Estudos espectroscópicos dos complexos európio-tetraciclinas e

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES

Autarquia associada à Universidade de São Paulo

ESTUDOS ESPECTROSCÓPICOS DOS COMPLEXOSEURÓPIO-TETRACICLINAS E SUAS APLICAÇÕES NA DETECÇÃO

DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E PERÓXIDO DE URÉIA

ANDREA NASTRI GRASSO

Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear – Materiais.

Orientadora: Profa. Dra. Lilia Coronato Courrol

SÃO PAULO2010

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer minha orientadora Lilia C. Courrol, minha família por

sempre apoiar as minhas escolhas e especialmente minha amiga Luciane S. Teixeira

por tornar esta etapa mais fácil.

ESTUDOS ESPECTROSCÓPICOS DOS COMPLEXOS EURÓPIO-

TETRACICLINAS E SUAS APLICAÇÕES NA DETECÇÃO DE

PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E PERÓXIDO DE URÉIA

Andrea Nastri Grasso

RESUMO

Neste trabalho foram estudadas as propriedades espectroscópicas do íon

európio trivalente complexado à componentes da família das tetraciclinas, a

clorotetraciclina, oxitetraciclina e metaciclina, em presença de peróxido de hidrogênio

e peróxido de uréia. Para isso foram obtidos os parâmetros ópticos de absorção,

emissão, tempo de vida e construídas curvas de calibração para os espectros de

luminescência. Realizaram-se experimentos com compostos inorgânicos juntamente

com os complexos a fim de verificar a interferência dos mesmos. Também foram

realizados estudos para determinação de glicose utilizando os complexos európio-

tetraciclinas como biossensor. Os resultados mostram que os complexos európio-

tetraciclinas apresentam um espectro de emissão bem definido na região do visível

e, na presença de peróxido de hidrogênio ou peróxido de uréia, há um aumento

sensível na luminescência e tempo de decaimento. Assim, os complexos európio-

tetraciclinas estudados podem ser utilizados como biossensores para determinação

dos peróxidos de hidrogênio e uréia, sendo um método realizado em temperatura

ambiente, direto e de baixo custo. Um método indireto para determinação de glicose

foi estudado através da adição da enzima glicose oxidase aos complexos európio-

tetraciclinas na presença de glicose no qual há como produto o peróxido de

hidrogênio.

Palavras-Chave: európio; tetraciclina; peróxido de hidrogênio; peróxido de uréia;

glicose.

SPECTROSCOPIC STUDIES OF EUROPIUM-TETRACYCLINES

COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS IN DETECTION

OF HYDROGEN PEROXIDE AND UREA PEROXIDE.

Andrea Nastri Grasso

ABSTRACT

In this work were studied the spectroscopic properties of trivalent europium ion

complexed with components of tetracycline family, chlorotetracycline, oxytetracycline

and metacycline, in the presence of hydrogen peroxide and urea peroxide. Optical

parameters were obtained such as absorption, emission, lifetime and calibration

curves were constructed for luminescence spectra. Experiments were carried out with

both inorganic compounds and europium-tetracyclines complexes in order to verify

possible interferences. Studies for glucose determination were also described using

europium-tetracyclines complexes as biosensors. Results show that europium-

tetracyclines complexes emit a narrow band in the visible region and, in the presence

of hydrogen peroxide or urea peroxide there is a greater enhancement in their

luminescence and lifetime. Thus, europium-tetracyclines complexes studied can be

used as biosensors for hydrogen and urea peroxides determination as a low cost and

room temperature method. An indirect method for glucose determination was studied

by adding glucose oxidase enzyme in europium-tetracyclines complex in the

presence of glucose promoting as product hydrogen peroxide.

Key-words: europium; tetracycline; hydrogen peroxide; urea peroxide; glucose.

SUMÁRIO

Página

INTRODUÇÃO.............................................................................................................11

OBJETIVOS.................................................................................................................13

REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................................14

1.1 Lantanídeos ............................................................................................................ 14

1.2 Európio ................................................................................................................... 15

1.3 Tetraciclina ............................................................................................................. 18

1.4 Complexo EuTC ..................................................................................................... 19

1.5 Peróxido de Hidrogênio .......................................................................................... 23

1.6 Peróxido de Uréia .................................................................................................. 25

1.7 Glicose ................................................................................................................... 26

MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................29

1.8 Reagentes e Solventes .......................................................................................... 30

1.9 Preparação das amostras ...................................................................................... 31

RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................34

1.10 Estudos dos Reagentes e Complexos Európio-Tetraciclinas .............................. 34

1.11 Determinação das curvas de calibração .............................................................. 38

1.11.1 Complexos EuTC-PH ........................................................................................ 39

1.11.2 Complexos EuTC-PHU ..................................................................................... 48

1.12 Tempo de Vida ..................................................................................................... 54

1.13 Interferentes ......................................................................................................... 60

1.13.1 Complexos EuTC-PH ........................................................................................ 60

1.13.2 Complexos EuTC-PHU ..................................................................................... 62

1.14 Complexos EuTC com Glicose ............................................................................ 64

CONCLUSÕES............................................................................................................72

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................75

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Métodos para determinação de peróxido de hidrogênio4,52,............25

Tabela 2 - Valores de glicemia para diagnóstico de diabetes melito60...............26

Tabela 3- Amostras do complexo európio tetraciclinas........................................31

Tabela 4 - Valores de referência dos componentes inorgânicos estudados......32

Tabela 5 – Deslocamento dos picos de absorção e emissão dos complexos EuOTc, EuCTc e EuMTc............................................................................................38

Tabela 6 - Razões molares do EuTC na presença de PH que obtiveram emissão com maior intensidade..............................................................................................41

Tabela 7 - Razão molar do EuTC na presença de PHU que obteve emissão com maior intensidade.......................................................................................................49

Tabela 8 - Razão Molar das amostras de EuTC para estudo de tempo de vida..55

Tabela 9 – Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida dos complexos EuTc, EuTc-PH e EuTc-PHU......................................................................................56

Tabela 10 - Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida dos complexos EuOTc, EuOTc-PH e EuOTc-PHU.............................................................................57

Tabela 11 - Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida dos complexos EuCTc, EuCTc-PH e EuCTc-PHU..............................................................................58

Tabela 12- Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida dos complexos EuMTc, EuMTc-PH e EuMTc-PHU.............................................................................59

Tabela 13 – Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida do complexo EuTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox...................69

Tabela 14 - Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida do complexo EuCTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox................70

Tabela 15 - Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida do complexo EuOTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox................71

Tabela 16 – Resumo dos resultados obtidos nos estudos com peróxido de hidrogênio e peróxido de uréia................................................................................72

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Diagrama de energia do Európio16.......................................................16

Figura 2 – Estrutura química das tetraciclinas22...................................................18

Figura 3 - Mecanismo de emissão de fluorescência de complexos de Eu3+, sendo S0, S1 e T1 estado singleto fundamental, estado singleto excitado, e estado tripleto, respectivamente48..........................................................................21

Figura 4 - Proposta de estrutura para o complexo Eu-Tc.....................................23

Figura 5 – Espectofotômetro Fluorolog 3................................................................29

Figura 6 – Estrutura do ácido propanosulfônico 3-(N-morfolino) ou MOPS.......34

Figura 7 - Espectro de absorção óptica do tampão MOPS, íon európio em solução MOPS, solução-mãe PH e solução-mãe PHU...........................................34

Figura 8 - Espectro de absorção óptica: (a) complexo EuOTc e OTc, (b) complexo EuCTc e CTc, (c) complexo EuMTc e MTc............................................35

Figura 9 - (a) Espectro de emissão óptica das soluções de OTc e do íon európio. (b) Emissão óptica do complexo EuOTc em diversas razões molares........................................................................................................................36

Figura 10 - (a) Espectro de emissão óptica da solução CTc. (b) Emissão óptica do complexo EuCTc em diversas razões molares.................................................37

Figura 11 - (a) Espectro de emissão óptica da solução MTc. (b) Emissão óptica do complexo EuMTc em diversas razões molares.................................................37

Figura 12 - Espectro de absorção óptica dos complexos (a)EuOTc, (b)EuCTc, (c)EuMTc, em diferentes concentrações molares, com e sem PH.......................40

Figura 13 - Espectro de emissão dos complexos: (a) EuOTc-PH, (b) EuCTc-PH, (c) EuMTc-PH, em diferentes concentrações molares EuTC................................41

Figura 14 – (a) Espectro de emissão (b) e curva de calibração do complexo 3Eu:1Tc-PH.................................................................................................................43

Figura 15 – (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração complexo 4Eu:1CTc-PH...............................................................................................................44

Figura 16 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 4Eu:1OTc-PH..............................................................................................................46

Figura 17 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 2Eu:1MTc-PH..............................................................................................................47

Figura 18 - Espectro de absorção óptica dos complexos (a)EuOTc, (b)EuCTc, (c)EuMTc, em diferentes concentrações molares sem PHU e com PHU.............48

Figura 19 - Espectro de emissão dos complexos (a) EuOTc-PHU, (b) EuCTc-PHU, (c) EuMTc-PHU, em diferentes concentrações molares de EuTC...............49

Figura 20 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 3Eu:1Tc-PHU...............................................................................................................50

Figura 21 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 4Eu:1OTc-PHU............................................................................................................51

Figura 22 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 3,5Eu:1CTc-PHU.........................................................................................................52

Figura 23 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 1,5Eu:1MTc-PHU.........................................................................................................53

Figura 24 – Tempo de vida dos complexos EuTc, EuTc-PH e EuTc-PHU............56

Figura 25 - Tempo de vida dos complexos EuOTc, EuOTc-PH e EuOTc-PHU....57

Figura 26 - Tempo de vida dos complexos EuCTc, (a) EuCTc-PHU e (b)EuCTc-PH.................................................................................................................................58

Figura 27 - Tempo de vida dos complexos EuMTc, (a) EuMTc-PH e (b) EuMTc-PHU..............................................................................................................................59

Figura 28 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuTc, EuTc-PH e dos complexos EuTc-PH na presença de interferentes................................................................................................................61

Figura 29 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuOTc, EuOTc-PH e dos complexos EuOTc-PH na presença de interferentes................................................................................................................61

Figura 30 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuCTc, EuCTc-PH e dos complexos EuCTc-PH na presença de interferentes................................................................................................................62

Figura 31 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuTc, EuTc-PHU e dos complexos EuTc-PHU na presença de interferentes................................................................................................................63

Figura 32 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuOTc, EuOTc-PHU e dos complexos EuOTc-PHU na presença de interferentes................................................................................................................63

Figura 33 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuCTc, EuCTc-PHU e dos complexos EuCTc-PHU na presença de interferentes................................................................................................................64

Figura 34 - Emissão dos complexos EuOTc e EuCTc, acrescidos de glicose nas concentrações de 50, 100 e 200 mg/dL....................................................................64

Figura 35 - Emissão e curva de calibração dos complexos EuTc-Glicose-Gox, variando a concentração de glicose nas amostras. Excitação em 400 nm.........66

Figura 36 - Emissão e curva de calibração dos complexos EuOTc-Glicose-Gox, variando a concentração de glicose nas amostras. Excitação em 390 nm.........67

Figura 37 - Emissão e curva de calibração dos complexos EuCTc-Glicose-Gox, variando a concentração de glicose nas amostras. Excitação em 390 nm.........68

Figura 38 – Tempo de vida do complexo EuTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox.......................................................................................69

Figura 39 - Tempo de vida do complexo EuCTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox..................................................................................70

Figura 40 - Tempo de vida do complexo EuOTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox..................................................................................71

LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SIGLAS

Eu Európio

EuCTc Complexo Európio-Clorotetraciclina

EuMTc Complexo Európio-Metaciclina

EuOTc Complexo Európio-Oxitetraciclina

EuTC Complexo Európio e um componente da família da Tetraciclina

EuTc Complexo Európio-Tetraciclina

Gox Glicose Oxidase

MOPS Ácido propanosulfônico 3-(N-morfolino)

MTc Metaciclina

OTc Oxitetraciclina

PH Peróxido de Hidrogênio

PHU Peróxido de Uréia

pH Potencial Higrogeniônico

Tc Tetraciclina

11

INTRODUÇÃO

As propriedades ópticas de complexos de íons lantanídeos vem sendo

estudadas desde 1941, sendo íon európio um dos lantanídeos de maior interesse1.

A emissão por excitação direta do íon európio é pouco eficiente. Porém

quando ligado a outras moléculas, há a formação de um complexo cuja

luminescência torna-se mais intensa e a banda de emissão mantém-se bem definida,

característica dos íons lantanídeos. Este fenômeno chama-se “efeito antena”, onde o

ligante absorve a radiação incidente transferindo-a para o íon európio (transferência

de energia intramolecular). Como resultado ocorre um aumento da luminescência,

grande deslocamento Stokes (ampla banda de absorção, com pico em torno de 400

nm e emissão em torno de 615 nm) e o aumento no tempo de decaimento2.

