PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET BIOLOŠKI ODSJEK

Slavko Kepec

EKOTOKSIKOLOŠKA

I MIKROBIOLOŠKA KARAKTERIZACIJA

PROČIŠĆENIH OTPADNIH VODA

GRADA VIROVITICE

DOKTORSKI RAD

Zagreb, 2016.

FACULTY OF SCIENCE DEPARTMENT OF BIOLOGY

Slavko Kepec

ECOTOXICOLOGICAL AND

MICROBIOLOGICAL

CHARACTERIZATION OF TREATED

WASTEWATER OF THE CITY OF

VIROVITICA

DOCTORAL THESIS

Zagreb, 2016.

Ovaj je doktorski rad izraĎen u Institutu RuĎer Bošković u Zagrebu, Laboratoriju za

biotehnologiju u akvakulturi (stari naziv: Laboratorij za ihtiopatologiju – biološke

materijale), Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta u Zagrebu i poduzeću

Virkom d.o.o. Virovitica, pod vodstvom mentorice dr.sc. Natalije Topić Popović i mentora

prof.dr.sc. Gorana Klobučar, u sklopu Sveučilišnog poslijediplomskog doktorskog studija

biologije.

Zahvale

Prije svega, najiskrenije se zahvaljujem mojoj mentorici dr.sc. Nataliji Topić Popović i

mojem mentoru prof.dr.sc. Goranu Klobučaru, bez čijeg strpljenja i velike pomoći, kroz cijelo

vrijeme, sve ovo ne bih mogao privesti kraju.

Zahvaljujem se ponaosob svima u Laboratoriju za biotehnologiju u akvakulturi Instituta

RuĎer Bošković u Zagrebu na pomoći u stručnom dijelu, na razumijevanju i podršci u

svakom smislu.

Ogromnu zahvalnost dugujem mojoj dragoj suradnici iz Tvornice šećera Virovitica, Kseniji

Zidar, dipl.ing. zbog svega što je učinila kako bi se istraţivanje moglo provesti na pravi

način.

Zahvaljujem mojim dragim kolegicama Blaţenki Čeleš, dipl.ing. i Ljiljani Jarčov,

mag.ing.univ.spec. iz Zavoda za javno zdravstvo Bjelovarsko bilogorske ţupanije, Mirjani

Špehar, mag.med.biochem. iz Zavoda za javno zdravstvo „Sveti Rok“ Virovitičko-podravske

ţupanije, dr.sc. Ljiljani Čačić, dr.sc. Ţeljki Romić i Antoniji Kezerle, dipl.ing. iz Vodovoda

Osijek, na pomoći u stručnom dijelu i moralnoj podršci. Hvala Draţenki Stipaničev, dipl.ing.

i Siniši Repecu, dipl.ing. iz Glavnog vodnogospodarskog laboratorija Hrvatskih voda na

njihovom doprinosu.

Posebno se zahvaljujem mojim prijateljima Denisu Balaţu, dipl.ing. i Marijanu Mlinariću iz

Tvornice šećera, Draţenu Viljevcu iz Brezovice, mojem nećaku Ivanu, i ostalima, na pomoći u

izlovu riba.

Zahvaljujem se direktorima Virkom-a, Zdravku Peru, dipl.ing. na pomoći u početku

doktorskog studija i Damiru Mareniću, dipl.ing. na razumijevanju i velikoj podršci u svakom

smislu. Hvala i ostalima iz Virkom-a koji su u mene vjerovali.

Zahvaljujem i onima koje nisam naveo imenom, a koje sam u poslovnoj suradnji, kroz dugi

niz godina, susretao i zavolio.

Hvala cijelom mom obiteljskom krugu na inspiraciji i strpljenju.

Sveučilište u Zagrebu Doktorski rad

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

EKOTOKSIKOLOŠKA I MIKROBIOLOŠKA KARAKTERIZACIJA PROĈIŠĆENIH

OTPADNIH VODA GRADA VIROVITICE

SLAVKO KEPEC

Prirodoslovno-matematički fakultet, Biološki odsjek

Analiza pročišćenih otpadnih voda koje se ispuštaju u vodene prijemnike uglavnom

podrazumijeva tek utvrĎivanje koncentracije organskih tvari (kemijske i biološke potrošnje

kisika) i nutrijenata (dušika i fosfora). Stoga je u ovom radu ispitan i učinak efluenta na

bioindikatorske organizme (ribe (Carassius gibelio)) i gujavice (Eisenia fetida, Oligochaeta))

i stupanj rezistentnosti bakterijskih izolata na antimikrobne lijekove podrijetlom iz otpadnih

voda, s ciljem utvrĎivanja štetnog djelovanja na ţiva bića u vodi, a posredno i na zdravlje

ljudi. U tom smislu provedena su ekotoksikološka ispitivanja na bioindikatorskim modelnim

organizmima, izvršeno je mjerenje mehanizma multiksenobiotičke otpornosti i vrijednosti

parametara oksidacijskog stresa. Citogenetska oštećenja utvrĎivana su mikronukleus testom a

mutageni učinci Ames testom. Izvršena je komparativna mikrobiološka analiza standardnim

mikrobiološkim testovima i MALDI-TOF spektrometrom masa, te su provedena hematološka

i histopatološka istraţivanja. Rezultati navedenih istraţivanja pokazuju da pročišćene otpadne

vode unošenjem ksenobiotika mijenjaju okolišne parametre recipijenta, dovode do porasta

otpornosti bakterija na antibiotike, histopatoloških promjena i oksidacijskog stresa u riba.

Dobiven je cjeloviti prikaz utjecaja pročišćenih otpadnih voda na ključne prarametre kakvoće

i ekološkog stanja vode i biote.

