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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Estudo da Atividade Antinociceptiva e
Possíveis Mecanismos de Ação do Ácido
Oleanólico em Modelos de Nocicepção Induzida por
Capsaicina e Óleo de Mostarda em Camundongos
JULIANA LEMOS MAIA
FORTALEZA
2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
JULIANA LEMOS MAIA
Estudo da atividade antinociceptiva e possíveis
mecanismos de ação do ácido oleanólico em modelos de
nocicepção induzida por capsaicina e óleo de mostarda em
camundongos
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Orientador : Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
Fortaleza
2006
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E POSSÍVEIS
MECANISMOS DE AÇÃO DO ÁCIDO OLEANÓLICO EM MODELOS
DE NOCICEPÇÃO INDUZIDA POR CAPSAICINA E ÓLEO DE
MOSTARDA EM CAMUNDONGOS
JULIANA LEMOS MAIA
Esta dissertação foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca setorial da referida Universidade. A citação de qualquer trecho desta dissertação é permitida, desde que realizada de acordo com as normas da ética científica.
Data da aprovação: 22 /12/ 2006
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao (orientador)
Universidade Federal do Ceará
_______________________________________
Profa. Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal
Universidade Federal do Ceará
_______________________________________
Profa. Dra. Fernanda Regina de Castro Almeida
Universidade Federal do Piauí
“É o conhecimento, e não outra coisa, que move o homem a realizar as
finalidades superiores de sua vida, e é também ele quem o leva pelos
caminhos do mundo, buscando-se sempre a si mesmo”.
(Raumsol)
Aos meus pais, Francisco Erivando Abraão
Maia e Telma Leda Gomes de Lemos, pelo amor
e incentivo que possibilitaram a conquista de
mais uma etapa na minha vida
Ao meu irmão David Lemos Maia por estar
presente nos momentos importantes da
minha vida
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Vietla Satyanarayana Rao pela sua competente orientação e pela
amizade demonstrada em cada ensinamento e conselho durante a realização deste
trabalho.
À Profa. Flávia Almeida Santos pelo incentivo e ajuda no desenvolvimento
deste trabalho.
À Profa. Adriana Rolim Campos pela amizade e grande colaboração para a
realização desse trabalho.
Ao Prof. Jorge David e à Profa. Juceni David pelo fornecimento do ácido
oleanólico, a base de realização deste trabalho.
Aos Doutorandos Roberto César Lima Júnior e Caroline Mourão Melo pelas
longas horas de contribuição nos meus experimentos e pelo inestimável
companheirismo.
Aos Doutorandos Karina Moreira de Alencar, Marjorie Moreira Guedes,
Silvéria Lira Regina, Cíntia e Dr. Sérgio pela amizade e momentos de
companheirismo.
Aos mestrandos do LPN, Alana, Ana Carla, Tiago, Danilo, Iana, Otacílio e
Deive pela amizade.
Aos bolsistas de iniciação científica do LPN, Ítalo, Jonnathann, Lívia Sales e
Lívia Lopes pela colaboração nos experimentos.
Às técnicas do Laboratório de Produtos Naturais, Daniella e Karina, pela
manutenção da organização do LPN e pela contribuição nos experimentos.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Aura,
Chiquinho, Edmílson, Fernando, Íris, Joana, Marta e Rose.
A todos os meus familiares e amigos por sempre estarem presentes na minha
vida.
Ao Cristiano pelo grande incentivo.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................17
1.1. Dor...................................................................................................................17
1.2. Mecanismos da dor.........................................................................................18
1.2.1. Ativação e sensibilização dos nociceptores.......................................19
1.2.2. Vias de transmissão da dor................................................................21
1.2.2.1. Vias ascendentes............................................................................21
1.2.2.2. Vias descendentes..........................................................................23
1.3. Classificação dos tipos de dor.........................................................................24
1.3.1. Classificação temporal da dor............................................................24
1.3.2. Classificação fisiopatológica da dor...................................................25
1.4. Dor nociceptiva................................................................................................26
1.5. Modelos de dor nociceptiva.............................................................................27
1.5.1. Capsaicina..........................................................................................28
1.5.2. Óleo de mostarda...............................................................................30
1.6. Uso de plantas no tratamento da dor..............................................................31
1.7. Terpenos.........................................................................................................33
1.8. Eriope blanchetii (Benth).................................................................................36
1.9. Ácido oleanólico..............................................................................................37
1.10. Relevância e justificativa...............................................................................40
2. OBJETIVOS...........................................................................................................41
3. MATERIAIS............................................................................................................42
3.1. Material botânico.............................................................................................42
3.2. Animais experimentais....................................................................................42
3.3. Drogas e reagentes.........................................................................................42
3.4. Equipamentos..................................................................................................43
4. MÉTODOS.............................................................................................................43
4.1. Obtenção do ácido oleanólico (extração e fracionamento)..............................43
4.2. Estudo da atividade antinociceptiva somática..................................................44
4.2.1. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina...............44
4.2.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide........................................ 44
4.2.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico................................. 45
4.2.4. Estudo do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico........................45
4.2.5. Estudo do envolvimento dos canais de potássio..................................45
4.3. Estudo da atividade antinociceptiva visceral....................................................46
4.3.1. Nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda.............................46
4.3.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide.........................................46
4.3.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico..................................47
4.3.4. Estudo do envolvimento do receptor da capsaicina (TRPV1)...............47
4.4. Avaliação do Sistema Nervoso Central............................................................48
4.4.1. Teste do campo aberto..........................................................................48
4.4.2. Teste do Rota Rod................................................................................48
4.5. Análise estatística............................................................................................49
5. RESULTADOS.......................................................................................................50
5.1. Estudo da atividade antinociceptiva somática..............................................50
5.1.1. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina em
camundongos.............................................................................................................50
5.1.2. Estudo do envolvimento opióide............................................................53
5.1.3. Estudo do sistema adrenérgico.............................................................53
5.1.4. Estudo do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico........................58
5.1.5. Estudo do envolvimento dos canais de potássio..................................58
5.2. Estudo da atividade antinociceptiva visceral..................................................63
5.2.1. Nocicepção induzida pela administração intracolônica de óleo de
mostarda.....................................................................................................................63
5.2.2. Estudo do envolvimento opióide............................................................63
5.2.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico..................................68
5.2.4. Estudo do envolvimento do receptor da capsaicina (TRPV1)...............68
5.3. Avaliação da atividade no Sistema Nervoso Central......................................73
5.3.1. Teste do campo aberto.........................................................................73
5.3.2. Teste do Rota Rod...............................................................................73
6. DISCUSSÃO..........................................................................................................76
7. CONCLUSÕES......................................................................................................87
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................89
LISTA DE SIGLAS
Mais ou menos
% Percentagem ® Marca registrada < Menor que
Alfa
Beta
Delta
Microlitro
Micrograma
Micromol
Micrômetro
Acetil CoA Acetil coenzima A AMPc 3‗,5‗-Adenosina monofosfato cíclico AO Ácido Oleanólico ANOVA Análise de variância C Átomo de carbono Ca2+ Íon cálcio cm Centrímetros E.P.M. Erro padrão da média et al. ...e colaboradores GABA Ácido gama aminobutirico GMPc Guanosina monofosfato cíclico g Grama h Hora H2O Água i.p. Intraperitoneal K+ Íon potássio Kg Kilograma mg Miligrama min Minuto mL Mililitro mm Milímetros No Número NMDA N-metil-D-aspartato NK1 Neurocinina 1 NO Óxido nítrico NOs Óxido nítrico sintase C° Grau centígrado p Nível de significância P.A. Para análise s Segundos s.c. Sub-cutâneo SNC Sistema Nervoso Central SUS Sistema Único de Saúde TRPV1 Transient Receptor Potential Vanilloide 1 v.o. Via oral VR1 Receptor Vanilóide 1 vs Versus
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Classificação dos terpenóides............................................................35
Tabela 2- Exemplos de plantas medicinais que contêm ácido oleanólico como
contituinte ativo...........................................................................................................39
Tabela 3- Efeito do ácido oleanólico sobre a nocicepção induzida pela
administração subplantar de capsaicina em camundongos.......................................52
Tabela 4- Efeito do naloxona sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e morfina na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos ....................................................................................55
Tabela 5- Efeito da ioimbina sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e clonidina na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos.....................................................................................57
Tabela 6- Efeito do L-NAME e L-arginina sobre a atividade antinociceptiva do
ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos ....................................................................................60
Tabela 7- Efeito da gibenclamida sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e diazóxido na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos ....................................................................................62
Tabela 8- Efeito do ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzida
por óleo de mostarda em camundongos....................................................................65
Tabela 9- Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e morfina na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em
camundongos ............................................................................................................67
Tabela 10- Efeito da ioimbina sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e clonidina na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em
camundongos ............................................................................................................70
Tabela 11- Efeito do vermelho de rutênio sobre a atividade antinociceptiva do
ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda
em camundongos ......................................................................................................72
Tabela 12- Efeito do ácido oleanólico no teste do campo aberto em
camundongos ............................................................................................................74
Tabela 13- Efeito do ácido oleanólico no teste do Rota Rod em
camundongos.............................................................................................................75
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Representação esquemática dos mecanismos da dor..............................24 Figura 2- Estrutura química da capsaicina ...............................................................29 Figura 3- Fotografia ilustrando a flor (A) e a planta (B) da espécie de Eriope
blanchetii ...................................................................................................................36
Figura 4- Estrutura química do ácido oleanólico.......................................................38 Figura 5- Efeito do ácido oleanólico sobre a nocicepção induzida pela administração
subplantar de capsaicina em camundongos .............................................................51
Figura 6- Estudo do envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação do
ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos.....................................................................................54
Figura 7- Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico no mecanismo de ação
do ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos.....................................................................................56
Figura 8- Estudo do envolvimento do óxido nítrico no mecanismo de ação do ácido
oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de capsaicina em
camundongos.............................................................................................................59
Figura 9- Estudo do envolvimento dos canais de potássio no mecanismo de ação do
ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos.....................................................................................61
Figura 10- Efeito antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de nocicepção
visceral induzida por óleo de mostarda em camundongos .......................................64
Figura 11- Estudo do envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação do
ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em
camundongos... ........................................................................................................66
Figura 12- Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico no mecanismo de ação
do ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em
camundongos........ ....................................................................................................69
Figura 13- Estudo do envolvimento do receptor vanilóide no mecanismo de ação do
ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em
camundongos.............................................................................................................71
RESUMO
Estudo da atividade antinociceptiva e possíveis mecanismos de ação do ácido oleanólico em modelos de nocicepção induzida por capsaicina e óleo de mostarda em camundongos. Juliana Lemos Maia. Orientador: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2006.
O ácido oleanólico é um triterpeno pentacíclico largamente encontrado em várias plantas medicinais. Essa substância demonstrou ter uma variedade de atividades farmacológicas, dentre as quais se destacam: antiinflamatória, hepatoprotetora, gastroprotetora e antinociceptiva. Este trabalho objetivou investigar a atividade antinociceptiva do ácido oleanólico em modelos de nocicepção aguda induzida por capsaicina (20µl/ 1,6 μg) e óleo de mostarda (0,75%, 50 µL/animal) em camundongos, além dos possíveis mecanismos de ação envolvidos. Camundongos foram pré-tratados com ácido oleanólico (3, 10, 30, 100 mg/kg, v.o.) ou veículo, e os comportamentos de dor foram analisados. As doses de 10, 30 e 100 mg/kg, v.o., foram capazes de reduzir os comportamentos dolorosos expressos pelos animais nos modelos de nocicepção induzida por capsaicina e óleo de mostarda, sendo o maior nível de inibição (p<0,001) encontrado na dose de 30 mg/kg. Na tentativa de desvendar os possíveis mecanismos de ação do ácido oleanólico no modelo de nocicepção induzido por capsaicina, avaliamos a participação dos receptores opióides, α2, óxido nítrico e canais de potássio. O efeito antinociceptivo do ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) foi significantemente revertido pelo pré-tratamento com antagonista opióide, naloxona (2 mg/kg, i.p.); pelo doador de óxido nítrico, L-arginina (600 mg/kg, i.p.) e pela glibenclamida (2 mg/kg, i.p.), um antagonista dos canais de potássio. Por outro lado, o pré-tratamento com um antagonista α2, ioimbina (2 mg/kg, i.p.), não ocasionou a reversão da antinocicepção. Na tentativa de desvendar os possíveis mecanismos de ação do ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda, avaliamos a participação dos receptores opióides, α2 e TRPV1. O efeito antinociceptivo do ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) foi significantemente revertido (p<0,05) pelo pré-tratamento com antagonista opióide, naloxona (2 mg/kg, i.p.), enquanto que o antagonista α2 , ioimbina (2 mg/kg, i.p.), não teve o mesmo efeito. O pré-tratamento com vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.), um antagonista não competitivo do receptor TRPV1 causou inibição significativa da nocicepção (p<0,01) induzida pelo óleo de mostarda, entretanto a administração conjunta com o ácido oleanólico não produziu antagonismo nem potenciação da antinocicepção causada pelo ácido oleanólico. Para avaliar a existência de um impedimento locomotor ou de uma incoordenação motora, foram utilizados os testes do campo aberto e o teste do rota rod, respectivamente. Os dados indicaram que o tratamento com o ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) não induziu (p>0,05) impedimento locomotor ou incoordenação motora nos animais, sendo ainda capaz de reverter (p<0,05) o impedimento locomotor induzido pelo óleo de mostarda no teste do campo aberto. Em conjunto os dados revelaram a efetividade do ácido oleanólico em modelos de nocicepção possivelmente envolvendo receptores opióides, TRPV1, óxido nítrico e canais de potássio. Palavras-chave: ácido oleanólico, triterpenos, atividade antinociceptiva, receptor
opióide, TRPV1, óxido nítrico.
ABSTRACT
Antinociceptive study and possible mechanisms of action of oleanolic acid in models of nociception induced by capsaicin and mustard oil in mice. Juliana Lemos Maia. Principal guide: Dr. Vietla Satyanarayana Rao. Department of Physiology and Pharmacology, UFC, 2006.
Oleanolic acid is a triterpene pentacyclic widely distributed in the plant kingdom. Different biologic activities have been reported including: antiinflammatory, hepatoprotective, gastroprotective and antinociceptive. This work was aimed to evaluate the antinociceptive s induced by capsaicin (20µl/ 1.6 μg) and mustard oil (0.75%, 50 µL/animal) in mice and to establish the likely mechanism(s) of action. Mice were pretreated orally with oleonolic acid (3, 10, 30 and 100 mg/kg) or vehicle, and the pain-related behavioral responses were analysed. The pain behavioral responses were significantly suppressed at doses 10, 30 and 100 mg/kg in acute nociception models induced by capsaicin and mustard oil. The maximal suppression (p<0.001) was observed at the dose of 30 mg/kg. In order to verify the possible mechanisms involved in the antinociceptive action of oleanolic acid in the capsaicin-induced nociception, the involvement of endogenous opioids, α2, nitric oxide and KATP channels were analyzed. The antinociception produced by OA (30 mg/kg, v.o.) was found to be significantly blocked in animals pre-treated with the opioid antagonist, naloxone (2 mg/kg, i.p.); the substrate for oxide nitric synthase, L-arginine (600 mg/kg, i.p.); or a KATP-channel blocker, glibenclamide (2 mg/kg, i.p.) but was unaffected by yohimbine (2 mg/kg, i.p.), an α2 -adrenoceptor antagonist. In order to verify the possible mechanisms involved in the antinociceptive action of oleanolic acid in the mustard oil-induced visceral pain model, opioid, α2 adreno and TRPV1 receptors were analyzed. The antinociceptive effect of oleanolic acid (30 mg/kg, v.o.) was significantly blocked (p<0.05) by pretreatment with the opioid antagonist, naloxone (2 mg/kg, i.p.), but the α2-adrenoceptor antagonist, yohimbine (2 mg/kg, s.c.), had no effect. Pretreatment with ruthenium red (3 mg/kg, s.c.), a non-competitive TRPV1 antagonist alone caused significant inhibition (p<0.01) of mustard oil-induced nociception but its co-administration with oleanolic acid produced neither antagonism nor potentiation of oleonolic acid antinociception. Further, to evaluate a possible motor impairment and motor incoordination effects related to oleanolic acid, open-field and rota-rod tests were performed. The data indicated that the treatment of animals with the oleanolic acid (30 mg/kg, v.o.) was unable to cause motor impairment or motor incoordination effects (p>0.05), being even able to reverse (p<0.05) a mustard oil-induced motor impairment in the open field test. The results taken together strongly suggest the therapeutic potential of oleanolic acid in oblitering nociception through the mechanisms that possibly involve the opioids, TRPV1 receptors, nitric oxide and KATP channels. Key words: oleanolic acid, triterpenes, antinociceptive activity, opioid-receptor, TRPV1 receptor, oxide nitric.
