Erőgeneráláshoz vezető szerkezetváltozásokteo.elte.hu/minosites/tezis2010/takacs_b.pdf · Erőgeneráláshoz vezető szerkezetváltozások a miozinban Doktori értekezés tézisei

Erőgeneráláshoz vezető szerkezetváltozások

a miozinban

Doktori (PhD) értekezés tézisei

Takács Balázs

Témavezető: Dr. Kovács Mihály,

habilitált tudományos főmunkatárs

ELTE Biokémiai Tanszék,

Biológia Doktori Iskola,

Szerkezeti Biokémia Doktori Program

Tanszékvezető: Dr. Nyitray László,

az MTA doktora, habilitált egyetemi docens

Iskolavezető: Prof. Erdei Anna,

az MTA rendes tagja, tanszékvezető egyetemi tanár

Programvezető: Prof. Gráf László,

az MTA rendes tagja, egyetemi tanár

Budapest, 2010.

Erőgeneráláshoz vezető szerkezetváltozások a miozinban Doktori értekezés tézisei

2


3

Bevezetés

A miozinok minden eukarióta sejtben megtalálható motorfehérjék, melyek az

aktinfilamentum, mint sín mentén „lépkedve” teszik lehetővé az egyes molekulák,

sejtalkotók, sejtek, testrészek, sőt, végső soron az egész szervezet mozgását. A

miozinoknak számos, különböző szerepet betöltő formáját ismerjük, melyek az 1.

ábrán bemutatott kemomechanikai modell alapján működnek. A miozinok motor

aktivitásának alapja a ciklus erőgenerálási lépése, melynek során az ATP-hidrolízis

termékei felszabadulnak, a miozin erős aktinkötést létesít, a miozin erőkarja

lecsapódik és a miozin disztális része elmozdul az aktinfilamentumon.

1. ábra: Az aktomiozin

kemomechanikai ciklus modellje, a

legfontosabb szerkezetek

elnevezésével.

A régóta tartó kutatások dacára az erőgenerálás pontos részletei máig

megoldatlanok. Nem ismeretes az erőgenerálás kezdőállapota, csupán feltételezik

az ilyen állapotú miozin tulajdonságait. Továbbá nincs megoldva az atomi

szerkezete az erőgenerálás végállapotát jelentő nukleotidmentes rigor aktomiozin

komplexnek, csak aktint nem tartalmazó rigor-szerű konformációkat írtak le. A

különböző miozin izoformák rigor-szerű kristályszerkezetében az ún. aktinkötő

árok eltérő konformációt vesz fel: más-más mértékű zártságot mutat. Mivel a rigor

komplex létrejöttéhez az ároknak be kell záródnia, az egyes izoformák aktinkötő

régiójának ez a különböző konformációja eltérő kinetikai és energetikai aktinkötési

útvonalakat sugall (2. ábra).

E munkában az erőgenerálási lépésről a fenti témákban szerzett új ismereteinket

írom le.


4

2. ábra: Az aktinkötés útvonalainak szerkezeti és

kinetikai sémája.

Aktin távollétében a miozinfej (szürke) zárt vagy nyitott

árkú konformációt vehet fel; a két állapot közti átmenetet

a Kzárt egyensúlyi állandó szabja meg (felső sor). A

nyitott árokkal bíró miozinok aktinkötése a kék

nyilakkkal (Kgyenge és KA, zárt), a zárt árokkal

kristályosított miozinok a fekete nyíllal (Kerős, jobb oldal)

jelzett aktinkötési útvonalat követhetik.

Célkitűzések és kérdések

Munkánk célja a miozinban az erős aktinkötés és az erőgenerálás során végbemenő

szerkezetváltozások azonosítása volt. Miozin modellként az izmokat is felépítő

miozin 2 különböző izoformáinak, illetve a vezikula-transzporter miozin 5-nek a

katalitikus fragmentumait (szubfragmentum-1 – S1 – illetve motordomén)

alkalmaztuk.

1. probléma: Nem ismeretes az erőgenerálás kezdőállapota.

Kiindulás: A blebbistatin nevű miozin 2 inhibitor mechanizmusát vizsgáltuk. Az

inhibitorról témavezetőm és munkatársai korábban kimutatták, hogy a normál

ATPáz ciklus során az aktinkötő árokba kötve a pre-powerstroke állapotban

blokkolja a miozint (M.ADP.Pi komplex).

Kérdések:

Hogyan befolyásolja a blebbistatin inhibitor a miozin 2 motordomén

konformáció-változásait?

