UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

Irena Iršič

ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV

Diplomska naloga

Maribor, december 2008

Stran 2

UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

SI - 2000 MARIBOR, Smetanova 17

Diplomsko delo visokošolskega strokovnega programa

ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV

Študent: Irena Iršič Študijski program: Visokošolski strokovni, Kemijska tehnologija Smer: Kemijska tehnologija Mentor: izr. prof. dr. Črtomir Stropnik Somentor: izr. prof. dr. Peter Krajnc prim. Vera Urlep Šalinović, dr. med.

Stran 3

UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

SI - 2000 MARIBOR, Smetanova 17

Diplomsko delo visokošolskega strokovnega programa

ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV

Študent: Irena Iršič Študijski program: Visokošolski strokovni, Kemijska tehnologija Smer: Kemijska tehnologija Predvideni strokovni naslov: Dipl. inž. kem. tehnol. Mentor: izr. prof. dr. Črtomir Stropnik Somentor: izr. prof. dr. Peter Krajnc

prim. Vera Urlep Šalinović, dr. med.

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledala sem literaturo iz področja diplomskega dela po naslednjih elementih:

Vir: Medical abstract

Gesla: testiranje krvi, encimsko-imunska metoda, krvodajalec, HBsAg, anti-HCV, anti-HIV, anti-TP

Skupine gesel (unija itd.): EIA, ELISA, HBsAg, anti-HCV, anti-HIV, anti-TP

Časovno obdobje: 1975-2008

Število referenc: 34

Število prebranih izvlečkov: 31

Število prebranih člankov: 16

Število pregledanih knjig: 9

-------------------------- Maribor, december 2008 podpis študentke

Stran 4

ZAHVALA

Iskrena hvala mentorju prof. dr. Črtomirju

Stropniku in somentorju prof. dr. Petru Krajncu za

koristne nasvete in napotke.

Zahvaljujem se somentorici, prim. Veri Urlep

Šalinović, dr.med. za strokovno pomoč pri

oblikovanju diplomske naloge.

Posebna zahvala moji družini za pomoč in

vsestransko podporo.

Stran 5

POVZETEK

Naslov: ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI

PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV

UDK: 591.111.1:612.12(043.2) Ključne besede: testiranje krvi, encimsko-imunska metoda, krvodajalec,

hepatitis B surface antigen, protitelesa proti virusu hepatitisa C, protitelesa proti

virusu človeške imunske pomanjkljivosti, protitelesa proti Treponemi pallidum. Namen

Načelo, sprejeto v Evropi in tudi v svetu, da si mora vsak narod sam zagotoviti zadostne

količine krvi, krvnih komponent in produktov, obvezuje transfuzijsko dejavnost, da načrtuje

in izvaja nacionalni program samozadostnosti pri oskrbi s krvjo. Ker potrebe po krvi

naraščajo, je velikega pomena pridobivanje novih krvodajalcev. Kri in krvni pripravki

morajo biti varni za bolnike. Med mnogimi ukrepi zagotavljanja varne transfuzije je tudi

presejalno testiranje. Pravilnik o obveznem testiranju krvi in komponent krvi določa obseg

obveznega testiranja vsake odvzete enote krvi. Namen naloge je ugotoviti pojavnost

okužbe z virusom človeške imunske pomanjkljivosti (HIV), z virusom hepatitisa B in C ter

z bakterijo Treponema pallidum med novimi in rednimi krvodajalci.

Metode

V računalniškem programu Datec smo v Centru za transfuzijsko medicino Maribor pridobili

podatke o številu novih krvodajalcev v obdobju od leta 2003 do 2007. Predstavili smo

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) za določanje površinskega antigena

hepatitisa B (HBsAg), protiteles proti virusu hepatitisa C (anti-HCV), protiteles proti virusu

človeške imunske pomanjkljivosti (anti-HIV) in protiteles proti bakteriji Treponema

Stran 6

pallidum (anti-TP). Podatke o številu pozitivnih krvodajalcev na posamezne virusne

označevalce smo za obdobje petih let poiskali v računalniškem programu Datec.

Rezultati

Število novih krvodajalcev, ki jih testiramo v Centru za transfuzijsko medicino Maribor, iz

leta v leto upada. Največ novih krvodajalcev je bilo leta 2005 in sicer 5537, kar znaša 17%

od vseh sprejetih krvodajalcev v tem letu. Razen leta 2003 je bilo število pozitivnih

krvodajalcev na HBsAg med novimi krvodajalci večje kot med rednimi krvodajalci. Še

posebej izstopa leto 2006, ko smo med novimi krvodajalci odkrili kar 6 okuženih z virusom

hepatitisa B, med rednimi pa 1. V petletnem obdobju smo skupaj odkrili 8 krvodajalcev

okuženih z virusom hepatitisa C, od tega 7 med novimi krvodajalci in enega med rednimi.

Samo leta 2005 smo odkrili 2 krvodajalca okužena z virusom HIV, oba sta kri darovala že

večkrat. Skupno število okuženih krvodajalcev z bakterijo Treponema pallidum v letih od

2003- 2007 je bilo 9, od tega 5 med rednimi in 4 med novimi krvodajalci. Največ smo jih

odkrili leta 2007, kar 4. V tem petletnem obdobju smo skupno odkrili 19 krvodajalcev

pozitivnih na HBsAg, 8 na anti-HCV, 2 na anti-HIV in 9 na anti-TP.

Zaključki

Kljub rahlemu upadanju števila novih krvodajalcev, še zadostimo zahtevam

samozadostnosti v preskrbi s krvjo in krvnimi komponentami. V letih od 2003 - 2007 smo

odkrili, da je okuženost z virusom hepatitisa B in C večja med novimi krvodajalci, okuženih

z virusom HIV in Treponemo pallidum pa je bilo več med rednimi krvodajalci.

Stran 7

ABSTRACTE

Title: ENZYME-IMMUNO ASSAYS OF TESTING BLOOD OF

VOLUNTARY BLOOD DONORS

UDK: 591.111.1:612.12(043.2) Key words: blood testing, enzyme-immuno assay, blood donor, hepatitis B

surface antigen, antibodies against hepatitis C virus, antibodies against human

immunodeficiency virus, antibodies against Treponema pallidum. Purpose

The principle, which was accepted in Europe and also in the world, that each nation

should by itself assure the sufficient amount of blood, blood components and products,

makes the transfusional activity responsible for planning and execution of the national

program of self-sufficiency when blood supply is concerned. Because the needs for blood

are on the increase, the acquisition of new blood donors is of great importance. Blood and

blood preparations have to be safe for the patients. One of the many precautions which

are taken in order to assure safe transfusion is also screening testing. Rules on obligatory

testing of human blood and blood components determine the extent of the obligatory

testing of each taken unit of blood. The purpose of the paper is to establish the

appearance of infection with human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B and C

viruses and the bacterium Treponema pallidum among new and regular blood donors.

Methods

The data about the number of new blood donors from the period of 2003 to 2007 was

gained from the computer program Datec in the Center for Transfusional Medicine

Maribor. We presented Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) for the

Stran 8

establishment of surface hepatitis B antigen (HBsAg), antibodies against hepatitis C virus

(anti-HCV), antibodies against human immunodeficiency virus (anti-HIV) and antibodies

against Treponema pallidum bacterium (anti-TP). The data about the number of blood

donors who were tested positive on individual viral markers for the period of five years

were found in the computer program Datec.

Results

The number of new blood donors, who are tested in the Center for Transfusional Medicine

Maribor, decreases from year to year. In 2005 the highest number of new blood donors

was marked, namely 5537 which is 17% of all blood donors who donated blood that year.

With the exception of 2003, the number of blood donors positive on HBsAg among new

blood donors was higher than those of the regular blood donors. Year 2006 stands out

especially, because we discovered 6 new blood donors infected with hepatitis B virus,

while there was only one among regular ones. In the five year period we together

discovered 8 blood donors infected with hepatitis C virus, 7 of them were new blood

donors and 1 regular blood donor. Only in 2005 we discovered 2 blood donors infected

with HIV, both donated blood many times. From 2003 to 2007 9 blood donors were

infected with Treponema pallidum bacterium, 5 were regular and 4 new blood donors. The

highest number of them was discovered in 2007, 4. In the five year period we together

discovered 19 blood donors positive on HBsAg, 8 on anti-HCV, 2 on anti-HIV and 9 on

anti-TP.

Conclusions

Although the number of new blood donors is slightly decreasing, we can still meet the

requirements of self-sufficiency in supply with blood and blood components. From 2003 to

2007 we discovered that the infection with hepatitis B and C viruses is bigger among new

blood donors, while there was more of those infected with HIV and Treponema pallidum

among regular blood donors.

Stran 9

VSEBINA 1 UVOD 13 1.1 ZGODOVINA TRANSFUZIOLOGIJE 13 1.2 ORGANIZACIJA TRANSFUZIJSKE DEJAVNOSTI 15 1.3 PROSOTOVOLJNO KRVODAJALSTVO 16 1.4 VARNA TRANSFUZIJA 17

1.4.1 Zdravstvena vzgoja krvodajalcev 17 1.4.2 Izbira krvodajalca 18 1.4.3 Presejalno testiranje krvi krvodajalcev 19

1.5 NAMEN NALOGE 19 2 METODE IN MATERIALI 21 2.1 ENCIMSKO IMUNSKA METODA 21 2.2 REAGENTI ZA PRESEJALNO TESTIRANJE KRVI 24 PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV 2.3 TESTIRANJE KRVI KRVODAJALCEV NA HBsAg 27 2.4 TESTIRANJE KRVI KRVODAJALCEV NA anti-HCV 30 2.5 TESTIRANJE KRVI KRVODAJALCEV NA anti-HIV 33 2.6 TESTIRANJE KRVI KRVODAJALCEV NA anti-TP 36

2.7 INFORMACIJSKI SISTEM DATEC 37

2.7.1 Analiza podatkov 38 3 REZULTATI 39 3.1 DELEŽ NOVIH KRVODAJALCEV 39

Stran 10

3.2 REZULTATI PRESEJALNEGA TESTIRANJA 40

3.2.1 Rezultati testiranja na HBsAg 40 3.2.2 Rezultati testiranja na anti-HCV 41 3.2.3 Rezultati testiranja na anti-HIV 42 3.2.4 Rezultati testiranja na anti-TP 43

4 RAZPRAVA 46 5 SKLEP 48 6 LITERATURA 49

Stran 11

SEZNAM TABEL Tabela 3-1: Število novih krvodajalcev

Tabela 3-2: Število pozitivnih krvodajalcev na HBsAg v obdobju 2003-2007

Tabela 3-3: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-HCV v obdobju 2003-2007

Tabela 3-4: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-HIV v obdobju 2003-2007

Tabela 3-5: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-TP v obdobju 2003-2007

Tabela 3-6: Število pozitivnih krvodajalcev na virusne označevalce v obdobju 2003-2007

SEZNAM GRAFOV Graf 3-1: Pozitivni krvodajalci na HBsAg med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju

2003-2007

Graf 3-2: Pozitivni krvodajalci na anti-HCV med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju

2003-2007

Graf 3-3: Pozitivni krvodajalci na anti-HIV med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju

2003-2007

Graf 3-4: Pozitivni krvodajalci na anti-TP med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju

2003-2007

Graf 3-5: Gibanje števila pozitivnih krvodajalcev na HBsAg, anti-HCV, anti-HIV in anti TP v

letih od 2003-2007

SEZNAM SLIK Slika 2-1: Indirektna ELISA

Slika 2-2: Sendvič ELISA

Slika 2-3: Kompetitivna ELISA

Slika 2-4: Analizator BEP 2000

Slika 2-5: Analizator Axsym

Stran 12

UPORABLJENI SIMBOLI A absorbanca

Ā povprečna absorbanca

anti-HCV protitelesa proti hepatitis C virusu

anti-HIV protitelesa proti human immuno deficiency virusu (protitelesa proti virusu

človeške imunske pomanjkljivosti)

anti-TP protitelesa proti bakteriji Treponema pallidum

anti-HBc protitelesa proti hepatitis B core antigenu (protitelesa proti antigenu jedra

virusa hepatitisa B)

CTM Center za transfuzijsko medicino

Cut-off mejna vrednost

EDTA Etilendiamintetraocetna kislina

EIA Enzyme Immuno Assay (encimsko imunski postopek)

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

HBsAg hepatitis B surface antigen (površinski antigen virusa hepatitisa B)

HCV RNA ribonukleinska kislina virusa hepatitisa C

MEIA Microparticles Enzyme Immuno Assay

mmHg milimetri stolpca živega srebra

NAT nucleic acid testing (detekcija nukleinskih kislin)

Rh Rhesus faktor

RIA RadioImmuno Assay

RK Rdeči križ

ZTM Zavod za transfuzijsko medicino

g gram

g/L gram na liter

kg kilogram

mL mililiter

mmol/L milimol na liter

nm nanometer

Stran 13

1 UVOD

1.1 Zgodovina transfuziologije Terapevtski učinek krvi je bil spoznan že pred stoletji, vendar je preteklo več kot tisoč let,

da so spoznali pomembnost same transfuzije krvi. Razvoj transfuziologije bi lahko razdelili

na:

• doba pred dajanjem transfuzije

• transfuzija krvi od živali-živali

• transfuzija krvi od živali -človeku

• dajanje krvi človeka-človeku(1).