115 stranica/ 36 slika/ 17 tablica/ 165 literaturnih navoda/ jezik izvornika hrvatski

Ključne riječi: ureĎaj za biološko pročišćavanje, efluent, bakterije, ribe, genotoksičnost,

mehanizma multiksenobiotičke otpornosti, mikronukleus, oksidacijski stres

Mentori: dr.sc. Natalija Topić Popović, znanstvena savjetnica, IRB, Zagreb

prof.dr.sc. Goran Klobučar, PMF, Zagreb

Ocjenjivači:

1. Dr.sc. Ivančica Strunjak-Perović, viša znanstvena savjetnica, IRB, Zagreb

2. Prof.dr.sc. Mirjana Pavlica, PMF, Zagreb

3. Izv.prof.dr.sc. Jasna Hrenović, PMF, Zagreb

4. Zamjena: Dr.sc. Rozelindra Čoţ-Rakovac, znanstvena savjetnica, IRB, Zagreb

Rad prihvaćen:

University of Zagreb Doctoral thesis

Faculty of Science

Department of Biology

ECOTOXICOLOGICAL AND MICROBIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF

TREATED WASTEWATER OF THE CITY OF VIROVITICA

SLAVKO KEPEC

Faculty of Science, Department of Biology

Currently, analysis of treated wastewater discharged from the wastewater treatment plants

(WWTP) inflowing into recipients involves determination of concentrations of organic

substances (chemical and biological oxygen demand) and nutrients (nitrogen and

phosphorus). In this study, the impact of effluent on organismic bioindicators and degree of

resistance of bacterial isolates to antimicrobial drugs originating from wastewater has been

evaluated with the aim to determine toxic effects on aquatic (fish, Carassius gibelio) and

terrestrial (earthworm, Eisenia fetida, Oligochaeta) organisms, and indirectly on human

health. The ecotoxicological testings on bioindicator model organisms were conducted,

measuring mechanisms of multixenobiotic resistance and parameters of oxidative stress.

Cytogenetic damages were determined by micronucleus test, and mutagenic effects with

Ames test. Comparative microbiological analyses were made with conventional methods and

mass spectrometry analyser. Results of this study show that treated wastewater (leaving

WWTP) changed environmental parameters by introduction of xenobiotics, contributed to

microbial contamination and antimicrobial resistance, histopathological tissue changes and

oxidative stress of examined organisms. Hencewith, our approach encompassed an integrated

overview of the impact of treated wastewater on key environmental and organismal

parameters.

115 pages/ 36 figures/ 17 tables/ 165 references/ original in Croatian

Keywords: wastewater treatment plant, effluent, bacteria, fish, genotoxicity, mechanism of

multixenobiotic resistance, micronuclei, oxidative stress

Supervisors:

Natalija Topić Popović, Ph.D., Senior Scientist, RBI, Zagreb

Goran Klobučar, Ph.D., Full Professor, PMF, Zagreb

Reviewers:

1. Ivančica Strunjak-Perović, Ph.D., Senior Scientist, RBI, Zagreb

2. Mirjana Pavlica, Ph.D., Full Professor, PMF, Zagreb

3. Jasna Hrenović, Ph.D., Associate Professor, PMF, Zagreb

Replacement: Rozelindra Čoţ-Rakovac, Ph.D., Senior Scientist, RBI, Zagreb

Thesis accepted:

SADRŢAJ

SADRŢAJ ..............................................................................................................................7

1. UVOD ...........................................................................................................................1

1.1. Cilj i značaj istraţivanja............................................................................................3

2. LITERATURNI PREGLED ..........................................................................................6

2.1. UreĎaji za biološko pročišćavanje otpadnih voda ......................................................6

2.2. Fizikalno-kemijske analize .......................................................................................7

2.3. Biološke analize utjecaja onečišćenja na okoliš ........................................................7

2.4. Mikrobiološka istraţivanja ..................................................................................... 10

2.5. Histološke pretrage ................................................................................................. 11

2.6. Biokemijske i hematološke pretrage krvi ................................................................ 12

2.7. Ekotoksikološki testovi na modelnim organizmima ................................................ 13

2.8. Mehanizam multiksenobiotičke otpornosti .............................................................. 13

2.9. Mikronukleus test ................................................................................................... 14

2.10. Oksidacijski stres ................................................................................................ 15

2.11. AMES test .......................................................................................................... 16

3. MATERIJALI I METODE .......................................................................................... 18

3.1. UreĎaj za biološko pročišćavanje otpadnih voda i lokacije za uzimanje uzoraka ..... 18

3.2. OdreĎivanje fizikalno-kemijskih pokazatelja .......................................................... 22

3.3. Analitika vode i sedimenta ..................................................................................... 23

3.4. Ţivotinjske vrste i obrada tkiva ............................................................................... 24

3.4.1. Ribe ................................................................................................................ 24

3.4.1.1. Ribe, pregled i uzimanje tkiva za analize .................................................. 25

3.4.1.2. Histološke analize .................................................................................... 28

3.4.1.3. Analize krvi riba....................................................................................... 28

3.4.1.4. Istraţivanje genotoksičnosti ...................................................................... 28

3.4.2. Gujavice .......................................................................................................... 29

3.4.2.1. Gujavice, predtretman: Test kontakta na filtar papiru................................ 29

3.4.2.2. Mjerenje MXR inhibitornog potencijala gujavica nakon izlaganja otpadnim

vodama i otpadnom mulju ......................................................................................... 29

3.4.2.3. Mjerenje oksidacijskog stresa nakon izlaganja gujavica otpadnim vodama i

otpadnom mulju ........................................................................................................ 30

3.5. Ames test ............................................................................................................... 31

3.6. Mikrobiološke analize vode, mulja i tkiva riba........................................................ 32

3.6.1. Maldi TOF MS ................................................................................................ 34

3.6.2. OdreĎivanje osjetljivosti izolata bakterija prema antimikrobnim lijekovima .... 35

3.7. Statistička obrada rezultata ..................................................................................... 35

4. REZULTATI ............................................................................................................... 36

4.1. Analiza uzoraka otpadnih i površinskih voda .......................................................... 36

4.1.1. Rezultati mjerenja temperature vode, suspendirane tvari, pH i

elektroprovodljivosti ..................................................................................................... 36

4.1.2. Rezultati mjerenja otopljenog kisika, kemijske potrošnje kisika (KPKCr i

KPKMn) i biološke potrošnje kisika (BPK-5) ................................................................. 37