Megváltoztatja-e a blebbistatin a nukleotidkötő zseb és az aktinkötő árok, illetve

a nukleotidkötő zseb és az erőkar kapcsoltságát?

A termékfelszabadulás során az erős aktinkötés létrejötte és az erőkar lecsapása

milyen konformációs változásokon keresztül valósul meg?

A már azonosított miozin.ADP.Pi.blebbistatin komplexen kívül előállítható-e az

erőgenerálásnak más stabil konformációs intermediere?

2. probléma: A rigor-szerű szerkezetekben a különböző miozin izoformákban az

aktinkötő régió más-más zártságú konformációt vesz fel. Ez az egyes izoformákra

eltérő kinetikai és energetikai aktinkötési útvonalakat sugall.


5

Kiindulás: Eltérő rigor-szerű szerkezettel bíró miozin izoformák aktinkötését,

illetve aktomiozin komplexének disszociációját karakterizáltuk és hasonlítottuk

össze egymással.

Kérdések:

Az erős aktinkötés létrejöttének energetikai profilja és kinetikája hogyan függ

össze a miozinnak az aktin távollétében felvett szerkezetével a különböző miozin

izoformákban?

Az erős aktinkötés kialakulásakor a miozinban bekövetkező konformáció-

változások (pl. az árokzáródás) hogyan befolyásolják az aktinkötés energetikáját?

Az energetikai változások mennyire járulnak hozzá az erőgeneráló lépés

„hajtásához”?

Az energetikai változások mennyire univerzálisak a különböző miozin izoformák

erőgenerálása során?

Kísérleti megközelítés

Alkalmazott módszerek

Fehérjetermelés eukarióta sejtkultúrában: Dictyostelium discoideum (vad típusú

és egy-triptofános miozin 2 motordomének – DdMD) és Sf9-bakulovírus (miozin

5 S1 – m5S1) rendszerben.

Fehérjetisztítás: His- (DdMD) és FLAG-címkés (m5S1) affinitás kromatográfia.

Fehérjepreparálás nyúl vázizomból: miozin 2 S1 és aktin.

Fehérje kémiai módosítása: aktin jelölése Cys374

-en N-(1-pirén)jódacetamiddal.

ATPáz aktivitás mérése NADH-csatolt reakcióval fotometriásan.

Steady-state és egyensúlyi fluorimetria.

Tranziens kinetikai mérések: fluoreszcens stopped-flow kísérletek.

Aktomiozin koszedimentáció, majd a frakciók SDS-gélelektroforézise és a gélek

denzitometrálása.

ITC – izotermális titrációs kalorimetria.

Kollaborátoraink segítségével elektron-mikroszkópia és atomi szerkezeteken

alapuló számítások.


6

A kérdéseket megválaszoló kísérletek

A blebbistatin hatására a miozinban bekövetkező konformáció-változásokat vad

típusú és egy-triptofános mutáns DdMD konstrukciók segítségével vizsgáltuk. A

mutánsok triptofán fluoreszcencia-változásait korábban megfeleltették a miozinban

bekövetkező konformáció-változásoknak: az erőkar alapjánál triptofánt tartalmazó

W501+ mutáns az erőkar állapotát, míg az aktívhelyen lévő switch-1 hurokban

triptofánt tartalmazó W239+ mutáns – allosztérikus kapcsoltság révén – az

aktinkötő árok állapotát jelzi. E triptofán szenzorok fluoreszcencia-változásait és

azok kinetikáját ADP, ATP illetve ADP.AlF4- (ADP.Pi-analóg), valamint

blebbistatin jelenlétében és távollétében mértük. A vad típusú DdMD miozint,

valamint a pirén-jelölt aktint az aktomiozin kötés vizsgálatára alkalmaztuk. A

miozin konstrukciók szerkezetét kollaborátoraink segítségével elektron-

mikroszkópos felvételekkel is vizsgáltuk.

A rigor aktomiozin komplex kialakulásához vezető konformációs és energetikai

változásokat négy különböző, ismert rigor-szerű szerkezettel bíró miozin izoforma

összehasonlító vizsgálatával tanulmányoztuk. Az aktomiozin kötés és -disszociáció

folyamatát pirén-aktinnal több módon is vizsgáltuk, melyek hőmérséklet-

függéséből számítottuk azok energetikai paramétereit. Az aktomiozin kötés során

bekövetkező energiaváltozást közvetlenül kalorimetriás módszerrel mértük. A

miozinban bekövetkező szerkezetváltozások energetikáját kollaborátorunk

segítségével atomi szintű energetikai számításokkal is vizsgáltuk.

