Elektronu transports mitohondriju elpošanas ķēdē:

skābekļa reducēšana un protonu translokācija

Elektronu transporta ķēdē notiek skābekļa četrelektronu reducēšana par ūdeni, un elektronu transports ir sajūgts ar protondzinējspēka veidošanu.

Citohroma c oksidāzē skābekļa reducēšana ir saistīta ar protonu translokāciju

“vektoriālie protoni”

“ skalārie protoni”

Divi protondzinējspēka veidošanās mehanismi, kas saistīti jeb sajūgti ar elektronu transportu, ir:

• “protonu pumpja” jeb konformāciju sūkņa mehanisms; vektoriālie protoni

• tāds red-oks reakciju telpiskais izkārtojums elektronu transporta ķēdē, ka membrānas iekšpusē notiek reducēšanās ar protonu saistīšanu, un/vai ārpusē – oksidēšanās ar protonu atbrīvošanu; skalārie protoni

Protondzinējspēka veidošanos atvieglo tas, ka protoni tieši iesaistīti daudzās red-oks reakcijās

Fea33+- O -– O --Cub

2+

Fea33+- O -– O --Cub

2+

Brzezinski and Gennis (2008) J Bioenerg Biomembr 40:521–531

Stacionārās kinētikas dati nesniedz informāciju par enzimātiskās reakcijas mehanisma elementārajiem soļiem, piemēram, elementārajām konstantēm

P

To ļauj priekšstacionārā kinētika, kas aplūko periodu, kurā [ES] nav vēl stabilizējies

– no pikosekundēm līdz sekundei

Kā tiek pētīti citohroma c oksidāzes elementārie reakcijas etapi?

CuA

aa3

CuB

matrix

e-

Lai noskaidrotu elementāros reakcijas etapus, kuru laika mērogs ir mikrosekunžu

diapazonā, pielieto flash-fotolīzi, vienu no priekšstacionārās kinētikas metodēm

e-

e-e-

CO

cyt c oksidāzes preparātu anaerobos apstākļos reducē, izgāzē ar CO, kas cieši piesaistās binukleārajā centrā, un tad piesātina vidi ar skābekli

O2

O2

O2

O2

O2

O2

O2

CuA

aa3

CuB

matrix

e-

Lai noskaidrotu elementāros reakcijas etapus, kuru laika mērogs ir mikrosekunžu diapazonā, pielieto flash-fotolīzi

e-

e-e-

CO

Tad ar ≈ 10 nanosekunžu lāzera impulsu (‘flash’) izraisa CO disociāciju no binukleārā centra, kam var sekot pārākumā esošā skābekļa piesaistīšanās

O2

O2

O2

O2

O2

O2

O2

Notikumiem pēc skābekļa piesaistīšanās var izsekot spektroskopiski, ar mikrosekunžu izšķirtspēju:

560 nm – citohroma redox stāvoklis;

610 nm – peroksisavienojuma veidošanās;

570 nm – pH indikators fenolsarkanais, kura absorbcija pieaug, saistot protonu;

830 nm – CuA redox stāvokļa izmaiņas

Ballmoos et al. (2011) PNAS vol. 108: 11057–11062

H+

CuA

aa3

CuB

matrix

e-

Vektoriālais H+ elektriski kompensē elektronu

Kā darbojas protonu sūknis?Elektronam nonākot hidrofobajā vidē pie binukleārā centra, kur vides dielektriskā konstante ir ļoti zema, tā nekompensētais negatīvais lādiņš rada enerģētiski nestabilu stāvokli

CuB

a3

a

CuA

H+

matrix

H+

Binukleārajā centrā saistoties skalārajam protonam, tas ar savu elektrisko lādiņu sekmē vektoriālā protona disociāciju

Kā darbojas protonu sūknis?