Prve sledove teh zamisli najdemo že v antičnih zapiskih Ovidovih Metamorfoz. Stari Grki

so pili kri padlih junakov, prepričani, da bodo pridobili mladost oziroma hrabrost padlega.

V Libaviusovih pismih leta 1615 najdemo že prvi opis tedanje transfuzije. Zdravnik je

uporabljal za transfuzijo krvi dve prilegajoči se srebrni cevki. Krvodajalcu je odprl žilo in

vanj vstavil eno cevko, drugo pa namestil v žilo bolnika. Menili so, da kri nastaja v srcu, od

koder gre v ostale organe (2). Leta 1616 je William Harvey odkril krvotok. Zapisal je, da kri

cirkulira skozi telo v zaprtem sistemu. Srce je črpalka, ki potiska kri skozi arterije, vrača pa

se skozi vene (1).

V 17. stoletju se je pojavilo več oseb, ki so pričeli z eksperimentalnimi transfuzijami. Te so

potekale večinoma na živalih in leta 1666 je angleški zdravnik Richard Lower uspešno

opravil transfuzijo na psu. Kmalu za tem se je utrnila zamisel, da bi živalsko kri prenesli na

človeka. To je uspelo mlademu zdravniku Jean Denisu, ki je prenesel kri ovce na človeka

(2). Mnogi zapleti, ki so se pojavljali, so preprečili da bi se ta metoda zdravljenja razširila.

Medicinska fakulteta v Parizu je označila transfuzijo kot kriminalno dejanje. Leta 1678 je

odredba francoskega parlamenta prepovedala transfuzije v Franciji, pridružila pa se ji je

tudi Royal Society v Londonu (1).

Do ponovnega napredka je prišlo v 19. stoletju. Zdravnik James Blunder je dal prvo

transfuzijo krvi človeku. Trdil je, da se mora za humano transfuzijo uporabljati humana kri.

Zato so bile te transfuzije krvi direktne iz žile dajalca v žilo prejemnika.

Stran 14

Komplikacije so bile pogoste in hude, največkrat smrtne, zato so transfuzijo krvi spet

prepovedali (2). Raziskave so se nadaljevale. Ugotovili so, da kri posameznih dajalcev

ustreza krvi bolnika. Nemški kirurg K. Oelecker je pred vsako transfuzijo uvedel »biološki

poskus« in bistveno zmanjšal zaplete po transfuziji krvi (3).

Temelji sodobnega transfuzijskega zdravljenja so bili postavljeni v začetku 20 stoletja.

Leta 1901 so Karl Landsteiner in njegovi sodelavci v Ameriki odkrili krvne skupine AB0

sistema. Ugotovili so, da prisotnost ali odsotnost antigenov A in B na eritrocitih omogoča

razdelitev človeške krvi v štiri skupine A, B, AB in 0. S tem odkritjem so omogočili

pomemben razvoj transfuzijske medicine (3).

Leta 1942 je Landsteiner odkril na eritrocitih opice (vrste Rhesus Macacus) novi antigen.

Poimenoval ga je Rhesus faktor (Rh faktor). Raziskave so pokazale, da je Rh faktor v

populaciji belcev prisoten v 85%. Odkritje Rh faktorja je dodatno znižalo število zapletov

po transfuzijah krvi. Kasneje so ugotovili še druge eritrocitne, levkocitne in trombocitne

antigene (3). V začetku so transfuzije krvi izvajali direktno iz žile krvodajalca v žilo

prejemnika. Izvajali so jih tako, da so odprli arterijo krvodajalca in veno prejemnika ter ju

neposredno zvezali s šivom ali pa med obe žili vstavili cevko (2,3). Prvo takšno transfuzijo

krvi v Sloveniji je v Mariboru opravil dr. Adolf Ramšak jeseni leta 1926 (4).

Mnogi znanstveniki so iskali sredstvo, ki bi preprečevalo strjevanje krvi. Med prvo

svetovno vojno leta 1915 je bil odkrit natrijev citrat kot sredstvo, ki preprečuje strjevanje

krvi. Tako so bile dane možnosti za konzerviranje krvi. V drugi svetovni vojni so se

potrebe po krvi izjemno povečale (4). Njena uporaba je zmanjšala število mrtvih. Žalostna

je ugotovitev, da so prav velike vojne najbolj značilno vplivale na razvoj transfuzijske

medicine (3).

Krvodajalska služba se je v večjem obsegu najprej razvila v Angliji. Že leta 1918 je Rdeči

križ (RK) Anglije zbiral prostovoljne krvodajalce in jih po potrebi pošiljal v posamezne

bolnišnice (3).

Šele leta 1945 je bila v Sloveniji organizirana prva transfuzijska postaja v Ljubljani, v

okviru Centralne vojne bolnice, kjer so 4. junija darovali kri prvi plačani krvodajalci. Ta dan

praznujemo kot Dan krvodajalcev. Januarja leta 1946 se je transfuzijska postaja

preimenovala v Zavod za transfuzijo krvi Medicinske fakultete v Ljubljani. Kmalu se je

izkazalo, da zavod sam ne bo mogel kriti hitrega naraščanja potreb po krvi za vse

bolnišnice v Sloveniji. Zato so organizirali transfuzijske oddelke po večjih bolnišnicah

(Celje, Maribor, Jesenice, Izola…) (5).

Stran 15

V Mariboru je bila ustanovljena Postaja za transfuzijo krvi konec leta 1949. V njej so prvi

plačani krvodajalci darovali kri 28. decembra istega leta. Postaja v začetku ni imela lastnih

prostorov in je gostovala kar na treh oddelkih. Leta 1953 so prešli na prostovoljno

krvodajalstvo, ki ga od vsega začetka organizira RK v tesnem sodelovanju s strokovno

službo. V začetku so kri zbirali le v bolnišnici, leta 1954 so začeli z zbiranjem krvi tudi na

terenskih akcijah. Leta 1965 se je Postaja za transfuzijo krvi preimenovala v Oddelek za

transfuzijo krvi, leta 1973 pa v Oddelek za transfuziologijo in imunohematologijo. Število

prostovoljnih krvodajalcev je iz leta v leto naraščalo, vse do začetka 90. let, ko sta se

ekonomska kriza in odpuščanje delavcev močno odrazila tudi v krvodajalstvu. S selitvijo v

kletne prostore kirurške stolpnice leta 1990 so se rešili prostorske stiske, ki jih je pestila

vsa leta delovanja in tu deluje še danes. Ves čas delovanja so sledili hitremu razvoju

transfuziologije, v skrbi za pripravo kvalitetnejše in varnejše transfuzije krvi. Vzporedno s

krvodajalstvom se je razvijala tudi laboratorijska in ambulantna dejavnost. Izjemno

pomembna je bila uvedba hemostaziološke dejavnosti, s katero so se tesno povezali s

kliniki in postali prvi klinični transfuziologi v Sloveniji. V okviru laboratorijske dejavnosti

imajo danes interno ločeno imunohematoserološko, virološko in hemostaziološko

dejavnost (4). Leta 2007 je oddelek dobil naziv Center za transfuzijsko medicino.

1.2 Organizacija krvodajalstva pri nas

Svet Evrope v priporočilih o odgovornosti zdravstvenih oblasti pri izvajanju transfuzijske

dejavnosti določa, da mora biti transfuzijska dejavnost organizirana kot vladna javna

nepridobitvena organizacija, ki z upravljanjem javnih storitev in proizvodnjo javnih dobrin

deluje v javno korist. Njen ustanovitelj je država oziroma vlada, ki zagotavlja tudi finančna

sredstva za njeno delovanje. Transfuzijska dejavnost je pomemben del javnega

zdravstva, ki deluje in se razvija znotraj državnega sistema zdravstvenega varstva (3).

Glavni organizator krvodajalstva v Sloveniji je RK, ki to nalogo opravlja s svojo mrežo 56

območnih združenj RK po vsej državi in je odgovoren za zagotavljanje zadostnega števila

krvodajalcev. Za odvzem krvi, zbiranje, predelavo ter oskrbo z varno krvjo in krvnimi

pripravki je pristojna transfuzijska služba. Delo transfuzijske službe in RK je na področju

krvodajalstva tesno povezano (6).

V Sloveniji sodeluje pri izvajanju nacionalnega programa:

Stran 16

• Zavod za transfuzijsko medicino v Ljubljani (ZTM)

• Center za transfuzijsko medicino v Mariboru (CTM)

• 9 oddelkov za transfuzijo krvi, ki pripadajo regionalnim bolnišnicam

• RK Slovenije

Država Slovenija je z Zakonom o RK tej humanitarni organizaciji dala javno pooblastilo

pridobivanja krvodajalcev in organizacijo krvodajalskih akcij (3).

Letno oceno potreb po krvi poda transfuzijska služba. To so podatki, ki so RK osnova za

načrtovanje krvodajalskih akcij. Priprave za planiranje krvodajalskih akcij za prihodnje leto

se pričnejo že v mesecu septembru. Strokovna služba RK pri planiranju krvodajalskih

akcij vključuje območna združenja RK, ki s transfuzijsko službo razporedijo akcije čim

enakomerneje preko celega leta (3). V letu 2007 je bilo v Sloveniji organiziranih 1500

krvodajalskih akcij, od tega 350 na terenu in opravljenih 86564 odvzemov krvi (7). Kri se

zbira v rednih, izrednih in dodatnih akcijah in z individualnim telefonskim obveščanjem-

klicanje krvodajalcev v primeru dodatne potrebe po krvi.

Načelo, sprejeto v Evropi in tudi v svetu, da si mora vsak narod sam zagotoviti zadostne

količine krvi, krvnih komponent in produktov, obvezuje transfuzijsko dejavnost, da načrtuje

in izvaja nacionalni program samozadostnosti pri oskrbi s krvjo. Evropski koncept

samozadostnosti predvideva pomoč naprednejših držav tistim evropskim državam, ki jim

samozadostnosti samim ne bo uspelo doseči (8). Po številu krvodajalcev med prebivalci in

po količini zbranih enot krvi je Slovenija popolnoma primerljiva z državami Evropske unije.

Najpomembneje pa je, da imamo na razpolago toliko krvi, kot je potrebujemo (6).