4.1.3. Rezultati mjerenja amonijaka, nitrita, nitrata i ukupnog dušika ........................ 38

4.1.4. Rezultati ispitivanja ortofosfata i ukupnog fosfora ........................................... 40

4.1.5. Rezultati mjerenja teških metala ...................................................................... 41

4.1.6. Rezultati mjerenja farmaceutika ...................................................................... 42

4.2. Ţivotinjske vrste i obrada tkiva ............................................................................... 44

4.2.1. Ribe ................................................................................................................ 44

4.2.1.1. Zdravstveni status riba .............................................................................. 44

4.2.1.2. Histologija škrga, bubrega, jetre i slezene ................................................. 44

4.2.1.3. Hematologija, biokemijski parametri u krvi riba ....................................... 48

4.2.1.4. Procjena genotoksičnosti (ENA i MN test) ............................................... 51

4.2.2. Gujavice .......................................................................................................... 52

4.2.2.1. Gujavice: Test kontakta na filtar papiru .................................................... 52

4.2.2.2. Mjerenje lipidne peroksidacije u gujavicama nakon izlaganja otpadnim

vodama i otpadnom mulju ......................................................................................... 54

4.2.2.3. Razina inhibicije MXR proteina uslijed izlaganja otpadnom mulju ........... 56

4.2.2.4. Razina oksidacijskog stresa uslijed izlaganja otpadnom mulju .................. 58

4.3. AMES test .............................................................................................................. 60

4.4. Mikrobiološke analize vode, mulja i tkiva riba........................................................ 64

4.5. Osjetljivost izdvojenih sojeva prema antimikrobnim lijekovima ............................. 76

5. RASPRAVA ............................................................................................................... 83

6. ZAKLJUČAK ............................................................................................................. 94

7. POPIS SIMBOLA I KRATICA ................................................................................... 95

8. LITERATURA ............................................................................................................ 97

9. ŢIVOTOPIS .............................................................................................................. 111

10. POPIS SLIKA I TABLICA ....................................................................................... 113

1

1. UVOD

Voda je opće dobro od osobitog povijesnog, gospodarskog, ekološkog značenja i u sluţbi

zaštite ljudskog zdravlja. Komunalne i industrijske otpadne vode opasne su po okoliš s

obzirom na to da mogu sadrţavati toksične i štetne tvari organskog i anorganskog podrijetla,

koje pak mogu negativno djelovati na vode u koje se ulijevaju, ugroţavajući biotu koja u

njima ţivi narušavajući njihove mikrobiološke, fizikalno-kemijske i biološke osobitosti.

Onečišćivači organskog podrijetla posebice mogu narušiti ravnoteţu ekosustava. U cilju

sprečavanja onečišćenja kopnenih voda koriste se ureĎaji za pročišćavanje otpadnih voda na

kojima se provodi preliminarno, primarno, sekundarno i tercijarno pročišćavanje otpadnih

voda. Preliminarno pročišćavanje predstavlja uklanjanje krupnijih plivajućih tvari, šljunka,

pijeska, ulja i masti, kao i ujednačavanje sastava daljnjeg toka vode. Primarnim

pročišćavanjem uklanjaju se raspršene zrnate plivajuće tvari i suspendirane čestice, te se u

slučaju odstupanja pH vrijednosti provodi neutralizacija. Sekundarno (biološko) pročišćavanje

je uklanjanje otopljenih biorazgradivih organskih tvari gdje mikroorganizmi aerobnim,

anoksičnim i anaerobnim postupcima (biooksidacija, metanska fermentacija, nitrifikacija,

denitrifikacija, biološko uklanjanje fosfora) razgraĎuju sastojke sa ugljikom, dušikom i

fosforom iz otpadne vode (Glancer i sur. 2005). Tercijarno pročišćavanje predstavlja

uklanjanje iz otpadnih voda posebno opasnih tvari kao što su npr. otopljene soli,

mikroorganizmi, pesticidi, deterdţenti, toksične i radioaktivne tvari. Upotreba aktivnog mulja

najčešći je način pročišćavanja otpadnih voda, koji se pokazao vrlo učinkovit stvarajući

relativno kvalitetan efluent (Naidoo i Olaniran 2014). Ispuštanjem pročišćenih otpadnih voda

u prirodne vodotoke mijenjaju se prirodne vrijednosti parametara sastava vode, kako u

kvantitativnom, tako i u kvalitativnom smislu. Ispuštanje pročišćenih otpadnih voda još uvijek

opterećenih organskim tvarima, nutrijentima i različitim zagaĎivalima dovodi do

eutrofikacije, a procesi samopročišćavanja ostatka organskog opterećenja troše kisik otopljen

u vodi i dovode do njegova manjka. TakoĎer dolazi i do akumulacije onečišćivača u

površinskim vodama koje sluţe kao recipijent (Bhatia i Goyal 2013). UreĎaji za biološko

pročišćavanje otpadnih voda projektirani su za smanjenje biokemijske potrošnje kisika,

ukupne suspendirane tvari, dušika i fosfora iz otpadnih voda, dok se uklanjanju patogenih

mikroorganizama poklanjalo manje paţnje (Lucas i sur. 2014.) Iako se primarnim i

sekundarnim pročišćavanjem iz otpadnih voda ukloni i do 99 % bakterija fekalnog porijekla

(Lucas i sur. 2014; Servais i sur. 2007), to još uvijek nije dovoljno smanjenje da bi se

2

površinske vode koje su recipijent s ureĎaja za pročišćavanje otpadnih voda mogle koristiti za

kupanje i rekreaciju. Promjene u vodenom okolišu mogu povećati ranjivost organizama koji

ţive u vodi na toksične kemikalije zbog promjene kapaciteta organizma za prepoznavanje i

popravak oštećenja izazvanih toksikantima ili promjenom u ponašanju ţivotinja kao što su

migracije ili predatorstvo (Couillard i sur. 2008). MeĎutim, vrlo je vaţno naglasiti da se sastav

otpadnih (komunalnih i industrijskih) voda tijekom proteklih desetljeća promijenio. Povećala

se količina endokrinih modulatora, genotoksikanata, antimikrobnih lijekova, antikoroziva i

organofosfata u otpadnim vodama, vodotocima, pa i u vodi za piće. Njihov nalaz u

vodotocima zavisi od postupaka obrade otpadnih voda jer ih svi pročistači otpadnih voda ne

uklanjaju u cijelosti, tako da njihovo otpuštanje u vodotoke moţe čak biti kontinuirano

(Esteban i sur. 2014). Tvari strane organizmu (ksenobiotici) mogu utjecati na sposobnost

akvatičnih vrsta za prilagodbu na promjene uzrokovane različitim stresorima ili patogenim

bakterijama u okolišu. Ribe su vrlo osjetljive na promjene okolišnih uvjeta tako da njihovo

fiziološko stanje moţe posluţiti kao jedan od najranijih indikatora specifičnog zdravstvenog

statusa ekosustava (Kaur i Dua 2014).

