ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SO FRANCISCO

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIRIDO

MARIA DE FATIMA SOUZA SILVA

ESTUDO QUMICO E AVALIAO DA ATIVIDADE

ANTIBACTERIANA DE Pityrocarpa moniliformis (BENTH)

LUCKON & R. W. JOBSON (FABACEAE)

PETROLINA - PE

2013

MARIA DE FATIMA SOUZA SILVA

ESTUDO QUMICO E AVALIAO DA ATIVIDADE

ANTIBACTERIANA DE Pityrocarpa moniliformis (BENTH)

LUCKON & R. W. JOBSON (FABACEAE)

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Recursos Naturais do Semirido

da Universidade Federal do Vale do So

Francisco, para obteno do ttulo de MESTRE

EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIRIDO.

rea de concentrao: Qumica e Atividade

Biolgica.

ORIENTADORA: Profa. Dra. Xirley Pereira Nunes.

PETROLINA - PE

2013

Ficha elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da Univasf Bibliotecrio (a): Maria Betnia de Santana da Silva CRB4-1747.

Silva, Maria de Fatima Souza

S729e Estudo qumico e avaliao da atividade antibacteriana de Pityrocarpa moniliformis (BENTH) Luckon & R. W. Jobson (fabaceae) / Maria de Fatima Souza Silva Petrolina, 2013.

xx;154f: il 29 cm . Dissertao (Mestrado em Recursos Naturais do

Semirido) - Universidade Federal do Vale do So Francisco, Campus Petrolina, Petrolina, 2013.

Orientadora: Dra. Profa. Xirley Pereira Nunes. 1. Botnica - Estudo qumico e biolgico 2.

Fabaceae 3. Pityrocarpa moniliformis. I. Ttulo. II. Universidade Federal do Vale do So Francisco.

CDD 581.19

ESTUDO QUMICO E BIOLGICO DE Pityrocarpa

moniliformis (BENTH) LUCKON & R.W JOBSON

(FABACEAE)

Aprovado em ___/___/___

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Xirley Pereira Nunes

(Universidade Federal do Vale do So Francisco)

Orientadora

Profa. Dra. Edignia Cavalcante da Cruz Arajo


Examinadora Interna

Profa. Dra. Gabriela Lemos de Azevedo Maia


Examinadora Externa

Aos meus pais, Anisio Jos da Silva e Maria do Carmo

Souza Silva

v

AGRADECIMENTOS

Agradeo...

em primeiro lugar a Deus meu protetor e guia por todas bnos concedidas.

aos meus pais, Anisio Jos da Silva e Maria do Carmo Souza Silva por todo

amor, apoio e educao dedicados. Pois apesar de todas as dificuldades, sempre

me ensinaram atravs de seus exemplos qualidades essenciais ao ser humano,

como: honestidade, humildade e determinao frente vida.

aos meus irmos: Shyrlene Souza Feitosa, Marcos Souza Silva e,

principalmente, Luciano de Souza Silva pela referncia acadmica que sempre foi e

pelo incentivo a carreira cientfica.

aos meus adorados sobrinhos Caio Gabriel e Raquel (ambos de dois aninhos)

que nasceram junto ao sonho de ingressar no mestrado. Agradeo pelas alegrias e

momentos de diverso que me motivaram de certa forma a sempre ir em frente.

ao meu namorado Francisco da Silva Matias, por estar ao meu lado nos

ltimos cinco anos e meio, sempre me apoiando nas horas boas e ruins.

a minha melhor amiga Keytte Emanuela da Silva Bernardo que me

acompanha desde a adolescncia, pela sua pacincia por ter tolerado tantas vezes

a minha ausncia em muitas ocasies.

a professora Dra. Xirley Pereira Nunes por tudo: confiana que me foi dada,

dedicao na orientao deste trabalho e pacincia em me passar tantos

ensinamentos.

ao professor Dr. Jackson Guedes por toda sua dedicao ao programa de

ps-graduao.

ao professor Dr. Raimundo Braz Filho da Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro pela sua generosa contribuio neste trabalho.

ao CRAD, em especial o professor Dr. Jos Alves de Siqueira Filho pelo

apoio concedido no fornecimento de material vegetal para as pesquisas.

a todos professores da ps-graduao, por transmitir no apenas

conhecimentos cientficos, mas paixo por suas reas de estudo.

a doutoranda Alessandra Pacheco por sua generosa ajuda nos experimentos

de microbiologia em especial por sua dedicao aos domingos.

aos alunos de iniciao cientfica Amara Caroline Oliveira, Cristhiane Adriely

Ferraz e Raimundo Oliveira Junior pela amizade e ajuda direta nos experimentos de

laboratrio, pois sem vocs eu no teria conseguido.

vi

aos tcnicos de laboratrio que auxiliaram no desempenho dos trabalhos.

a todos funcionrios que tornaram o dia a dia na Universidade mais

harmonioso.

as amigas veteranas de graduao; Camila de Souza Arajo, Edja Eliza Silva

e Suzana Vieira pelas experincias trocadas e momentos de descontrao.

e a todos os novos colegas que fiz na ps-graduao pela amizade,

conhecimento e experincias trocadas que foram de fundamental relevncia nesta

formao.

A todos, meus sinceros agradecimentos!

vii

ESTUDO QUMICO E BIOLGICO DE Pityrocarpa moniliformis (BENTH)

LUCKON & R.W JOBSON (FABACEAE)

RESUMO

Pityrocarpa moniliformis pertence famlia Fabaceae, terceira maior famlia das

angiospermas e uma das maiores entre as dicotiledneas. uma espcie arbrea e

frequentemente encontrada no Vale do Rio So Francisco. Conhecida popularmente

como angico de bezerro extremamente til para a apicultura local e amplamente

usada no fornecimento de madeira, lenha e carvo. Neste trabalho foi realizada a

triagem fitoquimica com os extratos brutos das sementes (Pm-EEB/S), partes areas

(Pm-EEB/PA) e fases particionadas a partir do extrato das partes aereas, fase

hexnica (Pm-Hex), fase clorofrmica (Pm-CHCl3) e fase acetato de etila (Pm-

AcOEt) onde observou-se predominantemente a presena de terpenos e compostos

fenlicos como os flavonoides. O estudo fitoqumico de Pm-CHCl3 resultou no

isolamento e identificao do -tocoferol e -tocotrienol, por meio de mtodos

cromatogrficos e espectroscpicos. A caracterizao dos extratos etanlicos brutos

e da fase acetato de etila foi realizada por CLAE-DAD (IES-EM), sendo possvel

identificar os flavonis glicosilados quercetagetina-3-metoxi-7-O-glicosideo,

isorhamnetina-7-O-glicosil (16) ramnosideo e siringetina 3-O--ramnoside-7-O--

glicosideo. A determinao do teor de fenis totais demonstrou que os extratos Pm-

EEB/PA (427,0640,97 mg de EAG/g), Pm-EEB/S (286.5028,04 mg de EAG/g) e a

fase Pm-AcOEt (150,95 7,52 mg de EAG/g), foram as que apresentaram maiores

valores. Quanto a determinao de flavonoides, foram verificados os maiores teores

para a fase Pm-CHCl3 e extratos Pm-EEB/PA e Pm-EEB/S com valores iguais a

188,001,36, 141,7018,04, 135,3012,47 mg de ECA/g. A avaliao da atividade

antioxidante evidenciou a presena de substncias nos extratos e fases de P.

moniliformis, eficazes em sequestrar radicais livres, como o DPPH, e pouco

eficientes em prevenir a oxidao de compostos em meios oxidveis, como o -

caroteno na presena do cido linoleico. O estudo da atividade fotoprotetora

demostrou que embora os extratos e fases de P.moniliformis tenham sido capazes

de absorver todas as radiaes referentes ao espectro eletromagntico da regio

ultravioleta, no mostraram eficincia em absorver a radiao da regio UVA e UVB.

Na avaliao antibacteriana os extratos e fases de P. moniliformis mostraram-se

ativos contra as bactrias Gram positivas e Gram negativas testadas, sendo mais

sensveis contra as bactrias Gram-positivas S. aureus e B. cereus. Este estudo

configura-se como pioneiro e de grande relevncia para o mapeamento dos

metablitos secundrios produzidos por esta espcie, uma vez que propem as

substancias responsveis pelas atividades aqui apresentadas.

Palavras-chave: Atividade antibacteriana, Estudo qumico, Pityrocarpa moniliformis.

viii

STUDY CHEMIST AND BIOLOGIC OF Pityrocarpa moniliformis (BENTH)

LUCKON & R.W JOBSON (FABACEAE)

ABSTRACT

Pityrocarpa moniliformis belongs to the Fabaceaes family, the third largest family of

angiosperms and one of the largest of the dicotyledons. It is an arboreal species and

often found in the Valley of the So Francisco River. Popularly known as "calfs

angico", it is extremely useful for the local apiculture and largely used in the supply of

timber, firewood and charcoal. In this work was carried out phytochemical screening

with crude extracts of the seeds (Pm-EEB/ S), leaves ( Pm-EEB/L) and phase

partitioned from the leaves extract , hexane phase (Pm-Hex), chloroform phase (Pm-

CHCl3) and ethyl acetate phase (Pm-AcOEt) where it was observed the presence of

terpenes and phenolic compounds such as flavonoids . The phytochemical study of

Pm-CHCl3 resulted in the isolation and identification of -tocopherol and -

tocotrienol, by chromatographic and spectroscopic methods. The characterization of

the crude ethanolic extract and the ethyl acetate phase was performed by HPLC-

DAD (IES- MS), it being possible to identify the glycosylated flavonols quercetagetina

-3'-methoxy-7-O-glycoside, isorhamnetin-7-O-glycosyl (16) rhamnosideo and

siringetina 3-O--ramnoside-7-O--glicosideo. The determination of total phenols

tenor showed that the phases Pm-EEB/L (427.06 40.97 mg GAE/g), Pm-EEB/S

(286.50 28.04 mg GAE/g) and Pm - AcOEt (150.95 7.52 mg GAE/g), presented

the highest values. Concerning the determination of flavonoids, were observed the

highest levels for phases Pm-CHCl3, Pm-EEB/L and Pm-EEB/S with values 188.00

1.36, 141.70 18.04, 135 30 12.47 mg CE/g. The evaluation of antioxidant activity

showed the presence of compounds in the extracts and stages of P. moniliformis,

effective on abduct free radicals such as DPPH and little efficient in preventing the

oxidation of compounds in oxidizable means, such as -carotene in presence of

linoleic acid. The study of Photoprotective activity demonstrated that although the

extracts and phases P. moniliformis have been able to absorb all the radiation

pertaining to electromagnetic spectrum of the ultraviolet region, showed no efficiently

absorb radiation in the UVA and UVB region. In antibacterial evaluation the phases

and extracts of P. moniliformis showed actives against positive and negative Gram

bacteria, being more sensitive against Gram-positive bacteria S. aureus and B.

cereus. This study is characterized as pioneering and of great relevance to the

mapping of secondary metabolites produced by this species, since they propose the

substances responsible for the activities presented here.