Zakon o Zdravstveni dejavnosti Republike Slovenije določa, da preskrbe s krvjo in krvnimi

pripravki ni mogoče opravljati v obliki zasebne zdravstvene dejavnosti. Zakon prav tako

določa, da se sredstva za zbiranje krvi zagotavljajo iz sredstev republiškega proračuna

(Ur.L.št. 9/92).

1.3 Prostovoljno krvodajalstvo

Prve steklenice krvi so v Sloveniji konzervirali 4. junija 1945. Uprava Centralne vojne

bolnice je dajala krvodajalcem kosilo in kot darilo moko, olje in sladkor. Ko so bile živilske

nakaznice ukinjene, so dobivali krvodajalci le še denar. Tako se je prešlo na plačano

Stran 17

krvodajalstvo. Kmalu so se pokazale negativne strani plačanega krvodajalstva. Med

krvodajalci, ki so dajali kri iz nesebičnih, človekoljubnih nagibov, da bi reševali življenja, so

prihajali ljudje, ki jim je šlo le za denar. Pri tem niso upoštevali niti nevarnosti zase, niti za

bolnika. Podatki o prebolelih boleznih in njihovem zdravstvenem stanju so največkrat bili

lažni. Leta 1953 se je ukinilo plačevanje krvodajalcem in se je prešlo na neplačano,

prostovoljno in anonimno krvodajalstvo (9). Definicija prostovoljnega krvodajalstva

Svetovne zdravstvene organizacije je naslednja: Oseba daruje kri, plazmo ali krvne celice

prostovoljno in za to ne dobi plačila niti v obliki denarja, niti v obliki denarnega

nadomestila, ki vključuje dela prost dan. Manjša pozornostna darila, osvežilni obroki in

povračilo stroškov prevoza so združljivi s prostovoljnim neplačanim darovanjem krvi (10).

Priporočila Sveta Evrope definicijo prostovoljnega krvodajalstva še nekoliko razširijo, in

sicer tako, da dovoljujejo plačilo za odsotnost z dela, ki je potrebna za pot in samo

darovanje krvi. Pri nas so zaposleni krvodajalci upravičeni do enega ali celo dveh prostih

delovnih dni. V bodoče se bomo moral prilagoditi zahtevam Sveta Evrope (11)..

Prostovoljni, neplačani in anonimni krvodajalci so lahko:

• Zdravi ljudje

• Starost krvodajalcev od 18-65 let

• Telesna teža vsaj 50 kg

• Krvni pritisk: sistolični 105-180 mm stolpca živega srebra (mmHg), diastolični 60-

100 mmHg

• Hemoglobin 125 g/L (7,8 mmol/L) za ženske in 135 g/L (8,4 mmol/L) za moške

• Ne smejo biti pod vplivom alkohola ali zdravil

Po standardih, ki so enotni po mnogih deželah Evrope in Amerike, lahko ljudje darujejo

450 ml krvi, ne da bi s tem ogrožali svoje zdravje in dobro počutje. Moški lahko darujejo

krvi s 3-mesečnimi razmaki, ženske pa z 4-mesečnimi razmaki med posameznimi

odvzemi (12).

1.4 Varna transfuzija krvi

1.4.1 Zdravstvena vzgoja krvodajalcev

Globalni cilj zdravstvene vzgoje krvodajalcev je »zdrav krvodajalec«:

Stran 18

• Ozaveščeni in vzgojeni krvodajalci znanje, pridobljeno s pomočjo zdravstveno

vzgojnih dejavnosti, vnašajo v vsakdanje življenje. Sami prevzamejo pobudo in

odgovornost za krepitev in povrnitev svojega zdravja in se izogibajo škodljivim

vplivom.

• Krvodajalci se zavedajo, da se s krvjo lahko prenašajo povzročitelji različnih

bolezni, zato sami odstopajo od darovanja krvi, če pri sebi prepoznajo vedenje s

katerim tvegajo okužbo ali znake bolezni, ki se lahko prenašajo s krvjo. S tem

pripomorejo k varni transfuziji (13).

Mednarodno združenje Rdečega križa in Rdečega polmeseca priporoča izvajanje

zdravstvene vzgoje krvodajalcev v štirih stopnjah. Temu glede na dane kadrovske,

finančne in tehnične možnosti skuša slediti tudi Slovenija.

1.stopnja: Zdravstvena vzgoja krvodajalcev v skupnosti

2.stopnja: Zdravstvena vzgoja krvodajalcev pred odvzemom krvi

3.stopnja: Zdravstvena vzgoja krvodajalcev med odvzemom krvi

4.stopnja: Zdravstvena vzgoja krvodajalcev po končanem testiranju krvi (3).

1.4.2 Izbira krvodajalca

Krvodajalec sme biti le zdrava oseba. Ker moramo zagotoviti, da je dajanje krvi varno za

krvodajalca in da je dana kri varna za bolnika, moramo pred odvzemom upoštevati

določene strokovne omejitve, kot so starost, časovni presledek med odvzemi,

laboratorijske preiskave, pregled krvodajalca. Ker v praksi ni mogoče opraviti popolnega

zdravstvenega pregleda krvodajalca, ocenimo splošni videz krvodajalca, izvede se

merjenje krvnega tlaka in srčnega utripa (12). Septembra leta 1994 smo uvedli prvi

vprašalnik in spremenili način zdravniškega pregleda. Vprašanja so usmerjena na

prebolele bolezni, ki se prenašajo s krvjo (hepatitis, aids, malarija, tuberkuloza…), na

klinične simptome teh bolezni, kontakte z obolelimi osebami, jemanje drog in tvegani

način življenja (11). Prednosti vprašalnika pred ustnim spraševanjem so predvsem v tem,

da vsem krvodajalcem postavimo ista vprašanja, in sicer tista, ki so po dognanjih stroke

potrebna za izbor primernih - varnih krvodajalcev. Krvodajalec podpiše izjavo na hrbtni

strani krvodajalskega kartona, da je razumel podane informacije in dal pravilne podatke o

svojem zdravju (12).

Stran 19

1.4.3 Presejalno testiranje krvi krvodajalcev

S testiranjem krvi lahko ugotavljamo prisotnost povzročiteljev okužb (viruse, bakterije,

parazite) ali pa kazalce okužb – seroloških označevalcev, ki kažejo na prisotnost okužbe

ali pa že prebolelo infekcijo. Pri krvodajalcih opravljamo t. i. presejalno testiranje

(screening), kjer med velikim številom vzorcev iščemo tiste z reaktivnim rezultatom. Tako

kri nato izločimo kot neprimerno za transfuzijo. S presejalnim testiranjem ugotavljamo

samo reaktivnost na izbran označevalec, šele s ponovitvami testiranja in potrditvenim

testiranjem pridobi testiranje tudi diagnostično vrednost. Metoda, po kateri izvajamo

presejalno testiranje, je encimsko imunska (14). Pravilnik o obveznem testiranju krvi in

komponent krvi (Ur.l.RS, št.9/2007) določa obseg obveznega testiranja vsake odvzete

enote krvi. V Sloveniji je vsa kri testirana na protitelesa proti bakteriji Treponema pallidum

(anti-TP) od leta 1960, na hepatitis B površinski antigen (HBsAg) od leta 1970, na

protitelesa proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti (anti-HIV) od leta 1986 in na

hepatitis C protitelesa (anti- HCV) od leta 1993 (15).Čeprav je transfuzija danes varna

oblika zdravljenja, še vedno obstaja možnost prenosa virusov hepatitisa B, C in HIV s

krvjo, zaradi diagnostičnega okna. To je čas od okužbe do izdelave zadostne količine

protiteles. V tem času so osebe že kužne, vendar so presejalni testi negativni (11). V ta

namen je bilo 1. marca 2000 uvedeno dodatno rutinsko testiranje krvi krvodajalcev na

prisotnost ribonukleinske kisline virusa hepatitisa C (HCV RNA) z namenom skrajšati

diagnostično okno in tako z večjo gotovostjo preprečiti prenos okužbe z virusom hepatitisa

C. Test se je izvajal na ZTM Ljubljana. Leta 2007 pa je bilo uvedeno kot dodatno testiranje

detekcija nukleinskih kislin (NAT testiranje) na viruse hepatitisa B, hepatitisa C in HIV.

Testiranje za celotno Slovenijo izvajajo na ZTM Ljubljana (16).

1.5 Namen naloge

Naloga transfuzijske dejavnosti v svetu in pri nas je samozadostnost v preskrbi s

kakovostno in varno krvjo in krvnimi pripravki. Zaradi potrebe po vedno večji količini krvi, je

velikega pomena skrb za pridobivanje novih krvodajalcev. V nalogi želimo ugotoviti trend

pridobivanja novih krvodajalcev in ugotoviti pojavnost okužbe z virusom hepatitisa B, C in

HIV ter Treponeme pallidum med novimi in rednimi krvodajalci.

Stran 20

Eden izmed ukrepov za zagotavljanje varne transfuzije je presejalno testiranje vsake

enote krvi. Metoda testiranja je encimsko imunska (EIA). S pomočjo informacijskega

sistema Datec bomo pridobili podatke o številu novih krvodajalcev in rezultate

presejalnega testiranja.

Stran 21

2 METODE IN MATERIALI

2.1 Encimsko imunska metoda

Encimsko imunska metoda (EIA) je biokemična metoda, uporabljena največkrat v

imunologiji za dokazovanje protiteles ali antigenov v vzorcu. Encimska metoda, pri kateri

se v procesu ločevanja vezanih in nevezanih komponent uporablja trdna faza

(polistirenska mikrotitrska plošča z vdolbinicami, polistirenske kroglice…), imenujemo

enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) (17). Metodo odlikuje visoka občutljivost in

specifičnost. V reakciji antigenov s protitelesi so protitelesa označena z encimom, ne da bi

se spremenila aktivnost encima ali lastnosti sestavin imunskega kompleksa (18). Za

označevanje se uporabljajo različni encimi, alkalna fosfataza, peroksidaza in p-nitrofenil

fosfataza (19) Reakcijo izvedemo tako, da izbrani virusni antigen (lahko tudi

rekombinantne virusne beljakovine) vežemo na trden nosilec. Nato dodamo serum. Na

nastale komplekse antigena in protiteles vežemo sekundarna protitelesa, ki so označena

z encimom. S spiranjem odstranimo nevezana sekundarna protitelesa. Dodamo ustrezni

substrat, ki zaradi delovanja encima spremeni barvo. Končni barvni produkt reakcije

fotometrično izmerimo (18). Razvili so številne variante ELISA, s katerimi lahko

kvalitativno in kvantitativno določimo protitelesa ali antigene (20).

Določevanje protiteles – indirektna ELISA

Protitelesa lahko odkrijemo in kvantitativno določimo z indirektnim ELISA. Na dnu

vdolbinice mikrotitrske plošče imamo vezan antigen. Serum ali kak drugi vzorec, v

katerem je primarno protitelo, odpipetiramo v mikrotitrsko vdolbinico in pustimo da reagira

z vezanim antigenom. Speremo nevezana protitelesa. Na nastale komplekse protiteles in

antigena vežemo druga z encimom označena protitelesa. Ta se vežejo s primarnim

protitelesom. Prosta sekundarna protitelesa speremo in dodamo substrat za encim.

Dobimo obarvan produkt reakcije. V spektrofotometru pri določeni valovni dolžini odčitamo

optično gostoto in tako ugotovimo prisotnost protiteles (Slika 2-1) (20,21).

Stran 22

Slika 2-1: Indirektna ELISA

Na trdni nosilec vezani antigeni.

Protitelesa iz testnega vzorca.

Z encimom označena protitelesa (konjugat).

Vezava sekundarnih protiteles na specifična

primarna protitelesa.