U Virovitici je 1989. g. izgraĎen ureĎaj za biološko pročišćavanje (UBP) otpadnih voda grada

i industrije te Tvornice šećera Virovitica (TŠ). Pročistač je sekundarnog tipa pročišćavanja i

pomoću mehaničkih i bioloških metoda pročišćava komunalne i tehnološke otpadne vode.

Gradske otpadne vode mješovite su vode iz kućanstava i industrije te oborinske vode.

Industrijske otpadne vode prije ispuštanja u sustav gradske kanalizacije, zavisno od prirode

procesa, prolaze različite predtretmane. Odvodni sustav otpadnih voda završava na

mehaničkom i biološkom ureĎaju za pročišćavanje otpadnih voda koji je tehnološki

koncipiran tako da se na njemu zajedno pročišćavaju otpadne vode grada Virovitice i

tehnološke otpadne vode TŠ-a na anaerobno-aerobnom principu, tehnologijom aktivnog

mulja. Na tom ureĎaju otpadne vode nakon primarnog čišćenja (rešetka, pjeskolov, aerobni

mastolov) ulaze u bioaeracijske bazene i nakon toga se u sekundarnim taloţnicama obavlja

odvajanje aktivnog mulja i bistre faze. Konačni recipijent nakon pročišćavanja otpadnih voda

je kanal Manteč, Ţupanijski kanal i dalje rijeka Drava.

Radi dobivanja reprezentativnih uzoraka vode, sedimenta, mulja i riba razvijena je strategija

prikladna za UBP na kojem se čiste komunalne, šećeranske i bolničke otpadne vode. Prednost

zajedničkog pročišćavanja ovih vrsta otpadnih voda je razrjeĎenje organski visoko

opterećenih šećeranskih otpadnih voda komunalnim otpadnim vodama radi čega ne dolazi do

izlijevanja nepročišćenih otpadnih voda zbog gubitaka kroz propusni odvodni sustav ili

prelijevanjem u okoliš. Za vrijeme provoĎenja ovog istraţivanja odvijala se proizvodnja

3

šećera, u proljeće iz sirovog šećera dobivenog od šećerne trske, a u jesen iz šećerne repe.

Šećeranske otpadne vode, u odnosu na druge industrije koje ispuštaju otpadne vode u sustav

za njihovo sakupljanje i odvodnju, daju značajan doprinos hidrauličkom i netoksičnom

organskom opterećenju ureĎaja (Ingaramo i sur. 2009).

1.1. Cilj i znaĉaj istraţivanja

Odnos izmeĎu specifičnog doprinosa efluenta s ureĎaja za pročišćavanje otpadnih voda i

promjena u organizmima koji obitavaju u efluentu ili su mu izloţeni u prijemnicima

pročišćenih otpadnih voda ili mulju, uvelike je bio neistraţen. Isto tako, nedovoljno je

evaluirana učinkovitost uklanjanja iz otpadnih voda bakterija i neorganskih onečišćivača

(posebice antimikrobnih lijekova). Zbog toga je cilj ovog rada ispitati hipotezu da 1) efluent s

UBP-a uzrokuje biološke učinke na indikatorskim organizmima; 2) u pročišćenoj vodi i mulju

postoje bakterije rezistentne na antimikrobne lijekove koje mogu biti patogene za ribe i ljude,

a u sedimentu brojni antimikrobni lijekovi. Kako bi se ove hipoteze potvrdile, proveden je niz

testova kojima se dokazivao utjecaj na zdravstveni status riba koje obitavaju nizvodno od

ulijevanja prijemnika pročišćenih otpadnih voda. OdreĎivana je njihova mikrobiološka

kontaminacija, struktura tkiva, biokemijski profil krvi, oksidacijski stres, genotoksični učinci,

te mehanizam multiksenobiotičke otpornosti na gujavicama (MXR; engl. multixenobiotic

resistance), a za odreĎivanje mutagenosti tvari iz vode i mulja koristio se Ames test: (i)

provjeren je zdravstveni status riba, provedena je histopatološka obrada tkiva (za hipotezu 1);

(ii) fenotipskim testovima i masenom spektrometrijom - matricom potpomognutom laserskom

desorpcijom/ionizacijom i analizatorom vremena leta (MALDI-TOF MS, engl. Matrix-

assisted laser induced desorption ionization-time of flight-mass spectrometry) istraţen je veći

broj bakterijskih izolata uzoraka voda, riba i mulja (za hipoteze 1, 2); (iii) u krvi riba

istraţivani su biokemijski parametri i parametri oksidacijskog stresa (za hipotezu 1); (iv)

odreĎivana je učestalost nepravilnosti graĎe stanične jezgre; (v) nakon izlaganja testnih

organizama (gujavica) nepročišćenoj i pročišćenoj otpadnoj vodi i mulju odreĎivan je stupanj

staničnog detoksikacijskog mehanizma posredovanog aktivnošću ABC transportnih proteina

koji na sebe veţu i iz stanice izbacuju ksenobiotike, uključujući antropogeno stvorene

spojeve, sprečavajući na taj način potencijalno toksičan učinak u stanici (za hipotezu 1); (vi)

izvršeno je odreĎivanje koncentracije antimikrobnih lijekova u uzorcima voda i sedimenta (za

hipotezu 2).

4

Naglasak je stavljen na istraţivanje utjecaja pročišćenih otpadnih voda na ribe i gujavice kao

testne organizme, naročito u pogledu utjecaja svih korisnika javnog odvodnog sustava

(otpadne vode iz kućanstava, šećeranske i bolničke otpadne vode) što je jedinstven slučaj u

proučavanju učinkovitosti rada ureĎaja za pročišćavanje otpadnih voda.