As tetraciclinas são uma família de antibióticos extensivamente utilizados com

amplo espectro de ação. São fortes agentes quelantes, complexando-se facilmente

com íons metálicos, como o íon európio3.

A emissão do complexo európio-tetraciclina (EuTC) é fortemente dependente

das características da solução, tais como presença ou ausência de peróxido de

hidrogênio e peróxido de uréia.

O peróxido de hidrogênio (PH) é um poderoso oxidante, vastamente utilizado

em indústrias especialmente para clareamento, limpeza e desinfecção podendo ser

liberado no meio ambiente, logo a importância da sua detecção. Além disso, é

produto de diversas reações metabólicas do nosso organismo possibilitando a

detecção indireta dos seus produtos4. Já o peróxido de uréia é um agente citotóxico e

seu aumento no organismo está relacionado à problemas renais5.

Na presença de peróxido de hidrogênio, o complexo EuTC fluorescente, se

transforma no complexo EuTC-PH altamente fluorescente. Com adição de pequenas

quantidades de peróxido de hidrogênio ocorre um aumento de até 15 vezes na

intensidade da banda de emissão do európio em torno de 615 nm, em solução com

pH neutro. O tempo de vida do európio no complexo EuTC-PH aumenta para ~60

12

microssegundos decorrente de uma redução da supressão da luminescência por

transferência de energia intramolecular 6. Efeitos semelhantes ocorrem na formação

de complexos EuTC com peróxido de uréia7.

Tais características proporcionam às medidas de emissão e tempo de vida,

alta sensitividade, alta sensibilidade e especificidade na detecção de peróxido de

hidrogênio, peróxido de uréia e glicose, esta substrato de reações catalisadas por

oxidases produzindo PH. O complexo EuTc é de fácil síntese, opera em pH neutro,

apresenta alta estabilidade e baixo custo. É frequentemente estudado devido ao seu

alto potencial em aplicações nas áreas da biomedicina, indústria e meio ambiente6.

Neste trabalho estudamos alguns dos componentes da família da tetraciclina

(oxitetraciclina, clorotetraciclina e metaciclina) na formação do complexo com o íon

európio, assim como estes complexos em presença do peróxido de hidrogênio e

peróxido de uréia.

13

OBJETIVOS

Caracterização e estudo espectroscópico dos complexos európio-

clorotetraciclina, európio-metaciclina e európio-oxitetraciclina na presença de

peróxido de hidrogênio (EuTC-PH) e peróxido de uréia (EuTC-PHU). Obtenção dos

espectros de emissão e curvas de tempo de vida do európio em função do aumento

de concentração dos peróxidos. Obtenção das curvas de calibração. Estudos de

interferentes inorgânicos. Estudo de detecção de glicose. Verificação da

possibilidade de utilização dos complexos como biossensores de peróxido de

hidrogênio, peróxido de uréia e glicose.

14

REVISÃO DA LITERATURA

1.1 Lantanídeos

A série do lantânio é formada por um conjunto de 15 elementos químicos com

números atômicos de 57 (lantânio) ao 71 (lutécio). Os lantanídeos correspondem aos

elementos da série que contém elétrons na camada 4f, ou seja, do cério ao lutécio.

Juntamente com o escândio (Sc) e ítrio (Y) são conhecidos como terras raras e

possuem propriedades físicas e químicas muito semelhantes. Apesar da

denominação “raras”, estes elementos não são incomuns, exceto pelo promécio que

não ocorre na natureza. O túlio que é o elemento menos abundante na crosta

terrestre é encontrado mais facilmente que a prata, arsênio, mercúrio, cádmio e

selênio8,9.

A aplicação dos lantanídeos se estende a diversas áreas, como por exemplo,

na fabricação de laser, em reações de catálise e como materiais luminescentes.

Também são muito estudados em sistemas biológicos devido às suas propriedades

espectroscópicas e magnéticas, sendo utilizados como traçadores biológicos e

agentes de contraste em RMN (ressonância magnética nuclear)8,9.

A semelhança das propriedades químicas e físicas dos lantanídeos decorre da

sua configuração eletrônica. Todos os átomos neutros derivam da configuração do

gás nobre xenônio (Xe) seguida do preenchimento sequencial da camada 4f. Assim,

os lantanídeos possuem o orbital 6s2 e um preenchimento do nível 4f variável

apresentando a seguinte distribuição eletrônica: [Xe] 6s2 4fn 5d0-1, com n variando de

1 até 14. A camada 4f é interna, sendo blindada pelas camadas mais externas 6s e

5d10.

Os íons lantanídeos mais estáveis encontram-se no estado trivalente (3+).

Neste caso há a perda de 2 dos elétrons 6s e o elétron 5d (ou um elétron 4f caso não

exista elétron 5d), e a camada 4f permanece blindada pelos orbitais 5p e 5s.

15

Nos compostos com estes íons trivalentes a luminescência em geral, é devida

às transições f-f. Os elétrons 4f são internos sendo fracamente afetados pelo campo

dos ligantes, as propriedades eletrônicas são pouco afetadas pelo ambiente químico

e assim as transições ópticas são geralmente muito finas. Essas transições f — f são

proibidas (regra de Laporte) resultando em baixo coeficiente de absorção e taxa de

emissão, logo, suas transições ópticas são geralmente caracterizadas por bandas

finas de emissão e tempos de vida longos, de microssegundos a milissegundos. A

variação do ambiente do íon apenas causa pequenos desdobramentos nos níveis de

energia e nas intensidades relativas das bandas11,12. Outro fator interessante é o

grande deslocamento Stokes (deslocamento entre comprimento de onda de

excitação e emissão)13 .

O espectro de emissão dos lantanídeos trivalentes ocorre nas regiões do visível

e infravermelho próximo. Por exemplo, o íon európio trivalente é um forte emissor em

aproximadamente 615 nm na região do vermelho e o térbio trivalente emite na região

do verde. Em nossos estudos o íon európio foi o lantanídeo escolhido.

1.2 Európio

O európio é um elemento químico de símbolo Eu, número atômico 63 e peso

atômico 151,96 g. Juntamente com o térbio é dos lantanídeos que possuem maior

capacidade de emissão, por isso as propriedades do íon európio são muito

estudadas14.

Os níveis envolvidos nas transições radiativas são não-degenerados15. O

estado emissivo de energia mais baixo, 5D0, é 17.250 cm-1 acima do estado

fundamental16 (Figura 1).

16

Figura 1 – Diagrama de energia do Európio16.

A luminescência por excitação direta do íon európio é pouco eficiente, pois não

têm absortividade molar alta. Porém, quando ligado a outras moléculas formando um

complexo, a luminescência torna-se forte e apresenta uma banda de emissão bem

definida, característica dos íons lantanídeos.

Um complexo ou composto de coordenação é formado quando um íon metálico

central se combina com um grupo de moléculas vizinhas doadoras de um par de

elétrons que são compartilhados entre ambas as espécies químicas. As moléculas

que circundam o íon metálico são chamadas de ligantes e a quantidade de átomos

ligados diretamente ao íon central é denominada número de coordenação. Nos

casos em que um cátion metálico liga-se a uma molécula com duas ou mais ligações

coordenadas o complexo resultante é chamado de quelato e o ligante referido como

agente quelante ou ligante polivalente17.

Desta forma, usa-se um agente quelante para absorver a luz transferindo esta

energia para o íon lantanídeo, que emite de acordo com sua luminescência

17

característica8. Este processo de transferência de energia intramolecular entre o

ligante orgânico e o íon lantanídeo é conhecido como efeito antena12,18.

A intensidade da luminescência dos íons lantanídeos é principalmente

influenciada pela desativação não-radiativa (supressão) do estado excitado do

lantanídeo e da capacidade do estado excitado tripleto do ligante transferir a energia

ao nível de emissão do lantanídeo. Fatores estes que dependem da natureza do

ligante e íon assim como do meio em que se encontram19.

Quando em solução, a emissão do európio pode ser inibida por grupos OH, NH

e CH. O íon európio apresenta de 8 a 9 sítios de coordenação. O encapsulamento

dos íons por agentes quelantes pode aumentar a luminescência e tempo de vida do

complexo15,20.

A luminescência e tempo de vida destes complexos em solução está

diretamente relacionada com o número de moléculas de água coordenadas ao íon

metálico. Devido à eficiente transferência de energia entre o nível de ressonância do

íon e o grupo OH, o tempo de vida decresce linearmente conforme o aumento da

quantidade de moléculas de água coordenadas3.

Em nosso trabalho utilizaremos como ligantes a oxitetraciclina, clorotetraciclina

e metaciclina (compostos da família da tetraciclina) por serem fortes agentes

quelantes22.

18

1.3 Tetraciclina

As tetraciclinas (TCs) são uma família de antibióticos descoberta no final dos

anos 40. Sua estrutura básica consiste em um núcleo hidronaftaceno com 4 anéis

fundidos3 (Figura 2).

R1 R2 R3 R4Tetraciclina H CH3 OH HClorotetraciclina Cl CH3 OH HOxitetraciclina H CH3 OH OHMetaciclina H CH2 - OH

Figura 2 – Estrutura química das tetraciclinas22.

Possuem ação bacteriostática em concentrações terapêuticas e amplo

espectro de atividade incluindo bactérias aeróbias e anaeróbias, Gram-positivas,

Gram-negativas, espiroquetas, micoplasmas, riquétsias, clamídias e alguns

protozoários. Atuam inibindo a síntese protéica bacteriana devido à sua capacidade

de ligação aos ribossomos microbianos impedindo a ligação da aminoacil-tRNA aos

mesmos21,22.

Devido ao relativo baixo custo e segurança do ponto de vista terapêutico, as

tetraciclinas são extensivamente utilizadas em terapias de infecções bacterianas

humanas e medicina veterinária, assim como em criadouros de animais para

produção de carne, peixes e laticínios23.

19

Os principais eventos adversos consistem em fototoxicidade, distúrbios

gastrointestinais, reações alérgicas em indivíduos mais sensíveis, e, por serem

agentes quelantes, as tetraciclinas podem se fixar ao cálcio depositando-se nos

ossos e dentes em formação, provocando manchas e, em casos mais graves,

hipoplasia dentária e deformidades ósseas. O uso irracional de antibióticos assim

como o seu consumo em alimentos em baixas doses por um longo período de tempo

pode promover e disseminar a resistência bacteriana. Assim os resíduos destes

medicamentos, tetraciclinas inclusive, são rotineiramente monitorados24,25.

As tetraciclinas possuem vários possíveis locais de ligação, logo, formam

facilmente complexos metálicos, sendo seu mecanismo de ação nos fluidos

biológicos fortemente dependente da presença de íons metálicos 26. Os sítios de

complexação incluem o sistema beta-dicetona (posições 11 e 12), os grupos enol

(posições 1 e 3) e carboxiamida (posição 2)22.

Em nossos estudos, comparamos a oxitetraciclina, clorotetraciclina e

metaciclina com a tetraciclina na formação dos complexos na presença de peróxido

de hidrogênio e peróxido de uréia. Espera-se observar variação da emissão do

európio, com a mudança estrutural, na formação de complexos. Isto porque a

variação da estrutura acarreta em mudança de sítios de ocupação do európio. Em

solução aquosa as possíveis ligações do íon európio ocorrem nos radicais OH dos

anéis B e A e no nitrogênio do grupo CH3 do anel A. A diferença entre a tetraciclina e

a oxitetraciclina está no radical R4 que é um H no caso da tetraciclina e um OH no

caso da oxitetraciclina. No caso da clorotetraciclina o radical R1 é substituído por

cloro. Já na metaciclina não existe o grupo OH no radical R3.

1.4 Complexo EuTC

As características espectroscópicas de complexos formados pelo íon európio

trivalente com ligantes orgânicos são estudadas desde 19411. Desde então já era

20

observada a importante propriedade destes complexos em absorver radiação

próximo ao ultravioleta através do ligante orgânico, a transmissão desta energia para

o európio (chamada transferência de energia intramolecular) com emissão

característica do lantanídeo.

Em 1961 foi proposto que este fenômeno ocorre devido ao aumento da

população do estado vibracional do quelato, transferência de energia do estado

tripleto para o nível 4f de menor energia do íon e transição radioativa para o estado

fundamental resultando em uma banda de emissão bem delimitada27,28.

Em 1982 Richardson29 observou experimentalmente as propriedades

espectroscópicas do íon európio trivalente concluindo que o íon metálico possuía

boas características para ser utilizado como biossensor. Através da complexação do

európio com um ligante orgânico observou a transferência de energia do ligante para

o európio (transferência intramolecular) com aumento da luminescência.

