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Espectroscopía de Fluorescencia
Ana Denicola
S0
S1
S2
hυA
kNR IC
hυF
fluorescencia
T1cruce intersistemas ISC
kNR ISC hυP
fosforescencia
DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980)
conversión interna IC
relajación vibracional
relajación vibracional
LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado
Se alcanza el estado excitado por absorción de luz en:
FLUORESCENCIA estado singulete excitado, transición permitida, ns
FOSFORESCENCIA estado triplete excitado, transición prohibida, ms
QUIMIOLUMINISCENCIA se alcanza el estado excitado por una reacción química
10-15 s
10-8 s
10-3 s
LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS:
• ABSORCION: ~ 10-15 seg
• CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg
• FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg
• FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transición “prohibida” porsimetría)
• RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg
Los pasos propiamente dichos de absorción y de emisión son extremadamenterápidos, tanto que los núcleos no llegan a moverse (principio de Franck-Condon). La absorción sólo da información del entorno inmediato a la molécula queabsorbe.
La relajación vibracional por lo general es mucho más rápida que la fluorescencia, entonces la molécula se relaja completamente y (en general) sólo vemos la emisión desde el estado S1.
La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia poseeinformación de un entorno más amplio que el de absorción.
FLUORESCENCIA
• 1er. paso: absorción o excitaciónenergía suficiente para llegar a nivel
electrónico superior S1 o S2
λexc
• 2do. paso: emisión de luzenergía radiativa emitida menor que la absorbida, λem > λexcCorrimiento de Stokes
ESTADO EXCITADO
RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA:
Q = # fotones emitidos / # fotones absorbidos
0 < Q < 1
en términos de las constantes cinéticas de cada proceso:
Q = kF / (kF + ∑ kNR)
donde kNR son todos los procesos de decaimiento no radiativos
TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluoróforo pasa en el estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquiervía)
τ = 1 / (kF + ∑ kNR)
TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si sólovolviera por fluorescencia
τn = 1 / kF
se puede calcular a partir de τ y Q:
τn = τ / Q
Rendimiento (Q) = fotones emitidos <1fotones absorbidos
= constante de velocidad de emisión
= constante de velocidad de decaimiento no radiativo
= tiempo de vida intrínseca o natural,
sin ningún proceso no radiativo
= tiempo de vida medida
Parámetros a medir en fluorescencia
• Intensidad de fluorescencia (ISS)
• Espectros de excitación y emisión (IF vs λ)
• λmax(ex), λmax(em)
• Rendimiento cuántico de fluorescencia (Q)
• Vida media del fluoróforo (τ)
• Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional)
• Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)
Intensidad de fluorescencia (estado estacionario) ISS
Intensidad resuelta en el tiempo (τ)
Pulso de luzIluminación continua
ESPECTROFLUORÍMETRO
ESPECTROFLUORÍMETRO
FUENTE DE LUZ Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (lase, LED)
MONOCROMADORES excitación y emisión vs FILTROSancho de bandapolarizadores
DETECTOR tubo fotomultiplicador (PMT)
MUESTRA geometría de iluminación de la muestra
La medida de IF es relativa a la geometría del equipo
Usar soluciones diluidas A < 0..05
Control con solo solvente
Usar adecuada λexc, filtro, conc. fluoróforo
Filtrar la solución
Intensidad de Fluorescencia y concentración del fluoróforo
Efecto de filtro interno
Cuantificación del fluoróforomidiendo Intensidad de fluorescencia IF
IF (λex, λem) = IA Φ Z Z = factor instrumental
Φ= rendimiento cuántico de F
IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l)
ε = coef. Absortividad a λexc
c = concentración del fluoróforo
IF (λex, λem) = I0 Φ Z 2.3 ε c l
IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas
Si Aλ << 1 ⇒ IA = I0 (2.3 ε c l)
Fluoróforos en bioquímica
• Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural, propia del sistema
• Fluorescencia extrínsecaagrego a la muestra un fluoróforo externo
(sonda fluorescente)
Fluorescencia en:
• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano. Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y derivados.
• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI) o fosfolípidos marcados
• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)
Fluorescencia en:
• NAD(P)H
• FAD, FMN
• Piridoxal fosfato (PLP)
• Clorofilas
• Indicadores fluorescentes (pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)
0.4 ns en solución1-5 ns unido a DH
4.7 ns en solución(2.3 ns FMN)0.3-1 ns unido a prot.
Phe Abundancia: 3.5%
λex = 260 nm, λem= 282 nm (Q.ε ~ 5)
Insensible al entorno
Tyr Abundancia: 3.5%
λex = 275 nm, λem= 303 nm (Q.ε ~ 220)
Insensible al entorno, quencheable
Ionizable, tirosinato emite (<Q)
Trp Abundancia: 1.1%
λex = 295 nm, λem= 350 nm (Q.ε ~ 770)
Sensible al entorno, quencheable
Varias τ
Sondas fluorescentes para proteínas
DNS-Cl sensible a polaridad del entorno, fluorescencia polarizada
Fluoresceína (y Rodaminas) absorbey emite en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1
Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH
Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos
Bases modificadas fluorescentes
GFP = Green Fluorrescent Protein
Formación espontánea del fluoróforo al plegarse
X X*hν
hν’
Relajación por solvente
Transferencia de energía
Quenching
Transferencia de carga
Disociación de H+
Formación de complejos
Formación de oligómerosτ (ns)
Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia
H = hexano
CH = ciclohexano
T = tolueno
EA = acetato de etilo
Bu = butanol
Efectos del solvente y del entorno
k >> 1/τ k ∼ 1/τ
Corrimientos de Stokes dinámicos
Ecuación de Lippert-Mataga
Materiales dieléctricos, conductores y medios biológicos
El fluoroforo es consideredo un dipolo en un mediocontinuo de constante dieléctrica (permitividad) uniforme
Solvatación de ionesSaturación dieléctrica en las cercanías del ión
constafhc GE +−
Δ=Δ 2
3 )(2 μμν
Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej. unión a proteína)
HSA = albúmina humana
ANS = Anilinonaftalensulfonato (fluoróforo muy sensible a la polaridad entorno)
Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej. unión a proteína)
Determinar constantes de unión de un ligando sieste es fluorescente y su fluorescencia cambia con la unión o si la fluorescencia intrínsecacambia por efecto de la unión de un ligando
Emisión del triptofano es sensible al entorno (ej. desnaturalización de proteína)
N = nativa
U = desplegada “unfolded”
Usos de fluorescencia en bioquímica
• Localización subcelular• Cambios en la concentración • Interacciones moleculares• Cambios conformacionales• Distancias intra/intermoleculares• Difusión rotacional • Caracterización estructural• Actividad enzimática
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