Substrat ob prisotnosti encima spremeni barvo.

Določevanje antigena –sendvič ELISA

Antigene, ki imajo več epitopov, lahko določimo kvantitativno s sendvič ELISA. Pri tej

tehniki imobiliziramo v mikrotitrski vdolbinici protitelo. Dodamo vzorec, ki vsebuje antigen,

in pustimo, da reagira z vezanimi protitelesi. Ko speremo vdolbinico, dodamo drugo z

encimom vezano protitelo, specifično za drugi epitop na antigenu in pustimo, da reagira z

vezanim antigenom. Ko s spiranjem odstranimo drugo protitelo, dodamo substrat in

izmerimo obarvan produkt reakcije (slika 2-2) (20,21).

Stran 23

Slika2-2: Sendvič ELISA

Na trdni nosilec vezana protitelesa.

Antigeni iz testnega vzorca.

Z encimom označena protitelesa, specifična za

drugi epitop na antigenih.

Vezava specifičnih protiteles označenih z

encimom.

Substrat ob prisotnosti encima spremeni barvo.

Kompetitivna ELISA

Vzorec, ki vsebuje neoznačena protitelesa, inkubiramo določen čas s protitelesi,

označenimi z encimom. V času inkubacije poteka tekmovanje med označenimi in

neoznačenimi protitelesi za vezavna mesta na antigenih. Večja je količina neoznačenih

protiteles, manjša količina označenih protiteles se bo vezala na antigene in manjša bo

izmerjena absorbanca. Razmerje med izmerjeno absorbanco in koncentracijo protiteles v

vzorcu je obratno sorazmerno (Slika 2-3) (17,21).

Stran 24

Slika 2-3: Kompetativna ELISA

Na trdni nosilec vezani antigeni.

Protitelesa iz testnega vzorca in z encimom

označena protitelesa. Med njimi poteka

tekmovanje za vezavna mesta na antigenih.

Vezava označenih in neoznačenih protiteles na

antigene.

Obarvanje substrata zaradi delovanja encima.

2.2 Regenti za presejalno testiranje krvi prostovoljnih krvodajalcev V Centru za transfuzijsko medicino Maribor (CTM) uporabljamo za testiranje krvi

krvodajalcev na virusne označevalce hepatitis B površinskega antigena (HBsAg),

protiteles proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti (anti-HIV) in protiteles proti

bakteriji Treponema pallidum (anti-TP) reagente proizvajalca Dade Behring in za

določanje protiteles proti virusu hepatitis C (anti-HCV) reagente proizvajalca Ortho.

Testi poleg specifičnih protiteles zaznavajo tudi prisotnost antigenov. S tem se je skrajšalo

diagnostično okno. Specifičnost in občutljivost testov se je močno povečala z uporabo

monoklonskih protiteles. Specifičnost testa izrazimo z odstotkom zdravih, neokuženih

oseb, pri katerih je rezultat testa negativen. Specifičnost diagnostičnega testa predstavlja

sposobnost ločevanja določenega antigena ali protiteles od drugih antigenov ali protiteles.

Občutljivost testa izrazimo z odstotkom oseb z določeno okužbo, pri katerih je rezultat

testa pozitiven. Občutljivost testa predstavlja sposobnost dokazovanja najmanjše količine

določenega antigena ali protiteles (18).

Stran 25

HBsAg je prvi serološki označevalec hepatitisa B, ki ga lahko zaznamo 2-12 tednov po

okužbi z virusom hepatitisa B. Je prvi pokazatelj akutne oblike bolezni. Če njegova

koncentracija bistveno ne pade več kot 6 mesecev, govorimo o kroničnih prenašalcih

HBsAg. Večina hepatitisa B se prenaša z okuženo krvjo ali s spolnimi odnosi z okuženo

osebo (22). Najpogosteje uporabljena tehnika za dokazovanje HBsAg je sendvič ELISA

(23). Vsaka enota krvi mora biti testirana z licenčnim visoko občutljivim testom. Za HBsAg

občutljivost EIA testov mora doseči 0,5 ng HBsAg/mL seruma (24). Enzygnost HBsAg 5.0.

proizvajalca Dade Behring je encimsko imunski test tretje generacije, ki ga uporabljamo

za kvalitativno določitev HBsAg v serumu ali plazmi pri krvodajalcih. HBsAg zaznamo s

temi reagenti 59 dni po okužbi. Diagnostična občutljivost testa znaša <0,2 ng/mL seruma,

specifičnost testa pa je 99,83% (25).

Protitelesa anti-HCV v krvi določamo za odkrivanje akutne, kronične ali prebolele infekcije

s hepatitis C virusom ter odkrivanje okuženih krvodajalcev. Za določanje se uporabljajo

različne imunokemijske metode s kloniranimi in sintetičnimi proteini virusa hepatitisa C kot

antigeni. Najpogosteje uporabljena je EIA metoda. Določajo se skoraj izključno protitelesa

razreda IgG. Prva generacija testov na anti-HCV je uporabljala samo en rekombinantni

virusni protein c100-3 in se danes zaradi slabe občutljivosti in specifičnosti ne uporablja

več. Klinična občutljivost testov druge generacije, ki so prišli na tržišče leta 1991, je bila

izboljšana z uvedbo antigenov virusne kapside (c22-3) in NS3 antigenov (c33 ali c200) v

teste. Leta 1995 so s tretjo generacijo testov še dodatno izboljšali občutljivost z uvedbo

antigena NS5 regije (22). S testi tretje generacije se je diagnostično okno skrajšalo na 82

dni (15). V CTM Maribor uporabljamo test tretje generacije proizvajalca Ortho HCV 3.0

Elisa Test.

S testom Enzygnost HIV Integral II proizvajalca Dade Behring zaznavamo HIV infekcijo.

Test je 4. generacije, ki temelji na hkratnem ugotavljanju HIV p24 antigena in specifičnih

IgG in IgM protiteles proti virusu HIV, tipa 1 in 2, kot protiteles proti HIV 1 (podtip 0).

Občutljivost testa znaša med 10-50 x 10-12 g HIV antigena/mL seruma, specifičnost testa

je 99,89% (29). S testi četrte generacije je diagnostično okno 15-16 dni (16).

Z encimsko imunskimi testi zaznamo prisotnost protiteles proti bakteriji Treponema

pallidum 11 dni po okužbi. Trenutno so na tržišču testi prve generacije. Za dokazovanje

protiteles proti bakteriji Treponema pallidum uporabljamo test Enzygnost Syphilis

proizvajalca Dade Behring. Je enofazni encimsko imunski test za določitev protiteles. Test

se izvaja na osnovi kompetativne ELISA tehnike.

Stran 26

Analizator BEP 2000

Testiranje izvajamo na analizatorju BEP 2000 (slika 2-4). Aparat je popolnoma avtomatski

analizator, katerega uporabnost je v In vitro diagnostiki. Testiranje poteka na mikrotitrskih

ploščah. Vsi koraki, začenši z redčenjem vzorcev, razdeljevanjem vzorcev,

razdeljevanjem reagentov, inkubacijo, spiranjem, merjenjem plošč v fotometru in

vrednotenjem testa in rezultatov potekajo v aparatu samodejno. V aparatu lahko hkrati

testiramo 4 teste in 90 testnih vzorcev. V času delovanja aparata lahko dodatno testiramo

še na eni mikrotitrski plošči. Aparat je primeren za izvajanje testov v laboratorijih bolnišnic

in krvnih bank.

Slika 2-4: Analizator BEP 2000

Priprava reagentov in testnih vzorcev

Reagenti in testni vzorci morajo biti segreti na 15-25ºC. Za testiranje HBsAg, anti-HIV in

anti –TP pripravimo spiralno tekočino tako, da 20 mL spiralnega koncentrata POD

(fosfatni pufer, ki vsebuje Tween ) zmešamo z 400 mL destilirane oz. deionizirane vode.

Za pripravo kromogena zmešamo 1mL kromogen TMB (tetrametilbenzidin dihidroklorid) z

Stran 27

10 mL Pufer/Substrat TMB (vodikov peroksid v acetatnem pufru); hranimo ga v zaprti

steklenički zaščitenega pred svetlobo. Na sobni temperaturi je obstojen 8 ur, na

temperaturi 2-8ºC pet dni, oziroma manj, če se obarva rahlo modro. Za test HIV Integral II

raztopimo pozitivno kontrolo z 1mL destilirane vode in konjugat 1 s konjugat diluentom.

Tako pripravljena pozitivna kontrola in konjugat 1 sta obstojna 4 tedne na temperaturi 2-

8ºC. Ostale reagente uporabimo že tovarniško pripravljene. Za testiranje na anti-HCV

pripravimo spiralno tekočino po naslednjem postopku: zmešamo 50 mL spiralnega pufer

koncentrata (0,2M fosfatni pufer s 3,0M NaCl) in 950 mL destilirane ali deionizirane vode.

Obstojnost spiralne tekočine je 30 dni na sobni temperaturi in 60 dni na temperaturi 2-8ºC.

Za testiranje uporabljamo vzorce krvi krvodajalcev, odvzete v epruvete z antikoagulantnim

sredstvom etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) - plazma ali v epruvete brez dodatka –

serum. Vzorci so lahko pred testiranjem hranjeni največ 3 dni na temperaturi 2-8ºC. Če

vzorce ne testiramo znotraj tega časa, je potrebno serum ali plazmo zamrzniti. Pred

testiranjem vzorce centrifugiramo 20 min na 4500 obratov.

2.3 Testiranje krvi krvodajalcev na HBsAg

Potek testiranja v analizatorju BEP 2000: Predhodno pripravimo aparat, speremo ga s spiralno tekočino. V stojala vstavimo

potrebne reagente:

• Konjugat 1 (Anti HBs/ Biotin); mišja monoklonska protitelesa, konjugirana z

biotinom, reagent je modre barve.

• Konjugat 2 (Streptavidin/POD); streptavidin konjugiran s peroksidazo (POD),

reagent je rumene barve.

• Kromogen; TMB (tetrametilbenzidin dihidroklorid) pomešan s Pufer/Substrat

TMB.(vodikov peroksid v acetatnem pufru)

• Stop solucija POD; 0,25 M H2SO

• Pozitivna in negativna kontrola.

• Mikrotitrska plošča; vdolbinice plošče prevlečene z mišjimi protitelesi proti HBsAg

Glede na število testnih vzorcev pripravimo ustrezno število stripov (št. vzorcev in 5

vdolbinic za kontrole).

V aparatu BEP 2000 potekajo naslednje faze testiranja:

Stran 28

-Pipetiranje 100 µL negativne kontrole v prve tri vdolbinice (pozicija A1-C1), pozitivna

kontrola v eno vdolbinico (D1), nato analizator napolni naslednje vdolbinice s 100 µL

testnega vzorca in na koncu še 100 µL pozitivne kontrole. Pipetiranje mora biti končano

znotraj 30 min.

-Takoj po končanem pipetiranju vzorcev in kontrol se napolnijo vdolbinice s 25 µL

konjugata 1.

-Inkubacija mikrotitrske plošče poteka 60 ±2 min pri 37±1 ºC. Vdolbinice mikrotitrske

plošče so prevlečene s protitelesi proti HBsAg. V testnem vzorcu HBsAg reagira v prvem

koraku s poliklonskimi protitelesi vezanimi na dno vdolbinice mikrotitrske plošče in s

konjugatom 1.

-V spiralcu se posesajo vse vdolbinice. Plošča se spere s približno 0,3 mL spiralne

tekočine v štirih ciklusih. Med vsakim ciklusom se plošča namaka približno 10 sek. S tem

se odstranijo vsi nevezani reaktanti.

-Vsaka vdolbinica se napolni z 100 µL konjugata 2.

