diffé
renciation.
Nous avons donc essayé dans ce travail préliminaire
de :
- déterminer les conditions ootimales d' inid'Jction
de la synthèse d'hémoglobine par l'hémine pour la
lignée K562 dont nous disposons. Nous suivons la
synthèse d'hémoglobine par spectrophotométrie qua
litative et quantitative.
1 9 1
- Suivre le profil des ~lycoprotéines de membrane au
cours de l'induction en présence de différentes
doses d'hémine. Ce profil est établi après marqua-3 3
ge externe (N+G+ H / G+ H) et séparation par élec-
trophorèse en ACRY/SDS.
4.2. - INDUCTION DE LA SYNTHESE D'HE~OGLOBINE EN
PRESENCE D'HEMINE.
4.2.1. - CULTURE CELLULAIRE.
Les cellules K562 sont ~aintenues en culture
dans le ~ilieu de EAGLE DULBECC~ comme il B été
déj~ décrit [cf. Matériels, ~éthodes, ~éthodologies).
Pour l'étude de l'induction d'hémoglobine, les
cellules sont récoltées en phase de croissance
exp 0 n e n t ie l 1 Ret a jus t é e s à une con c e n t rat ion d e
5 x 10 4 cellules/ml dans du milieu neuf additionné
de l'agent inducteur en l'occurence l 'hemine.
(Type I, BOVINE SIGI'1A).
La solution d'hémine est préparée selon la mé-
thode de RUTHERFORD 1 6 1 ) 13 mg d'hpmine
sont dissouts dans 0,2 ~l de NaOH 0,5 M et 0,5 ml
de Tris (pH 7,81 0,5 M qu'on ajuste à un volume
final de 5 ml avec de l'eau distillée.
Pour l'induction, l'hémine est utilisée à une
concentration finale de 12,5 ~~ ou 50 ~~.
4.2.2. - CONTENU EN HEMOGLOBINE.
Après la culture en présence d'hémine, les cellules
sont récoltées par centrifugation à faible vitesse,
et lavées 3 fois par du PBS (pH 7,21 froid.
192
Le culot cellulaire est remis en suspension dans
de l'eau distillée à une concentration finale de
5 'x 1 06
cel luI es lm l .
Après 15 minutes dans la glace, le lysat cellu
laire est centrifugé (5000rpm, 15 minutes) et le
surnageant est filtré (filtre millipore O,22p).
La présence d . hémoglobine dans le surnageant
est déterminée par l'établissement du spectre
d'absorption dans le visible ( 160 J.
4.2.3. - .RESULTATS.
Nous avons confirmé la présence d'hémoglobine
par l'identification d'une absorption maximum
à 415, 540, 576 nm, absorption qui varie à
417, 537 et 568 nm après traitement par l'oxy
de de carEJone. (Fig. 66).
Toujours par la même technique, et à 415 nm,
nous avons q~antifié la synthèse d'hémoglo
bine pendant 4 jours (cf. Fig. 67 A ).
Alors que les cellules traitées par l'hémine
( 1 2, 5 M) ont un taux d'hémoglobine qui varie
de 1,8 pg/cellule ('!jour de culture) à 4,5 pgl
cellule (4jours), les cellules témoins ont un
taux d'hémoglobine qui est inférieur à 1 pgl
cellule.
Ces résultats qui confirment l'induction de la
synthèse d'hémoglobine par l'hémine sont en
parfait accord avec ceux de DEAN et Coll. ( 38).
En effet, ces derniers ont montré une accumu
lation d'hémoglobine dans les K562 en présence
d'hémine 10 ~M, 20~M et 30pM (cf. Fig.67B).
193
. ~--'--"--'--Î
B lJJ
A 0, yhtmoglob1n 1
B Me1hemoQIOb,n lC Cyonmelhrmoglob,n J
iï
1~1
:': . 1:. 1: ::: :,
1111111,\\\\\\ ,
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• - t 1 .~.. ; : 1" ~.:-.; ~ -~.1; i':::: i ~ ~.~ - - .. ," -,' '" +-" ._-
: , • J
~-,- --
Fig.66 - SPECTRE D'ABSORPTION DE L'HEMOGLOBINE.
A LYSAT CELLULAIRE DE K5E2 APRES 4 JOURS
D'INDUCTION PAR L'HEMINE 12.5 ~M.
8 SPECTRE DE L'HEMOGLOBINE SELON FRIEND.( 48
oHb.
P91cell.
5
4
:3
2
A
°----0_--~oTé
, 194
Fig. 67 - Détermination quantitative
de l'hémoglobine.
3 4 Tps.( joorsJ
B Selon DEAN 8,t Coll. 38 )
~ K562 + He 30 ~ r1
~ K562 + He 20 p M
-0 K562 + He 1 0 ~ M
-0 K562 Témoins
Te K562 Têmoins
A He K552 + Hémine 12.5 p-M6
5-'"()...Cl 40---C
..030
00ECl 2:I:
1 2 3 ~
Timo ln culture (doya)
DO [en 1/1000) x 0.13 x 10 3
Hb en pg/cell.Nbre de cell. en fVlillion·s
195
4.3 - VARIATION DES GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES
AU CQURS DE L'INDUCTION PAR L'HEMINE.
4.3.1. - EFFETS PRECOCES.
Par élsctrophorèse en ACRY/SDS. et après révéla
tion fluorographique (Méthode-Révélation) nous
avons établi le profil des glycoprotéines de mem
brane aprss 1 jour d'induction en présence d'hé-
mine 50 f i'i.
Le fluorogramme (Fig. 68) après la détermi-
nation des M.M .. révèle une glycoprotéine majeure
(4+ Fig. 69) fortement marquée après traitement
N+G+ 3 H. Cette glycoprotéine de 130000 daltons de
M.M. est totalement inexistante dans les profils
témoins. Par contre les bandes 49000.39000 et
37000. faiblement marquées ou inexistantes après
1 jour d'induction, sont parfaitement mises er. pvi-
dence dans les témoins (Fig.68, 69).
Ce profil électrophorétique est confirmé lorsq'on
établit la courbe de radioactivité après découpage
de gel en section de 0.5 cm et comptage en scintil
lation liquide (Fig. 70).
4.3.2. - EFFETS TIIRDIFS.
Le profil des glycoprotéines a été réalisé après
4 jours d'induction en présence d'hémine 12.5 ~M.
Alors que la production d'hé~oglobine est maxiMale
(4.5 PIS/cell. Fio;.67A), la distribution des glyco
protéines est rigoureusement la même que dans les
témoins ( Fi9' 68)3 lN+G+ H que G+-H.
aussi bien après marquage
19 6
~ 8 C D le<>.' A 8 C 0 E .\
fi ll>'il \!. j
~
~ -&' 94--~4 .. ""1-:t_ i8 68 - .; ; ,~H
ft <fi!!!JP .." 1...& '-. a 1\>
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1Il 1Ml)t~~Gllii
~ ~1\1 10 -3 ·1
10 .... 3 S'"" ) ,';1
~'_L _____~Jj
Fip-. 68 Variation des GP de K 562 au coursde l'induction par l!hémine.
Gauche ACRY-SDS 5-15%
Droi te ACRY-SDS 8°1/0:)
A He' 24 Heures ( 5 Op j'i1) N + r, +3H
B He' 4 Jours ( 12 , 5~JY: ) : N G3~"
+ + H
C He 4 Jours (12 ,5~r-1) : G + 3I-{
D Te N + r;. +3
H,.,E Te G + °11
M. M. APPARENTES ~J + G +3
H G +3
H
( x 1 0 - 3)He 1 He4 Te4 He4 T84
+ + +GP 260 - - - - -
+ + +GP 230 - - - - -
+ + +GP 210 - - - - -
+G? 190 - - - - -
+ + +GP 160 - - - - -
GP 130 4 + - - - -GP 11 5 + 2 + 2 + - -
GP 90 + + + - -+ +
GP 85 Cl + 3 + 3 + - -'-'
+ +GP 78 + + + - -
+ +GP 72 + ... + - -
+ +GP 66 + + + - -
+ +GP 62 + + + - -GP 53 3 + 3 + 3 + 3 + 3 +
GP 49 + 2 + 2 + 2 + 2 +
GP 44 2 + 2 + 2 + 2 + 2 +
GP 39 - 2 + 2 + 2 + 2 +
GP 371
- 2 + 2 + 2 + 2 +
GP 34 ... + + + +
GP 29 2 + 2 + 2 + 2 + 2 +
+ + + + +GP 22,5 - - - - -
+ + + + +GP 21 - - - - -
+ + + + +GP 1 6 - - - - -
Fig.59 - TABLEAU DES MODIFICATIONS DES GLYCnPROTEINES
DE MEMBRANE DE LA K562 APRES TRAITEMENT
PAR L'HEMINE
He1 K562 TRAITEES PENOANT 24 H.
