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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ELISA DALMORA MÜLLER
ANÁLISE DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO E
MUTAGÊNICO DE EXTRATOS E SUBSTÂNCIAS OBTIDAS
DE DIFERENTES ESPÉCIES DE Piper
Itajaí, 2011
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS
SINTÉTICAS BIOATIVAS
ELISA DALMORA MÜLLER
ANÁLISE DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO
E MUTAGÊNICO DE EXTRATOS E SUBSTÂNCIAS OBTIDAS
DE DIFERENTES ESPÉCIES DE Piper
Projeto de pesquisa submetido ao Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
Orientador: Alexandre Bella Cruz Co-orientador: Ângela Malheiros
Itajaí, fevereiro de 2011
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ANÁLISE DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO
E MUTAGÊNICO DE EXTRATOS E SUBSTÂNCIAS OBTIDAS
DE DIFERENTES ESPÉCIES DE Piper
ELISA DALMORA MÜLLER
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
_____________________________________________
Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora
Coordenadora do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Doutor Alexandre Bella Cruz (Univali)
Presidente
____________________________________
Doutora Angela Malheiros (Univali)
Co-orientador
______________________________________
Doutora Christiane Meyre da Silva Bittencourt (Univali)
Membro
______________________________________
Doutor Obdulio Gomes Miguel (UFPR)
Membro Externo
Itajaí (SC), fevereiro de 2011
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Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus por ter me iluminado nos momentos difíceis
e me acompanhado nesta caminhada.
Ao meu orientador professor Dr. Alexandre Bella Cruz e a minha co-
orientadora professora Dra. Angela Malheiros, por serem exemplos, pela amizade e
paciência e principalmente por acreditarem em mim e me guiarem por este caminho
que foi longo e não foi fácil, meus sinceros agradecimentos.
Á professora Dra. Christiane Meyre da Silva Bittencourt, pela participação na
Banca de Qualificação, trazendo contribuições importantes para o crescimento e
concretização do trabalho.
Á professora Dra. Ednéia Casagranda Bueno pela participação na banca de
qualificação com considerações importantes na finalização deste estudo.
Ao professor Dr. Rilton Alves de Freitas pelo auxilio e dedicação nos
ensinamento com os teste in vivo.
À todos os professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas
pelos ensinamentos transmitidos nesta jornada.
À minha família, meus pais, minha irma e meu namorado, pelo carinho e
incentivo, por estarem sempre comigo com a palavra certa no momento certo e
principalmente pela paciência, muito necessária em certos momentos.
Aos meus amigos que estavam presentes nos momentos de descontração
principalmente minha colega de mestrado e grande amiga Priscila Martins não
somente pelos momentos de alegria, mas principalmente pelos conselhos e por
estar sempre presente quando precisei.
Por fim agradeço a coordenação do Mestrado de Ciências Farmacêuticas da
UNIVALI por ter proporcionado a realização deste trabalho.
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ANÁLISE DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO
E MUTAGÊNICO DE EXTRATOS E SUBSTÂNCIAS OBTIDAS
DE DIFERENTES ESPÉCIES DE Piper
Elisa Dalmora Müller
Fevereiro/ 2010 Orientador: Alexandre Bella Cruz, Dr. Co-orientadora: Ângela Malheiros, Dr. Area de Concentração: Microbiologia Número de Páginas: 82
As doenças infecciosas são hoje uma das principais causas de morte em todo o mundo.
Tanto o surgimento de doenças infecciosas emergentes quanto o problema da resistência microbiana
tem impulsionado a pesquisa por novos agentes antimicrobianos. As plantas medicinais vêm sendo
usadas pelas suas propriedades curativas há milhares de anos. A partir dessa utilização estudos
científicos propiciaram o descobrimento de propriedades benéficas e nocivas de cada planta, e a
comprovação científica da ação terapêutica dessas, tem propiciado um aumento no consumo ao
longo do tempo. Dentre as diversas plantas com potencial terapêutico se incluem aquelas da família
Piperaceae. Por esse motivo, o objetivo dessa pesquisa foi analisar a atividade antimicrobiana
através do ensaio de Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Bactericida Mínima (CBM)
e Concentração Fungicida Mínima (CFM), o potencial de citotoxicidade e toxicidade aguda através
dos ensaios com Artemia salina e de dose-fixa e mutagenicidade através do ensaio com
Sacharomyces cerevisiae e micronúcleo dos extratos de Piper cernuum, P. amplum, P. aduncum,
Piper 4 e Piper 5 e das substâncias isoladas da P. aduncum, (3-(1’-oxo-3’-metil-2’-butenil)-4-
hidroxibenzoato de metila, (éster metílico do ácido 2,2-dimetil-6-carboxicroman-4-ona), (3-(1’-oxo-3’-
metil-2’-butenil)-4-metoxibenzoato de metila) e (2’,6’-diidroxi-4’-metoxi-dihidrochalcona). No ensaio
bioautográfico tanto os extratos como as substâncias isoladas demonstraram halos de inibição contra
a cepa de S. aureus. Já no ensaio da CIM os extratos que apresentaram os melhores resultados
foram o Piper 4 contra S. epidermides, B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus, e os extratos da Piper
aduncum, e da Piper 5 que foram ativos contra os mesmos micro-organismos citados acima além do
S. pyogens. No teste realizado contra os fungos os melhores resultados ficaram para os extratos da
P. aduncum e Piper 5 que foram ativos contra C. albicans e C. parapsilosis. Com relação a
citotoxicidade frente a Artemia salina todos os extratos e substâncias apresentaram concentrações
menores que 1000 μg/mL sendo assim considerados citotóxicos. Porém no ensaio in vivo de
toxicidade aguda e nos ensaios de mutagenicidade os extratos testados não demonstraram potencial
tóxico ou mutagênico.
Palavras-chave: Atividade antimicrobiana. Piper. Mutagenicidade, Citotoxicidade e Toxicidade aguda.
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ANALYSIS OF ANTIMICROBIAL, CYTOTOXIC AND MUTAGENIC POTENCIAL OF EXTRACTS AND SUBSTANCES OBTEINED OF
DIFERENT SPECIES OF Piper
Supervisor: Alexandre Bella Cruz, Dr. Co-supervisor: Ângela Malheiros, Dr. Area of Concentration: Microbiology Number of Pages: 82
The infectious diseases are now one of the major causes of death in all over the world. The
appearance of emerging infectious diseases and the problem of microbial resistance has driven the
research for new antimicrobial agents. A thousand of years the medicinal plants has been used by
your properties of healing. From this utilization scientific studies has discovered the beneficial and
harmful properties of each plant, and the scientific proof of the therapeutic action has led to an
increase in their consumption over time. Among the several plants with therapeutic potential are
include the Piperacea family. For this reason the objective of this research was to analyze the
antimicrobial activity through the test of minimal inhibitory concentration (MIC), minimal bactericidal
concentration (MBC) and minimal fungicidal concentration (MFC), the citotoxic and acute toxicity
through the test with Artemia salina and fixed-dose, and mutagenicity through the test with
Sacharomyces cerevisae and micronucleus of the extracts of Piper cernuum, P. amplum, P. aduncum,
Piper 4 and Piper 5, and of the isolated substances of P. aduncum (3-(1’-oxo-3’-methyl-2’-butenyl)-4-
hydroxybenzoate of methyl, (ester methylic of acid 2,2-dimethyl-6-carboxycroman-4-ona), (3-(1’-oxo-
3’-methyl-2’-butenil)-4-metoxybenzoate of methyl) and (2’,6’-dihydroxy-4’-metoxy-dihydrochalcone). In
the bioautographic test, such the extracts as the isolated substances have showed inhibition against
S. aureus. In the MIC test, the extracts that showed the best results was the Piper 4 against S.
epidermides, B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus, and the extracts of P. aduncum and Piper 5 that
has showed activity against the same microorganisms aforesaid and S. pyogens. In the test performed
with de fungi the best results was of the P. aduncum and Piper 5 extracts that showed activity against
C. albicans and C. parapsilosis. In relation to cytotoxicity against Artemia salina, all the extracts and
isolated substances showed lower concentration than 1000 μg/mL, thus considerate cytotoxic. In in
vivo teste of acute toxicity and mutagenicity the extracts that were tested don’t demonstrate toxic
potencial or mutagenic.
Keyword: Antimicrobial activity. Piper. Mutagenicity, Cytotoxicity and Acute toxicity.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Piper cernuum (Piperaceae) ....................................................... 26
Figura 2 Piper amplum (Piperaceae).......................................................... 27
Figura 3 Piper adundum (Piperaceae)........................................................ 27
Figura 4 Processo de formação de micronúcleo na divisão celular............ 34
Figura 5 Processo da avaliação da atividade antimicrobiana..................... 41
Figura 6 Esquema da metodologia do ensaio de mutagenicidade com
Sacharomyces cerevisae.............................................................
46
Figura 7 Esquema de obtenção das células para o teste de micronúcleo. 47
Figura 8 Placa de CCD revelada com UV sendo P. cernuum (1), P.
amplum (2), Piper 4 (3), P. aduncum (4), Piper 5 (5)....................
49
Figura 9 Placa bioautográfica revelada com TTC, sendo P. cernuum (1),
P. amplum (2), Piper 4 (3), P. aduncum (4), Piper 5 (5)................
49
Figura 10 Placa de CCD revelada com UV sendo P. aduncum (1),
Taboganto de metila (2), Cromanona (3), Metóxi-Taboganto de
metila (4), Myrigalona G (5)..........................................................
49
Figura 11 Placa bioautográfica revelada com TTC sendo P. aduncum (1),
Taboganto de metila (2), Cromanona (3), Metóxi-Taboganto de
metila (4), Myrigalona G (5)..........................................................
49
Figura 12 Cortes histológicos do fígado dos ratos tratados com P.
aduncum (A), Piper 4 (B), Piper 5 (C) e salina (D), corados com
hematoxilina/eosina e observados em microscópio Olympus em
400x..............................................................................................
62
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Atividade biológica de diversas espécies de Piper........................ 24
Tabela 2 Estruturas das substâncias isoladas da P. aduncum..................... 38
Tabela 3 Atividade antimicrobiana dos extratos e substâncias de Piper
frente a três micro-organismos......................................................
52
Tabela 4 Atividade antimicrobiana dos extratos e substâncias das 5
espécies de Piper frente à bactérias Gram – positivas..................
56
Tabela 5 Atividade antifúngica dos extratos e substâncias das 5 espécies
de Piper..........................................................................................
57
Tabela 6 Toxicidade dos extratos e substâncias frente a Artemia salina...... 59
Tabela 7 Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por
deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na
linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae,
após o tratamento com os extratos de P. amplum e P. cernuum...
64
Tabela 8 Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por
deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na
linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae,
após o tratamento com os extratos de P. aduncum e Piper 4........
65
Tabela 9 Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por
deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na
linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae,
após o tratamento com o extrato de Piper 5.................................
66
Tabela 10 Indução de micronúcleo em roedores............................................ 67
9
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC – American Type Culture Collection
ATP – Adenosina Trifosfato
AIDS – Adquired Imunodeficiency Syndrome (Síndrome da Imonodeficiência
Adquirida)
CBM – Concentração Bactericida Mínima
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CDC – Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos
CFM – Concentração Fungicida Mínima
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CL50 – Concentração Letal 50%
DL50 – Dose Letal de 50%
DMSO – Dimetilsulfóxido
FDA – Food and Drugs Administration
GHS – Sistema de Classificação Globalmente Harmonizado de Substâncias
Químicas e Misturas
LDL – Low Densinty Lipoprotein
MMS - Metilmetanosulfonato
MN - Micronúcleo
NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards
OMS – Organização Mundial da Saúde
SC – Meio Minimo Completo
TTC – Cloreto 2,3,5 Trifenil Tetrazólico
UNIVALI – Universidade do Vale do Itajaí
UV – Ultra - Violeta
4 – NQO – Nitroquinoleína-1-Óxido
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................
12
2.OBJETIVO....................................................................................................... 14 2.1 Objetivo geral................................................................................................ 14 2.2 Objetivo Específico.......................................................................................
14
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................ 15 3.1 Doenças Infecciosas..................................................................................... 15 3.2 Plantas Medicinais........................................................................................ 19 3.2.1 Família Piperaceae e o gênero Piper......................................................... 22 3.2.2 Piper cernuum............................................................................................ 25 3.2.3 Piper amplum............................................................................................. 26 3.2.4 Piper aduncum........................................................................................... 27 3.3 Toxicidade..................................................................................................... 29 3.3.1 Citotoxicidade frente a Artemia salina........................................................ 30 3.3.2 Toxicidade aguda....................................................................................... 31 3.3.3 Mutagenicidade sobre Sacharomyces cerevisae....................................... 32 3.3.4 Teste do micronúcleo.................................................................................
34
4 MATERIAL E MÉTODO................................................................................ 36 4.1 Material Vegetal............................................................................................. 36 4.2 Extratos e Substâncias................................................................................. 36 4.3 Material Microbiológico................................................................................. 38 4.4 Preparo dos inóculos..................................................................................... 39 4.4.1 Bactérias.................................................................................................... 39 4.4.2 Fungos....................................................................................................... 39 4.5 Bioautografia................................................................................................. 40 4.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM).............................. 40 4.7 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Fungicida Mínima (CFM).....................................................................................................
42
4.8 Ensaio de toxicidade com Artemia salina..................................................... 42 4.9 Ensaio de toxicidade aguda “in vivo”............................................................ 43 4.9.1 Animais....................................................................................................... 43 4.9.2 Ensaio toxicológico dose-fixa..................................................................... 43 4.9.3 Analise histológica...................................................................................... 43 4.9.3.1 Desidratação........................................................................................... 44 4.9.3.2 Clareamento Fixação e Coloração.......................................................... 44 4.10 Ensaio com Saccharomyces cerevisiae...................................................... 44 4.11 Ensaio do micronúcleo “in vivo”................................................................... 46 4.11.1 Obtenção das células............................................................................... 46 4.11.2 Análise das lâminas..................................................................................
47
5 RESULTADO E DISCUSSÃO.......................................................................... 48 5.1 Bioautografia................................................................................................. 48 5.2 Atividade Antibacteriana................................................................................ 50 5.3 Atividade Antifúngica..................................................................................... 57
11
5.4 Toxicidade em Artemia salina........................................................................ 58 5.5 Toxicidade aguda.......................................................................................... 60 5.6 Analise histológica......................................................................................... 61 5.7Ensaio de mutagenicidade frente ao Sacharomyces cerevisae..................... 62 5.8Teste do micronúcleo.....................................................................................