-Sledi inkubacija mikrotitrske plošče 30 ±2 min pri 37±1 ºC. Po spiranju nevezanih

reaktantov se doda konjugat 2, ki reagira s konjugatom 1. Odločilna je aktivnost encima,

vezanega na konjugatu 2.

-Plošča se ponovno spere po prej opisanem postopku.

-Po končanem spiranju se vsaka vdolbinica napolni s 75 µL kromogena.

-Plošča se inkubira 30 ± 2 min pri 15-25 ºC, zaščitena pred svetlobo. Kromogen se obarva

rumeno, zaradi aktivnosti encima na konjugatu 2.

-Reakcija se ustavi z dodajanjem 75 µL stop solucije POD.

-Plošča se odčita v fotometru pri 450/650 nm valovne dolžine v času 1 ure. Intenzivnost

barve je sorazmerna koncentraciji antigena v testnem vzorcu (25).

Veljavnost testa:

1. Absorbanca negativne kontrole:-0,010 ≤ A(neg) ≤ 0,150, vrednost le ene negativne

kontrole lahko odstopa.

2. Absorbanca pozitivne kontole: A(poz ) ≥ 0,700, vrednosti obeh pozitivnih kontrol

morajo biti znotraj določenih mej.

Vrednotenje rezultatov:

Ā (neg. kontrole) + 0,050 = cut-off

1. A (vzorca) < cut-off =.NEGATIVEN 2. A (vzorca) ≥ Ā (neg. kontrole + 0,050) x 0,89 < cut-off = NEJASEN in mora biti

ponovljen v dvojniku

Stran 29

3. A (vzorca) ≥ cut-off = začetno REAKTIVEN in mora biti ponovljen v dvojniku. Če

sta oba rezultata manjša od cut-off vrednosti, potem se smatra vzorec negativen

na virusni označevalec HBsAg. Če je vsaj eden rezultat ponovljenega testiranja v

dvojniku enak ali večji od cut-off vrednosti, se vzorec vrednoti kot ponovljeno

reaktiven.

Pri vseh začetno reaktivnih vzorcih ravnamo dalje po navodilih proizvajalca reagentov in

po algoritmu testiranja za HBsAg. Kot reagent drugega proizvajalca uporabljamo HBsAg

(V2) proizvajalca Abbott. Testiranje izvajamo na aparatu Axsym (slika. 2-5). Izvajamo še dodaten test protitelo proti antigenu jedra (core) virusa hepatitisa B (anti-HBc), imenovan

CORE proizvajalca Abbott, na aparatu Axsym.

Slika 2-5: Analizator Axsym

Stran 30

Test Abbott HBsAg (V2) je encimsko imunski test, ki uporablja mikrodelce (polistirenske

kroglice), na katere so vezana monoklonska protitelesa proti površinskemu antigenu

virusa hepatitisa B (anti-HBs). Test temelji na Microparticles Enzyme Immuno Assay

(MEIA) tehniki.

V reakcijsko posodico se odpipetira ustrezna količina vzorca in reagenta. Reakcijska

posodica potuje v procesni center, kjer se zgodijo naslednje faze reakcije:

• Vzorec, mikrodelci prevlečene z anti-HBs in anti-HBs označena z biotinom se

pomešajo v reakcijski posodici.

• Če so v vzorcu prisotni HBsAg , se vežejo z anti-HBs vezanimi na mikrodelcih in z

anti-HBs označenimi z biotinom. Nastane kompleks protitelo-antigen-protitelo v

reakcijski mešanici.

• Del reakcijske mešanice se prenese na matrix celico. Mikrodelci se vežejo

ireverzibilno na steklena vlakna matrix celice.

• Doda se konjugat:, alkalna fosfataza, ki se veže na protitelo-antigen-protitelo

kompleks.

• Matrix celica se spere in se tako odstranijo vsi nevezani delci.

• Doda se substrat:4-metilumbeliferil fosfat (MUP). Vezana alkalna fosfataza iz

konjugata povzroči odcepljanje fosfatne skupine iz substrata, kar ima za posledico

fluorescentno obarvanje reakcijskega produkta (4-Metilumbeliferon).

• Sledi merjenje fluorescentnega produkta v MEIA optičnem čitalcu (26).

Vrednotenje rezultatov:

Cut-off = vrednost indeks kalibratorja x 2

S/CO = vrednost vzorca (S) / Cut-off (CO)

1. S/CO vzorca < 1 = NEGATIVEN

2. S/CO vzorca ≥ 1 = začetno REAKTIVEN

2.4 Testiranje krvi krvodajalcev na anti-HCV Potek testiranja v analizatorju BEP 2000

Aparat speremo s spiralno tekočino. Pripravimo reagente in mikrotitrsko ploščo:

• Diluent vzorcev: fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom, stabilizator volovski

proteini.

Stran 31

• Konjugat; prititelesa proti človeškim protitelesom razreda IgG proti virusu

hepatitisa C konjugirana s hrenovo peroksidazo in stabilizirana z volovskimi

proteini.

• Substrat; tableta OPD (o-phenilenediamin·2HCl) raztopljena v substratnem pufru

(citratnofosfatni pufer z 0,02% vodikovega peroksida).

• Stop solucija; 2M H2SO4.

• Mikrotitrska plošča; dno vdolbinic prevlečeno z rekombinantnimi antigeni virusa

hepatitisa C: c22-3, c200 in NS5.

Pripravimo potrebno število stripov (št. vzorcev in 6 vdolbinic za kontrole).

V aparatu potekajo naslednje faze testiranja:

-Pipetiranje 200 µL diluenta v vse vdolbinice, tudi v A1.

-Dodajanje po 20 µL negativne kontrole v tri zaporedne vdolbinice od pozicije B1 dalje in

20 µL pozitivne kontrole v dve naslednji vdolbinici. Sledi pipetiranje vzorcev krvi po 20 µL.

-Inkubacija mikrotitrske plošče poteka 30 ±1 min pri 37±1 ºC. Če je v vzorcu prisotno

protitelo proti kateremu od vezanih antigenov, se bo tvoril kompleks antigen-protitelo.

-Vdolbinice se posesajo in nato do vrha napolnijo s spiralno tekočino. Spiranje poteka v

štirih zaporednih ciklusih, med posameznimi ciklusi mora biti 20 sek premora. Spiranje se

zaključi s sesanjem spiralne tekočine. V tem postopku se odstranijo vse nevezane

komponente vzorca.

-V vse vdolbinice se doda 200 µL konjugata.

-Sledi inkubacija mikrotitrske plošče 30 ±1 min pri 37±1 ºC. Konjugat se veže na

specifična mesta človeških protiteles tipa IgG na antigen-protitelo kompleksu.

-Ponovi se postopek spiranja. Če se v prvi fazi ni tvoril kompleks antigen-protitelo, potem

se celotni konjugat v tem koraku odstrani.

-Še pred koncem druge inkubacije nas aparata z zvočnim signalom opozori, da moramo

pripravit reagent. Raztopimo OPD tableto v substratnem pufru (za 24 vzorcev rabimo 1

tableto in 6 mL substratnega pufra). Ko je tableta dobro raztopljena reagent vlijemo v prej

pripravljeno prazno stekleničko. Aparat odpipetira 200 µL substrata v vse vdolbinice.

-Plošča se inkubira 30 ± 2 min pri 15-25 ºC, zaščitena pred svetlobo. Če je vezan konjugat

prisoten potem OPD oksidira in nastane rumeno obarvan končni reakcijski produkt. Barva

se spremeni v oranžno z dodajanjem 50 µL 2M H2SO4..

-Mikrotitrska plošča se odčita v roku 1 ure pri 492/620 nm (27).

Test je veljaven kadar so zagotovljeni naslednji trije kriteriji:

1. Vrednost absorbance blank kontrole: ≥ -0,020 in ≤ 0,050

Stran 32

2. Vrednost absorbance posamezne negativne kontrole: ≥ -0,005 in ≤ 0,120. Test je

veljaven, kadar le ena absorbanca negativne kontrole odstopa.

3. Vrednost absorbance pozitivne kontrole:> cut-off. Da je test veljaven, morata obe

pozitivni kontroli zadostiti temu kriteriju.

Vrednotenje rezultatov:

Cut-off = Ā (neg kontrole) + 0.330

1. Vzorec z A < -0,025 mora biti ponovljen v dvojniku. Kot nereaktiven se smatra, če

so vrednosti ponovljenega testiranja manj od vrednosti cut-off. Hkrati se smatra

vzorec kot nereaktiven, če so vrednosti absorbance ponovno < -0,025.

2. Vzorec z A < cut-off in > -0,025 = NEREAKTIVEN

3. Vzorec z A ≥ Ā (neg kontrole + 0.330) x 0,84 < cut off = NEJASEN in mora biti

ponovljen v dvojniku.

4. Vzorec z absorbanco ≥ cut-off = začetno REAKTIVEN in mora biti ponovljen v

dvojniku pred končnim vrednotenjem rezultata. Vzorec je ponovljivo reaktiven,

kadar je vsaj ena vrednost testiranja v dvojniku ≥ cut-off vrednosti, drugače se

vrednoti kot nereaktiven.

Po navodilih proizvajalca in po algoritmu testiranja za anti-HCV vse začetno reaktivne

vzorce ponovimo v dvojniku z istim reagentom in v enojniku z reagentom HCV version 3.0

proizvajalca Abbott.

HCV version 3.0 je MEIA test za kvalitativno detekcijo protiteles proti virusu hepatitisa C.

Test je namenjen dokazovanju protiteles proti določenim proteinom HCV genoma. Test se

izvaja na analizatorju Axsym v večih fazah:

• Vzorec se odpipetira v vdolbinico reakcijske posodice in se redči z ustreznim

diluentom.

• V tako razredčen vzorec se odpipetirajo mikrodelci prevlečeni z antigenom.

• Reakcijska posodica se prenese v procesni center. Tam se reakcijska mešanica

inkubira. Protitelesa iz vzorca se vežejo z antigeni na mikrodelcih.

• Del reakcijskega kompleksa se prenese na matrix celico, kjer se vežejo na

steklena vlakna matrix celice.

• Površina matrix celice se spere.

• Doda se konjugat, monoklonska protitelesa koze konjugirana z alkalno fosfatazo,

ki se v času inkubacije vežejo na protitelo-antigen kompleks.

• Spere se matrix celica in se tako odstranijo vsi nevezani reaktanti.

Stran 33

• Doda se substrat: 4- metilumbeliferil fosfat (MUP). Vezana alkalna fosfataza iz

konjugata povzroči odcepljanje fosfatne skupine iz substrata, kar ima za posledico

fluorescentno obarvanje reakcijskega produkta (4-metilumbeliferon).

• Reakcijski produkt izmerimo v fotometru (28).

Vrednotenje rezultatov:

Cut-off = vrednost indeks kalibratorja x 0,12

S/CO = vrednost vzorca (S) / Cut-off (CO)

1. S/CO vzorca < 1 = NEREAKTIVEN

2. S/CO vzorca ≥ 1 = začetno REAKTIVEN

2.5 Testiranje krvi krvodajalcev na anti-HIV Potek testiranja v analizatorju BEP 2000

Aparat speremo s spiralno tekočino za test anti-HIV proizvajalca Dade Behring. V stojala

naložimo potrebne reagente in pripravimo mikrotitrsko ploščo:

• Dilunet vzorcev; fosfatni pufer s kazeinom in Triton X-100, modre barve.

• Konjugat 1, rekombinantni HIV proteini (Escherichia Colli)/ sintetični peptidi HIV 1,

HIV 2 in HIV 1(podtip 0) ter mišja monoklonska protitelesa proti antigenu HIV p24.

razredčena s konjugat dilunetom (Tris pufer s Sapogenatom in kazeinom).

Reagent je zelene barve.

• Konjugat 2; Tris pufer s Sapogenatom in streptavidinom, konjugiran s peroksidazo

(POD), rdeče barve.

• Kromogen; TMB (tetrametilbenzidin dihidroklorid) pomešan s Pufer/Substrat TMB

(vodikov peroksid v acetatnem pufru).

• Stop solucija POD; 0,25 M H2SO4.

• Pozitivna in negativna kontrola.

• Mikrotitrska plošča; vdolbinice plošče prevlečene z mešanico rekombinantnih

proteinov (Escherichia Colli) in sintetičnih peptidov HIV 1 gp24, HIV 1 (podtip 0)

gp41, HIV 2 gp36 ter mišja monoklonska protitelesa proti HIV p24 antigenu.

Pripravimo in vstavimo v aparat ustrezno število stripov (št. vzorcev in 4 vdolbinice za

kontrole).

V analizatorju BEP 2000 potekajo naslednje faze testiranja:

Stran 34

-Pipetiranje 25 µL diluenta za vzorce v vse vdolbinice.

-Dodajanje 100 µL negativne kontrole v vdolbinico A1 in B1, v vdolbinico C1 doda 100 µL

pozitivne kontrole, sledi pipetiranje vzorcev po 100 µL. Na koncu vseh vzorcev aparat

doda še 100 µL pozitivne kontrole.

-Inkubacija mikrotitrske plošče poteka 30 ±2 min pri 37±1 ºC. HIV specifični imunoglobulini

v testnem vzorcu reagirajo z rekombinantnimi proteini in sintetičnimi peptidi HIV 1 gp24,

HIV 1 (podtip 0) gp41 in HIV 2 gp36, ki so vezani na dno vdolbinic mikrotitrske plošče.

Istočasno se v vzorcu obstoječi HIV p24 antigeni vežejo z monoklonskimi mišjimi

protitelesi.

-V spiralcu se posesajo vse vdolbinice. Plošča se spere s približno 0,3 mL spiralne

tekočine v treh ciklusih. Odstranijo se vse nevezane komponente testnega vzorca.

-V vsako vdolbinico aparat odpipetira 100 µL konjugata 1.

-Sledi inkubacija mikrotitrske plošče 30 ±2 min pri 37±1 ºC. Vezana specifična protitelesa

se v tem koraku vežejo z biotin konjugiranimi rekombinantnimi proteini oz. sintetičnimi

peptidi HIV 1, HIV 2 in HIV 1(podtip 0). Hkrati se vsi vezani HIV antigeni vežejo z biotin

konjugiranimi monoklonskimi protitelesi HIV p24.

-Nevezan biotin konjugat se spere.

-Vsaka vdolbinica plošče se napolni s 100 µL konjugata 2.

-Ponovno sledi inkubacija plošče 30 ±2 min pri 37±1 ºC. Konjugat 2 (Streptavidin/POD)

reagira s prej vezanim konjugatom 1. Aktivnost encima vezanega na konjugatu 2 povzroči

obarvanje reakcije modro.

-Višek konjugata se spere.

-Doda se75 µL kromogena v vse vdolbinice.

-Plošča se inkubira 30 ± 2 min pri 18-25 ºC, zaščitena pred svetlobo. Poteka encimska

zamenjava na kromogenu.

-Po končani inkubaciji se doda 75 µL stop solucije POD. Reakcijski produkt se obarva

rumeno. Plošča se izmeri v fotometru pri 450/650nm (29).

Veljavnost testa:

1. -0,010 ≤ A (negativna kontrola) ≤ 0,200

2. 0,500 ≤ A (pozitivna kontrola) ≤ 2,600

3. A (negativna kontrola) < cut-off

Obe vrednosti negativne in pozitivne kontrole morajo biti znotraj zahtevanih mej.

Vrednotenje rezultatov:

Cut-off = Ā (pozitivne kontrole) x 0,23

Stran 35

1. A (vzorca) < cut-off = NEGATIVEN

2. Ā (pozitivne kontrole x 0,23 ) x 0,89 ≤ A (vzorca) < cut-off = NEJASEN in mora

biti ponovljen v dvojniku pred končno interpretacijo rezultata.

3. A (vzorca) ≥ cut-of = začetno REAKTIVEN in mora biti ponovljen v dvojniku. Če

sta oba rezultata manjša od cut-off vrednosti, potem se smatra vzorec negativen

na virusni označevalec anti-HIV. Če je vsaj eden rezultat ponovljenega testiranja v

dvojniku enak ali večji kot je cut-off vrednost, se vzorec vrednoti kot ponovljeno

reaktiven.

Algoritem testiranja za anti-HIV in navodila proizvajalca določajo, da moramo vse začetno

reaktivne vzorce ponoviti v dvojniku z istim reagentom in v enojniku z reagenti drugega

proizvajalca.

Kot test drugega proizvajalca v CTM Maribor uporabljamo reagent HIV Ag/Ab Combo

proizvajalca Abbott. Je MEIA test za istočasno detekcijo protiteles proti virusu imunske

pomanjkljivosti tipa 1 in/ali tipa 2 (HIV1/HIV 2) in HIV p24 antigena v testnem vzorcu. Test

izvajamo na analizatorju Axsym:

• V reakcijski posodici se naredi mešanica iz vzorca, diluenta in mikrodelcev

prevlečenih z rekombinantnimi antigeni in monoklonskimi HIV p24 protitelesi. Če

so človeška protitelesa HIV 1/HIV 2 ali HIV p24 antigeni prisotni v vzorcu pride do

vezave na mikrodelce. Formira se antigen-protitelo na mikrodelcih.

• Del reakcijske mešanice se prenese na matrix celico.

• Na oprano martix celico se dodajo rekombinantni antigeni označeni z biotinom,

sintetični peptidi in HIV p24 monoklonska protitelesa. Tvorijo se imunski

kompleksi sestavljeni iz rekombinantnih antigenov- človeških protiteles- antigenov

označenih z biotinom, ali imunski kompleksi sestavljeni iz monoklonskih protiteles-

p24 antigenov- monoklonskih protiteles označenih z biotinom.

• Matrix celica se spere in se tako odstranijo vse komponente, ki se niso vezale na

mikrodelce.

• Doda se konjugat: anti-biotin alkalna fosfataza in se veže na imunske komplekse.

Ponovno se spere matrix celica in se doda substrat 4-Metilumbeliferil fosfat

(MUP). Vezana alkalna fosfataza iz konjugata povzroči odcepljanje fosfatne

skupine iz substrata. Reakcijski produkt se obarva fluorescentno. (4-

Metilumbeliferon).

• Sledi merjenje fluorescentnega produkta v MEIA optičnem čitalcu (30).

Vrednotenje rezultatov:

Stran 36

Cut-off = vrednost indeks kalibratorja + 27,5

S/CO = vrednost vzorca (S) / Cut-off (CO)

1. S/CO vzorca < 0,9 = NEREAKTIVEN

2. 0,9 > S/CO vzorca < 1 = NEJASEN

3. S/CO vzorca ≥ 1 = začetno REAKTIVEN

2.6 Testiranje krvi krvodajalcev na anti-TP Potek testiranja v analizatorju BEP 2000

Aparat speremo s spiralno tekočino za test anti-TP proizvajalca Dade Behring. Pripravimo

mikrotitrsko ploščo in potrebne reagente:

• Konjugat; IgG frakcije človeškega seruma, konjugiran s peroksidazo (v Tris pufru

POD).

• Kromogen; TMB (tetrametilbenzidin dihidroklorid) pomešan s Pufer/Substrat TMB

(vodikov peroksid v acetatnem pufru).

• Stop solucija POD; 0,25 M H2SO4.

• Pozitivna in negativna kontrola.

• Mikrotitrska plošča; vdolbinice plošče prevlečene z inaktiviranimi antigeni

Treponeme pallidum.

Glede na število testnih vzorcev pripravimo ustrezno število stripov (št. vzorcev in 6

vdolbinic za kontrole).

V analizatorju BEP 2000 potekajo naslednje faze testiranja:

-V 4 zaporedne vdolbinice (A1-D1) aparat nakaplja 25 µL negativne kontrole. V vdolbinico

E1 doda 25 µL pozitivne kontrole, sledi pipetiranje vzorcev po 25 µL. V zadnjo vdolbinico

doda še 25 µL pozitivne kontrole. Pipetiranje mora biti zaključeno znotraj 30 min.

-Doda se 100 µL konjugata.

-Inkubacija mikrotitrske plošče poteka 90 ±2 min pri 37±1 ºC. Treponema pallidum

specifična protitelesa in protitelesa označena z encimom peroksidazo, med sabo

tekmujejo za vezavo na Treponema pallidum antigene, ki so vezani na dno vdolbinic

mikrotitrske plošče.

-V spiralcu se posesajo vse vdolbinice in tako odstranijo vsa nevezana protitelesa. Plošča

se spere s približno 0,3 mL spiralne tekočine v treh ciklusih.

-V vse vdolbinice aparat nakaplja 100 µL kromogena.

Stran 37

-Sledi inkubacija v temi 30 ± 2 min pri 18-25 ºC. Encimska komponenta na konjugatu

reagira s kromogenom. Reakcija se obarva modro.

-Po končani inkubacije se odpipetira 100 µL stop solucije POD, kar povzroči spremembo

barve v rumeno. Plošča se odčita v fotometru pri valovni dolžini 450/650 nm. Intenzivnost

rumene barve je obratno sorazmerna koncentraciji anti-TP v vzorcu (31).

Veljavnost testa:

1. 0,700 ≤ A (negativna kontrola) ≤ 2,500

2. -0,010 ≤ A (pozitivna kontrola) ≤ 0,200

Test je veljaven, kadar le ena vrednost negativne kontrole odstopa. Obe vrednosti

pozitivne kontrole morata biti znotraj določenih mej.

Vrednotenje rezultatov:

Cut-off = Ā (negativne kontrole) x 0.7

1. A (vzorca) > cut-off = NEGATIVEN

2. Ā (neg. kontrola) x 0,6 ≤ A (vzorca) ≤ cut-off = NEJASEN

3. A (vzorca) < Ā (neg. kontrola) x 0,6 = začetno REAKTIVEN

Vsi vzorci krvi z začetno reaktivnim ali nejasnim rezultatom testiranja morajo biti

ponovljeni v dvojniku.

Začetno reaktivne in nejasne vzorce ponovimo v dvojniku z istimi reagenti. Ponovno

reaktiven vzorec, po algoritmu testiranja na anti-TP, pošljemo na potrditveno testiranje na

ZTM Ljubljana.

2.7 Informacijski sistem Datec

Osnovna dejavnost vseh transfuzijskih ustanov je zbiranje krvi, predelava in priprava

posameznih komponent ter ustrezno testiranje in pošiljanje krvi zdravstvenim ustanovam.

Za efektivno izvajanje teh dejavnosti je pomemben enoten informacijski sistem, ki

ustrezno povezuje notranjo dejavnost posameznih ustanov in pa vse ustanove med seboj.

S tem namenom so na Zavodu za transfuzijsko medicino (ZTM) Ljubljana razvili

informacijski sistem Datec (32). Trenutni informacijski sistem je zastarel, zato se

intenzivno pripravlja njegova nadomestitev (7).

Stran 38

2.7.1 Analiza podatkov

Podatke o rezultatih testiranja krvodajalcev v obdobju od 2003-2007 smo dobili v

programu Datec. Napravili smo izpis 254: Kontrola motenj in zadnji pozitivni rezultati

virusnih markerjev (po datumu odvzema). Izpis vsebuje naslednje podatke: številka krvi,

številka krvodajalca, priimek in ime krvodajalca, datum rojstva in pod virusnim

označevalcem izpisan datum prve motnje testiranja oz. datum prvič pridobljenega

pozitivnega rezultata. Za vsako izpisano številko krvi smo pregledali ali gre le za motnjo

testiranja ali pozitiven rezultat.