Keywords: Antibacterial activity, Chemical study, Pityrocarpa moniliformis.

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Distribuio geogrfica da famlia Fabaceae representada em vermelho

no mapa. Fonte: http://exa.unne.edu.ar/biologia/diversidadv, acessado em 04 de

maio de 2013..............................................................................................................25

Figura 02: I Espcies da subfamlia Mimosoideae: Pityrocarpa moniliformis

(Benth.) Luckow & R.W.Jobson; II - Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenam; III -

Senegalia polyphylla (DC.) Britton & Rose. (Fonte: SILVA e colaboradores

2012)..........................................................................................................................27

Figura 03: Mapa de distribuio de espcies do gnero Piptadenia representada nas

reas verdes. Fonte: LIRA, 2009................................................................................28

Figura 04: Alcalides isolados de espcies do gnero Piptadenia. Fonte: LIRA,

2009............................................................................................................................29

Figura 05: Pityrocarpa moniliformis (BENTH) LUCKON & R. W. JOBSON. Foto:

NUNES, 2007.....................................................................................................35

Figura 06: (a) Flores e folhas de P. moniliformis. Fonte: http://googleimagens.com.br

(b) frutos de P. moniliformis. Fonte: http:// www.univasf.edu.br/hvasf, acessos em 30

de junho de 2013........................................................................................................36

Figura 07: Reao de cido glico com o on molibdnio componente do reagente

Folin-Ciocalteu (NUNES e colaboraores, 2012 apud Oliveira e colaboradores

2009)..........................................................................................................................42

Figura 08: Formao do complexo Flavonoide-Al, em soluo metanlica de cloreto

de alumino(MARKHAM, 1982)..................................................................................43

Figura 09: Reao de reduo do DPPH..................................................................44

Figura 10: Componentes bsicos de um espectrofotmetro (DINIS, 2011)..............47

Figura 11: Identificao botnica: Exsicata n 1090, HVASF/CRAD.........................44

Figura 12: Moinho mecnico, A; Recipiente de ao inoxidvel, B.............................55

Figura 13: Placa contendo, meio de cultura bacteriano, amostras de P. moniliformis

em 8 diferentes concentraes e suspenso de bactrias aps a adio de CTT....69

Figura 14: Constituintes qumicos isolados da fase clorofrmica de Pityrocarpa

moniliformis................................................................................................................72

Figura 15: Expanso do espectro de RMN 13C - DEPT Q (125 MHz, CDCl3) de Pm-

01................................................................................................................................76

http://exa.unne.edu.ar/biologia/diversidadvhttp://googleimagens.com.br/

x

Figura 16: Expanso do espectro de RMN de 13C DEPT Q (125 MHz, CDCl3) de

Pm-01.........................................................................................................................77

Figura 17: Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de Pm-01............78

Figura 18: Expanso do espectro de 1H (500 MHz, CDCl3) de Pm-01.....................79


Figura 20: Espectro de correlo vicinal 1H x 1H de COSY (500 MHz, CDCl3) de Pm-

01................................................................................................................................80

Figura 21: Cromatograma obtido pela tcnica de cromatografia gasosa de Pm-

02................................................................................................................................81

Figura 22: Espectro de massa de Pm-02a, componente majoritrio de Pm-

02................................................................................................................................82

Figura 23: Propostas de fragmentaes de Pm-02a.................................................82

Figura 24: Espectro de massa de Pm-02b, componente de Pm-02..........................83

Figura 25: Propostas de fragmentaes para Pm-02b..............................................83

Figura 26: Biossntese dos terpenos.........................................................................84

Figura 27: Expanso do espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) de Pm-02...........88

Figura 28: Expanso do espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) de Pm-02...........89


Figura 30: Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de Mp-02............91

Figura 31: Espectro de correlao 1H x 13C - HSQC (500 MHz e 125 MHz, CDCl3)

de Pm-02....................................................................................................................92

Figura 32: Espectro de correlao 1H x 13C - HMBC (500 MHz e 125 MHz, CDCl3)

de Pm-02....................................................................................................................93

Figura 33: Espectro de correlo vicinal 1H x 1H de COSY (500 MHz, CDCl3) de Pm-

02................................................................................................................................94

Figura 34: Estrutura molecular dos tocoferis e tocotrienois....................................95

Figura 35: Perfil cromatografico de (A) Pm-EEB/S; (B) Pm-EEB/PA e (C) Pm-AcOEt

obtido por CLAE-DAD................................................................................................97

Figura 36: Quercetagetina-3-metoxi-7-O-glicosideo, proposto para Pm-

03................................................................................................................................99

Figura 37: Espectros de massa, EM e EM2 fornecidos por Pm-

03..............................................................................................................................100

Figura 38: Proposta de fragmentao para Pm-03.................................................101

xi

Figura 39: Isorramnetina-7-O-glicosil (16) ramnosdeo proposta para Pm-

04..............................................................................................................................103

Figura 40: EM e EM2 de isorramnetina-7-O-glicosil (16)

ramnosdeo...............................................................................................................103


Figura 42: Singeritina 3-O--thamnoside-7-O--glucosideo...................................105

Figura 43: EM e EM2 de singeritina 3-O--thamnoside-7-O--glucosideo.............106


Figura 45: Teor de flavonoides expressos em mg de equivalente por grama de

extrato bruto ou fase testada de P. moniliformis......................................................112

Figura 46: Comparativo do teor fenlico (mg de EAG/g) com; o percentual da

atividade antioxidante obtido no ensaio de inibio da oxidao do -caroteno (a) e

CI50% obtida no teste de sequestro de DPPH (g/mL)

(b).............................................................................................................................114

Figura 47: Ataque das EROs ou ERNs ao lipdios da membrana celular (Fonte:

BARREIROS; DAVID, 2006)....................................................................................115

Figura 48a: Proteo do tocoferol e ascorbato a membrana celular (Fonte:

BARREIROS; DAVID, 2006)....................................................................................116

Figura 48b: Regenerao do tocoferol pelo ubiquinol (Fonte: BARREIROS; DAVID,

2006)........................................................................................................................116

Figura 49: Absoro espectrofotomtrica dos extratos e fases de P.

moniliformis..............................................................................................................120

Figura 50: Fator de proteo solar (FPS) in vitro dos extratos e fases de P.

moniliformis..............................................................................................................121

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Caractersticas das tcnicas hifenadas (RODRIGUES e colaboradores

2006)..........................................................................................................................46

Tabela 02: Dados da triagem fitoqumica realizada com extratos de

P.moniliformis.............................................................................................................58

Tabela 03: Gradiente de solventes eludos pela coluna de CLAE.............................61

Tabela 04: Valores previamente determinados para o clculo do FPS. ...................67

Tabela 05: Dados de RMN 1H e 13C - DEPT Q, (, CDCl3, 500 MHz) da substncia

Pm-01.........................................................................................................................74

Tabela 06: Dados comparativos de RMN 1H e 13C da substncia Pm-01 (, CDCl3,

500 e 125 MHz respectivamente) com dados da literatura apresentados por Ayres e

colaboradores (2009) (RMN 1H e 13C, , CDCl3, 500 e 125 MHZ, respectivamente...75

Tabela 07: Dados de RMN 1H e 13C - DEPT Q (, CDCl3, 500 MHz) da substncia

Pm-02a/Pm-02b.........................................................................................................86

Tabela 08: Dados comparativos de RMN 1H e 13C da substncia Pm-02b (, CDCl3,

500 MHz) com dados da literatura apresentados por Carvalho e colaboradores

(2009) (RMN 1H e 13C, , CDCl3, 200,13 e 50 MHz,

respectivamente.........................................................................................................87

Tabela 09: Substancias detectadas em Pm-EEB/S, Pm-EEB/PA e Pm-AcOEt........96

Tabela 10: Contedo de fenlicos totais do extrato das sementes e fases

particionadas das folhas de P. moniliformis.............................................................110

Tabela 11: Atividade antioxidante dos extratos e fases de P. moniliformis.............113

Tabela 12: Tipo de radiao intensamente absorvida pela maior concentrao de

extratos e fases de P. moniliformis...........................................................................119

Tabela 13: Atividade antibacteriana dos extratos e fases de P. moniliformis..........124

xiii

LISTA DE QUADROS

Quadro 01: Alcalides isolados de espcies do gnero Piptadenia. Fonte: Lira

2009............................................................................................................................30

Quadro 02: Flavonoides isolados do gnero Piptadenia (LIRA, 2009).....................31

Quadro 03: Terpenos isolados do gnero Piptadenia (LIRA, 2009).........................33

Quadro 04: Fraes obtidas na CC da fase clorofrmica e sistema de solventes

utilizados......................................................................................................................60

Quadro 05: Resultados da triagem fitoqumica de extratos e fases de P.

moniliformis..................................................................................................................71

xiv

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 01: Preparao dos extratos etanlicos das partes areas (Pm-

EEB/PA) e sementes (Pm-EEB/S) de P. moniliformis................................................56

Fluxograma 02: Particionamento do extrato etanlico bruto das folhas de P.

moniliformis................................................................................................................57