67
6 CONCLUSÕES................................................................................................
68
7 REFERÊNCIA .................................................................................................
70
8 ANEXOS.......................................................................................................... 80
12
1 INTRODUÇÃO
A incidência de doenças infecciosas no mundo vem aumentando em um ritmo
acelerado, algumas destas ressurgindo como emergentes. O comércio e a
circulação mundial rápida de pessoas, animais, plantas, mercadorias e micro-
organismos (vírus, bactérias, parasitas, fungos) contribuem para esse aumento em
escala global. Essa facilidade de transferência de infecções de uma região para
outra pode ser exemplificada pela existência da malária aeroportuária, pela
proliferação do Aedes aegypti e a disseminação da febre amarela no Brasil
procedente dos navios que atracavam nos portos brasileiros. Em países
desenvolvidos e em desenvolvimento as doenças infecciosas são responsáveis por
mais de 25% de todas as mortes (GRISOTI, 2010; MIMS et al., 2005).
Outro grave problema frente às infecções é a resistência de patógenos diante
do uso irracional de antimicrobianos. Esse fator, aliado ao aumento da incidência de
infecções, impulsionam a pesquisa por novos agentes com atividade antimicrobiana.
Uma das alternativas na busca de novos agentes antimicrobianos são os produtos
naturais como organismos marinhos, animais e plantas.
As plantas são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas,
muitas das quais constituem modelos para síntese de um grande número de
medicamentos. Um dos aspectos que distingue os produtos naturais dos sintéticos é
a diversidade molecular dos produtos naturais que é muito superior àquela derivada
dos processos de síntese, e que apesar dos avanços tecnológicos atuais ainda é
restrita. Esse fato possibilita que os compostos químicos encontrados nas plantas
possam vir a ser fármacos em potencial para as mais diferentes moléstias (NODARI;
GUERRA, 2000).
Várias plantas da flora brasileira são usadas na medicina natural, no
tratamento de doenças tropicais, incluindo infecções bacterianas. Por outro lado,
devido à possibilidade da existência de ação tóxica e ausência de indicação
adequada, as plantas medicinais são muitas vezes usadas de forma incorreta, não
produzindo o efeito desejado (PEREIRA et al., 2004). Ainda hoje faltam trabalhos
científicos que comprovem a eficácia no tratamento das enfermidades e recursos
para o isolamento de compostos ativos das plantas estudadas com vista a
transformá-los em medicamentos (SILVA et al., 2002).
13
Desta forma se faz necessário o desenvolvimento de novos fármacos com
atividade antimicrobiana, por isso o presente projeto de pesquisa propõe avaliar a
atividade antimicrobiana, citotoxicidade, toxidade aguda e mutagenicidade de
diferentes espécies de Piper, uma espécie vegetal brasileira da Família Piperaeae.
14
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Analisar a atividade antimicrobiana e potencial de toxicidade e
mutagenicidade de extratos e substâncias obtidas de cinco espécies de Piper.
2.2 Objetivos específicos
Direcionar a pesquisa através de ensaios de bioautografia, na localização dos
componentes com potencial antimicrobiano.
Avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica de extratos e substâncias obtidas.
Avaliar a toxicicidade dos extratos e substâncias sobre o microcrustáceo Artemia
salina.
Analisar a toxicidade aguda dos extratos através da metodologia de dose fixa em
ratos.
Avaliar a mutagenicidade dos extratos empregando a levedura Sacharomyces
cerevisiae.
Analisar a mutagenicidade dos extratos, em células de medula utilizando ensaio
de micronúcleo.
15
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Doenças Infecciosas
A infecção é causada por micro-organismos que liberam toxinas ou invadem
os tecidos do corpo, ela ocorre através de uma complexa interação entre o
patógeno, o hospedeiro e o meio ambiente, sendo causada principalmente por
bactérias, vírus, fungos, protozoários e helmintos (HEMAISWARYA; KUTHIVENTI;
DOBLE, 2008; KANG; CROGAN, 2009). A infecção pode ser causada de forma
endógena ou exógena. Aquelas cujo agente atinge o hospedeiro através de um
reservatório ou fonte externa é considerada exógena, enquanto que as causadas por
agentes da microbiota normal do próprio hospedeiro são classificadas como
endógenas (TRABULSI et al., 2005).
As bactérias são organismos unicelulares. Foram identificadas pela primeira
vez após a invenção do microscópio, por Van Leeuwenhoek, por volta de 1670.
Porém a possibilidade destes micro-organismos serem os causadores dos
processos infecciosos ocorreu somente no século XIX através de experimentos de
Luis Pasteur. A pesquisa revelou que algumas linhagens de bactérias eram
importantes para o processo de fermentação e também que as bactérias tinham
ampla distribuição no meio ambiente, bem como Robert Koch entre outros, que
identificaram micro-organismos responsáveis por doenças como a tuberculose, a
cólera e a febre tifóide. Nessa época, as pesquisas eram conduzidas na busca de
agentes químicos que apresentassem atividade antimicrobiana (GUIMARÃES;
MOMESSO; PUPO, 2010).
Existem quatro tipos distintos de micro-organismos infecciosos que são
classificados a seguir (MIMS et al., 2005):
Micro-organismos com mecanismos específicos para fixação e penetração nas
superfícies corporais de hospedeiros saudáveis (a maioria dos vírus e algumas
bactérias).
Micro-organismos introduzidos por artrópodes vetores (malaria, peste, tifo, febre
amarela).
Micro-organismos introduzidos em hospedeiros saudáveis através de mordedura
de animais (Clostridia, vírus da raiva).
16
Micro-organismos capazes de infectar um hospedeiro saudável exclusivamente
quando as defesas de superfície ou sistêmicas encontram-se deficitárias como
ocorre com queimaduras, inserção de corpos estranhos (cânulas e cateteres),
infecção do trato urinário em homens (cálculo, hipertrofia de próstata),
pneumonia bacteriana após dano viral (pós-influenza), ou imunocomprometido
como no caso de fármacos imunossupressores ou doenças como a
Imunodeficiência adquirida (AIDS).
É importante ressaltar que nem todos os micro-organismos causam
enfermidades, e para que a infecção seja estabelecida, é necessário que o agente
causador primeiramente penetre no corpo do hospedeiro. O acesso ao corpo
humano é dificultado pelas suas barreiras naturais, que são a pele, o muco, o
epitélio ciliado e algumas secreções que produzem enzimas. Porém pode ocorrer
destruição destas barreiras proporcionando uma porta de entrada para estes micro-
organismos (MURRAY et al., 2002; LEVINSON; JAWETZ, 2005).
Para que a infecção de fato ocorra é necessário que o patógeno e o
hospedeiro estejam em contato freqüente, e que esse contato resulte na reprodução
do parasita dentro do hospedeiro. Ainda para que essa infecção se torne uma
doença é necessário que o patógeno se multiplique e cause sintomas (PONTIER et
al., 2009).
O aparecimento de uma infecção não depende apenas de fatores intrínsecos,
como idade, estado imunológico, estresse, e alguns fatores genéticos, mas também
de fatores ambientais como temperatura e umidade (PONTIER et al., 2009).
O aumento na exploração dos sistemas naturais, que ocorre principalmente
nas práticas agrícolas, processos de urbanização, e no remanejamento dos recursos
hídricos, faz com que ocorram mudanças na disponibilidade e distribuição geográfica
de hospedeiros, vetores e espécies de parasitas, ocasionando novos sistemas de
patógeno/hospedeiro e novas doenças (PONTIER et al., 2009).
Segundo publicações dos Centros de Controle de Doenças dos Estados
Unidos (CDC), doenças infecciosas emergentes podem ser definidas como
infecções que têm aparecido recentemente em uma população ou que já existiam,
mas têm aumentado rapidamente em incidência e alcance geográfico. Essas
doenças podem ocorrer pelo reconhecimento do caráter não-detectável de uma
infecção que já estava presente na população, pela introdução do agente etiológico
17
em outras espécies ou como uma variante de uma infecção humana já existente.
Outros motivos apontados são: alterações climáticas, conjunto de atividades
humanas que atingem direta ou indiretamente o ambiente, destacando o
crescimento e assentamento populacional e o uso indiscriminado de antibióticos
(GRISOTTI, 2010).
Outra causa do reaparecimento de algumas doenças infecciosas são os
desastres naturais, que através de um sinergismo de fatores favorece a mortalidade
e a morbidade causada por doenças tratáveis. Os principais fatores causadores
dessas doenças em situações como estas são a falta de higiene, machucados que
podem causar tétano, infecções por S. aureus, leptospirose, e infecções causadas
por comida e água contaminada (LIGON, 2006).
Os antibióticos, classificados como substâncias químicas produzidas por
organismos vivos, inibem o crescimento de micro-organismos patogênicos ou não
(FONSECA, 1999). Estas substâncias são empregadas há mais de 3000 anos,
quando ainda eram usados de maneira empírica. Somente a partir do século XVI os
fármacos medicinais passaram a ser obtidos por métodos laboratoriais. Nesta
mesma época foi isolada a primeira substância com ação antimicrobiana, a quinina,
usada sob a forma de pó da casca da Cinchona no tratamento de febres
(TAVARES,1994).
A descoberta da penicilina foi descrita em 1929, porém foi introduzida como
agente terapêutico somente em 1940, com a industrialização da penicilina e em
conseqüência da Segunda Guerra Mundial foi observado um rápido crescimento na
descoberta e desenvolvimento de novos antibióticos (GUIMARÃES; MOMESSO;
PUPO, 2010).
Através disso houve uma expectativa de erradicação das doenças
infecciosas, com o declínio de algumas doenças como tuberculose, difteria, febre
amarela, varíola, tifo e sífilis, porém não foi atingido êxito total. Durante algum tempo
acreditou-se que a humanidade aumentaria sua expectativa de vida e venceria a
guerra contra os micro-organismo, houve uma época em que as doenças crônico
degenerativas deslocaram as doenças infecciosas do primeiro lugar de mortalidade
mas isso logo mudou principalmente com o aparecimento da AIDS. A separação
entre doenças crônicas e doenças infecciosas também passou a ser questionada
levando em consideração que os micro-organismos (vírus, bactérias e parasitas)
18
poderiam estar na raíz de muitas doenças cardíacas, do Mal de Alzheimer,
esquizofrenia e até mesmo do câncer (GRISOTTI, 2010).
Com a descoberta de varias classes de antibióticos, muitas doenças que
antes devastavam a humanidade foram controladas, mas o seu uso indiscriminado
acabou desenvolvendo patógenos multi-resistentes aos referidos fármacos
(HEMAISWARYA; KUTHIVENTI; DOBLE, 2008). Desde o primeiro relato de
resistência ao Staphylococcus, este vem se tornando um sério problema de saúde
pública, com implicações econômicas, sociais e políticas que ultrapassaram a
barreira de países e etnias. As principais conseqüências da resistência microbiana
são a mortalidade levando em conta que as infecções resistentes são muito mais
fatais, a morbidade pois ocorre um prolongamento da doença aumentando as
chances do organismo resistente ser transmitido e o aumento do custo para o
tratamento pois geralmente são necessários fármacos de elevado custo.
Existem dois tipos de resistência, a natural e a adquirida. Na primeira,
qualquer indivíduo isolado da espécie, apresenta a resistência, isto é, por se tratar
de resistência inata, o perfil de resistência é encontrado em espécies isoladas em
qualquer local do mundo. Já na resistência adquirida, apenas algumas cepas a
apresentam justamente porque desenvolveram ao longo do tempo (TRABULSI et al.,
2005).
A resistência natural ocorre através de genes mutantes espontâneos, e a
adquirida é através da transferência de DNA através de transposons de uma
bactéria para outra. Os principais mecanismos deste tipo resistência são:
modificação no receptor ou sítio alvo da célula, degradação enzimática e
modificação do fármaco e redução da quantidade de fármaco dentro da célula
bacteriana (HEMAISWARYA; KUTHIVENTI; DOBLE, 2008).
Devido ao grande número de casos relacionados à resistência microbiana e
ao fato de uso indiscriminado de antimicrobianos ser um dos principais fatores
relacionados a esta resistência, em 2010 foi instalada uma nova norma da Vigilância
Sanitária descrita na RDC 44/2010, que dispõe sobre o controle de medicamentos à
base de substâncias classificadas como antimicrobianos, de uso sob prescrição
médica, isoladas ou em associação, podendo assim medicamentos que contenham
tais substâncias serem vendidos apenas com prescrição médica e receituário de
controle especial (Brasil, 2010).
19
A necessidade urgente por novos agentes antimicrobianos pode ser
justificada por diversas razões: doenças infecciosas são a maior causa de
mortalidade do mundo (WHO, 2008), altas taxas de resistência microbiana,
especialmente em ambientes hospitalares, o número de novos agentes
antimicrobianos aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) diminui a cada
ano, e a necessidade existente de agentes que atuem por mecanismos de ação
diferentes dos fármacos em uso (GUIMARÃES, 2010).
Como fontes para a obtenção de novos agentes antimicrobianos encontram-
se os produtos naturais, destacando-se as plantas superiores com suas riquezas de
moléculas biotivas.
3.2 Plantas Medicinais
Para a Organização Mundial da Saúde (OMS) a definição de planta medicinal
é “todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que
podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos
semi-sintéticos” (BULETIN OF THE WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1998).
A diferença entre planta medicinal e fitoterápico esta no fato de que o
fitoterápico elabora a planta para uma formulação específica. Segundo a Secretaria
de Vigilância Sanitária, em sua portaria no. 6 de 31 de janeiro de 1995, fitoterápico é
“todo medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se
exclusivamente matérias-primas vegetais com finalidade profilática, curativa ou para
fins de diagnóstico, com benefício para o usuário. É caracterizado pelo
conhecimento da eficácia e dos riscos do seu uso, assim como pela
reprodutibilidade e constância de sua qualidade. É o produto final acabado,
embalado e rotulado. Na sua preparação podem ser utilizados adjuvantes
farmacêuticos permitidos na legislação vigente. Não podem estar incluídas
substâncias ativas de outras origens, não sendo considerado produto fitoterápico
quaisquer substâncias ativas, ainda que de origem vegetal, isoladas ou mesmo suas
misturas” (JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005).
Os metabólitos secundários produzidos pelas plantas constituem uma enorme
fonte de substâncias bioativas. O interesse científico nestes metabólitos aumentou
com a busca por novos agentes terapêuticos de origem vegetal, aliado ao crescente
20
desenvolvimento da resistência dos micro-organismos aos antimicrobianos utilizados
atualmente (MBOSSO et al., 2010).