Eredmények (tézisek)

1. tézis: A blebbistatin gátolja valamennyi vizsgált DdMD konstrukció ATPáz

aktivitását.

2. tézis: A blebbistatin az erőkar felhúzását idézi elő a miozin.ADP komplexben.

3. tézis: A blebbistatin nem változtatja meg a miozin aktinkötő sajátságait.

4. tézis: A miozin motordomének többsége aktomiozin.ADP.blebbistatin négyes

komplexben is erős aktinkötő, felhúzott erőkarú állapotban van jelen.

5. tézis: A blebbistatin kötése nem változtatja meg az apo miozin szerkezetét.


7

6. tézis: A vizsgált izoformák pirén-aktin kötéskor hasonló fluoreszcencia-

csökkenést mutattak.

7. tézis: Az aktinkötés energetikai profilja összefügg az aktinkötő árok – rigor-

szerű kristályszerkezetekben megfigyelt – záródásának mértékével. A zárt árokkal

kristályosított miozinok aktinkötése exoterm folyamat.

8. tézis: Az egyes miozinok aktinkötésének sebességi állandója és a kötés

affinitása nem korrelál az aktinkötés energetikájával, vagyis az árok

konformációjával.

9. tézis: Az aktinkötő árok bezáródása közben a miozin központi β-lemezének, a

transducer-nek a számított torziós szöge hasonló az összes izoformában.

10. tézis: Az ADP a miozinok aktinkötését endoterm irányba tolja el a

nukleotidmentes állapothoz képest, az entalpia-különbség mértéke hasonló

nagyságrendű mindegyik izoforma esetében.

Következtetések

1. következtetés: Mivel a blebbistatin inhibitor a DdMD konstrukcióink ATPáz

aktivitását is hatékonyan gátolja, a blebbistatin mechanizmusának

tanulmányozására a DdMD miozinok megfelelő modellek.

2. következtetés: Az erőkar szenzora, a W501+ mutáns triptofán fluoreszcencia-

változásai szerint a blebbistatin hatására a miozin erőkarja nemcsak ATP mellett,

hanem ADP jelenlétében (ATP nélkül, azaz betöltetlen -foszfát kötőhely esetén)

is felhúzott állapotba kerül; a miozin pre-powerstroke konformációt vesz fel. Az

erőkar felhúzott voltát a miozin.ADP.blebbistatin komplexben kollaborátoraink

elektron-mikroszkópos felvételekkel is igazolták. Ez az első, a -foszfát kötőhelyet

betöltő ligandum nélküli felhúzott erőkarú miozin szerkezet. Ezzel kapcsolatban

kimutattuk azt is, hogy a blebbistatin gátolja a -foszfát kötőhely betöltését, vagyis

a miozin.ADP.blebbistatin komplex hozzáférhetetlen -foszfát kötőhellyel bír.

3. következtetés: Az aktinkötő árok szenzora, a W239+ mutáns triptofán

fluoreszcencia-változásai szerint a miozin megőrzi az aktinkötés egyensúlyát,

vagyis magas aktin affinitását ADP mellett, illetve alacsony aktin affinitását ATP


8

mellett blebbistatin jelenlétében is. A fluoreszcens eredményeket aktomiozin

koszedimentációs kísérletekkel is megerősítettük.

4. következtetés: Az akto-W501+ triptofán fluoreszcencia-változásai az

aktinmentes állapothoz hasonló tendenciát mutattak. Tehát blebbistatin mellett az

aktin jelenléte nem befolyásolja az erőkar állapotainak megoszlását: az akto-

W501+ ADP-kötése is előidézi az erőkar felhúzását. A miozin.ADP.blebbistatin

komplex erős aktinkötését mindegyik DdMD konstrukció esetén kimutattuk: pirén-

aktin és triptofán fluoreszcencia, valamint fényszórás detektálásával steady-state és

gyorskinetikai mérésekkel, továbbá koszedimentációval. Az általunk blebbistatin

és ADP jelenlétében „elkapott”, felhúzott erőkarú, magas aktin affinitású miozin

intermedier tehát az erőgenerálás lehetséges kezdőállapotával megegyező

tulajdonságokkal bír.

5. következtetés: A blebbistatin-molekula aktív és inaktív (a W501+ miozinhoz

nem is kötődő) enantiomerje egyforma triptofán fluoreszcencia-csökkenést idéz elő

a két DdMD mutánsnál. Ez a csökkenés tehát nem a miozin saját, intrinsic

triptofán fluoreszcencia-változásának, hanem a blebbistatin fényabszorpciójából

származó belső szűrő hatásának (inner filter effect) a következménye; így a

blebbistatin kötése önmagában (aktin és nukleotid távollétében) nem idéz elő

szerkezetváltozást az apo motordoménben.