No ano seguinte Hirschy e colegas2,30 estudaram a formação do complexo

Európio-Tetraciclina (EuTc). Enquanto o complexo apresentava um amplo espectro

de absorção, similar ao do ligante orgânico, o espectro de emissão era formado por

uma banda estreita e bem definida, característica das transições 4f dos íons

lantanídeos, com aumento da luminescência e tempo de vida.

Assim, no quelato a energia é absorvida através da tetraciclina e é transferida

através de um efeito antena para o íon európio, que emite parte desta energia em

uma banda característica do lantanídeo 31. Os mecanismos de fluorescência do

complexo EuTc são o resultado de diversos processos como mostrado na Figura 3

(diagrama de Jablonski).

21

Figura 3 - Mecanismo de emissão de fluorescência de complexos de Eu3+, sendo S0, S1 e T1 estado singleto fundamental, estado singleto excitado, e estado tripleto,

respectivamente48.

Na excitação, a tetraciclina absorve a energia fornecida por uma fonte externa

e é elevada do estado singleto fundamental (S0) para qualquer um dos estados

vibracionais do primeiro estado singleto excitado (S1). Em muitos casos há um

relaxamento para o estado vibracional S1 de menor energia por conversão interna,

um decaimento não radioativo. Novamente, através de um processo não radiativo de

cruzamento intersistema (ISC – intersystem crossing), ocorre o decaimento de S1

para o primeiro estado tripleto T1. Então ocorre a transferência de energia

intramolecular do estado tripleto do ligante orgânico para o íon európio trivalente,

com nível de energia mais baixo que o nível T1. Assim o Eu3+ é excitado, de onde

partem múltiplas emissões provenientes das transições eletrônicas 5D0 → 7FJ (J = 0,

22

1, 2, 3, 4) e 5D1 → 7FJ (J = 1, 2, 3, 5, 6). As transições mais intensas são 5D0 → 7F2 e

5D0 → 7F1 em torno de 610-660 nm e 585-600 nm, respectivamente 32,33.

Devido à dissipação de energia durante os processos de conversão interna,

conversão intersistema e transferência de energia intramolecular a energia emitida

pelo lantanídeo é muito diferente da energia de excitação. Assim, há um grande

deslocamento entre os espectros de absorção e emissão (deslocamento Stokes). No

complexo EuTc o deslocamento é de aproximadamente 220 nm (absorção ~395 nm

e emissão ~615 nm), característica que pode ser aplicada para evitar a sobreposição

entre os espectros de excitação e de emissão do próprio fluoróforo ou a emissão da

matriz biológica.

Outra propriedade interessante é a estreita banda de emissão. Isso acontece

por causa da proteção ou blindagem dos orbitais f pelos orbitais mais elevados s e p

do lantanídeo. E a intensidade de fluorescência da banda principal do complexo de

lantanídeo é muito alta, embora seu rendimento quântico seja geralmente mais baixo

do que aquele dos fluoróforos convencionais. A razão disso é que a energia

transferida é fortemente emitida por uma banda estreita48.

Além disso, o complexo possui um longo tempo de vida da fluorescência (~20

µs). As transições eletrônicas f-f do lantanídeo são proibidas, conduzindo para longo

tempo de vida do estado excitado34. Os tempos de decaimento de complexos de

lantanídeo são completamente sensíveis à natureza detalhada do ambiente do

ligante, em especial ao número de moléculas de água que ocupam locais internos da

coordenação. As transições proibidas f-f são refletidas também nos coeficientes

baixos de excitação, o que dificulta a foto-excitação direta de seus íons, e

requerendo desta forma a presença de ligantes orgânicos para a absorção da

energia35. Os tempos de decaimentos relativamente longos de complexos de

lantanídeos facilitam a fluorometria resolvida no tempo.

Devido às propriedades citadas, existem diversas aplicações deste complexo

desde a detecção de teores da própria tetraciclina36,37, até detecção de peróxido de

hidrogênio6, glicose38, heparina39, peróxido de uréia40, etc.

23

Na Figura 4 é apresentada uma proposta da estrutura para o complexo Eu-Tc

em pH neutro.

Figura 4 - Proposta de estrutura para o complexo Eu-Tc.

1.5 Peróxido de Hidrogênio

O peróxido de hidrogênio (PH), de fórmula molecular H2O2 e comercialmente

conhecido como água oxigenada, é um potente agente oxidante o qual pode ser

convertido, através de catálise, em radical hidroxila (•OH) com reatividade inferior

apenas ao flúor. É um líquido transparente, assemelhando-se à água e tem odor

característico. Não é inflamável, é miscível em água em todas as proporções4.

É formado pela ação da luz solar na água em presença de substâncias

húmicas (material orgânico dissolvido) 41,42.

O peróxido de hidrogênio está presente em pequenas concentrações na

atmosfera e no ambiente marinho 43. Na atmosfera, o H2O2 contribui diretamente

como agente oxidante para a conversão de SO2 em H2SO4 - um dos maiores

responsáveis pela chuva ácida – e indiretamente pela formação de radicais hidroxila,

que reagem com milhares de gases atmosféricos, podendo causar danos à camada

24

de ozônio44,45. É um composto amplamente utilizado na indústria para

branqueamento, limpeza e desinfecção, sendo liberado ao meio ambiente em

grandes quantidades, logo a relevância de seu monitoramento ambiental46. Também

é importante em áreas envolvendo medicamentos e alimentos4.

O PH é um metabólito natural de muitos organismos sendo decomposto em

oxigênio molecular e água e está presente em inúmeras reações biológicas como

principal produto de oxidases.

Assim, diversas substâncias de grande importância no nosso organismo -

como, por exemplo, o álcool47, a glicose48, lactose49 e até a atividade da catalase50,51 -

podem ser determinadas indiretamente através da detecção do peróxido de

hidrogênio resultante das reações de oxidação.

Na presença de peróxido de hidrogênio, o complexo európio-tetraciclina

(EuTc) fracamente fluorescente, se transforma no complexo (EuTc-PH) que é

altamente fluorescente. Este processo foi observado por Y. Rakicioglu em 199952, e

aplicado por A. Duerkop na detecção de peróxido de hidrogênio em águas de rios53.

Com adição de pequenas quantidades de peróxido de hidrogênio ocorre um

aumento de até 15 vezes da intensidade da banda de emissão do európio em torno

de 615 nm em solução com pH neutro. Este aumento ocorre devido à formação de

um novo complexo, onde moléculas de água circundantes ao íon európio são

substituídas por peróxido de hidrogênio, minimizando efeitos de supressão. O tempo

de vida do európio no complexo EuTc-PH aumenta de ~20µs para ~60µs.

A Tabela 1 compara o método de determinação de PH utilizando a sonda

európio-tetraciclina com outros métodos utilizados. Desta forma, tanto a

espectroscopia de emissão como a espectroscopia resolvida no tempo são técnicas

sensíveis a presença de peróxido de hidrogênio em solução.

25

Tabela 1 - Métodos para determinação de peróxido de hidrogênio4,52,54.

MétodoEscala

Linear

Limite de

Detecção

Eletrodo modificado (carbono vítreo) 5 – 50 µmol.L-1 0,5 µmol.L-1

Biossensor Amperométrico (carbono vítreo) 0,01 -1,5 mmol.L-1 5 µmol.L-1

Biossensor Potenciométrico (eletrodo redox) 1,98 - 9,86 mol.L-1 0,4 µmol.L-1

Biossensor Condutométrico (ouro) 5 – 300 µmol.L-1 -

Biossensor de Fibra Óptica 0,05 -1,2 mmol.L-1 25 µmol.L-1

Quimiluminescência (Luminol e Peroxidase) 0,1 – 0,3 mmol.L-1 0,67 mmol.L-1

UV-Vis (Ferro e Porfirina) 3,5 – 70 µmol.L-1 1 µmol.L-1

Volumetria 41 – 200 µmol.L-1 3 µmol.L-1

Cromatografia Líquida 0,5 – 5 µmol.L-1 0,15 µmol.L-1

EuTc 2 – 400 µmol.L-1 0,96 µmol.L-1

1.6 Peróxido de Uréia

O peróxido de uréia (PHU), ou peróxido de carbamida, possui a fórmula

molecular CH4N2O.H2O2, ou seja, é formado por uma molécula de uréia ligada ao

peróxido de hidrogênio, sendo uma forma estável do H2O2. O PHU é um forte agente

oxidante e apresenta efeito citotóxico5, 55.

A uréia é a principal forma de excreção de nitrogênio realizada pelos rins em

nosso organismo em um processo metabólico chamado ciclo da uréia. A fim de

serem utilizados pelo nosso organismo, os aminoácidos sofrem um processo de

desaminação (remoção do grupo amina) produzindo amônia (NH3). Estas moléculas

capturam íons de hidrogênio transformando-se em amônio (NH4+). Ambos, amônia e

amônio, são tóxicos e, portanto convertidos no fígado em uréia sendo finalmente

excretadas pelos rins 56.

Indivíduos com insuficiência renal crônica apresentam elevação nos níveis de

PHU. Experimentos mostram que os níveis de pentosidina e carboximetillisina foram

aumentados pelo radical hidroxila gerado pelo PHU através da reação de Fenton. As

substâncias citadas (pentosidina e carboximetillisina) são produtos da reação de

26

Maillard, e podem promover várias respostas celulares, resultando em disfunções

vasculares, aterosclerose, piora do quadro de diabetes e envelhecimento celular57,58.

A determinação de PHU é realizada por meio de métodos indiretos com

diversas etapas e reagentes57. O complexo európio-tetraciclina utilizado como

sensor de PHU pode ser uma alternativa mais econômica e direta40,7.

1.7 Glicose

A glicose ou dextrose é um monossacarídeo, o menor tipo de carboidrato.

Todas as células dos organismos vivos armazenam glicose como fonte de energia na

forma de polissacarídeo (moléculas complexas de carboidratos)56.

O aumento da concentração de glicose no sangue, ou hiperglicemia, é

resultante de alterações da secreção de insulina e/ou ação da insulina nos tecidos. O

conjunto de disfunções metabólicas causado pelo aumento da glicemia chama-se

diabetes melito, e tem como sintomas clássicos poliúria (aumento do volume de

urina), polidispia (sede), perda de peso, visão embaçada e fadiga. Tem como

complicações crônicas retinopatia, aumento do risco de infecções e nefropatia, esta

provocando disfunções gastrointestinais, cardiovasculares e sexuais59,60.

Cerca de 7,6% da população adulta entre 30 e 69 anos e 0,3% das gestantes

sofrem de diabetes. Alterações da tolerância à glicose são observadas em 12% dos

adultos e em 7% das grávidas, e apenas aproximadamente 50% dos indivíduos

acometidos pela doença tem conhecimento do diagnóstico61.

O diagnóstico do diabetes baseia-se fundamentalmente nas alterações da

glicose plasmática de jejum ou após uma sobrecarga de glicose por via oral 61.

A concentração de glicose sanguínea varia normalmente de 80 a 120 mg/dL.

A Tabela 2 mostra os valores da glicemia considerados normais e que diagnostica o

diabetes pelo comitê especialista internacional de diabetes, financiado pela

Sociedade Americana de Diabetes e aceito pela Organização Mundial de Saúde60.

Tabela 2 - Valores de glicemia para diagnóstico de diabetes melito60.

DiagnósticoGlicemia em

jejum (mg/dL)

Glicemia 2h após a ingestão de 75 g

glicose (mg/dL)

Glicemia casual- horário aleatório

(mg/dL)

27

Normal < 100 < 140Tolerância à glicose diminuída

≥ 100 a < 126 ≥ 140 a < 200

Diabetes mellitus≥ 126 ≥ 200 ≥ 200 (com

sintomas clássicos)

Existem 3 principais métodos laboratoriais para determinação da glicose no

sangue: métodos de redução e de condensação (ambos métodos químicos) e

métodos enzimáticos.

Dos métodos químicos empregados, os de redução são os mais antigos e

baseiam-se nas propriedades de redução da glicose. Os oxidantes utilizados são o

cobre ou o íon ferricianeto em meio alcalino, reduzidos pela glicose a íon cuproso e

íon ferrocianeto, respectivamente. Os métodos mais populares transformam os íons

cuprosos a óxido cuproso em presença de calor. A coloração é feita através da

redução do fosfomolibdato (Folin-Wu) ou arsenomolibdato (Somogyi-Nelson) para

formar azul de molibdênio. Estes métodos são não-específicos e qualquer agente

redutor forte pode elevar o valor real do resultado 62,63.

Nos métodos de condensação o grupo aldeído da glicose reage com aminas

aromáticas formando um produto colorido, cuja intensidade é medida através de

espectrofotometria no UV-visível e relacionada com a concentração de glicose. Um

exemplo clássico é a reação da o-toluidina com a glicose em ácido acético formando

uma glicosilamina com intensa colocação verde cuja absorbância é medida em 630

nm. Uma desvantagem é a alta corrosividade e toxicidade da o-toluidina. Além disso,

o método sofre interferências podendo causar resultados falsamente elevados como,

por exemplo, em amostras com teores elevados de bilirrubina que pode ser

parcialmente transformada em biliverdina de cor verde, ou turvação na solução final

como em presença de lipemia (aumento na concentração de lipídeos no sangue),

condição frequentemente encontrada em diabéticos62,63.