O uso de plantas medicinais como recurso terapêutico faz parte da evolução
humana. Há milhares anos elas vem sendo usadas sobre a forma de pós, tinturas,
chás e outras formulações (BALUNA; KINGHORN, 2005).
Através dessa utilização popular foi-se descobrindo as propriedades
benéficas e nocivas de cada planta, que muitas vezes curavam e outras produziam
efeitos colaterais graves ou ate matavam. Essas descobertas aconteciam de forma
empírica muitas vezes baseadas nas observações do efeito causado nos animais ao
ingerirem tais plantas. Um exemplo disto foram as observações religiosas sobre os
efeitos excitantes dos cafeeiros selvagens (Coffea arabica L.) nos herbívoros
domésticos que os tinham ingerido. A partir destas observações elas começaram a
fazer uso desses vegetais para aumentar o tempo de vigília a que eram submetidas
devido às suas piedosas ocupações (TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006).
No Brasil a utilização das plantas medicinais começou com os escravos
africanos que trouxeram consigo plantas que usavam em rituais religiosos e também
por suas propriedades curativas empiricamente descobertas. No entanto com o
desenvolvimento da indústria na elaboração de novos fármacos houve por parte da
população uma diminuição no uso das plantas medicinais, que foram substituídas
por fármacos sintéticos (TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006).
Os antibióticos foram, durante um tempo, logo após seu descobrimento,
considerados fármacos milagrosos, porém sua popularidade logo foi perdendo
espaço, levando em consideração que eles passaram a perder sua efetividade pela
resistência microbiana (SALEEM et al., 2010).
Com o passar dos anos além do problema da resistência os consumidores
foram se tornando cada vez mais exigentes e criteriosos em relação à qualidade dos
produtos consumidos procurando cada vez mais produtos de origem natural que
fossem menos agressivos ao organismo, somado a isso e através da comprovação
cientifica da ação terapêutica das plantas medicinais houve novamente um aumento
de seu consumo, justificado também pelo questionamento da população em relação
aos efeitos colaterais causados pelo uso abusivo e irracional dos medicamentos
sintéticos (PACKER; LUZ, 2007).
No Brasil, atualmente, as plantas medicinais são amplamente utilizadas como
remédios caseiros por habitantes rurais e urbanos, o que em parte pode ser
21
explicado pelo alto custo dos medicamentos industrializados (BRANDÃO et al.,
2008). Nas ultimas décadas, a quantidade de informações sobre o uso das plantas
presentes nas florestas tropicais tem aumentando. O Brasil possui uma enorme
biodiversidade e, além disso, uma grande quantidade de informações acumuladas
por pessoas que tem acesso direto a natureza e aos produtos de sua biodiversidade
(CARTAXO; SOUZA; ALBUQUERQUE, 2010).
O mercado mundial movimenta cerca de US$ 22 bilhões por ano. Em 2000 o
setor faturou US$ 6,6 bilhões nos Estados Unidos e US$ 8,5 bilhões na Europa. No
Brasil estima-se que o comércio de fitoterápicos seja da ordem de 5% do mercado
total de medicamentos, avaliado em mais de US$ 400 milhões. Dados obtidos pelo
Departamento de Comércio Exterior indicam que no Brasil em 1998 foram
exportadas oficialmente 2.842 toneladas de plantas medicinais, e que de 1999 para
2000 as vendas de fitoterápicos aumentaram 15% contra 4% dos medicamentos
sintéticos (TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006).
Metade dos extratos vegetais comercializados na Europa é consumido na
Alemanha (cerca de US$ 3,5 bilhões do total de US$ 7 bilhões) onde foi relatado que
desses extratos 66% são usados para tratar resfriados, 38% para gripe, 25% para
doenças do trato digestivo ou intestinal 25% para dores de cabeça, 25% para insônia
36% para úlcera estomacal 21% nervosismo 15% para bronquite, 15% para doenças
de pele e 15% para fadiga e exaustão (JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005).
O papel das plantas medicinais na busca e descoberta de novos fármacos
aumentou e tem se mostrado relevante, porém somente uma pequena porcentagem
(15%) das 250.000 a 350.000 espécies vegetais estimadas no mundo foi estudada
cientificamente causando ainda maior interesse nessa fonte de novos agentes
terapêuticos (MALHEIROS et al, 2010).
O Brasil é considerado um importante fornecedor de matéria-prima botânica
para o mercado de indústria farmacêutica internacional como exemplo de plantas
nativas brasileiras, que são usados quase exclusivamente por empresas
farmacêuticas internacionais pode-se citar, a Pilocarpina extraída das folhas do
jaborandi (Pilocarpus microphyllus, da família Rutaceae), o α-bisabolol, extraído da
madeira candeia (Eremanthus erythropappus, da familia Asteraceae), e a rutina,
obtida dos frutos da fava-d'anta (Dimorphandra mollis, da família Fabaceae)
(BRANDÃO et al., 2008).
22
Entre as classes de metabólitos secundários presentes nas plantas medicinais
que possuem ação antimicrobiana pode-se citar: os alcalóides, presentes por
exemplo no Allium neopolitanum que apresenta ação antimicrobiana de amplo
espectro, os acetilenos, as cumarinas, presentes comumente na família Rutaceae,
flavonóides e isoflavonoides, que são amplamente distribuídos entre várias espécies
de plantas, os iridóides, que estão distribuídos entre a família das dicotiledôneas, as
lignanas, os macrolídeos, os polipeptídeos que já tem utilização farmacêutica na
preservação, limpeza e desinfecção, as quinonas com a sua propriedade
bactericida, entre outros (SALEEM et al., 2010).
Apesar de todo o progresso da medicina, as doenças infecciosas continuam
sendo um grave problema de saúde pública, atingindo ainda mais países em
desenvolvimento, levando em consideração uma menor disponibilidade de
medicamentos, além da emergência de uma resistência microbiana generalizada,
como descrito anteriormente. Diante deste contexto a pesquisa por novos agentes
antimicrobianos precisa continuar e todas as possibilidades devem ser exploradas
incluindo os produtos naturais que são grandes fontes de agentes terapêuticos
inovadores (COS et al., 2006).
Dentre as diversas plantas com potencial terapêutico se incluem aquelas da
família Piperaceae.
3.2.1 Família Piperaceae e o gênero Piper
A família Piperaceae pertence a ordem das Piperales e esta classificada como
uma das mais antigas angiosperamas existentes. Possui mais de 1000 espécies
distribuídas pelo mundo em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil esta
representada por cinco gêneros, com destaque para a Piper e a Peperômia
(JUNQUEIRA, 2007; USIA, 2005; VANIN et al., 2008).
Esta família caracteriza-se por apresentar espécies arbustivas, eretas ou
escandentes, arvoretas, ou plantas herbáceas epifíticas, terrestres ou suculentas,
com caule nodoso, folhas pecioladas ou raramente sub-sésseis, e estípulas adnatas
ao pecíolo ou ausentes (ALBIERO et al, 2005).
Estudos realizados com espécies de Piper revelam uma variedade de
compostos pertencentes a diversas classes químicas, entre eles estão: alcalóides,
amidas, lignanas, neoglicanas, propenilfenóis, terpenos, esteróides, chalconas,
23
diidrochalconas, flavonas, flavanonas, kavapironas, piperolídeos, cromenos e
derivados de ácidos benzóicos (SENGUPTA; RAO, 1987; JENSEN; HANSEN;
BOLL, 1993; LAGO et al., 2005).
As espécies pertencentes ao gênero Piper são amplamente utilizadas na
medicina popular e entre as atividades biológicas citadas para este gênero e
descritas na Tabela 1 destacam-se: a atividade inseticida do extrato aquoso das
folhas e raízes da Piper aduncum sobre Aetaliun sp (SILVA et al., 2007). O efeito
ansiolítico causado pelas kavalactonas presentes na Kava kava (P. methysticum)
(ERNST, 2007). Atividade antiparasitária da P. longum contra Giardia lamblia (LEE,
2000) e Entamoeba histolytica (GHOSHAL; PRASAD; LAKSHMI, 1996). Efeito
antiespasmódico observado em P. auritum (MÍLIAN; TORRES; RODRÍGUES, 2001).
Estudos realizados com extratos e fracões de P. regnelli apresentaram
atividade antileishmania com ausência de efeitos tóxicos no hospedeiro
(NAKAMURA et al., 2006). O óleo essencial de P. amplum, P. arboreum, P. dilalatum,
P. goessii, P. hispidium, P. hoffmanseffianum, P. nigrum, P. gaudichaudianum, P.
guineense, P. molliconum, P. regnelli e P. cernuum apresentaram forte atividade
moluscicida contra Biomphalaria glabrata (NAVICKIENE et al., 2006).
Além das atividades citadas destaca-se a atividade antifúngica presente em
várias espécies desse gênero. Extrato de folhas de P. malacophyllum contendo
piperolídeos apresentaram atividade antifúngica contra Cladosporium
sphaerospermum e Cladosporium cladospurioides (LAGO et al., 2005). O extrato de
frações das folhas de P. regnelli apresentou atividade contra dermatófitos
(KOROISHI, 2008). Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum
foram fortemente inibidos por óleos essenciais de P. aduncum e P. tuberculatum
(NAVICKIENE et al., 2006).
24
Tabela 1: Atividade biológica de diversas espécies de Piper:
Atividade Biológica Espécie de Piper Referência
Atividade inseticida P. aduncum SILVA et al., 2007 Efeito ansiolítico P. methysticum ERNST, 2007
Atividade antiparasitária P. longum LEE, 2000; GHOSHAL; PRASAD; LAKSHMI, 1996
Efeito antiespasmódico P. auritum MÍLIAN; TORRES; RODRÍGUES, 2001
Atividade antileishmania P. regnelli NAKAMURA et al., 2006
Atividade antifúngica P. malacophyllum P. tuberculatum
P. aduncum P. regnelli
LAGO et al., 2005 (KOROISHI, 2008
NAVICKIENE et al., 2006
Atividade antibacteriana P. regnelli P. cernuum P. aduncum
HOLETZ et al.,2002; ZAIDAN, 2005
A atividade antibacteriana é também muito explorada em plantas deste
gênero, estudos demonstraram que o extrato hidroalcóolico de P. regnelli inibe
consideravelmente as bactérias Gram – positivas, Staphylococcus aureus e Bacillus
subtilis, e apresenta uma moderada atividade contra a bactéria Gram–negativa
Pseudomonas aeruginosa (HOLETZ et al., 2002). O extrato de P. sarmentosum e o
óleo essencial de P. cernuum e P. regenelli demonstram potencial antibacteriano
contra a bactéria Gram – positiva S. aureus (ZAIDAN, 2005).
Uma das substâncias isoladas do gênero Piper e utilizadas neste trabalho foi
a 2’,6’-diidroxi-4’-metoxi-dihidrochalcona (1) também chamada de Myrigalona G
(ANDRADE; BLÖDORN, 2010). Esta diidrochalcona apresentou atividade antifúngica
para os fungos C. cladosporoides e C. sphaerospermum, e também apresentou
atividade contra a forma promastigota de Leishmania brasilienses (LAGO et al, 2007;
HERMOSO et al, 2003).
OH O
O
CH3
OH
(1)
25
Duas chalconas, sendo elas, Myrigalona G e a 2',6',4-triidroxi-4'-metoxi-
diidrochalcona, isoladas da P. elongatum apresentaram atividade contra
promastigotas de Leishmania brazileinsis extracelular in vitro sendo mais ativas que
o cetoconazol, usado como controle positivo (HERMOSO et al., 2003).
Outra substância posteriormente isolada foi o ácido 3-(1’-oxo-3’-metil-
2’-betenil)-4-hidroxibenzoico (2) também conhecido como ácido tabogânico. Este
derivado de ácido benzóico foi isolado e descrito pela primeira vez em 1998 da Piper
dilatatum (TERREAUX; GUPTA; HOSTETTMANN, 1998).
O
OH CH3
CH3O
OH
(2)
3.2.2 Piper cernuum
P. cernuum, observada na Figura 1, é um arbusto imponente com folhas
grandes e que pode chegar até 6 metros de altura, ocorre comumente na Amazônia,
Sudeste e Nordeste do Brasil. É uma espécie utilizada na medicina popular, através
da infusão de suas folhas, como analgésico, especialmente para dores no estômago,
contra problemas do fígado, dos rins e circulação (STIPP, 2000; Di STASI et al.,
2002).
Foram isolados das folhas desta espécie derivados de ácidos cinâmicos
identificados como 3,4–dimetoxi–diidrocinamato, ácido 3,4–dimetoxi–diidrocinâmico,
metil 3,5–dimetoxi–4–hidroxi–diidrocinamato e metil 3,5– dimetoxi–4–
hidroxicinamato, além de lignanas cubeninas. No caule e em suspensão de cultura
estão presentes feniletilaminas, tiramina e dopamina como maiores componentes
(DANELLUTE et al., 2005).
Foram identificados como componentes principais do óleo essencial desta
espécie, os constituintes: di-hidro-β-agarofurano (31,2%), elemol (12,2%) e 10-epi-
geudesmol (12,9%) (AGUIAR, 2003).
26
O óleo essencial da P. cernuum foi testado contra S. aureus, P. aeroginosa, C.
albicans através do método de difusão em ágar e apresentou halos significativos de
inibição para S. aureus e C. albicans (CONSTANTIN et al., 2001).
Figura 1: Piper cernuum (Piperaceae)
3.2.3 Piper amplum
São plantas arbustivas de 2-3 metros de altura que possuem folhas com
tamanha amplo como observado na Figura 2. Têm ramos cilíndricos, estriados,
nodosos, glabros, entrenós variando entre 4-9 cm comprimento. As folhas
apresentam-se com pecíolo de 3,0-3,5cm de comprimento com bainha caniculada
(GUIMARÃES; VALENTE, 2001).
É conhecida popularmente como caabepa, jaborandi, murta ou pariparoba.,
No Brasil encontra-se nos estados da Bahia, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de
Janeiro e Santa Catarina (GUIMARÃES; MONTEIRO, 2006).
O óleo essencial desta espécie tem como constituintes principais: α-pineno
(12,9%); limoneno (3,8%); α-copaeno (4,2%); Ecariofileno (24,4%); valenceno
(16,3%) e α -cadinol (8,5%), sendo todos os principais constituintes pertencentes a
classe dos terpenos (ANGNES, 2005).
Não existem atividades biológicas descritas na literatura sobre este gênero.
27
Figura 2: Piper amplum (Piperraceae)
3.2.4 Piper aduncum
P. aduncum é um arbusto que pode chegar de 3 a 8 metros, é uma planta
nativa da região Amazônica e é chamado popularmente de falso-jaborandi, jaborandi
e erva do jatoti (SILVA et al., 2007). Seu extrato é utilizado na medicina popular para
tratar infecções e dores de estômago (LUSTOSA; OLIVEIRA; ROMEIRO, 2007).