U ovom se radu, dakle, istraţivao odnos čimbenika koji utječu na fizikalno-kemijske,

mikrobiološke, genotoksične i mutagene značajke voda koje ulaze i izlaze iz UBP-a, odnosno

djelovanje pročistača na smanjenje toksičnog utjecaja otpadnih voda. OdreĎivan je sastav

populacija riba koje obitavaju u neposrednim recipijentima (kanal Manteč i Ţupanijski kanal

prije utoka u Dravu), njihovo zdravstveno stanje, identificirane su mikrobiološke prijetnje

njihovom zdravlju, odreĎeni su hematološki pokazatelji citotoksičnosti i biokemijski profil

krvi. Na uzorcima vode i u aktivnom mulju obavljena je mikrobiološka pretraga, kao i

odreĎivanje mutagenog potencijala i prisutnost MXR inhibitora. Na taj način dobivena je

cjelovita slika utjecaja pročišćenih otpadnih voda grada Virovitice na ključne parametre

kakvoće i ekološkog stanja, a poglavito na mikrobiološke i toksikološke značajke vode i biote.

Takvo sveobuhvatno istraţivanje, uzimajući u obzir granične vrijednosti emisija

onečišćujućih tvari u otpadnim vodama (NN 80/13, NN 43/14, NN 27/15, NN 3/16),

poglavito fizikalno-kemijske, ekotoksikološke, organske i anorganske pokazatelje, do sada

nije provoĎeno.

Značaj ovog istraţivanja ogleda se u činjenici da je svaki ţivi organizam podloţan fiziološkim

i patološkim promjenama koje je moguće sagledati kroz kvalitativne i kvantitativne

pokazatelje na različitim razinama biološke organizacije, a koje su inducirane abiotičkim

(kakvoća vode, antibiotici i kemoterapeutici, tragovi metala) i biotičkim (vrsta, starost, spol,

mikroorganizmi) čimbenicima. UtvrĎivanje fiziološkog statusa te biokemijskih/kemijskih

profila tkiva (krvi) riba i njihovo korištenje kao bioloških senzora od iznimne je vaţnosti jer

oni mogu sluţiti kao dijagnostičke metode za procjenu zdravstvenog statusa i stupnja

ekološke ugroţenosti vodenog sustava (Affonso i sur. 2002; Čoţ-Rakovac i sur. 2008; Ferri i

sur. 2011; Topić Popović i sur. 2008). Prethodne studije i citološka istraţivanja pokazali su da

okoliš bitno utječe na morfologiju stanice i njezine regulatorne mehanizme. Dokazana je

korelacija izmeĎu pojave mikronukleusa i eritrocitnih nuklearnih abnormalnosti, te utjecaj

ekoloških faktora (temperatura, kisik, salinitet) na pojavu morfoloških promjena jezgri

(nepravilan oblik, jezgre s vakuolama, binuklearni eritrociti) riba (Polard i sur. 2011;

Strunjak-Perović i sur. 2009). Korištenjem novih kliničko-biokemijskih dijagnostičkih metoda

(raspon referentnih vrijednosti biokemijskih i kemijskih parametara tkiva), te modifikacijom

5

postojećih mikrobioloških dijagnostičkih metoda (brzi biokemijski dijagnostički i fenotipski

testovi) uz usporedbu s MALDI-TOF MS rezultatima mikrobiološke identifikacije skraćuje

se vrijeme do donošenja konačne dijagnoze i procjene onečišćenosti okoliša (Biswas i Rolain

2013; Braga i sur. 2012; El-Bouri i sur. 2012). OdreĎivanje mikrobioloških parametara

opisano je u brojnim istraţivanjima kao presudno za kakvoću vode (Cabral 2010; Garrido i

sur. 2014; Varela i Manaia 2013) i zdravlje riba (Novotny i sur. 2004; Stoskopf 1993), a oni

izravno ili neizravno utječu na zdravlje korisnika tih voda.

6

2. LITERATURNI PREGLED

2.1. UreĊaji za biološko proĉišćavanje otpadnih voda

Bez obzira na to što arheološki pronalasci upućuju da su sustavi sakupljanja i odvodnje

otpadnih voda graĎeni već 4 000 godina pr.n.e., prvi ureĎaji za pročišćavanje otpadnih voda

su se pojavili tek sredinom XIX stoljeća. Veći dio XIX stoljeća sanitarne otpadne vode, kao i

sve veće količine industrijskih otpadnih voda, ispuštale su se izravno u mora, u rijeke

nizvodno od naselja, jezera ili u tlo, često u neposrednoj blizini zdenaca iz kojih se zahvaćala

voda za piće. Za vrijeme epidemije kolere u Londonu sir John Snow prvi je ukazao na vezu

izmeĎu otpada ljudskog podrijetla i oboljenja vezanih uz vodu. Tema rasprava Kraljevskog

instituta Velike Britanije (Royal Institution of Great Britain) 1868. bila je onečišćenje vode za

piće sa slivnog područja planina Cader Idris i Plyalimmon (sjeverni Wales) nezdravim

„klicama“ i kemikalijama. U to vrijeme Fankland u Velikoj Britaniji i Finkener i Zinreck u

Njemačkoj započinju s uzorkovanjem voda iz zagaĎenih rijeka i njihovim analizama i

utvrĎuje se proces samopročišćavanja nizvodno od mjesta zagaĎenja (Wiesmann i sur. 2007).

ProvoĎenjem pokusa aeracijom otpadne vode utvrĎeno je da do smanjenja koncentracije

organske tvari dolazi tek nakon nekoliko tjedana. Smatra se da je Alexander Müller bio prvi

koji je 1869. godine naslutio da smanjenju organske tvari u otpadnoj vodi doprinose

mikrobiološki procesi (Wiesmann i sur. 2007). Veliki doprinos u razumijevanju procesa

pročišćavanja otpadnih voda dao je Winogradsky (1890) koji je ukazao na procese

denitrifikacije. On je ustvrdio da, za razliku od bakterija koje kao izvor energije koriste ugljik

iz organske tvari, postoje kemolitičko-autotrofne nitrificirajuće bakterije koje energiju

dobivaju oksidacijom i

a ugljik dobivaju redukcijom (Wiesmann i sur. 2007).