Introdução
17
1. INTRODUÇÃO
1.1. Dor
A dor continua sendo uma das grandes preocupações da humanidade. Desde
os primórdios do ser humano, conforme sugerem alguns registros gráficos da pré-
história e os vários documentos escritos anteriormente, o homem sempre procurou
esclarecer as razões que justificassem a ocorrência de dor e os procedimentos
destinados ao seu controle. A expressão da dor varia não somente de um indivíduo
para outro, mas também de acordo com as diferentes culturas (COLLINS, 1978).
A capacidade de sentir dor tem papel protetor para os seres vivos, pois alerta-
os para iminente ou real dano aos tecidos e induz reflexos coordenados e respostas
comportamentais para que tal lesão seja mínima (LEE et al., 2005; CAILLIET, 1999).
Se o dano tecidual for inevitável, uma gama de alterações da excitabilidade no
sistema nervoso central e periférico se estabelece como um profundo, mas
reversível estado de dor e hipersensibilidade no tecido inflamado e nas suas
adjacências. Esse processo facilita a reparação das partes lesadas, evitando o
contato local até que a cura aconteça. Entretanto, quando as lesões afetam as vias
nervosas centrais e periféricas, podem se desenvolver síndromes dolorosas
persistentes que não oferecem nenhuma vantagem biológica, causando sofrimento e
estresse para os portadores (USUNOFF et al., 2006).
De acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) deve-
se distinguir dor de nocicepção. A dor foi conceituada em 1986, como uma
experiência sensorial e emocional desagradável que é associada a lesões reais ou
potenciais ou descrita em termos de tais lesões (IASP, 1979). Nocicepção, por outro
lado, é um termo neurofisiológico que denota a atividade específica do nervo e o
mecanismo de transmissão fisiológica, não descrevendo a dor psicológica (NASSER
et al., 2004).
A dor é uma sensação de complexa percepção (JULIOS; BASBAUM, 2001).
De todas as sensações é a mais influenciada pelo estado emocional, pelas
18
contingências ambientais e pela própria experiência da pessoa sendo por isto difícil
de tratar clinicamente (CALVINO, 2006).
A dor é uma das razões mais freqüentes das consultas médicas, sendo o
motivo pelo qual cerca de 10 a 40% dos indivíduos procuram clínicos gerais (SBED,
2005). No Brasil, a dor manifesta-se em mais de 70% dos doentes que procuram
consultórios médicos e é a razão das consultas para um terço dos doentes. Devido à
dor, cerca de 50 a 60% dos doentes se tornam parcial ou totalmente incapacitados,
transitória ou permanentemente (TEIXEIRA et al., 1995).
Mesmo tendo uma função tão importante, o conhecimento científico sobre a
dor ainda está no seu início. Apesar de a dor ser um sentimento que sempre
acompanhou o ser humano e os seus ancestrais, foi só no último século que o
Mundo Ocidental conseguiu ter algum tipo de conhecimento sobre o seu mecanismo
de funcionamento, e só nas últimas três décadas a pesquisa sobre a dor foi
conduzida de maneira mais intensa. O principal motivo desta preocupação está no
aumento do número de pessoas que sofrem de dores devido às mudanças ocorridas
na área da saúde e na mudança do estilo de vida do mundo moderno (YENG;
TEIXEIRA, 2005).
Graças aos avanços da medicina, as pessoas estão tendo uma sobrevivência
muito maior do que há apenas 20 ou 30 anos atrás. Além da maior sobrevivência à
doença, houve também nesta época um envelhecimento da população,
especialmente nos países mais ricos, que aumentou em muito a demanda por novas
pesquisas e tratamentos para a dor (YENG; TEIXEIRA, 2005).
1.2. Mecanismos da dor
O fenômeno sensitivo doloroso é um processo extensivo e complexo, que
envolve eventos biológicos em vários níveis do sistema nervoso (PORTH, 2004). A
sensação da dor é iniciada com a transformação dos estímulos ambientais em
potenciais de ação, que das fibras periféricas, são transferidos para o Sistema
Nervoso Central (SNC) através de neurônios de primeira, segunda e terceira ordem.
(SBED, 2005).
19
Os neurônios de primeira ordem e suas terminações receptivas detectam
estímulos que ameaçam a integridade dos tecidos inervados. Os neurônios de
segunda ordem localizam-se na medula espinhal e processam a informação
nociceptiva. Os neurônios de terceira ordem projetam a informação dolorosa para o
cérebro. A partir dessa percepção da dor pelo SNC, são obtidas as respostas
motoras, autonômicas e comportamentais diante do estímulo doloroso (PORTH,
2004).
Durante esse trajeto, esse mecanismo tem sua atividade regulada por um
conjunto de substâncias produzidas no sistema nervoso, que agem sobre o sistema
de transmissão da dor, aumentando ou diminuindo a sensação dolorosa (SBED,
2005).
1.2.1. Ativação e sensibilização dos nociceptores
O estímulo doloroso é transcodificado por um mecanismo de transdução,
onde estímulos nocivos são transformados em potenciais de ação do nervo
sensitivo, captado perifericamente pelos receptores do tipo nociceptores (receptores
para dor) (STUCKY et al., 2001).
Os nociceptores são terminações nervosas livres, que consistem nos
prolongamentos periféricos de axônios de neurônios aferentes primários distribuídos
na periferia, cujos corpos celulares situam-se no glânglio da raiz dorsal ou gânglio
trigeminal (PORTH, 2004). Esses neurônios, denominados neurônios aferentes
primários, possuem além do ramo periférico, um ramo central, que adentra o corno
dorsal da medula espinhal pela raiz dorsal (NUMAZAKI; TOMINAGA, 2004).
Os nociceptores estão localizados na pele, nos músculos, articulações, tecido
conjuntivo e vísceras. Podem ser ativados por basicamente 4 tipos de estímulos:
mecânico, elétrico, térmico ou químico (NASSER et al., 2004). Alguns tecidos
possuem nociceptores que podem ser térmicos (ativados por temperaturas
extremas), mecânicos (ativados por intensa pressão) ou polimodais (ativados por
estímulos químicos, térmicos ou mecânicos de elevada intensidade). As vísceras
possuem nociceptores ―silenciosos‖ que respondem a estímulos químicos e
20
inflamações. A ativação dos nociceptores é, em geral, associada a uma série de
reflexos, tais como o aumento do fluxo sanguíneo local, a contração de músculos da
vizinhança, mudanças na pressão sanguínea e dilatação da pupila (DE LA TORRE,
2001).
A atividade dos receptores nociceptivos é modulada pela ação de substâncias
químicas, que amplificam os eventos pela liberação local de substâncias
denominadas genericamente de algogênicas. Essas substâncias podem surgir em
elevadas concentrações no ambiente tecidual em decorrência de processos
inflamatórios, traumáticos ou isquêmicos (MARQUES, 2004; PORTH, 2004).
Em resposta ao dano tecidual, células liberam mediadores inflamatórios no
local da agressão, tais como, prostaglandinas, leucotrienos, histamina, serotonina,
bradicinina, acetilcolina, citocinas, íons potássio e produtos derivados do ácido
araquidônico (GUYTON; HALL, 2002; CAILLIET, 1999). Outros são produzidos no
sentido inverso da transmissão dos nervos sensitivos, isto é, do corpo neural para a
periferia, sendo a mais importante a substância P (MARQUES, 2004).
Esses mediadores químicos produzem seus efeitos pela estimulação direta
dos nociceptores ou sensibilizando-os aos efeitos dos estímulos nociceptivos; pela
perpetuação das respostas inflamatórias que levam à liberação dos agentes
químicos que atuam como estímulos nociceptivos; ou pela incitação dos reflexos
neurogênicos que aumentam a resposta aos estímulos nociceptivos (PORTH, 2004).
Esses neurotransmissores ligam-se a receptores específicos induzindo alterações
na permeabilidade iônica da membrana pós-sináptica, produzindo desta forma
diferenças de potencial que determinam o nível de atividade do neurônio e a sua
capacidade de transmitir informação a outros neurônios (NASSER et al., 2004). Os
sinais originados dos nociceptores são propagados até a medula espinhal através de
fibras aferentes primárias, que podem ser classificadas com base em seu diâmetro,
estrutura e velocidade de condução (MARQUES, 2004).
O primeiro tipo de neurônio a ser excitado possui fibras do tipo A delta. Esse
tipo de neurônio é responsável pela sensação de dor aguda. Esta é a primeira forma
de impulso de dor que recebemos devido à velocidade em que é transmitida, já que
21
esse tipo de neurônio possui um recobrimento de mielina mais espesso e um
diâmetro do axônio maior (2-6 μm de diâmetro) (JULIUS; BASBAUM, 2001; LEE et
al., 2005). O outro tipo de neurónio possui fibras do tipo C, que leva ao cérebro um
impulso de dor do tipo "pulsante", semelhante as que ocorrem nas inflamações. Este
impulso é mais demorado, pois o neurônio do tipo C tem um diâmetro menor (0,4-1,2
μm de diâmetro) e são amielínicos (LE BARS et al., 2001; DAVIS et al., 2000). Ainda
existem fibras do tipo A beta que são mielinizadas e de rápida condução. Estão
relacionadas à sensação do tato e envolvidas na modulação do sinal doloroso, e em
algumas situações participando de forma absolutamente anormal no processo
doloroso (MARQUES, 2004; PORTH, 2004).
1.2.2. Vias de transmissão da dor
A dor não é uma sensação uniforme, a qualidade da dor e o início das
respostas de proteção são determinados por muitos fatores dentro da medula
espinhal e estruturas do cérebro, envolvidas na integração e modificação da
sinalização nociceptiva (DICKENSON; BESSON, 1997). Existem duas vias que
processam o estímulo doloroso: a via ascendente e a via descendente.
1.2.2.1. Vias ascendentes
Após uma estimulação periférica de natureza e intensidade suficientes para
ativarem os nociceptores, a informação é conduzida em potenciais de ação que
percorrem o neurônio aferente primário, o qual estabelece sinapses com neurônios
do corno dorsal da medula espinhal, denominados neurônios de segunda ordem
(LEE et al., 2005) (Figura 1).
O corno dorsal da medula espinhal apresenta uma organização laminar,
numerada de I à X, cada lâmina com características morfofuncionais e de recepção
das fibras advindas da periferia, distintas. As lâminas mais superficiais (I e II),
juntamente com a lâmina V constituem as regiões predominantemente implicadas na
recepção, processamento e transmissão da informação nociceptiva. As fibras C
terminam na lâmina II, as fibras A delta nas lâminas I e V e, as fibras A beta nas
lâminas II, IV e V (MARQUES, 2004).
22
Os neurônios aferentes primários transmitem o impulso nervoso para a
medula espinhal através da liberação de aminoácidos excitatórios (glutamato e
aspartato) e neuropeptídeos (substância P), os quais ocupam receptores específicos
tipo NMDA e NK1 entre outros, na região pós-sináptica do segundo neurônio
sensitivo (TERMAN; BONICA, 2001). A ativação destes receptores promove a
produção de segundos mensageiros (AMP, fosfatidilinositol, fosfolipase C) para
abertura de canais de cálcio e, consequentemente, influxo de Ca2+ nas células
neuronais. Ocorre então produção de outros mediadores (óxido nítrico e metabólitos
do ácido araquidônico), que alteram a transmissão do potencial de ação e a ultra-
estrutura dos neurônios, suas sinapses, sensibilização medular e aumento da
duração da resposta de certos neurônios (KRAYCHETE; GUIMARÃES, 2003).
Os neurônios de segunda ordem cruzam a medula espinhal, transmitindo o
impulso para o cérebro, incluindo formação reticular, tálamo e córtex cerebral,
através de tratos ascendentes, que formam dois sistemas filogenéticos distintos. O
primeiro, passa através da região medial da medula espinhal, sendo formado pelos
tratos: paleoespinotalâmico, espinoreticular, espinomesencefáfico,
espinoparabrachio-amigdalóide, espinobrachio-hipotalâmico e espinotalâmico. O
outro sistema ocupa a região lateral da medula espinhal e consiste no trato
neoespinotalâmico, espinocervical e pós-sináptico no corno dorsal (ALMEIDA et al.,
2004).
No tálamo, neurônios de terceira ordem emitem axônios através da cápsula
interna ao córtex somatosensor, onde a somatização do estímulo nocivo ocorre, ou
emitem axônios ao giro cingulado anterior, onde existe o componente emocional da
dor (RUSSO; BROSE, 1998).
Contudo, nem todos os eventos que ocorrem no corno dorsal da medula
espinhal facilitam a nocicepção. Em 1965, Melzack e Wall propuseram a teoria do
controle do portão, onde um sistema modulador específico da dor regula a
passagem dos impulsos das fibras aferentes periféricas ao tálamo através dos
neurônios de transmissão no corno dorsal. Os neurônios na substância gelatinosa
(SG) do corno dorsal agem para inibir a via de transmissão. Os interneurônios
inibitórios são ativados pelos neurônios inibitórios descendentes ou pela aferência
23
nociceptiva das fibras A. Eles são inibidos pela aferência nociceptiva da fibra C, de
modo que a atividade persistente da fibra C facilita a excitação das células de
transmissão pelas aferências nociceptivas e não nociceptivas (SCHNEIDER et al.,
1998; MELO, 2006).
1.2.2.2. Vias descendentes
As vias descendentes originadas de estruturas cerebrais têm um importante
papel na modulação e integração das mensagens nociceptivas no corno dorsal da
medula. A via descendente dirige-se em sentido diametralmente oposto ao da via
sensitiva ascendente, exercendo um efeito inibitório e modulador sobre estruturas
distais, muito particularmente sobre a parte posterior da medula espinhal (MILLAN,
1999).
A via descendente é controlada por vários sistemas que modulam a
transmissão nociceptiva, podendo ser tanto inibitórios quanto estimulatórios. A
estimulação de algumas áreas cerebrais (periaquedutal e periventricular) provoca a
liberação de substâncias neuromoduladoras, como por exemplo, os peptídeos
opióides endógenos que tem ação analgésica (MILLAN, 2002). Três famílias
distintas desses peptídeos opióides foram identificados: encefalinas, endorfinas e
dinorfinas (PORTH, 2004).
O sistema serotoninérgico e o sistema catecolinérgico são importantes
exemplos desses sistemas inibitórios. A ativação destes sistemas produz analgesia,
mas a sua falência é obviamente causa de dor, ou seja, quando esta via está
patologicamente interrompida, as endorfinas já não desempenham o seu papel
analgésico (MILLAN, 2002).