He4 K562 TRAITEES PENQANT 4 JOURS.
Te4 K562 TEMOINS.
1 9
198cpm
li_2
10
r67. 43. 30. 14.
__ V __ 1 ' , , -'---------~HM )(10- 3
Fig.70 - PROFIL RADIOACTIF DES GLYCOPROTEINES DE K562
APRES TRAITEMENT PAR L'HEMINE ET MARQUAGE EXTERNE.
*-* K51J2 +- HFi1PJE (1 j C' (J r)- '" ~I "'" G :3"'" H.
(4 1ours) N + G 3+- tL
@-.@ " K56? TEMOIN N +- G 3+ H.
199
4.3.3. - REMARQUES.
Il est ô noter que la glycoprotéine B5000 qui est
vraisemblablement le di~ère de la glycophorine A.
par comparaison avec les travaux de GAHMEERG st
ANoERSJN (9,95) est toujours r::;résente à la
surface quels que sOient les effets étudiés (précoces
ou tardifs).
Dans des systèmes peu résolutifs (gel à B ~o • cf.
Fig. 68) le glyco~rotéine 130000 daltons
qui apparait lors des effets précoces. pourrait
être confondue avec la GP 115000 alors qu'elles
sort nettement distinctes dans Ln gredient plus ré
solutif (5-15 ~ par exemple).
v - APPLICATIONS CLINIQUES ~ ELECTROPHORESE
BIDIMENSIONNELLE DES PROTEI~ES SERIQUES
ETUOE O'UN MYELOME A IgA.
5.1. - I~TROOUCTION.
Après ces études fondamentales. il nous a paru inté
ressant d'appliquer les performances des différents
systR~es de séparation aux protéines sériques.
Contrairement à certains ëluteurs (124/ 125 ) qui
étudient les protéines sériques en milieu non déna
turant. nous avons choisi d'opérer selon les techni-
ques d'électrophorèse déjà décrites (ACRY/SoS. bidi
mensionnelle) ; c'est-à-dire en présence d'urée 10M.
SOS 0.4 ~. et de ~ ~ercaptoéthanol 5 ~o •
Ce choix a été motivé par le fait que nous désirions
mettre en évidence simultanément les différents com-
posants [chaînes lourdes et chaînes légères) d'im
munoglobulines de ~alades atteints de myelome.
Nous rapportons ici les premiers résultats obtenus
en illustrant l'intérêt de cette technique électro
phorétique. par la présentation du cas d'un malade
atteint d'un myelome à IgA type ~ .
200
5.2. - DESCRIPTION ET PREPARATION DES ECHANTILLONS.
5.2.1. - DESC,~IPTION.
- Le tsmoin utilisé est un mélange de 20 sérums
provenant de donneurs apparemment sains et ayant
chacun un profil électroDhor~tique normal.
- Le sérum du patient étudié. présente une hypsr-
gammaglobulinsmie avec une bande monoclonale
importante è l'électrophorèse de zone sur acétate
de céllulose.
L'immunoélectrophorèse de ce sérum. révèle une
diminution des arcs IgG. IgM et des chaines K.
Les arcs des IgA et des chaînes lé~ères À sont
aug~entps et défor~és, signant une oaraorotéiné-
mie IgA de tvpe ,'.1 •
( F i fi . 7 1 A ) .
5.2.2. - PREPARATION DES ECHANTILLONS.
- A,eRY /SOS.
L_ e "p 0 0 1" s é rio u e t é moi n. e t les é r u m é t u d i é ,
sont dilués au 1/20ème dans du tampon échantil
lon [solutir'r' 5).
Les échantillons sont chauffés 2 minutes è 100 0 C
et des [Jépôts de 10 et 20 ~ sont effectués
dans les Duits.
- ELECTROPHORESE BIDIMENSIONNELLE.
Les sérums sont dilués au 1/2Dème dans le tampon
é cha n t i l Ion (s (] lut i il n K! 8 t des dép Ô t s de 30 fIsont éf~ectués dans la 1?re ~imension (I.E.F. tube)
Pour la 1ère dimension. nous avons utilisé 2 gammes
d'al";lpholir,8s
- un mélan~8 oH 3,5 - 10 + pH 5 - 10.
- une gamme olus large pH 3,5 - 10.
201
5 .3.- RESULTATS.
5 . 3 . 1. - 1; CRY /S DS (7, 5 - 1 6 S).
L'électrophorèse monodimensionnelle en gradient
d'ACRY/SOS, fait apparaitre dans l'échantillon
myelomateux deux bandes nettement accentuées après
coloration au BC (Fig. 718). Les masses molécu
laires apparentes de ces deux protéines, sont res
oectivement de 61000 et 24008. Ces bandes accentuées
correspondent donc vraisemblablement aux chaînes
lourdes (~.~. 63000) des IgA, et aux chaînes lé-
gères (~.M. 22000).
5.3.2. - BIDIMENSIONNELLE.
Après révélation (au BC), la carte électrophoré-
tique du sérum témoin (Fig;. 72 est en accord
avec celle obtenue par ANDERSON et ANDERSON 7
dans leur étude bidimensionnelle des protéines
plasmatiques.
L'analyse du sérum myelomateux, révèle dans la
zone des chaînes lourdes, une série de taches for
tement colorées, ayant la même M.M. apparente (M.M.
61000) mais des oHi variant de 5,6 i'J 6,2 (Fig. 73 ).
Les résultats indiqués dans la Fig 74 confirment
cette hétérogénéité des chaînes ~
L'utilisation d'un gradient de pH élargi (3,5 - 10)
vers les zones alcalines permet de visualiser une
tache importante au niveau des chaînes légères
(M.M. 24080) avec un pHi supérieur ou égal à 8,5.
,."
A
B
T M
--...---_.~ ..-!ef! .. ". __ ~
19G
TigA
M
19M:T
k
M~
T
94
67
43
30
20
Fig, 71 A I~1UNOELECTROPHORESE
T = Témoin sainM = Malade
B ACRY - SDS 7,5-10 0 170
T = TémoinM = I\lalade
sd s
a
203
ie[
b\
..,.~"""'d·.E
....,..~ ..~---::
serum
-="
-.-
')
94
67
43
30
20
plasma
~e IonAnde rson
_Acldk
80,000
83.000
".000.41.000
4:2.000
(7 )
23.000
17,000
..• 0~ M.I."OCIClII••'<IloI.I.
o 0 01 C>
.. 1" UCIIl'(J4ol.l1r1
8'g)~O ~~
13.000
Fiq. 72
'-------------_ .._-_ ....__ ....
Electrophorèse Bidimensionnelle..J
sds
l'
~
ief ~
4 4 '";.06" .
204
serum myelomateux
Fic. 73
1
1
1
1
clectrophorèse Bidlmensionnelle1
1ère D : N,1PHOL1NF:! : PH 3,5-10
1
205
5 • 4- REM ARQUE S •
L ' e xa men de plu sie urs f ra ct ion n e nit s é l e c t r 0 p h 0 r é
tiques a confirmé que les chaînes lourdes apparais
sent sous forme de taches multiples. démontrant
ainsi l<hétérogénéité des chaînes ~ des protéines
monoclonales. Cette hRtérogénéité ne peut pas être
révélée par les autres mAthodes électrophorétiques.
et elle ne porte que sur la charge des molécules.
la neu-
multiples
les tout premiers résultats.