Fluxograma 03: Procedimento cromatogrfico da fase clorofrmica de P

moniliformis..................................................................................................................60

xv

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

: Deslocamento qumico

CBM: Concentrao bacteriosttica mnima

CC: Cromatografia em Coluna

CCD: Cromatografia em camada delgada

CCDA: Cromatografia em camada delgada analtica

CCDP: Cromatografia em camada delgada preparativa

CDCl3: Clorofrmio deuterado

CIM: Concentrao inibitria mnima

CLAE: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

CLAE-DAD: Cromatografia Lquida de alta eficincia acoplada a um detector na

regio do UV com arranjos de diodos

CLAE-IES-EM-EM: Cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a

espectrometria de massas com ionizao por electropray

COSY: Espectroscopia de correlao homonuclear de hidrognio (correlated

specroscopy)

d: dupleto

dd: duplo dupleto

DAD: Detector de arranjo de diodos (Diode Array Detector)

EM: Espectrmetro de massas

ERNs: Espcies reativas de nitrognio

EROs: Espcies reativas de oxignio

FDA: Food and Drug Administration

HA: Soluo hidroalcolica

HMBC: Correlao heteronuclear de mltiplas ligaes (multiple bond correlation)

Hz: Hertz

xvi

HO.: Radical hidroxila

HSQC: Correlao heteronuclear quntica simples (heteronuclear single quantum

correlation)

IES: Ionizao por electropray

IES (+): Ionizao por electropray em modo positivo

IES-EM: Espectrometria de massas com ionizao por electropray

J: Constante de acoplamento

m: multipleto

NCCLS: National Commitee of clinical Laboratory Standards

Pm-AcOEt: Fase acetato de etila de Pityrocarpa moniliformis

Pm-CHCl3: Fase clorofrmica de Pityrocarpa moniliformis

Pm-EEB/PA: Extrato etanlico bruto das partes areas

de Pityrocarpa moniliformis

Pm-EEB/S: Extrato etanlico bruto das sementes de Pityrocarpa moniliformis

Pm-Hex: Fase hexnanica de Pityrocarpa moniliformis

ppm: partes por milho

RMN 1H: Ressonncia magntica nuclear de hidrognio

RMN 13C: Ressonncia magntica nuclear de carbono

s: simpleto

t: tripleto

TR: Tempo de reteno

UFC: Unidades formadoras de colnias

UV: Ultravioleta

OBS: as abreviaturas e os smbolos utilizados neste trabalho e que no constam

nesta relao, encontram-se descritas no texto ou so convenes adotadas

universalmente.

SUMRIO

1. INTRODUO.......................................................................................................21

2. FUNDAMENTAO TERICA.............................................................................25

2.1 Generalidades sobre a famlia Fabaceae (Leguminosae)...................................25

2.2 Aspectos Gerais sobre o gnero Piptadenia .......................................................27

2.3 Substncias isoladas do gnero Piptadenia........................................................29

2.3.1 Alcalides..........................................................................................................29

2.3.2 Flavonoides.......................................................................................................30

2.2.3 Terpenos...........................................................................................................32

2.4 Piptadenia moniliformis x Pityrocarpa moniliformis..............................................34

2.5 Consideraes gerais sobre Pityrocarpa moniliformis.........................................34

2.6 Compostos com Atividades Teraputicas............................................................36

2.6.1 Atividade antioxidante.......................................................................................36

2.6.2 Atividade fotoprotetora......................................................................................38

2.6.3 Atividade antibacteriana....................................................................................40

2.7 Uso de Tcnicas Hifenadas na Qumica de Produtos Naturais...........................41

2.7.1 Quantificao de fenis.....................................................................................41

2.7.2 Quantificao de flavonoides............................................................................42

2.7.3 Determinao da atividade antioxidante in vitro................................................43

2.7.3.1 Mtodo de DPPH............................................................................................43

2.7.3.2 Autoxidao do sistema -caroteno/cido linoleico.......................................44

2.7.3.3 Determinao da atividade fotoprotetora.......................................................45

2.8 Uso de Tcnicas Hifenadas na Qumica de Produtos Naturais...........................45

2.9 Espectro de Massas.............................................................................................47

2.9.1 Fonte de ionizao............................................................................................48

2.9.2 Analisadores de massas...................................................................................48

2.9.3 Detectores.........................................................................................................49

2.10 IES-EM...............................................................................................................49

2.10.1 Dissociao induzida por coliso....................................................................50

3. OBJETIVOS...........................................................................................................52

3.1 Geral.....................................................................................................................52

3.1 Especficos...........................................................................................................52

4. MATERIAL E MTODOS......................................................................................54

4.1 Coleta do Material Botnico.................................................................................54

4.2 Obteno dos Extratos das Folhas e Sementes de P. moniliformis.....................55

4.3 Preparao das Fases de P. moniliformis............................................................56

4.4 Avaliao Fitoqumica Preliminar dos Constituntes Qumicos............................57

4.5 Mtodos Cromatogrficos Utilizados no Isolamento de Substncias..................58

4.6 Isolamento e Purificao dos Constituintes Qumicos.........................................59

4.7 Mtodos Espectromtricos Utilizados na Identificao de Substncias..............60

4.7.1 Anlise por CLAE-DAD/IES-EM........................................................................61

4.7.2 Cromatografia gasosa acoplada a espectrmetro de massas (CG-EM)...........62

4.8 Determinao Quantitativa do Teor de Fenis totais...........................................62

4.9 Determinao Quantitativa do Teor de Flavonoides............................................63

4.10 Avaliao da Atividade Antioxidante..................................................................63

4.10.1 Seqestro do Radical Livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)........................64

4.10.2 Inibio da Autooxidao do -caroteno.........................................................65

4.11 Avaliao da Atividade Fotoprotetora.................................................................66

4.11.1 Determinao da absoro mxima e fator de proteo solar (FPS).............66

4.12 Avaliao da Atividade Antibacteriana...............................................................67

4.12.1 Preparo da suspenso de microorganismos...................................................68

4.12.2 Determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM)................................68

4.12.3 Determinao da Concentrao Bactericida Mnima (CBM)...........................68

4.13 Analise Estatstica..............................................................................................69

5. RESULTADOS E DISCUSSO.............................................................................71

5.1 Triagem Fitoqumica dos Extratos e Fases de P. moniliformis............................71

5.2 Constituntes Qumicos Isolados da Fase Clorofrmica de Pityrocarpa

moniliformis................................................................................................................72

5.3 Identificao Estrutural de Pm-01........................................................................73

5.4 Identificao Estrutural de Pm-02........................................................................81

5.5 Consideraes sobre a vitamina E.......................................................................95

5.6 Estudo Metabolmico de Pityrocarpa moniliformis por CLAE-DAD-IES-

EM..............................................................................................................................96

5.6.1 Identificao das Substncias...........................................................................98

5.6.2 Caracterizao dos Flavonoides de P. moniliformis..........................................98

5.6.3 Proposta para Pm-03........................................................................................99

5.6.4 Proposta para Pm-04......................................................................................102

5.6.5 Proposta para Pm-05......................................................................................105

5.7 Flavonoides no Identificados............................................................................108

5.8 Determinao do Teor de Fenis e Flavonoides Totais e Atividade Antioxidante

in vitro de P. moniliformis.........................................................................................109

5.9 Atividade Fotoprotetora......................................................................................118

5.10 Atividade Antimicrobiana de P. moniliformis....................................................122

6. CONCLUSES....................................................................................................126

7. REFERNCIAS....................................................................................................129

8. APNDICE ..........................................................................................................146

21

Silva, M. F. S. Introduo

1. INTRODUO

A busca por alvio e cura de doenas atravs da ingesto de ervas e folhas,

talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilizao dos produtos naturais pelas

populaes antigas (VIEGAS e colaboradores, 2006). No entanto, esses produtos

no ficaram restritos apenas aos tempos antigos, pois so considerados atualmente

como a principal matria prima das indstrias farmacuticas (ZUANAZZI;

MAYORGA, 2010).

Dados da Organizao Mundial de Sade mostram que dos 252 frmacos

essenciais para a sade humana, 11% so exclusivamente de origem vegetal. E no

mercado mundial de medicamentos, estimado em cerca de 300 bilhes de dlares,

aproximadamente 40% destes so oriundos direta ou indiretamente de fontes

naturais, sendo 75% fitoprodutos de origem vegetal e 25% de origem animal e de

microorganismos (ZUANAZZI; MAYORGA, 2010).

O uso e a aplicao das plantas medicinais na teraputica vasta, e abrange

desde o combate ao cncer at o combate a microorganismos patognicos (SILVA;

CARVALHO, 2004).

Na busca por molculas ativas com potenciais teraputicos, destacam-se os

compostos naturais com propriedades antioxidantes e fotoprotetoras que melhoram

a qualidade e a expectativa de vida ao atuarem contra o stress oxidativo, associado

a muitas doenas crnicas e degenerativas, como o alzheimer, parkinson,

arterosclerose, complicaes do diabetes e envelhecimento precoce (SORG, 2004).

Outras molculas que promovem a ao antibacteriana tambm tem sido

crescentemente pesquisadas, isso por que o uso indiscriminado e frequente de

antibiticos em medicina humana e veterinria considerado o principal responsvel

na promoo do aumento da resistncia bacteriana. Estes fatores impem a

necessidade permanente de pesquisas e desenvolvimento de novos compostos a

serem utilizadas no combate e/ou controle desses microorganismos (RATES, 2001).

Sobretudo, a atividade biolgica de plantas superiores e aromticas tem sido

amplamente utilizada na medicina popular, sendo reconhecida uma importante fonte

de produtos teraputicos uma vez que apresentam ampla atividade e inibio

comprovada contra muitas espcies de bactrias (DUARTE e colaboradores, 2004).

22


Muitas so as propriedades teraputicas conferidas s plantas em decorrncia

dos princpios ativos desenvolvidos pelo seu metabolismo secundrio. Nesses

organismos, os compostos so biossintetizados como um mecanismo prprio de

defesa para atuarem em alvos moleculares especficos de seus predadores

(FERREIRA; PINTO, 2010) e variam dependendo de uma interface qumica entre as

plantas e o ambiente circundante. Fato este que interfere na quantidade e qualidade

de produtos secundrios resultantes de uma planta em um determinado momento

(GOBBO-NETO, 2007).

