ESTRUCTURA EXTERNA DEL CROMOSOMA EUCARIOTICO

Dr. Misael Guevara P.

ESTRUCTURA EXTERNA

Forma, tamaño y número cromosómico.

Forma.- Observada en profase y metafase, se aprecia constituido por dos cromatidios (enrollamiento plectonémico ).

•Metacéntrico

•Submetacéntrico

•Subtelocéntrico o acrocéntrico

•Telocéntrico,confirmaron su existencia Gimenez-Martín et al. (1965), Comings y Okada.

TAMAÑO

Durante la metafase mitótica, clasificándose en largos y cortos (Swanson, 1960; White, 1973).

Cromosomas largos (10μ y 20 μ ): Monocotiledóneas.

Trillium 30 μ, Lillium, Allium, Tradeschantia, Ortópteros y Anfibios.

Cromosomas cortos 3-5 μ: Dicotiledóneas, la mayoría de los animales, el hombre.

Microcromosomas, presentes en algunas aves y reptiles.

Vicia faba

Homo sapiens sapiens

NUMERO

La mayoría de las especies se caracterizan por tener células diplontes (2n) y diplohaplontes (n).

En los animales el número es variado, hay organismos como Parascaris univalens, n=1y Parascaris equorum n= 2, que tienen esté número en su línea germinal, mientras que en la somática presentan diferente número 2n= 60.

En la hormiga australiana Myrmecia pilosula, presenta un solo cromosoma en los machos (haploide) y en las hembras dos (diploide).

En la mayoría de Lepidópteros como Lysandra atlántica, el número haploide n= 217-233.

EL CARIOTIPO

Complemento cromosómico (forma, número, tamaño).

Ordenamiento de los pares de homólogos en relación a su tamaño y forma.

La representación gráfica simplificada del cariotipo constituye el idiograma

Idiograma con bandas G

HERRAMIENTAS• Valores de longitud relativa.- Relación entre la longitud del cromosoma y la longitud del complemento haploide.

•Índice centromérico.- Longitud del brazo corto y la longitud total del mismo.

•Telocéntrico.- ic = 0.

•Metacéntrico.- ic = 0.5

•Indice de brazo.- Relación entre las longitudes de los brazos corto y largo del cromosoma.

•Telocéntrico = 0

•Metacéntrico = 1

BANDEO CROMOSOMICOHasta 1968 las técnicas citológicas permitían detectar sobre los cromosomas metafásicos, las constricciones primarias (centrómero) y, en ocasiones, la secundaria.

El primer paso en la diferenciación de los cromosomas por bandeo transversal de los cromatidios se debió a la técnica de fluorescencia, utilizando la mostaza de quinacrina y derivados.

Cariotipo de un hombre normal bandas “G”

QFG: Bandas Q por fluorecencia, usando quinacrina.

GTC: Bandas G, por tratamiento enzimático con tripsinma utilizando Giemsa.

RFA: Bandas R por fluorecencia usando naranja de acridina.

RHG: Bandas R, mediante desnaturalización térmica utilizando Giemsa.

THG: Bandas T por desnaturalización térmica empleando Giemsa.

CBG:Bandas C por hidróxido de bario, utilizando Giemsa.

TECNICAS DE BANDEO

Bandas Q,G,C,R,T y FeulgenTécnica de Fish de Aegilops speltoides

Translocaciones con bandas “C”

SIGNIFICADO DE LAS BANDAS •Bandas C.- Heterocromatina constitutiva (sin genes).

•Bandas G+ y Q+.- Ricas en A = T (20% de los genes humanos), sin genes constitucionales (house keeping genes).

•Bandas R.- genes constitucionales (house keeping genes).

•Las islas CpG, asociadas con el 50% de genes humanos, se pueden usar como marcadores cromosómicas usando las zonas de reconocimiento de las endonucleasas de restricción sensibles a metilación y son utilizadas en las técnicas de FISH (pintado de cromosomas).

Los isocoros de BERNARDI (segmentos largos de ADN homogéneos que por su composición pueden subdividirse en un número pequeño de familias caracterizadas por su contenido GG).

En los vertebrados los isocoros de sangre caliente se presentan entre 30% a 60%, se identificaron dos familias (L1y L2) de bajo contenido en GC, representan un 62% del genomio y tres ricas en GC (H1, H2 y H)( 22%, 9%, 3) respectivamente del genoma.

En relación con las bandas cromosómicas, se ha demostrado que los isocoros pobres en GC están localizados en las bandas G, mientras que los ricos en GC están localizados en las bandas R y en las bandas T.

AUTOMATIZACIÓN DEL ANÁLISIS GENÉTICO

El cariotipado automático implica:

• Captura de la imagen.- en pixeles (valor de intensidad) se almacenan en el CPU (datos para el análisis).

