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Biochimie des protéines membranaires ou l’importance de
la bonne concentration de détergent
Atelier « cristallisation des protéines membranaires »Carry le Rouet 26-29 Novembre 2007
Plan
0. Rappels
• Solubilisation des membranes
• Stabilité des protéines membranaires en détergent
• Liaison et échange de détergent
• Concentration de protéine et de détergent
• Les détergents dans les cristaux
0. La Concentration Micellaire Critique
a
a
b
b
c
c
Detergent phenomena in membrane protein crystallisation. (1991) M. Zulauf
0. Comment manipuler les protéines membranaires en solution?
??
Agrégation du fait de "l'effet hydrophobe"
0. La bouée de détergent autours de la protéine
Pebay-Peyroula et al. (1995) Structure 3,1051 Penel et al. (1998). Biochimie 80, 543
1. Solubilisation d'une membrane par un détergent
III. Solubilisation totale de la membrane
I. Partition du détergent dans la membrane II. Solubilisation sélective de lipides puis de protéines
OG
CholateTX100
1,25mM lip
10mM lip
5mM lip
2,5
1,25
[Detsat] = Dw + Rsat[lip]
[Detsol] = Dw + Rsol[lip]TX100 OG Cholate
cmc (mM) 0,18 18 3Rsat 0,64 1,3 0,3Rsol 2,5 3,6 0,9Dw (mM) 0,18 17 2,8/3,7K (mM-1) 3,5 0,09 0,11
1. Solubilisation d'une membrane par un détergent
Paternostre et al., 1988 Biochem. 27, 2668
détergent àcmc élevée
(e.g. CHAPS,cholate,octylglucoside,MEGA-8…)
cmc du cholatedans l’eau: 9-15 mM,P ≈ 103
détergent àfaible cmc
(e.g. Tween 20,Triton X-100,dodecylmaltoside,Lubrol PX…)
cmc du Lubrol PX~0.1 mM,P ≈ 5.105
Détergent
lipides 1 g/l
conditions standard
X = 0.1
X = 0.1
[détergent]tot = 5.7 mM[détergent]eau = 5.56 mM(97.5% dans l’eau)
[détergent]tot = 0.15 mM[détergent]eau = 11 µM(7% dans l’eau)
lipides 2 g/l
2 fois plus de lipides
X = 0.098
X = 0.052
[détergent]tot = 5.7 mM[détergent]eau = 5.42 mM
[détergent]tot = 0.15 mM[détergent]eau = 5.8 µM
lipides 0.5 g/l
2 fois plus de tampon
X = 0.051
X = 0.093
[détergent]tot = 2.85 mM[détergent]eau = 2.8 mM
[détergent]tot = 0.077 mM[détergent]eau = 10 µM
Diapo de JL Popot
2. Biochimie des protéines membranaires
Gradient de saccharose
Diverses colonnes (échange d'ions, affinité, tamis moléculaire…)
Méthodes de purification classiques :
Gels d'acrylamide dénaturants, natifs,
d'isoélectrofocalisation...
Etudes fonctionnelles en détergent
Reconstitution dans des membranes pour études fonctionnelles
Cristallisation (3D, 2D)
Une fois solubilisé, le complexe protéine/détergent se manipule comme une protéine soluble. Mais il faut TOUJOURS être en présence de détergent au-dessus de
sa CMC.
Perte d'un cofacteur stabilisateur(lipides, sous-unités, groupes
prosthétiques…)
Perturbation directe de la région transmembranaire de la protéine
2. Mécanismes moléculaires de l'inactivation de protéines par les détergents
détergent
lipideProtéine active
Protéine inactive
2. Les différents détergents ne sont pas équivalents
Gel natif 2D Digitonine/DDM
3ième dim. gel SDS : sép. des sous-unités de chaque complexe
Isolation de "supercomplexes" de mitochondrie
2. Exemple : la purification du b6 f en DDM (cmc = 0.17mM)
Solubilisation des membranes à 4,5mg/ml lip en 12mM DDM
Colonne d’échangeuse d’anions (pour délipider un peu et améliorer la fixation sur la colonne Ni) : équilibre en 1mM DDM,
lavage et élution en 0.5mM DDM
Colonne Ni : Equilibration, lavage et élution en 0.2mM DDM
Dessalage en 0.2mM DDM
Cristallisation en 0.2mM DDM
0.2 mM dodecylmaltoside
3 mM dodecylmaltoside
Rieske
bas haut
bas hautBreyton et al., J. Biol. Chem. 272:21892 (1997)
dimère actif
chlorophylle libre + Rieske
monomère inactif
2. Sensibilité du b6 f au détergent
2. Purif de FhuA
Cassage des cellules par Presse de FrenchCentri basse vitesse pour virer les cellules non casséesCentri haute vitesse pour récupérer les mbs (interne et externe) Solubilisation à 2% OPOE : solubilise la mb interneCentri pour récupérer la mb externeSolubilisation 1% LDAO, 2%OG, ou 0,5%DDMColonne d’affinité 0,1% LDAO lavage extensif pour délipider,Colonne d’échange d’anions 0,05% LDAO (cmc = 0,023%)
LPS 2 ug, fractions Q
2. Exemple de la Na,K-ATPase
cmc = 20mM
cmc = 3-20mM
cmc = 0,02mMcmc = 1-5mM
Brotherus et al., 1979Biochem 18, 5043
incub. 10-15 minincub. 1 semaine
3. Détermination de la quantité de détergent lié par chromatographie
Gel de silice (3000SW) Superose 620mM Tes pH7
100 mM NaCl
1mM DDM
0.08g/g lipids(11-12mol/mol)
0.92g/g DDM/prot
0.8g/g DDM qd délipidé.