Existe um grande número de mediadores químicos implicados no processo de
transmissão da dor tanto em nível periférico quanto em nível de SNC. A sensação
final de dor dependerá, portanto, da interação entre essas substâncias. A
transmissão da dor não é somente um simples processo de transmissão nervosa, e
sim um resultado de numerosos sistemas transmissores tanto excitatórios quanto
24
inibitórios, agindo tanto em nível periférico quanto central (McCURDY; SCULLY,
2005).
FIF
1.3. Classificação dos tipos de dor
1.3.1. Classificação temporal da dor
A dor pode ser classificada de várias maneiras. Quanto a classificação temporal, a
sensação dolorosa pode ser classificada em: dor aguda, dor crônica ou transitória.
Na dor transitória, a ativação dos receptores da dor acontece na ausência de
qualquer dano tecidual (LOESER; MELZACK, 1999).
A dor aguda é um sintoma biológico de um estímulo nociceptivo aparente, como
1.3. Classificação dos tipos de dor
1.3. Classificação dos tipos de dor
1.3.1. Classificação temporal da dor
A dor pode ser classificada de várias maneiras. Quanto à classificação
temporal, a sensação dolorosa pode ser classificada em: dor aguda, dor crônica ou
Trauma
Capilar
Liberação de:
Substância P
Histamina
Serotonina
Bradicinina
Prostaglandinas
Vias descendentes inibitórias
Neurotransmissor:
noradrenalina
serotonina
encefalinas
Trato
espinotalâmico
Liberação de
noradrenalina
Neurotransmissores
nervo aferente primário:
Sustância P
Glutamato
GABA
Figura 1- Representação esquemática dos mecanismos da dor
25
transitória. Na dor transitória, a ativação dos receptores da dor acontece na
ausência de qualquer dano tecidual (LOESER; MELZACK, 1999).
A dor aguda é um sintoma biológico de um estímulo nociceptivo aparente,
com um dano tecidual devido à doença ou trauma. Essa dor pode ser altamente
localizada e pode irradiar. Pode ser descrita em caráter de pontadas e persiste
enquanto houver patologia tecidual. A dor aguda tem função de alerta, é auto-
limitada e geralmente desaparece com a resolução do processo patológico. Nos
casos em que o controle do processo patológico não é satisfatório, pode tornar-se
crônica (SMITH et al., 1986; VILELA FILHO; CORRÊA, 1999).
A dor crônica difere significativamente da dor aguda por ter duração maior
que o curso usual de uma doença aguda ou lesão. Essa dor pode estar associada
com a continuação da patologia ou pode persistir após a recuperação da doença ou
lesão. Como ocorre na dor aguda, se a dor crônica for devido à doença orgânica, ela
é efetivamente curada ao se tratar a desordem de base. Geralmente não é bem
localizada e tende a ser maciça, dolorida, contínua ou recorrente (SMITH et al.,
1986; VILELA FILHO; CORRÊA, 1999).
1.3.2. Classificação fisiopatológica da dor
Na classificação fisiopatológica, a dor pode ser dividida em nociceptiva,
neuropática e psicogênica (MILLAN, 1999).
A dor pode ser considerada nociceptiva quando é originada pela estimulação
excessiva dos nociceptores localizados na pele, vísceras e outros órgãos (MILLAN,
1999).
A dor neuropática é fruto da lesão ou disfunção do SNC ou Sistema Nervoso
Periférico. Em geral, persistem por longo tempo após o evento precipitante. A dor
neuropática pode ser episódica, temporária ou crônica, persistente, podendo
inclusive não estar associada a qualquer lesão detectável. Pode manifestar-se de
várias formas como sensação de queimação, peso, agulhadas, ferroadas ou
26
choques, podendo ou não ser acompanhada de "formigamento" ou "adormecimento"
de uma determinada parte do corpo (MILLAN, 1999; TEIXEIRA, 2003).
Considera-se a existência da dor psicogência quando nenhum mecanismo
nociceptivo ou neuropático pode ser identificado e que pode refletir fatores
psicológicos (MILLAN, 1999). Na prática, a dor psicogênica é diagnóstico de
exclusão, tendo ocorrência muito rara. Muitos autores consideram-na virtual, uma
vez que mesmo patologias puramente psiquiátricas são manifestações de alterações
orgânicas e identificáveis, mesmo que somente bioquimicamente.
1.4. Dor Nociceptiva
A dor nociceptiva é a forma de dor que surge em todos os indivíduos normais,
como conseqüência da aplicação de estímulos que produzem danos ou lesões nos
órgãos somáticos ou viscerais. Ocorre como resultado da ativação de nociceptores
em tecidos cutâneos e profundos, os quais poderão encontrar-se em um estado
normal ou sensibilizados. Quando encontram-se normais, nenhuma disfunção
sensorial é observada. Caso estejam sensibilizados, na ocorrência de lesão tissular
periférica e posterior liberação de agentes inflamatórios, alterações sensoriais
(alodínia e hiperalgesia) estarão presentes (FILHO; BRAUN, 2004). A dor
nociceptiva começa simultaneamente ao início da atividade do fator causal, o qual
pode ser usualmente identificado (PORTO, 2004).
A dor nociceptiva somática é frequentemente descrita como uma sensação
dolorosa rude, aguda e localizada. Muitas vezes está associada a uma contratura
muscular e pode ser exarcebada ao movimento. É aliviada pelo repouso, e variável
conforme a lesão básica. Exemplos desse tipo de dor são: dores ósseas, pós-
operatórias, dores músculo-esqueléticas, dores artríticas, entre outras (PERRON;
SCHONWETTER, 2001).
A dor nociceptiva visceral ocorre quando os estímulos que vão produzir a
sensação de dor provêm das vísceras. É causada por alterações internas dos
órgãos ocos e cápsulas de vísceras sólidas, tais como, estômago, rins, bexiga,
vesícula biliar e intestinos. Os principais fatores que estimulam as fibras nociceptivas
27
viscerais são: estiramento ou tensão na parede muscular das vísceras, processo
inflamatório de origem infecciosa ou química, isquemia e neoplasias (CERVERO;
LAIRD, 1999; NESS, 1999; GIAMBERARDINO, 1999).
A dor visceral é usualmente descrita por alguns sintomas característicos:
1) Não é evocada por todas as vísceras. Algumas vísceras apresentam deficiência
de receptores sensoriais. As propriedades funcionais de seus receptores periféricos
não evocam a percepção consciente ou não são receptores sensoriais verdadeiros;
2) Não está sempre relacionada à lesão visceral;
3) É difusa e pobremente localizada devido à organização das vias nociceptivas
viscerais no SNC, que ascendem com as de origem somática;
4) É referida em outros locais, provavelmente relacionada à convergência das fibras
nervosas viscerais e somáticas ao conectarem no corno dorsal da medula espinhal.
A dor é relacionada à pele porque áreas encefálicas interpretam o impulso de
maneira errada, ou porque algumas fibras aferentes inervam estruturas somáticas e
viscerais;
5) É acompanhada de reflexos autonômicos e motores, que servem como
mantenedor e facilitador da transmissão dolorosa (CHAER; TRAUB, 2002;
CERVERO, 2002; GIAMBERARDINO, 1999).
É uma das formas de dor mais comuns, bem como uma das mais freqüentes
razões pelas quais o paciente necessita de cuidados médicos. Apesar disso, a dor
visceral tradicionalmente foi muito pouco estudada, quando comparada à dor
somática, provavelmente devido à dificuldade de acesso aos órgãos internos
(CERVERO, 2002; LAIRD, et al., 2001). Atualmente, com o aumento da sofisticação
tecnológica para detecção e mensuração da dor, a dor visceral passou a ser melhor
estudada.
1.5. Modelos de dor nociceptiva
Diversos modelos animais são empregados no estudo de novas drogas
analgésicas derivadas de produtos naturais. Nesses modelos experimentais, a
nocicepção pode ser induzida por agentes químicos, mecânicos, térmicos e
inflamatórios. A capsaicina e o óleo de mostarda são produtos naturais derivados de
28
plantas, que levam à nocicepção e à inflamação quando aplicados na pele. Essas
substâncias são facilmente encontradas na alimentação diária, o que torna mais fácil
sua utilização. No nosso estudo, a capsaicina foi utilizada como modelo de
nocicepção somática, enquanto que o óleo de mostarda foi utilizado como modelo
de nocicepção visceral (JORDT et al., 2004).
1.5.1. Capsaicina
Capsaicina, um ingrediente pungente da pimenta vermelha (Capsicum spp) é
extensamente utilizada como ferramenta farmacológica no estudo tanto em
humanos quanto em animais (SZALLASI; BLUMBERG, 1999) (Figura 2).
A capsaicina tem um efeito nociceptivo, que se deve à ligação dessa
substância com um receptor específico chamado TRPV1 (receptor vanilóide 1,
inicialmente chamado VR1) presente na membrana de muitos nociceptores,
especialmente nas fibras aferentes primárias A e C que transmitem a sensação de
dor. É um canal iônico polimodal, pois reage não só à capsaicina, mas também ao
calor intenso, prótons (íons de hidrogênio, que acidificam o meio) e derivados
lipídicos (LEE et al., 2005; GEPPETTI et al., 2006). A ativação dos receptores
TRPV1 inicia uma complexa cascata de eventos, incluindo um aumento no influxo de
Ca2+ nos neurônios sensoriais nociceptivos, resultando na despolarização e
liberação de neuropeptídeos pró-inflamatórios dos terminais de neurônios aferentes
(PELISSIER et al., 2002; MELO et al., 2006).
Além dos efeitos associados com a nocicepção, a administração sistêmica da
capsaicina produz vários efeitos farmacológicos, tais como termorregulação,
bradicardia, redução na pressão sanguínea e redução da motilidade intestinal, ações
estas que devem ser reguladas por outros neurônios que não sejam os primários
(SASAMURA; KURAISHI, 1999).
O papel dos receptores TRPV1 na nocicepção aguda e crônica tem sido
estabelecido pelo uso de antagonistas do receptor TRPV1 e camundongos TRPV1
knockout (WALKER et al., 2003). A dessensibilização induzida por agonistas do
receptor TRPV1 apontam para sua utilização na supressão da dor neuropática,
29
enquanto que antagonistas TRPV1 são agentes poderosos no tratamento da dor
inflamatória, pós-operatória e da artrite (LOPEZ-RODRIGUEZ et al., 2003; EL
KOUHEN et al., 2005).
A injeção de capsaicina na pata traseira de camundongos, produz padrão de
comportamento de nocicepção característico, tais como lamber e morder a pata
afetada, produzindo alterações significativas nos limiares de nocicepção térmica e
mecânica. Tais fatos acontecem pela indução da estimulação direta de receptores
específicos localizados nos neurônios nociceptivos, causando a liberação de vários
neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa, dentre estes a substância P.
Os comportamentos dolorosos produzidos têm sido usados como um modelo de
nocicepção em camundongos e mais recentemente em ratos (NAH et al., 2000;
SAWYNOK et al., 2006).
Após repetidas aplicações de capsaicina, ocorre um período de redução na
sensibilidade, e em seguida uma dessensibilização, possivelmente decorrente da
depleção de substância P. Tem sido demonstrado também que dependendo da dose
sistêmica utilizada, a capsaicina pode produzir uma pronunciada nocicepção, bem
como uma antinocicepção. Após aplicações de altas doses de capsaicina em
animais, ocorre dessensibilização e degeneração das fibras aferentes (NOLANO et
al., 1999; SANTOS; CALIXTO, 1997).
Esse modelo é muito atrativo porque os eventos moleculares envolvidos
(ativação dos receptores TRPV1, entrada de cátions e despolarização das fibras C)
são muito melhor entendidos do que aqueles envolvidos em outros modelos de
nocicepção química, como por exemplo no modelo da formalina, onde muitos
mediadores teciduais e celulares estão envolvidos (SAWYNOK et al., 2006).
Figura 2- Estrutura química da capsaicina
30
1.5.2. Óleo de mostarda
O uso de modelos animais é um passo necessário para elucidar o mecanismo
neurofisiológico e neurofarmacológico da nocicepção visceral. Até recentemente,
muito do que se sabia sobre o mecanismo da dor derivava de estudos experimentais
da nocicepção somática. Entretanto, com o passar dos anos, uma variedade de
modelos animais têm sido desenvolvidos para mimetizar a nocicepção originada das
vísceras (LAIRD et al., 2001).
A dificuldade de realizar experimentos envolvendo nocicepção visceral se
deve à maior dificuldade de acesso aos tecidos viscerais quando comparados com
estruturas mais superficiais como a pele. A maioria dos modelos animais de
nocicepção visceral envolve algum tipo de procedimento mais complexo para sua
realização. Mais recentemente, alguns modelos animais utilizando substâncias
algogênicas, como por exemplo, capsaicina, ácido acético e salina hipertônica, têm
sido utilizadas para produzir contrações nos músculos viscerais (GIAMBERADINO,
1999; LAIRD et al., 2001).
Esses modelos ajudaram no melhor entendimento da resposta aguda
fisiológica associada com a nocicepção visceral mecânica ou inflamatória, e tem-se
tornado evidente que dor visceral e somática são diferentes, apesar de algumas
similaridades existirem (CHAER; TRAUB, 2002).
A aplicação tópica de óleo de mostarda na pele ativa as terminações
nervosas produzindo dor, inflamação, hipersensibilidade a estímulos térmicos e
mecânicos (JORDT et al., 2004). O óleo de mostarda é um potente ativador neuronal
que promove alodínia e hiperalgesia em poucos minutos após aplicação. Induz uma
estimulação direta de fibras aferentes sensoriais, uma colite rápida, aguda e
transitória, além de mudanças na motilidade intestinal e inflamação, o que permite
seu estudo como modelo de desordens intestinais (KIMBALL et al., 2005).
A administração intra-colônica do óleo de mostarda, bem como da capsaicina,
pode ser usado como um modelo válido de nocicepção aguda visceral em
camundongos, levando à comportamentos dolorosos espontâneos, simulando a
31
sensação de hiperalgesia visceral geralmente expressada por pacientes com
desordens funcionais viscerais (MAIA et al., 2006).
1.6. O uso de plantas no tratamento da dor
Nos primórdios da humanidade, os homens procuravam vencer as doenças
com exorcismos. A magia foi a primeira fase da luta do homem contra as doenças.
Mais tarde, verificando que nem sempre essas práticas levavam à cura, o homem
acrescentou uma nova arma: a planta (BRESOLIN; FILHO, 2003). Plantas, orações,
magias e crenças se difundiam na esperança de se conseguir minimizar o
sofrimento humano causado pela dor. Com o uso de infusões, chás, beberagens e
emplastros de origem vegetal, a humanidade deu o seu primeiro passo na direção
da futura Medicina (AZAIZEH et al., 2006; RATES, 2001).
No início do século XIX, o francês Armand Seguin, isolou pela primeira vez a
principal substância ativa do ópio: a morfina (nome grego derivado de Morfeus, deus
do sono). O ópio compreende o látex obtido de incisões no fruto da papoula,
Papaver somniferum L. Contêm além da morfina, outros alcalóides importantes,
como a codeína, papaverina e aporfinas (BRESOLIN; FILHO, 2003; PORTH, 2004).
Posteriormente, a morfina foi estudada pelo farmacêutico alemão Friedrich
Sertürner, tornando-se o primeiro composto ativo extraído de um vegetal com
propriedades analgésicas e iniciando-se daí os estudos e pesquisas para isolar os
componentes ativos das plantas.