2e-

b  o Cu 

2H+ Periplazma

UQH2

  UQ

2H+

2H++ 0.5O2 H2O

2H+

   b595 d

 

b558

UQH2

  UQ

2H+

2e- 2e-

2H++ 0.5O2 H2O

Citoplazma

  

Ne visas vara-hema oksidāzes ir cyt c oksidāzes, un ne visas terminālās oksidāzes pieder vara-hema grupai

piemēram, E. coli terminālās oksidāzes:

bo bd • abas oksidē ubihinolu, nevis cyt. c

• tikai bo pieder vara – hema oksidāžu grupai

• bo pumpē protonus, H+/e-=2

• bd nepumpē protonus, H+/e-=1; protondzinēj-spēku veido tikai skalārie protoni

III komplekss, jeb bc1 komplekss, jeb ubihinol:cyt. c oksidoreduktāze

matrix

Ciklisks elektronu transports – red-oks reakcijas ar H+ saistīšanu un atbrīvošanu notiek pretējās membrānas pusēs

Ciklam ir 2 apgriezieni:

(1) QH2 pie ārējās virsmas oksidējas par Q, 2H+ tiek atbrīvoti starpmembrānu telpā, 1e- tiek pārnests uz c1 un 1e- caur cit. bl un bh uz Q pie membrānas iekšējās virsmas, to reducējot par QH., protonu piesaistot no matriksa puses

(2) tas pats, tikai pie iekšējās virsmas QH., piesaistot vēl vienu protonu no matriksa puses, reducējas par QH2

I komplekss (NADH:UQ oksidoreduktāze) ir vislielākais elpošanas ķēdes komplekss

Red-oks kofaktori – FMN, vairāki (7) Fe/S centri (N1a, N1b, N2,...)

un kompleksā saistīts ubihinons

matrix

H+ translokācijas mehanisms – iespējams, protonu sūknis, kā

citohromoksidāzē: red-oks reakcijas pie N2 izsauc konformāciju

izmaiņas, kuras darbina H+ vai Na+ sūkni (daļai baktēriju)

O2

.- O2

.-

Elpošanas ķēde ir aktīvo skābekļa formu avots

Elektronu pārnesēju autooksidācija: flavīni semihinons

Vienelektrona skābekļa molekulas reducēšana dod superoksīda anjonradikāli; divelektronu skābekļa molekulas reducēšana dod ūdeņraža peroksīdu

Četrelektronu skābekļa reducēšanā terminālajā oksidāzē rodas ūdens

Fentona reakcija:

Oksidatīvo stresu šūnā rada skābekļa aktīvās formas, tām mijiedarbojoties ar brīvu (kofaktoros neiesaistītu) Fe2+

Divvērtīgā dzelzs viegli asociē pie proteīniem un DNS, un iesaistoties Fentona reakcijā izraisa oksidatīvus bojājumus

Aerobos augšanas apstākļos šie oksidatīvie bojājumi ir galvenais mutaģenēzes avots. Mutanti ar defektīvām DNS reparācijas sistēmām ir hipersensitīvi pret H2O2.

Superoksīds un ūdeņraža peroksīds noārda dzelzs-sēra klasterus, kas ir daudzu fermentu prostētiskās grupas:

[4Fe – 4S]2+

[3Fe – 4S]+ + Fe3+

[3Fe – 4S]2+ + Fe2+

H2O2O2

.-

H2O2

Fentona reakcija

Fe3+ + HO.

Aizsardzības mehanismi: •šūnā pēc oksidatīvā stresa notiek strauja klasteru reparācija

•parādīts, ka oksidatīvā stresa apstākļos Fe-S klasterus saturoši enzīmi (piem. fumarāze un akonitāze Krebsa ciklā) tiek nomainīti pret izoenzīmiem, kas šādus kofaktorus nesatur

Peroksidāžu reakcijas:

Katalāzes reakcija:

2 O2.- + 2 H+ O2 + H2O2

Superoksīddismutāzes reakcija:

Kas pazemina superoksīda un H2O2 līmeni šūnā?

H2O2 izraisa S-S saišu veidošanos proteīnos.

Tioredoksīni un glutaredoksīni ir nelieli –SH grupas saturoši olbaltumi, kuri veic oksidētu makromolekulu redox reparāciju, reducējot to S-S saites. Glutations ir tripeptīds (Glu-Cys-Gly) ar līdzīgu funkciju

Savu SH grupu reģenerēšanai kā reducējošo ekvivalentu avotu tie izmanto NADPH.

NADPH ir svarīgākais elektronu donors šūnas aizsargsistēmām oksidatīvā stresa apstākļos.

H2O2 inhibē GAPDH un novirza katabolismu uz pentozofosfāta ceļu

a member of the di-iron carboxylate group of proteins, characterized by an active site that includes two iron atoms coordinated by several highly conserved glutamate and histidine residues

Augos iespējams alternatīvs elektronu transports, kurš neietver I, III un IV kompleksus, un ģenerē siltumu, neveidojot protondzinējspēku