Après traitement du séru~ myelom
raminidase (12,5 U/24 heures), l
Il est vraisemblable que ceci est dO è une différen
ce de sialylation des copules glycanniques comme
cela a déjà été évoquA pour d'autres problèmes (124,125,133, 62)
Pour confirmer cette différence de sialylation, nous
avons entrepris une série d'expé iences dont voici
apparues dans la région des chaînes ~ changent de
conformation. En effet, le nombr de taches se réduit,
et elles semblent se regrouper e~ une tache unique.
(Fig.74). 1
Des études plus fines sont en co~rs sur diverses
paraprotéinémies et paraprotéinu~ies. pour savoir
si cette hétérogénéité de taches Iréflêts rêsllement
une hétérogénéité des fractions "monoclonales".
Dans ce cas, il est vraisemblable que cette hétéro
généité proviendrait des chaînes glycanniques.
'. ~ '... ,--.. -i ri
te· \1
""
,.......
••
,...,.
( .
•
205 Bis
Fi;-r. 74 Electrophorèse Bidimensionnelleaprès trai temen t Dar la T'Jeurqminidase
QUATRIEME PARTIE
DISCUSSION - INTERPRETATION
206
1 - TECHNIQUES-METHODOLOGIES.
1.1. - TRYPSINATION.
Aborder l'étude des glycoprotéines de membrane par
une digestion trypsique douce à 4° C représente une
approche séduisante. car les cellules restent viables(34)
En fait, c'est une technique qui quant à sa réali
sation pose beaucoup de problèmes. Elle nécessite
d'pnorme quantité de cellules au départ (100 à
600 x 10 6 cellules), avec un rendement en protéines6
~g/10 cellules) faible et très aléatoire.
Ouand on observe le tableau de la Fig. 7 5 , aucune
corrélation n'est possible d'une exoérience ~ l'au-
tre, entre le nombre de cellules et la quantité de
protpine extraite par la trypsine. Les mêmes condi
tions d'extraction étant respectées, les quantités
de protéines e~traites varient pnormément d'une ex
périence à l'autre.
Du tableau de la Fi~. 75 si on exclut les valeurs
supérieures à 10 tJg/106 cellules(dues certainement
à des contaminants intracellulaires) il n'en est pas
moins vr3i que le rendement en protéines est tr~s faible.
Ce rendement très faible semble être inérant à la
technique, quand on se réfère aux résultats obtenus
technique appliquée à des
par CODINGTON et JENLOZ
109
cellules, par la même
3 2 34 ). A partir de
cellules cancéreuses vivantes d'ascite TA3-Ha, ils
obtiennent des rendements qui varient de 1,3 à6
2,6 tJf;/10 ceilules.
On voit donc toute la difficulté qu'il y a à carac
tériser les résidus glycônniques, quand on pense ~
la composition de la membrane où on retrouve environ
207
CELLULES PROTEINES TOTALES PROTEINES ~g/MILLION
( x 1 0 6 ) APRES TRYPSINATo DE CELLULES
( tJ- g )
300 1 6 B 0,56
150 260 1 , 73
600 6900 11, 50
400 702 1 , 75
420 1 B9 0 4,50
3BO 50D 1 , 31
200 B77 , 5 4,38
44 2100 47,72
400 960 2,40
152 243 1 , 59
180 725 4,02
200 420 2,10
20D :28 2,64
200 576 2,88
44 11 :3 0 25,68
55 3280 59,63
86 840 9 ,76
86 300 3,48
100 645 6,45
100 225 2,25
60 445,3 7,42
150 219 ,61
1 , 46
350 1008,6 2,88
250 233,7 0,93
400 7540 1 q , 9 7
450 8 9 70 19 ,93
Fig.75 - TABLEAU DE LA QUANTITE DE PROTEINES EXTRAITES
DES MEMBRANES DE L1210 APRES TRYPSINATION.
208
52 ~ de orotéines, 40 ~ de lipides et 8 ~ de sucres.
Dans les 8 ~ de sucres, 7 ~ sont liés à des lipides
(glycolipide), et il ne reste qu'1 ~ qui entre
dans la composition des glycoprotéines (115).
De surcroît GAH!"IBERG (53 a montré qu'après tryp-
sination des erythrocytes, plus de 50 ~ de glyco
protéines demeuraient attachées à la membrane. Il
émet donc l'hypothèse que la partie protéique de
certaines glycoprotéines. est profondément ancrée
dans la membrane, et se trouve ainsi protégée par
les résidus glycanniques de l'action des enzymes.
En fait, par cette méthode que nous avons utilisée
au début. nous n'avons qu'une vue partielle de l'en
semble des glycoprotéines de membrane.
Après trypsination nous n'analysons donc par élec
trophorèse que des glyconrotéines ou fragments de
glycoprot~ines ~tryosino sensibles~.
1.2. - MlI,ROUAGE r<JETABOLIQUE.
Pour révéler (aorès ~lectrophorèse et autoradio
graphie) les glycoprotéines dans la fraction "tryp
sino sensibles". nous avons utilisé l'incorporation
dans les glycoorotéines de 2 précurseurs radiomar-
qués la glucosamine et le fucose.
La glucosamine et le fucose ont été choisis parce
qu'ils sont 2 constituants des glycoprotéines qui
ne se situent pas au même endroit.
La glUcosamine est à la fois un précurseur de la
N-acétyl-glucosamine qui s'incorpore dans le corps
de la molécule, et de l'acide sialique qui consti
tue avec le fucose les 2 seules extré~ités en prin
cipe possibles des glycoprotéines [ 114 ).
209
D-GLUCOSAMIr-:E
NADH
l-ASCORBATE
-21H11
.. H101l-xylulose 0 NAD l-gulonate
NAUH t l l~ INOSITOL~ COl NADPH
xylitolNADPt D-gluc~ronate~ UDP-1()-sa,acturonate
o
ATP I! NAD UDP-L-iduronatePENTOSES---.... D-pentose-5-P /
,~ o-glucuronale-I-P~ NADNADP r ~ COl o-GALACTOSE UDP-u-glucuronate +l Z6-P-gluconate t NAD{P)ç...C02 W
ATP /" 1 ATP UDP-o-xylose -- • ~7 t/,o a-D-galactose-I-P~ UDP(a)-o-galactose 2NAD g:
o-GLU.5.0NATE NAOPt K 1 8/-2IHI NAD ~
Il-D-GLUCOSE Il-D-glucopyranose-6-P Cl1 ATP t
• 1 gl IP UTP ô'-D-GL\C~::'H ~D-g ",Dpy"",~·6-P~o-~ r\~ -. :u DP~)~gl",D~ ~
\ An' • ADP-ta)-D-glucose -----+i ~SOR nnOL dTTP dTDP-(a)-D-glucose t3(0 D-mannoseZATP D-MANNOSE dTDP~4-keto-6- g/1'1) / ------... deoxy-o-glucose a "
o-FRUCTOSE AT!' • D-fruct0se-6-P • D-mannose-I-P tNAO(PJH <\ATP ATP l~ ~Ulamine ~GTP dTDP-l-rhamnose' §
\ NAn~ N~ ~ GDP-o-mannose ~D-fructose-I-Pt n-fructose- 1,6-diP mannitol-P' n-o-glucosamine-6-P t ::;
J t l GDP-J-ketofucose 22.celyl CoA 1
MANNITOL ~NAD(P)H 0
o-glyceral- ATP u-glyceral- N-acetylclucos- GDP-l-f:Jcose ~
dehyde =-- dehyde-J-P amine-6-P UDP-N-acetylmuramic acid'
/ J ATP t f P-<:nolp)'ru'.'e 8, N-acctylglucos-~ UDP-N-acetyl-o- :J
dlhydroxyacetone-P... amine-I-P glucosamme 0
~DP-~etYI- ~ ~1 o-galactosamine CIl
N-acetyl-D-mannosamine-6-P 8~ P-enolpyru\oa((' ~
N-acet)'lneurarninic (sialic) acid-9-P ClH,Q ~ crI' CMP-N-acetyl
sialic aci<l~ neuraminic acid
GLYCEROL~a-glycerol-P _.-----------..;CT:;.:,.:P-------.. CDP-gl~,cerol
Fig.76 INTERCONVERSION DES SUCRES
210
L'incorporation de cette osamine rend ainsi compte
de la synthRse globale des glycoprotéines et aussi,
mais à un degré moindre des glycolipides. Il faut
signaler que le glucose serait même préférable
dans ce sens, malheureusement au contraire de la
glucosamine, il se retrouve dans de nombreux autres
constituants cellulaires (Fig.76).