Em 1828, o farmacêutico francês Henri Leroux e o químico italiano Raffaele
Piria, isolaram uma substância amarela em forma de cristais, com sabor muito
amargo ao qual denominou de salicina ou ácido salicílico (MASON; PASERO, 2006).
Essa substância foi encontrada em plantas, como a Spiraea ulmaria que mais tarde
inspirou o nome aspirina, droga com potencial analgésico e antipirético utilizada até
os dias de hoje.
A partir dessas descobertas, inúmeras outras plantas foram estudadas e seus
potenciais analgésicos descobertos (McCURDY; SCULLY, 2005). Atualmente,
32
aproximadamente 60% da população mundial utiliza plantas medicinais como
medicação. Estima-se a existência de aproximadamente 350.000 espécies de
plantas no mundo e provavelmente apenas 10% foram testadas em ensaios
biológicos (HARVEY, 2000; RATES, 2001).
As plantas medicinais têm ingredientes bioativos que podem ser usados como
atenção primária ou suplementar quando utilizados adequadamente. Até
recentemente, a maioria dos medicamentos era derivada diretamente de plantas ou
de animais. Apesar do grande aumento no uso das drogas sintéticas, os produtos
naturais continuaram a ser o tratamento de escolha em diferentes tipos de doenças
(HALBERSTEIN, 2005).
A descoberta de novos fármacos, ou fármacos acessíveis, pode determinar a
melhoria da qualidade de vida em doenças crônicas ou a própria sobrevivência do
paciente afetado. Socialmente, a descoberta de fontes naturais de compostos
químicos usualmente importados e/ou o desenvolvimento de fitoterápicos de
fabricação nacional, podem ter conseqüências econômicas significativas, além de
possibilitar a autonomia de cada país no gerenciamento de suas políticas de saúde
(ELIZABETZKY, 2001).
A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a
sua complexidade, estimando-se a existência de mais de 2 milhões de espécies
distintas de plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com maior
diversidade genética vegetal do mundo (BRESOLIN; FILHO, 2003), contando com
mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000
espécies (GUERRA; NODARI, 1998).
No Brasil, aproximadamente 84% das drogas atualmente no mercado são
importadas e 60% de todas as drogas processadas são consumidas por 23% da
população, o que faz com que os remédios caseiros à base de plantas medicinais
sejam ainda a principal fonte de medicamentos para a maioria do povo brasileiro.
Assim, é inegável que a maioria da população de baixa renda recorre às plantas
medicinais para o tratamento dos seus males (ELISABETZKY; WANNMACHER,
1993; ELISABETZKY, 2001).
33
Nos últimos anos, tem-se evidenciado um crescente aumento no estudo de
plantas preconizadas pela medicina popular para validar sua utilização como
fitoterápico seguro e eficaz, tendo em vista que o uso popular de uma determinada
planta não é suficiente para validá-la como fitoterápico. Desta forma, o emprego de
técnicas modernas renovou o interesse na procura de novos medicamentos ou de
protótipos de novos fármacos a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2000).
Atualmente, o Ministério da Saúde do Brasil, por meio do Departamento de
Assistência Farmacêutica, vem desenvolvendo de forma participativa com todos os
níveis e instâncias do governo e da sociedade, diversas ações voltadas ao
desenvolvimento das cadeias produtivas de plantas medicinais e fitoterápicos, com
vista à ampliação do acesso a esses produtos e serviços aos usuários do SUS, na
perspectiva da integralidade da atenção à saúde (BRASIL, 2006). Nesse sentido, foi
aprovada no dia 22 de junho de 2006, foi aprovada a Política Nacional de Plantas
Medicinais pelo governo federal, assegurando o acesso às plantas medicinais,
fitoterápicos, com segurança e eficácia, para melhoria da atenção à saúde e
inclusão social (BRASIL, 2006).
1.7. Terpenos
Os princípios ativos são moléculas quimicamente definidas, responsáveis total
ou parcialmente pelas ações farmacológicas das plantas medicinais. A origem
biossintética das principais classes de substâncias vegetais dá-se através do
metabolismo primário ou secundário. Os metabólitos primários são encontrados em
todos os seres vivos, essenciais ao crescimento e à vida, como os aminoácidos e
lipídios. Os metabólitos secundários são produtos de metabolismo específico,
relacionados aos processos adaptativos. São biossintetizados a partir de metabólitos
primários, com distribuição restrita a certas plantas e microorganismos; e
caracterizados por uma enorme diversidade química, como por exemplo os
alcalóides, esteróides e terpenóides (BRESOLIN; FILHO, 2003; KAUFMAN et al.,
1999).
Muitos compostos vegetais biologicamente importantes pertencem à classe
dos terpenos ou derivados de terpenos em partes de sua molécula. Os terpenos
34
constituem o maior grupo de produtos naturais secundários. São metabólitos
secundários derivados do acetato, cuja estrutura básica é o isopreno, e que quando
possuem elementos adicionais, como o oxigênio, são denominados terpenóides. As
diversas substâncias dessa classe, são em geral, insolúveis em água e sintetizadas
a partir de acetil CoA ou de intermediários glicolíticos (NES; ZHOU, 2001).
Os terpenóides representam a maior classe química de constituintes ativos de
plantas, havendo mais de 30.000 substâncias descritas. A classificação básica dos
vários terpenos decorre do número de unidades isoprênicas que contêm
(VERPOORTE; MARASCHIN, 2001). Através de ligações sucessivas de esqueletos
de carbono, obtêm-se assim as classes principais de terpenos, como os
hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20),
sesterterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40) (DEWICK, 2002) (Tabela
1).
Várias atividades farmacológicas dos compostos terpênicos foram
descobertas, tais como sedativa (DO VALE et al., 2002), gastroprotetora (GUEDES,
2002), hepatoprotetora (OLIVEIRA et al., 2005), antiinflamatória (IWAMOTO et al.,
2001; AHMAD et al., 2005; KÜPELI et al., 2003), cardioprotetora (LIEBGOTT et al.,
2000), antitumoral (CARNESECCHI et al., 2004), anti-hipertensiva, relaxante da
musculatura lisa vascular (TORRES et al., 2000), antimicrobiana (MADUREIRA et
al., 2003), antiulcerogênica (HIRUMA-LIMA et al., 2002) e antinociceptiva (GUEDES,
2002; LIMA-JÚNIOR et al., 2006).
Os triterpenos constituem talvez o grupo mais importante dos terpenóides.
São moléculas constituídas por trinta átomos de carbono, seis unidades
isoprenóides (com cinco átomos de carbono). Apresentam estrutura do tipo C30,
policíclica, normalmente tetra ou pentacíclica, quase sempre hidroxilados na posição
C3. Os triterpenos estão divididos em várias classes, com diferentes estruturas
básicas. Já foram isolados e reportados mais de quatro mil triterpenóides naturais e
identificados mais de quarenta tipos de esqueletos (PATOCKA, 2003).
35
Tabela 1 - Classificação dos terpenóides
UNIDADES DE ISOPRENO
NÚMERO DE CARBONOS
CLASSIFICAÇÃO
1
5 Hemiterpeno
2
10 Monoterpeno
3
15 Sesquiterpeno
4
20 Diterpeno
5
25 Sesterterpeno
6
30 Triterpeno
8
40 Tetraterpeno
>8
>40 Politerpeno
Fonte: Santos (2005)
A seleção apropriada da dose para a utilização desses triterpenos é
essencial. Embora alguns triterpenos sejam relativamente seguros, a toxicidade
pode ocorrer em algumas circunstâncias. Por exemplo, em baixas doses um
triterpeno pode ser hepatoprotetor enquanto que em doses altas pode produzir
hepatotoxicidade (LIU, 2005).
Há um crescente interesse nessas substâncias devido ao seu variado
espectro de atividades farmacológicas (PATOCKA, 2003). Apresentam propriedades
medicinais, com grandes potencialidades em atividades biológicas, entre estas:
antiinflamatória (AHMED et al., 2006), antimicrobiana (EL- SEEDI, 2005), antiviral
(NIEDERMEYER et al., 2005), antinociceptiva (LIMA- JÚNIOR et al., 2006),
cardiovascular (DU; KO, 2006), antitumoral e imunomoduladora (PLOHMANN et al.,
1997). Devido à sua grande diversidade o seu estudo científico tem sido de grande
interesse na tentativa de novas e reais aplicabilidades.
36
1.8. Eriope blanchetii (Benth.)
A família Lamiaceae pertencente à Ordem Tubiflorae (Lamiales), abrange
cerca de 200 gêneros e aproximadamente 3.500 a 4.000 espécies, distribuídas em
todo o mundo. Possui ampla distribuição, principalmente na região mediterrânea.
Seu crescimento ocorre em diferentes habitats e altitudes: desde a região Ártica até
o Himalaia, Austrália, África dentre outros (ALMEIDA; ALBUQUERQUE, 2002).
Dentre os gêneros, podemos encontrar o gênero Eriope, nativo das regiões
tropical e subtropical da América do Sul e possui cerca de 20 espécies, sendo que
18 destas estão restritas ao território brasileiro. No Brasil, estas espécies distribuem-
se principalmente em áreas de campo rupestre em Minas Gerais, Bahia, Goiás e
estados vizinhos (DAVID et al., 2001).
Figura 3 – Fotografia ilustrando a flor (A) e a planta (B) da espécie Eriope blanchetii
Na literatura, poucos trabalhos são encontrados utilizando Eriope blanchetii
(Figura 3). Segundo David et al. (2001), de Eriope blanchetii foram isolados quatro
triterpenos pentacíclicos, sitosterol glicosilado, bem como β-peltatina e α-peltatina,
lignanas responsáveis pela atividade citotóxica observada em testes in vitro. Cerca
de 30% do extrato CHCl3 é formado pelo ácido oleanólico, portanto a pequena
expressão desta atividade citotóxica no extrato bruto, provavelmente, é decorrente
da alta concentração dos ácidos triterpênicos, especialmente do ácido oleanólico.
A B
37
1.9. Ácido Oleanólico
O ácido oleanólico (AO) é um triterpeno pentacíclico largamente encontrado
em várias plantas medicinais e em vários outros tipos de plantas, podendo ser
encontrado na forma livre ou ligado com unidades de açúcares denominados
glicosídeos. É um triterpeno pentacíclico pertencente ao grupo dos oleanos e seu
nome oficial é ácido (3β)-3-Hidroxioleano-12-en-28-oico. É um isômero do ácido
ursólico, sendo os dois quase sempre encontrados simultaneamente em diversas
plantas (SOMOVA et al., 2003) (Figura 4).
Nas últimas décadas, vários artigos sobre AO foram publicados, o que reflete
o grande interesse e progresso no entendimento dessa substância, incluindo o
isolamento e purificação de triterpenos de várias plantas, modificações químicas,
estudos farmacológicos, estudos toxicológicos e o uso clínico do AO no tratamento
de várias doenças, tasi como a hepatite (CHEN et al., 2006; LIU, 2005) (Tabela 2).
Muitos experimentos demonstraram uma variedade de atividades
farmacológicas para o AO, dentre as quais se destacam: atividade antiinflamatória
(OVESNA et al., 2004), antioxidante (OVESNA et al., 2006) hepatoprotetora (LIU,
1995), gastroprotetora (SANCHÉZ et al., 2006), antialérgica (BANNO et al., 2004),
anti-úlcera (OVESNA et al., 2004) e antimicrobiana (NGOUELA et al., 2005), bem
como efeito antiparasitário contra Trypanosoma sp. (CUNHA et al., 2003) e
Leishmania species (TORRES-SANTOS et al., 2004). Também mostrou ter efeito
contra patógenos periodontais, contra o vírus do HIV (OVESNA et al., 2004) e contra
Mycobacteruim tuberculosis, o agente causador da tuberculose (GUA et al., 2004).
O AO foi testado para avaliar sua ação antihipertensiva em animais
(SOMOVA et al., 2004) e como imunomodulador (OVESNA et al., 2004). Em virtude
de inúmeras atividades apresentadas por AO, surgiu interesse por parte dos
pesquisadores em estudar os efeitos deste triterpeno na inibição de tumores. Os
resultados mostraram que o AO pode atuar nas diversas fases do desenvolvimento
do tumor (OVESNA et al., 2004; APARECIDA et al., 2006), além de possuir uma
atividade antiproliferativa (CIPAK et al., 2006).
38
Mais recentemente alguns pesquisadores descobriram uma possível ação do
AO sobre o metabolismo do glicogênio. Este parece inibir a enzima que metaboliza o
glicogênio. Testes in vivo comprovaram um potencial efeito hipoglicemiante em ratos
diabéticos (CHEN et al., 2006).
Extratos de plantas ricas em AO têm demonstrado propriedades
antinociceptivas nos testes da placa quente e tailflick (CHOI et al., 2005) e um efeito
benéfico na dor em pessoas com artrites (LUKACZER et al., 2005). Foram
demonstrados também, estudos mostrando a eficácia dessa substância no combate
a infertilidade (CHATTOPADHYAY et al., 2005).
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
H3C CH3
COOH
HO
Figura 4- Estrutura química do ácido oleanólico
39
Tabela 2- Exemplos de plantas medicinais que contêm ácido oleanólico como constituinte ativo
Nome das plantas medicinais Atividade biológica
Aralia chinesis L. var nuda Nakai Atividade hepatoprotetora
(Araliaceae)
Calendula officinalis L. Atividade antifúngica
(Compositae)
Ganoderma lucidum karst Atividade anticariogênica
Ligustrum lucidum
(Oleaceae) Atividade hipoglicemiante
Oleandra neriifolia L. Atividade antiinflamatória
Panax ginseng C. A. Meyer Atividade hepatoprotetora
(Araliaceae)
Sapindus mukorossi Gaertn Atividade antiinflamatória
(Sapindaceae)
Swertia mileensis He et Shi. Atividade hepatoprotetora
(Gentianaceae)
Tetrapanax papyriferum L. Atividade hepatoprotetora
(Araliaceae)
Tinospora sagittata G. Atividade hipoglicemiante
(Menispermaceae)
(LIU, 1995)
40
1.10. Relevância e Justificativa
A dor é uma das mais frequentes razões das consultas médicas. Possui uma
incidência alta, muitas vezes tornando os doentes parcial ou totalmente
incapacitados (SBED, 2005). Grandes progressos na elucidação dos mecanismos
da transmissão da dor têm permitido a descoberta de novas substâncias usadas no
seu tratamento. Entretanto, a morfina, uma substância que apesar de efetiva
promove uma variedade de efeitos colaterais, continua a ser uma das drogas mais
ultilizadas na prática clínica para desordens dolorosas (BRESOLIN; FILHO, 2003).
Portanto, torna-se necessário a descoberta de novas drogas analgésicas mais
seguras e eficazes (CALIXTO et al., 2001).
Os produtos naturais são uma fonte rica em substâncias com potenciais
efeitos terapêuticos, onde se busca novas fontes de medicamentos. A indicação de
plantas medicinais aumenta a opção terapêutica, ofertando medicamentos
equivalentes, também registrados, com espectros de ação mais adequados e, talvez
com indicações terapêuticas complementares às medicações existentes, sem
substituir os medicamentos já comercializados e registrados (DI STASI, 1996).
Observando-se a necessidade de se descobrir novos medicamentos no
combate à dor, selecionamos o ácido oleanólico, uma substância largamente
encontrada em várias plantas, com uma ampla e reconhecida variedade de
propriedades farmacológicas. Entretanto, poucos são os relatos científicos sobre o
potencial antinociceptivo dessa substância (LIU, 1995).
Nesse sentido, o presente estudo se justifica, tendo em vista que estudos
prévios mostram o potencial terapêutico dessa substância. Contudo, estudos
adicionais são necessários para confirmar a importante atividade antinociceptiva do
ácido oleanólico, bem como analisar os possíveis mecanismos de ação
responsáveis por esse efeito.