Os métodos químicos (de redução e condensação) citados acima estão em

desuso por não apresentarem a especificidade adequada, sendo os métodos

enzimáticos preferidos para diagnóstico, pois são absolutamente específicos para

glicose e mais simples de serem realizados61.

28

Métodos enzimáticos utilizam enzimas como reativos. As principais enzimas

utilizadas são: glicose desidrogenase, hexoquinase e glicose oxidase.

A glicose desidrogenase catalisa a redução de NAD+, produzindo

gliconolactona e NADH que pode ser monitorado em 340 nm. O método com a

enzima hexoquinase é realizado em duas etapas. Primeiramente a glicose é

fosforilada pelo ATP com a ação da hexoquinase formando glicose-6-fosfato. Na

segunda etapa a glicose-6-fosfato é convertida por outra enzima, a glicose-6-fosfato

desidrogenase, na presença de NADP+, em 6-fosfogliconolactona e NADPH.

Finalmente o NADPH formado é proporcional à quantidade de glicose na amostra e é

medido em 340 nm, como no método enzimático da glicose desidrogenase62,63.

O método com a glicose-oxidase ou Gox é específico para a β-D-Glicose. Em

solução, aproximadamente 66% da D-glicose encontra-se no estado β e 34% na

forma de α-D-Glicose 62. Primeiramente a Gox catalisa a oxidação da glicose para

ácido glicônico e peróxido de hidrogênio de acordo com a reação abaixo 48:

β-D-Glicose + O2 →

o x i d a s eeg l ic o s

gluconolactona

→ hidrólise ácido glicônico + H2O2

A quantidade de peróxido formada na reação é então mensurada de diversas

formas. Usualmente utiliza-se novamente a enzima peroxidase que oxida o H2O2 em

um cromogênio para formar um complexo oxidado colorido que revela a presença de

glicose (método enzimático-colorimétrico).

Outra forma que está sendo estudada atualmente é utilizar o complexo EuTC,

que reage com o H2O2 formando um complexo altamente fluorescente cuja

intensidade é medida através de espectrofotometria em 615 nm48. Através deste

método não há a necessidade de utilizar outra enzima e é possível observar a

emissão em um comprimento de onda na região visível.

29

MATERIAIS E MÉTODOS

Os equipamentos utilizados para a realização das medidas encontram-se

no Centro de Lasers e Aplicações (CLA) do Instituto de Pesquisas Energéticas e

Nucleares (IPEN)/USP. Todos os experimentos foram realizados em temperatura

ambiente.

Os espectros de absorção das amostras foram medidos em um

espectrofotômetro Cary-Olis-17D. Para a obtenção dos espectros de emissão e

tempo de vida utilizamos o sistema Fluorolog 3 da Jobin Yvon (Figura 5). O

fluorímetro fornece uma curva de contagens de fótons em função do comprimento de

onda.

Em todas as medidas realizadas neste aparelho as amostras foram

colocadas em cubetas com as quatro faces polidas, com 1 mm de caminho óptico.

Figura 5 – Espectofotômetro Fluorolog 3.

Dados técnicos do Fluorolog 3:

• Excitação: Lâmpada de Xe 450 Watts;

• Acurácia: 0.5 nm;

30

• Velocidade: 150 nm/s;

• Faixa de detecção: 0 nm – 1100 nm;

• Grades: 330 nm (intervalo de 200–700 nm) e 500 nm (intervalo de 300–1000

nm);

• Sensibilidade: S/N >5000:1 (R928 PMT) em 397 nm, com slits de 5 nm;

• Tempo de pulso: 10 µs.

1.8 Reagentes e Solventes

Os reagentes e solventes utilizados seguem listados abaixo:

• Cloreto de Európio Hexahidratado

• Cloridrato de Tetraciclina

• Cloridrato de Clorotetraciclina

• Cloridrato de Oxitetraciclina

• Cloridrato de Metaciclina

• Água bideionizada

• Hidróxido de sódio

• Ácido propanosulfônico 3-(N-morfolino) ou MOPS

• Peróxido de Hidrogênio

• Peróxido de Uréia

• Glicose Oxidase

As tetraciclinas foram importadas da Sigma Aldrich, cloreto de európio

hexa-hidratado da Molecular Probe, solução tampão MOPS da alemã Carl Roth. A

glicose oxidase foi adquirida do kit comercial de dosagem de glicose por método

enzimático Laborlab. Usou-se a glicose anidra e peróxido de hidrogênio 30% p.a. da

Casa Americana. O peróxido de uréia 98% foi adquirido do laboratório Sigma-Aldrich.

Todos os reagentes foram pesados em balança analítica com precisão de ± 0,0001g.

31

1.9 Preparação das amostras

Foram preparadas as seguintes amostras:

Solução MOPS: preparou-se uma solução tampão adicionando 2,09 g de MOPS em

1000 mL de água bideionizada. O pH da solução foi ajustado para 6,9 através do

acréscimo de NaOH, pois o MOPS em água bideionizada possui um pH mais ácido

que o desejado.

Solução TCs: 21 μmolL−1 das tetraciclinas (Tc, OTc, CTc, MTc) completando o

volume com a Solução MOPS para 100 mL.

Solução EuTCs: foram preparadas amostras de európio em diferentes concentrações

molares para a quantidade fixa de 21 μmolL−1 das tetraciclinas (EuTc, EuOTc,

EuCTc, EuMTc) completando o volume com a Solução MOPS para 100 mL, como

mostra a Tabela 3.

Tabela 3- Amostras do complexo európio tetraciclinas.

Proporção Eu:TCs Eu3+(μmolL−1) TC (μmolL−1)1,0Eu:1,0Tc 21,00 21,001,5Eu:1,0Tc 31,50 21,002,0Eu:1,0Tc 42,00 21,002,5Eu:1,0Tc 52,50 21,003,0Eu:1,0Tc 63,00 21,003,5Eu:1,0Tc 73,50 21,004,0Eu:1,0Tc 84,00 21,00

Solução-mãe PH: 11,5 µL de peróxido de hidrogênio 30% p.a. dissolvidos em 100 mL

de água bideionizada, obtendo 100 mL de uma solução de peróxido de hidrogênio

1000 µM.

32

Solução-mãe PHU: 0,009407 g de peróxido de uréia dissolvidos em 100 mL de água

bideionizada, obtendo 100 mL de uma solução de peróxido de uréia 1000 µM.

Solução EuTCs-PH : 1 mL da Solução EuTC acrescidas de 1 mL de solução de PH

em diversas concentrações molares (0 à 1000 µM) que foram preparadas à partir da

Solução-mãe PH, completando com água bideionizada quando necessário para um

volume final de 2 mL.

Solução EuTCs-PHU : 1 mL da Solução EuTC acrescidas de 1 mL da solução de

PHU em diversas concentrações molares (0 à 1000 µM) que foram preparadas à

partir da Soluça-mãe PHU, completando com água bideionizada quando necessário

para um volume final de 2 mL.

Solução EuTC-Glicose: 1 mL da Solução EuTC + 50 µL Glicose nas concentrações

de 50, 100 e 200 mg/dL, estas preparadas a partir de uma solução mãe de 250

mg/dL de glicose.

Solução EuTC-Glicose-Gox: 1mL Solução EuTC + 5µL Gox + 50 µL Glicose em

diversas concentrações (0 à 225 mg/dL), preparadas a partir de uma solução mãe de

250 mg/dL de glicose.

Solução de Interferentes: 500 µL Solução EuTC + 500 µL de PHU ou PH 500 µM +

500 µL da solução com interferente inorgânico. Os interferentes e concentrações

utilizados seguem na Tabela 4. As concentrações correspondem à valores

encontrados normalmente no sangue e as soluções de interferentes foram

preparadas com água bideionizada.

Tabela 4 - Valores de referência dos componentes inorgânicos estudados.

Interferente Valor de Referência no Sangue

Zn 20 µ M 64

33

Al 12 µ M 65

Ca 1,12 µ M 66

Co 0,1 µ M 64Cu 11,02 µ M 67

Fe 10,74 µ M 67Mg 0,75 mM a 1 mM 67Mn 0,2 µM 64Ni 0,1 µ M 64Ag 0,093 µ M 68

34

RESULTADOS E DISCUSSÃO

1.10 Estudos dos Reagentes e Complexos Európio-Tetraciclinas

A base das soluções de európio-tetraciclina são feitas utilizando o tampão

MOPS (Figura 6) a fim de manter o pH da solução neutro, mais precisamente em 6.9.

Estudos mostram que para melhor complexação do íon európio com a tetraciclina o

pH neutro é o ideal2,30,53.

Figura 6 – Estrutura do ácido propanosulfônico 3-(N-morfolino) ou MOPS.

A Figura 7 mostra os espectros de absorção óptica da solução de MOPS, do

íon európio 63 μmolL−1 em solução de MOPS, e das soluções-mãe dos peróxidos de

hidrogênio e uréia na concentração molar de 1000 µM , realizados nos comprimentos

de onda entre 200 e 500 nm. Nenhum dos reagentes apresenta absorção neste

intervalo, não interferindo assim no complexo EuTC.

Observa-se que o íon európio possui um baixo coeficiente de absorção,

resultado das transições proibidas f-f12.

200 250 300 350 400 450 500-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

MOPS Eu PH PHU

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca

Comprimento de Onda (nm)

Figura 7 - Espectro de absorção óptica do tampão MOPS, íon európio em solução MOPS, solução-mãe PH e solução-mãe PHU.

35

As candidatas ao nosso estudo da família das Tetraciclinas: oxitetraciclina

(OTc), clorotetraciclina (CTc) e metaciclina (MTc) apresentam, em solução, um

amplo espectro de absorção característico de compostos orgânicos e, quando em

solução com európio, apresentam um deslocamento de absorção para o vermelho,

indicando a formação do complexo EuTC (Figura 8). A OTc e CTc sofrem um

deslocamento para um maior comprimento de onda de aproximadamente 30 nm

quando complexadas com európio. Na solução MTc o deslocamento foi de 40 nm.

As Tetraciclinas em solução preparadas com concentração molar de 21 μmolL−1 e o

os complexos EuTC nas razões molares 1:1; 1:2; 1:3 e 1:4.

200 250 300 350 400 450 500-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7 1Eu:1OTc 2Eu:1OTc 3Eu:1OTc 4Eu:1OTc OTc

Den

sida

de Ó

ptic

a


(a )

200 250 300 350 400 450 500

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1Eu:1CTc 2Eu:1CTc 3Eu:1CTc 4Eu:1CTc CTc

Den

sida

de Ó

ptic

a


(b )

200 250 300 350 400 450 500

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6 1Eu:1MTc 2Eu:1MTc 3Eu:1MTc 4Eu:1MTc MTc

Den

sid

ade

Óp

tica


(c)

Figura 8 - Espectro de absorção óptica: (a) complexo EuOTc e OTc, (b) complexo EuCTc e CTc, (c) complexo EuMTc e MTc.

36

O complexo EuTC mantém a banda larga de absorção característica do

ligante orgânico, indicando que a energia absorvida pelo quelato ocorre através

deste. É possível observar que para diferentes razões molares de EuTC a absorção

do complexo permanece praticamente no mesmo comprimento de onda.

A Figura 9(a) mostra a emissão das amostras da solução de OTc 21

μmolL−1 e do íon európio 21 μmolL−1, excitadas respectivamente em 357nm e 390

nm.

3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 0

3 0 0 0 0

3 5 0 0 0

Sina

l (C

ont.

fóto

ns)


Eu OT c

(a)

580 590 600 610 620 630 6400

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

1,0 Eu:1OTc 1,5 Eu:1OTc 2,0 Eu:1OTc 2,5 Eu:1OTc 3,0 Eu:1OTc 3,5 Eu:1OTc 4,0 Eu:1OTc

Sin

al (

Con

t. f

óton

s)


(b)

Figura 9 - (a) Espectro de emissão óptica das soluções de OTc e do íon európio. (b) Emissão óptica do complexo EuOTc em diversas razões molares.

A OTc possui um amplo banda de emissão, característico dos compostos

orgânicos, com máximo em torno de 480 nm, com emissão de 7.000 fótons. O

európio apresenta banda de emissão com picos finos e bem definidos em: 578nm,

590nm e 614nm, este último com emissão máxima em torno de 33.000 fótons.

O espectro de emissão do EuOTc é mostrado na Figura 9(b), com

excitação em 390 nm. A razão molar 1Eu:1OTc foi a que obteve maior intensidade

na emissão, em torno de 5.500.000 fótons, ou seja, um aumento na emissão de mais

de 150 vezes em relação ao íon európio em solução. Todas as razões molares

estudadas emitiram no mesmo comprimento de onda, com máximo em

aproximadamente 615 nm. Isto ocorre porque o ligante orgânico absorve energia

transferindo-a ao estado tripleto do íon metálico central, que emite a radiação em

37

uma banda estreita e bem definida, devido à transição 5D0 → 7F2 dos íons európio

(efeito antena).

Os espectros de emissão da CTc e do seu complexo com o íon európio

(Figura 10), assim como os da MTc e do complexo EuMTc (Figura 11) demonstram o

mesmo fenômeno de transferência de energia intramolecular entre o ligante orgânico

e o lantanídeo descrito anteriormente. As soluções CTc e EuCTc foram excitadas em

370 e 400 nm, enquanto a solução MTc e EuMTc foram excitadas em 350 e 390 nm

respectivamente.

4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0

0

1 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0

Sina

l (C

ont.

fóto

ns)

C o m p rim e nto de O nd a (nm )

CT c (a )

600 650

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Sina

l (C

ont.

fóto

ns)


1,0Eu:1,0CTc 1,5Eu:1,0CTc 2,0Eu:1,0CTc 2,5Eu:1,0CTc 3,0Eu:1,0CTc 3,5Eu:1,0CTc 4,0Eu:1,0CTc

(b)

Figura 10 - (a) Espectro de emissão óptica da solução CTc. (b) Emissão óptica do complexo EuCTc em diversas razões molares.

450 500 550 600 650 7000

100000

200000

300000

400000

500000

(a )

Sina

l (C

ont.

Fóto

ns)

C om p rim ento d e O nda (nm )

M T c

580 590 600 610 620 630 640 6500

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

10000000

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)


1,0Eu:1,0MTc 1,5Eu:1,0MTc 2,0Eu:1,0MTc 2,5Eu:1,0MTc 3,0Eu:1,0MTc 3,5Eu:1,0MTc 4,0Eu:1,0MTc

(b)

Figura 11 - (a) Espectro de emissão óptica da solução MTc. (b) Emissão óptica do complexo EuMTc em diversas razões molares.

38

Na Tabela 5 é apresentado o grande deslocamento entre a absorção e

emissão dos complexos EuTCs, importante característica que evita a sobreposição

dos espectros de excitação e emissão.

Tabela 5 – Deslocamento dos picos de absorção e emissão dos complexos EuOTc, EuCTc e EuMTc

EuTC Absorção (nm) Emissão (nm) Deslocamento (nm)EuOTc 390 615 225EuCTc 400 615 215EuMTc 390 615 225

1.11 Determinação das curvas de calibração

Uma curva de calibração permite a determinação da concentração de uma

substância em uma amostra desconhecida, comparando o desconhecido a um

conjunto de amostras padrão de concentração conhecida. Os dados - as

concentrações do analito (peróxido de hidrogênio, peróxido de uréia, glicose, etc.) e

a resposta do instrumento para cada padrão – podem ser ajustados como uma linha

reta de equação y = a + b*x, onde y é a resposta do instrumento de medida, x

corresponde à concentração do peróxido, b (coeficiente angular da reta) representa o

ruído de fundo e a (coeficiente linear) descreve a sensibilidade. A concentração do

analito das amostras desconhecidas ('x) pode ser calculada a partir desta equação.

Outro fator a ser considerado é o limite de detecção (LD) que corresponde

à menor quantidade do analito capaz de ser detectado em uma amostra69. O LD

pode ser calculado a partir da seguinte fórmula:

Para a construção da curva de calibração dos complexos EuOTc, EuCTc e

EuMTc com o peróxido de hidrogênio e peróxido de uréia primeiramente foi

39

determinada a melhor razão molar de Eu:TC para a formação do complexo,

considerando a melhor razão molar aquela que apresenta maior intensidade de

luminescência. Logo, foram preparadas amostras em diversas concentrações

molares de európio (1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0) para 1 de Tetraciclina (OTc, CTc

e MTc), acrescidas de peróxido de hidrogênio ou uréia em uma concentração fixa, no

caso 500 µM. Encontrada a melhor razão de EuTC, foram obtidos os espectros de

emissão variando a concentração dos peróxidos. Os espectros de emissão foram

feitos entre os comprimentos de onda 580 e 650 nm, intervalo em que ocorre o maior

pico de emissão do complexo. A curva de calibração foi construída através da

integral do espectro de cada amostra para a concentração do analito em questão.

Os resultados foram comparados com o complexo Európio-Tetraciclina

(EuTc), este amplamente estudado na detecção de peróxidos de hidrogênio52,53 e

uréia40,7. A curva de calibração da EuTc foi construída baseando-se em estudos

prévios que demonstram que a melhor razão molar de EuTc para a realização dos

experimentos é de 1:3 e que o complexo possui pico de absorção com máximo no

comprimento de onda em 400 nm2,30.

1.11.1 Complexos EuTC-PH

Foram obtidos os espectros de absorção dos complexos EuOTc, EuCTc e

EuMTc na presença de PH (Figura 12). As amostras foram preparadas em diversas

concentrações molares de Eu:TC (1:1; 2:1; 3:1 e 4:1) acrescidas de peróxido de

hidrogênio 500 µM.

Pode-se observar que a posição das bandas de absorção dos EuTCs não se

alteram com a presença de PH, havendo apenas alteração na intensidade. Os picos

de absorção mantiveram-se em 390 nm nos complexos EuOTc-PH e EuMTc-PH, 400

nm no complexo EuCTc-PH.

40

2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0

0 , 0

0 , 1

0 , 2

0 , 3

0 , 4

0 , 5

0 , 6

0 , 7

0 , 8 1 E u : 1 O T c - P H 2 E u : 1 O T c - P H 3 E u : 1 O T c - P H 4 E u : 1 O T c - P H 1 E u : 1 O T c

Dens

idad

e Ópt

ica

C o m p r i m e n t o d e O n d a ( n m )

( a )

2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0

0 ,0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6

1 E u :1 C T c -P H 2 E u :1 C T c -P H 3 E u :1 C T c -P H 4 E u :1 C T c -P H 1 E u :1 C T c

Dens

idad

e Ópt

icaC o m p r i m e n t o d e O n d a (n m )

( b )

2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 00 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6

0 ,7 1 E u :1 M T c - P H 2 E u :1 M T c - P H 3 E u :1 M T c - P H 4 E u :1 M T c - P H 1 E u :1 M T c

Dens

idad

e Ópt

ica

C o m p r im e n t o d e O n d a ( n m )

(c )

Figura 12 - Espectro de absorção óptica dos complexos (a)EuOTc, (b)EuCTc, (c)EuMTc, em diferentes concentrações molares, com e sem PH.

Os espectros de luminescência das EuTC com PH 500 µM estão

apresentados na Figura 13. As soluções foram excitadas nos comprimentos de onda

obtidos nos experimentos dos espectros de absorção realizados anteriormente: 390

nm para os complexos EuOTc-PH e EuMTc-PH; 400 nm para o complexo EuCTc-

PH.

41

580 590 600 610 620 630 640 650

0

30000

60000

90000

120000

150000

180000

210000 1,0Eu:1OTc-PH 1,5Eu:1OTc-PH 2,0Eu:1OTc-PH 2,5Eu:1OTc-PH 3,0Eu:1OTc-PH 3,5Eu:1OTc-PH 4,0Eu:1OTc-PH

Sina

l (C

ont.

fót

ons)


(a)

580 590 600 610 620 630 640 6500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000 1,0Eu:1CTc-PH 1,5Eu:1CTc-PH 2,0Eu:1CTc-PH 2,5Eu:1CTc-PH 3,0Eu:1CTc-PH 3,5Eu:1CTc-PH 4,0Eu:1CTc-PH

Sina

l (C

ont.

fóto

ns)


B

(b)

580 590 600 610 620 630 640 6500

500000

1000000

1500000

2000000

2500000 1,0Eu:1MTc-PH 1,5Eu:1MTc-PH 2,0Eu:1MTc-PH 2,5Eu:1MTc-PH 3,0Eu:1MTc-PH 3,5Eu:1MTc-PH 4,0Eu:1MTc-PH

Sina

l (C

ont.

fót

ons)


(c)

Figura 13 - Espectro de emissão dos complexos: (a) EuOTc-PH, (b) EuCTc-PH, (c) EuMTc-PH, em diferentes concentrações molares EuTC.

Assim, os resultados com a razão molar com maior intensidade de emissão

seguem na Tabela 6 abaixo:

Tabela 6 - Razões molares do EuTC na presença de PH que obtiveram emissão com maior intensidade.

EuTCRazão Molar Eu:TC, na

presença de PH 500 µM

EuOTc 4:1

EuCTc 4:1

EuMTc 2:1A partir do resultado anterior, foram preparadas amostras dos complexos

4Eu:1OTc, 4Eu:1CTc e 2Eu:1MTc com PH variando a concentração deste de 0 até

42

1000 µM. As soluções foram então excitadas nos comprimentos de onda 390 nm

para os complexos EuOTc-PH e EuMTc-PH, 400 nm para o complexo EuCTc-PH.

Para comparação dos resultados, o complexo EuTc foi preparado a razão molar de

3:1 acrescido de PH em diversas concentrações molares, excitado em 400 nm.

Os resultados obtidos para a EuTc-PH são exibidos na Figura 14. A curva de

calibração mostrou um aumento relativamente linear de 0 a 600 µM, com um

aumento na emissão em 7 vezes se comparado ao complexo sem PH. O limite de

detecção do EuTc-PH é de 0,17 mg/mL.

43

570 580 590 600 610 620 630 640 6500,0

2,0x10 6

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7

1,2x10 7

1,4x10 7

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)


0 µM PH 100 µM PH 200 µM PH 300 µM PH 400 µM PH 500 µM PH 600 µM PH 700 µM PH 800 µM PH 900 µM PH 1000 µM PH

+ 3Eu:1Tc

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000,0

5,0x10 7

1,0x10 8

1,5x10 8

2,0x10 8

2,5x10 8

Sin

al

(C

on

t. fóto

ns)

PH [µM]

3Eu:1Tc + PH

Equation y = a + b*xAdj. R-Square 0,97743

Value Standard Errora Intercept 3,32371E7 2,92183E6

b Slope 294217,155 16870,2579

Figura 14 – (a) Espectro de emissão (b) e curva de calibração do complexo 3Eu:1Tc-PH.

O complexo EuCTc-PH obteve um aumento na luminescência de quase 7,2

vezes em relação ao EuCTc (Figura 15) . A emissão aumentou de 15 milhões de

fótons para 110 milhões de fótons na presença de PH. A curva de calibração

mostrou-se linear entre 100 a 700 µM. O limite de detecção obtido foi de 0,06 mg/mL.

44

570 580 590 600 610 620 630 640 6500

1x10 6

2x10 6

3x10 6

4x10 6

5x10 6

6x10 6

7x10 6

+ 4Eu:1CTc


Sin

al

(Co

nt.

fóto

ns)


0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000,00E+000

2,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

4Eu:1CTc + PH

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)

PH [µM]


Value Standard Errora Inte rce pt 4,77971 E6 772796,22452

b Slope 1 44654,993 321 0,32039

Figura 15 – (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração complexo 4Eu:1CTc-PH.

45

A curva de calibração do complexo EuOTc também mostrou um aumento

linear de 0 a 600 µM (Figura 16). O aumento na intensidade de luminescência foi

menor que os anteriores, de aproximadamente 4 vezes em relação ao complexo sem

PH. O limite de detecção para o EuOTc-PH é de 0,12 mg/mL.

46

570 580 590 600 610 620 630 640 650

0,0

2,0x10 6

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7

1,2x10 7

+ 3Eu:1OTc

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)



0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10002,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)

PH [µM]

4Eu:1OTc + PH


Value Standard ErrorB B 3,5541 9E7 1 ,571 03E6B B 1 95906,41 1 7 7936,41 61 9

Figura 16 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 4Eu:1OTc-PH.

47

O espectro de emissão e curva de calibração do complexo EuMTc-PH é

apresentado na Figura 17. Pode-se observar que não houve alteração na emissão do

complexo EuMTc na presença de PH.

570 580 590 600 610 620 630 640 6500

1x10 5

2x10 5

3x10 5

4x10 5

5x10 5

+ 2Eu:1MTc

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)



0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000

1x10 6

2x10 6

3x10 6

4x10 6

5x10 6

2Eu:1MTc + PH

Sin

al

(C

on

t. fó

to

ns)

PH [µM]


Value Standard Errora Intercept 4,00658E6 112237,34442b Slope -107,401 07 1 88,1 7928

Figura 17 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 2Eu:1MTc-PH.

É possível observar no espectro de emissão que em torno da transição 5D0 → 7F2 a banda apresenta dois picos, o que pode significar que existam diferentes sítios

de ligação para o európio na molécula da tetraciclina quando em presença de PH.

Especificamente no caso do complexo EuOTc nota-se que isto ocorre mesmo sem a

presença de PH.

48

O aumento da luminescência com a adição do peróxido ocorre devido à

substituição de moléculas da água na coordenação do európio (que diminuem a

intensidade de emissão) pelo H2O2 . Além disso, estudos sugerem que o peróxido de

hidrogênio promove uma reorganização estrutural do complexo EuTc em solução

aumentando a proximidade do íon metálico central com os ligantes orgânicos, o que

permitiria maior eficiência na transferência de energia intramolecular6.

O complexo EuMTc, ao contrário dos outros, não sofre aumento na emissão

em presença de PH. Isto ocorre provavelmente porque não há um aumento no

número de sítios de ligação da molécula com a presença do peróxido.

1.11.2 Complexos EuTC-PHU

A Figura 18 mostra os espectros de absorção dos complexos EuOTc, EuCTc e

EuMTc na presença de PHU. As amostras foram preparadas em diversas razões

molares de Eu:TC (1:1; 2:1; 3:1 e 4:1) acrescidas de peróxido de uréia 500 µM. Não

há alteração significativa do comprimento de onda de absorção das amostras na

ausência ou presença do peróxido de uréia. Os picos de absorção mantiveram-se em

390 nm nos complexos EuOTc-PHU e EuCTc- PHU, 400 nm no complexo EuCTc-

PHU.

2 00 2 5 0 3 00 3 5 0 40 0 45 0 5 0 0

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8 1 E u :1 O T c-P H U 2 E u :1 O T c-P H U 3 E u :1 O T c-P H U 4 E u :1 O T c-P H U 1 E u :1 O T c

Den

sidad

e Ópt

ica

C om p r im en to d e O n d a (n m )

(a )

200 250 300 350 400 450 500

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1Eu:1CT c-PH U 2Eu:1CT c-PH U 3Eu:1CT c-PH U 4Eu:1CT c-PH U 1Eu:1CT c

Den

sidad

e Ó

ptic

a

Com prim ento de O nda (nm )

(b )

2 0 0 2 5 0 3 00 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0

0 ,0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6 (c ) 1E u :1 M T c-P H U 2E u:1 M T c-P H U 3E u:1 M T c-P H U 4E u:1 M T c-P H U

1E u:1M T c

Den

sidad

e Ópt

ica

C om p rim e nto d e O n da (nm )

Figura 18 - Espectro de absorção óptica dos complexos (a)EuOTc, (b)EuCTc, (c)EuMTc, em diferentes concentrações molares sem PHU e com PHU.

Os espectros de emissão das EuTC com PHU 500 µM são apresentados na

Figura 19. As soluções foram excitadas nos comprimentos de onda obtidos nos

49

experimentos dos espectros de absorção realizados anteriormente: 390 nm para os

complexos EuOTc- PHU e EuMTc- PHU; 400 nm para o complexo EuCTc- PHU.

580 590 600 610 620 630 640 6500

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

Sin

al (

Con

t. f

óton

s)

1,0Eu:1OTc-PHU 1,5Eu:1OTc-PHU 2,0Eu:1OTc-PHU 2,5Eu:1OTc-PHU 3,0Eu:1OTc-PHU 3,5Eu:1OTc-PHU 4,0Eu:1OTc-PHU


(a)

580 590 600 610 620 630 640 6500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000 1,0Eu:1CTc-PHU 1,5Eu:1CTc-PHU 2,0Eu:1CTc-PHU 2,5Eu:1CTc-PHU 3,0Eu:1CTc-PHU 3,5Eu:1CTc-PHU 4,0Eu:1CTc-PHU

Sin

al (

Con

t. f

óton

s)


(b)

580 590 600 610 620 630 640 6500

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1,0Eu:1MTc-PHU 1,5Eu:1MTc-PHU 2,0Eu:1MTc-PHU 2,5Eu:1MTc-PHU 3,0Eu:1MTc-PHU 3,5Eu:1MTc-PHU 4,0Eu:1MTc-PHU

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)


(c)

Figura 19 - Espectro de emissão dos complexos (a) EuOTc-PHU, (b) EuCTc-PHU, (c) EuMTc-PHU, em diferentes concentrações molares de EuTC.

Os resultados com a razão molar com maior intensidade de emissão seguem

na Tabela 7.

Tabela 7 - Razão molar do EuTC na presença de PHU que obteve emissão com maior intensidade.

EuTCRazão Molar Eu:TC, na

presença de PHU 500 µM

EuOTc 4,0:1EuCTc 3,5:1EuMTc 1,5:1

50

De acordo com o resultado obtido, foram preparadas amostras dos complexos

4Eu:1OTc, 3,5Eu:1CTc e 1,5Eu:1MTc com diversas concentrações molares de PHU.

As soluções foram novamente excitadas nos comprimentos de onda 390 nm para os

complexos EuOTc- PHU e EuMTc- PHU, 400 nm para o complexo EuCTc- PHU.

Para comparação dos resultados, o complexo EuTc foi preparado a razão molar de

3:1, e excitado em 400 nm.

A Figura 20 apresenta o espectro de emissão e curva de calibração do

complexo EuTc-PHU. A curva de calibração mostrou boa linearidade de 0 a 1000 µM

de PHU e houve um aumento em torno de 7 vezes na emissão da luminescência. O

limite de detecção obtido para o complexo foi de 0,076 mg/mL.

570 580 590 600 610 620 630 640 650

0,0

2,0x10 6

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7 0 µM PHU 100 µM PHU 200 µM PHU 300 µM PHU 400 µM PHU 500 µM PHU 600 µM PHU 700 µM PHU 800 µM PHU 900 µM PHU 1000 µM PHU

+ 3Eu:1Tc

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)


0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000,00E+000

2,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

3Eu:1Tc + PHU

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)

PHU [µM]


Value Standard Errora Inte rce pt 2,08371 E7 885557,37905b Slope 1 34788,07004 341 5,85239

Figura 20 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 3Eu:1Tc-PHU.

51

Na presença de PHU a curva de calibração para o EuOTc mostrou-se

relativamente linear de 0 até 500 µM com um aumento na luminescência de 4,8

vezes em relação ao complexo sem o peróxido (Figura 21). O limite de detecção

obtido é de 0,24 mg/mL.

570 580 590 600 610 620 630 640 6500,0

2,0x10 6

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7

1,2x10 7

1,4x10 7 0 µM PHU 100 µM PHU 200 µM PHU 300 µM PHU 400 µM PHU 500 µM PHU 600 µM PHU 700 µM PHU 800 µM PHU 900 µM PHU 1000 µM PHU

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)


+4Eu:1OTc

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10002,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

1,80E+008

2,00E+008

2,20E+008

2,40E+008 4Eu:1OTc + PHU

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)

PHU [µM]



b Slope 333201 ,1 6366 27662,1 2235

Figura 21 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 4Eu:1OTc-PHU.

52

Na Figura 22 é apresentado o espectro de emissão e curva de calibração

do complexo EuCTc-PHU. A curva obtida possui linearidade entre 200 a 1000 µM. O

aumento na emissão foi de 3 vezes em relação ao complexo sem PHU. O limite de

detecção do complexo é de 0,08 mg/mL.

570 580 590 600 610 620 630 640 6500,0

2,0x10 5

4,0x10 5

6,0x10 5

8,0x10 5

1,0x10 6

1,2x10 6

0 µM PHU 100 µM PHU 200 µM PHU 300 µM PHU 400 µM PHU 500 µM PHU 600 µM PHU 700 µM PHU 800 µM PHU 900 µM PHU 1000 µM PHU

+ 3,5Eu:1CTc

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)


0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10004,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7

1,2x10 7

1,4x10 7

1,6x10 7

1,8x10 7

3,5Eu:1CTc + PHU

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)

PHU [µM]


Value Standard Errora Inte rce pt 2,92923E6 1 92797,1 5621b Slope 1 3709,1 5343 396,30668

Figura 22 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 3,5Eu:1CTc-PHU.

53

A Figura 23 mostra o espectro de emissão e a curva de calibração do

EuMTc-PHU. Pode-se observar que não houve alteração da luminescência com a

presença de PHU.

570 580 590 600 610 620 630 640 6500

1x10 5

2x10 5

3x10 5

4x10 5

5x10 5

6x10 5 0 µM PHU 100 µM PHU 200 µM PHU 300 µM PHU 400 µM PHU 500 µM PHU 600 µM PHU 700 µM PHU 800 µM PHU 900 µM PHU 1000 µM PHU

Sin

al

(C

on

t.

fó

ton

s)


+ 1,5EuMTc

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000,0

2,0x10 6

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7

1,2x10 7

1,5Eu:1MTc + PHU

Sin

al

(C

on

t.

fó

to

ns)

PHU [µM]


Value Standard ErrorB Intercept 7,77871E6 216506,29371B Slope -480,47735 359,47952

Figura 23 - (a) Espectro de emissão e (b) curva de calibração do complexo 1,5Eu:1MTc-PHU.

54

Assim como nos experimentos com o peróxido de hidrogênio, há uma

divisão da banda em torno de 615 nm sugerindo que o európio ocupa diferentes

sítios na tetraciclina. Também há um considerável aumento na luminescência com a

adição do peróxido de uréia (exceto nos estudos com o complexo európio-

metaciclina) provocado pela substituição de moléculas da água pelo PHU.

1.12 Tempo de Vida

O tempo de vida é o tempo que o sistema demora a retornar ao estado

fundamental, isto é, o tempo de transição 5D0→7F2 do európio presente no complexo.

Assim como os espectros de absorção óptica e de emissão, é uma importante

medida para a caracterização dos complexos.

As medidas dos tempos de vida foram realizadas no fluorímetro Fluorolog 3

onde um pulso de luz excita a amostra. O aparelho permite o controle de atrasos

variáveis quando abre a janela de detecção, e por quanto tempo.

Geralmente sistemas complexos podem apresentar múltiplas espécies

fluorescentes, e sendo assim, o perfil de decaimento da intensidade de fluorescência

não pode ser ajustado por uma função exponencial simples. Dessa forma, foi

ajustado por uma exponencial dupla: ( ) )/(

2/

1021 ττ tt eAeAyy −− ++= , onde τ1 e τ2 são os

tempos de decaimento (µs) e A1 e A2 são as amplitudes do sinal. No caso de

decaimento com múltiplas exponenciais, a média do tempo de vida (τav), é

proporcional a área total abaixo da curva de decaimento da fluorescência, definida

por :

∑∑

=

iii

iii

av A

A

τ

ττ

2

55

Os experimentos foram realizados considerando as razões molares de EuTCs

que apresentaram maior intensidade de emissão na presença dos peróxidos de

hidrogênio e uréia em nossos estudos (Tabela 8). No caso da tetraciclina a melhor

proporção adotada, como dito anteriormente, foi a partir de artigos científicos que

demonstram que a melhor razão molar da EuTc é 3:12,30.

Tabela 8 - Razão Molar das amostras de EuTC para estudo de tempo de vida.

TCRazão Molar

EuTC com PHRazão Molar

EuTC com PHU

OTc 4:1 4:1CTc 4:1 3.5:1MTc 2:1 1.5:1Tc 3:1 3:1

Foram realizadas medidas do tempo de vida do európio em 615 nm para os

complexos EuTc, EuCTc, EuMTc e EuOTc na ausência e na presença de 500 µM de

peróxido de hidrogênio ou peróxido de uréia. Os complexos EuTc e EuCTc foram

excitados em 400 nm, e os complexos EuMTc e EuOTc excitados em 390 nm.

Comparando o tempo de vida de ambos os complexos EuTc e EuOTc com a

adição de PH e PHU, podemos notar um expressivo aumento no tempo de

decaimento nas amostras que contêm peróxidos.

O complexo EuTc apresentou um tempo de vida de 34 µs, dobrando este valor

na presença de peróxido de hidrogênio e uréia para 68 µs e 70,8 µs respectivamente

(Tabela 9 e Figura 24).

56

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

0

100000

200000

300000

400000

500000 3Eu:1 Tc 3Eu:1 Tc-PH 3Eu:1 Tc-PHU

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)

Tempo (µs)

Figura 24 – Tempo de vida dos complexos EuTc, EuTc-PH e EuTc-PHU.

Tabela 9 – Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida dos complexos EuTc, EuTc-PH e EuTc-PHU.

Complexos EuTc

Parâmetros Valor Erros τav(µs)

3Eu:1Tc

A1 17959,80474 1361,28738

34,40τ1 0,05979 0,00258A2 95405,85839 1232,90573τ2 0,02039 2,39E-04

3Eu:1Tc-PH

A1 295970,0749 --

68,12τ1 0,06812 936,27005A2 295970,0749 --τ2 0,06812 936,2752

3Eu:1Tc-PHU

A1 419503,6848 4076,60778

70,87τ1 0,07143 6,29E-04A2 19039,70452 2999,26646τ2 0,01581 0,00543

57

O EuOTc obteve um tempo de decaimento de 56 µs. Na presença de PH

houve um aumento significativo para 95 µs e complexado com PHU o aumento foi

um pouco menor, 85 µs (Figura 25 eTabela 10).

0,0 0,1 0,2 0,3

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

4Eu:1 Ox 4Eu:1 Ox-PH 4Eu:1 Ox-PHU

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)

Tempo (µs)

Figura 25 - Tempo de vida dos complexos EuOTc, EuOTc-PH e EuOTc-PHU.

Tabela 10 - Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida dos complexos EuOTc, EuOTc-PH e EuOTc-PHU.

Complexos EuOTc


4Eu:1OTc

A1 118162,3517 13287,85149

56,62τ1 0,03069 0,00158A2 145421,3542 13424,57947τ2 0,06637 2,60E-03

4Eu:1OTc-PH

A1 361436,2103 --

95,13τ1 0,09513 27594,36244A2 361436,2103 --τ2 0,09513 27594,37603

4Eu:1OTc-PHU

A1 266855,5896 5,68E+10

85,57τ1 0,08557 2,24E+03A2 266855,5896 5,68E+10τ2 0,08557 2238,38497

O complexo EuCTc apresentou um tempo de vida de aproximadamente 14 µs

e não houve variação significativa neste valor com a adição de ambos os peróxidos

(Figura 26 e Tabela 11).

58

0,0 0,1 0,2 0,3

0

5000

10000

15000

20000

0,0 0,1 0,2 0,3

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000(a)

3,5Eu:1CTc 3,5Eu:1CTc-PHU

Sin

al

(C

on

t. fóton

s)

Tempo (µs)

(b)

4Eu:1CTc 4Eu:1CTc-PH

Sin

al

(C

on

t. fó

to

ns)

Tempo (µs)

Figura 26 - Tempo de vida dos complexos EuCTc, (a) EuCTc-PHU e (b)EuCTc-PH.

Tabela 11 - Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida dos complexos EuCTc, EuCTc-PH e EuCTc-PHU.

Complexos EuCTc


4Eu:1CTc

A1 68489,77526 108,83675

14,50τ1 0,01065 4,22E-05A2 1269,88781 99,48436τ2 0,05484 0,00341

4Eu:1CTc-PH

A1 99184,43977 5,70E+10

17,26τ1 0,01726 1152,10575A2 99184,44086 5,70E+10τ2 0,01726 1,15E+03

3,5Eu:1CTc

A1 55412,20864 1,71E+02

14,26τ1 0,01002 8,57E-05A2 1926,65618 2,01E+02τ2 0,04284 0,00276

3,5Eu:1CTc-PHU

A1 57142,97607 2,76E+02

12,83τ1 0,00985 1,78E-04A2 2718,83077 6,23E+02τ2 0,03207 0,00336

O complexo EuMTc obteve o maior tempo de vida de todos os complexos

estudados sem os peróxidos, 60 µs para a razão molar de 2Eu:1MTc e 74 µs para

razão molar de 1,5Eu:1MTc. Na presença dos peróxidos houve uma diminuição no

tempo de vida (Figura 27 e Tabela 12).

59

0,0 0,1 0,2 0,3

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0,0 0,1 0,2 0,3

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000(a)

Sin

al (

Con

t. fóto

ns)

Sin

al (

Co

nt.

fóto

ns)

Tempo (µs)

2Eu:1MTc 2Eu:1MTc-PH

(b)

1,5Eu:1MTc 1,5Eu:1MTc-PHU

Tempo (µs)

Figura 27 - Tempo de vida dos complexos EuMTc, (a) EuMTc-PH e (b) EuMTc-PHU.

Tabela 12- Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida dos complexos EuMTc, EuMTc-PH e EuMTc-PHU.

Complexos EuMTc


2Eu:1MTc

A1 87851,8574 4217,77092

60,80τ1 0,03435 1,01E-03A2 20270,3167 4066,61632τ2 0,1001 0,01572

2Eu:1MTc-PH

A1 72578,6393 5,70E+03

54,22τ1 0,03021 0,00128A2 37370,17134 5,76E+03τ2 0,07342 5,86E-03

1,5Eu:1MTc

A1 17094,2358 3,03E+03

74,55τ1 0,1496 4,12E-02A2 139295,0583 3,79E+03τ2 0,04072 7,27E-04

1,5Eu:1MTc-PHU

A1 70179,78358 3,87E+03

53,06τ1 0,02895 9,29E-04A2 33439,38579 3,92E+03τ2 0,07311 0,00465

Para o expressivo aumento no tempo de vida dos complexos na presença de

peróxidos, sugerimos que as moléculas de água na solução contendo peróxidos são

substituídas por estes. Com menor número de moléculas na vizinhança do íon

európio, a transferência de energia para as moléculas de água é minimizada, e a

60

energia é então praticamente mantida para o íon Eu3+, aumentando o tempo de vida

e a intensidade da luminescência, resultando em um melhor rendimento quântico.

No complexo EuCTc não houve aumento no tempo de vida com a adição dos

peróxidos possivelmente devido ao limite de detecção do equipamento, pois o ajuste

fornece um valor irreal já que a medição realizada é o flash da lâmpada de xenônio

do aparelho.

1.13 Interferentes

Para a análise da tolerância de compostos inorgânicos, preparamos amostras

com interferentes em concentrações encontradas normalmente no sangue como

ponto de partida para o estudo, e verificamos se tais componentes nestas

concentrações de referência acarretam em aumento ou redução da fluorescência do

európio em 615 nm. Foram obtidas as relações de emissão para o complexo com PH

ou PHU na presença dos interferentes. Os estudos de interferentes com a

metaciclina foram desconsiderados devido aos resultados não expressivos na

criação da curva de calibração.

1.13.1 Complexos EuTC-PH

Foram realizados experimentos para observar a interferência dos compostos

inorgânicos nos complexos 3Eu:1Tc-PH (Figura 28), 4Eu:1OTc-PH (Figura 29) e

4Eu:1CTc-PH (Figura 30). Verifica-se que dentro das faixas de concentração

encontradas normalmente no sangue, tais compostos não apresentam interferência

significativa no sinal de emissão, pois considerando o aumento da luminescência em

relação ao complexo európio-tetraciclina sem a presença de peróxido, a interferência

torna-se irrelevante.

61

EuTc

EuTc-PH

Zn AlCa Co Cu Fe

Mg

Mn Ni

Ag0,00E+000

2,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

1,80E+008

In

teg

ral

da e

mis

são

(C

on

t. f

óto

ns)

Interferentes

EuTc-PH

Figura 28 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuTc, EuTc-PH e dos complexos EuTc-PH na presença de interferentes.

EuOTc

EuOTc-P

H

Zn AlCa Co Cu Fe

Mg

Mn Ni

Ag0,00E+000

5,00E+007

1,00E+008

1,50E+008

2,00E+008

2,50E+008

3,00E+008

3,50E+008

4,00E+008

EuOTc-PH

Interferentes

In

teg

ral

da e

mis

são

(C

on

t. f

óto

ns)

Figura 29 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuOTc, EuOTc-PH e dos complexos EuOTc-PH na presença de interferentes.

62

EuCTc

EuCTc-PH

Zn Al Ca Co Cu Fe Mg

Mn Ni

Ag0,0

2,0x106

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x106

1,0x10 7

1,2x107

EuCTc-PH

Interferentes

In

teg

ral

da e

mis

são (

Co

nt.

fó

ton

s)

Figura 30 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuCTc, EuCTc-PH e dos complexos EuCTc-PH na presença de interferentes.

1.13.2 Complexos EuTC-PHU

Foram realizados experimentos para observar a interferência dos compostos

inorgânicos nos complexos 3Eu:1Tc-PHU (Figura 31), 4Eu:1OTc-PHU (Figura 32) e

3,5Eu:1CTc-PHU (Figura 33). Assim como nos experimentos do peróxido de

hidrogênio, existe uma pequena interferência na luminescência dos compostos

inorgânicos estudados, que quando comparado ao aumento da emissão devido à

presença do PHU torna-se irrisória.

63

EuTc

EuTc-PH

U

Zn AlCa Co Cu Fe

Mg

Mn Ni

Ag0,00E+000

2,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

1,80E+008

EuTc-PHU

Interferentes

In

teg

ral

da e

mis

são

(C

on

t. f

óto

ns)

Figura 31 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuTc, EuTc-PHU e dos complexos EuTc-PHU na presença de interferentes.

EuOTc

EuOTc-P

HU

Zn AlCa Co Cu Fe

Mg

Mn N

iAg

0,00E+000

2,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

EuOTc-PHU

Interferentes

In

teg

ral

da e

mis

são

(C

on

t. f

óto

ns)

Figura 32 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuOTc, EuOTc-PHU e dos complexos EuOTc-PHU na presença de interferentes.

64

EuCTc

EuCTc-PHU

Zn Al Ca Co Cu Fe Mg

Mn Ni

Ag0,0

2,0x10 6

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7

1,2x10 7

EuCTc-PHU

Interferentes

In

teg

ral

da e

mis

são

(C

on

t. f

óto

ns)

Figura 33 - Comparação da intensidade de emissão entre o os sinais dos complexos EuCTc, EuCTc-PHU e dos complexos EuCTc-PHU na presença de interferentes.

1.14 Complexos EuTC com Glicose

Sabendo que a glicose, na presença se GOx é quebrada em ácido glicônico e

peróxido de hidrogênio, foram realizados estudos com o complexo európio-

tetraciclinas para a verificação do PH resultante e assim, indiretamente da glicose.

Para este estudo foram utilizados os complexos 4Eu:1OTc-Glicose-Gox, 4Eu:1CTc-

Glicose-Gox e 3Eu:1Tc-Glicose-Gox para comparação dos resultados.

A Figura 34 mostra que a presença de apenas glicose com o complexo EuTC

não promove aumento na intensidade da luminescência do mesmo.

580 590 600 610 620 630 640 650

0,0

2,0x106

4,0x106

6,0x106

8,0x106

1,0x107

1,2x107

1,4x107

1,6x107

1,8x107

2,0x107

EuOTc EuOTc-Gli 50 mg/dL EuOTc-Gli 100 mg/dL EuOTc-Gli 200 mg/dL

Sina

l (C

ont.

fót

ons)


580 590 600 610 620 630 640 650

0,0

5,0x105

1,0x106

1,5x106

2,0x106

2,5x106

3,0x106

3,5x106

4,0x106

4,5x106

5,0x106

Sin

al (

Con

t. f

óton

s)


EuCTc EuCTc-Gli 50 mg/dL EuCTc-Gli 100 mg/dL EuCTc-Gli 200 mg/dL

Figura 34 - Emissão dos complexos EuOTc e EuCTc, acrescidos de glicose nas concentrações de 50, 100 e 200 mg/dL.

65

Nos experimentos seguintes foi adicionado Gox ao complexo EuTC-

Glicose para a quebra da molécula de açúcar e formação de peróxido de hidrogênio.

Foi utilizada a concentração de 5µL de Gox, pois para 225 mg/dL de glicose maiores

quantidades de Gox não mostraram diferença no aumento na luminescência e

portanto na formação de PH. Observa-se que para todas as tetraciclinas estudadas

houve um aumento na emissão do complexo.

A Figura 35 mostra a emissão e curva de calibração do complexo EuTc-

Glicose-Gox. Houve um aumento de 4,7 vezes na emissão com linearidade de 0 à

100 mg/dL de glicose. O limite de detecção foi de 0,29 mg/dL.

66

570 600 630 660 6900,0

2,0x10 6

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7

Sin

al

(Co

nt.

fóto

ns)


0 mg/dL Gli 10 mg/dL Gli 25 mg/dL Gli 50 mg/dL Gli 75 mg/dL Gli 100 mg/dL Gli 125 mg/dL Gli 150 mg/dL Gli 175 mg/dL Gli 200 mg/dL Gli 225 mg/dL Gli + 3Eu:1Tc + Gox

0 50 100 150 200 2502,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

3Eu:1Tc + Gox + Glicose

Sin

al

(C

on

t. f

óto

ns)

Concentração de Glicose (mg/dL)



b Slope 1 ,0075E6 98796,58625

Figura 35 - Emissão e curva de calibração dos complexos EuTc-Glicose-Gox, variando a concentração de glicose nas amostras. Excitação em 400 nm.

O complexo EuOTc-Glicose-Gox apresentou um aumento de 3,1 em em

relação à amostra sem glicose (Figura 36). A faixa de linearidade foi de 10 a 125

mg/dL de glicose e o limite de detecção obtido foi 0,246 mg/dL.

67

570 600 630 660 6900,0

2,0x10 6

4,0x10 6

6,0x10 6

8,0x10 6

1,0x10 7

1,2x10 7

Sin

al

(Con

t. f

óto

ns)


0 mg/dL Gli 10 mg/dL Gli 25 mg/dL Gli 50 mg/dL Gli 75 mg/dL Gli 100 mg/dL Gli 125 mg/dL Gli 150 mg/dL Gli 175 mg/dL Gli 200 mg/dL Gli 225 mg/dL Gli + 4Eu:1OTc + Gox

0 50 100 150 200 250

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

1,80E+008

2,00E+008

2,20E+008 4Eu:OTc + Gox + Glicose

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)



Value Standard Errora Intercept 1 ,02799E8 4,1 01 52E6

b Slope 835385,36983 68690,06374

Figura 36 - Emissão e curva de calibração dos complexos EuOTc-Glicose-Gox, variando a concentração de glicose nas amostras. Excitação em 390 nm.

A Figura 37 mostra a emissão e curva de calibração do complexo EuCTc-

Glicose-Gox. Houve um aumento de 4,2 vezes na luminescência em relação à

68

amostra sem glicose com linearidade de 10 a 125 mg/dL de glicose. O limite de

detecção foi de 0,22 mg/dL.

570 600 630 660 6900,0

4,0x10 5

8,0x10 5

1,2x10 6

1,6x10 6

2,0x10 6

2,4x10 6

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)


0 mg/dL Gli 10 mg/dL Gli 25 mg/dL Gli 50 mg/dL Gli 75 mg/dL Gli 100 mg/dL Gli 125 mg/dL Gli 150 mg/dL Gli 175 mg/dL Gli 200 mg/dL Gli 225 mg/dL Gli

+ 4Eu:1CTc + Gox

0 50 100 150 200 2505,0x10 6

1,0x10 7

1,5x10 7

2,0x10 7

2,5x10 7

3,0x10 7

3,5x10 7

4,0x10 7

4,5x10 7

4Eu:1CTc + Gox + Glicose

Sin

al

(Co

nt.

fó

ton

s)



Value Standard Errora Intercept 1 ,70685E7 682056,68524

b Slope 1 59783,35838 1 1 71 9,52054

Figura 37 - Emissão e curva de calibração dos complexos EuCTc-Glicose-Gox, variando a concentração de glicose nas amostras. Excitação em 390 nm.

Foram também realizados estudos do tempo de vida com os complexos:

EuTc-Glicose-Gox (Figura 38 e Tabela 13), EuCTc-Glicose-Gox (Figura 39 e Tabela

14) , EuOTc-Glicose-Gox (Figura 40 e Tabela 15). Todos apresentaram um aumento

no tempo de vida.

69

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

3Eu:1Tc + 0 mg/dL Glicose + Gox 3Eu:1Tc + 50 mg/dL Glicose + Gox 3Eu:1Tc + 70 mg/dL Glicose + Gox 3Eu:1Tc + 100 mg/dL Glicose + Gox 3Eu:1Tc +15 0 mg/dL Glicose + Gox 3Eu:1Tc + 200 mg/dL Glicose + Gox

Sin

al (

Co

nt.

fó

to

ns)

Tempo (µs)

Figura 38 – Tempo de vida do complexo EuTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox.

Tabela 13 – Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida do complexo EuTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox.Complexo EuTc Parâmetros Valor Erros τav(µs)

3Eu:1Tc + 0 mg/dL Glicose +

Gox

A1 121550,65703 1193,59368

40,93τ1 0,02158 0,00021A2 24195,68202 1304,33551

τ2 0,07064 0,00265

3Eu:1Tc + 50 mg/dL Glicose

+ Gox

A1 109827,03652 17190,91484

65,87τ1 0,03599 0,00218A2 228310,65272 17184,86842

τ2 0,07297 0,00220

3Eu:1Tc + 70 mg/dL Glicose +

Gox

A1 297660,40431 33852,44129

67,74τ1 0,07218 0,00335A2 83103,63878 33824,85897

τ2 0,03511 0,00571


+ Gox

A1 332630,06093 31674,35235

69,33τ1 0,07286 0,00311A2 71109,08663 31586,01998

τ2 0,03334 0,00661


+ Gox

A1 395877,62839 19573,03805

69,83τ1 0,07132 0,00197A2 36073,95718 19108,45165

τ2 0,02721 0,00913


+ Gox

A1 88095,33658 71256,06906

74,09τ1 0,04264 0,01071A2 364994,19201 70906,74260

τ2 0,07823 0,00528

70

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

0

20000

40000

60000

80000

100000

4Eu:1CTc + 0 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1CTc + 50 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1CTc + 70 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1CTc + 100 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1CTc + 150 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1CTc + 200 mg/dL Glicose + Gox

Tempo (µs)

Figura 39 - Tempo de vida do complexo EuCTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox.

Tabela 14 - Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida do complexo EuCTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox.Complexo EuCTc Parâmetros Valor Erros τav(µs)

4Eu:1CTc + 0 mg/dL Glicose +

Gox

A1 72832,03257 198,45849

23,04τ1 0,01081 0,00008A2 5864,51364 206,69803

τ2 0,05365 0,00145


Gox

A1 15697,85126 520,36288

31,48τ1 0,05791 0,00143A2 98849,54040 331,70868

τ2 0,01355 0,00012


Gox

A1 105213,99684 639,21869

36,66τ1 0,01407 0,00022A2 22347,84784 968,24062

τ2 0,06115 0,00208


Gox

A1 27292,34207 1047,50260

41,08τ1 0,06431 0,00201A2 104849,44526 722,82028

τ2 0,01478 0,00024


Gox

A1 109849,01646 606,36756

48,94τ1 0,01573 0,00019A2 36639,60353 828,09009

τ2 0,07101 0,00145


Gox

A1 108472,36126 1411,83128

49,97τ1 0,01580 0,00043A2 44996,56435 1923,16881

τ2 0,06888 0,00253

71

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

4Eu:1OTc + 0 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1OTc + 50 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1OTc + 70 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1OTc + 100 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1OTc + 150 mg/dL Glicose + Gox 4Eu:1OTc + 200 mg/dL Glicose + Gox

Tempo (µs)

Figura 40 - Tempo de vida do complexo EuOTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox.

Tabela 15 - Parâmetros da dupla exponencial e tempo de vida do complexo EuOTc com diferentes concentrações de Glicose acrescidas de Gox.Complexo EuOTc Parâmetros Valor Erros τav(µs)

4Eu:1OTc + 0 mg/dL Glicose +

Gox

A1 92805,64026 7640,52093

57,83τ1 0,02675 0,00124A2 200902,32308 7841,81219

τ2 0,06385 0,00118


Gox

A1 34493,90438 11189,90736

95,31τ1 0,00716 0,00195A2 516263,77842 595,05360

τ2 0,09576 0,00023


Gox

A1 25886,81210 2044,08315

101,42τ1 0,01236 0,00224A2 556456,83466 1174,14417

τ2 0,10193 0,00042


Gox

A1 610676,00934 862,34273

106,94τ1 0,10736 0,00040A2 36465,36600 15303,10396

τ2 0,00750 0,00280


Gox

A1 642610,02664 777,36218

114,12τ1 0,11459 0,00042A2 40688,66998 11242,39342

τ2 0,00801 0,00216


Gox

A1 666793,47878 1273,20596

120,19τ1 0,12074 0,00075A2 41634,51733 9365,40061

τ2 0,00951 0,00276

72

CONCLUSÕES

Neste trabalho foram realizados estudos espectroscópicos dos complexos

európio-clorotetraciclina, európio-metaciclina e európio-oxitetraciclina na presença de

peróxido de hidrogênio e peróxido de uréia. Os resultados obtidos foram comparados

ao complexo európio-tetraciclina, este bastante estudado no meio científico.

Todos os complexos estudados (EuOTc, EuCTc e EuMTc) apresentaram as

características típicas de um complexo lantanídeo-ligante: um grande deslocamento

Stokes (aproximadamente 220 nm) importante para evitar a sobreposição dos

espectros de excitação e emissão; amplo espectro de absorção com pico em torno

de 400 nm com estreita banda de emissão em 615 nm com forte luminescência em

pH neutro.

Na presença dos peróxidos os espectros de absorção e emissão

característicos se mantêm, porém com há aumento significativo na luminescência.

Os complexos citados anteriormente foram comparados com o complexo EuTc.

Os resultados do complexo com PH e PHU podem ser resumidos na Tabela

16. A intensidade relativa corresponde à intensidade máxima de emissão com

peróxido/ intensidade da emissão sem peróxido.

Tabela 16 – Resumo dos resultados obtidos nos estudos com peróxido de hidrogênio e peróxido de uréia.

ComplexoIntensidade

Relativa

Linearidade

(µM)

Limite de

Detecção (mg/mL)

Tempo de

Vida (µs)

PH

EuTc 7,0 0-600 0,17 68,12EuOTc 4,0 0-600 0,12 95,13EuCTc 7,2 100-700 0,06 17,26EuMTc 0,0 - - 54,22

PHU

EuTc 7,0 0-1000 0,07 70,87EuOTc 4,5 0-500 0,24 85,57EuCTc 3,0 200-1000 0,08 12,83EuMTc 0,0 - - 53,06

73

Os complexos EuTc-PH e EuCTc-PH foram os que obtiveram maior aumento

na luminescência de até 7 vezes mais comparado ao complexo sem o peróxido.

Todos os complexos apresentaram praticamente o mesmo intervalo de linearidade e

bons resultados no limite de detecção sendo o complexo EuCTc-PH que obteve

melhor resultado, 0,06 mg/mL. O tempo de vida das amostras EuTc-PH e EuOTc-PH

praticamente dobraram o seu tempo de vida de fluorescência em relação às

amostras sem peróxido. Somente a EuCTc-PH não sofreu aumento significativo no

tempo de decaimento e o EuMTc-PH teve seu tempo de vida diminuido.

O complexo EuTc-PHU obteve melhor resultado. Apresentou maior aumento na

luminescência, um aumento de 7 vezes, com linearidade ao longo de toda a curva de

calibração, menor limite de detecção no valor de 0,07 mg/mL e dobrou seu tempo de

decaimento. O complexo EuCTc apresentou um bom resultado. Mostrou-se

relativamente linear em um grande intervalo e com baixo limite de detecção, com

aumento de 4,5 vezes na luminescência. O tempo de vida diminuiu em relação à

amostra sem o peróxido. O complexo EuOTc apresentou um pequeno aumento (3

vezes) na emissão com uma menor linearidade comparado aos anteriores, o maior

limite de detecção, porém o tempo de decaimento aumentou consideravelmente.

Para ambos os peróxidos observa-se que o complexo EuOTc mostrou um longo

tempo de vida, em torno de 90 µs.

O aumento da emissão com a adição do peróxido de hidrogênio ou com

peróxido de uréia ocorre devido à substituição de moléculas de água nos sítios de

coordenação do íon európio e a oxidação da tetraciclina pelo peróxido permitindo a

complexação de mais íons Eu3+ nos sítios da tetraciclina. Os peróxidos também

promovem uma reorganização estrutural do complexo em solução aproximando o íon

metálico central com os ligantes orgânicos aumentando a eficiência na transferência

de energia intramolecular. No complexo EuMTc não há alteração na emissão mesmo

em presença de peróxidos, possivelmente porque não há um aumento no número

de sítios de ligação da molécula.

Foi observado nos estudos com interferentes inorgânicos que estes

compostos não promovem interferência significativa no sinal de emissão, pois

74

considerando o aumento da luminescência em relação ao complexo EuTC sem a

presença dos peróxidos, a interferência torna-se irrelevante.

Assim um biossensor para PH e PHU mostra-se possível também para os

complexos EuCTc e EuOTc. No caso do PHU o complexo EuTc ainda mostrou-se

como a melhor opção para a detecção do peróxido, possibilitando a criação de um

método mais rápido, direto e de menor custo que pode ser realizado em temperatura

ambiente e ser observado sem a necessidade de condições especiais, já que a

emissão da luz é em uma região visível.

Os complexos EuCTc e EuOTc também mostraram-se eficientes na detecção

de glicose. O método baseia-se na adição da enzima glicose oxidase que promove a

quebra da glicose em ácido glicônico e peróxido de hidrogênio, que em presença do

complexo EuTC possui forte luminescência na região de 615 nm. Todos os

complexos apresentaram um aumento na emissão, baixo limite de detecção e

relativa linearidade até aproximadamente 125 mg/dL de glicose. Foi observado nos

experimentos um aumento gradativo no tempo de vida conforme o aumento da

concentração de glicose na amostra. O complexo EuOTc para 200 mg/dL de glicose

mostrou um tempo de vida de 120 µs, o dobro do valor obtido sem a presença de

glicose. Logo o método para determinação de glicose é promissor.

75

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Estudos espectroscópicos dos complexos európio-tetraciclinas e