Dentre a família das Piperaceae a P. aduncum demonstrada na Figura 3 é a
que possui maior estudo sobre sua composição química. Dentre seus componentes
principais estão diversos ácidos benzóicos, alcalóides, cromanonas,
dihidrochalconas, flavonóides e derivados do ácido benzóico (LAGO, et al., 2009;
LUSTOSA; OLIVEIRA; ROMEIRO, 2007).
Figura 3: Piper adundum (Piperaceae)
28
A P. aduncum é muito conhecida popularmente por sua atividade
antimicrobiana sendo significativamente mais ativo para bactérias Gram-positivas,
incluindo Bacilo subtilis, Staphylococcus aureus,, Micrococcus luteus (KOKOSKA et
al., 2005) e contra os fungos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum
(LAGO et al., 2009).
No óleo essencial desta espécie ocorre o predomínio do fenilpropanóide
dilapiol, e em menor quantidade apresenta safrol e sarisan. O óleo essencial quando
submetido a ensaios biológicos apresentou toxicidade para Cerotoma tingomarianus,
demonstrando atividade inseticida (FAZOLIN, 2005).
Segundo Moraes e colaboradores (2007) o óleo essencial da Piper aduncun
apresentou boa atividade contra larvas de A. aegypti, seu óleo é conhecido por
conter o composto larvicida dilapiol. O dilapiol (3) (5-alil-6,7-dimethoxi-1,3-
benzodioxol) e seu derivado reduzido o dihidrodilapiol (4) (5-n-propil-6,7- dimetoxi-
1,3-benzodioxol), são utilizados individualmente ou em sinergismo em formulações
inseticidas.
O
O
OCH3
OCH3
CH2
O
O
OCH3
OCH3
CH3
(3) (4)
A P. aduncum possui muitas substâncias isoladas e já identificadas como: 2,2-
dimetil-8-(3'-metil-2'-butenil)-2H-1-cromeno-6-carboxilato de metila (5), 2,2-dimetil-
2H-1-cromeno-6-carboxilato de metila (6), 8-hidroxi-2,2-dimetil-2H-1-cromeno-6-
carboxilato de metila (7), acido 2,2-dimetil-2H-1-cromeno-6-carboxílico (8) e 3-(3 ', 7'-
dimetil-2', 6'-octadienilo)-4-metoxibenzóico (9). A atividade dos compostos isolados
foi também investigada contra cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae,
apresentando atividade (BALDOQUI et al., 1999).
29
O
CH3
CH3
CH2-CH=C(CH3)
O
OCH3
(5)
O
CH3
CH3
O
OCH3
(6)
O
CH3
CH3
O
OCH3
OH (7)
O
CH3
CH3
O
OH
(8)
CH3
CH3 CH3
O OH
OCH3
(9)
3.3 TOXICIDADE
A compreensão dos componentes ativos presentes nas plantas e seus
mecanismos de ação são alguns dos maiores desafios para a química farmacológica
e bioquímica. A seleção de bioensaios para a detecção de efeitos específicos das
substâncias pesquisadas é muito importante, e a toxicidade é um dos ensaios que
avalia a interação e os efeitos deletérios nocivos entre a substância extraída ou
purificada e o organismo (MACIEL; PINTO; VEIGA, 2002).
30
Desta forma a toxicidade pode ser definida como a capacidade que as
substâncias químicas têm, algumas em maior e outras em menor grau, de instalar
um estado patológico após sua introdução ou interação com um organismo (SOUZA,
2008).
As avaliações toxicológicas de novas substâncias e produtos são utilizadas
para determinar o potencial dos mesmos em causar danos à saúde humana. São
realizadas através da análise da toxicidade local ou sistêmica, permitindo classificar,
e rotular apropriadamente as substâncias de acordo com seu potencial de letalidade
ou toxicidade como estabelecido pela legislação (VALADARES, 2006).
A avaliação toxicológica pré-clínica e registro de fitoterápicos são descritos
pelo Guia para Realização de Estudos de Toxicidade Pré-clinica de Fitoterápicos,
presente na resolução no 90 de 16 de março de 2004, citando os testes de toxicidade
aguda, toxicidade de doses repetidas e o teste de genotoxicidade, que deve incluir
uma avaliação in vitro de reversão de mutação em bactérias, e uma avaliação in vivo
do dano de cromossoma de células hematopoiéticas em roedores (BRASIL, 2004).
3.3.1 Toxicidade frente a Artemia salina
Artemia salina L. (Artemidae) é um microcrustáceo invertebrado que vive em
habitat aquático, de ecossistemas de água salgada ou marinha (LEWAN;
ANDERSSON; MORALES-GOMEZ, 1992). O crustáceo pertence a classe
Anostracea, e possui quatro estágios de desenvolvimento (ovo, náuplio, metanáuplio
e adulto), sendo que a Artemia utilizada no ensaio deve encontrar-se no estágio
metanáuplio quando apresenta maior sensibilidade ao tratamento (LOPES et al.,
2002).
O microcrustáceo Artemia salina é um modelo de invertebrado que é muito
utilizado em estudos de toxicidade geral de compostos químicos e produtos naturais,
por ser um ensaio biológico rápido, simples e baixo custo (MEYER et al., 1982;
FAVILLA et al., 2006; FAC; BIEBER; SANT’ANA, 2005).
Os cistos de Artemia salina são facilmente encontrados no comércio, e ainda
possuem a vantagem de permanecerem viáveis por vários anos no estado seco
(MEYER et al., 1982).
31
O ensaio da Artemia salina foi proposto inicialmente por Michael, Thompson e
Abramovitz (1956), e posteriormente desenvolvido por Vanhaecke et al. (1981), bem
como por Sleet e Brendel (1983). O teste baseia-se na capacidade do extrato,
composto ou fração de matar os microcrustáceos cultivados em laboratório
(CARBALLO et al., 2002).
Já foi relatada uma correlação entre a toxicidade geral em Artemia salina, e a
citoxicidade frente a células humanas tumorais (McLAUGHLIN, 1991). Existem
também correlações entre a toxicidade geral frente a Artemia salina com atividades
parasiticidas (SAHPAZ et al., 1994), antifúngica, viruscida, e antimicrobiana (McRAE;
HUDSON; TOWERS, 1988).
Considerando os critérios descritos por Meyer (1982), substâncias ou extratos
que apresentarem concentrações menores que 1000 μg/mL apresentam algum grau
de toxicidade. Porém Dolabela (1997) utiliza intervalo de concentração para graduar
a toxicidade onde um extrato ou substância é considerada altamente tóxica quando
a CL50 for menor que 80 μg/mL, moderadamente tóxica, quando os valores são entre
80 μg/mL e 250 μg/mL e quando os valores forem acima de 250 μg/mL a substância
é considerada com baixa toxicidade ou não tóxica.
3.3.2 Toxicidade aguda
A toxicidade aguda é definida como os efeitos adversos que ocorrem em um
curto período de tempo após a administração de uma dose única ou doses múltiplas
dentro de 24 horas. A dose única é utilizada de modo geral para determinar a
potência da droga em casos de ingestão ou envenenamento acidental. A via mais
indicada de administração é a via oral, porém outras vias podem ser utilizadas de
acordo com a exposição humana (OGA, 2003).
De acordo com a RDC 90/2004, os mamíferos devem ser observados durante
as primeiras 24 horas, nos períodos de 0, 15, 30 e 60 minutos e cada 4 horas
diariamente, sendo que este prazo pode ser aumentado se houver o aparecimento
de sinais de toxicidade como alteração da locomoção, frequência respiratória,
piloereção, diarréia, sialorréia, alteração do tônus muscular, hipnose, convulsões,
hiperexcitabilidade do sistema nervoso central e contorções abdominais. As doses
limites toxicológicas são de 2000 mg/kg, sendo que quando justificado pelo uso do
produto, podem ser utilizadas doses de 5000 mg/kg. Posteriormente, da 24ª hora e
32
até 14 dias após a administração, a variação de peso e o consumo de alimentos
devem ser observados. Ao fim do período de observação todos os animais
sobreviventes devem ser sacrificados e autopsiados. Caso sejam observadas
alterações nas autópsias, estudos histopatológicos dos órgãos acometidos devem
ser realizados (BRASIL, 2004).
O teste de toxicidade aguda tem por objetivo avaliar a relação dose/resposta
que conduz ao calculo da DL50, um parâmetro que representa a probabilidade
estatística de uma dose causar efeito letal em 50% dos animais de uma população.
Os resultados servem também para identificar possíveis órgãos ou sistemas
sensíveis, e determinar se os efeitos são reversíveis (OGA, 2003).
3.3.3 Mutagenicidade sobre Saccharomyces cerevisiae
Certos agentes ambientais a que os organismos vivos estão freqüentemente
expostos podem induzir modificações químicas tanto ao nível celular quanto
molecular. Existem agentes químicos, físicos e biológicos, que podem causar essas
lesões, pois tem a capacidade de afetar os processos vitais como a duplicação e a
transcrição gênica, sendo assim prejudiciais as células. As alterações podem
também causar mutações e aberrações cromossômicas, fenômeno esse que pode
levar a processos cancerosos e morte celular. Esses agentes então, por causarem
lesões no material genético e por serem potenciais causadores de tumores em seres
humanos são normalmente conhecidos como mutagênicos (COSTA; MENK, 2000).
Os ensaios com leveduras tem sido de grande utilidade na determinação de
agentes mutagênicos ambientais e farmacológicos, são ensaios econômicos,
reprodutíveis, simples e rápidos. A levedura possui também uma vantagem sobre os
ensaios bacterianos que é a presença de um sistema endógeno de ativação
metabólica, constituído por um complexo enzimático (citocromo P-450) e
detoxificação sem a necessidade de adição de sistemas endógenos (MARTINS,
2010).
A levedura utilizada no ensaio, o S. cerevisiae é um organismo unicelular que
apresenta ciclo eucariótico típico, notavelmente semelhante às células de mamíferos
no que refere-se às macromoléculas, organelas e proteínas com homologia a
proteínas humanas completo e bem definido. Possui vantagens como genoma
pequeno e crescimento rápido em condições adequadas, tornando-se uma
33
ferramenta importante nas pesquisas sobre mutagênese e reparo do DNA (COSTA;
FERREIRA, 2001; GASPARRI, 2005; MOURA, 2006).
Os experimentos mais comumente utilizados são os de mutações reversas.
Estes se baseiam na restauração ou compensação de um defeito gênico
responsável por um requerimento nutricional (ZIMMERMANN, 1975; GASPARRI,
2005). A restauração se deve a uma reversão exata do defeito original, enquanto
que a compensação pode ser devido a uma mutação secundária dentro do gene
(mutação supressora interna) ou por uma mutação externa, como no caso dos alelos
sem sentido (nonsense – mutação que resulta na alteração de um códon que
determina um aminoácido para um códon de terminação da síntese protéica)
(HAWTHORNE; LEOPOLD, 1974; ATKIN et al., 1993; GASPARRI, 2005).
A reversão de auxotrofia (micro-organismos mutante que tem necessidade de
fatores de crescimento) para prototrofia (micro-organismos que não necessitam de
fatores de crescimento) pode ser causada por uma substituição, inserção ou deleção
de pares de bases, ou ainda uma mutação induzida por supressor do gene mutante
original (HENRIQUES; VALSA; GOMES, 1987; GASPARRI, 2005). Para que seja
identificada a mutação reversa é necessária à utilização de uma linhagem com
alterações genéticas adequadas, como por exemplo, a linhagem haplóide de S.
cerevisiae XV185-14c, isolada por Von Borstel. Esta linhagem permite a detecção de
dois tipos de mutações lócus específico: reversões do alelo ocre lis1-1 (alteração no
códon UAA de término de cadeia) ou do alelo missense his1-7 (códon alterado
codifica um aminoácido diferente), e reversões por deslocamento do quadro de
leitura do DNA (frameshift) verificadas no lócus hom3-10. As células revertentes
podem ser detectadas pela semeadura em placas contendo meio seletivo no qual o
fator de crescimento inicialmente requerido não está presente, ou está em
quantidades muito pequenas, permitindo um background de crescimento (PARRY;
PARRY, 1984; GASPARRI, 2005).
Os resultados dos testes de mutagencicidade representam grande
importância no desenvolvimento de novos fármacos, pois a legislação prevê que
para as indústrias farmacêuticas obterem um novo registro de medicamento, é
obrigatória a apresentação de requisitos de segurança, envolvendo entre outros
ensaios toxicológicos aqueles referentes a mutagenicidade in vitro e in vivo (NUNES,
2008).
34
3.3.4 Teste do micronúcleo
O micronúcleo (MN) é definido como uma pequena massa nuclear delimitada
por membrana e separada por núcleo principal, eles são formados, na telófase
durante a divisão celular (Figura 4), quando nesta fase o envelope celular é
reconstituído ao redor dos cromossomos das células filhas. São constituídos por
fragmentos cromossômicos acêntricos ou cromossomos inteiros que são perdidos
durante a divisão nuclear e por isso foram excluídos do núcleo principal das células
filhas (SALVADORI; RIBEIRO; FENECH, 2003).
Os MN podem ser formados pela interação de agentes químicos, físicos e
biológicos com estruturas não genômicas, que promovem distúrbios na maquinária
mitótica e falha na segregação de cromossomos. A ação dos agentes pode originar
os micronúcleos, um ou vários por células (FENECH, 2000; SOUZA; FONTANELLI,
1998).
Figura 4: Processo de formação de micronúcleo na divisão celular
Os micronúcleos são encontrados em uma grande variedade de células da
medula óssea: mieloblastos, mielócitos, eritrócitos. Contudo, eles são principalmente
observados nos eritrócitos policromáticos. As células policromáticas têm um curso
mais vantajoso para este teste. Poucas horas após as últimas mitoses, os
eritroblastos expelem seus núcleos. Por razões desconhecidas, os micronúcleos
mantêm-se dentro deles, e são fáceis de serem detectados. Durante um período de
24 horas os eritrócitos jovens têm uma coloração diferenciada de outras formas. A
cor desses então chamados “eritrócitos policromáticos” é azulada (LEDEBUR;
SCHMID, 1973). Os eritrócitos jovens (policromáticos) coram em azul-acinzentado
35
basofílico com Giemsa, porque ainda não perderam seus ribossomos, que perduram
aproximadamente 24 horas após a enucleação. Após a dissolução dos ribossomos,
a célula madura (normocromática) cora em laranja-rosa acidófilo (HEDDLE et al.,
1983).