6. következtetés: A miozinok különböző rigor-szerű szerkezetében az eltérő

mértékben záródó aktinkötő árok ellenére az aktinkötő kölcsönhatási felület

hasonló.

7. következtetés: Az aktinkötés és aktomiozin disszociáció kinetikájának

hőmérséklet-függéséből származó eredményeket fluoreszcencia-méréses

egyensúlyi titrálásokkal, valamint az aktinkötés kalorimetriás vizsgálatával is

megerősítettük. A nyitott árokkal bíró nyúl vázizom miozin 2 aktinkötése

endotermnek bizonyult, a korábbi adatoknak megfelelően. Ezzel ellentétben

exoterm aktinkötést figyeltünk meg a zárt árkú puhatestű izom miozin 2, DdMD és

miozin 5 esetében.

8. következtetés: A korábbi sejtésekkel ellentétben azt tapasztaltuk, hogy az árok

záródása az aktin távollétében (Kzárt, a 2. ábrán) nem szabja meg direkt módon

sem az aktinkötés affinitását, sem a másodrendű aktinkötési sebességi állandó

nagyságrendjét. Bár a Kzárt egyensúlyi állandó nem határozható meg közvetlenül, a


9

szerkezeti adatok és energetikai számításaink azt jelzik, hogy az egyensúly az

egyes izoformáknál vagy a zárt (exoterm aktinkötés), vagy a nyitott állapot

(endoterm aktinkötés) felé van eltolva. Mivel az aktinkötő árok záródása és az

aktin affinitás sem korrelál, a különböző miozinok nemcsak a Kzárt egyensúlyi

állandóban, hanem a gyenge vagy erős aktinkötő állapotok affinitásában (Kgyenge

ill. Kerős, a 2. ábrán) is változatosságot mutatnak.

9. következtetés: A transducer, torziós szögének változásai által valószínűleg

szerepet játszik a motordomén nukleotid- és aktinkötő helye közti allosztérikus

kommunikációjában. Számításaink azt erősítik meg, hogy e torzió szükséges az

erőgeneráláshoz, ugyanakkor nem magyarázhatja az egyes izoformák esetén

tapasztalt energetikai különbségeket. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a

transducer az aktinkötött állapotban van mechanikailag feszítettebb

konformációban: a miozinfejben belső feszültség ébred az árok bezárásakor az

aktinfilamentummal való pontos térbeli komplementaritás kialakítása érdekében.

10. következtetés: Az aktomiozin kölcsönhatás energetikáját ADP jelenlétében is

megvizsgáltuk, a nukleotid a nyitott aktinkötő árokkal bíró (poszt-rigor) miozin

konformációt modellezte. Az árok bezáródásának irányában (poszt-rigor – rigor-

szerű/rigor irányban) definiált entalpia-különbség arra utal, hogy az árok záródása

entalpikusan kedvezőtlen folyamat. Energetikai számításaink szerint ugyanakkor

ezt az entalpikus „költséget” felülírja az árok bezáródása közbeni

kölcsönhatásokból származó nagy kedvező (negatív) elektrosztatikus hozzájárulás.

Összegzés

A miozin ADP és a blebbistatin nevű inhibitor hármas komplexében felhúzott

erőkarú, erős aktinkötő állapotban van jelen. Felhúzott erőkarú miozin eddig csak

ATP, vagy más, a -foszfát kötőhelyet is betöltő ligandum esetében volt ismert. A

kimutatott intermedier azért fontos a miozin működésében, mert az erőgenerálási

lépés feltételezett kezdőállapotával megegyező tulajdonságokkal bír. Eszerint az

erős aktinkötés létrejötte váltja ki az erőgenerálási lépést. Az erős aktinkötés

létrejötte során a miozin aktinkötő árkának be kell záródnia. Gerinces vázizom

miozinban ez endoterm folyamat. Az aktin távollétében is zárt árokkal bíró


10

puhatestű és DdMD miozin 2, valamint a miozin 5 aktinkötése ellenben exoterm.

Az árok állapota így meghatározza az aktinkötés energetikáját, ezáltal az

erőgenerálási lépést.

Publikációk

Az értekezés alapjául szolgáló publikációk:

Balázs Takács, Neil Billington, Máté Gyimesi, Bálint Kintses, András Málnási-

Csizmadia, Peter J. Knight, and Mihály Kovács (2010): Myosin complexed with ADP

and blebbistatin reversibly adopts a conformation resembling the start point of the

working stroke. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 6799-6804.