No entanto, embora o Brasil possua a maior diversidade gentica em espcies

de plantas no mundo, menos de 10% foram avaliadas quanto as suas caractersticas

biolgicas e menos de 5% foram submetidas a estudos fitoqumicos detalhados

(LUNA et al., 2005) ficando inclusive atrs de pases menos desenvolvidos

tecnologicamente (PEDROSA e colaboradores, 2001). Fazendo-se necessrio,

muitos ajustes para garantir a colocao merecida do nosso pais frente a um

contexto de necessidade de novos fitoprodutos que sanem as enfermidades que

cada dia surgem na populao.

O Brasil detm uma rea total de 8,5 milhes de km2 e considerado o quinto

maior pas em extenso territorial do mundo (BAS; GADELHA, 2007). Estima-se

que um tero de toda flora mundial esteja sob sua posse, sendo que uma parte

significativa deste percentual composta por muitas espcies endmicas

(BARREIRO; BALZANI, 2009).

A biodiversidade brasileira uma reconhecida fonte de substncias

biologicamente ativas e uma fonte ainda inexplorvel de novos frmacos distribuda

nos biomas: Caatinga, Floresta Amaznica, Cerrado, Mata Atlntica, Pantanal,

Manguezal e as transies, recentemente consideradas, Amaznia-caatinga,

Amaznia-cerrado, Cerrado-caatinga (WWF-Brasil, 2013).

Os biomas brasileiros abrigam 55 mil espcies de plantas, sendo que cerca de

10 mil podem ser medicinais, aromticas e teis, com elevada importncia

econmica para o mercado mundial de produtos farmacuticos, cosmticos e

agroqumicos (MARINHO e colaboradores 2007). Nesta perspectiva, muitas

pesquisas de bioprospeco nos nossos biomas vm sendo desenvolvidas,

objetivando uma busca racional de bioprodutos de valor agregado (BARREIRO;

BOLZANI, 2009).

23


Apesar de determos de grande riqueza em biodiversidade no permitido

concluir que esta matria prima seja inesgotvel e, por isso, no seja preservada,

pois muitos dos insumos vegetais utilizados por indstrias brasileiras no so

fornecidos a partir de plantas cultivadas, sendo obtidas principalmente por

extrativismo (ZUANAZZI; MAYORGA, 2010).

O bioma caatinga, exclusivamente brasileiro, uma zona biogeogrfica que

abrange 4440 espcies de plantas com 16,8% de edemismo (GANEN;

DRUMMOND, 2010) castigada pela desertificao natural e provocada, que numa

situao crescente pem em risco a existncia de muitas espcies. Segundo dados

publicados no ano de 2010 pelo o Ministrio do Meio Ambiente, at o ano de 2008,

45% da vegetao original deste bioma foi perdida e cresce 0,33% ao ano.

Devido a este cenrio aes de conservao neste ambiente devem ser mais

bem conduzidas com intuito de preservar a vegetao local antes que sejam

perdidas espcies ainda no estudadas do ponto de vista qumico e biolgico, e que

podem ser uteis no uso teraputico de vrias enfermidades.

Com o intuito de enriquecer o conhecimento cientfico cerca do bioma

caatinga foi realizado o estudo qumico da espcie Pityrocarpa moniliformis inserida

na paisagem de clima semirido, atravs do uso de tcnicas cromatogrficas e

tcnicas hifenadas aplicadas no isolamento e/ou identificao de compostos

qumicos.

analise qumica das substncias presentes em P. moniliformis, foi

incrementada a discusso do teor de fenis e flavonoides totais, avaliao da

atividade antioxidante e fotoprotetora dos extratos e fases obtidos, fazendo-se uso

de mtodos espectrofotomtricos. Sobretudo a espcie estudada teve sua ao

biolgica testada por meio da avaliao da atividade da antibacteriana, contra

espcies Gram positivas e Gram negativas.

25

Silva, M. F. S. Fundamentao Terica

2. FUNDAMENTAO TERICA

2.1 Aspectos Gerais sobre a Famlia Fabaceae (Leguminosae)

A famlia Fabaceae (Leguminosae), terceira maior entre as angiospermas,

compreende cerca de 727 gneros e 19.135 espcies distribudas principalmente

nas regies tropicais, subtropicais e temperadas do globo (Figura 01) (LEWIS e

colaboradores, 2005).

Figura 01: Distribuio geogrfica da famlia Fabaceae representada em vermelho

no mapa.

Fonte: http://exa.unne.edu.ar/biologia/diversidadv, acessado em 04 de maio de

2013.

No Brasil esta famlia ocorre em cerca de 210 gneros e 2.694 espcies (LIMA,

2007), com grande aplicao popular e econmica que compreende desde o uso na

fabricao de mveis, confeco de rodas e eixo de carro de boi at uma ampla

utilizao na medicina popular (RODRIGUES; CARVALHO, 2012).

http://exa.unne.edu.ar/biologia/diversidadv

26


As leguminosas representam uma das famlias mais tpicas de regies

brasileiras com dficit hdrico e de clima semirido, formando um dos principais

recursos naturais da flora nativa desses ambientes (FONTENELE e colaboradores,

2009).

Alm de ser conhecida por sua relevncia apcola e possuir um importante

papel biolgico como fonte de nitrognio (FONTENELE e colaboradores, 2009)

considerada por muitos autores como uma excelente representante do bioma

caatinga correspondendo 30% da vegetao local, com 80 espcies endmicas

atualmente relatadas (GIULLIETTI e colaboradores, 2003; QUEIROZ, 2006).

Qumicamente a famlia Fabaceae tem apresentado incidncia de cumarinas

(RIBEIRO; KAPLAN, 2002), alcalides do tipo indlicos, quinolizidnicos,

pirrolizidnicos, isoquinolnicos, piperidnicos e piridnicos (SMOLENSKI;

KINGHORN, 1981) e flavonoides do tipo isoflavonas, comumente alvos de estudos

para uso em terapia de reposio hormonal na ps-menopausa (GRAHAM; VANCE,

2003).

Taxonomicamente est divida nas subfamlias Faboideae, Caesalpinioideae e

Mimosoideae (LEWIS e colaboradores, 2005).

Faboideae, maior entre as divises de Fabaceae, caracterizada como um

grupo de sementes e legumes de espcies herbceas de alto valor nutritivo para

homens e animais onde h deficincia de protenas no globo (SOUZA, 2004).

Compreende cerca de 482 gneros e 12.000 espcies (LEWIS e colaboradores,

2005) e frequentemente encontrada em regies temperadas (ANDRADE e

colaboradores, 2003). Entre as espcies mais consumidas pertencentes a este txon

esto o feijo (Phaseolus vulgaris), lentilha (Lens culinaris), soja (Gyicine max) e

amendoim (Arachis hypogaeae) (HEYWOOD, 1996).

Mimosoideae a segunda maior subfamlia com cerca de 3.270 espcies

(LEWIS e colaboradores, 2005) distribudas nas regies tropicais, subtropicais e

clido-temperadas (ANDRADE e colaboradores, 2003), sendo sua maior diversidade

encontrada nos trpicos (COUTINHO, 2009). A maior parte das suas espcies

pertencente ao gnero Acacia, Mimosa e Ing (NUNES; GARCIA; LIMA, 2007).

Botanicamente so caracterizadas por possurem folhas bipinadas com frequente

nectrio extrafloral (COUTINHO, 2009), a exemplo da espcie em estudo

27


Pityrocarpa moniliformis, Anadenanthera colubrina e Senegalia polyphylla,

observadas na Figura 02.

Caesalpinioideae, menor subfamlia de Fabaceae, possui cerca de 2.200

espcies, distribudas em regies tropicais e subtropicais (ANDRADE e

colaboradores, 2003) e 150 gneros nos quais Bauhinia L, Chamaecrista Moench e

Senna Mill se destacam em nmero de espcies (CRONSQUIST, 1981).

Figura 02: I Espcies da subfamlia Mimosoideae: Pityrocarpa moniliformis

(Benth.) Luckow & R.W.Jobson; II - Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenam; III -

Senegalia polyphylla (DC.) Britton & Rose.

Fonte: SILVA e colaboradores, 2012.

2.2 Aspectos Gerais sobre o gnero Piptadenia

O gnero Piptadenia (Mimosoideae) compreende cerca de 25 espcies nas

formas arbreas, arbustos e lianas (MOURA, 2011) distribudas nos trpicos da

Amrica do sul com centros de diversidade na Amaznia e na floresta Atlntica do

Brasil (LEWIS et al., 2005). Espcies como P. peregrina, P. macrocarpa, P. rigida, P.

viridiflora P. paraguayensi e P. africana tem distribuio registrada na frica tropical,

Senegal a Angola e em toda a regio do Congo e Uganda (Figura 03) (MORIM,

2010).

No Brasil so ocorrentes 21 espcies, sendo 13 (61%) presentes na Mata

Atlntica e regio sudoeste onde o gnero atinge o auge da sua diversidade central

(MORIM, 2010). O perodo de florao geralmente se estende de dezembro a maro

e o de frutificao de abril a julho, podendo ir at setembro em algumas espcies

(MOURA, 2011).

28


As espcies deste gnero so conhecidas popularmente como angico,

angico branco, angico do campo, angico roxo, angico vermelho, angico

bravo, angico preto, angico rajado, angico de cerrado e na Argentina e

Paraguai, conhecidas como cebil, cebil colorado e cebil ita (CARVALHO, 2009;

CORREA, 1984; RIZZINI, 1998).

Economicamente so importantes por fornecer madeira de boa qualidade para

uso em construes e fabricao de mveis, alm de serem frequentemente usadas

em projetos de reflorestamento (MOURA, 2011) e na medicina popular, a exemplo

de Piptadenia stipulaceae, cujo decocto ou tintura da casca do caule so usadas

como antiinflamatrio (ALBUQUERQUE; ANDRADE, 2002) e Piptadenia

adiantoides, usada no tratamento de bronquite e infeco do pulmo (CAMPOS,

2009).