Moller et le Maire (1993) JBC 268
3. Attention si on passe en dessous de la cmc!0,14mM0,18mM
Chromato à 0,18mM DDM (= cmc)
0,89 (0,92) g DDM/g prot
0,04-0,05 g lip/g prot (6-7 mol/mol)
Chromato à 0,14mM DDM
0,7 (0,65)g/g monomère
0,4 (0,5) g/g oligomères
0,04-0,05 g/g lip (6-7 mol/mol)
Dépôt : Ca2+ATPase délipidée en 1,8mM DDM
Moller et le Maire (1993) JBC 268
3. Quelle concentration de détergent utiliser ?
Basse cmc Haute cmcEx. DDM, cmc = 0,17 mM3 cmc = 0,51 mM, 0,34mM de det sous forme de micelles
Ex. OG, cmc = 20 mM3 cmc = 60 mM, 40mM de det sous forme de micelles
[Prot] = 5μM, ~ 150 det/prot => 750 μM de det lié
Basse cmc Haute cmcEx. DDM, cmc = 0,17 mM3 cmc = 0,51 mM, 0,34mM de det sous forme de micelles
Ex. OG, cmc = 20 mM3 cmc = 60 mM, 40mM de det sous forme de micelles
[Prot] = 5μM, ~ 150 det/prot => 0,75 mM de det lié
3. Quelle concentration de détergent utiliser ?
Basse cmc Haute cmcEx. DDM, cmc = 0,17 mM3 cmc = 0,51 mM, 0,34mM de det sous forme de micelles
Ex. OG, cmc = 20 mM3 cmc = 60 mM, 40mM de det sous forme de micelles
[Prot] = 5μM, ~ 150 det/prot => 0,75 mM de det lié
NE PAS RAISONNER EN "xCMC" MAIS EN CONCENTRATION AU DESSUS DE LA CMC
3. Quelle concentration de détergent utiliser ?
4. Concentration de la protéine par ultrafiltration = concentration du détergent
1. Bien choisir le MWCO
2. La taille de la micelle peut varier : micelles + lipides plus grosses => concentration des micelles
3. Bien entendu, le détergent lié à la protéine est concentré avec la
protéine
La membrane de filtration laisse passer les monomères de détergent, le problème se pose pour la micelle!MMicelle DDM ~ 50 000 Da (mais agrégat dynamique)
4. Concentration de la protéine par ultrafiltration = concentration du détergent
1. Bien choisir le MWCO
2. La taille de la micelle peut varier : micelles + lipides plus grosses => concentration des micelles
3. Bien entendu, le détergent lié à la protéine est concentré avec la
protéine
Il est très difficile de connaître [det] après concentration => toujours
faire la même chose…
La membrane de filtration laisse passer les monomères de détergent, le problème se pose pour la micelle!MMicelle DDM ~ 50 000 Da (mais agrégat dynamique)
1. 2. 3.
4. Taille d’une micelle
Manip de SEC
Vm Vt
Ve = 1,47 ml => Rs = 3,3 nm (courbe de calibration)
Chromatographie d’exclusion de taille (ou tamis moléculaire), superose 12 :injection de 10μl de 20mM DDMtampon de colonne : 20mM Tris pH 8, 250mM NaCl, 0,2mM DDMNagg = 98 monomère dans une micelle
Données F. Lebaupain
4. Concentration de la protéine par ultrafiltration = concentration du détergent
daCosta and Baezinger (2002) Acta Cryst D
QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)
sont requis pour visionner cette image.
0.1 0.5%LDAO
FhuA0.1%
FTav apconcent
cmc LDAO = 0.023%
5. Méthode de cristallisation 3D :Diffusion de vapeur
Agent cristallisant [+++]
goutte pendante2-10 μl
ProtéineAgent cristallisant [+]
Méthode de la goutte suspendue
[agent cristallisant][p
roté
ine]
précipitation
nucléation
zone métastable
Diapo de D. Picot
5. Diagrammes de phase de la cristallisation de protéines membranaires
[agent cristallisant]
[pro
téin
e]
Protéine Détergent
[agent cristallisant]
cmc
[dét
erge
nt]
L1’ + L1’’
L1
M
précipitation
nucléation
zone métastable
Diapo de D. Picot
5. Rôle du détergent dans la formation des cristaux
QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)
sont requis pour visionner cette image.
QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)
sont requis pour visionner cette image.
C10DAO
OG
Pebay-Peyroula et al. (1995) Structure 3,1051
Penel et al. (1998). Biochimie 80, 543