Agentes que quebram cromossomos (clastrogênicos), ou interferem no fuso e
migração das cromossomal (aneugênicos), induzem ao aparecimento de
micronúcleos. Uma elevada frequência de células micronucleadas sugere que um
desses tipos de aberrações ocorreu. Quando a frequência de células
micronucleadas não é elevada, pode-se concluir que os tipos de aberrações acima
descritos não ocorreram nos eritroblastos, em divisão, da medula óssea, sob as
condições de tratamento utilizados no teste (MACGREGOR et al., 1987).
O teste de micronúcleo é um teste amplamente utilizado para o
monitoramento de danos mutagênicos em populações expostas a substâncias
mutagênicas e carcinogênicas. A frequência de MN observada em determinado
momento pode ser considerada uma resposta complexa entre a atividade
mutagênica e a eficiência do mecanismo fisiológico de defesa do organismo do teste
(MERSCH; BEAUVAIS, 1997).
36
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Material Vegetal
As partes aéreas (caules e folhas) das espécies abaixo relacionadas foram
coletadas no município de Blumenau, rua Belo Horizonte, bairro Glória, no Estado de
Santa Catarina, no período de julho de 2008. A exsicata das espécies coletadas
encontram-se depositadas em Herbários conforme abaixo ou estão ainda em fase de
identificação botânica.
A Piper aduncum foi classificada pela Prof. Cynthia Hering-Rinnert
(Universidade de Joinville - UNIVILLE). Uma amostra da espécie foi depositada no
Herbário da UNIVILLE com o código HJOI 9768.
A Piper cernuum Vell. var. cernuum foi classificada pelo Prof. Oscar Benigno
Iza (Universidade do Vale do Itajaí - UNIVALI). Uma amostra da espécie foi
depositada no Herbário da UNIVALI com o código Nicolau 613.
A Piper amplum Kunth foi classificada pelo Prof. Oscar B. Isa (Universidade
do Vale do Itajaí - UNIVALI). Uma amostra da espécie foi depositada no Herbário da
Univali com o código LR 719.
As espécies de Piper denominadas Piper 4 e Piper 5 estão em fase de
identificação.
4.2 Extratos e Substâncias
As partes aéreas das espécies das P. amplum, P. cernuum e Piper 4 e 5 foram
secas, pulverizadas e extraídas por maceração exaustiva com etanol a temperatura
ambiente, por 7 dias. Para cada 1 grama de planta utilizou-se 10 mL de solvente. Os
extratos obtidos foram concentrados a pressão reduzida em evaporador rotatório à
temperatura máxima de 50 0C para a eliminação do solvente.
As partes aéreas da P. aduncum foram secas, pulverizadas e extraídas por
maceração exaustiva com etanol, a temperatura ambiente, por 7 dias. O extrato
obtido foi concentrado a pressão reduzida em evaporador rotatório à temperatura
máxima de 50 0C. O extrato etanólico foi submetido a cromatografia em coluna de
sílica gel, com hexano, acetato de etila e metanol com aumento gradativo da
polaridade pela mistura dos referidos eluentes. Foram coletadas frações, que foram
37
monitoradas por Cromatografia de Camada Delgada (CCD) e reunidas conforme
semelhança do perfil cromatográfico apresentado.
Foram isoladas cinco substâncias denominadas de acordo com a sequência de
eluição como segue: Na fase móvel de hexano-acetato de etila 96:4 isolou-se a
substância denominada C1 40-48 (3-(1’-oxo-3’-metil-2’-butenil)-4-hidroxibenzoato de
metila, também conhecido como taboganato de metila, já na fase móvel de hexano-
acetato de etila 85:15 foi isolado a substância C1 105-108 (éster metílico do ácido
2,2-dimetil-6-carboxicroman-4-ona), na fase móvel de hexano-acetato de etila 75:25
foram isoladas as substâncias C1 117-125 (3-(1’-oxo-3’-metil-2’-butenil)-4-
metoxibenzoato de metila) e C1 136-140 (2’,6’-diidroxi-4’-metoxi-dihidrochalcona).
Os procedimentos foram executados pelos alunos do Curso de Farmácia da
UNIVALI, Fernanda Sobreiro de Andrade e Vinícius Borges Blödorn, na monografia
de conclusão de Curso, sob a orientação da Prof. Ângela Malheiros. As estruturas
das substâncias isoladas podem ser visualizadas na Tabela 2.
Neste trabalho foram utilizadas as seguintes denominações para facilitar o
entendimento:
C1 40-48 (3-(1’-oxo-3’-metil-2’-butenil)-4-hidroxibenzoato de metila): Taboganato de
Metila.
C1 105-108 (éster metílico do ácido 2,2-dimetil-6-carboxicroman-4-ona): Cromanona
C1 117-125 (3-(1’-oxo-3’-metil-2’-butenil)-4-metoxibenzoato de metila): Metóxi-
Taboganato de metila
C1 136-140 (2’,6’-diidroxi-4’-metoxi-dihidrochalcona): Myrigalona G
38
Tabela 2: Estruturas das substâncias isoladas da P. aduncum
Substância Estrutura
Taboganato de Metila
Cromanona
Metóxi-Taboganato de metila
Myrigalona G
4.3 Material Microbiológico
Os micro–organismos utilizados como cepas padrões para a realização dos
ensaios de atividade antimicrobiana foram as bactérias: Bacillus subtilis (ATCC
2385), Escherichia coli (ATCC 11775), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P),
Staphylococcus saprophyticus (ATCC 35552), Streptococcus pyogenes (ATCC
19615), Staphylococcus epidermides (ATCC 12228), Enterobacter aerogenes (ATCC
13048), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Proteus mirabilis (25933), e os fungos
OH
CH3O OH
O
O O
OH
O
O
O O
O
O O
O
O
39
leveduriformes: Candida albicans (ATCC10231), C. krusei (ATCC 6258), C.
parapsilosis (ATCC 22019), Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763).
As bactérias mantidas em ágar nutriente e os fungos (leveduras) em ágar
Sabouraud dextrosado, conservadas sob refrigeração (4 ºC) no Laboratório de
Pesquisa em Microbiologia do Curso de Farmácia da UNIVALI, sendo repicadas em
intervalos de 15 a 30 dias para manter as colônias viáveis.
4.4 Preparo dos inóculos
4.4.1 Bactérias
Cada bactéria foi transferida do meio de manutenção para o meio ágar
Mueller-Hinton e incubada a 37 ºC por 18-24 horas, para a ativação da respectiva
cultura.
Para o preparo do inóculo foi selecionado de 4 a 5 colônias da bactéria
ativada em ágar Mueller – Hinton, foram transferidas para tubo de ensaio com 5 mL
de solução de NaCl 0,86% estéril, seguido de homogeneização em agitador de tubos
por 15 segundos. A densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520
nm, por comparação com a escala de McFarland (CLSI, 2009).
O inóculo final foi obtido pela diluição da suspensão das respectivas culturas
bacterianas, obtendo-se concentração de aproximadamente 1,5 x 106 células/mL
para o método de diluição em ágar. Foi inoculado em cada frasco (meio) uma alça
calibrada de 1 μL (1-5 x 105 células) (CLSI, 2009).
4.4.2 Fungos
Cada levedura foi cultivada em ágar Sabouraud dextrosado, pelo menos duas
vezes, para assegurar a viabilidade das culturas jovens de 24 e 48 horas a 37 ºC.
Para o preparo do inóculo foram selecionadas 5 colônias de leveduras, com
aproximadamente 1mm diâmetro, as quais foram suspensas em 5 mL de NaCl
0,85% estéril e homogeneizadas em agitador de tubos por 15 segundos. A
densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520 nm para a obtenção
de transmitância equivalente a 95%, obtendo-se uma concentração final entre 1,5 x
40
106 células/mL. Foi inoculado em cada frasco (meio) uma alça calibrada de 1 μL (1-5
x 105 células), como descrito por Espinel-Ingroff e Pfaller (1995).
4.5 Bioautografia
Para o direcionamento das pesquisas na localização dos componentes com
potencial antimicrobiano da planta em estudo foi realizado o ensaio de bioautografia.
As amostras testes (extratos e substâncias isoladas) foram dissolvidas em
solvente apropriado e aplicadas em placas de cromatografia em camada delgada
(CCD) (Sílica Gel 60) e em seguida, as placas foram submetidas a eluição em
diferentes solventes para a escolha daquele com a melhor resolução. Após a eluição
e eliminação dos resíduos de solventes foi distribuída uma fina camada de meio de
cultura contendo inóculos de micro-organismo susceptível (106 células/mL) sobre as
placas de CCD e em seguida, estas foram incubadas a 37 ºC por 18 a 24 horas.
Para facilitar a leitura dos resultados, após o período de incubação, foi
borrifado nas placas uma solução aquosa de cloreto 2,3,5 trifenil tetrazólico (TTC)
(20 mg/mL) e estas novamente incubadas a 37 ºC por mais 4 horas.
O critério empregado para a interpretação dos resultados de bioautografia foi
o aparecimento de zonas claras em torno dos compostos isolados na CCD,
indicando a respectiva atividade antimicrobiana (RAHALISON et al., 1994).
4.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O método consiste em preparar diluições sucessivas da amostra a ser testada
(extrato, fração ou composto), em meios de cultura sólidos ou líquidos, semear a
bactéria ou fungo em estudo, e após incubação, verificar a menor concentração da
amostra que inibiu o crescimento do microorganismo utilizado no ensaio.
Os valores da CIM foram determinados através da diluição dos componentes
obtidos das diferentes espécies de Piper em ágar empregando a metodologia
descrita por CLSI (2009) com modificações. Os extratos e substâncias isoladas
foram dissolvidos em solução de dimetisulfóxido (DMSO) e água destilada (4:6),
foram adicionados em séries de 10 frascos com capacidade para 5 mL em diferentes
concentrações (1 a 10 μg/mL, 10 a 100 μg/mL ou de 100 a 1000 μg/mL). Em
seguida, a cada frasco foi adicionado 1mL de meio agar Mueller-Hinton para as
41
bactérias e 1mL de ágar Sabouraud dextrosado para as leveduras e fungos
filamentosos, seguido de imediata homogeneização da mistura. Após a solidificação
dos respectivos meios de cultura, os micro-organismos, previamente ativados, foram
inoculados nas séries correspondentes, sendo então incubados a 37 ºC por 18 a 24
horas para as bactérias, 37 ºC por 24 a 48 horas para os fungos leveduriformes e a
temperatura ambiente (25 ºC) por 5 a 15 dias para os fungos filamentosos (Figura 5).
Após esse período de incubação, foram realizadas leituras da CIM através da
verificação visual do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados foi
considerada CIM a inibição total do crescimento microbiano.
Durante os testes foram utilizados controles, como os meios de cultura e
solvente utilizado na solubilização do extrato e substâncias, a fim de verificar seu
efeito sobre o micro-organismo. A concentração final de DMSO nos ensaios não
excedeu 2%. A leitura dos resultados foi considerada válida somente quando houve
crescimento microbiano nos controles. Os ensaios foram repetidos três vezes.
Figura 5: Processo de avaliação da atividade antimicrobiana
4.7 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Fungicida
Mínima (CFM)
Para determinar a concentração bactericida mínima ou fungicida mínima
foram selecionadas as culturas que apresentaram inibição do desenvolvimento
bacteriano ou fúngico no ensaio de CIM, sendo realizadas suas respectivas
42
subculturas em meio ágar Mueller – Hinton para as bactérias e ágar Sabourand
dextrosado para os fungos leveduriformes, incubadas a 37 ºC por 18 a 24 horas para
as bactérias e 24 a 48 horas para os fungos leveduriformes. Após a incubação as
culturas foram inspecionadas para a verificação visual do crescimento microbiano.
Para a interpretação dos resultados foi considerado que a inibição no ensaio
de CIM e crescimento de micro – organismo na subcultura (CBM ou CFM) significa
ação bacteriostática ou fungicida e a ausência do crescimento na subcultura significa
ação bactericida ou fungicida (BARON; FINEGOLD, 1990).
4.8 Ensaio de citotoxicidade com Artemia salina
O ensaio de citotoxicidade do extrato e substâncias das diferentes espécies
de Piper foi realizado conforme o método descrito por Meyer et al. (1982) utilizando
o microcrustácio Artemia salina Leach.
Os componentes das diferentes espécies de Piper foram dissolvidos em
solução de DMSO e água marinha sintética (solução de cloreto de sódio 3,8%).
Ovos de Artemia salina, adquiridos comercialmente, foram colocados em um
becker contendo água marinha sintética com pH entre 8 e 9, e incubados em banho-
maria entre 20 e 25 ºC, por 48 horas para eclodirem. Após este período, em
microplacas (2000 μL) foram preparadas diferentes concentrações do extrato,
frações e substâncias, que variam de 2 a 1000 μg/mL e a cada uma delas foram
adicionadas entre 6 e 12 larvas do microcrustácio, seguido de nova incubação em
banho-maria (20 a 25 ºC) por 24 horas.
Após este período, o número de microcrustáceos vivos e mortos em cada
diluição (concentração) foi contado, com auxílio de um microscópio binocular E Lentz
Wetzlar (10x). O ensaio foi realizado em triplicata. Como controle negativo foi
utilizado 2000 μL de água marinha. Foram acrescentados controles como o solvente
utilizado para a dissolução das amostras.
A leitura dos resultados foi validada somente quando no controle negativo
houve a sobrevivência de todos os indivíduos.
Para o calculo final de CL50 e seu respectivo intervalo de confiança de 95%
utilizou-se o método de Próbitos de análise. Os extratos e substâncias isoladas
foram considerados citotóxicos quando o nível de toxicidade frente a Artemia salina
foi menor que 1000 μg/mL.
43
4.9 Ensaio de toxicidade aguda in vivo
4.9.1 Animais
Este ensaio foi realizado no Laboratório de Farmacologia in vitro com
orientação do Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas. Foram utilizados ratos Wistar adultos
(de 2 a 3 meses de idade), fêmeas (peso médio no início do experimento: 250 g)
obtidos no Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí. Os animais foram
mantidos em gaiolas, com livre acesso à água e comida, numa sala com
temperatura controlada, em torno de 24 ºC, e ciclo claro/escuro natural (12 horas de
claridade a partir das 5:30 h). Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê
de Ética numero 002/10 em Pesquisa com Animais da UNIVALI.