Razvoj industrije povećavao je onečišćenje rijeka i nametao potrebu ţurnog rješavanja ovog

problema. U Berlinu je s tim ciljem Hobrecht izgradio jedinstveni sustav za odvodnju

otpadnih i sakupljanje oborinskih voda, koje su se gravitacijski slijevale u središnju najniţu

točku, iz koje se ova voda koristila za navodnjavanje poljoprivrednih površina izvan grada.

Procjedna voda se sakupljala i odvodila keramičkim drenaţnim cijevima u kanale i rijeke.

Analizama je utvrĎeno da ova voda sadrţi znatno manje suspendirane i organske tvari, manju

vrijednost potrošnje i amonijaka, uz manju redukciju otopljenih i anorganskih tvari.

Dr. Angus Smith je objavio da se aeracijom otpadne vode moţe stabilizirati organska tvar a

1913. god. na Lawrence Experiment Station (SAD) utvrĎeno je da mikroorganizmi povezani s

7

uronjenim pločicama škriljevca poboljšavaju stabilizaciju organske tvari (Wiesmann i sur.,

2007). Na bazi ovog pronalaska britanski inţenjeri Edward Arden i William T. Lockett su

došli do zaključka da se višekratnom recirkulacijom krute tvari koja se akumulira u bačvama

za vrijeme aerobne stabilizacije, u trajanju od nekoliko sati, povećava stupanj stabilizacije

organske tvari i prvi put uveli pojam „aktivni mulj“. U narednim godinama ovaj proces

primijenjen je na model s kontinuiranim protokom uz korištenje aeracijskog bazena, bazena

za taloţenje aktivnog mulja i sistema za njegovu reciklaciju. Nakon više pokusa na pilot-

ureĎajima u Velikoj Britaniji i SAD-u, prvi ureĎaj za pročišćavanje otpadnih voda

tehnologijom aktivnog mulja izgraĎen 1920. godine u gradu Sheffeld u Velikoj Britaniji koji

je započinjao dugim meandriranim kanalom zbog aeracije. Na ureĎaju u Indianapolisu (SAD)

aeracija se vršila utiskivanjem zraka u cijevi perforirane pri dnu, a prvi površinski aerator s

vertikalnom osovinom pomoću kojeg se dopremao u otpadnu vodu kisik iz zraka i vršilo

miješanje aktivnog mulja izgradio je Bolton 1921. godine. U Njemačkoj su prvi ureĎaji za

obradu otpadnih voda izgraĎeni 1926. u Essen-Rellinghausenu i u Stahnsdorfu pokraj Berlina

izmeĎu 1929 i 1931. godine (Wiesmann i sur. 2007).

2.2. Fizikalno-kemijske analize

Provedba zaštite voda u Hrvatskoj regulirana je (Zakonom o vodama, NN 153/09, 130/11,

56/13, 14/14), Strategijom upravljanja vodama (NN 91/08), Drţavnim planom za zaštitu voda

(NN 8/99), Pravilnikom o graničnim vrijednostima emisije otpadnih tvari (NN 80/13, NN

43/14, NN 27/15, NN 3/16) i Uredbom o standardu kakvoće voda (NN73/13). Dosadašnja

istraţivanja kakvoće vode Ţupanijskog kanala provoĎena su u razdoblju od 1983. do 2003.

godine sa ciljem uporabe vode za navodnjavanje. Vrijednosti za KPKMn u tom razdoblju

kretale su se od 3,48 do 9,00 mgO2/L, BPK-5 od 2,16 do 24,17 mgO2/L a otopljenog kisika od

1,63 do 9,2 mg/L . Koncentracija amonijaka kretale su se u rasponu od 0,10 do >1,50 mgN/L

a nitrita od <0,01 do 0,20 mgN/L. Broj koliformnih bakterija bio je u rasponu od <5x102 do

105/100 mL a broj aerobnih bakterija na 22 °C od od <10

3 do 10

5/mL (Šimunić i sur. 2006).

2.3. Biološke analize utjecaja oneĉišćenja na okoliš

Sve do 1980. godine osnovni cilj pročišćavanja otpadnih voda bio je udovoljiti estetskim i

okolišnim kriterijima, nakon čega se, zbog rastućeg onečišćenja otpadnih voda otrovnim

8

tvarima, sve veća pozornost daje brizi za ljudsko zdravlje i bioti vodenih sustava kao

prijemnika pročišćenih otpadnih voda. UreĎaji za pročišćavanje otpadnih voda projektirani su

na način da iz njih uklanjaju suspendirane tvari, organsku tvar i nutrijente, a nacionalnim

propisima utvrĎeni su kriteriji za ispuštenu otpadnu vodu u toj razini čišćenja. Nacionalni

propisi za ispuštanje organskih mikrozagaĎivala i polarnih spojeva u vode ne postoje, a

najčešće se mjerenja ovih spojeva u otpadnim vodama niti ne provode. Uz mjerenje

anorganskih (metali, slabi metali-metaloidi, nemetali) i organskih toksikanata (ugljikovodici,

pesticidi, detergencije, klorofenoli, TBT) u središte istraţivanja dolaze nova onečišćivala (npr.

antibiotici, antiepileptici, analgetici i protuupalni spojevi, regulatori lipida, beta-blokatori,

diuretici, kontrastna sredstva, mirisi, psihostimulansi, dezinficijensi, antidepresivi,

plastifikatori (Ašperger i sur. 2013). Značaj sve više dobivaju toksikološka i ekotoksikološka

istraţivanja. Dok toksikologija proučava štetne učinke kemijskih tvari na ţive organizme,

pozornost pridaje ciljanim organima i promjenama u njima uzorkovanim kemikalijama,

proučava pretvorbu toksikanata u organizmu, tvorbu metabolita i zaštitne mehanizme,

ekotoksikologija se bavi istraţivanjem toksičnih učinaka onečišćivača prirodnog i

antropogenog porijekla na sastavnice ekosustava, odnosno ekosustav u cjelini (Truhaut 1977).

U najnovije vrijeme umjesto pojma ekotoksikologija, sve se češće navodi pojam ekologija

stresa zbog neprijeporne činjenice da su, uz izravno djelovanje kemikalija na organizme u

okolišu, prisutni i drugi, abiotički i biotički aspekti negativnog utjecaja na okoliš (van Stralen

2003). Utjecaj na ţivi svijet velikog broja kemikalija koje dospijevaju u okoliš, zbog njihove

meĎusobne interakcije uvjetovane nizom fizikalno-kemijskih čimbenika, ne moţe se utvrditi

mjerenjem samo kemijskih pokazatelja, odnosno u turbulentnim medijima kao što je voda to

bi moglo navesti na pogrešne zaključke. Interakcije meĎu kemikalijama mogu biti sinergijske,

antagonističke, potencirajuće ili aditivne (Stepić 2010). Zbog toga se rezultati toksikoloških

ispitivanja kojima se procjenjuje utjecaj kemikalije na testni organizam u laboratorijskim

uvjetima ne mogu izjednačiti s utjecajem na ţiva bića u uvjetima okoliša. Biološka

istraţivanja uključuju sve analize koje ukazuju na interakciju izmeĎu biološkog sustava i

potencijalno štetnog kemijskog, fizikalnog ili biološkog djelovanja (WHO 1993). Često se

negativni utjecaj zagaĎivala na ţivi svijet uočava tek nakon incidentnog zagaĎenja, ili ako je

onečišćenje bilo prisutno kroz duţe vrijeme. U takvim slučajevima potreban je dugi period,

nekad i deseci godina, da se ekosustav oporavi, a nekad ugibanjem ţivih bića nestaje dio

genetičke informacije, smanjuje se biološka raznolikost i mogućnost oporavka ekosustava.

Radi sprečavanja štetnog utjecaja zagaĎenja na okoliš razvile su se biološke metode i

uspostavio biološki nadzor (biomonitorig) kojim se utvrĎuje utjecaj zagaĎivala na različitim

9

razinama biološke organizacije. Ekološki pokazatelji promjena mogu se utvrditi na razini

ekosustava, zajednice ili populacije korištenjem ekoloških indikatora kao što su analize

promjena u populacijama, brojnost jedinki, mortalitet, natalitet, starosna struktura, omjer

spolova, gustoća i raspored jedinki u prostoru. Prate se i promjene u sastavu zajednica

kvantitativnim i kvalitativnim istraţivanjem. Kvantitativnim ispitivanjem se odreĎuju vrste

ţivih bića koje nastanjuju sustav uvaţavajući činjenicu da svaka vrsta u drugačijoj mjeri

podnosi promjene uzrokovane onečišćenjem. Razvijen je saprobni sustav s osnovnim

kategorijama kopnenih voda (Kolkwitz i Marsson 1902) gdje je kriterij bio koncentracija

organske tvari, količina otopljenog kisika i raznolikost flore i faune (oligosaprobna, β-

mezosaprobna, α-mezosaprobna i polisaprobna voda s najmanje kisika zbog visoke

koncentracije organske tvari i najmanjom raznolikosti flore i faune). Biološko odreĎivanje

kvalitete vode zasniva se na indikatorskim vrstama (bioindikatorima) čiji pronalazak ili

izostanak upućuje na organsko onečišćenje sustava. Prvi popisi obuhvaćali su oko 800 biljnih

i ţivotinjskih indikatorskih vrsta (Kolkwitz i Marsson 1908; Kolkwitz i Marsson 1909).

Kvantitativna istraţivanja zajednica podrazumijevaju odreĎivanje vrsta i procjenu njihove

brojnosti, a za prikaz ovih istraţivanja uveden je saprobni indeks (Liebman 1962; Pantle i

Buck 1955; Sladeček 1973). Kasnije se za prikaz kvantitativnih istraţivanja koristi indeks

raznolikosti (npr. Shannon-Wienerov ili Shannonov indeks) za čiji izračun je potrebno

ustanoviti broj pronaĎenih vrsta i ukupan broj naĎenih jedinki svake vrste. Primjenom metoda

biotičkog indeksa koriste se indikatorske vrste, najčešće makrozoobentos, za koje se utvrĎuje

prisutnost ili odsutnost, a svakoj se biotičkoj skupini pridaju bodovi koji su u korelaciji s

njihovom osjetljivošću prema onečišćenju. Ţivotinjama koje su više osjetljive na onečišćenje i

pronalaze se u nezagaĎenim vodama dodaje se veća brojčana vrijednost i obrnuto.

Istraţivanjima utjecaja zagaĎenja na razini zajednice i populacije kao ekološkim indikatorima

najčešće se otkrivaju već poodmakle promjene. UtvrĎivanjem promjena na razini organizma,

organa, tkiva, stanice i molekule, tj. biomarkerima najranije se mogu dobiti informacije o

mogućem pogoršanju zdravlja promatrane jedinke, populacije i biocenoze u cijelini (Koeman

i sur. 1993). Pokazatelji promjene na organizmima kao bioindikatorima su morfološke i

bioenergetske prirode i time izdvojeni iz skupine biomarkera (Van Gastel i Van Brummelen

1994). Biomarkeri predstavljaju histopatološke, imunološke, fiziološke, detoksikacijsko-

enzimatske, biokemijske i molekularno-genetičke promjene na tkivu, organu, stanici ili

molekuli.

10

2.4. Mikrobiološka istraţivanja

Voda, posebice ako je opterećena organskim tvarima, okoliš je u kojemu uspješno opstaju

pripadnici mnogih bakterijskih rodova. Mikrobiološki sastav otpadnih voda odreĎuju bakterije

podrijetlom iz probavnog sustava kraljeţnjaka. Najčešće se radi o bakterijama Bacteroides

spp, Bifidobacterium spp., Chlostridium perfingens, Enterobacter aerogenes, Escherichia

coli, Lactobacillus spp. i Enteroococcus fecalis. Budući da je otpadna voda jednim dijelom

porijeklom iz domaćinstava, ljudski patogeni mogu se naći i u muljevima pročistača otpadnih

voda. Najčešće bakterije ove skupine su Campilobacter spp., Leptospira spp., Salmonella

paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae i Vibrio cholerae.