Le L-fucose est incorporé non métabolisé (94)
comme sucre ter~in~l des glvcorrot~ines et des
glycolipides (113,189).
De façon ~énéral~, l'interpr~tation et le calcul
des ~.M. des glycoprot~ines Htrvosin~ sensibles"
après électrophorèse (ACRY/SDS), posent des problè
mes. La révélation après marquage à la GLcNH 2 donne
des trainées radioactives difficilement interpré
tables (Fig. 77 ).
La qualité des s~parations électrophorétiques n'est
pas en cause, puisque les profils "BC" montrent des
séparations parfaites. Cette observation soulève
deux questions
- La fraction "trvosino sensibles" est-elle conta-
minée par des protéines du SVF ayant fixée de la
radioactivité?
- Existe-t-il une radioactivité aâsorbée sur les
membranes ?
En effet, tant pour le fucose que pour la gluco-
samine, les travaux de CARPENTIER (25) ont
démontré qu'une certaine radioactivit 6 6tait adsorbée
sur les protéines du SVF en présence ou en l'absence
de cellules. Cette adsorotion a d'ailleurs été
décrite par KASPAR et KALTENBACH ( 98 ). Cette
adsorption sur les protéines du SVF, n'explique
pas à elle seule, cette trainée qu'on observe sur
les autoradiogrammes. car les cellules sont exhaus
tivement lavées pendant les étapes de trypsination.
A B -C 0
94
67
43
30
20
14
MM x10 - 3
Fi~. 77 : Trypsinat ~e L 1210aprôs maraua~e mêtaboli~ue
A,C = 14C - GlnH214
P,D = C - fucose
2 11
,
212
De plus, on n'observe ce ph~r.omène qu'avec la gluco
samine. En fait, l'explication la plus satisfai
sante serait l'existence d'une adsorption de radio
activit~ directement sur les membranes.
En effet, il ne faut pas écarter la possibilité
d'une liaison de glucosamine éventuellement poly
mérisée avec les membranes cellulaires comme l'ont
décrit TERRY et ZUPNIK 184 J. Dans ce cas, un
grand nombre de cellules présent dans le milieu,
pourrait entrainer une quantité plus importante de
glucosamine liée à la membrane.
En fait, dans une telle voie d'approche des glyco
protéines, le fucose serait le marqueur de choix
puisqu'il est incorporé no~ métabolisé, et il pré
sente un flux métabolique constant (25J. Mais hélas,
il se trouve être un sucre terminal sur les chaînes
glycanniques, mais de façon inconstante. La f.ai
blEsse du marquage qu'on observe avec le fucose
contrairement à la glucosamine, Dourrait s'expliquer
par une augmentation de la taille de la fraction
glycannique. Cette augmentation pourrait-être due,
soit à des chaînes glycanniques de plus grande
longueur, soit ~ des chaînes plus ramifiées, toutes
les ramifications n'étant pas nécessairement ter
minées. ( 103 ).
Cette epproche des glycoprotéines de membrane, souf
fre de plusieurs faiblesses
- Faiblesse due à la tec~nique de trypsination qui
nécessite un grand nombre de cellules, et qui
n'est pas constante d'une expérience à l'eutre.
- Faiblesse due aussi au cAoix du traceur radioac
tif, dont l'utilisation nécessite beaucoup ce
précautions pour éviter des artéfacts dûs essen
tiellement à des ~hénomènes d'adsorption et de
contamination.
213
Et par cette méthode. nous n'étudions par électro
phorèse que Des glycoprotéines ~trypsin 0 sensibles~.
Nous n'avons donc qu'une vue partielle de l'ensemble
des glycoprct~ines De membrane.
Nous avons donc recherché d'autres ~éthodes d'ap
proche qui nous donneraient une vue globale. notqm
ment les ffiéthodes de marquage ~ la galactose oxydase.
1.3. - MARC)U,l'lGE EX1ERNE.
Par cette rrétrode. nous avons abordé l'étude des
glycoorotéines de membrane. sous un autre angle.
Par ce biais. nous analysons la structure profonde
et totale des glycoprotéines puisque les glycann85
sont marqués in situ. et les glycoprotéines sont li
bérées dans le milieu par lyse cellulaire.
Cette mnthode à la galactose oxydase est largement
utilisée dans l'étude des molécules de surface de
différents types cellulaire5 (8) 174) 58).
Cette méthode est spécifique de la surface cellulaire.
puisque la galactose oxydase qui a une M.M. de 75000
daltons. apparemment ne traverse pas la membrane
olasmique des cellules vivantes ( 57). Ouand
modifications comme le souligne i'lNDERSSfJN ( 8).
sialique peut entrainer des
Cela
elle est associée à un ~r~tr'aitement par la neura
minidase. les résidus galactosyls liés à de5 restes
sialyls sont aisément ~is en évidence. ~ais néammoins.
comme nous le verrons plus bas (Discussion Résultatsl.
le fait de retirer l'acide
peut af~8cter ~'organisation des ~lycoprotéin~5 ~ l~
surface cellulaire. et se traduire nar la réduction
des mobilit6s électroDhor~tiques.
Sans traitement par la neuraminidase. les glycoprotéi
nes sont en général très feiblement marquées.
2 14
Cette observation indique dans les sD~ches cellulai
res que nous avens étudiées, que la ~ajorité des gly
coprotéines marquées, contiennent dans leur etruc
ture en avant dernière position, dee r~sidus galac
tosyls/N acetyl galactosaminyls liés 3 des acides
sialiques terminaux.
En l'absence de galactose oxydase, et en présence
De ooronydure tritié seul, une certaine quantité de
radioactivité était incorporée dars les protéines
57 1 531-__ 54 ).
Nous avons retrouvé ce merqua~e asopcifique dans les
2 souches cellulaires étudiées. Sur la L121D le
marquage porte sur des fractions 48000 et 45000 daltons
chez la K552 cette iGcorooration aspécifique a lieu
dans les fractions 51000 et 44000.
ANDERSS~~ et GAHMBERG o , 5 8 cnt d'ail-
leurs retrouvé ce ~arquage asoécifique sur une frac
tion 57~on daltons dans leur étude des r,lvcoDrotéines
de membrane oe cellules lvmphoIdes murines ou humaines.
Ils émettent l'hypoth~se ou'un tel ~arquage aspéci
fique, serait dû à la formation de bases de schiff
entre l'aldhéhyce et la fonction amine d'une enzyme
conteGant du pyrido~al phospnate. en sait par ailleurs,
que des enzymes telles l'orntthine d~carboxylase sent
fortement activées dans les cellules malignes 1 3 8 ).
Dans cette technique ~e ~arquage, il est dOGC toujours
nécessaire d'inclure ur let de cellules té~oins uni
quement marquées au bcrchydrure tritié.
Nous avone donc acoptr cette techrique de marquage,
parce qu'~lle ~st spécifioue des glycoprotéines de
sur~ace, et elle r.P. nécessite que très peu de cellules
au départ. (20 è 50 x 106
cellules).
215
II - RESUL TATS.
2.1. - L121D.
2.1.1. - GLYCOPROTEINES TOTALES (N+G+3
H/G+3
H/P+ 3 H).
Sur la membrane de la cellule L1210, nous avons
mis en évidence 22 glycoprotéines dont les majeures
(86 000, BD 000, 76 000, 54 000, 50 000, 23 000
daltons):1N+G+ H,
sont fortement marquées après traitement
et faiblement révélées après G+3
H. Ces
résultats démontrent que la majorité des glyco
protéines de surface de la cellule L1210 sont ter
minées par des résidus sialyls liès à des restes
galactosyls en position pénultième.
A côté de ces structures coexistent des chaînes
glycannioues à galactosyl terminal puisqu'on ob-3
serve un léger marquage après G+ H.
Le traitement par N+G+3
H/G+3
H révèle l'absence de
galactosyls libres (terminaux) dans les glycopro
téines majeures. En fait, toutes les glycoprotRines
Mises en évidence À la surface de la cellule L1210,
présentent dans leur structure, de nombreuses chaî~
nes glycanniques terminées par des résidus sialyls.