Podatke o številu novih krvodajalcev smo pridobili z izpisom Novi krvodajalci v časovnem

obdobju. Z izpisom 28: Statistika sprejema in odvzema v časovnem obdobju smo dobili

podatek o številu testiranih enot krvi.

Stran 39

3 REZULTATI

3.1 Delež novih krvodajalcev Naloga transfuzijske medicine je zagotoviti zadostne količine kakovostne in varne krvi ter

krvnih komponent. V letih po osamosvojitvi se zaradi družbeno-ekonomskih in socialnih

sprememb srečujemo s težavami pri preskrbi s krvjo. Zaradi vedno večje potrebe po krvi

so nujno potrebni novi pristopi pri motiviranju in organiziranju krvodajalstva pri nas (33).

Novi krvodajalec je oseba, ki ni nikoli dala krvi ali plazme (Tabela 3-1) (10).

Tabela 3-1: Število novih krvodajalcev

Leto Št. vseh krvodajalcev Št. novih krvodajalcev

2003 21539 3490 (16,2%)

2004 21519 3143 (14,6%)

2005 32501 5537 (17,0%)

2006 31472 4509 (14,3%)

2007 32410 4351 (13,4%)

V tabeli 3-1 so zajeti vsi krvodajalci, ki so darovali kri na transfuzijskih ustanovah v

Mariboru, Murski Soboti, Ptuju in Slovenj Gradcu od leta 2005 dalje pa še krvodajalci iz

Oddelka za transfuzijo Splošne bolnišnice Celje. Iz tabele je razvidno, da je bil večji upad

števila vseh krvodajalcev v letu 2006. V letu 2003 in 2004 je skoraj enako število vseh

krvodajalcev. V letu 2005 je število poraslo, saj so tu prvič zajeti tudi vsi krvodajalci, ki so

darovali kri v transfuzijski ustanovi v Celju. V Evropskih državah imajo letno okrog 15%

novih krvodajalcev (34). Pri nas delež novih krvodajalcev iz leta v leto upada, če

primerjamo leti 2003 in 2004 in nato obdobje od 2005-2007, ko testiramo še krvodajalce iz

transfuzijske ustanove Celje. Velik upad smo zabeležili leta 2006, kar za 2,7% glede na

leto 2005.

Stran 40

3.2 Rezultati presejalnega testiranja

3.2.1 Rezultati testiranja na HBsAg

Vse vzorce, pri katerih smo pridobili reaktiven ali nejasen rezultat, smo ponovili v dvojniku

z istim reagentom in v enojniku še z reagentom drugega proizvajalca. Kot dodaten test

smo naredili protitelesa proti antigenu jedra virusa hepatitisa B (anti-HBc). Vse ponovno

reaktivne vzorce smo poslali na potrditveno testiranje na ZTM Ljubljana (tabela 3-2).

Tabela 3-2: Število pozitivnih krvodajalcev na HBsAg v obdobju 2003-2007

Leto Št. testiranih enot krvi

Št. pozitivnih krvodajalcev

Redni krvodajalci Novi krvodajalci

2003 19227 3 (0,016%) 2 1

2004 19371 5 (0,026%) 2 3

2005 29367 2 (0,007%) 0 2

2006 28556 7 (0,025%) 1 6

2007 29344 2 (0,007%) 0 2

V tabeli 3-2 je predstavljeno število pozitivnih krvodajalcev glede na število vseh testiranih

enot krvi. Največ pozitivnih krvodajalcev na HBsAg smo odkrili leta 2004 in 2006.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

2003 2004 2005 2006 2007

REDNI KRVODAJALCI

NOVI KRVODAJALCI

POZITIVNI KRVODAJALCI

Graf 3-1: Pozitivni krvodajalci na HBsAg med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju od

2003-2007

Stran 41

V grafu 3-1 so pozitivni krvodajalci razdeljeni na nove in redne krvodajalce. Razen leta

2003 je bilo število pozitivnih krvodajalcev med novimi večje kot med rednimi krvodajalci.

Še posebej izstopa leto 2006, ko smo med novimi krvodajalci odkrili kar 6 okuženih z

virusom hepatitisa B, med rednimi pa 1. Leta 2005 in 2007 okužbe z virusom hepatitisa B

med rednimi krvodajalci nismo odkrili. Samo leta 2005 je bilo več okuženih z virusom

hepatitisa B med rednimi krvodajalci, vsa ostala leta pa je bilo odkritih več okužb med

novimi krvodajalci (graf 3-1).

3.2.2 Rezultati testiranja na anti-HCV

Pri vseh krvodajalcih, pri katerih smo pridobili reaktiven rezultat na virusni označevalec

anti-HCV, smo po navodilih proizvajalca reagenta Ortho in algoritmu testiranja opravili

ponovitev v dvojniku. Po ponovno reaktivnem rezultatu smo opravili še test anti-HCV z

reagenti drugega proizvajalca, nakar smo vzorec poslali še ustreznemu laboratoriju v

potrditev (tabela 3-3).

Tabela 3-3: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-HCV v obdobju 2003-2007

Leto Št. testiranih enot krvi

Št. pozitivnih krvodajalcev Redni krvodajalci Novi krvodajalci

2003 19227 1 (0,005%) 0 1

2004 19371 0 (0,0%) 0 0

2005 29367 2 (0,007%) 0 2

2006 28556 1 (0,004%) 1 0

2007 29344 4 (0,014%) 0 4

V tabeli 3-3 je prikazano število pozitivnih krvodajalcev v letih od 2003 do 2007. Število

pozitivnih krvodajalcev je v rahlem porastu. Posebej izstopa leto 2007, ko smo odkrili 4

pozitivne krvodajalce na anti-HCV in to vse štiri med krvodajalci, ki so kri darovali prvič

(graf 3-2).

Stran 42

0

1

2

3

4

5

2003 2004 2005 2006 2007

REDNI KRVODAJALCI

NOVI KRVODAJALCI

POZITIVNI KRVODAJALCI

Graf 3-2: Pozitivni krvodajalci na anti-HCV med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju od

2003-2007

Leta 2004 nismo odkrili nobenega pozitivnega krvodajalca na anti-HCV. Kar 4 pozitivne

smo odkrili leta 2007, vse 4 med novimi krvodajalci. Bili so moški, stari od 19 do 49 let.

3.2.3 Rezultati testiranja na anti-HIV

Testiranje vsake enote krvi na virusni označevalec anti-HIV je obvezno od leta 1986. Pri

pridobljenem reaktivnem rezultatu na anti-HIV smo vzorec ponovili v dvojniku. Testiranje

smo opravili še z reagenti drugega proizvajalca. Ko smo tako pridobili tri reaktivne

rezultate in pozitiven rezultat potrditvenega testiranja na ZTM Ljubljana smo krvodajalca

povabili na kontrolni pregled. Opravili smo odvzem novega vzorca in na novem vzorcu

potrdili izid testiranja in identiteto dajalca (tabela 3-4).

Tabela 3-4: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-HIV v obdobju 2003-2007

Leto Št. testiranih enot krvi

Št. pozitivnih krvodajalcev Redni krvodajalci Novi krvodajalci

2003 19227 0 (0,0%) 0 0

2004 19371 0 (0,0%) 0 0

2005 29367 2 (0,007%) 2 0

2006 28556 0 (0,0%) 0 0

2007 29344 0 (0,0%) 0 0

Stran 43

V petletnem obdobju od 2003 do 2007 smo samo leta 2005 odkrili dva krvodajalca

okužena z virusom HIV.

0

1

2

3

4

5

2003 2004 2005 2006 2007

REDNI KRVODAJALCI

NOVI KRVODAJALCI

POZITIVNI KRVODAJALCI

Graf 3-3: Pozitivni krvodajalci na anti-HIV med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju od

2003-2007 Oba pozitivna krvodajalca sta bila redna krvodajalca. Kri sta pred tem odvzemom

darovala že večkrat.

3.2.4 Rezultati testiranja na anti-TP

3-5: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-TP v obdobju 2003-2007

Leto Št. testiranih enot krvi

Št. pozitivnih krvodajalcev Redni krvodajalci Novi krvodajalci

2003 19227 0 (0,0%) 0 0

2004 19371 2 (0,010%) 1 1

2005 29367 1 (0,003%) 0 1

2006 28556 2 (0,007%) 2 0

2007 29344 4 (0,014%) 2 2

V tabeli 3-5 je prikazano število krvodajalcev okuženih z bakterijo Treponema pallidum.

Skupno število okuženih v letih od 2003- 2007 je bilo 9, od tega 5 med rednimi in 4 med

novimi krvodajalci. Še največ smo jih odkrili leta 2007, kar 4 (graf 3-4).

Stran 44

0

1

2

3

4

5

2003 2004 2005 2006 2007

REDNI KRVODAJALCI

NOVI KRVODAJALCI

POZITIVNI KRVODAJALCI

Graf 3-4: Pozitivni krvodajalci na anti-TP med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju od

2003-2007

Število okuženih z bakterijo Treponema pallidum v obdobju od 2003-2007 rahlo narašča

in je pogostejša med rednimi krvodajalci, skupaj 5 med rednimi in 4 med novimi

krvodajalci.

Tabela 3-6: Število pozitivnih krvodajalcev na virusne označevalce v obdobju 2003-2007

Leto Št. pozitivnih na HBsAg

Št. pozitivnih na anti-HCV

Št. pozitivnih na anti-HIV

Št. pozitivnih na anti-TP

2003 3 1 0 0 2004 5 0 0 2 2005 2 2 2 1 2006 7 1 0 2 2007 2 4 0 4 2003-2007 19 8 2 9

Število pozitivnih krvodajalcev na HBsAg niha, največ jih je bilo leta 2006,sedem,

najmanj pa leta 2005 in 2007. V rahlem porastu je število pozitivnih krvodajalcev na anti-

HCV in anti-TP. Največ smo jih odkrili leta 2007, po 4 na oba označevalca okužbe. Samo

leta 2005 smo odkrili 2 krvodajalca okužena z virusom HIV (graf 3-5). Najpogosteje

zaznana okužba med krvodajalci je z virusom hepatitisa B. V petletnem obdobju jih je bilo

skupno 19.

Stran 45

0

1

2

3

4

5

6

7

8

2003 2004 2005 2006 2007

POZITIVNI NA HBsAg POZITIVNI NA anti-HCV

POZITIVNI NA anti-HIV POZITIVNI NA anti-TP

Graf 3-5: Gibanje števila pozitivnih krvodajalcev na HBsAg, anti-HCV, anti-HIV in anti TP v

letih od 2003-2007

Iz grafa je razvidno, da je bilo največ pozitivnih krvodajalcev okuženih z virusom hepatitisa

B. Anti-HCV in anti-TP pozitivnih krvodajalcev je bilo v povprečju do 2 letno, le leta 2007

je poraslo na 4.

Stran 46

4 RAZPRAVA Na težave pri zadostni preskrbi s krvjo močno vplivajo družbeno-ekonomske in socialne

spremembe, potrebe po krvi pa naraščajo. S planiranimi krvodajalskimi akcijami ne

zadostimo vsem potrebam po krvi. Največje pomanjkanje krvi se kaže v času poletnih in

zimskih dopustov. V tem obdobju večje količine krvi zagotovimo z individualnim klicanjem

krvodajalcev. Ravno tako nismo najbolj uspešni pri pridobivanju novih krvodajalcev, saj

število le teh upada. V letih od 2003-2007 je prvič darovalo kri povprečno 15,1%

krvodajalcev. V pridobivanju novih krvodajalcev smo primerljivi z ostalimi Evropskimi

državami, kjer imajo letno okrog 15% novih krvodajalcev. Nujno je pristopiti k drugačnemu

in bolj učinkovitemu načinu organizacije krvodajalstva. Pristopi, ki so bili učinkoviti v

preteklosti, ne ustrezajo današnjemu k individualnosti usmerjenemu človeku.