• Segmentación.- Aislamiento de los valores del cromosoma respecto a su entorno.

• Medición.- Se realiza aplicando formulas matemáticas al conjunto de pixeles.

• Clasificación.- Se hace aplicando un tratamiento estadístico.

• Modelo.- Interpretación de la imagen digitalizada.

CITOGENETICA DE FLUJOPermite separar y purificar cromosomas específicas en pequeñas cantidades (Gray, 1989).

El análisis en cromosomas humanos utiliza dos fluorocromos Hoechst 33258 con especifidad AT y cromicina con especificidad en GC (Gray et.al.1979).

Los cromosomas con la doble tinción pueden ser separados por su contenido de ADN y por la proporción de sus bases.

Esto puede servir para construir bibliotecas de ADN específicos de un cromosoma determinado, o para la técnica de FISH.

PINTADO CROMOSOMICO

ELECTROFORESIS

Cariotipado electroforético.- Utilizando electroforesis en gel en campo pulsado (PFGE) (separa cromosomas completos en organismos unicelulares) p.e Sacharomyces cerevisae.

Así como la electroforesis convencional en gel de agarosa, permite separar hasta un límite superior de 20 Kb, la PFGE, puede alcanzar límites de hasta 6 a 12 Mb (megabases), incluyendo por tanto, el tamaño de los cromosomas de organismos unicelulares como algunos hongos y protozoarios.

Secuencia de pasos para la Electroforesis  

HIBRIDACIÓN IN SITU

Técnicas de hibridación in situ (ISH) de ácidos nucleicos introducidas por Ritosa y Spiegelman (1965), Gall y Pardue (!969), sirven para localizar sobre los cromosomas la información correspondiente en ADN o ARN; utilizadas como sondas marcadoras radioactivamente.

Posteriormente el marcaje radioactivo de la sonda fue sustituido por un marcaje no radioactivo como biotina y la bigoxigenina, dando lugar a la hibridación in situ con fluorescencia (FISH).

ESTRUCTURA INTERNA DEL CROMOSOMA

EUCARIOTICO

DIFERENCIACIONES ESTRUCTURALES

Diferenciación lateral.- En citología clásica el cromonema se define como la fibra espiral izada que constituye el cromosoma telofásico o anafásico tardío de la mitosis y considera tres postulados:

1. El cromonema se transforma en el armazón o estructura reticular del nucleo.

2. Hay una identidad individual entre las fibras cromáticas de la profase y las de la telofase anterior.

3. Se produce una división longitudinal de la fibra durante la profase (Wilson, 1925).

Postulados que hoy han sido enriquecidos.

Con referencia a la diferenciación lateral se plantea lo siguiente:

• Teoria monofibrilar, supone que el cromatidio es la ultima unidad indivisible del cromosoma.

•Teoria polifibrilar.- Supone que el cromatidio está constituido por dos subcromatidios y estos a su vez por medios subcromatidios (Bajer, 1965; Gimenez- Martin et al), 1963.

•La citología molecular, asi como la microscopia electrónica demostraron la teoría monofibrilar (Callan, 1967; Coming and Okada, 1973; Du praw, 1970, entre otros, que es la que se acepta en forma universal.

DIFERENCIACIÓN LONGITUDINAL

Refereido a estructuras distribuidas a lo largo del cromosoma.

•Telómeros.- denominados así por Muller (1938), se refiere al extremo de los cromosomas, “sellándolos”.

•Las ideas iniciales de Muller y Herkowitz, acerca de lo indispensable de éstos para la estabilidad cromosómica fue corroborada por estudios realizados por Roberts (1975) en delecciones del cromosoma X de Drosophila melanogaster.

ESTRUCTURA MOLECULAR DE LOS TELÓMEROS

Los telómeros son complejos de ADN terminal y proteínas, necesarios para la estabilidad cromosómica.

Evitan la unión de los extremos cromosómicos, así como que sean atacados por exonucleasas.

Johnson et al (1984), definió al telómero como cada uno de los términos de una molécula lineal de ADN celular necesaria para la replicación completa de la molécula, seguida por la resolución y segregación apropiada de las moléculas replicantes.

La secuencia telomérica humana 5‘CCCTAA3', de la hélice rica en “C” puede producir una estructura cuadruplexa por el apareamiento de la citosina protonada C:C+ (Ahmed et al; 1994).