Figura 03: Mapa de distribuio de espcies do gnero Piptadenia representada nas

reas verdes.

Fonte: LIRA, 2009.

29


R1

N

R2

R3

NCH3

I - R1 = H, R2 = OH, R3 = CH3

II - R1 = H, R2 = H, R3 = H

III - R1 = H, R2 = H, R3 = CH3

IV - R1 = H, R2 = OCH3, R3 = CH3

V - R1 = O-, R2 = OCH3, R3 = H

VI - R1 = O-, R2 = OH, R3 = CH3

VII - R1 = O-, R2 = H, R3 = CH3

2.3 Substncias isoladas do gnero Piptadenia

Segundo levantamento bibliogrfico realizado por Lira (2009) este gnero

composto por alcalides, extrados principalmente das sementes, flavonoides e

terpenos, conforme apresentado a seguir:

2.3.1 Alcaloides

So substncias orgnicas, de origem natural e cclicas, contendo uma tomo

de nitrognio no estado de oxidao negativo (SIMES e colaboradores, 2010). So

diversas as funes observadas em plantas que possuem alcaloides, como a de

proteo contra a radiao ultravioleta. Essa propriedade pode ser conferida aos

alcaloides que possuem, em sua maioria, ncleos aromticos altamente absorventes

dessa radiao (HENRIQUES e colaboradores, 2000).

Para este gnero foram encontrados alcalides verdadeiros do tipo indlico e

um protoalcalide. No quadro 01 e Figura 04 esto registrados todos os alcaloides,

at ento, isolados de espcies de Piptadenia.

A bufotenina o alcaloide mais relatado nas sementes do gnero, sendo

conhecida por sua capacidade de provocar alucinaes visuais e utilizao como

matria prima para preparao de derivados triptamnicos que podem exibir

atividade antimicrobiana, antitumoral e atuar como capturadores de radicais livres

(MOREIRA, 2011).

Figura 04: Alcaloides isolados de espcies do gnero Piptadenia.

Fonte: LIRA, 2009.

O

OCH3

NH

NHN

N

VIII

30


Quadro 01: Alcaloides isolados de espcies do gnero Piptadenia.

Fonte: LIRA, 2009.

2.3.2 Flavonoides

Os flavonides esto amplamente distribudos no reino vegetal e representam

um dos grupos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem

natural. Muitos estudos tem sido realizados devido as vrias propriedades que a

classe exibe frente a sistemas biolgicos, tais como efeitos antimicrobiano, antiviral, ,

citotxico, antineoplsico, antihepatotxico, antihipertensivo, hipolipidmico,

antiinflamatrio entre outros. Alm dos muitos relatos sobre sua funo em retardar

ou inibir a oxidao de lipdios ou outras molculas, evitando o incio ou propagao

das reaes de oxidao em cadeia, conferindo, assim, sua popular ao

antioxidante (MACHADO e colaboradores, 2008).

A estrutura bsica dos flavonoides consiste na composio de 15 tomos de

carbonos distribudos em dois anis aromticos identificados como A e B

interligados via carbono oxigenado pertencente a um anl pirano, que quando

formado classificado como anel C, a exceo est na estrutura das chalconas.

Conforme o estado de oxidao da cadeia heterociclica do pirano diferentes classes

Alcalide Espcie vegetal

I Bufotenina

P. columbrina P. communis, P. contorta,

P. excelta, P. falcata, P. leptostachya,

P. macroarpa e P. peregrina

II N - metiltriptamina P. macrocarpa, P. peregrina

III N, N - dimetiltriptamina P. peregrina

IV 5 - metxidimetiltriptamina P. peregrina e P. macrocarpa

V 5 metxi-N-metiltriptamina P. peregrina e P. macrocarpa

VI xido de bufotenina P. peregrina e P. macrocarpa

VII xido de N, N - dimetiltriptamina P. peregrina

VIII Teobromina P. leptostachya

31


de flavonoides so identificadas: antocianinas, flavonis, flavonas, isoflavonas,

flavononas e flavonas (VOLP e colaboradores, 2008).

No quadro 02 esto alguns dos flavonoides encontrados em partes de

espcies do gnero Piptadenia que incluem cascas, galhos e folhas, presentes nas

formas de agliconas e gliconas (LIRA, 2009).

Quadro 02: Flavonoides isolados do gnero Piptadenia.

Flavonoide Parte utilizada Espcie vegetal

Cascas P. cebil

Cascas P. rgida

Cascas P. macrocarpa

Folhas P. gonoacantha

32


Galhos P. gonoacantha

Galhos P. gonoacantha

Fonte: LIRA, 2009.

2.3.3 Terpenos

Os terpenos, cuja origem biossinttica, deriva de unidades do isopreno, formam

uma famlia riqussima em variaes estruturais constitudas de unidades

isoprenoides C5. Esses compostos possuem esqueletos de carbono, representados

por (C5)n com importantes atividades farmacolgicas, como antiinflamatria,

antinociceptiva, anestsica e antitumoral (SIMES e colaboradores, 2010)

Os triterpenos so frequentemente incidentes no gnero sendo j relatados o

sitosterol, 3-O-glucopiranosil sitosterol, lupeona e lupeol isolados de P. macrocarpa

(MIYAUCHI; YOSHIMOTO; MINAMI, 1976) e estigmasterol de P. gonoacantha

(CARDOZO, 2006), conforme descrito no Quadro 03.

33


Quadro 03: Terpenos isolados do gnero Piptadenia.

Terpenos isolados Parte utilizada Espcie vegetal

P. macrocarpa P. macrocarpa

P. macrocarpa P. macrocarpa

P. gonoacantha P. gonoacantha



Fonte: LIRA, 2009.

.

34


2.4 Piptadenia moniliformis X Pityrocarpa moniliformis

Alguns trabalhos recentemente publicados em peridicos na rea de agricultura

ainda reconhecem o nome Piptadenia moniliformis Benth, devido ao fato deste ser

considerado um sinnimo de Pityrocarpa moniliformis. No entanto, a nomenclatura

atual vem aos poucos sendo substituda e divulgada entre a comunidade cientfica.

Em 1841, Benthan agrupou espcies que possuam glndulas na antera e

sementes exalbuminosas ao gnero Piptadenia dividindo-a em trs sees:

Eupiptadenia, Pityrocarpa Benth e Niopa Benth que posteriormente vieram a ser

elevadas a gnero por Britton & Rose em 1927-1928, em que Eupiptadenia seguiu

com o nome de Piptadenia (TAMASHIRO,1989).

As espcies, do ento gnero denominado por estudiosos da poca de

complexo Piptadenia, por possuir ampla distribuio geogrfica e ser muito

relacionado a diversos outros gneros americanos, asiticos e africanos foram

distribudas em outros 8 gneros. Entre estes estava Pityrocarpa (Benth) Britton &

Rose caracterizado pelo legume deiscente e sementes lenticulares que em 1963

voltou a chamar-se apenas de Piptadenia Benth (TAMASHIRO,1989).

Mais tarde Piptadenia moniliformis, at ento identificada por Benth foi

novamente estudada por Richard W. Jobson e Melissa Luckow e no trabalho

intitulado Phylogenetic Study of the Genus Piptadenia (Mimosoideae: Leguminosae)

Using Plastid Trnl-f and Trnk/Matk Sequence Data (2007), sugeriram a incluso da

referida espcie ao gnero Pityrocarpa, por tratar de um taxn botanicamente

diferente, que detm de rvores desarmadas, flores recurvadas e ovrio num longo

ginforo. A nomenclatura botnica atribuda espcie objeto deste estudo trs

consigo os nomes de todos os cientistas que se empenharam em reclassific-la,

passando a chamar de Pityrocarpa moniliformis (BENTH) LUCKOW & R. W.

JOBSON (JOBSON; LUCKOW, 2007).

2.5 Consideraes Gerais sobre Pityrocarpa moniliformis

P. moniliformis uma espcie arbrea sem espinhos que possui em sua copa

arredondada folhas compostas e bipinadas (Figura 05), flores amareladas em forma

de espigas cilndricas (Figura 06a) e frutos denominados vagens (Figura 06b)

35


Ocorre principalmente na caatinga dos estados do Maranho, Piau, Cear indo at

a Bahia (BENEDITO, 2010).

Podendo atingir entre 4 e 10 m de altura conhecida popularmente como

angico-de-bezerro, catanduva, quipembe (PE), surucucu (BA) e carrasco

(PA) sendo, particularmente encontrada no Vale do Rio So Francisco (BENEDITO,

2010).

uma espcie rstica, de crescimento rpido, indicada para reflorestamentos

heterogneos com fins preservacionistas e recomendada como forragem para

bovinos e ovinos (AZEREDO e colaboradores, 2010). Na regio Nordeste do Brasil,

onde a apicultura tem como fonte as flores de plantas nativas, esta espcie destaca-

se como planta melfera em potencial. Suas flores so apreciadas pelas abelhas,

fornecendo mel de excelente qualidade (SILVA e colaboradores, 2004).

Figura 05: Pityrocarpa moniliformis (BENTH) LUCKON & R. W. JOBSON.

Foto: Nunes, 2007.

36


Figura 06: (a) Flores e folhas de P. moniliformis. (b) frutos de P. moniliformis.

Fonte: (a) Fonte:http://googleimagens.com.br (b) http:// www.univasf.edu.br/hvasf,

acessos em 30 de junho de 2013.

2.6 Compostos com Atividades Teraputicas

2.6.1 Atividade antioxidante

Na busca cada vez mais crescente por princpios ativos com propriedades que

melhoram a expectativa de vida, esto os compostos antioxidantes e fotoprotetores

naturais capazes de combater o stress oxidativo (BALOGH e colaboradores, 2011),

associado ao envelhecimento precoce e doenas degenerativas crnicas como

Alzheimer, Parkinson e aterosclerose (AMES; GOLD; WILET, 1995). O estresse

oxidativo corresponde a oxidantes e sua degradao, e ocorre quando a produo

de espcies reativas (ER) est acelerada ou quando os mecanismos envolvidos na

proteo contra eles encontram-se deteriorados (VICENTINO; MENEZES, 2007).