4.9.2 Ensaio toxicológico dose - fixa
O extratos de Piper, foram administrados, por via oral, a um grupo de 3
animais (3 fêmeas) em jejum por 12 horas, na dose de 2000 mg/kg, num volume de
2,6 mL/kg. O grupo controle (1 fêmea) recebeu o mesmo volume de salina. Após a
administração, durante as primeiras 12 horas, nos períodos de 15, 30 e 60 minutos e
a cada 4 horas foram observados sinais tóxicos de caráter geral, sendo avaliados os
seguintes parâmetros: atividade geral, frêmito vocal, irritabilidade, resposta ao toque,
aperto da cauda, contorção, trem posterior, tônus corporal, força de agarrar, ataxia,
tremores convulsões, estimulações, cauda em Straub, hipnose, anestesia,
lacrimação, ptoses, micção, defecação, piloereção, respiração, cianose. Os animais
foram observados uma vez ao dia ate o 14º dia. No ultimo dia os animais foram
pesados para observar a variação de peso, foi contabilizado o número de mortes e
todos os animais sobreviventes foram eutanasiados e autopsiados, sendo
observadas as características macroscópicas dos pulmões, rins, intestinos, fígado,
gônadas e coração.
4.9.3 Análise histológica
Os ensaios histológicos foram realizados no Laboratório de Pesquisas e
Técnicas Histológicas do Curso de Odontologia da UNIVALI, orientados pelo Prof.
44
Dr. David Rivero Tamis. Os ratos foram sacrificados em câmara de CO2,
posteriormente foi realizada uma laparotomia. Os tecidos aparentemente alterados
foram retirados, lavados em salina, cortados (2-4 mm) e fixados em formaldeído 10%
por 24 horas.
4.9.3.1 Desidratação
A desidratação foi realizada de modo progressivo em ciclos, sendo iniciada
com álcool etílico 70% por 4 horas, álcool etílico 80% por mais 4 horas e para
finalizar 3 ciclos de 4 horas com álcool etílico 100%.
4.9.3.2 Clareamento, Fixação e Coloração
As peças foram embebidas em xilol durante 1 hora, após esse processo foi
realizada a fixação que consiste em três banhos com parafina, de 1 hora cada, em
estufa a 60 ºC. Sendo assim realizada a inclusão das peças em blocos de parafina e
feitos os cortes de aproximadamente 7 µm de espessura, posteriormente foram
fixados em lâminas histológicas e coradas com hematoxilina/eosina para posterior
observação em microscópio óptico Olympus, 400x.
4.10 Ensaio com Saccharomyces cerevisiae
Para o ensaio de mutagenicidade utilizou-se Saccharomyces cerevisiae a
linhagem haplóide XV-185-14c. O crescimento das células foi feito em meio líquido
completo (YEL) contendo 1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona e 2% de
glicose. Para determinação do número de células viáveis, ou seja, unidades
formadoras de colônias, foram feitas semeaduras em meio YEPD (Extrato de
Levedura, Peptona e Dextrose) solidificado com 2% de bacto-ágar, marca Vetec
(AUSUBEL; BRENT; KINGSTON, 1989).
Para todos os tratamentos, as células foram ressuspendidas e diluídas em
PBS (tampão salina fosfato-Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,76 mM, KCl 2,7 mM e NaCl
137 mM; pH 7,4). Neste teste foi empregado o Meio Sintético suplementado (SC-
45
histidina, SC-lisina e SC-homoserina), nos quais os aminoácidos foram omitidos,
conforme descrito por Ausubel e colaboradores (1989).
Em frasco de Erlenmeyer contendo 20 mL de YEL foi inoculada uma colônia
isolada dessa linhagem e colocada para crescer em shaker (incubadora com
agitação orbital – LABLINE), à 180 rpm e 30oC, durante 24 horas, para atingir a fase
estacionária. As culturas assim mantidas atingiam uma concentração de 1 a 2 x108
células/mL. Duas diluições foram feitas e as células foram então contadas em
câmara de Neubauer no microscópio óptico. Posteriormente, 5 mL desta suspensão
foi passada para um tubo Falcon de 10 mL e centrifugada por 5 minutos a 5000 rpm.
Após esta centrifugação, desprezou-se o sobrenadante e adicionou-se uma
quantidade de PBS calculada para atingir a concentração de 1x 109 células/mL.
Da suspensão final, utilizou-se 100 μL para cada tratamento (25; 62,25; 125;
250 e 500 μg/mL) dos extratos. As células foram tratadas por 1hora à 30 oC, sob
agitação à 800 rpm. Determinou-se a sobrevivência através de semeadura em meio
mínimo completo (SC). Para cada tubo de tratamento foram feitas cinco diluições, a
concentração do tubo de onde foram retirados os volumes para a semeadura
equivalente a 1 x 103 células/mL, as placas foram colocadas em estufa na ausência
de luz a 30 oC por 5 dias. Para detecção de mutação induzida (revertentes das
marcas auxotróficas his1-7 lis1-1 hom3-10) as células foram semeadas em meio
mínimo seletivo na concentração de 1 x 108 células/mL nas mesmas condições de
incubação (Figura 6). Como controle positivo foi utilizado o composto
nitroquinoleína-1-óxido (4-NQO 5 µM) (Sigma). O teste foi feito em duplicata.
46
Figura 6: Esquema da metodologia do ensaio de mutagenicidade com Sacharomyces cerevisae
Fonte: GASPARRI, 2005
4.11 ENSAIO DO MICRONÚCLEO IN VIVO
4.11.1 Obtenção das células de medula
Este ensaio foi realizado no Laboratório de Farmacologia in vitro com
orientação do Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas. As células foram obtidas da medula
dos ratos, que foram sacrificados por deslocamento cervical e após sofreram
vivisseção pra retira do fêmur mantendo as epífises preservadas. Após a extração,
as epífises foram removidas e o canal medular foi lavado três vezes com 1 mL de
soro fetal bovino gelado, coletando o material em tubo Epperdorf (Figura 7). O
material coletado foi submetido a centrifugação a 1000g durante 10 minutos para
formação do precipitado. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi re-
suspendido em 500 µL de soro fetal bovino. Após foi colocado o corante azul de
tripan a 4%. Desta suspensão foram realizados os esfregaços das células
(MAVOURNIN; BLAKEY; CIMINO, 1990). As lâminas foram fixadas utilizando 15 a
47
20 gotas de metanol PA por 2 minutos, escorrer o metanol e sem deixado secar, a
lâmina foi coberta com solução de Giemsa (5 mL), agindo por 10 minutos, lavada
com água 3 vezes e deixada secar na posição vertical (MAVOURNIN; BLAKEY;
CIMINO, 1990).
Extração das epífeses Lavado do canal medular
Figura 7: Esquema de obtenção das células para o teste de micronúcleo
4.11.2 Análise da lâmina de células de medula
Foram avaliados 1000 eventos por lâmina aonde foram observados, o número de
eritrócitos monocromáticos e policromáticos, a proporção entre estes, avaliação de
eritrócitos contendo micronúcleo, células mononucleares e células totais com
micronúcleo (MAVOURNIN; BLAKEY; CIMINO, 1990).
Os resultados foram analisados utilizando o teste de Dunnet e a quantidade
de micronúcleo elevada confirma mutagenicidade.
48
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Bioautografia
A bioautografia é um método utilizado para a localização de substâncias com
ação antimicrobiana em um cromatograma (CCD) tanto em uma mistura complexa
quanto em uma fração semi-purificada. Essa técnica permite o biodirecionamento da
pesquisa para o isolamento de substâncias ativas. O critério utilizado neste trabalho
para a interpretação dos resultados foi o aparecimento de zonas claras em torno dos
extratos ou compostos na CCD, indicando a respectiva atividade antimicrobiana
(RAHALISON et al., 1994).
Para a bioautografia, foram testados os extratos das 5 espécies de Piper e as
substâncias isoladas da P. aduncum, contra a bactéria S. aureus. Foi realizada
previamente uma triagem onde foi constatado que o S. aureus era sensível aos
extratos.
Para a resolução das placas cromatográficas, foram testados diversos
sistemas de solventes e entre aquele que demonstrou melhor resolução para a
realização do ensaio foi o Hexano:Acetato de Etila (70:30).
Na Figura 8 pode ser observada uma placa cromatográfica dos 5 extratos de
Piper com os pontos correspondentes aos extratos de P. cernuum (1), P. amplum (2),
Piper 4 (3), P. aduncum (4) e Piper 5 (5), revelada com luz Ultra Violeta (UV). Nesta
primeira placa pode-se perceber que o perfil cromatográfico dos extratos de P.
aduncum e Piper 5 é muito parecido, apresentando as mesmas substâncias com
diferença apenas em suas concentrações. Estas duas espécies são muito
semelhantes quanto a aspectos físicos, a principal diferença esta nas folhas, as da
P. aduncum são lisas enquanto que as da Piper 5 tem pêlos, provavelmente a Piper
5 deve ser uma subespécie da P. aduncum.
A Figura 9 mostra a mesma placa revelada para bioautografia, onde se pode
perceber inibição do crescimento de S. aureus, correspondente aos extratos de P.
cernuum no Rf= 0,30 e 0,74, P. amplum no Rf= 0,09, Piper 4 no Rf= 0,34, 0,41 e
0,45, P. aduncum no Rf= 0,14 e 0,53 e Piper 5 no Rf= 0,13 e 0,56 revelando que
estes extratos possuem substâncias em sua composição com atividade
antibacteriana.
49
Fig. 8: Placa de CCD revelada com UV sendo P.
cernuum (1), P. amplum (2), Piper 4 (3), P.
aduncum (4), Piper 5 (5).
Fig. 9: Placa bioautográfica revelada com
TTC, sendo P. cernuum (1), P. amplum (2),
Piper 4 (3), P. aduncum (4), Piper 5 (5).
Fig. 10: Placa de CCD revelada com UV sendo
P. aduncum (1), Taboganto de metila (2),
Cromanona (3), Metóxi-Taboganto de metila (4),
Myrigalona G (5).
Fig. 11: Placa bioautográfica revelada com
TTC sendo P. aduncum (1), Taboganto de
metila (2), Cromanona (3), Metóxi-Taboganto
de metila (4), Myrigalona G (5).
1 2 3 4
1
5
1
1 2 3 4
1
5
1
1 2 3 4
1
5
1 5
1 4
1
3 2 1
Rf- 0,74
Rf- 0,30
Rf- 0,09
Rf- 0,45 Rf- 0,41 Rf- 0,34
Rf- 0,53
Rf- 0,14
Rf- 0,56
Rf- 0.13
Rf- 0,68 Rf- 0,62
Rf- 0,41 Rf- 0,32
Rf- 0,62
Rf- 0,48 Rf- 0,40
Rf- 0,38
50
Devido à verificação da atividade antibacteriana da P. aduncum, foi realizada
a bioautografia utilizando seu extrato bruto e suas substâncias isoladas,
demonstrados na Figura 10 onde pode-se observar os pontos correspondentes a P.
aduncum (1), Taboganato de metila (2), Cromanona (3), Metóxi-taboganato de metia
(4) e Myrigalona G (5), revelados com UV, é possível perceber que as substâncias
possuem algumas impurezas porém em pequena concentração.
Na Figura 11 pode-se observar que houve formação de halo de inibição no
extrato bruto de P. aduncum nos Rfs= 0,32, 0,41, 0,62 e 0,68, todas as substâncias
testadas também apresentaram halos de inibição nos Rfs de 0,62 para o Taboganato
de metila, 0,48 para a Cromanona, 0,40 para o Metóxi-Taboganto de metila e 0,38
para Myrigalona G, tendo em vista que todos os extratos e substâncias
demonstraram atividade todos foram utilizados no experimento de atividade
antimicrobiana.
5.2 Atividade Antibacteriana
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração
bactericida mínima (CBM) dos extratos e substâncias isoladas das diferentes
espécies de Piper foi realizada através do método de diluição em ágar, como
descrito no 4.6 e 4.7.
Este método foi utilizado porque os extratos vegetais possuem componentes
com características polares e apolares, bem como, permite obter informações sobre
a concentração microbicida mínima através de subculturas da determinação da CIM
(BELLA CRUZ et al., 2009).
Para a realização do ensaio de determinação da CIM foram utilizados os
cinco extratos brutos de diferentes espécies de Piper e as quatro substâncias
isoladas da P. aduncum. Para a classificação da atividade podem ser utilizados
diversos critérios, dependendo do objetivo que se tem para o produto em análise.
Levando em consideração o objetivo do emprego clínico dos extratos e substâncias
isoladas, foram seguidos os critérios descritos por Tegos e colaboradores (2002) e
Holetz e colaboradores (2002), que classificam a atividade antimicrobiana como
ótima se a CIM for < 10 μg/mL, boa entre 10 e 100 μg/mL, moderada entre 100 e
500 μg/mL, fraca quando a CIM for entre 500 e 1000 μg/mL e inativo se for > 1000
μg/mL.
51
Inicialmente foi realizada uma triagem para verificar a possível ação
antimicrobiana dos extratos e substâncias contra um representante de bactérias
Gram-positivas (Staphylococcus aureus), bactéria Gram-negativa (Escherichia coli) e
de fungo leveduriforme (Candida albicans), até a concentração máxima de 1000
µg/mL.
Os resultados mostraram que entre os cinco extratos testados, o extrato da P.
cernuum e P. amplum não foram capazes de inibir os micro-organismos até a
concentração máxima testada (1000 µg/mL). O extrato de Piper 4 também não foi
ativo para E. coli e C. albicans porém apresentou atividade moderada para a
bactéria Gram-positiva com valor de CIM equivalente a 250 µg/mL. Com relação a P.
aduncum e a Piper 5 ambas não apresentaram atividade contra a bactéria Gram-
negativa (Escherichia coli), porém, sua atividade foi considerada boa contra
Staphylococcus aureus com valores de CIM de 31,25 e 125 µg/mL, respectivamente,
bem como foi verificada a atividade moderada contra o fungo leveduriforme
(Candida albicans), com CIM de 125 e 250 µg/mL, respectivamente (Tabela 3).
As substâncias isoladas da P. aduncum: Taboganato de metila, Cromanona,
Metóxi-taboganato de metila e Myrigalona G, também foram testados contra os
mesmos micro-organismos, porém não apresentaram atividade contra os mesmos,
apesar de seu extrato bruto ter apresentando um dos melhores resultados e das
substâncias terem se mostrado ativas na bioutografia. Três possibilidades podem ser
avaliadas: a primeira, devido a concentração, que no caso da bioautografia não pode
ser quantificada, provavelmente ultrapassando 1000 μg/mL. A outra explicação seria
a possibilidade de ter ocorrido um efeito de associação entre as substâncias
presentes no extrato (efeito somatório ou sinérgico), e consequentemente quando
isolados os mesmos apresentaram CIM superior ao limite máximo testado, e por fim
existe ainda a possibilidade de a substância mais ativa não ter sido isolada..
52
Tabela 3: Atividade antimicrobiana dos extratos e substâncias de Piper frente a três micro-organismos.
Componente Concentração inibitória mínima (µg/mL)
S. aureus E. coli C. albicans
P. cernuum >1000 >1000 >1000
P. amplum 1000 >1000 >1000
P. aduncum 31,25 >1000 125
Piper 4 250 >1000 >1000
Piper 5 125 >1000 250
Taboganto de Metila >1000 >1000 >1000
Cromanona >1000 > 1000 >1000
Metóxi-taboganato
de Metila
>1000 >1000 >1000
Myrigalona G >1000 >1000 >1000
Legenda: Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli), Candida albicans
(C. albicans).
As substâncias isoladas da P. aduncum: Taboganato de metila, Cromanona,
Metóxi-taboganato de metila e Myrigalona G, também foram testados contra os
mesmos micro-organismos, porém não apresentaram atividade contra os mesmos,
apesar de seu extrato bruto ter apresentando um dos melhores resultados e das
substâncias terem se mostrado ativas na bioutografia. Três possibilidades podem ser
avaliadas: a primeira, devido a concentração, que no caso da bioautografia não pode
ser quantificada, provavelmente ultrapassando 1000 μg/mL. A outra explicação seria
a possibilidade de ter ocorrido um efeito de associação entre as substâncias
presentes no extrato (efeito somatório ou sinérgico), e consequentemente quando
isolados os mesmos apresentaram CIM superior ao limite máximo testado, e por fim
existe ainda a possibildade de a substância mais ativa não ter sido isolada..
Após a realização da triagem, como descrito acima, os extratos foram
testados frente a outras bactérias Gram– negativas (Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis), para confirmar a ausência de atividade
para este tipo de bactéria. Os resultados confirmaram a suspeita, todos
apresentaram CIM >1000 µg/mL.
53
A ausência da atividade contra as bactérias Gram-negativas seja dos extratos
ou substâncias pode ser explicada pela diferença de estrutura e organização entre o
envelope celular das bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. No caso das
bactérias Gram-positivas esse envelope é relativamente simples composto de uma
membrana citoplasmática e parede celular composta inteiramente por
peptideoglicano. Esta camada de peptideoglicano é composta por redes com vários
poros, os quais permitem com que moléculas estranhas entrem na célula sem
nenhuma dificuldade (KOLER; PECHERE; PLESIAT, 1999; BROOKS; BUTEL;
MORSE, 2005).
O envelope celular das bactérias Gram-negativas trata-se de uma estrutura
mais complexa que a outra classe de bactéria, constituído de múltiplas camadas,
uma membrana citoplasmática, a parede celular que é composta por uma fina
camada de peptideoglicanos e envolvida por uma membrana externa seguida de
uma camada de lipopolissacarídeo (LPS), constituída por lipoproteínas e
fosfolipídeos, além disso as bactérias Gram-negativas ainda possuem o espaço
periplasmático (entre a membrana externa e o citoplasma), que pode conter enzimas
capazes de inativar alguns compostos com ação antimicrobiana (BROOKS; BUTEL;
MORSE, 2005).
Como foi observado na triagem que os extratos e substâncias apresentaram
atividade contra S. aureus, posteriormente foram testados contra outras bactérias
Gram-positivas (S. pyogenes, S. epidermides, B. subtilis, S. saprophyticus) os dados
estão apresentados na Tabela 4. Com relação a P. cernuum, assim como aconteceu
na triagem, não foi verificada atividade contra as bactérias testadas.
O extrato da P. amplum apresentou atividade somente frente a cepa do B.
subtilis, já os extratos da P. aduncum, Piper 4 e Piper 5 apresentaram os melhores
resultados, sendo ativos para todas bactérias testadas com exceção da Piper 4 para
S. pyogenes. Considerando que os melhores resultados foram da P. aduncum para
S. aureus e B. subtilis com valor de CIM de 31,25 µg/mL e 62,5 µg/mL
respectivamente, a Piper 5 também apresentou CIM de 62,5 µg/mL para B. subtilis,
isso mostra a semelhança fitoquímica entre elas, porém a concentração deve ser
diferente pois para outras bactérias testadas a CIM teve diferença de valores. As
substâncias isoladas novamente não apresentaram atividade.
O S. aureus é um dos patógenos hospitalares mais importantes e mais
disseminados, representando a terceira causa mais comum de infecções
54
sanguíneas; se houver disseminação de S. aureus, o quadro infeccioso pode evoluir
para endocardite, osteomielite, hematogênica aguda, meningite ou infecções
pulmonares (BROOKS; BUTEL; MORSE, 2005).
Outro resultado importante foram os resultados de CIM do extrato da Piper 4 e
da P. aduncum contra a cepa de S. epidermides, os valores de CIM foram de 250 e
125 µg/mL, respectivamente, um resultado interessante tendo em vista que o S.
epidermides é um membro da flora normal da pele humana, vias respiratórias e trato
gastrointestinal, porém pode causar infecções em próteses ortopédicas ou
cardiovasculares, e também causar doenças em pacientes imunodeprimidos., além
disso o S. epidermides é mais frequentemente resistente a antimicrobianos que o S.
aureus (BROOKS; BUTEL; MORSE, 2005).
Apesar do Bacillus subtilis não ser uma bactéria patogênica este micro-
organismo geralmente é utilizado para testes de substâncias ativas devido a sua
morfologia servindo de modelo para outros bacilos (KALEMBA; KUNICKA, 2003).
O extrato de P. aduncum foi o que apresentou os melhores resultados de
atividade antimicrobiana contra as bactérias testadas, essa espécie vegetal é
conhecida por apresentar em sua composição diversas classes de compostos que
são conhecidas por apresentarem atividade antimicrobiana, dentre elas podemos
destacar os alcalóides, cumarinas flavonóides, terpenos e os ácidos benzóicos,
porém as substâncias isoladas por Andrade e Blödorn (2010) e testadas neste
trabalho não são as principais responsáveis pela atividade apresentada. (SALEEM et
al., 2010, PARK et al., 2001).
Estudos realizados por Kokoska e colaboradores (2005) e Lago e
colaboradores (2009), também descrevem a atividade da P. aduncum para B. subtilis
e S. aureus, além da bactéria Micrococcus luteus.
Constatin e colaboradores (2001) e Zaidan e colaboradores (2005) relatam
que o óleo essencial da P. cernuum possui atividade frente a S. aureus e C. albicans,
o que não ocorreu no presente estudo provavelmente devido à concentração, tendo
em vista que foi testado o extrato bruto. No mesmo estudo o óleo foi testado contra
uma cepa de bactéria Gram-negativa (P. aeroginosa) e não houve atividade.
Existem diversos estudos de atividade antibacteriana realizados com
espécies da família Piperaceae. Pessini et al. (2003), testou o extrato de P. regnellii e
suas frações, frente duas bactérias Gram-negativas (E. coli, P. aeruginosa) e duas
Gram-positivas. Como no presente estudo, não foi observado atividade frente as
55
bactérias Gram-negativas e as frações demonstraram boa atividade frente as cepas
Gram-positivas S. aureus e B. subtilis.
Campos et al. (2005) testou P. solmsianum, revelando que seu extrato bruto
possui ótima atividade contra as bactérias Gram-positivas (Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus agalactiae) e
também não foi verificada atividade contra as bactérias Gram-negativas.
Após a determinação da concentração inibitória mínima foi realizado o ensaio
da concentração bactericida mínima (CBM), que é a mínima concentração de uma
determinada substância necessária para a inviabilização dos micro-organismos e
não apenas a inibição do seu crescimento. A ação bactericida difere da
bacteriostática por ser irreversível, isto é, o micro-organismo inviabilizado não pode
mais se reproduzir, mesmo após a remoção do contato com o agente.
Para o ensaio da concentração bactericida mínima foram utilizados apenas os
extratos com atividade antibacteriana. Os extratos que apresentaram atividade
bactericida foram o da P. aduncum e da Piper 5 com CBM de 62,5 µg/mL contra o B.
subtilis, e o extrato da Piper 4 com CBM de 500 µg/mL contra o S. aureus (Tabela 4).
Uma substância com ação bactericida pode ser muito proveitosa no caso de
pacientes imunodeprimidos, levando em consideração que o paciente muitas vezes
não possui imunidade suficiente para atuar contra os micro-organismos patogênicos
que não seriam totalmente eliminados por antimicrobianos bacteriostáticos. Se a
substância no caso for específica para o micro-organismo patogênico, isso pode
tornar o tratamento ainda mais eficaz e preservar células saudáveis do hospedeiro
que poderiam ser atingidas durante o tratamento.
56
Tabela 4: Atividade antimicrobiana dos extratos e substâncias das 5 espécies de Piper frente à bactérias Gram - positivas
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MINÍMA (CIM e CBM) Bactérias gram-positivas
S. pyogens S. epidermides B. subtilis S. Aureus S. saprophyticus CIM CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM
P. cernuum >1000 - >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
P. amplum >1000 - >1000 - 250 > 1000 1000 - >1000 -
P. aduncum 250 >1000 125 >1000 62,5 62,5 31,25 >1000 125 >1000
Piper 4 >1000 - 250 >1000 62,5 > 1000 250 500 500 >1000
Piper 5 500 >1000 500 >1000 62,5 62,5 125 1000 125 >1000
Taboganto de
metila
>1000 - >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Cromanona >1000 - 1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Metóxi-taboganto
de metila
>1000 - >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Myrigalona G >1000 - >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Legenda: Streptococcus pyogens (S. pyogens), Staphylococcus epidermides (S. epidemides), Bacilo subtilis (B. subtilis), Staphylococcus aureus (S. aureus), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus)
57
5.3 Atividade Antifúngica
Para avaliação da atividade antifúngica, empregou-se o método de diluição
em ágar e foram utilizados os fungos leveduriformes (C. albicans, C. krusei, C.
parapsilosis e S. cerevisae). Valores de CIM menores que 1000 μg/mL foram
considerados inativos.
Confirmando o resultado da triagem (Tabela 3) pode-se observar que os
extratos da P. cernum, P. amplum e Piper 4 não foram ativos contra nenhum dos
fungos testados. As substâncias isoladas da P. aduncum também não apresentaram
atividade.
Conforme pode ser observado na Tabela 5, dentre as 4 espécies de fungos
leveduriformes testados o extrato da P. aduncum apresentou os melhores
resultados, com CIM de 125 µg/mL para todos os fungos com exceção da C. krusei.
Ácidos benzóicos/cromenos com atividade antifúngica já foram identificados na
espécie de P. aduncum (KATO et al., 2004).
Tabela 5: Atividade antifúngica dos extratos e substâncias das 5 espécies de Piper
Componente Concentração Inibitória e fungicida mínima (CIM e CFM)
C. albicans C. krusei C. parapsilosis S. cerevisiae CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM
P. cernuum >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
P. amplum >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
P. aduncum 125 125 >1000 - 125 >1000 125 >1000
Piper 4 >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Piper 5 250 500 >1000 - 250 >1000 >1000 -
Taboganto de
metila
>1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Cromanona >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Metóxi-
taboganto de
metila
>1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Myrigalona G >1000 - >1000 - >1000 - >1000 -
Legenda: Candida albicans (C. albicans), Candida Krusei (C. krusei), Candida parapsilosis
(C. parapsilosis), Sacharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)
58
O extrato de Piper 5 demonstrou resultados significativos contra as cepas de
C. albicans e C. parapsilosis com resultados de CIM de 250 µg/mL frente as duas
leveduras.
O extrato da P. aduncum e da Piper 5 apresentaram também ótimos resultado
na atividade fungicida com resultado de CFM de 125 µg/mL e 500 µg/mL,
respectivamente frente à cepa de C. albicans.
Os resultados vão de encontro aos reportados por Schmit e RiffeI (2010), que
testaram os extratos de P. aduncum, P. amplum e P. cernuum e obtiveram CIM de
125 µg/mL frente a C. albicans para P. aduncum enquanto os outros dois extratos
não apresentaram atividade frente aos fungos testados.
De acordo com Navickiene e colaboradores (2006) e Lago e colaboradores
(2009) óleo essencial da P. aduncum possui atividade frente aos fungos
Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum.
As infecções fúngicas invasivas permanecem como importante causa de
morbidade e mortalidade, em especial na população de pacientes gravemente
enfermos e os imunocomprometidos, tais como: pacientes com câncer,
politraumatizados, em uso de quimioterapia para tumores sólidos ou hematológicos,
Aids, entre outros. Estes pacientes estão sob risco especial de desenvolver
infecções oportunistas por leveduras em especial as do gênero Candida sp
(MORETTI, 2007).
As leveduras do gênero Candida têm sido consideradas entre os principais
agentes causadores de infecção sistêmica de origem hospitalar e representam o
principal fungo causador de infecção de corrente sanguínea. Apresentam uma taxa
de mortalidade geral em torno de 50% a 60%, com aumento do tempo de internação
para mais de 30 dias. Muitos estudos têm apontado as leveduras do gênero Candida
como sendo o quarto ou quinto micro-organismo mais frequentemente isolado em
hemoculturas (MORETTI, 2007).
5.4 Toxicidade em Artemia salina
O potencial de toxicidade dos extratos e compostos das espécies de Piper foi
determinado através do ensaio com Artemia salina, um ensaio que pode ser utilizado
para um monitoramento simples e rápido, avaliando a letalidade do extrato ou
substância em um organismo animal (LHULLIER; HORTA; FALKENBERG, 2006).
59
Considerando os critérios descritos por Meyer (1982), concentrações menores
que 1000 μg/mL apresentam algum grau de toxicidade, sendo assim todos os
extratos e substâncias testados podem ser considerados tóxicos. Porém Dolabela
(1997) utiliza intervalo de concentração para graduar a toxicidade onde um extrato
ou substância é considerada altamente tóxica quando a CL50 for menor que 80
μg/mL, moderadamente tóxica, quando os valores são entre 80 μg/mL e 250 μg/mL e
quando os valores forem acima de 250 μg/mL a substância é considerada com baixa
toxicidade ou não tóxica.
Os resultados da toxicidade dos extratos das cinco espécies de Piper e
substâncias isoladas da P. aduncum frente a Artemia salina são mostrados na
Tabela 6.
Tabela 6: Toxicidade dos extratos e substâncias frente a Artemia salina
Componente CL50 (μg/mL) Limite de Confiança
P. cernuum 166,3 131,2 – 201,4
P. amplum 81,9 54,9 – 108,9
P. aduncum 48,2 37,2 – 72,4
Piper 4 52,1 38,9 – 65,3
Piper 5 56,4 42,3 – 70,5
Taboganato de
metila
210, 5 164,2 – 256,9
Cromanona 127,7 87,3 – 168,1
Metóxi-taboganto
de metila
45,7 42,4 – 77,8
Myrigalona G 611,3 408,7 – 814,0
A concentração letal média (CL50) variou entre 45,7 e 611,3 μg/mL.
Considerando o critério empregado por Dolabela (1997) apenas a Myrigalona G foi
considerada de baixa toxicidade, enquanto todos os outros extratos e substâncias
estão classificados com moderadamente tóxicos ou altamente tóxicos.
Dentre os extratos, o da P. aduncum, Piper 4 e Piper 5 foram considerados
altamente tóxicos com resultados de 48,2, 52,1 e 56,4 μg/mL respectivamente.
Devido à similaridade fitoquímica entre os extratos da P. aduncum e Piper 5 pode-se
dizer que as substâncias responsáveis pelo potencial tóxico provavelmente estão
60
presentes em maior concentração no extrato de P. aducum, uma vez que esta
apresentou maior grau de toxicidade.
Uma das substâncias isoladas que pode estar contribuindo para alta
toxicidade apresentada pela P. aduncum é o Metóxi-Taboganto de metila. Ainda em
relação a esta substância não foram encontrados registros na literatura, ou seja,
trata-se de uma substância inédita.
O ensaio com Artemia salina tem a capacidade de identificar atividade
anticancêr, porém é limitado em relação a capacidade de distinguir entre o potencial
forte, moderado ou fraco dos compostos. Entretanto o teste pode ser utilizado como
uma rápida triagem para detecção de potentes citotoxinas, porém para ensaios mais
específicos de atividade anticancerígena existe a necessidade de um ensaio contra
células cancerígenas humanas (COLEGATE; MOLYNEUX, 2008).
Dados experimentais mostram que existe uma importante correlação entre a
CL50 para Artemia salina e a Dose Efetiva média (DE50) obtida para linhagem de
células tumorais (MCLAUGHLIN, 1991). Portanto pode-se supor que os extratos da
P. aducum, Piper 4, Piper 5, e a substância Metóxi-taboganato de metila podem ser
bons protótipos para uma futura avaliação de suas propriedade antitumorais.
5.5 Toxicidade aguda
Levando em consideração o alto grau de citotoxicidade observado no teste da
Artemia salina in vitro foi realizado um teste in vivo de toxicidade aguda, com dose
única de 2000mg/kg em ratos. Os extratos utilizados foram o da P. aduncum, Piper 4
e Piper 5. Foram utilizados 5 animais em cada grupo de extrato e no grupo controle
salina.
Nas primeiras 4 horas pós-administração e nos 14 dias seguintes não foram
observados sinais físicos de toxicidade pelo teste hipocrático como irritabilidade,
resposta ao toque, contorção, alterações no trem posterior ou tônus corporal,
tremores, convulsões, Straub, hipnose, sinais de anestesia, aumento ou diminuição
de defecação ou micção, piloereção ou cianose.
No grupo da P. aduncum, os animais tiveram um aumento médio de 21,4%,
no grupo da Piper 4 o aumento médio de peso foi de 21,15% e os animais tratados
com a Piper 5 tiveram aumento médio de 23%. Esse aumento de peso também foi
61
observado no grupo tratado com salina que teve em média 19,5% de aumento de
peso, sendo assim considerado normal.
De acordo com a classificação da categoria GHS (Sistema de Classificação
Globalmente Harmonizado de Substâncias Químicas e Misturas), descrito na OECD/
OCDE 420 de 17 de dezembro de 2001, os extratos estão classificados na classe D
ou E que indica baixa toxicidade oral, pois na maior dose utilizada não houve morte
nos animais.
5.6 Análise histológica
Após a observação dos sinais físicos nos durante os 14 dias seguintes ao
tratamento, os animais foram sacrificados em câmara de CO2 e foi realizada uma
laparotomia, sendo observadas durante a necropsia possíveis alterações
morfológicas macroscópicas nos fígados dos animais, que foram então retirados
para a análise histológica.
O fígado sem alterações é composto por cordões de hepatócitos dispostos
radialmente nos lóbulos hepáticos; entre os cordões estão os capilares sinusóides,
cada lóbulo contém uma veia central e em cada canto deste se encontramos
espaços porta que são compostos por ramos da veia porta, artéria hepática e do
ducto biliar (DOMINGUES; TOLEDO; MORAES, 2009).
Com a análise microscópica das lâminas observada na Figura 12 ficou
evidenciado que não houve diferença entre as estruturas dos fígados dos ratos
tratados com os extratos em relação a salina, as estruturas morfológicas se
mantiveram preservadas indicando que não houve sinais tóxicos.
62
Figura 12: Cortes histológicos do fígado dos ratos tratados com P. aduncum (A), Piper 4 (B), Piper 5
(C) e salina (D), corados com hematoxilina/eosina e observados em microscópio Olympus em 400x.
5.7 Ensaio de mutagenicidade frente ao Saccharomyces cerevisiae
O teste frente a linhagem XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae foi
utilizado com o objetivo de avaliar a mutagenicidade (dano genético) dos extratos
dos cinco extratos de Piper.
Nas Tabelas 7, 8 e 9 pode-se observar que os cinco extratos testados não
apresentaram potencial mutagênico na concentração máxima de 500 μg/mL (p >
0,05) sobre a linhagem testada (XV 185-14c) mostrando que não há diferença
estatística entre as médias dos extratos e as do controle negativo.
Os testes de mutagênese tem sido utilizados como testes de triagem para
prever o potencial carcinogênico de substâncias, entretanto eles apenas avaliam as
substâncias que produzem câncer por mecanismos mutagênicos, isto é que
interagem diretamente com o material genético (OGA, 2003), sendo assim o
resultado negativo de mutagênese dos extratos frente ao S. cerevisae pode ser
63
considerado um indicativo de que estes extratos não possuem ação carcinogênica
porém outros testes visando a produção de câncer por mecanismos não
mutagênicos devem ser realizados para que este resultado seja comprovado.
64
Tabela 7 : Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os extratos de P. amplum e P. cernuum .
Componente Tratamento (µg/mL)
Sobrevivência (%)
Revertentes his 1/108
sobreviventes a
Revertentes lys 1/108
sobreviventes b
Revertentes met 1/108
sobreviventes a
4 NQO 1 305,38% 179,0 ± 12,72c** 158,5 ± 72.83c** 106,0 ± 16,97c**
DMSO 0 100% 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 25 86,82% 1,5 ± 0,7 2,0 ± 2,82 0,5 ± 0,7 62.5 55,68% 0,5 ± 0,7 1,0 ± 1,41 0,0 ± 0,0 P. amplum 125 34,13% 0,5 ± 0,7 2,5 ± 2,12 0,5 ± 0,7 250 14,9% 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 500 10,17% 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 25 98,2% 1,5 ± 2,12 0,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 62.5 74,8% 0,5 ± 0,7 3,5 ± 4,94 0,5 ± 0,7 P. cernuum 125 59,3% 0,0 ± 0,0 1,0 ± 1,41 0,5 ± 0,7 250 27,5% 0,0 ± 0,0 1,0 ± 1,41 1,0 ± 1,41 500 4,2% 0,5 ± 0,7 1,0 ± 1,41 0,0 ± 0,0
Legendas: Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5µM – Controle positivo); Dimetilsulfóxido (DMSO – Controle negativo); a Revertentes lócus específicos;
b
Revertentes de lócus não – específico; c Significância e Desvio Padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo
controle negativo (DMSO) *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 no teste ANOVA (Dunnett´s Multiple Comparison Teste’).
65
Tabela 8 Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os extratos de P. aduncum e Piper 4.
Componente Tratamento (µg/mL)
Sobrevivência (%)
Revertentes his 1/108
sobreviventes a
Revertentes lys 1/108
sobreviventes b
Revertentes met 1/108
sobreviventes a
4 NQO 1 177,5% 167,5 ± 31,81c** 144,5 ± 7,7c** 174,0 ± 1,41c**
DMSO 0 100% 5,5 ± 2,12 3,5 ± 0,7 1,0 ± 1,41 25 117,26% 4,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,0 62.5 87,14% 3,0 ± 0,0 1,0 ± 1,41 1,0 ± 1,41 P. aduncum 125 73,09% 2,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 250 42,2% 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 500 29,3% 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 25 86,82% 3,0 ± 1,41 3,5 ± 2,12 0,5 ± 0,7 62.5 55,68% 2,0 ± 1,41 5,0 ± 1,41 0,5 ± 0,7 Piper 4 125 34,13% 0,5 ± 0,7 2,5 ±2,12 0,0 ± 0,0 250 14,9% 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 500 10,17% 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Legendas: Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5µM – Controle positivo); Dimetilsulfóxido (DMSO – Controle negativo); a Revertentes lócus específicos;
b
Revertentes de lócus não – específico; c Significância e Desvio Padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo
controle negativo (DMSO) *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 no teste ANOVA (Dunnett´s Multiple Comparison Teste’).
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Tabela 9: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com o extrato de Piper 5.
Componente Tratamento (µg/Ml)
Sobrevivência (%)
Revertentes his 1/108
sobreviventes a
Revertentes lys 1/108
sobreviventes b
Revertentes met 1/108
sobreviventes a
4 NQO 1 369,5% 195,0 ± 7,07c** 182,0 ± 16.97c** 162,0 ± 16,97c**
DMSO 0 100% 3,0 ± 4,24 0,5 ± 0,7 1,0 ± 1,41 25 93,47% 5,0 ± 1,41 0,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 62.5 74,63% 3,5 ± 2,12 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 Piper 5 125 51,44% 3,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 250 40,5% 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 25,36% 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Legendas: Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5µM – Controle positivo); Dimetilsulfóxido (DMSO – Controle negativo); a Revertentes lócus específicos;
b
Revertentes de lócus não – específico; c Significância e Desvio Padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo
controle negativo (DMSO) *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 no teste ANOVA (Dunnett´s Multiple Comparison Teste’).
67
5.8 Teste do Micronúcleo
Como citado anteriormente e previsto na RDC 90/2004 o teste de
genotoxicidade, deve incluir uma avaliação in vitro de reversão de mutação em
bactérias, e uma avaliação in vivo do dano de cromossoma de células
hematopoiéticas em roedores.
O teste dos micronúcleo foi realizado utilizando salina como controle negativo,
Metilmetanosulfonato (MMS) como controle positivo e os extratos da P. cernuum, P.
amplum, P. aduncum e Piper 5, os resultados estão demonstrados na Tabela 10.
A aplicação do Teste de Dunnet permitiu comparar as médias dos tratamentos
dos diferentes extratos com o tratamento feito com salina. Os resultados revelaram
que p<0,05 indicando que não houve significância na formação de micronúcleos.
Tabela 10: Indução de micronúcleo em roedores
Componente Erit. poli. (%) Frequência MN %
P. cernuum 47,2 ± 7,7 1,33 ± 0,57 (p< 0,05)
P. amplum 48,3 ± 6,6 1,66 ± 2,08 (p< 0,05)
P. aduncum 46 ± 7,6 2 ± 2 (p< 0,05)
Piper 5 42 ± 5,6 0,33 ± 0,57 (p< 0,05)
Salina 48,8 ± 3,2 0,33 ± 0,57 (p< 0,05)
MMS 30 10.02 ± 2.6 (p> 0,05)
Legenda: Erit. poli. (Eritrócitos policromáticos); Frequência MN ( Freqüência de Micronúcleo).
Levando em consideração os resultados obtidos nos teste realizados,
poderiam ser feitos mais estudos fitoquímicos com o extrato de P. aduncum, visando
à extração e identificação de outras substâncias, que possam ser responsáveis pela
atividade antimicrobiana presente no extrato bruto, poderiam ser feitos também teste
de sinergismo com as substâncias utilizadas neste trabalho.
Tendo em vista a alta citotoxicidade relatada nos extratos de P. aduncum, Piper
4 e 5, poderiam ser realizados testes utilizando estes extratos e substâncias em
ensaios contra células cancerígenas humanas.
68
6 CONCLUSÕES
No ensaio bioautográfico realizado contra S. aureus foram encontradas zonas de
inibição em compostos da P. amplum, P. cernuum, P. aduncum, Piper 4 e Piper 5,
bem como foram encontrados halos de inibição nas substâncias isoladas da P.
aduncum testadas (Taboganto de Metila, Cromanona, Metóxi-Taboganato de
metila e Myrigalona G), indicando que eles possuem atividade antibacteriana.
Os extratos da P. amplum, P. aduncum, Piper 4 e Piper 5, apresentaram atividade
significativa contra bactérias Gram-positivas , sendo os extratos de P. aduncum e
Piper 5 os que apresentaram os melhores resultados com concentração inibitória
mínima de 250, 500 µg/mL, respectivamente contra S. pyogens, 125 e 500 µg/mL
para S. epidermides, 62,5 µg/mL contra B. subtilis, 31,25 e 125 µg/mL contra S.
aureus e 125 µg/mL frente ao S. saprophyticus e concentração bactericida
mínima de 62,5 µg/mL para B. subtilis.
Os extratos de Piper não foram ativos contra as bactérias Gram-negativas
testadas.
O extrato de P. aduncum apresentou atividade significativa contra os fungos
leveduriformes Candida albicans e C. parapsilosis com CIM de 125 µg/mL, e o
extrato de Piper 5 apresentou CIM de 250 µg/mL para os mesmos fungos. Os
mesmos extratos apresentaram concentração fungicida mínima equivalente a
125 e 500 µg/mL, respectivamente, contra C.albicans.
Todos os extratos e substâncias testadas foram considerados citotóxicos frente a
Artemia salina com concentrações inferiores a 1000 µg/mL.
No teste de toxicidade aguda de dose fixa em ratos não foram observados sinais
físicos de toxicidade nem alterações histológicas nos fígados retirados dos
animais tratados com os extratos utilizados (P. aduncum, Piper 4 e 5).
69
No teste de mutagênicidade pode-se observar que nenhum dos extratos testados
foi capaz de induzir a mutagenicidade na linhagem XV 185-14c de
Saccharomyces cerevisiae até a dose máxima testada (500 µg/mL).
O ensaio do micronúcleo demonstrou que os extratos testados (P. cernuum, P.
amplum, P. aduncum e Piper 4), não foram capazes de induzir mutagenicidade
até a dose máxima testada
70
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8 ANEXOS