ORGANISMOS SECUENCIA REPETIDA (HÉLICE RICA EN G)

Tetrahymena 5‘TTGGGG3'

Paramecium 5‘TT(T/G)GGG3'

Oxytricha 5‘TTTTGGG/G3'

Plasmodium 5‘TT(TC)AGGG3'

Trypanosoma 5‘TTAGGG3'

Dytiostelum 5‘TG1-83'

Arabidopsis 5‘TTTAGGG3'

Homo 5‘TTAGGG3'

REPLICACION DEL ADN TELOMÉRICO

Durante este proceso la hélice rica en G es sintetizada por la telomerasa, ésta es una es una ribonucleoproteina cuyo componente de ARN contiene una secuencia complementaria a la de la secuencia repetida telomérica, pudiendo actuar como una terminal transferasa /Blackburn, 1992; Lee et al, 1993, Morin, 1989).

CROMÓMEROS

Se definen como partículas discretas de cromatina ordenadas linealmente a lo largo del cromosoma (Wilson, 1925).

En algunas especies se presenta un patrón cromomérico paquiténico característico.

Adquieren nombres específicos `por la ubicación-cromómeros centroméricos, en los cromosomas politénicos se denominan bandas y cromiolos en los plumulados.

CENTRÓMERO La constricción primaria o centrómero, es la región que se asocia a las fibras del huso en la mitosis y meiosis.

En esta zona el cinetocoro es la zona específica del centrómero que se asocia con los micotúbulos, aparece en el microscopio como una constricción acromática (heteropicnosis negativa).

TIPOS DE CENTRÓMEROS

•Centrómero localizado.- Cinetocoro en una sola posición.

•Centrómero difuso.-Cuando las fibras del huso se puede asociar a toda extensión cromosómica (en plantas del género Luzula, y algunas algas y hongos.

•Cromosomas holocinéticos.- múltiples centrómeros.

•Cromosomas policéntricos.- múltiples centrómeros, uno al lado del otro Ascaris megalocephala.

Lagowski y col (1973) en Oncopeltus fasciatus, encontraron secuencias de ADN repetitivo de secuencia corta y distribuidas a lo largo de los cromosomas con centrómeros difusos.

Los cromosomas pueden ser:

•Monocéntricos

•Dicéntricos.- Consecuencia de una translocación recíproca.

•Como consecuencia de la rotura cromosómica, misdivisión:

•Telocéntricos.

•Isocromosomas.

•Univalentes en anillo.

•Neocentrómero.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES.

Conocidos y aislados los fragmentos de ADN que constituyen los centrómeros y los telómeros, se han podido construir los cromosomas artificiales., Murray y Szostak (1983, 1985b), usando un plasmidio, un marcador de ADN centromérico y Saccharomyces.

La técnica ha permitido construir bibliotecas de ADN de gran tamaño en diversos organismos.

ORGANIZADOR NUCLEOLAR

Algunos cromosomas, presentan además constricción secundaria conocida como región organizadora nucleolar (NOR), Mc Clinctock 1934.

Contribuye activamente a la formación de nucleolo, y es heteropicnótica negativa. De ubicación subterminal en el brazo correspondiente, lo que origina un fragmento conocido como SAT.

En el hombre los cromosomas 13,14,25,21 y 22 son organizadores nucleolares.

Los genes codifican ADN ribosomal (ADNr), este varia de un organismo para otro.

En eucariontes forman nichos “Clusters” (Ritossa) y Spiegelman, 1965).

Entre las copias sucesivas se presentan zonas espaciadoras que no se replican y que constituyen elementos reguladores.

Metafase mitótica de un varón con bandas “G”

GENES DE HISTONAS DE LA MOSCA DE LA FRUTA

COMPETENCIA NUCLEOLAREl nucleolo, fue analizado con métodos de tinción argéntica diferencial en animales(Goodspasture and Bloom, 1975; y en plantas (Hyzume et al., 1980).

Se define por competencia nucleolar al hecho que no todos los nucleolos son funcionalmente activos, la expresión citológica dela competencia es la anfiplastia que fue visualizada cistológicamente en híbridos interespecíficos.

Nucleolos en Allium cepa

Coloración argéntica

ANFIPLASTIA

El procedimiento consiste en:

Conocer cuantos NORs activos están presentes en las células e identificar los cromosomas SAT (Coloración argéntica y bandeo C).

El análisis se realiza en los alopoliploides o en los híbridos inter específicos.

La técnica resulta útil para analizar la potencialidad nucleolar.

(Lacadena et al, 1988; Giraldez et al, 1979).

Especie Genomio Cromosoma SAT

Triticum monococcum A 1A, 5A

Aegilops speltoides B 1B, 6B

Aegilops squarrosa D 5D, (7D)

Secale cereale R 1R

Hordeum vulgare HV 5HV , 6HV

Agropyron elongatum E 5E, 6E

Aegilops umbellulata U IU, 5U

Cromosomas SAT en Triticum portadores de NOR

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