Os organismos aerbicos sobrevivem graas s reaes oxidativas, realizadas

atravs do oxignio (O2) atmosfrico. Contudo, tais reaes ainda que permitam a

continuidade da vida, ameaam a mesma, pois estas reaes permitem a formao

de espcies reativas de oxignio (ERO) (SOARES, 2002). Estas espcies tem

origem endgenas associada reaes metablicas (reao de oxidao na

mitocndria, fagocitose durante o processo de inflamao, ativao do metabolismo

do cido araquidnico) e exgena (devido radiao ultravioleta em especial o UVA

que reage com fotossensibilizadores e com cromforos da pele como a melanina)

06a 06b

http://googleimagens.com.br/

37


com fatores ambientais (pesticidas, poluio, fumaa de cigarro, medicamentos

antitumorais e estilos de vida no saudveis (HIRATA; SATO; SANTOS, 2004) e so

caracterizadas por ter um eltron livre em seu ltimo orbital molecular (SOARES,

2002).

As principais EROs distribuem-se em dois grupos, os radicalares: hidroxila

(HO), superxido (O2), peroxila (ROO) e alcoxila (RO); e os no-radicalares:

oxignio, perxido de hidrognio e cido hipocloroso (VICENTINO; MENEZES,

2007).

A predisposio gentica, fatores ambientais como radiao UV e propriedades

intrnsecas especficas de grupos celulares podem exacerbar o dano oxidativo ou

diminuir a capacidade das clulas de degradar agentes agressores (VICENTINO;

MENEZES, 2007).

Sabe-se que as EROs esto fortemente envolvidas nos processos de

fotodeteriorao da pele, induzidos pela radiao solar UV (ultravioleta). A radiao

UV contribui para a fotodeteriorao da pele, causando cncer cutneo,

fotoenvelhecimento, fotosensibilizao e outras patologias associadas. (RIBEIRO e


Ao reagirem com substratos biolgicos os radicais livres podem ocasionar

danos s biomolculas e, conseqentemente, afetar a sade humana. O trabalho de

Barreiros e colaboradores (2006) relata alguns prejuzos causados pelo excesso de

espcies reativas in vivo:

Podem quebrar a cadeia de DNA e RNA e ao ser reconectada ser alterada a

ordem de suas bases. Sendo esse um dos processos bsicos da mutao e o

acmulo de bases danificadas que pode desencadear a oncognese. Uma enzima

que tenha seus aminocidos alterados pode perder sua atividade ou, ainda, assumir

atividade diferente.

Podem promover a oxidao de lipdios da membrana celular, e alterar o

transporte ativo e passivo normal atravs da membrana, ou ocasionar a ruptura

dessa, levando morte celular.

Alm de provocar a oxidao de lipdios no sangue e, assim, agredir as

paredes das artrias e veias, facilitando o acmulo desses lipdios, com

38


conseqente aterosclerose, podendo causar trombose, infarto ou acidente vascular

cerebral.

As protees conhecidas do organismo contra as ERO e ERN abrangem a

proteo enzimtica ou por micromolculas, com ao antioxidante que podem ter

origem no prprio organismo ou serem adquiridas atravs da dieta. Uma substncia

com propriedade antioxidante qualquer substncia que, quando presente em baixa

concentrao comparada do substrato oxidvel, regenera o substrato ou previne

significativamente a oxidao do mesmo (BARREIROS e colaboradores, 2006 apud

HALLIWELL, 2000).

Os antioxidantes atualmente mais usados so de origem sinttica ou natural.

Alguns dos antioxidantes sintticos mais importantes so o hidroxianisol de butila

(BHA), hidroxitolueno de butila (BHT) e o galato de propila e entre os naturais

destacam-se cido ascrbico, vitamina E e -caroteno. Alm desses tem-se os

compostos fenlicos como potentes antioxidantes, podendo agir como redutores de

oxignio singleto, atuando nas reaes de oxidao lipdica, assim como na

quelao de metais (DUARTE-ALMEIDA e colaboradores, 2006). Embora seja

comum o uso de antioxidantes sintticos na indstria alimentcia, o consumo

frenquente tem sido visto de forma negativa, devido possibilidade de causarem

efeitos indesejveis em enzimas de vrios rgos humanos. Dessa forma, h grande

interesse em se encontrar novos antioxidantes que sejam seguros e provenientes de

fontes naturais (NAKATANI, 1996).

As EROs so responsveis pelo ponto chave do envelhecimento ao ser

consideradas extremamente danosas aos tecidos, uma vez que desencadeiam

reduo brusca da quantidade dos antioxidantes endgenos, atacam lipdeos de

membranas celulares, protenas, carboidratos e cidos nuclicos, causando

oxidao e alterao dessas molculas (NAKATANI, 1996).

2.6.2 Atividade fotoprotetora

A agresso do Sol cumulativa e irreversvel, capaz de produzir alteraes

normalmente imperceptveis aos nossos olhos, tais como induzir a diversas

alteraes bioqumicas, inclusive alteraes das fibras colgenas e elsticas, perda

de tecido adiposo subcutneo e fotocarcinognese (SOUZA, 2005).

39


As radiaes ultravioletas (UV), extremamente energticas, so divididas em

radiaes ultravioleta A (UVA), longas; ultravioleta B (UVB), medianas; e ultravioleta

C (UVC), curtas (SOUZA, 2005).

A radiao UVA, menos energtica, estende-se de 320 a 400 nm e ocorre

durante todo o dia, provocando danos mais leves e crnicos (STEINER, 1995);

caracteriza-se por no produzir eritema, por apresentar fraca ao bactericida, por

ser pigmentgena e por ser responsvel pelo bronzeamento imediato e de curta

durao (RANGEL; CORRA, 2002).

J a radiao UVB, de 290 a 320 nm, predominante entre 10 e 14 horas e

causa danos agudos, como queimaduras (STEINER, 1995), sendo eritematgena,

promovendo o bronzeamento tardio e de longa durao (SANTOS, 1987) e

responsvel pela transformao do ergosterol em vitamina D. E por ltimo a

radiao UVC (mais energtica), que se estende de 100 a 290 nm, absorvida pela

atmosfera, via camada de oznio (RANGEL; CORRA, 2002).

A proteo efetiva contra a radiao ultravioleta est disponvel na forma de

preparaes para uso tpico, contendo filtros solares, conhecidas como

fotoprotetores (SOUZA, 2005). Que so substncias capazes de absorver, refletir ou

refratar a radiao ultravioleta e assim proteger a pele da exposio direta da luz

solar (GIOKAS e colaboradores, 2005). A atividade biolgica de um protetor solar

avaliada por sua habilidade em proteger a pele de eritemas e edemas, reduzir o

risco de queimaduras e o risco de carcinoma de clulas da camada basal e

espinhosa (TOYOSHIMA e colaboradores, 2004).

Os filtros solares podem ser classificados em dois grupos: qumicos (sinttico e

natural) e fsicos. Os filtros solares qumicos ou orgnicos so, geralmente,

compostos aromticos com um grupo carbonila (ou parte de uma cetona ou um

ster) e um substituinte liberador de eltrons (normalmente grupo amina ou metoxi)

na posio orto ou para do anel benznico (SCHULER; ROMANOWSKI, 1999).

Os extratos vegetais com capacidade para absorver radiao UVA e UVB, so

principalmente vantajosos quando se detectada a ao antioxidante. Pois a ao

dessas duas atividades intensificariam a proteo final do produto ao tempo que

neutralizariam os radicais livres produzidos na pele aps exposio ao sol (SOUZA,

e colaboradores, 2013 apud CHIU; KIMBALL, 2003; DAL`BELO, 2008; KIM e

40


colaboradores, 2002; AQUINO e colaboradores, 2002; BONINA e colaboradores,

2000).

Vrios extratos e leos de plantas tm sido utilizados em produtos cosmticos

como filtros solares, devido ao fotoprotetora. Mas para isso, h necessidade que

os mesmos apresentem em sua composio, molculas com estruturas semelhantes

s dos filtros qumicos sintticos (VIOLANTE e colaboradores, 2009).

2.6.3 Atividade antibacteriana

A partir da descoberta da penicilina a busca de substancias com propriedades

antimicrobianas nos vegetais superiores ganhou impulso (SILVEIRA e

colaboradores, 2009 apud SOUZA, 2004) despertado uma investigao crescente

sobre o potencial da flora brasileira (AYRES, 2008).

Apesar dos avanos tcnico-cientficos, as doenas infecciosas continuam a

ocupar posio de destaque como causa de morbidade e mortalidade em todo o

mundo. Um dos principais fatores que explicam essa liderana a capacidade que

os microorganismos possuem para a aquisio de mecanismos de resistncia aos

tratamentos antimicrobianos. Tal habilidade impe a necessidade permanente de

pesquisas e desenvolvimento de novas drogas a serem utilizadas no combate e/ou

controle dos microrganismos (AYRES, 2008).

Uma grande variedade de mtodos podem ser empregados para medir a

atividade in vitro de extratos vegetais contra os agentes antimicrobianos. Os dois

mtodos mais comumente utilizados para a avaliao de extratos de plantas com

potencial antibacteriano so o de diluio em caldo e de difuso em gar (ALVES e


Ensaios de diluio so aqueles nos quais os extratos ou substncias a serem

testadas so adicionados a um meio de cultura lquido, previamente inoculado com o

microrganismo teste. Aps incubao, o crescimento do microrganismo

determinado pela leitura visual direta ou turbidimrica pelo uso de espectrofotmetro

em comprimento de onda apropriado (SILVEIRA, 2009 apud VANDEN BERGHE;

VLIETINCK, 1991).