Cette richesse en acide sialique, expliquerait le
nombre restreint (six) de glycopro~pines mises en
évidence par CHEN et CANELLAKIS ( 28, 29) sur
la membrane de L1210. Ils ont en effet, utilisé un
maroua~e externe uniquem~nt à la G+3
H qui ne révèle
que les galactosyls libres.
Par le marquage au periodate (P+ 3 H), qui ne révèle
que les restes sialyls nous avons confirmé la pré
sence de glycoprotéines riches en radicaux sialyls.
216
Mais comparativement au marqua~e ~ la N+G+3
H. les
M.M. déterminées après P+3
H sont inférieures aux
M.M. calculées après N+G+3
H. En effet. lorsque3
les cellules sont marquées par la N+G+ H. les M.M.
calculées vont de 135 000 ~ 2~ 000 daltons. tandis3
que par le P+ H. elles vont de 97 000 à 19 000
daltons ( cf. Fig.4040"').J
Cette observation met en évidence une des limites
du marqua~e à 1\J+G+ 3 H. De nomhreux auteurs 3 1 ,
1 3 3 • 8 soulignent leNcomportement anormal"
des glycoprotéines lors de leurs séparations en
ACRY/SDS. En effet. la désialydation entraîne des
modifications dans la charge totale des glvcooro
téines donc par la même occasion une diminution
de leur mobilité électrophorétique. Cette diminu
tion de mobilité. entraine donc des erreurs par
excès lors de la détermination des M.M. On voit
donc t0ute la difficulté qu'il y a à déterminer
avec précision les M.M. des glvcoprotéines après
séparation en ACRY/SDS. En fait. les M.M. calculées
ne représentent que des M.M. apoarentes.
Les altérations structurales des glycoprotéines.3
aorès marquage à la ~+G+ H. sont fortement mises
en évidence lorsque les glycoprotéines sont sou
mises à une électrophorèse bidimensionnelle.
En effet. les glycoprotéines qui apparaissaient, , 3
sous forme allongee apres G+ H. se retrouvent
sous forme circulaire. et dans des zones de oH
plus basioue après action de la neuraminidase. La
glycoprotéine la plus reorésentative de ce phéno
mène est la GP M1 (60 000) qui après marquage G+3
H
se situe dans les zones oHi 6.B - 7.1 (Fi~.4950)'
"'3alors qu'après N+G+ H. elle se situe dans des zones
de pHi ~ 7.1. Cette GP M1 est très riche en rési
dus sialyls. puisqu'elle est fortement marquée après3
N+G+ H (ACRY/SDS). Le traitement I=ar la neurarrinidase
fer ait don c dis par e î t rel a m,'(roh été r 0 g é n é i t éd' li n E
glycoprotéine si elle est due à divers degrés de
sialylation.
217
Mc GREGOR et CLEr'IETSDN ( 133 ), utilisant la même
technique (N+G+ 3 H/G+3H/Bidimensionnelle) à propos
des glycoprotéines de membrane de plaquettes san
guines, ont mis en évidence des altérations dras
tiques dans les pHi des glycoprotéines après mar-3quage N+G+ H.
Malgré ces aléas inérants à la technique même de
marquage, l'électrophorèse bidimensionnelle met en
évidence lrhétérog~néité des glycoprotéines membra-
na ires de L1210. En effet, les GP 68 000, GP 63 000,
qui apoaraissaient majeures [3+) et homogènes après
ACRY/SJS, se répartissent en des taches bien dis
tinctes, sur le fluorogramme bidimensionnelle,
ayant la même ~.M. et des pHi différents.
Cette h~térogénéité mise en évidence serait due à
des dif+érences dans la partie glycannique, ou à
des variations dans la séquence peptidique des gly
coprotéines (133, 62 ).
Cependant, de grandes précautions doivent-être
prises quant à l'interprétation de tels résultats,
quand on pense aux effets possibles que peut avoir3 3
la technioue de marouage [N+G+ H/G+ Hl sur les pHi
et les M.~. des glycoprotéines.
Contrairement à HOURANI et Coll. 79 qui n'ont
en évidence que 4 glycoprotéines (84 000, 63 000,
44 000 et 33 000) 3 la surface de la L1210 Dar les
méthodes de coloration au PAS, nous avons révélé
plus d'une vingtaine de glycoprotéines ~ la surface3de cette même cellule (ACRY /SOS+N+G+ H).
La forte incorporation de radioactivité obtenue3après traitement par la neuraminidase (N+G+ H) ou
"1par le periodate (P+~H) semble indiquer que la ma-
joritp des constituants membranaires sont de nature
glycoDrotéinique.
218
Cette observation est un accord avec les tests
d'inhibition d'agglutination par les lectines. En
effet, HOURANI ( 7 9 ), JANSON et BURGER ( 92,
9 1 ) ont démontré que les extraits membranaires
(GP) de L121o, inhibent leur agglutination par la
concanavaline A l'agglutinine de germe de
blé et par l'agglutinine de lentille
Cette variété d'interaction avec les lectines rend
compte de l'hétérogénéité dans la structure des
glycoprotéines présentes à la surface de la membrane.
2.1.2. - GLYCOPROTEINES "TRYPSINO SENSIBLES".
Si la trypsine détache de nombreuses fractions pro
téiques (cf. Profil BC/ACRY/SOS), en fait, très peu
de ces fractions sont de nature glycoprotéinique.
En effet, après marquage métabolique, nous n'avons
mis en évidence qu'une dizaine de glycopeptides.
Ces glycoprotéines contiennent toutes de la gluco
samine, ce qui est comoatible avec la position qu'oc
cupe cette osamine dans le "corps" des glycoprotéi-
nes ( 1 3 5 ). La fraction "trypsino sensibles"
regrouoe aussi bien des fragments de hautes ~.M. (140
à 128 000) ~ue des fragments de basses M.M. (§O 000 à
28000 qaltonsl. Mais il est vraisemblable comme
l'ont souligné COOINGTON et JENLOZ ( 32 ) que ces
différents fragments pourraient provenir de glyco
protéines de ~.M. encore plus élevées.
3 3Le marquage externe (N+G+ H/G+ H) du trypsinat
recoupe le marquage métabolique (14 C GINH2
fuc) puisqu'
on retrouve des glycopeptides de 135 000, 120 000,
90000, 68000, 60000 et 30000. Les fractions 135,
120, 60 et 3D 000 qui sont des fractions Majeures
après marouage métabolique, sont aussi des fractions
prédomi~antes lorsque le trypsinat est marqué par
la N+G+ 3 H.
219
Cette observation laisse donc supposer que ces
glycoprotéines ont des structures glycanniques
ramifiées et finies car elles contiennent de la
glucosamine N-acetyl glucosamine, du fucose, du
galactose!N-acetyl galactosamine et des acides sia
liques.
La GP GO 000, comporte dans sa structure, une partie
peptidique imoortante (BC 3+), de la glucosamine
(3+) du fucose (2+) et des restes galactosyls liés
à des restes sialyls (N+G+3
H = 3+). Le fucose et
l'acide sialique qui sont des sucres terminaux, se
trouvent simultanément en intensité importante dans
cette GP GO 000.
On peut donc penser que cette GP GO 000 possède des
struc~ures glycanniques complexes très ramifiées avec
de nombreyx résidus sialvls (G+3
H = -).
Les GP G8 nOD et GP GO 000 pourrAient-être rapprochées
des transporteurs du ~TX (G700J et G3000) mis en évi
dence par ~c CQRMICK et FREISHEIM (132) à la surface
de la L1211 mais par des techniques différentes.
La mise en évidence de radicaux sialyls dans les
glycoprotéines "tryosino sensibles", permet de noter
que la orésence d'acide sialique, n'inhibe pas com
plètement l'attaque de la chaine peptidique par la
trypsine, comme l'avaient observé GOTTSCHALK et
FAZEKAS de St GROTH (68 oour les ~lycoprotéines
isolées du plasma ou de sécrétion.
2.2 - K562.
2.2.1. - GLYCOPROTEINES TOTALES (N+G+ 3 H/G+ 3 H).