41
2. OBJETIVOS
Objetivos gerais:
Determinar a atividade antinociceptiva do ácido oleanólico em modelos de
nocicepção visceral e somática em camundongos
Avaliar os possíveis mecanismos de ação envolvidos
Objetivos específicos:
Investigar a atividade antinociceptiva do ácido oleanólico no modelo de
nocicepção na pata induzida por capsaicina
Avaliar a participação do sistema opióide, do receptor α2-adrenérgico, do óxido
nítrico e dos canais de potássio ATP dependentes no mecanismo antinociceptivo do
ácido oleanólico no modelo de nocicepção na pata induzida por capsaicina
Analisar a atividade antinociceptiva do ácido oleanólico no modelo de nocicepção
visceral induzida por óleo de mostarda
Avaliar a participação do sistema opióide, do receptor α2-adrenérgico e do
receptor da capsaicina (TRPV1) no mecanismo antinociceptivo do ácido oleanólico
no modelo de nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda
Determinar os efeitos do ácido oleanólico nos modelos de campo aberto e rota-
rod
42
3. MATERIAIS
3.1. Material botânico
Partes aéreas de Eriope blanchetii (Benth), foram coletadas na região
metropolitana de Salvador-Bahia, nas proximidades da lagoa do Abaeté. A
identificação botânica foi feita por especialistas e uma excicata com o No (# 045599)
encontra-se depositada no Herbário Alexandre Leal Costa no Departamento de
Biologia da Universidade Federal da Bahia. O material de estudo, o ácido oleanólico,
foi obtido a partir desse material.
3.2. Animais experimentais
Camundongos albinos (Mus musculus) variedade Swiss Webster, adultos,
machos, pesando entre 25-30 g, provenientes do Biotério setorial do Departamento
de Fisiologia e Farmacologia e do Biotério Central da Universidade Federal do
Ceará, mantidos em caixas de propileno, a temperatura média de 26 2º C em
ciclos de claro-escuro de 12/12 horas, recebendo ração padrão (Purina Chow) e
água ―ad libitum‖. Os animais foram colocados em jejum de sólidos 18 h antes da
realização dos experimentos.
Os protocolos utilizados neste trabalho possuem aprovação pelo Comitê de
Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará.
3.3. Drogas e Reagentes
PRODUTOS ORIGEM
Capsaicina Calbiochem, USA
Clonidina Sigma, USA
Diazóxido Sigma, USA
Glibenclamida Sigma, USA
43
Ioimbina Sigma, USA
L- arginina Sigma, USA
L-NAME Sigma, USA
Morfina Cristália, Brasil
Naloxona Sigma, Brasil
Óleo de mostarda Ridel-de Haën, Alemanha
Tween 80 Sigma, USA
Vaselina AVD, Brasil
Vermelho de rutênio Aldrich, USA
3.4. Equipamentos
Equipamento Origem
Balança para animais (mod. MF-6) Filizola, Brasil
Balança analítica (mod. AX-200) Shimadzu, Japão
Campo aberto LPN – CE
Rota-Rod Insight, Brasil
4. MÉTODOS
4.1. Obtenção do ácido oleanólico (extração e fracionamento)
Partes aéreas de Eriope blanchetii (Benth) foram secas à temperatura
ambiente, trituradas e submetidas ao processo de extração a frio com metanol,
seguido de concentração de solvente orgânico. O extrato metanólico obtido foi
submetido a processo de partição com mistura de solventes nas seguintes
proporções: hexano:MeoH/H2O (9:1); CHCl3 : MeOH/H2O (6:4) e AcOEt :H2O (6:4).
A fração clorofórmica obtida de partição foi então cromotografada em sílica gel
usando a mistura de solvente CHCl3;MeOH/H2O com aumento gradativo de
polaridade . As frações obtidas foram purificadas por sucessivas cromatografias em
sílica gel, seguido de reação de metilação com obtenção de éster metílico de ácido
oleanólico na forma pura (2,5 g). O ácido oleanólico foi identificado por dados
44
espectroscópicos como: RMN (1H e 13C), infra-vermelho e espectrometria de massa
além de comparação com dados da literatura.
4.2. Estudo da atividade antinociceptiva somática
4.2.1. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e colocados para
ambientação no local de observação por 30 min. Após esse período, os animais
foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.),
ácido oleanólico (3, 10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) ou vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.)
1 h antes da administração subplantar (20 µl) da capsaicina. Cada animal foi usado
somente uma vez por experimento. O prurido (tempo de lambedura) na pata que
recebeu capsaicina foi observado durante 5 min (SANTOS; CALIXTO, 1997). A dose
de escolha para a capsaicina foi de (1,6 µg), já a dose de escolha das drogas
agonistas e antagonistas foram baseadas em testes pilotos realizados ou citações
de trabalhos anteriores. Um grupo controle normal que recebeu apenas salina por
via intraplantar foi incluído no estudo.
4.2.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e colocados para
ambientação no local de observação por 30 min. Após esse período, os animais
foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.),
ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) 1 h ou morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min antes da
administração subplantar (20 µl) da capsaicina (1,6 μg).
O papel do sistema opióide foi avaliado pela administração de naloxona (2
mg/kg, i.p.) 30 min antes da morfina (5 mg/kg, s.c.) ou 15 min antes do ácido
oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após 30 min da administração da morfina e 1 h após a
administração de ácido oleanólico os animais receberam administração subplantar
(20 µl) da capsaicina (1,6 μg).
45
4.2.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e colocados
para ambientação no local de observação por 30 min. Após esse período, os
animais foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg;
v.o.), ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) 1 h ou clonidina (0,1 mg/kg, i.p.) 30 min antes
da administração subplantar (20 µl) da capsaicina (1,6 μg).
O papel do sistema adrenérgico foi avaliado pela administração de ioimbina (2
mg/kg, i.p.) 30 min antes de clonidina (0,1 mg/kg, s.c.) ou 15 min ant
oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após 30 min da administração da clonidina e 1 h após a
administração de ácido oleanólico, os animais receberam administração subplantar
(20 µl) da capsaicina (1,6 μg).
4.2.4. Estudo do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e colocados para
ambientação no local de observação por 30 min. Após esse período, os animais
foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.),
ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) 1 h, L-NAME (20 mg/kg, i.p.) 20 min ou L-arginina
(600 mg/kg, i.p.) 30 min antes de receberem administração subplantar (20 µl) da
capsaicina (1,6 μg).
O papel da via L-arginina-óxido nítrico foi avaliado pela administração de um
inibidor da enzima óxido nítrico sintase, o L-NAME (20 mg/kg, i.p.), e após 20 min
receberam o AO (30 mg/kg, v.o.) ou L-arginina (600 mg/kg, i.p.), um substrato
precursor da síntese do óxido nítrico. Após 1 h da administração do ácido oleanólico
ou 30 min após o tratamento com L-arginina, os animais receberam a administração
subplantar (20 µl) da capsaicina (1,6 μg).
4.2.5. Estudo do envolvimento dos canais de potássio
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais e colocados para
ambientação no local de observação por 30 min. Após esse período, os animais
46
foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.),
ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) 1 h, glibenclamida (2 mg/kg, i.p.) 30 min ou
diazóxido (10 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração subplantar (20 µl) da
capsaicina (1,6 μg).
A participação dos canais de potássio na atividade antinociceptiva foi avaliada
pela administração de glibenclamida (2 mg/kg, i.p.) 30 min antes do tratamento com
diazóxido (10 mg/kg, i.p.) ou 15 min antes da administração do ácido oleanólico (30
mg/kg, v.o.). Após 1 h da administração do ácido oleanólico ou 30 min após o
tratamento com diazóxido, os animais receberam a administração subplantar (20 µl)
da capsaicina (1,6 μg).
4.3. Estudo da atividade antinociceptiva visceral
4.3.1. Nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e tratados com
veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.), ácido oleanólico (3, 10 ,
30 ou 100 mg/kg, v.o.) 1 h ou Morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min antes de receberem
óleo de mostarda intracolônico (0,75% em salina 0,9%; 50 μL/animal) através de
uma fina cânula com ponta arredondada, 1 mm de diâmetro externo. Foram
introduzidos 4 cm de comprimento da cânula pela via intracolônica para injeção do
óleo de mostarda. Foi utilizada vaselina sólida na região perianal para evitar
estimulação local pela administração. O número total de comportamentos
relacionados à dor (lamber abdômen, arrastar-se contra o solo, contorção e retração
abdominais) foram contados por 20 min imediatamente após a instilação de óleo de
mostarda (LAIRD et al., 2001). Um grupo controle normal, que recebeu apenas
salina por via intracolônica foi incluído no estudo.
4.3.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e tratados com
veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.), ácido oleanólico (30
47
mg/kg, v.o.) 1 h ou morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min antes de receberem óleo de
mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 µL/animal) por via intracolônica.
O papel do sistema opióide foi avaliado pela administração de naloxona (2
mg/kg, i.p.) 30 min antes de morfina (5 mg/kg, s.c.) ou 15 min antes do ácido
oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após 30 min da administração da morfina e 1 h após a
administração de ácido oleanólico os animais receberam óleo de mostarda (0,75%
em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via intracolônica.
4.3.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e tratados com
veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.), ácido oleanólico (30
mg/kg, v.o.) 1 h ou clonidina (0,1 mg/kg, i.p.) 30 min antes de receberem óleo de
mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 µL/animal) por via intracolônica.
O papel do sistema adrenérgico foi avaliado pela administração de ioimbina (2
mg/kg, i.p.) 30 min antes de clonidina (0,1 mg/kg, s.c.) ou 15 min ant
oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após 30 min da administração da clonidina e 1 h após a
administração de ácido oleanólico, os animais receberam óleo de mostarda (0,75%
em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via intracolônica.
4.3.4. Estudo do envolvimento do receptor da capsaicina (TRPV1)
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada e tratados com
veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg; v.o.), ácido oleanólico (30
mg/kg, v.o.) ou vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.) 1 h antes de receberem óleo de
mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 µL/animal) por via intracolônica.
O envolvimento do receptor TRPV1 foi avaliado pela administração de
vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.) 15 min ante g,
v.o.). Após 1h da administração de ácido oleanólico os animais receberam óleo de
mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via intracolônica.
48
4.4. Avaliação da atividade no Sistema Nervoso Central
4.4.1. Teste do Campo Aberto
A atividade motora espontânea dos animais foi verificada de acordo com o
método de Capaz et al (1981) com pequenas modificações, na tentativa de verificar
uma atividade sedativa/depressora no Sistema Nervoso Central, utilizando um
campo aberto, quadrangular, com 30 cm de lado, tendo em demarcados sua base 9
quadrados iguais de 10 cm de lado.
Camundongos foram divididos em 4 grupos de 8 animais: os grupos I e II
foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg de peso;
v.o.) e os grupos III e IV foram tratados com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após
1 h os grupos I e III receberam salina 0,9% por via intracolônica e os grupos II e IV
receberam óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via
intracolônica. Após 5 min os animais foram levados individualmente ao campo
aberto, ambientados por 1 min e, em seguida, observados por 4 min quanto ao
número de campos explorados.
4.4.2. Teste do Rota Rod
Camundongos foram pré-selecionados, 24 h antes da realização do
experimento, ao serem individualmente posicionados no aparelho de rota-rod (4
rotações por minuto). O animal que permanecia 2 min na barra era selecionado para
inclusão no estudo.
Camundongos foram divididos em 4 grupos de 8 animais: os grupos I e II
foram tratados com veículo (Tween 80 a 3% em água destilada; 10 mL/kg de peso;
v.o.) e os grupos III e IV foram tratados com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Após
1 h os grupos I e III receberam salina 0,9% por via intracolônica, os grupos II e IV
receberam óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50 μL/animal) por via
intracolônica. Após 5 min os animais foram levados individualmente ao rota rod e
registrado o tempo de permanência no aparelho durante 2 min (DUNHAM; MIYA,
1957).
49
4.5. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média E.P.M. (erro padrão da média).
Para comparação múltipla dos dados paramétricos, foi utilizada a Análise de
Variância (ANOVA), e o nível de significância entre os grupos foi determinado pelo
teste de múltipla comparação de Dunnet.
Em todas as análises estatísticas, considerou-se o nível crítico para rejeição
da hipótese de nulidade menos que 5% (p<0,05).
.
50
c
c
5. RESULTADOS
5.1. Estudo da atividade antinociceptiva somática
5.1.1. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina em
camundongos.
A Figura 5 e Tabela 3 mostram o efeito da administração oral do ácido
oleanólico sobre a nocicepção induzida por injeção intraplantar de capsaicina (1,6
g, 20 L/pata direita) em camundongos. O ácido oleanólico nas doses de 10, 30 e
100 mg/kg, v.o., reduziu de maneira significativa a nocicepção de 56,0 5,4 s
(veículo) para 26,36 5,4; 17,63 3,2 e 35,50 3,0 s respectivamente. A injeção de
salina induziu somente uma mínima lambedura da pata (1,00 0,38 s).
Vermelho de rutênio (3 mg/kg, s.c.), antagonista não competitivo dos
receptores vanilóides utilizado como controle positivo, reduziu significativamente
(p<0,05) a nocicepção induzida pela capsaicina de 56,0 5,4 s (veículo) para 34,4
5,53 s.
51
Figura 5– Efeito do ácido oleanólico sobre a nocicepção induzida pela
administração subplantar de capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a
3% em água destilada, v.o.), ácido oleanólico (3-100 mg/kg, v.o.) e Vermelho de
rutênio (VR, 3 mg/kg, s.c.) foram administrados 1 h antes da administração
subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). Os valores representam a média E.P.M.
do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a administração da capsaicina.
Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs. salina; bp<0,01; cp<0,001;
dp<0,05 vs. controle capsaicina (ANOVA e Teste de Dunnet).
Salina Veículo 3 10 30 100 3 mg/kg
Ácido oleanólico VR
Capsaicina
b
c
d d
a
0
10
20
30
40
50
60
70
Te
mp
o la
mb
ed
ura
pa
ta (
s/5
min
)
52
Tabela 3- Efeito do ácido oleanólico sobre a nocicepção induzida pela
administração subplantar de capsaicina em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Tempo lambedura pata (s/5min)
Salina - 1,00 0,38 Controle capsaicina - 56,0 5,4 a Ácido oleanólico 3, v.o. 52,44 6,4 10, v.o. 26,36 5,4 b 30, v.o. 17,63 3,2 c 100, v.o. 35,50 3,0 d Vermelho de rutênio 3, s.c. 34,4 5,53 d
Os valores representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata
durante 5 min após a administração da capsaicina. Veículo (controle), ácido
oleanólico e Vermelho de rutênio foram administrados 1 h antes da administração
subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). O grupo salina recebeu apenas salina por
via subplantar. Foram utilizados grupos de 8 animais cada. ap<0,001 vs. salina;
bp<0,01; cp<0,001; dp<0,05 vs. controle capsaicina (ANOVA e Teste de Dunnet).
53
5.1.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide
O tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) ou com
morfina (5 mg/kg, s.c.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) no tempo de
lambedura da pata (15,33 3,2; 0,2 0,8 s, respectivamente), quando comparado
ao grupo controle veículo (52,03 2,4 s). O pré-tratamento com naloxona (2 mg/kg,
i.p.) reverteu significativamente (p<0,001) a inibição dos comportamentos
nociceptivos do ácido oleanólico (47,29 4,4 s) e da morfina (39,86 4,2 s) (Figura
6 eTabela 4).
5.1.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico
O tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) ou com
clonidina (0,1 mg/kg, i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do tempo de
lambedura da pata (14,43 3,3; 3,4 1,26 s, respectivamente), quando comparado
ao grupo controle veículo (51,60 2,2 s). O pré-tratamento com ioimbina (2 mg/kg,
i.p.) reverteu significativamente (p<0,001) a inibição dos comportamentos
nociceptivos da clonidina (38,60 3,3 s), porém foi ineficaz na reversão da
antinocicepção produzida pelo ácido oleanólico (21,14 4,56 s) (Figura 7 e Tabela
5).
54
Figura 6– Estudo do envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação
do ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, v.o.) e
ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e a morfina (5
mg/kg, s.c.) 30 min antes da administração subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL).
A naloxona (Nalox, 2 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 min antes da morfina (5 mg/kg,
s.c.) ou 15 min antes do ácido oleanólico. Os valores representam a média E.P.M.
do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a administração da capsaicina.
Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,001
vs. ácido oleanólico e cp<0,001 vs. morfina (ANOVA e Teste de Dunnet).
Veículo AO 30 Morf 5
Nalox Nalox
mg/kg
a
b
a
c
Capsaicina
0
10
20
30
40
50
60
Te
mp
o la
mb
ed
ura
pa
ta (
s/ 5
min
)
55
Tabela 4- Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e morfina na nocicepção induzida pela administração
subplantar de capsaicina em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Tempo lambedura pata (s/5min)
Controle capsaicina
- 52,03 2,4
Ácido oleanólico
30, v.o. 15,33 3,2 a
Morfina
5, s.c. 0,2 0,8 a
Naloxona + Morfina
2, i.p. +
5, s.c.
39,86 4,2 c
Naloxona + Ácido oleanólico
2, i.p. +
30, v.o.
47,29 4,4 b
Os valores representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata
durante 5 min após a administração da capsaicina. Veículo (controle) e ácido
oleanólico foram administrados 1 h antes e morfina 30 min antes da administração
subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). A naloxona foi administrada 30 min antes
da morfina ou 15 min antes do ácido oleanólico. Foram utilizados 8 animais por
grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,001 vs. ácido oleanólico e cp<0,001
vs. morfina (ANOVA e Teste de Dunnet).
56
Figura 7– Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico no mecanismo de
ação do ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração
subplantar de capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água
destilada, v.o.) e ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes
e clonidina (Clon, 0,1 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração subplantar de
capsaicina (1,6 μg/20 μL). A ioimbina (Ioimb, 2 mg/Kg, i.p.) foi administrada 30 min
antes de clonidina (0,1 mg/Kg, s.c.) ou 15 min antes do ácido oleanólico. Os valores
representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a
administração da capsaicina. Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs.
controle capsaicina; bp<0,001 vs. clonidina (ANOVA e Teste de Dunnet).
AO 30 Clon 0,1 mg/kg
Ioimb Ioimb
a
a
b
Veículo
Capsaicina
0
10
20
30
40
50
60
Te
mp
o la
mb
ed
ura
pa
ta (
s/5
min
)
57
Tabela 5- Efeito da ioimbina sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e clonidina na nocicepção induzida pela administração
subplantar de capsaicina em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Tempo lambedura pata (s/5min)
Controle capsaicina
- 51,60 2,2
Ácido oleanólico
30, v.o. 14,43 3,3 a
Clonidina
0,1, i.p. 3,4 1,26 a
Ioimbina + Clonidina
2, s.c. +
0,1, i.p.
38,60 3,3 b
Ioimbina + Ácido oleanólico
2, s.c. +
30, v.o.
21,14 4,56
Os valores representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata
durante 5 min após a administração da capsaicina. Veículo (controle) e ácido
oleanólico foram administrados 1 h antes e clonidina 30 min antes da administração
subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). A ioimbina foi administrada 30 min antes da
clonidina ou 15 min antes do ácido oleanólico. Foram utilizados 8 animais por grupo.
ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,001 vs. clonidina (ANOVA e Teste de
Dunnet).
58
5.1.4. Estudo do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico
O tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/Kg, v.o.) ou com L-
NAME (20 mg/Kg, i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do tempo de
lambedura da pata (20,87 2,88; 12,83 3,99, respectivamente), quando
comparado ao grupo controle veículo (51,03 4,2). O pré-tratamento com L-arginina
(2 mg/Kg, i.p.) reverteu significativamente a antinocicepção induzido pelo ácido
oleanólico (p<0,05), enquanto que o pré-tratamento com L-NAME (20 mg/kg, i.p.)
potencializou a antinocicepção induzida pelo AO (p<0,05), respectivamente (41,67
4,0; 4,33 1,90) quando comparado ao grupo AO (20,87 2,88) (Figura 8 e Tabela
6).
5.1.5. Estudo do envolvimento dos canais de potássio
O tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) ou com
diazóxido (10 mg/kg, i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do tempo de
lambedura da pata (21,29 6,54; 8,8 2,21, respectivamente), quando comparado
ao grupo controle veículo (61,50 6,5). O pré-tratamento com glibenclamida (2
mg/kg, i.p.) reverteu significativamente a inibição dos comportamentos nociceptivos
do ácido oleanólico (p<0,05) e do diazóxido (p<0,01), respectivamente (42,50
6,54; 34,63 6,27) (Figura 9 e Tabela 7).
59
Figura 8– Estudo do envolvimento do óxido nítrico no mecanismo de ação do
ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração subplantar de
capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, v.o.) e
ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e a L-arginina (L-arg,
600 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração subplantar (20µl) da capsaicina
(1,6μg). O L-NAME (20 mg/kg, i.p.) foi administrado 20 min antes da L-arginina (600
mg/kg, i.p.) ou 15 min antes do ácido oleanólico. Os valores representam a média
E.P.M. do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a administração da
capsaicina. Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina;
bp<0,001 vs. L-NAME e c,dp<0,05 vs. ácido oleanólico (ANOVA e Teste de Dunnet).
Veículo 30 600 20 L-NAME +
L-arg
AO +
L-arg
AO +
L-NAME
mg/kg
AO L-arg L-NAME
a
a
b
c
a,d
0
10
20
30
40
50
60
Tem
po
lam
bed
ura
pata
(s/5
min
)
60
Tabela 6- Efeito do L-NAME e L-arginina sobre a atividade antinociceptiva do
ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração
subplantar de capsaicina em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Tempo lambedura pata
(s/5min)
Controle capsaicina
- 51,03 4,2
Ácido oleanólico
30, v.o. 20,87 2,88 a
L-arginina
600, i.p. 43,83 4,42
L-NAME
20, i.p. 12,83 3,99 a
L-NAME + L-arginina
20, i.p. +
600, i.p.
36,17 4,04 b
L-arginina + Ácido oleanólico
600, i.p. +
30, v.o.
41,67 4,0 c
L-NAME + Ácido oleanólico
20, i.p. +
30, v.o
4,33 1,9 a,d
Os valores representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata
durante 5 min após a administração da capsaicina. Veículo (controle) e ácido
oleanólico foram administrados 1 h antes e a L-arginina 30 min antes da
administração subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). O L-NAME foi administrado
20 min antes da L-arginina ou 15 min antes do ácido oleanólico. Foram utilizados 8
animais por grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,001 vs. L-NAME e
c,dp<0,05 vs. ácido oleanólico (ANOVA e Teste de Dunnet).
61
Figura 9– Estudo do envolvimento dos canais de potássio no mecanismo de
ação do ácido oleanólico na nocicepção induzida pela administração
subplantar de capsaicina em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água
destilada, v.o.) e ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes
e o diazóxido (Diaz, 10 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração subplantar de
capsaicina (1,6 μg/20 μL). A glibenclamida (Glib, 2 mg/kg, i.p.) foi administrada 30
min antes do diazóxido ou 15 min antes do ácido oleanólico. Os valores
representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata durante 5 min após a
administração da capsaicina. Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs.
controle capsaicina; bp<0,05 vs. Ácido oleanólico e cp<0,01 vs. diazóxido (ANOVA e
Teste de Dunnet).
Veículo AO 30 Diaz 2
Glib Glib
mg/kg
a
a
b
c
Capsaicina
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tem
po
lam
bed
ura
pata
(s/5
min
)
62
Tabela 7- Efeito da glibenclamida sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e diazóxido na nocicepção induzida pela administração
subplantar de capsaicina em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Tempo lambedura pata (s/5min)
Controle capsaicina
- 61,50 6,5
Ácido oleanólico
30, v.o. 21,29 6,54 a
Diazóxido
10, i.p. 8,8 2,21 a
Glibenclamida + Diazóxido
2, i.p. +
10, i.p.
34,63 6,27 c
Glibenclamida + Ácido oleanólico
2, i.p. +
30, v.o.
42,50 6,54 b
Os valores representam a média E.P.M. do tempo de lambedura da pata
durante 5 min após a administração da capsaicina. Veículo (controle) e ácido
oleanólico foram administrados 1 h antes e diazóxido 30 min antes da administração
subplantar de capsaicina (1,6 μg/20 μL). A glibenclamida foi administrada 30 min
antes do diazóxido ou 15 min antes do ácido oleanólico. Foram utilizados 8 animais
por grupo. ap<0,001 vs. controle capsaicina; bp<0,05 vs. ácido oleanólico e cp<0,01
vs. diazóxido (ANOVA e Teste de Dunnet).
63
5.2. Estudo da atividade antinociceptiva visceral
5.2.1. Nocicepção induzida pela adminstração intracolônica de óleo de
mostarda em camundongos
O triterpeno ácido oleanólico nas doses de 10, 30 e 100 e a morfina (5
mg/kg), atuaram reduzindo o número total de comportamentos de dor visceral
expressos pelos animais (28,80 4,76; 19 3,27; 34,17 3,13; 2,14 0,86,
respectivamente) de forma significativa, comparados ao grupo controle óleo de
mostarda (54,4 1,03). Este induziu dor visceral caracterizada pela diferença
estatística observada (p<0,001) entre este e o grupo salina (5,42 2,37), que
recebeu somente salina por via intracolônica (Figura 10 eTabela 8).
5.2.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide
O tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) ou com
morfina (5 mg/kg, s.c.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do número de
comportamentos de dor expressos (19,0 3,27; 8,86 1,6, respectivamente),
quando comparado ao grupo controle veículo (54,4 1,03). O pré-tratamento com
naloxona (2 mg/kg, i.p.) reverteu (p<0,05) a inibição dos comportamentos
nociceptivos do ácido oleanólico (34,0 5,1) e da morfina (21,0 3,35) (Figura 11 e
Tabela 9).
64
Figura 10- Efeito antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de nocicepção
visceral induzida por óleo de mostarda em camundongos. Veículo (Tween 80 a
3% em água destilada, v.o.) e ácido oleanólico (3-100 mg/kg, v.o.) foram
administrados 1 h antes e morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min antes da administração
intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 L/animal). Os valores
representam a média E.P.M. do número de comportamentos de dor durante 20 min
após a administração do óleo de mostarda. Foram utilizados 8 animais por grupo.
ap<0,001 vs. grupo salina; bp<0,001 e cp<0,01 vs. controle óleo de mostarda
(ANOVA e Teste de Dunnet).
Ácido oleanólico
Salina Veículo 3 10 30 100 5 mg/kg
Morfina
Óleo de Mostarda
a
b
b
c
b
0
10
20
30
40
50
60
Nú
mero
de C
om
po
rtam
en
tos
de d
or/
20m
in
65
Tabela 8- Efeito do ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral
induzida por óleo de mostarda em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Número de comportamentos
de dor/20min.
Salina - 5,42 2,37 Controle óleo de mostarda - 54,4 1,03 a ácido oleanólico 3, v.o. 51,17 4,17 10, v.o. 28,80 4,76 b 30, v.o. 19,0 3,27 b 100, v.o. 34,17 3,13c Morfina 5, s.c. 2,14 0,86 b
Os valores representam a média E.P.M. do número dos comportamentos de
dor durante 20 min após a administração do óleo de mostarda. Veículo (controle) e
ácido oleanólico foram administrados 1 h antes e morfina 30 min antes da
administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina, 50 L/animal). O
grupo salina recebeu apenas salina por via intracolônica. Foram utilizados grupos de
8 animais cada. ap<0,001 vs. grupo salina; bp<0,001 e cp<0,01 vs. controle óleo de
mostarda (ANOVA e Teste de Dunnet).
66
Figura 11- Estudo do envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação
do ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em
camundongos. Veículo (Tween 80 a 2% em água destilada, v.o.) e ácido oleanólico
(AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e morfina (5 mg/kg, s.c.) 30 min
antes da administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%,
50 μL/animal). A naloxona (Nalox, 2 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 min antes da
morfina ou 15 min antes da administração do ácido oleanólico. Os valores
representam a média E.P.M. do número de comportamentos de dor durante 20 min
após a administração do óleo de mostarda. Foram utilizados 8 animais por grupo.
ap<0,001 vs. grupo controle mostarda; bp<0,05 vs ácido oleanólico e cp<0,05 vs.
morfina (ANOVA e Teste de Dunnet).
Veículo AO 30 Morfina 5 mg/kg
Nalox Nalox
a
b
a
c
Óleo de mostarda
0
10
20
30
40
50
60
Nú
mero
de C
om
po
rtam
en
tos
de d
or/
20 m
in
67
Tabela 9- Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e morfina na nocicepção visceral induzida por óleo de
mostarda em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Número de comportamentos
de dor/20min.
Controle óleo de mostarda
- 54,4 1,03
Ácido oleanólico
30, v.o. 19,0 3,27 a
Morfina
5, s.c. 8,66 1,6 a
Naloxona + Morfina
2, i.p. +
5, s.c.
21,0 3,35 c
Naloxona + Ácido oleanólico
2 , i.p. +
30, v.o.
34,0 5,1 b
Os valores representam a média E.P.M. do número dos comportamentos de
dor durante 20 min após a administração do óleo de mostarda. Veículo (controle) e
ácido oleanólico foram administrados 1 h antes e morfina 30 min antes da
administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina, 50 L/animal). A
naloxona foi administrada 30 min antes da morfina ou 15 min antes da administração
do ácido oleanólico. Foram utilizados grupos de 8 animais cada. ap<0,001 vs. grupo
controle mostarda; bp<0,05 vs ácido oleanólico e cp<0,05 vs. morfina (ANOVA e
Teste de Dunnet).
68
5.2.3. Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico
O pré-tratamento dos animais com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.) ou com
clonidina (0,1 mg/kg, i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,001) do número
de comportamentos de dor (23,60 3,4; 3,6 1,16, respectivamente), quando
comparado ao grupo controle óleo de mostarda (55,0 2,2). O tratamento com
ioimbina (2 mg/kg, i.p.) reverteu (p<0,001) a inibição dos comportamentos
nociceptivos da clonidina (39,67 2,33), porém não reverteu a atividade
antinociceptiva do ácido oleanólico (15,75 2,62) (Figura 12 e Tabela 10).
5.2.4. Estudo do envolvimento do receptor da capsaicina (TRPV1)
Os grupos tratados com ácido oleanólico (30 mg/kg, v.o.), vermelho de rutênio
(3 mg/kg, i.p.) e ácido oleanólico + vermelho de rutênio apresentaram uma redução
significativa (p<0,001) na expressão do número de comportamentos de dor visceral
(28,83 1,4; 32,50 3,06; 26,67 1,5 respectivamente) quando comparados ao
grupo controle óleo de mostarda (54,60 2,31) (Figura 13 e Tabela 11).
69
Figura 12- Estudo do envolvimento do sistema adrenérgico no mecanismo de
ação do ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de
mostarda em camundongos. Veículo (Tween 80 a 2% em água destilada, v.o.) e
ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e clonidina
(Clon, 0,1 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração intracolônica de óleo de
mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 μL/animal). A ioimbina (Ioimb, 2 mg/kg, i.p.) foi
administrada 30 min antes de clonidina (0,1 mg/kg, s.c.) ou 15 min antes do
oleanólico (30 mg/kg, v.o.). Os valores representam a média E.P.M. do número de
comportamentos de dor durante 20 min após a administração do óleo de mostarda.
Foram utilizados 8 animais por grupo. ap<0,001 vs. grupo controle mostarda;
bp<0,001 vs clonidina (ANOVA e Teste de Dunnet).
Veículo AO 30 Clon 0,1 mg/kg
Ioimb Ioimb
a
a
b
Óleo de mostarda
0
10
20
30
40
50
60
Nú
mero
de C
om
po
rtam
en
tos
de d
or/
20 m
in
70
Tabela 10- Efeito da ioimbina sobre a atividade antinociceptiva do ácido
oleanólico e clonidina na nocicepção visceral induzida por óleo de
mostarda em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Número de comportamentos
de dor/20min.
Controle óleo de mostarda
- 55,0 2,2
Ácido oleanólico
30, v.o. 23,6 3,4 a
Clonidina
0,1, i.p. 3,6 1,16 a
Ioimbina + Clonidina
2, s.c. +
0,1, i.p.
39,67 2,33 b
Ioimbina + Ácido oleanólico
2, s.c. +
30, v.o.
15,75 2,62
Os valores representam a média E.P.M. do número dos comportamentos de
dor durante 20 min após a administração do óleo de mostarda. Veículo (controle) e
ácido oleanólico foram administrados 1 h antes e clonidina 30 min antes da
administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina, 50 L/animal). A
ioimbina foi administrada 30 min antes da clonidina ou 15 min antes da
administração do ácido oleanólico. Foram utilizados grupos de 8 animais cada.
ap<0,01 vs. grupo controle mostarda; bp<0,001 vs clonidina (ANOVA e Teste de
Dunnet).
71
Figura 13- Estudo do envolvimento do receptor vanilóide no mecanismo de
ação do ácido oleanólico na nocicepção visceral induzida por óleo de
mostarda em camundongos. Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, v.o.) e o
ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes e vermelho de
rutênio (3 mg/kg, s.c.) 30 min antes da administração intracolônica de óleo de
mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 μL/animal). O vermelho de rutênio (3 mg/kg,
s.c.) foi administrada 15 min antes da administração do ácido oleanólico. Os valores
representam a média E.P.M. do número de comportamentos de dor durante 20 min
após a administração do óleo de mostarda. Foram utilizados 8 animais por grupo.
ap<0,001 vs. grupo controle mostarda (ANOVA e Teste de Dunnet).
Veículo AO 30 AO 30 +
Vermelho de
Rutênio
mg/kg Vermelho de
Rutênio
a
a
a
0
10
20
30
40
50
60
Nú
mero
de C
om
po
rtam
en
tos
de d
or/
20 m
in
72
Tabela 11- Efeito do vermelho de rutênio sobre a atividade antinociceptiva do
ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzida por
óleo de mostarda em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Número de comportamentos
de dor/20min.
Controle óleo de mostarda
- 54,60 2,31
Ácido oleanólico
30, v.o. 28,83 1,4 a
Vermelho de Rutênio
3, i.p. 32,50 3,06 a
Vermelho de Rutênio + Ácido oleanólico
3, i.p. +
30, v.o.
26,67 1,5 a
Os valores representam a média E.P.M. do número dos comportamentos de
dor durante 20 min após a administração do óleo de mostarda. Veículo (controle) e
ácido oleanólcio foram administrados 1 h antes e vermelho de rutênio 30 min antes
da administração intracolônica de óleo de mostarda (0,75% em salina, 50
L/animal). O vermelho de rutênio foi administrado 15 min antes da administração do
ácido oleanólico. Foram utilizados grupos de 8 animais cada. ap<0,001 vs. controle
óleo de mostarda (ANOVA e Teste de Dunnet).
73
5.3. Avaliação da atividade no Sistema Nervoso Central
5.3.1. Teste do Campo Aberto
Os dados indicam que o ácido oleanólico, na dose de 30 mg/kg, não interfere
com o número de invasões dos animais, quando comparada ao grupo controle
veículo (44,67 2,11; 47,00 4,53, respectivamente). Porém, o óleo de mostarda
inibiu significativamente (p<0,05) a atividade locomotora normal dos animais (28,00
2,59) comparado ao grupo veículo. Os animais tratados com o triterpeno e que
receberam o óleo de mostarda por via intracolônica apresentaram uma reversão
(50,50 7,44) significativa (p<0,05) da inibição da atividade locomotora induzida
pelo óleo (Tabela 12).
5.3.2. Teste do Rota Rod
Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, v.o.) e ácido oleanólico (30
mg/kg, v.o.) foram administrados 1 h antes da administração intracolônica de salina
ou de óleo de mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 L/animal). Os dados indicam
que não houve diferença estatisticamente significante (p>0,05) entre os grupos
veículo, ácido oleanólico, veículo + óleo de mostarda e ácido oleanólico + óleo de
mostarda quanto ao tempo de permanência na barra (Tabela 13).
74
Tabela 12- Efeito do ácido oleanólico no teste do campo aberto em camundongos
Grupo Número de invasões
Veículo AO (30 mg/kg, v.o.) Veículo + óleo de mostarda AO (30 mg/kg, v.o.) + óleo de mostarda
47,00 4,53
44,67 2,11
28,00 2,59 a
50,50 7,44 b
Camundongos foram pré-tratados com veículo (3% tween 80 em água
destilada, v.o.) ou ácido oleanólico (AO, 30 mg/kg, v.o.), antes da administração
intracolônica de salina ou óleo de mostarda (0,75%, 50 μl). Os valores representam
a média E.P.M. do número de invasões dos animais após administração do óleo
de mostarda. ap<0,05 vs. grupo veículo; bp<0,05 vs. veículo + óleo de mostarda
(ANOVA e Teste de Dunnet).
75
Tabela 13- Efeito do ácido oleanólico no teste do rota rod em camundongos
Grupo Dose
(mg/kg) Tempo de permanência
na barra (s.)/2min.
- Controle (veículo)
120,00 0,00
Ácido oleanólico
30, v.o. 120,00 0,00
Óleo de Mostarda
- 114,30 4,54
Ácido oleanólico + Óleo de Mostarda
30, v.o. 116,78 3,14
Os valores representam a média E.P.M. do tempo (s) de permanência dos
animais no aparelho de rota rod durante 2 min. Veículo (controle), ácido oleanólico
foram administrados 1 h antes da administração intracolônica de salina ou de óleo
de mostarda (0,75% em salina 0,9%, 50 L/animal). Foram utilizados grupos de 8
animais cada (ANOVA e Teste de Dunnet).
76
6. DISCUSSÃO
A pesquisa com produtos naturais continua a nos dar uma enorme variedade
de substâncias que são usadas para o desenvolvimento de novas drogas pelas
indústrias farmacêuticas (BORRIS, 1996). Atualmente, o interesse para o uso clínico
de novas substâncias com atividades analgésicas utilizadas principalmente para o
tratamento de vários tipos de dor, vem aumentando significativamente. Vários
modelos de nocicepção em animais de laboratório podem ser utilizados para
verificar a atividade analgésica de extratos e compostos. No entanto, de uma
maneira geral, esses modelos possuem características próprias que devem ser
consideradas, tais como simplicidade, reprodutibilidade e validade dos resultados
obtidos e principalmente, a possibilidade de serem correlacionados com estudos
clínicos (DICKENSON; BESSON, 1997).
Uma classe de substâncias bastante estudada hoje em dia é a dos
triterpenos. Os triterpenos são substâncias naturais e biologicamente ativas
extraídas de muitas plantas, que têm produzido resultados promissores em estudos
experimentais e clínicos (SPESSOTO et al., 2003). O ácido oleanólico é um
triterpeno natural encontrado em algumas plantas e é um componente de muitas
ervas medicinais. Estudos anteriores demonstraram que essa substância possui
uma variedade de ações amplamente conhecidas, tais como: hepatoproteção,
gastroproteção, antiinflamatória, anti-câncer, antioxidante e também antinociceptiva
(CIPAK et al., 2006). Várias dessas atividades farmacológicas do AO são bem
estabelecidas na literatura, principalmente a atividade hepatoprotetora (TANG et al.,
2005; LIU, 2005). Entretanto, poucos trabalhos visaram o estudo da atividade
antinociceptiva.
Estudo realizado por Choi et al. (2005), demonstrou a atividade
antinociceptiva de um extrato de Akebia quinata nos modelos de placa quente e tail
flick, onde parte dessa atividade foi atribuída ao AO. A avaliação da atividade
antinociceptiva do AO isolado de um extrato de Kochia scoparia L., foi avaliada
também em um estudo realizado por Matsuda et al. (1997), nos testes de contorções
abdominais induzidas por ácido acético assim como no teste da formalina.
77
No presente estudo, procuramos avaliar a atividade antinociceptiva do AO
usando dois modelos de nocicepção, um somático e outro visceral, assim como
buscamos desvendar os possíveis mecanismos de ação envolvidos. O primeiro foi
um modelo de nocicepção neurogênica induzida pela injeção intraplantar de
capsaicina em camundongos.
Sakurada et al. (1992), foram os primeiros a demonstrar que a injeção
intraplantar de capsaicina na pata posterior de camundongos causava vigorosa
nocicepção, caracterizadas por lambidas e mordidas, sendo esse efeito relacionado
com a nocicepção de origem neurogênica. A capsaicina é um ingrediente pungente
extraído da pimenta vermelha, que estimula um receptor específico denominado
TRPV1, localizado nas fibras C. Quando aplicada na pele ou em animais, produz
irritação caracterizada por reação dolorosa e subseqüente dessensibilização para a
dor induzida quimicamente (MELO et al., 2006).
Sabe-se que a injeção intraplantar de capsaicina leva ao aumento na ativação
de nociceptores presentes nas fibras aferentes primária do tipo C e A , na ativação
de receptores TRPV1 e causa acúmulo de Ca2+, o que é necessário para a liberação
de neurotransmissores e para a inflamação neurogênica (SZOLCSÁNYI, 1999;
SAKURADA et al., 2003).
Os resultados obtidos com o AO, mostram que a substância administrada via
oral (10; 30 e 100 mg/kg) e o vermelho de rutênio, foram capazes de inibir a
nocicepção aguda induzida pela administração de capsaicina em camundongos. AO
produziu uma antinocicepção dose dependente nas dose de 10 e 30 mg/kg,
enquanto que em uma dose maior (100 mg/kg) a resposta foi bem mais reduzida
apesar de estatisticamente diferente. Essa é uma característica da resposta da
droga e consideramos que o AO em baixas doses produz efeitos benéficos
(CALABRESE et al., 2006).
Alguns trabalhos mostram que o AO em baixas doses, pode oferecer
gastroproteção, hepatoproteção, enquanto que em altas doses pode produzir
hepatotoxicidade. Portanto, apesar de ser relativamente segura e não tóxica a
78
seleção da dose apropriada da substância é essencial (LIU, 2005; LIU, 1995;
OVESNÁ et al., 2004).
Na dose de 100 mg/kg, o efeito inibitório do AO na nocicepção se assemelha
aquele do vermelho de rutênio, um antagonista não-competitivo TRPV1.
Capsazepina, embora pareça ser um antagonista seletivo dos receptores TRPV1,
não foi utilizada para comparação com o AO porque parece ser menos efetivo em
roedores e recentemente sua seletividade tem sido questionada (CORRELL et al.,
2004; WALKER et al., 2003).
De acordo com Stanfa et al. 1992, o sistema opióde exerce um importante
papel na modulação da dor tanto em condições fisiológicas, quanto em condições
inflamatórias. Estudos anteriores mostraram que opióides endógenos agem na
antinocicepção por abrir os canais de potássio ATP dependentes (LOHMANN;
WELCH, 1999).
Desde a descoberta do ópio da papola, é sabido que os opiáceos como a
morfina e a codeína têm efeitos analgésicos. A ligação dos opióides aos neurônios
pode provocar analgesia de duas maneiras: provocando a hiperpolarização das
membranas, devido ao aumento da condutância ao K+; ou pela diminuição da
liberação de neurotransmissores excitatórios, devido à inibição de canais de Ca2+
ativados por voltagem.
O efeito antinociceptivo de triterpenos envolvendo o sistema opióide já foi
descrito na literatura. Oliveira et al. (2005) demonstraram que o efeito antinociceptivo
da mistura de triterpenos, α- e -β amirinas, deve-se em parte a participação do
sistema opióide. Outro estudo feito por Ferreira et al. (2000), também mostrou o
efeito antinociceptivo do extrato de Epidendrum Mosenii, provavelmente devido à
presença de triterpenos, e em parte devido à participação do sistema opióide.
No nosso estudo, o papel do sistema opióide foi determinado pela
administração de morfina (5 mg/kg s.c.) e naloxona (2 mg/kg i.p.). Nossos resultados
sugerem a participação do sistema opióide no efeito antinociceptivo do AO frente à
79
capsaicina, devido a reversão do efeito antinociceptivo em animais pré-tratados com
naloxona, um antagonista opióide não seletivo.
Os canais KATP dependentes também mostraram ter um envolvimento nos
processos de dor. A ativação desses canais, leva a uma hiperpolarização celular,
diminuindo os níveis de Ca2+ intracelular e reduzindo a liberação de
neurotransmissores, desse modo levando à antinocicepção (ASSANO et al., 2000;
OCANA et al., 2004; LOHMANN; WELCH, 1999). Dependendo da localização, esses
canais podem agir direta ou indiretamente nos sinais de transmissão da dor.
Atualmente, vários anestésicos usados clinicamente agem por interagir com canais
de potássio. Alguns produtos naturais também possuem essa mesma ação
(McCURDY; SCULLY, 2005).
Para verificar o possível envolvimento dos canais KATP dependentes no
mecanismo de ação do AO, utilizamos a glibenclamida, um conhecido bloqueador
desses canais. Os resultados obtidos mostraram que a antinocicepção produzida
pelo AO não é somente revertida pelo naloxona, como também é revertida pela
glibenclamida, sugerindo o envolvimento dos canais KATP dependentes nesse
mecanismo de ação.
Outro mecanismo que procuramos avaliar foi o envolvimento do sistema
adrenérgico. O envolvimento dos receptores adrenérgicos do tipo 2 na modulação
da transmissão dolorosa encontra-se bastante estabelecido. Os receptores
adrenérgicos 2 encontram-se envolvidos na analgesia produzida após estimulação
de diversos componentes do sistema endógeno, como por exemplo a substância
cinzenta periaqueductal e diversas áreas do tronco cerebral que alojam grupos de
neurônios noradrenérgicos (JONES, 1992).
O funcionamento dos receptores quando ativados por um agonista é o de
inibir a enzima adenilato ciclase, que causa conseqüentemente diminuição do AMP
cíclico (AMPc) intracelular. Uma diminuição no AMPc causa atenuação da ativação
das proteínas alvo reguladoras, impedindo sua fosforilação, que, por sua vez, altera
a resposta biológica celular. Outro mecanismo é através da saída de potássio do
meio intracelular através de um canal ativado (BAGATINI et al., 2002).
80
Efetivamente, a analgesia produzida por estimulação dessas áreas pode ser
inibida por aplicação de antagonistas dos receptores adrenérgicos 2. Dessa
maneira, examinamos o possível envolvimento dos receptores 2 no efeito
antinociceptivo do AO, usando animais pré-tratados com clonidina, agonista ou
ioimbina, um antagonista desse receptor.
A ação analgésica da clonidina é exercida através de diferentes mecanismos,
ou seja, pelo bloqueio da condução nervosa das fibras C e A-δ, pelo aumento da
concentração de acetilcolina medular e pela elevação dos níveis de noradrenalina no
SNC (ROCHA et al., 2002).
Os resultados obtidos indicam que tanto a clonidina quanto o AO são capazes
de diminuir a dor aguda causada pela capsaicina, Entretanto, a ioimbina conseguiu
antagonizar somente o efeito antinociceptivo da clonidina, não revertendo o efeito
produzido pelo AO. Podemos sugerir que os receptores 2 não devem estar agindo
no mecanismo de ação do AO.
Investigou-se também a participação da via L-arginina- óxido nítrico na
antinocicepção induzida pelo AO, tendo em vista que essa via exerce um papel
importante na modulação da nocicepção. Uma série de estudos morfológicos,
fisiológicos e farmacológicos sugerem que o óxido nítrico (NO) participa do processo
de nocicepção (HALEY et al., 1992).
O NO é responsável pela ativação da guanilato ciclase solúvel e aumento do
GMPc intraceclular, podendo então modular uma série de funções fisiológicas.
Também está envolvido na nocicepção central e periférica, agindo como agente pró-
nociceptivo, bem como um agente antinociceptivo. Diversos estudos têm
evidenciado alguma participação do NO durante a transmissão nociceptiva
prolongada, notadamente medular, sugerindo importante papel do NO na dor
(DICKENSON, 1995). Entretanto, o mecanismo exato pelo qual o óxido nítrico
exerce esse duplo efeito ainda é incerto (MACHELSKA et al., 1997; ZAKARIA et al.,
2005).
81
Kawabata et al. (1994), sugere que o NO induz um efeito pró-nociceptivo em
baixas concentrações e antinociceptivo em altas concentrações. Em nível supra-
espinhal o NO parece ter um efeito duplo dependendo da via que é ativada. A
ativação da via NO-cGMPC resulta em hiperalgesia (KAWABATA et al., 1993).
A L-arginina administrada topicamente exibe atividade antinociceptiva em
ratos com hiperalgesia induzida por carragenina, sendo esse efeito bloqueado por
inibidores de NOS e de guanilato ciclase. Contrariamente a esses achados, a L-
arginina, produziu uma resposta nociceptiva em respostas inflamatórias causadas
por substância P, carragenina e bradicinina, sendo o efeito suprimido pelo L-NAME.
Esses achados confirmam o efeito nociceptivo e antinociceptivo da via NO- GMPc
nos tecidos periféricos (ZAKARIA et al., 2005).
No nosso estudo, camundongos foram pré-tratados com o substrato do óxido
nítrico sintase, a L-arginina, em uma dose que não teve nenhum efeito significativo
frente à injeção intraplantar de capsaicina, e este reverteu significativamente a
antinocicepção produzida tanto pelo AO quanto pelo L-NAME, esse último sendo um
conhecido inibidor de NO. Os achados desse estudo sugerem um possível
envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico na antinocicepção causada pelo AO.
É interessante notar que o L-NAME sozinho reduziu a nocicepção induzida
pela capsaicina, indicando o papel do NO na nocicepção induzida por esse agente.
Entretanto, a combinação deste com AO, mostrou uma potenciação na resposta.
Não é bem claro dizer se a formação de NO tem papel na abertura dos canais
KATP dependentes, mas um estudo realizado em porcos, mostrou que a formação de
NO leva á ativação dos canais KATP dependentes sensíveis a glibenclamida, através
da via cGMP-kinase. Através dessas observações e baseado em nossos resultados,
sugerimos o envolvimento da via oxido nítrico – cGMP – canais KATP no efeito
antinociceptivo do AO.
Em animais, muitas substâncias algogênicas, como a capsaicina, óleo de
mostarda e ciclofosfamida, quando aplicadas a estruturas viscerais induzem a
expressão de comportamentos relacionados à nocicepção envolvendo fibras
82
aferentes sensíveis à capsaicina (JORDT et al., 2004; KOBAYASHI, 2003; MAGGI et
al., 1992). Essas substâncias algogênicas são capazes de induzir nocicepção, bem
como uma reação inflamatória, quando fibras aferentes viscerais são sensibilizadas
ou neurônios centrais sofrem uma mudança em sua excitabilidade (sensibilização
central) após persistente ativação visceral (GEBHART, 1995).
O óleo de mostarda é um potente ativador neuronal que, quando aplicado
topicamente na pele, ativa as terminações nervosas, produzindo dor, inflamação e
hipersensibilidade a estímulos térmicos e mecânicos (JORDT et al., 2004). O maior
constituinte do óleo de mostarda é o Alil-isotiocianato, sendo postulada uma ação
sobre receptores da capsaicina TRPV1 como mecanismo de ação, também podendo
desenvolver lesão tecidual direta com produção de mediadores inflamatórios, como
a bradicinina e prostaglandinas. Muito se questiona quanto ao real mecanismo pró-
nociceptivo desta substância uma vez que camundongos ‗knock-out‘ para o receptor
TRPV1 possuem sensibilidade para o óleo de mostarda, sugerindo que a capsaicina,
um reconhecido agonista destes receptores, e os isotiocianatos possuem
mecanismos moleculares diferentes (CATERINA et al., 2000).
Mais recentemente, um estudo realizado por Bautista et al. (2006), sugeriu a
ligação do óleo de mostarda com um receptor específico, denominado TRPA1.
Utilizando camundongos ―knockout‖ para esse tipo de receptor, mostrou-se que o
TRPA1 é um importante receptor, no qual irritantes e agentes algésicos endógenos
se ligam despolarizando nociceptores para causar a dor inflamatória.
No modelo de nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda o
tratamento via oral dos animais com ácido oleanólico, em doses que variaram de 3-
100 mg/kg, também promoveu uma redução na nocicepção nas doses de 10, 30 e
100 mg/kg, sendo o maior percentual de inibição dos comportamentos obtido com a
dose de 30 mg/kg. Esta por ser mais efetiva foi, portanto, a dose selecionada para o
estudo do mecanismo de ação do AO nesse modelo.
Como já visto anteriormente, o AO demonstrou ter eficácia melhor em baixas
doses (10, 30 mg/kg, v.o.), ao passo que com uma dose mais elevada (100 mg/kg,
v.o.) ocorreu uma redução na atividade antinociceptiva da droga. Isso promoveu a
83
formação de um gráfico dose-resposta na forma de ―U‖, implicando que AO pode ter
uma dupla ação sobre a resposta do agente danoso, provavelmente devido ao
aumento da toxicidade da droga em altas doses. Esses resultados estão de acordo
com o trabalho realizado por Lima-Júnior et al. (2006). Nesse estudo, avaliou-se a
atividade antinociceptiva de uma mistura de triterpenos α- e -β amirinas no modelo
de nocicepção visceral induzido por óleo de mostarda. O aumento da dose testada
levava a uma redução da atividade antinociceptiva, semelhante ao ocorrido no nosso
estudo.
O triterpeno AO reduziu significantemente os comportamentos dolorosos
viscerais induzidos por óleo de mostarda, possivelmente regulando o funcionamento
das fibras aferentes primárias. As vísceras expressam uma vasta gama de
receptores de membrana (incluindo receptores vanilóides, TRPV1) para estímulos
químicos, que estão envolvidos na sinalização sensorial desde a periferia até o
sistema nervoso central (WOOD, 2004). O receptor TRPV1 realiza importante papel
na regulação funcional dos nervos sensoriais. Evidências apontam para o potencial
terapêutico dos moduladores destes receptores, particularmente no controle da dor
(DOHERTY et al., 2005; BONACHE et al., 2006). Antagonistas do receptor TRPV1
produzem efeitos anti-hiperalgésicos em modelos de dor neuropática e inflamatória
(OGNYANOV et al., 2006).
Camundongos ‗knock-out‘ para o receptor TRPV1, mostram analgesia em
alguns estados de dor inflamatória, sugerindo que antagonistas do receptor TRPV1
podem ser efetivos nesses tipos de dor associada com injúria tecidual e exposição a
substâncias irritantes (LIMA-JÚNIOR et al., 2006).
Jones et al. (2005), também demonstraram que receptores TRPV1 presentes
nas fibras neuronais aferentes de cólons de ratos, medeiam os comportamentos
nociceptivos viscerais durante uma injúria tecidual mecânica. Por essas razões,
buscamos avaliar a participação desse receptor em um modelo de nocicepção
visceral induzido quimicamente.
Com o objetivo de verificar a participação dos receptores TRPV1 no
mecanismo de ação do AO, utilizamos o vermelho de rutênio, um antagonista não-
84
competitivo do receptor TRPV1. Essa substância atua mediante bloqueio do influxo
de Ca2+ através do canal associado ao receptor, inibe a atividade excitatória
mediada pela capsaicina, além de inibir a liberação dos estoques intracelulares de
Ca2+ (SZALLASI; BLUMBERG, 1999).
O vermelho de rutênio e o ácido oleanólico foram capazes de inibir a
nocicepção induzida por óleo de mostarda. Entretanto, isso não implica que o ácido
oleanólico é um antagonista não competitivo do TRPV1, como o vermelho de
rutênio. Quando os animais foram pré-tratados com ácido oleanólico e vermelho de
rutênio em combinação, não existiu antagonismo ou aumento na antinocicepção no
teste do óleo de mostarda. Além disso, diferentemente da capsaicina, o AO falhou
em induzir per se nocicepção depois da injeção subplantar em pata de
camundongos. Essas observações sugerem que o AO não age como um agonista
do TRPV1, mas possivelmente induz uma influência modulatória nos receptores
vanilóides, o que necessita de estudos mais aprofundados.
Na tentativa de desvendar melhor o mecanismo de ação, verificou-se a
participação dos receptores α2. Estudos anteriores mostraram que a administração
de um agonista do receptor α2, demonstrou ter efeito antinociceptivo em modelos
experimentais de colite induzida por formalina em ratos e demonstrou reduzir a
hipersensibilidade visceral em testes clínicos (MIAMPAMBA et al., 1996;
BLACKSHAW; GEBHART, 2002).
A clonidina, agonista dos receptores α2, e o AO foram capazes de reduzir os
comportamentos dolorosos induzidos pelo óleo de mostarda. Entretanto, a ioimbina,
antagonista dos receptores α2, foi capaz de reverter a antinocicepção produzida pela
clonidina, mas não a produzida pelo AO, sugerindo que os receptores α2 não têm
participação nesse mecanismo.
Nesse modelo, procuramos avaliar também a participação do sistema opióide.
Nossos resultados mostraram que a morfina e o AO reduziram significantemente a
nocicepção visceral induzida pelo óleo de mostarda, sendo esse efeito revertido pelo
pré-tratamento com naloxona, o que indica um possível envolvimento do sistema
opióide. É interresante notar, que a inibição da morfina foi mais eficaz quando
85
comparado com o AO. Provavelmente, a morfina exerça um efeito maior sobre o
subtipo de receptor k-opióide. Como sugerem dados da literatura, dentre os subtipos
de receptores opióides, o receptor k-opóide exerce um papel bastante expressivo na
nocicepção visceral (BLACK; TREVETHICK, 1998).
A dor relacionada aos testes comportamentais usados para selecionar
agentes potencialmente antinociceptivos pode ter alguma limitação. Não está claro
qual extensão da sedação ou alterações nas funções motoras podem influenciar o
resultado destes testes. Estudos sugerem que a sedação do sistema nervoso central
e o efeito músculo-relaxante não-específico podem reduzir a resposta de
coordenação motora como, por exemplo, a lambedura de pata no teste da
capsaicina (SOJA et al., 2002). Desta maneira, procuramos avaliar a ação do AO
nos modelos do campo aberto e rota-rod.
No teste do campo aberto, houve uma redução significativa da freqüência de
locomoção dos animais associada à administração do óleo de mostarda. Porém, o
tratamento dos animais com AO antes da injeção intracolônica do óleo reverteu
significativamente este impedimento locomotor ‗freezing‘ induzido pelo óleo de
mostarda, permitindo afirmar a efetividade desta mistura como droga antinociceptiva.
Em adição, o teste do rota rod foi realizado para avaliar uma possível
interferência sobre a coordenação motora dos animais causada pela administração
do óleo de mostarda ou pelo tratamento com AO. Os dados indicam que tanto o AO
(30 mg/kg, v.o.), como o óleo de mostarda, não induzem incoordenação motora nos
animais no teste do rota rod, permitindo afirmar que o ‗freezing‘ expresso pelos
animais que receberam o algógeno não se relaciona a alterações motoras e que o
triterpeno é realmente efetivo na reversão desta condição.
Avaliando nossos achados, os resultados obtidos no presente estudo
confirmam e estendem os dados da literatura, mostrando que o triterpeno AO inibe a
nocicepção visceral e somática nos modelos de nocicepção induzido por capsaicina
e óleo de mostarda. Sugere-se que esse efeito sobre a nocicepção no modelo
induzido pela capsaicina é em parte devido a uma ação sobre os receptores
opióides, inibição da produção de NO e ativação dos canais de K+. Já no modelo de
86
nocicepção induzida por óleo de mostarda, sugere-se a participação do sistema
opióide, bem como uma ação modulatória sobre os receptores vanilóides,
necessitando de estudos mais aprofundados.
87
7. CONCLUSÕES
O ácido oleanólico nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg revelou uma atividade
antinociceptiva no modelo de nocicepção induzida pela injeção intraplantar de
capsaicina;
O estudo do mecanismo antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de
nocicepção induzido pela capsaicina, indica um envolvimento do sistema opióide, da
inibição da produção do óxido nítrico e dos canais de potássio, como evidenciado
pela reversão da atividade do AO, proporcionada pela naloxona, L-arginina e
glibenclamida respectivamente;
O uso do antagonista dos receptores α2-adrenérgicos, ioimbina, não reverteu a
atividade antinociceptiva do ácido oleanólico, excluindo-se a participação deste
receptor como mecanismo de ação do AO no modelo de nocicepção induzido por
capsaicina;
O ácido oleanólico nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg revelou uma atividade
antinociceptiva no modelo de nocicepção visceral induzida pelo óleo de mostarda;
O estudo do mecanismo antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de
nocicepção visceral induzido por óleo de mostarda, indica um envolvimento, do
sistema opióide, como evidenciado pela reversão da atividade do AO, proporcionada
pela naloxona;
O estudo do envolvimento do receptor TRPV1 como parte do mecanismo
antinociceptivo do ácido oleanólico no modelo de nocicepção visceral induzido por
óleo de mostarda, revela uma possível modulação ao nível deste receptor,
evidenciado pela não potencialização da resposta antinociceptiva do vermelho de
rutênio, um antagonista não competitivo do receptor TRPV1;
O uso do antagonista dos receptores α2-adrenérgicos, ioimbina, não reverteu a
atividade antinociceptiva do ácido oleanólico, excluindo-se a participação deste
88
receptor como mecanismo de ação do AO no modelo de nocicepção visceral
induzido por óleo de mostarda;
O ácido oleanólico não alterou a atividade locomotora espontânea dos animais,
como demonstrado pelo teste do campo aberto; porém na vigência de um estímulo
algogênico (injeção intracolônica de óleo de mostarda), que reduz a deambulação
normal dos animais, a substância (30 mg/kg) foi capaz de reverter esse estado de
imobilidade, indicando uma atividade antinociceptiva;
Tanto o ácido oleanólico, como o algógeno óleo de mostarda, não causam
alterações motoras nos animais, como evidenciado no teste do rota rod, indicando
que a atividade antinociceptiva da susbtância independe de um comprometimento
motor.
89
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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