41


Os ensaios de difuso so mtodos quantitativos, nos quais o efeito pode ser

graduado. Fundamentam-se na difuso da substncia a ser ensaiada, em um meio

de cultura slido e inoculado com o microorganismo. A partir da difuso ocorre o

aparecimento de um halo, no qual no h crescimento do microrganismo,

denominado halo de inibio. Diferentes tipos de reservatrios podem ser

empregados incluindo discos de papel, cilindros de porcelana ou de ao inoxidvel e

poos feitos no meio de cultura (SILVEIRA, 2009 apud VANDEN BERGHE;

VLIETINCK, 1991).

O mtodo de difuso em gar geralmente utilizado para microrganismos de

crescimento rpido e para alguns de crescimento fastidiosos. Para um resultado

confivel dos testes, preciso trabalhar com uma metodologia padronizada. O

mtodo padronizado que atualmente recomendado pela CLSI (Clinical and

Laboratory Standards Institute) se baseia no originalmente descrito por Bauer et al,

(1966).

2.7 Uso de Mtodos Espectrofotomtricos na Qumica de produtos Naturais

Os mtodos espectrofotomtricos tem se mostrado muito teis na qumica de

produtos naturais, sendo comumente utilizados para quantificar compostos fenlicos

e flavonoides em extratos e fases vegetais. Alm de atuarem na avaliao da

atividade antioxidante de amostras em diferentes modelos e ensaio da atividade

fotoprotetora.

2.7.1 Quantificao de fenis

Na determinao de compostos fenlicos totais, o mtodo Folin-Ciocalteu o

mtodo colorimtrico de oxidao/reduo mais utilizado (IKAWA e colaboradores,

2003).

O Folin-Ciocalteu um reagente formado a partir de misturas de cidos

fosfomolibdico e fosfotungustico, no qual o molibdnio e o tungstnio encontram-se

no estado de oxidao 6+, porm, em presena de certos agentes redutores, como

os compostos fenlicos, formam os chamados molibdnio e tungstnio de colorao

azul o que absorvem em 765 nm, nos quais a mdia do estado de oxidao destes

metais est entre 5 e 6, e cuja colorao permite a determinao da concentrao

das substncias redutoras (IKAWA e colaboradores, 2003).

42


A reao ocorre em meio alcalino e a soluo saturada de carbonato de sdio

(Na2CO3) a base mais indicada. O nmero de grupos hidroxilo controla a

quantidade de cor formada. O grupo fenlico deve estar na forma de fenolato para

que ambos os ons produzam a oxidao (Figura 07) (NACZK e colaboradores,

2004.

Figura 07: Reao de cido glico com o on molibdnio componente do reagente

Folin-Ciocalteu

Fonte: NUNES e colaboradores, 2012 apud OLIVEIRA e colaboradores, 2009).

2.7.2 Quantificao de flavonoides

Entre as tcnicas de quantificao de flavonoides destaca-se o uso da

espectrofotometria como uma tcnica bastante acessvel, prtica e menos onerosa.

Pois, devido s duplas ligaes presentes nos anis aromticos os flavonoides

podem ser analisados na regio do ultravioleta ou visvel. A tcnica de quantificao

de flavonoides baseia-se na medida da absorbncia, a 510 nm, do complexo

formado entre o flavonoide e o alumnio do reagente de cor, formando compostos de

colorao vermelha (Figura 08). O ction alumnio forma complexos estveis com os

flavonoides em metanol ocorrendo na anlise espectrofotomtrica um desvio para

maiores comprimentos de onda e uma intensificao da absoro. Deste modo,

43


possvel determinar a quantidade de flavonoides, evitando-se a interferncia de

outras substncias fenlicas (PEIXOTO SOBRINHO, 2008).

Figura 08: Formao do complexo Flavonoide-Al, em soluo metanlica de cloreto

de alumino

Fonte: MARKHAM, 1982.

2.7.3 Determinao da atividade antioxidante in vitro

Diversas tcnicas tm sido utilizadas para determinar a atividade antioxidante

in vitro, de forma a permitir uma rpida seleo de substncias e/ou misturas

potencialmente interessantes, na preveno de doenas crnicas e degenerativas.

Dentre estes mtodos destacam-se o sistema de co-oxidao do -caroteno/cido

linoleico e o mtodo de sequestro de radicais livres, tais como 2,2-difenil-1-

picrilhidrazila (DUARTE-ALMEIDA e colaboradores, 2006).

J o mtodo de oxidao do -caroteno cido linoleico determina a atividade de

uma amostra ou composto de proteger um substrato lipdico da oxidao enquanto

que o mtodo de DPPH baseia-se na transferncia de eltrons de um composto

antioxidante para um oxidante (DUARTE-ALMEIDA e colaboradores, 2006).

44


2.7.3.1 Mtodo de DPPH

Esse mtodo consiste em avaliar a atividade seqestradora do radical livre 2,2-

difenil-1-picrilhidrazila de colorao prpura que absorve a 515 nm, por ao de um

antioxidante (HOR). O DPPH reduzido formando difenilpicril hidrazina, de

colorao amarela, com consequente desaparecimento da absoro, podendo a

mesma ser monitorada pelo decrscimo da absorbncia (Figura 09). A partir dos

resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante ou

seqestradora de radicais livres e/ou a porcentagem de DPPH remanescente no

meio reacional. A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde

quantidade de DDPH consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de

antioxidante necessria para decrescer a concentrao inicial de DPPH em 50%

denominada concentrao eficiente (CE50), tambm chamada de concentrao

inibitria (CI50). Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra, menor ser a

sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante (SOUZA e colaboradores, 2007).

Figura 09: Reao de reduo do DPPH.

2.7.3.2 Autoxidao do sistema -caroteno/cido linoleico

No ensaio da oxidao acoplada do -caroteno/cido linoleico o sistema

modelo ao ser submetido em condies de oxidao, gera um radical a partir da

oxidao do cido linoleico, que ir abstrair o hidrognio da molcula insaturada do

-caroteno. Este mtodo tambm est fundamentado em medidas

45


espectrofotomtricas da descolorao (oxidao) do -caroteno induzida pelos

produtos de degradao oxidativa do cido linolico (DUARTE-ALMEIDA e


2.7.3.3 Determinao da atividade fotoprotetora

A atividade fotoprotetora avaliada por meio da determinao do FPS (fator de

proteo solar). O FPS estimado por espectrofotometria um nmero que avalia o

filtro solar, substncia ou extrato vegetal em estudo, de acordo com a altura, largura

e localizao da sua curva de absoro dentro do espectro do ultravioleta (MANSUR

e coloboradores, 1986b).

2.8 Uso de Tcnicas Hifenadas na Qumica de Produtos Naturais

O avano tecnolgico de tcnicas analticas, sobretudo das tcnicas hifenadas,

proporcionou um papel importante na anlise e elucidao de composies qumicas

complexas dos produtos de origem vegetal, com nveis de sensibilidade e

seletividade impensveis, at poucos anos atrs. (RODRIGUES e colaboradores,

2006).

O termo tcnicas hifenadas refere-se ao acoplamento entre duas ou mais

tcnicas analticas com o objetivo de obter uma ferramenta mais eficiente e rpida

comparada com as tcnicas convencionais. As tcnicas analticas qumicas mais

empregadas na analise de produtos oriundos de plantas medicinais so a

cromatografia e a espectroscopia. Um exemplo tpico o acoplamento de mtodos

de separao como a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e a

cromatografia a gs (CG), com tcnicas espectrofotomtricas como

espectrofotometria de UV-Vis (DAD), espectrometria de massas (EM e EM/EM) e

ressonncia magntica nuclear (RMN), que fornecem informaes complementares

sobre a estrutura qumica dos componentes da amostra (Tabela 01) (RODRIGUES e


A espectrometria de massas acoplada a um sistema de CLAE tem se

destacado nos ltimos anos como uma valiosa ferramenta para a anlise de

diversos compostos presentes na natureza. Aplica-se esta tcnica para se obter a

46


fragmentao de substncias em anlise existente em matrizes complexas

(RODIGUES, 2007).

O nmero de informaes obtidas, atravs dessas tcnicas, muito grande

tornando-se necessria a utilizao de processadores para a obteno e tratamento

dos dados visando a sua interpretao. Uma das vantagens das tcnicas acopladas

na qumica de produtos naturais moderna, em comparao com as tcnicas

espectroscpicas sem hifenao, a baixa quantidade de analito inicial que pode

ser da origem de miligramas ou microgramas (RODRIGUES e colaboradores, 2006).

Tabela 01: Caractersticas das tcnicas hifenadas

Fonte: RODRIGUES e colaboradores, 2006.

Tcnica Hifenada Caractersticas

CG-EM Identificao de compostos. Fornece informao estrutural da

molcula. Permite comparao com bibliotecas espectrais.

CG-EM-EM

Confirmao estrutural de molculas.

CLAE-DAD

Identificao de compostos conhecidos, atravs da comparao do

tempo de reteno e espectro de UV com o padro analtico. No

fornece informao estrutural.

CLAE-EM

Raramente resulta na identificao definitiva. Muitas vezes acoplado

com CLAE-DAD para fornecer informaes estruturais

complementares.

CLAE-EM-EM

Determinao de novos compostos, com incrvel vantagem da

simplicidade no preparo da amostra e rapidez na obteno dos

resultados.

CLAE-RMN

Fornece informaes estruturais (espectro de RMN de 1H). Constitui-

se a tcnica mais poderosa na determinao estrutural de

substncias inditas com novos esqueletos e em misturas

biologicamente ativas.

47


2.9 Espectro de Massas

O maior sucesso da tcnica de espectrometria de massas tem sido na sua

aplicao na anlise de molculas biolgicas no volteis. Em princpio todas as

molculas que podem ser carregadas so acessveis a uma anlise por IES-EM.

Entre estas encontram-se os pptidos e protenas que podem ser protonados

principalmente nas zonas bsicas, ou seja nos grupos terminais amino, hidratos de

carbono, drogas, produtos naturais, pesticidas e outras molculas de pequena

dimenso (SOON e colaboradores, 2005).

Existem diversos tipos de espectrmetros de massas, cada qual com suas

vantagens e limitaes. Porm, todos apresentam os mesmos componentes

bsicos: sistema de introduo de amostra, fonte de ionizao, analisador de

massas, detector e registrador. Um esquema da estrutura bsica de um

espectrmetro de massas mostrado na Figura 10 (DINIS, 2011).