Aprqs marquage externe 3(N+G+ H) les glycoorotéines
de la surface des cellules K562, présentent après
ACRY/SQS, des similitudes frappantes avec les ~lvco
protéines des érythrocytes normaux (cf. Fig. 53 ).
220
Cette similitude a d'ailleurs été décrite par plu-
sieurs auteurs (9,95). Nous avons donc retrou-
vé dans les deux profils (ACRY = 10 6) 3 bandes
fortement marquées [N+G+3
H) avec des ~.M. approxi-
matives de 85 000, 54 000 et 40 000 daltons. La
bande 54 000 correspond~nt à un marquage aspécifi
que, les bandes 85 O~O et 40 000 correspondent res-
pectivement au dimère (PAS1
de la glycophorine A, qui est
et au monomère (PAS2
)
la glycoprotéine ma-
jeure de l'érythrocyte normal.
un accord avecLe profil des
Cette dimérisation quiest un caractère spécifique
des protéines érythrocytaires, a été mise en évi-
dence par MARTON et GARVIN [ 130 ).
, G '1K562 apres N+~+ H est
les résultats de ANDERSON et GAHMBERG ( 9 ) qui
ont mis en évidence sur la K562, trois bandes ma-
jeures avec des M.M. de 105, 85 et 42 000 daltons,
les bandes 85 et 42 000 correspondant respective
ment au dimère et au monomère de la ~lycophorine A.
Lorsqu'on affine le profil des glycoprotéines par
s é par a t ion dan sun g rad i e n t d' ACRY [ 5 - 15 0J" ), l e
fluoro 5 ramme révèle 21 bandes radiomarquées dont
les M.M. vont de 26CJ à 16 000 (cf. Fig. 53/54).
En fait ,il est vraisemblable que ces 21 bôndes ne
représentent pas des entités individuelles. Certaines
d'entre elles seraient le résultat de diffusion de
bandes majeures. JOKINEN et GAHMBERG ( 95 ) ont
d'ailleurs noté que la glycophorine A donnait en
ACRY/SDS une bande large et diffuse. Nous avons
aussi observé ce phénomène, puisque autour de la
bande 85 000, sur le fluorogramme existe une zone
diffuse où ont été mises en évidence les bandes
90 000, 78 000 et 72 000 qui peuvent être assimilées
à des diffusions de dimère de glycophorine A.
221
Ce phéno~8ne expliquerait la disoarition de la
GP 40 000 mise en évidence dans un gel à 10
et l'apparition des GP 39 000 et 37 000 (monomèreJ
dans un gradient 5-15 ~.
Lorsqu'on analyse le fluorogramme sur un densi-
tomètre performant type UVICON 810 ou 820 (KONTRONJ
le profil devient simple et compatible
avec les résultats de ANDERSSON et Coll. 9 J •
En effet, on retrouve les pics majeures à 115 000,
85 000, 53 000, 49 000, 44 000, (39-37 OOOJ, et
29 000 daltons. Les pics 53 000 et 44 000 étant
des marquages aspécifiques puisqu'on les retrouve
en l'absence de tout traitement enzymatique.
Compte tenu des + 10 ~ d'erreurs inérants à la
méthode de détermination des ~.M. selon WEBER et
OSBDRN (206), la GP 11J5 de ANDERSSON et Coll. (9 J
corresDond vraisemblablement à la GP 115 000 que
nous avons mise en évidence.
Les glycoorotéines mises en évidence à la surface
de la K562 sont trà.s riches en acide sialique,
puisqu'elles ne sont presque pas marquées après. 3traltement G+ H 3 l'exception des GP 49 000,
(39-37 OOOJ et 2g 000, qui doivent contenir dans
leur structure des chaînes glycanniques à galac
tosyl terminal, et des chaînes à sialyl terminal.
2.2.2. - GLYCDPROTEINES »TRYPSINO SENSIBLES».
Le marquage externe du trypsinat de K562 après
ACRY/SOS révèle une trentaine de bandes aussi3 3
bien marquées après traitement N+G+ H que G+ H.
'f Fig. 5 7 ). Cam par a t ive men tau pro fil des le; l y c 0
protéi~es totales après marquage externe, il est
vraise~blable que les nombreuses fractions obtenues
proviennent du clivage de glycoprotéines plus lon
gues en de petits fragments Deptidiques porteurs
de chaînes glycanniques
222
A côté de ces fragments glycoprotéiniques, une
bande estimée à 72 000 daltons domine le profil
électrophorétique par son intensité de marquage3 3
aussi ~ien après N+G+ H que G+ H. Cette bande par
son comportement électrophorétique (Diffusion) et
son marquage intense, correspond vraisemblablement
au di~ère de la glycophorine A. Cette glycophorine
exposée à la surface membranaire peut-être détachée
par la trypsine 1 27 ) et sa M.M. est réduite.
Le marquage équivalent aDr~s N+G+ 3 H que G+ 3 H pour
rait s'expliquer par le fait que les fragments
glycoprotéiniques, une fois détachés de la membrane,
sont moins sujets au problème d'encombrement stéri
que. Ce qui rend les galactosyls libres plus acces
sibles au marquage. Les GP 64 et GP 54 ne sont uni
que~ent marquées qu'apr8s action de la neuraminidase
(Fig. 57 ). Elles ne contiennent dans leur structure
que des chaînes ~lycanniques 3 sialvl terminal lié
à un ~ésidu ~alactosyl.
La GP 57 n'apparait qu'après traitement G+3
H et
elle est totalement inexistante apr8s action de la
neura~inidase. Ce comportement anormal s'exolique,
si on considère que les acides sialiques ne sont
pas tous sensibles aux neuraminidases bactériennes
( 62 ) •
En e~~et, ROSEMBERG et SCHENGRUND 157 ) ont dé-
montré que les glycoconju~ués où la ~-acetylgalac
tosamine est liée en position 4 à un galactose qui
porte un acide sialilue en position 3, présentent
une grande résistance à l'action des neuraminidases.
Ils émettent l'hypothèse que le N-acetylgalactosa-
mine pourrait agir comme un inhibiteur compétitif
des sialidases. On peut donc penser que la GP 57
D c; :; 'ë ses j -:: c,:; :=::3 st:'"' U c t urs d 8 S 0; l Yc ô " r; S S à ,~ - a c s t \1 l -
. -' - .,... =----- - --
- =- .
223
L'action négative du traitement par la N+G+ 3 H,
pourrait s'expliquer par l'inhibition compétitive
due à la N-acetylgalactosamine, ou par la substi
tion du radical N-acetyl de l'acide sialique, qui
entrainerait une rRsistance à l'action de la neu-
raminidase de vibrio cholerae. (157 ).
2.3 - EFFECTEURS PHARMACOLOGIQUES.
2.3.1. - L1210 - MTX.
A des doses non létales, le MTX altère les profils
électrophorétiques de la fraction »trypsino sensi
ble» des membranes de L1210. Par I.E.F. et colora-
tion au BC, nous avons mis en évidence la duplica
tion d'une bande majeure (bande 15 = pHi = 6,4) en
faisant apparaître une nouvelle bande (15') avec
un pHi = 6,2 et parallèlement on assiste à une at
ténuation de la bande 16 (pHi = 5,9).
Par corrélation avec le profil bidimensionnel
(Fig. 45 ), cette bande 15 correspond à la tache
P1
qui se situe dans les zones de pHi 8,1 à 6,7 et
de M.M. 47 000. Cette observation devient signifi
cative quand on observe le profil des membranes
témoins et traitées après ACRY/SOS.
Dans les tout
entrepris 35
premiers travaux que nous avons
), nous avons mis en évidence
l'augmentation nette de 2 protéines membranaires
après traitement par le MTX. Les M.M. de ces pro
téines ont été estimées à 47 000 et 39 000. Par la
suite la seule modification associée de façon ir
réfutable au traitement par le MTX est l'augmenta
tion d'une protéine membranaire estimée à 53 000
daltons apr8s coloration au BC.
224
Le marquage par le periodate (p+3 H) qui révèle
les résidus sialyls met en évidence dans le fluo
rogramme des cellules traitées, 3 glycoprotéines
supplémentaires ayant des M.M. estimées à 105 000,
100 000 et 45 000. Compte tenu de l'approximation
(MM ~ 10 ~) de la méthode de détermination des
M.M. selon WEBER et OSBORN (206), les bandes
47 000, 53 000 et 45 000 correspondent vraisembla
blement à la même glycoprotéine. A côté des glyco
protéines> 100 000 daltons dont la présence ou
l'absence est souvent variable, les modifications
majeures s'opèrent toujours quel que soit le type
de gradient dans les zones 43 000 à 67 000 daltons
(étalons de M.M.).
Cette zone de M.M. prend toute son importance au
regard des travaux de Mc CORMICK et FREISHEIN (132).
Ils ont en effet, mis en évidence à la surface de
la L1210, 3 polypeptides capables de se lier au
MTX. Ces polypeptides ont une M.M. estimée à 67 000,
63 000, 56 000 et seraient des sous unités d'une
protéine complexe avec une M.~. >à 100 000 daltons.
Par ailleurs, on sait que le MJX pénètre dans la
cellule par un phénomène de transport ( 67 ).
Ces modifications observées dans les profils élec
trophorétiques des Elycoprotéines sont à rapprocher
des travaux effectués au sein du laboratoire, notam-
ment sur le métabolisme énergétique de la cellule
L1210 (188,25,108). Ces travaux ont en effet,
montré que le ~TX provoque une élévation de la con
sommation du ~lucose, n'altère pas le transport du
glucose et inhibe la resoiration mitochondriale.
La glycolyse et la modification des glycoprotéines
de me~brane représentent deux phénomènes qui peuvent
être reliés ne serait-ce que, parce que le trans
port du ?lucose à l'intRrieur de la cellule est as
suré par un transporteur qui n'est autre qu'une
glycoorotéine.
225
Un autre lien a été montré par SHIU et Coll. ( 168 1
qui ont observé dans des fibroblastes d'embryon de
poulet transformés par le virus du sarcome de ROUS
(RSV1. l'augmentation de 2 protéines membranaires
parallèlement à la consommation du glucose. En fait.
l'augmentation de ces protéines n'est pas une con
séquence de la transformation mais est consécutive
à la chute rapide de la concentration de glucose
dans le milieu de culture. On peut relier aussi
cette modification des ~lycoprotéines à l'action
inhibitrice du MTX sur la respiration mitochondriale
car de nombreuses relations ont été démontrées entre
l'intensité du métabolisme aérobie ou le fonctionne-
ment ries mitochondries et les constituants de mem
brane des cellules transformées (210).
Cette apparition de glycoprotéines. mise en évidence
aprRs séparations électrophorétiques est certes qua-
litative. mais néanmoins elle est en accords avec
les trôvaux de CARPENTIER
des glycoprotéines.
25 1 sur le métabolisme
En effet, ces travaux ont montré qu'en présence de
MTX, l'incorporation de ~lucosamine et de fucose
radiomarqués dans les macromolécules intracellulaires
par l'acide phosphotungstique (indice
de biosynthèse des glycoorotéines). est augmentée.
D'autres approches de l'influence d'antimitotiques
en général et du MTX en particulier, sur la membrane
plasmique ont été rapportées. HWANG et SARTORELLI
84 ont décrit une augmentation du taux d'ag-
glutination. induit par des lectines de cellules de
sarcone 1AO par 60 ~mol/l de MTX pendant 2 heures.
HOFFMANN et Coll. 77 ont observé par microscooie
électronique ~ balaya~e. une oerte de microvillosités
6 heures après l'administration de 5 x 10-B molll
de MTX à des lymphocytes stimulés par la phytohémag
glutinine.
226
Toutes ces observations renforcent l'idée que les
modifications membranaires que nou, avons obtenues
en présence de MTX ne sont point artéfactuales.
Mais néanmoins pour correler plus étroitement les
profils MTX et Témoins, il serait judicieux de
disposer d'un témoin lui aussi en phase S témoin
bloqup en phase S par un procédé non chimique), car
le MTX bloque les cellules en phase S et l'on sait
que les structures membranaires varient au cours du
cycle cellulôire (61)
2.3.2. - L121D - ~A.
Par électrophorèse et après action du RA 233, nous
avons mis en évidence des modifications profondes
entre le profil des protéines membranaires des cel
lules témoins et des cellules traitées.
Contrairement au MTX, le RA 233 semble affecter les
protéines membranaires d'une façon générale et non
ponctuelle. En effet, les séparatio~ en ACRY!SDS
après coloration au BC révèle une intensification
générale des bandes de faible M.M. Ces modifications
entre cellules témoins et traitées sont accentuées
quand les protéines membranaires sont séparées par
électrophorèse bidimensionnelle. En effet, la carte
bidimensionnelle des cellules traitées. exhibe des
taches dédoublées à la place des constituants ma
jeures (GP 11
, GP M1 , GP P4) qui sont de nature
glycoprotéinique. Ce phénomène semble être général
puisque de nombreuses taches sur le profil traité
sont d8doublées mais de façon moins précise.
Ces profils font penser à une adsorotion de la
drogue à la surface membranaire. Cette hypothèse
ne peut pas être retenue, puisqu'un simple lava~e
des cellules fait disoaraître les effets biologi
ques du RA 233, et avant trypsination les cellules
sont exhaustivement lavées.
227
On oeut nlutôt 8nvisa~er nue la ~?13 induit une
désorganisation de la structure ou de la cohpsion
des glycoprotéines membrenaires, ~ui serait aussi
responsable de l'augmentation du taux de protéines
"trypsino sensibles" et qui se traduit aussi par
une inhibition non co~pétitive des transporteurs
me~branaires. Cette idée est renforcée par le fait
que le RA 213 est un puissant antiagrégant plaquet
taire (6, 105) et on sait que les glycoprotéines
~embranai"es n~rticipent active~ent à l'agrégation
des pla~uettEs sanguines ( 162). Cette désor
ganisation des glycoprot~ines est appuyée par les
résult~ts des tests d'agglutinabilité par les lec-
tines. En effet, TRETESSAUX 188 a montré que
l'agglutinabilité des cellules L121D par la conca
navaline A est retardée et ralentie nar le RA 211.
Par ailleurs HWA~G et Coll. ( 84 ) ont montré que
c e r t a i n e :3 Co r 0 gue sin d Li i sen t [j e~, e l t é rat ion s a uni
veau des glvcoorotpines d8 ~e~brane des cellules
cancéreuses, oui présentent alors des réactivités
différentes vis-3-vis des lectines. Ces ~odifica
tions structurales au niveau de la membrane se
trouvent aussi confirmées par l'étude en microsco
pie électronique de balayage.
La membrane des cellules traitées Dar le RA 233,
prr?sente un aspect en "choux-fleur" (Fig. 78 ).
La su"face cellulaire est beaucoup plus cre'lossée,
et on observe des protubérances massives et irré
gulières de telles inages ne s'observent que dans
des cellules en souffrance. Par exemple des aspects
du même genre ont été publiés avec des cellules
cancéreuses attaquées nar des cellules immunitaires.
(215,72).
2.3.3. - K562 - DIFFERENCIATION.
Dans ce trav~il Dréliminaire sur la différenciation,
nous avons d'abord vérifié que la lignée K562 dont
nous disoosons, répond bien aux critères de la lignée
érythroIde retenus par ANDERSSON et GAHMBERG 9 ) .
ACTION DU RA 233 SUR
227bis
0.0. A 546 nm
1300
1200
1100
1000
900
L'AG G LUTINABI LITE DES
L 1210 par LA CON _ A
,v
'(V ,.
'('(
" V
5 10 1 5 20temps en mn
Dé croissance de la densité optique au
Cicours du temps à 37c.__ 8
L 1210 témoin
*-* L 1210 + RA
0_0 L 1210 + con A
y-, L 1210 + RA + con A
228
A
B
FiF.. 78 A = L 1210 Témoin
B L 1210 + RA 233.
229
Ces critères sont notam~ent la présence de glyco
phorine A qui est spécifique de la surface des
érythrocytes humains (44,9,95 / 127), et la synthèse
d'hémoglobine embryonnaire et foetale en présence
d'agent inducteur tel que l'hélTline 160 ) .Dans ce nouveau canevas de recherche, les études
électrophorétiques entreprises, n'ont visé qu'à
mettre en évidence les chaînes de globine après
induction de la syr,thèse d'hémoglobine (160.J5,15J.
Nous avons donc montré, après avoir établi le pro
fil général des glycoorotéines de membrane, que la
souche K562 dont nous disposons sécrète de large
quantité d'hémoglobine en présence d'hémine (12,5 ~~
ou 50 rJM). Cette hémoglobine a été qualifiée et
quantifiée par l'étab~issement du spectre d'absorp-
tion dans le visible (Fig.66, 67). Le sujet de-
vient ~rometteur quand on établit le orofil des
glycoprotéines de membrane au cours de l'induction.
Pour étudier les variations précoces, nous nous
sommes placés dans des conditions telles que la
cellule synthétise de l~rges quantités d'hémoglo
bine (1- 4,5 pg/cell.) au bout de 24 heures. Nous
avons donc incubé les cellules en présence d'hémine
50 ~M. Les effets tardifs ont été étudiés après
4 jours d'incubation en présence d'hémine 12,5 ~~.
Après 24 heures de culture en orésence d'hémine
50 p~, le fluorogralTIme révèle une glycoprotéine
hypersialidée dont la M.M. a été estilTlée 3
130 O~O daltons. Par contre les GP 49 000, (GP 37-
39 000) sont inexistantes. ~près 4 jours de culture
en présence d'hémine 12,5 ~M, alors Que la produc
tion d'hémoglobine est lTIaxilTIale (4,5 ~g/cell.) la
distribution des glycoprotéines est rigoureusement
la même que dans les témoins. Le dimère de la glyco
phorins A (GP 85 000) est toujours présente quel que
soit le type d'effet étudié (précoce ou tardi~)
alors que le monomère (GP 37-3q 000) est absent dans
les effets précoces.
230
Cette observation est encourageante quand on se
réfère aux travaux de GAHMBERG et ANDERSSDN ( 52 J.
Ils ont en effet, démontré qu'en plus de sa pr~
sence à la surface de l'érythrocyte, la glycorho
rine A était aussi présente dans les premières
étapes de l'érythropoiese (51/52 J. Ils ont aussi
montré que la glycophorine A était déjà présente
à la surface des normoblastes basophiles, indiquant
ainsi ~ue son expression à la surface membranaire
précédait le départ de la synthèse d'hémoglobine
détectable 52 ). Ils ont aussi montré que les
cellules leucé~iques blastiques, exprimaient les
deux formes de ~lyconhorine A (dim~re ou monomère)
dans certains cas, et dans d'autres cas, seule la
forme dimérique était exprimée à la surface. Mais
néanmoins, la corrélation entre ces différences et
le degré de différenciation reste à prouver ( 11 J.
L'apparition de la GP j10 000, dans les effets oré-
coces, pourrait s'expliquer au regard des travaux
de HQFFMAN et Coll. 76 J. Ils ont en effet, rrlon-
tré que des concentrations d'hémine variant de 50
à 100 pM entrainent, une augmentation de l'activité
des enzymes responsables de la synthèse de l'hème,
et surtout une augmentation de l'expression des
marqueurs de surface des cellules érythroides em-
bryonnaires et foetales. DEAN et Coll. 38 J ont
montré par ailleurs, que l'accumulatton d'h~~oglo
bine lors de l'induction par des faibles concentra
tions d'hémine (12,5 ~M par exemple), est réversible
et ne s'accompa~ne pas d'une différenciation termi
nale.
Cette observation pourrait expliquer les profils
identiques des glycoprotéines, que nous obtenons
entre cellules induites par 12,5 ~M d'hémine et
cellules témoins.
23 1
Toutes ces expériences préliminaires. nous encou
ragent à rechercher par les techniques électropho
rétiques des nouveaux critères de différenciation
qui pourraient être des glycoprotéines de surface.
Les travaux de KENJI et Coll. 1 0 2 nous confor-
tent d~ns ce sens. En effet. sur les cellules de
leucé~ie myeloide de souris (~1)' en présence d'a
gents inducteurs de différenciation. ils ont mis
en évidence une GP 180 000 qui n'est présente qu'à
la surface des granulocytes et des macrophages.
Or. on sait que cette souche M1
peut se différencier
en granulocyte et en macrophage sous l'action d'a-
gents inducteurs 102 ). Cette expérience certes
encore isolée. apporte l'espoir que des a~ents
inducteurs de différenciation peuvent "normaliser"
les glycoprotéines de membrane des cellules cancé
reuses et leur faire perdre ainsi leurs principales
Dropri~tés de malignité.
CINQUIEME PARTIE
CONCLUSION GENERALE
232
Le but de ce travail était de nous doter d'une bonne
technique de fractionnement et de révélation des glyco
protéines de membrane des cellules cancéreuses cultivées
in vitro. En effet. dans un travail précédent 35
nous avons adapté et mis au point des techniques électro
phorétiques. notamment l'isoélectrofocalisation (en tube).
l'ACRY/SDS et l'électrophorèse bidimensionnelle qui couple
les deux techniques précédentes. Nous nous sommes heurtés
à d'énormes problèmes dans la révélation des glycoprotéines.
Nous utili~ons alors des techniques de coloration au P.A.S.
et au S.A. Nous nous sommes donc tournés vers des techni
ques de révélation utilisant des radioéléments.
Nous avons donc adapté et mis au point les techniques
de marquage externe à la galactose oxydase de GAHMBERG et
HAKDMDRI 57 et les techniques de révélation par auto-
radiographie ou fluorographie de BONEY et LASKEY 20).
Nous nous sommes donc attardés sur les petits détails tech
niques et oratiques que nécessitent les électrophorpses
et les procédés de révélation. Car nous nous sommes rendus
compte que la Dualité des résultats était étroitement liée
au "petit détail technique" comme par exe~ple le séchage
parfait des gels d'acrylamide, sans lequel aucune fluoro
graphie n'est possible.
Par ces différents procédés. nous avons établi le
profil général des glycoprotéines de membrane des cellules
L121D et K562.
Parallèlement. nous avons montré que des effecteurs
exogènes (~TX-~A) oouvaient entrainer des modifications
des glycoprotéines de memhrane. Ces résultats certes qua
litatifs demandent à être aporonfondis afin de pouvoir en
déterminer le retentissement biologique. et voir si cet
effet de produits anticancpreux reorésente un épiphénomène
ou au contraire s'il est ~ossible de tirer parti de cette
2 33
~ction pour essayer de sélectionnar d~autres drogues anti
cancéreuses actives sur les glycoprotéines de membranes.
Car aux troubles fonctionnels de la membrane des cellules
cancéreuses sont associées de profondes altérations des
glycoprotéines membranaires. Et selon WARREN et VAN BEEK
(201,1951 la seule anomalie associée de façon permanente au
pouvoir oncogène des cellules malignes se situe au niveau
de certaines structures glycanniques N-glycosidiques des
glycoprotéines membrônaires.
Avec la K562 qui est une lignée humaine, nous avons
abordé le problème de la place des glycoprotéines de mem
brane dans les phénomènes de différenciation. Les résultats
exposés dans ce travail ne représentent qu'un "coup de
sonde" 'dans ce nouvel axe de recherche. En effet, avec
l'hémine utilisé comme modèle tyoe d'agent inducteur de
différenciation. nous avons montré que la souche K562 dont
noUs disposons. synthétise de l'hémoglobine. Parallèlement
on observe des modifications dans le profil des glycopro
téines. Des travaux sont en cours pour affiner le modèle
d'étude et pour essayer de s~lectionner des drogues anti
cancéreuses, qui en plus de leur impact sur 185 glycooro
téines membranaires, aurôient des effets différenciants.
Car WARREN et BUCK 2001 pensent que si une drogue pou-
rait "normaliser" les glycoprotéines membranaires, elle
"normaliserait" ainsi les cellules cancéreuses.
Cette nouvelle approche de l'action des mpdicaments
anticancéreux est réconfortante pour l'esorit, car on ne
chercherait plus ~ tuer la cellule mais à la rendre
" no r mal e" ~T 'c" par la on éviterait les limites actuelles de
la chimiothéraoie, dues aux effets cytotoxiques vis-à-vis
des cellules normales de l'organisme.
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