Balázs Takács, Elizabeth O’Neall-Hennessey, Csaba Hetényi, József Kardos,

Andrew G. Szent-Györgyi, and Mihály Kovács (2010): Myosin cleft closure

determines the energetics of the actomyosin interaction. FASEB J, [Epub ahead of

print].

Magyar nyelvű cikkek:

Nagy Nikolett, Takács Balázs, Kovács Mihály (2010): Motorenzimek működési

alapelvei és egyedi finomhangolása. Biokémia, XXXIV/2, 12-21.

Takács Balázs, Kovács Mihály (2009): Motorok a sejtben – Mi hajt bennünket?

Élet és Tudomány, LXIV/6, 174-175.

Konferencia-szereplések (aláhúzva az előadó szerző):


Andrew G. Szent-Györgyi, Mihály Kovács (2010): Myosin cleft closure determines

the energetics of the actomyosin interaction. 1st Prague’s Protein Spring Workshop,

Prága.



the energetics of the actomyosin interaction. Conference on Muscle and Many other

Motors, Alpbach, Ausztria.


11



the energetics of the actomyosin interaction. European Muscle Conference, Lille.

Nikolett Nagy, Kata Sarlós, Balázs Takács, Judit Tóth, Yuting Yang, David S.

Pearson, Csaba Hetényi, László Nyitray, András Málnási-Csizmadia, Michael A.

Geeves, Clive R. Bagshaw, James R. Sellers, Jerry H. Brown, Andrew G. Szent-

Györgyi, Carolyn Cohen, Mihály Kovács (2008): Routes of allosteric communication

between functional parts of the myosin motor. Scientific Meeting of International

Research Scholars of the Howard Hughes Medical Institute, Lisszabon.

Balázs Takács, Máté Gyimesi, Bálint Kintses, András Málnási-Csizmadia, Mihály

Kovács (2008): Utility of a myosin inhibitor in deciphering the structural mechanism

of force generation. Chemistry towards Biology Conference, Dobogókő.


Kovács (2008): Blebbistatin alters nucleotide-induced structural changes in myosin.

European Muscle Conference, Oxford.


Kovács (2007): Effect of blebbistatin on nucleotide-induced conformational changes

of myosin. European Muscle Conference, Stockholm.

Az értekezésben nem szereplő, saját közlemények:

Nikolett T. Nagy, Takeshi Sakamoto, Balázs Takács, Máté Gyimesi, Eszter Hazai,

Zsolt Bikádi, James R. Sellers, and Mihály Kovács (2010): Functional adaptation of

the switch-2 nucleotide sensor enables rapid processive translocation by myosin-5.

FASEB J [Epub ahead of print].

Ákos Kertész, Balázs Takács, Györgyi Váradi, Gábor K. Tóth, and Gabriella

Sármay (2006): Design and functional activity of phosphopeptides with potential

immunomodulating capacity, based on the sequence of Grb2-associated binder 1.

Ann. N. Y. Acad. Sci., 1091, 437-444.


12

Köszönetnyilvánítás

Doktoranduszként elöltött négy évemért és az ezen idő alatt kapott segítségért

nekik tartozom köszönettel:

Témavezetőmnek: Kovács Mihálynak, vagyis Stocinak, a Motor Enzimológia Csoport

vezetőjének.

Labortársaimnak: a Gervai Judit, Gyimesi Máté, Harami Gábor, Jelinek Balázs,

Kocsis Zsuzsa, Molnár Eszter, Nagy Niki, Sarankó Hajni és Sarlós Kata alkotta

csapatnak.

A cikkeinkben szereplő kollaborátoroknak, névszerint: Neil Billington, Hetényi

Csaba, Kardos József, Kintses Bálint, Peter J. Knight, Málnási-Csizmadia András,

Elizabeth O’Neall-Hennessey és Andrew G. Szent-Györgyi.

A tanszék munkatársainak, elsősorban Hegyi György professzornak; Simon Zolinak,

a Photoshop szakértőjének; Szász Ilona és Kurucz-Váradi Kati asszisztenseknek.

A tanszék vezetőinek: Gráf László professzornak és Nyitray Lászlónak.

Barátaimnak, és családomnak, hogy támogattak és – a nehezebb időszakokban –

elviseltek.

Documents

Erőgeneráláshoz vezető szerkezetváltozásokteo.elte.hu/minosites/tezis2010/takacs_b.pdf · Erőgeneráláshoz vezető szerkezetváltozások a miozinban Doktori értekezés tézisei