Figura 10: Componentes bsicos de um espectrofotmetro

Fonte: DINIS, 2011.

48


Na fonte de ons, os componentes de uma amostra so convertidos em ons e

os ons positivos ou negativos so imediatamente acelerados em direo ao

analisador de massas. A funo do analisador de massas separar tais ons de

acordo com a sua relao m/z. Finalmente, um detector recebe os ons que foram

separados pelo analisador, transformando a corrente de ons em sinais eltricos que

so processados, armazenados na memria de um computador e mostrados em

uma tela (PAVANELLI, 2010).

2.9.1 Fonte de ionizao

A fonte de ionizao um dispositivo que promove a ionizao dos analitos da

amostra antes da sua entrada no analisador de massas. Existe uma grande

variedade de tcnicas de ionizao, cuja escolha deve levar em conta as

propriedades fsico-qumicas do analito e a energia transferida durante o processo

de ionizao. Os mtodos de ionizao mais conhecidos so: ionizao por eltrons

(EI), ionizao qumica (CI), bombardeamento por tomos rpidos (FAB), ionizao

por dessoro a laser assistida por matriz (MALDI), ionizao qumica a presso

atmosfrica (APCI) e ionizao por electrospray (IES).Os mtodos de EI e CI so

adequados para analisar apenas molculas volteis e termicamente estveis, pois

os ons so formados aps a molcula ser volatilizada. A tcnica FAB pode ser

aplicada para amostras polares, inicas, termicamente lbeis, energeticamente

instveis e de alto peso molecular, que normalmente no podem ser analisadas

pelas tcnicas EI e CI. A tcnica MALDI baseia-se na ionizao do analito adsorvido

em uma substncia (matriz) por um feixe de laser. Na tcnica APCI as molculas do

solvente so transferidas fase gasosa, sendo ento, aplicado uma tenso em uma

agulha, prximo a sada do vaporizador, que cria uma descarga de ons atravs de

interaes com as molculas do gs de arraste e do solvente. uma tcnica

parecida com a CI, porm todo o processo ocorre sob presso atmosfrica

(SCHALLEY, 2000).

49


2.9.2 Analisadores de massas

Aps serem gerados na fonte de ionizao, os ons so transferidos para uma

regio do equipamento, conhecida como analisador de massas, onde sua razo m/z

medida. Os tipos de analisadores utilizados so: quadrupolo (Q), aprisionamento

de ons (ion trap), tempo de vo (TOF Time of Flight), setor eletrosttico (E) e setor

magntico (B), ressonncia ciclotrnica de ons (ICR Ion Cyclotron Resonance) e

configuraes hbridas como o setor eletrosttico e magntico (BE), quadrupolo-

quadrupolo (Qq), quadrupolo - TOF (QTof), quadrupolo - ion trap (Qtrap) e alguns

outros (DINIZ, 2011).

As trs principais caractersticas de um analisador de massas so: o limite

superior de medida da razo m/z, a transmisso, que a razo entre o nmero de

ons que alcana o detector e o nmero de ons produzidos na fonte, e o poder de

resoluo, que a habilidade de produzir sinais distintos para dois ons com uma

pequena diferena de massa (HOFFMAN e colaboradores, 2007).

2.9.3 Detectores

O detector tem a funo de detectar e amplificar o sinal da corrente de ons que

vem do analisador e transferir o sinal para o sistema de processamento de dados. E

depende do tipo de analisador; o fotomultiplicador e o multiplicador de eltrons so

utilizados com analisadores quadrupolo, setor magntico e ion trap e apresentam

faixa dinmica ampla (105-108), enquanto que o MCP utilizado com analisadores

TOF e apresentam resposta extremamente rpida, com alta sensibilidade

(SCHALLEY, 2000).

2.10 IES-EM

Desde seu surgimento, IES-EM tornou-se uma das tcnicas analticas mais

poderosas e amplamente utilizadas. Dentre as vantagens de IES-EM incluem alta

sensibilidade e seletividade, facilidade de uso e consumo reduzido de amostra

(DINIS, 2011 apud HECK; VAN DEN HEUVEL, 2004).

H essencialmente trs caractersticas que fazem com que IES seja

considerada uma tcnica distinta das outras tcnicas de ionizao. A primeira destas

50


caractersticas a capacidade para produzir ons multiplamente carregados,

reduzindo assim a razo m/z, de tal modo que possvel analisar compostos de

elevada massa molecular. A segunda caracterstica que as amostras a serem

analisadas devem ser introduzidas em soluo, o que faz com que seja possvel o

acoplamento com muitas tcnicas de separao. Por ltimo, IES uma tcnica de

ionizao suave, provocando pouca (ou nenhuma) fragmentao dos analitos

estudados (DINIZ, 2011).

Durante a ionizao por electrospray, trs tipos de ons podem ser gerados:

ons moleculares, molculas protonadas/desprotonadas (ons quasi-moleculares) e

molculas cationizadas ou anionizadas. A extenso com a qual cada um destes ons

formado pode ser compreendida em termos do balano entre trs processos

essencialmente distintos, que ocorrem no interior do capilar: reaes redox

(oxidao/reduo), que produzem ons moleculares (M+) ou (M); reaes

cido/base (protonao/desprotonao), que resultam na formao de molculas

protonadas ([M+H]+ ou desprotonadas [M-H]) e, coordenao com ctions

(geralmente os da famlia 1A) ou nions (principalmente cloretos), que leva

formao de molculas cationizadas ([M+Na]+, [M+K]+, ou anionizadas [M+Cl])

(CROTTI e colaboradores, 2006).

2.10.1 Dissociao induzida por coliso

Aps o on de interesse ser formado no espectrmetro de massas, pode-se

selecionar o mesmo dentro do analisador de massas e aplicar uma energia para que

esse on se fragmente. Esse processo conhecido como dissociao induzida por

coliso, sendo utilizado em sistemas de espectrometria de massas sequencial

(EM/EM) e desempenha um importante papel na determinao estrutural de ons e

anlises de misturas complexas. O processo de dissociao induzida por coliso

pode ser dividido em duas etapas: (a) ativao do on precursor atravs de coliso

com um gs inerte, onde uma frao de sua energia cintica convertida em

energia interna; (b) dissociao unimolecular do on precursor excitado. A formao

de vrios fragmentos provenientes da dissociao do on precursor fornece

informaes valiosas sobre a estrutura deste on, necessrias para sua identificao

e caracterizao (DINIZ, 2011).

52

Silva, M. F. S. Objetivos

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Contribuir para o estudo qumico da famlia Fabaceae por meio do estudo da

espcie Pityrocarpa moniliformis (BENTH) LUCKOW & R. W. JOBSON de forma a

colaborar com conhecimento cientfico cerca do bioma caatinga.

3.2 Especficos

3.2.1 Identificar e/ou elucidar a estrutura dos constituintes qumicos desta espcie

por intermdio das tcnicas de CG-EM, Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) 1H e

13C (uni e bidimensionais), CLAE-DAD-IES-EM e EM/EM;

3.2.2 Traar o perfil qumico dos extratos e fases por meio da triagem fitoqumica e

teor de fenis e flavonoides totais;

3.2.3 Avaliar o potencial qumico dos extratos brutos e fases da espcie P.

moniliformis, por meio da avaliao in vitro da atividade antioxidante e fotoprotetora.

3.2.4 Avaliar o potencial biolgico dos extratos brutos e fases da espcie P.

moniliformis por meio da avaliao da atividade antibacteriana.

54

Silva, M. F. S. Material e Mtodos

4. MATERIAL E MTODOS

4.1 Coleta do Material Botnico

As partes areas de P. moniliformis foram coletadas na Universidade Federal

do Vale do So Francisco, no campus Fazenda Experimental (coordenadas:

919'34,1'' S; 4032'55,9'' W), localizado no Municpio de Petrolina PE em agosto

de 2011. O material botnico foi submetido identificao pela biloga Macielle

Macedo Coelho, integrante do CRAD (Centro de Referncia para Recuperao de

reas Degradadas) da UNIVASF. Uma exsicata da espcie foi depositada no

Herbrio da Universidade Federal do Vale do So Francisco (HVASF) sob nmero

de registro 1090 (Figura 11).

Figura 11: Identificao botnica: Exsicata n 1090, HVASF/CRAD.

55


4.2 Obteno dos Extratos de P. moniliformis

Neste estudo foram usadas, de modo isolado, as partes areas (folhas) e

sementes de P. moniliformis. Os materiais vegetais foram secos em estufa com ar

circulante, pulverizados em moinho mecnico (Figura 12-A) e submetidos

macerao exaustiva com etanol (EtOH) a 95 %, em recipiente de ao inoxidvel

(Figura 12-B). Para garantir a mxima extrao dos constituintes qumicos, o

procedimento de extrao foi repetido por 3 vezes num intervalo de 72 horas entre

eles. As solues etanlicas obtidas foram filtradas, fazendo-se, em seguida, a

evaporaro do solvente com o auxlio de um rotaevaporador a uma temperatura

mdia de 50 oC. Aps a eliminao do solvente foram obtidos, 536,3 g de extrato

etanlico bruto das partes areas (Pm-EEB/PA) e 313,91 g de extrato etanlico

bruto das sementes (Pm-EEB/S) conforme o Fluxograma 01.

Figura 12: Moinho mecnico, A; Recipiente de ao inoxidvel, B.

B A

56


Fluxograma 01: Preparao dos extratos etanlicos brutos das partes areas (Pm-

EEB/PA) e sementes (Pm-EEB/S) de P. moniliformis.

4.3 Preparao das Fases de P. moniliformis

O Pm-EEB/PA foi solubilizado numa mistura MeOH :H2O (3:7 v/v) sob

agitao mecnica por 60 minutos, para obteno da soluo hidroalcolica I. Esta

foi submetida a partio lquido-lquido, em funil de separao, sob agitao manual,

de forma exaustiva com hexano, clorofrmio e acetato de etila. As solues obtidas

foram tratadas com Na2SO4 anidro e s

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ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE