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Estudio del potencial de biodegradación del

Captan en un cultivo de flores de la Sabana

de Bogotá

GUTIERREZ GOMEZ ANA MARIA*

* Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá

Colombia.

Departamento de Ingeniería Ambiental, Universidad de los Andes, Bogotá

Colombia.

Profesores asesores: Muñoz Felipe, Husserl Johanna.

RESUMEN

El fungicida captan se ha utilizado ampliamente para controlar hongos patógenos en plantas desde

hace más de 30 años. A partir de una muestra de suelo obtenida en un cultivo de rosas de la sabana

de Bogotá se aisló un morfotipo microbiano capaz de utilizar captan comercial como única fuente

de carbono y energía. Al realizar pruebas de biodegradación por medio de HPLC no se encontró

degradación del pesticida. Esto permite afirmar que el crecimiento microbiano observado se debía

a la degradación de otros ingredientes inertes que contiene el pesticida comercial. No se pudo

comprobar la mineralización completa del pesticida captan.

Palabras clave: pesticida; captan; biodegradación; ingredientes inertes;

INTRODUCCION

Uno de los principales motores de la economía Colombiana corresponde

al sector agropecuario. Las exportaciones de productos agrícolas

colombianas en los últimos 6 años son lideradas por el café y seguidas

por las flores. Las flores tienen una participación de alrededor de 8% en el

PIB de agricultura y actualmente se exportan a mas de 89 países.

(Asocolflores, 2010). Según datos del World Resources Institute de

Estados Unidos, Colombia es el segundo país con mayor consumo de

pesticidas en el mundo (16.7 kg por hectárea). Lo anterior conlleva a un

rápido crecimiento en la contaminación del suelo por residuos de

pesticidas.

Los fungicidas de tipo ftalamidas como captan, captafol, y folpet son

protectores importantes de superficies utilizados para controlar hongos

patógenos de las plantas. Captan (N-triclorometiltio-4-ciclohexano-1,2-

dicarboximida) es uno de los funguicidas mas ampliamente usado en

2

semillas, frutas, vegetales y plantas ornamentales (Megadi & Tallur,

2010). Este fungicida es utilizado para controlar enfermedades causadas

por hongos cómo, Botrytis sp., Fusarium sp., Fusicoccum sp. y Pythium

sp. entre otras. Este actúa inhibiendo el crecimiento de los micelios de las

esporas de hongo germinantes, y como resultado tiene una eficiente

acción protectora aunque no erradica una infeccion preexistente.

(NationalCancerInstitute, 1977) .

Figura 1. Estructura del captan. (EPA, 2011)

Además de los usos mencionados anteriormente, el captan también ha

sido utilizado como fungicida industrial en pinturas, plásticos, cuero,

papel, cosméticos y textiles para prevenir el crecimiento de hongos. Este

fungicida ha sido uno de los más utilizados desde su introduccion en

1970. El departamento salud, educación y bienestar de los Estados

Unidos elaboró un informe sobre los posibles efectos carcinogénicos del

captan debido al potencial daño por exposición a largo plazo en humanos.

En este se encontró que el pesticida en cuestión afecta de manera

adversa tanto a ratas como a ratones. El captan tiene una dosis oral LD50

de 9000 mg/kg en ratas, la cual es considerada una toxicidad baja.

(Gordon, 2001). El principio que gobierna la toxicidad del captan y otras

ftalamidas se centra en su rápida reaccion con grupos tiol la cual resulta

en la degradacion del compuesto.

El uso de este fungicida puede llegar a causar contaminación ambiental,

pérdida de la fertilidad del suelo debido a la destrucción de las

comunidades microbianas responsables de capturar el nitrógeno, fosfato y

otros nutrientes (Megadi & Tallur, 2010). La degradación microbiana de

este pesticida es entonces un problema de interés pues ha probado ser

efectiva en varios casos. Sin embargo no se han reportado en la literatura

muchos estudios al respecto a excepcion del de Buyanovsky et al. en el

que se estudió la degradación de captan en suelos bajo condiciones de

laboratorio mostrando su transformación en tetrahydroftalamida por

microorganismos presentes en el suelo. Tambien Megadi et al reportaron

la degradación bacteriana de este fungicidautilizando la bacteria Bacilus

3

circulans la cual probó utilizar al captan como unica fuerte de carbonos y

energía.

1.1 Estudios previos

Durante los últimos 50 años el problema de acumulación de pesticidas en

cuerpos de agua y suelo ha aumentado considerablemente, lo que ha

generado que las investigaciones para hallar nuevas formas de reducir

sus concentraciones se haya incrementado.

Varias investigaciones sobre la degradación de diferentes pesticidas se

han realizado. Una de estas es la realizada por Bhalerao y Puranik en el

2007 para probar la degradación del endosulfan con Aspergillus niger,

descubrió que la remoción del pesticida se inicia en las primeras 24 horas

de estudio. Para la comprobación y medición de esto se utilizó

cromatografía de gases y se descubrió que se produce un metabolito

intermedio en la degradación. Debido al control de pH que se llevó a cabo

durante el estudio, se determinó que hay dos formas de degradación:

química cuando hay cambio y biológica cuando no lo hay pues se de la

hidrólisis biológica. (Bhalerao & Puranik, 2007).

En cuanto a estudios específicos para el pesticida captan, Buyanovsky et

al. demostraron en su estudio de degradación de captan bajo condiciones

de laboratorio, que el fungicida tenía un efecto estimulante en la actividad

biológica total del suelo medida a través de la respiración del suelo. El

experimento rebeló que después de 60 días de incubación alrededor del

60% del pesticida inicial fue extraíble y no había sufrido una

transformación química significativa.

Por otra parte Megadi et al. encontró que la biodegradación se efectuaba por medio de la bacteria B. circulans la cual utilizaba el fungicida captan como única fuente de carbono y energía. El organismo degradó el captan por una vía que implica la hidrólisis inicial para producir cis-1,2,3,6-tetrahidroftalamida, un compuesto sin actividad fungicida. La formación de este compuesto fue confirmada por las técnicas de HPLC, IR, RMN y análisis espectral de masas. Los resultados también revelaron que la cis-1,2,3,6-tetrahidroftalamida se degradó aun más a ácido o-ftálico, indicando que hubo una mineralización completa del fungicida captan por B. circulans. Los estudios nombrados anteriormente los cuales han sido desarrollados

en los últimos 50 años, ilustran la necesidad creciente de generar

mayores bases de conocimiento para tratar los problemas de acumulación

de pesticidas en cuerpos de agua y suelos.

4

MATERIALES Y METODOS

Reactivos

El captan comercial (MAESTRO 50% WP) se obtuvo de Arysta LifeScince

Colombia S.A. El estándar para HPLC se obtuvo de Sigma-Aldrich, USA.

El resto de los reactivos utilizados, como las sales del medio de cultivo

fueron utilizados de grado analítico.

Metodología

Toma de muestra en cultivo

Crecimiento microbiano en medio con captan, con y sin glucosa

Aislamiento de microorganismo capaz de crecer en medio de sales con captan

comercial como única fuente de carbono

Elaboración de curva de crecimiento microbiano

Curva de calibración para HPLC y perfil de concentración del pesticida

5

Toma de muestra

El suelo fue tomado en un cultivo de flores cercano al Neusa en el

departamento de Cundinamarca. En el invernadero en el que se tomaron

las muestras se habían realizado dos aplicaciones previas del pesticida

captan con un mes de diferencia entre las dos. La muestra se tomo en

frascos previamente esterilizados. En el cultivo, el pesticida se aplica por

el método de aspersión con aguilón tal como lo muestra la figura 2.

La muestra fue almacenada desde entonces a 4°C.

Figura 2. Aplicación de pesticida en invernadero

Crecimiento Microbiano

Se seleccionó un medio de cultivo general de sales minerales para

realizar el crecimiento de las muestras. Dicho medio contiene:

6

Tabla1. Medio de Sales Minerales (MSM)

Adicionalmente se preparó una solución concentrada de glucosa (500g/L)

para agregarla a algunas de las muestras como fuente de carbono

adicional al captan comercial que se le agrega al medio a una

concentración de 1g/L.

Se prepararon en Erlenmeyers de 100 mL: 30 mL de MSM, 30 mg de

captan comercial y 1 gr de suelo. A la mitad de dichas muestras se

agrega 1 mL adicional de la solución de glucosa (previamente diluida a

250 g/L) para que pudiera ser autoclavada. Una muestra de cada tipo es

puesta a diferentes condiciones ambientales:

Figura 3. Muestras preparadas

La glucosa se utilizó en las muestras 2 y 4 como fuente alterna de

carbono. En estas, era posible hallar microorganismos que inicialmente

consumieran la glucosa y posteriormente empezaran a degradar el

pesticida o microorganismos que en presencia de glucosa crecieran más

rápidamente debido a su uso en procesos metabólicos. También esto hizo

posible hallar algunos hongos resistentes a dicha concentración del

Muestra 1

•Captan 30 mg (1g/L)

•MSM 30 mL

• Suelo 1g

•Condiciones: Shaker 120rpm y 28° C

Muestra 2

•Captan 30 mg (1g/L)

•MSM 29 mL

• Suelo 1g

•Glucosa 1 mL solución (8.33g/L)

•Condiciones: Shaker 120rpm y 28° C

Muestra 3

•Captan 30 mg (1g/L)

•MSM 30 mL

• Suelo 1g

•Condiciones: Ambientales agitación manual

Muestra 4

•Captan 30 mg (1g/L)

•MSM 29 mL

• Suelo 1g

•Glucosa 1 mL solución (8.33g/L)

•Condiciones: Ambientales agitación manual

REACTIVO FORMULA MOLECULAR

Cantidad (mg)

Fosfato di-potásico K2HPO4 3150

Fosfato mono-potásico KH2PO4 910

Cloruro de amonio NH4Cl 500

Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4 7H2O 100

Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 2H2O 50

Sulfato ferroso heptahidratado FeSO4 7H2O 50

Molibdato de Sodio dihidratado Na2MoO4 2H2O 0.3

Sulfato de Manganeso MnSO4 0.3

Agua desionizada H2O 500 mL

7

pesticida comercial (1g/L). Sin embargo se decidió realizar el estudio con

el morfotipo microbiano aislado de la muestra que contenía el pesticida

comercial como única fuente de carbono y energía para asegurar que su

crecimiento se debiera exclusivamente a la presencia de este.

Después de lograr aislar un morfotipo microbiano capaz de crecer en el medio de sales minerales con una concentración de 1g/L del pesticida comercial como única fuente de carbono, éste se conservó en medio sólido a 30°C en incubadora. El crecimiento fue medido a 650 nm en un espectrofotómetro de masas. Lo anterior se realizó en muestras con concentraciones de 1 y 3g/L de pesticida comercial y de 50 mg/L de pesticida estándar. Adicionalmente se comprobó que no hubiera crecimiento en el medio de sales minerales sin pesticida. En cuanto a las pruebas de crecimiento en pesticida estándar, éste se disolvió en acetonitrilo, debido a su baja solubilidad en agua (<5 mg/L). Lo anterior se llevó a cabo en los mismos Erlenmeyers que se utilizarían posteriormente para la prueba de crecimiento. La solución se dispersó por las paredes del Erlenmeyer hasta evaporación, con el fin de que el pesticida se dispersara en el medio. Posteriormente, se agregó el medio de sales minerales estéril y se inoculó cada una de las muestras.

Potencial de degradación de captan

HPLC

El método analítico que se decide utilizar para determinar los parámetros

cinéticos de degradación del pesticida en diferentes tiempos del periodo

de incubación, es la cromatografía líquida de alta eficacia, en fase

reversa. Para esto se utiliza la columna ZORBAX Eclipse Plus C18 de 5μm

(4.6mm x 150 mm) disponible en el laboratorio. Se usa como fase móvil

acetonitrilo-agua en una proporción de 60:40 (v/v), con un flujo constante

de 1.4 mL/min. Se trabaja con un detector UV 254 nm y un volumen de

inyección de 20µL. El pico esperado es de alrededor de 2.4 minutos. Lo

anterior se realiza utilizando el pesticida en grado analítico marca Sigma-

Aldrich. Se utilizó un control sin inocular para determinar cualquier

transformación del captan ocasionada por factores físicos. Después de

filtrar 1 mL de cada muestra para asegurar esterilidad, se agrega 1 mL

adicional de acetonitrilo para que el resultado sea comparable con la

curva de calibración realizada.

RESULTADOS

Aislamiento y crecimiento microbiano

El morfotipo microbiano encontrado fue observado en el microscopio

después de realizar una tinción de Gram. Como se puede evidenciar en la

8

Figura 4 es posible diferenciar al menos dos tipos de microorganismos

uno fúngico y uno bacteriano. Por un lado están unos cocobacilos gram

positivos pequeños y por el otro lo que parece ser un tipo de esporas de

hongo. Es posible que estas esporas sean del tipo zigosporas (estructuras

reproductivas de resistencia). Para poder identificar genéticamente dichos

microorganismos es necesario realizar la técnica de amplificación

genética de PCR u otro método bioquímico que permita clasificar los

microorganismos encontrados.

Figura 4. Microorganismos al microscopio (100X). A la izquierda esporas de hongo y a la derecha

cocobacilos gram positivos.

El crecimiento microbiano a una concentración de 1 g/L del pesticida

comercial, se estabilizó en un periodo de incubación aproximado de 5

horas. Posteriormente las mediciones espectrofotométricas dieron

negativas debido a la precipitación del medio y a la baja solubilidad del

ingrediente activo (<5 mg/L). Como es posible observar en la Figura 5, el

morfotipo microbiano no crece de manera significativa en el medio de

sales minerales sin pesticida comercial (control). Adicionalmente es

posible observar un incremento en el crecimiento a través de las

diferentes pruebas realizadas, probablemente debido a la aclimatación

del morfotipo. De esta manera el crecimiento aumentó alrededor de 2.9

veces en 22 días. Como es posible observar al comparar las Figuras 5 y

6.

9

Figura 5. Curva de crecimiento en una concentración de 1 g/L del pesticida comercial. Fecha de

elaboración: Octubre 11

Figura 6. Curva de crecimiento en una concentración de 1 g/L del pesticida comercial. Fecha de

elaboración: Noviembre 2

Por otra parte se evidenció que a una concentración superior del pesticida

comercial (3 g/L) el crecimiento incrementó también de manera muy

significativa (Figura 7). Al triplicar la concentración, la absorbancia

aumentó más de 6.5 veces.

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400

Ab

sorb

anci

a (6

50

nm

)

Tiempo (Minutos)

Curva de Crecimiento

Captan Control

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0 50 100 150 200 250 300 350

Ab

sorb

anci

a (6

50

nm

)

Tiempo ( Minutos)

Curva de Crecimiento

Captan

Control

10

Figura 7. Curvas de crecimiento a concentraciones de 1 y 3g/L del pesticida comercial. Fecha de

elaboración: Noviembre 16

Potencial de degradación de captan

Al realizar la curva de calibración del pesticida se encontró un pico a 2.1

minutos aproximadamente como se muestra en la siguiente figura.

Figura 8. Resultado HPLC para una concentración de 0.75 g/L de captan estándar en acetonitrilo

Adicionalmente fue posible observar las diferencias en los resultados al

comparar el pesticida comercial con el estándar. Las áreas del pesticida

estándar son en promedio, alrededor de 2 veces mayores que las del

pesticida comercial. Lo anterior es coherente con la concentración

reportada por el fabricante 50% WP de captan (ingrediente activo). Esto

quiere decir que para una misma cantidad de pesticida el estándar tiene el

doble de concentración del ingrediente activo.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Ab

sorb

anci

a (6

50

nm

)

Tiempo (minutos)

Captan 3 g/L Control Captan 1 g/L

11

Tabla 2. Resultados HPLC para 2 concentraciones de pesticida estándar y comercial

Concentración

(g/L) de

pesticida

Tipo de

pesticida

Área

resultante

del pico

HPLC

Concentración

calculada

según

calibración

(g/L)

0.2 Estándar 2823.2 0.2131

Comercial 1088.9 0.1074

0.5 Estándar 3666.5 0.2712

Comercial 2574.9 0.1969

Adicionalmente se muestra como ejemplo el pico obtenido para ambos

tipos de pesticidas a una concentración de 0.5 g/L (Figura 9). Los picos

que se pueden observar en el primer minuto se deben probablemente a

las sales presentes en el medio.

Figura 9. Resultado HPLC para una concentración de 0.5 g/L de captan comercial y estándar,

respectivamente, en acentonitrilo y medio de sales minerales

Al analizar las muestras por medio de HPLC no se encontró degradación

del ingrediente activo ni crecimiento microbiano utilizando el pesticida

estándar como única fuente de carbono. En la Figura 10 es posible

observar cómo a través del tiempo de muestreo no se registró crecimiento

microbiano ni degradación del principio activo en las muestras con una

concentración de 50 mg/L de pesticida estándar. Adicionalmente se

hicieron mediciones a un control sin inocular a las mismas condiciones

que las muestras (28°C y 120 rpm en el shaker) para determinar cualquier

tipo de transformación que pudiera sufrir el principio activo causada por

factores físicos.

12

Figura10. Utilización del fungicida captan ( ) durante el crecimiento ( ) del morfotipo aislado.

Control sin inocular ( ) en el medio de sales minerales con una concentración de 50 mg/L del

pesticida. Las barras de error representan el error calculado de la media de las 2 muestras

biológicas y 4 réplicas técnicas en el caso de la espectrofotometría.

La presencia de ingredientes inertes en el pesticida comercial, puede

llegar a explicar el crecimiento del morfotipo aislado en las muestras con

concentraciones de 1 y 3 g/L de pesticida comercial. Un ingrediente inerte

se adiciona a este tipo de pesticidas de manera intencional con el objetivo

de aumentar la efectividad de un producto pesticida. Por ejemplo, pueden

servir como solventes para aumentar la capacidad del ingrediente activo

de penetrar la superficie de la planta.

El pesticida MAESTRO 50% WP tiene solventes como parte de sus

ingredientes inertes debido a la baja solubilidad del ingrediente activo en

agua. Debido a que la ley no exige que el fabricante reporte cuáles son

los ingredientes inertes presentes en el producto, no es posible

determinar con claridad cual o cuales son dichos ingredientes inertes. La

lista de ingredientes inertes permitidos por la Agencia de Protección

Ambiental de los Estados Unidos (EPA por sus siglas en inglés), para uso

en productos pesticidas no alimentarios excede los 3600, (EPA, 2011) lo

cual hace muy difícil afirmar con precisión cuál/cuales de estos

ingredientes estén siendo degradados por el consorcio. Sin embargo el

estudio realizado hace evidente que el crecimiento de este morfotipo

microbiano no se debe a la presencia del principio activo ni a ninguno de

los ingredientes del medio de sales minerales. Adicionalmente, se realizó

una prueba de crecimiento en medio sólido con cristales de pesticida

estándar como única fuente de carbono en la que después de 8 días no

se observó crecimiento alguno. Por lo anterior se asocia el crecimiento en

pesticida comercial, a la degradación de alguno o varios ingredientes

inertes del producto y no del ingrediente activo.

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0 50 100 150 200 250 300 350

Co

nce

ntr

ació

n C

apta

n g

/L

Cre

cim

ien

to (A

bso

rban

cia

65

0 n

m)

Tiempo (minutos)

Crecimiento Concentración del fungicida en la muestra Control sin inocular

13

CONCLUSIONES Y TRABAJO FUTURO

Para la primera etapa del proceso se logró asilar un consorcio de

microorganismos capaces de crecer en medio de sales minerales con una

concentración de 1 g/L de captan comercial como única fuente de

carbono y energía. Para identificar dichos microorganismos de manera

más precisa es necesario utilizar un método de identificación genética

como la PCR. Según pruebas de densidad óptica a 650 nm, dicho

morfotipo microbiano es capaz de estabilizar su crecimiento en un periodo

aproximado de 5 horas y se aclimata a las concentraciones de pesticida

comercial agregado incrementando su crecimiento. Así mismo se evaluó

el potencial de degradación del principio activo (captan) del consorcio

aislado por medio de HPLC en un tiempo aproximado de 5 horas y a

condiciones de 28°C y 120 rpm.

De acuerdo a los valores obtenidos en la prueba de HPLC (Figura 10) no

se encontró evidencia de degradación del principio activo del pesticida.

Por lo anterior no fue posible hallar parámetros cinéticos al no presentarse

degradación. El estudio realizado hace evidente que el crecimiento de

este morfotipo microbiano no se debe a la presencia del principio activo ni

a ninguno de los ingredientes del medio de sales minerales. El

crecimiento del morfotipo aislado en pesticida comercial puede entonces

ser explicado por la presencia de diversos ingredientes inertes en el

pesticida comercial. Por lo anterior, se recomienda en estudios futuros

realizar pruebas de aclimatación por enriquecimiento del estándar en el

morfotipo microbiano aislado y estudiar el potencial de degradación con

respecto al principio activo directamente. Lo anterior no fue posible en

este estudio debido a la disponibilidad del estándar únicamente en los

últimos dos meses.

REFERENCIAS

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13-22.

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ANEXOS

Figura 11. Curva de calibración para el método de HPLC

R² = 0,9472

0,00

2000,00

4000,00

6000,00

8000,00

10000,00

12000,00

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Áre

a

Concentración Captan g/L

Series3

Lineal (Series3)