Transfuzijska služba se bo morala čim boj približati krvodajalcu, da bo za darovanje krvi

izgubil čim manj časa. Za nadaljnje darovanje krvi moramo motivirati že sedaj redne

krvodajalce, saj je največ tistih, ki kri darujejo le 1-krat letno. Leta 2007 je bilo takšnih

krvodajalcev 64% (7).

Poleg ukrepov, s katerimi bi povečali število darovalcev krvi, pa moramo zagotoviti, da bo

kri varna, kar pomeni, da le ta pri prejemniku ne povzroča neželenih učinkov. To

dosežemo z učinkovitim osveščanjem ljudi o pomenu zdravega načina življenja in

možnostih prenosa okužb s krvjo, dobro izbiro krvodajalca in presejalnim testiranjem.

Metoda testiranja je Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). ELISA je biokemična

tehnika uporabljena največkrat v imunologiji za dokazovanje prisotnosti antigenov ali

protiteles v serumu ali plazmi. ELISA testi so bolj občutljivi in bolj specifični, hkrati pa tudi

varnejši testi za izvajalca od prej uporabljenih Radioimmune Assays (RIA) testov. Prvi

ELISA testi so uporabljali poliklonska protitelesa. Vsaka enota krvi je v Centru za

transfuzijsko medicino (CTM) Maribor testirana z najnovejšimi testi, ki so trenutno na

tržišču. To so testi tretje oziroma četrte generacije, pri katerih uporabljamo specifična

monoklonska protitelesa označena z encimi. Z uporabo monoklonskih protiteles se je

močno povečala specifičnost in občutljivost diagnostičnih testov in se skrajšalo

diagnostično okno. Diagnostično okno z reagenti tretje generacije za hepatitis B površinski

antigen (HBsAg) znaša 59 dni, za protiteles proti hepatitis C virusu (anti-HCV) z reagenti

Stran 47

tretje generacije 82 dni. Protitelesa proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti (anti-

HIV) in antigene HIV p24 dokazujemo od maja 2006 s testi četrte generacije, diagnostično

okno je 15-16 dni. Od konca leta 2002 uporabljamo encimski test za dokazovanje

protiteles proti bakteriji Treponema pallidum (anti-TP), diagnostično okno je 11 dni. Prej

smo uporabljali hemaglutinacijski test, ki se je izvajal ročno. Vsi testi se izvajajo

popolnoma avtomatizirano, da se čimbolj izognemo možnim človeškim napakam in tako

še povečamo varnost transfuzije. Ves postopek testiranja je dokumentiran. Absolutne

varnosti ni moč doseči. Po podatkih literature ostaja po vseh testiranjih tveganje prenosa

virusa hepatitisa C 1:5000, hepatitisa B 1:20.000 -50.000 in HIV 1:500.000-1.000.000

transfuzij (11).

V obdobju od 2003-2007 smo opazili porast okužbe z virusom hepatitisa C in z bakterijo

Treponema pallidum. Okuženih z virusom hepatitisa C je bilo več med novimi krvodajalci.

Porast okužbe s Treponema pallidum je dober pokazatelj načina življenja in opozarja na

tvegano vedenje krvodajalcev. Največ okuženih krvodajalcev je bilo v petletnem obdobju z

virusom hepatitisa B, 19 od skupno 125865 testiranih enot krvi. Po podatkih svetovne

zdravstvene organizacije letno zboli za hepatitisom B okoli 5 milijonov ljudi. Incidenca je

odvisna od stopnje razvitosti države, v Evropi znaša 20 ljudi na 100 000 prebivalcev (22).

Leta 2005 smo odkrili dva krvodajalca okužena z virusom HIV. Zaskrbljujoče je bilo

spoznanje, da sta oba pred tem že darovala kri. Lahko bi prišlo do prenosa okužbe s

transfuzijo krvi v obdobju diagnostičnega okna, vendar so vse nadaljnje analize to skrb

ovrgle.

Stran 48

5 SKLEP Kri je zdravilo, ki ga ni moč nadomestiti z drugimi pripravki. Analiza podatkov v zadnjih

petih leti je pokazala upad števila novih krvodajalcev. Povečane potrebe po krvi nam

narekujejo, da je potrebno sprejeti nove ukrepe v pridobivanju novih krvodajalcev in

ustrezna motivacija že rednih krvodajalcev.

Porast okužbe z virusom hepatitisa C in z bakterijo Treponema pallidum nam narekuje

povečano skrb pri pravilni izbiri krvodajalcev in zdravstveni vzgoji le teh. Število okuženih

krvodajalcev z virusom hepatitisa B in C je bilo večje med novimi krvodajalci, pozitivnih

krvodajalcev na HIV in sifilis pa je bilo več med rednimi krvodajalci. Najverjetneje je bilo

petletno obdobje prekratko, da bi lahko z gotovostjo trdili, da so novi krvodajalci manj

varni krvodajalci.

Stran 49

6 LITERATURA

1. Glonar L. Zgodovina transfuziologije. Zbornik predavanj za transfuzijski tečaj. Ljubljana:Zavod RS za transfuzijo krvi, 1995.

2.

Dobnik K.Najpogostejše etične dileme pri transfuziji krvi. Diplomsko delo. Maribor, 2004:9-11.

3.

Keuc M.Racionalizacija v organizaciji krvodajalske službe. Diplomsko delo. Maribor, 2002:6-8.

4. Urlep-Šalinović V. 50 let transfuzijske medicine v Mariboru.V:Urlep-Šalinović V.Strokovno srečanje ob 50-letnici Oddelka za transfuziologijo in imunohematologijo,3.-4. december 1999, Maribor:Splošna bolnišnica Maribor, 1999:19-26.

5. Vuksan M.Krvodajalstvo. Zbornik predavanj za transfuzijski tečaj. Ljubljana:Zavod RS za transfuzijo krvi, 1995.

6. Bricl I., Lmapreht N. Življenje teče: letno poročilo transfuzijske službe v Sloveniji za leto 2005. Ljubljana: Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, 2006.

7. Potočnik M., Jeras M. Življenje teče: letno poročilo transfuzijske službe v Sloveniji za leto 2007. Ljubljana: Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, 2008.

8. Lukić L. Transfuziologija. Zbornik predavanj za transfuzijski tečaj. Ljubljana: Zavod RS za transfuzijo krvi, 1995.

9.

Potočnik M. 50 let organizirane transfuzijske službe v Sloveniji: 1945-1995. Ljubljana: Zavod republike Slovenije za transfuzijo krvi, 1995:19-22.

10. Lukić L.,Lampreht N. Poročilo o pripravi, uporabi in zagotavljanju kakovosti komponent krvi. Ljubljana:Svet Evrope, Zavod republike Slovenije za transfuzijsko medicino, IDC Sveta Evrope-NUK Ljubljana, 2002.

11. Urlep-Šalinović V., Jelatancev B. Izbira krvodajalcev in varnejša transfuzija krvi. Zdrav Vestn, 2000,69,257-259.

12. Maračić I. Izbira krvodajalca in varna transfuzija. V: Urlep-Šalinović V. Zbornik za organizatorje krvodajalstva. Splošna bolnišnica Maribor,Maribor, 2005:51-57

13. Gregorc C. Zdravstvena vzgoja krvodajalcev.V: Dobra transfuzijska praksa, Radenci, 1999:17-24.

14. Levičnik-Stezinar S., Presejalno testiranje krvi za transfuzijo na prisotnost virusnih markerjev.V: Dejavnosti v transfuzijski medicini, 33.strokovni seminar,1.-12. oktober 1996, Zreče: Sekcija medicinskih sester za anesteziologijo, intenzivno nego in terapijo ter transfuziologijo, 1996.

15. Majcen-Vivod B.Spremljanje prenosa hepatitisov A, B in C s krvjo v SB Maribor v triletnem obdobju od 1996 do 1998. Specialistična naloga. Maribor 2000:1-2.

16. Iršič I.Pozitivni rezultati na virusne označevalce in sifilis v CTM Maribor. Knjiga povzetkov 3.kongresa hematologov in transfuziologov Slovenije z mednarodno udeležbo. Podčetrtek, 2008.

17. Thomas L. Immunochemical technics.V: Clinical laboratory diagnostics. Use and Assessment of Clinical Laboratory Results.Frankfurt/Main: TH-Books-Verl.-Ges.,1998. str.1427-1440

Stran 50

18. Marin J. Posredno dokazovanje virusov. V:Koren S. Splošna medicinska virologija. Ljubljana: Medicinski razgledi, 1998,119-127.

19. Berkeš I., Tomašević-Berkeš P. Opšta i medicinska enzimologija. Beograd-Zagreb: Medicinska knjiga, 1975

20. Vozelj M. Merjenje in uporaba protiteles. V: Železnik T.Temelji imunologije.Ljubljana: DZS,2000,91-120.

21. J. R. Crowther, ELISA I Principles, Joint FAO/IAEA Division Vienna, 1995 [dostop: 13. oktober 2008]. < www-naweb.iaea.org/nafa/aph/public/ras-ai-elisai.pdf>.

22. Gobec L., Šepec P. Predavanje Virusni hepatitis. Oddelek za laboratorijsko diagnostiko. Splošna bolnišnica Celje, 2008.

23. Coppola R.C., Rizzeto M., Bradley D.W.Hepatitis B. V:Crivelli O. Viral hepatitis handbook. Atlanta itd: Sorin Biomedica Diagnostica S.p.A.,1996,27-54.

24. Majcen Vivod B., Urlep-Šalinović V. Prevalenca hepatitisov A in B pri krvodajalcih z anamnezo zlatenice. Zdrav Vestn, 2004, 73, 227-230.

25. Dade Behring Marburg GmbH, Navodila proizvajalca za test Enzygnost HBsAg 5.0. Dade Behring Inc. Newark, DE 19714 U.S.A.,2003

26. Abbott, Navodila proizvajalca za test HBsAg (V2). Abbott Diagnostics Division, Germany, 2005.

27. Ortho-Clinical Diagnostics, Navodila proizvajalca za test Ortho HCV 3.0 ELISA Test System with Enhanced SAVe, OCD UK, 2003.

28. Abbott, Navodila proizvajalca za test HCV version 3.0. Abbott Diagnostics Division, Germany, 2006.

29. Dade Behring Marburg GmbH, Navodila proizvajalca za test Enzygnost HIV Integral II. Dade Behring Inc. Newark, DE 19714 U.S.A.,2004

30. Abbott, Navodila proizvajalca za test HIV Ag/Ab Combo. Abbott Diagnostics Division, Germany, 2006.

31. Dade Behring Marburg GmbH, Navodila proizvajalca za test Enzygnost Syphilis. Dade Behring Inc. Newark, DE 19714 U.S.A.,2005

32. Breskvar M. Računalniško podprt informacijski sistem v transfuziologiji. Zbornik predavanj za transfuzijski tečaj. Ljubljana:Zavod RS za transfuzijo krvi, 1995.

33. Urlep-Šalinović V., Težave pri preskrbi s krvjo. V:Urlep-Šalinović V. Zbornik za organizatorje krvodajalstva. Splošna bolnišnica Maribor,Maribor, 2005: 9-17.

34. Jukić I.,Odabir davatelja-ključ sigurnog transfuzijskog lječenja. V: Golubić B. Klinička transfuziologija:lječenje eritrocitnim krvnim pripravcima. Zavod za kliničku transfuziologiju, Klinički zavod za laboratorijsku diagnostiku, Zagreb, 2002.