Osim navednih, u otpadnim vodama nalaze se i bakterije rodova Cytophaga, Micrococcus,

Pseudomonas, Bdellovibrio, Chromobacterium, Aeromonas, Rhodispirillium i druge vrste. Od

protozoa načešće se u otpadnim vodama mogu naći Entamoeba histolytica i Giardia

intestinalis a od virusa adenovirusi, enterovirusi (koksaki virusi, echovirusi i poliovirusi),

parvovirusi (hepatitis A virus) i reovirusi (Pejić 2014.).

Dokazano je da je normalna bakterijska flora riba odraz bakterijske flore vode u kojoj plivaju.

Ipak, postoje neke bakterijske vrste koje su obligatne ribljim domaćinima i bez njih ne mogu

opstati (Frerichs i Roberts 1989). S obzirom na to da se ribe trajno nalaze u vodenoj suspenziji

mikroorganizama, njihova je vanjska površina sa njima u stalnom doticaju (Topić Popović

1997). No, prema Austin i Austin-u (1987), tek naseljavanje tih bakterija u ribi je od posebnog

značaja, a ono moţe biti sljedeće:

a- bakterije se mogu naseliti na vanjsku površinu ribe i tu postati dijelom rezidentne mikroflore

koja inhibira kolonizaciju drugim mikroorganizmima

b- bakterije mogu biti privučene ili slučajno dospjeti na mjesto ozljede (oštećenje koţe,

nedostatak ljusaka) i tu se razmnoţiti

c- bakterije se mogu zaustaviti na škrgama i tu postati dijelom rezidentne mikroflore

d- bakterije mogu u ribu ući kroz usta, vodom ili česticama hrane, i dospjeti u probavni sustav.

Pojedini sojevi postanu dijelom normalne mikroflore, neki budu uništeni ili postaju patogeni, a

drugi prolaze kroz probavni sustav i izluče se izmetom.

Općenito uzevši, broj aerobnih heterotrofnih bakterija koje se nalaze na površini ribe odgovara

njihovom broju u okolnoj vodi. Predstavnici bakterijske populacije na površini slatkovodnih riba

najčešće su vrste Acinetobacter spp., Aeromonas hydrophila, Alcaligenes piechaudii,

Enterobacter aerogenes, E. coli, Flavobacterium spp., Micrococcus luteus, Moraxella spp.,

11

Pseudomonas fluorescens i Vibrio fluvialis (Allen i sur. 1983; Christensen 1977; Southgate

1993). Velika populacija mikroorganizama nalazi se u crijevima riba, gdje je broj bakterija

daleko veći nego u okolnoj vodi, ukazujući na to da u probavnom sustavu vladaju povoljni uvjeti

za mikroorganizme. Nedvojbeno je da veliki broj tih mikroorganizama potječe iz hrane, u kojoj

se većinom nalaze gram-pozitivni mikroorganizmi (Ringo i Strom, 1994). Bakterije koje se

nalaze u unutrašnjim organima riba, gdje neke mogu uzrokovati bolesti, su Lactobacillus spp.,

Mycobacterium spp., Nocardia spp., Renibacterium salmoninarum, vrste iz roda Aeromonas,

vrste iz porodice Enterobacteriaceae, poput Edwardsiella ictaluri, Yersinia ruckeri, zatim

Flavobacterium spp., Pseudomonas anguilliseptica, Pseudomonas fluorescens, Vibrio spp.,

Vibrio anguilarum, Acinetobacter spp., Photobacterium damselae i druge vrste. Stresori

(mikrobiološko, kemijsko, organsko onečišćenje) mogu narušiti zdravlje riba. Osim toga,

izlaganje stresorima u okolišu moţe smanjiti postotak preţivljavanja riba, smanjiti njihov

reproduktivni uspjeh sa mogućim ozbiljnim posljedicama na preţivljavanje cijele populacije riba

u vodotoku (Topić Popović 1997).

2.5. Histološke pretrage

S obzirom na to da onečišćenje okoliša moţe dovesti do odstupanja od normalne strukture tj.

manjih ili većih histopatoloških promjena, histološke metode se sve češće koriste kako bi se

bolje odredio zdravstveni status riba u biomonitoringu njihove ţivotne sredine. Prednost

histološkom pregledu organa riba leţi i u činjenici da se ribe u vodenim ekosustavima nalaze

na vrhu trofičke piramide, a zbog učinaka biokoncentracije i bioakumulacije dobri su

indikatori zagaĎenja vodenih ekosustava (Dallinger i sur. 1987; Polak-Juszczak 2012). Zbog

izravnog doticaja s vodom, u riba su djelovanju toksikanata najizloţenije škrge, a štetni se

učinci pojavljuju u vidu hiperplazije i hipertrofije epitela, te odizanja epitela kao regresivne

promjene. U cilju utvrĎivanja utjecaja zagaĎivala provode se histološke pretrage organa koji

su pridruţeni probavnom sustavu (npr. jetre), slezene i bubrega kao krvotvornih i ekskretornih

organa, a često i reproduktivnih organa.

12

2.6. Biokemijske i hematološke pretrage krvi

Analize krvi u humanoj medicini, kao i kod viših kraljeţnjaka (sisavci, ptice) vrlo su vaţne

metode utvrĎivanja fizioloških i patoloških stanja organizama, a u proučavanju zdravstvenog

statusa riba postaju sve značajniji čimbenik. Proteini krvne plazme su globularni proteini, a

plazma sadrţi više desetaka različitih proteina od kojih najveći dio dolazi u tragovima.

Proteini su i sastavni dio svake stanice. Stvaraju kontraktilne elemente i enzime koji

oslobaĎaju energiju potrebnu za odrţavanje ţivota. Nalaze se u krvi gdje imaju funkciju

transporta lijekova, hormona, vitamina i elektrolita koji se veţu na proteine. Pojedini proteini

imaju specifične funkcije, uključujući i zaštitnu funkciju (enzimi, hormoni, inhibitori enzima,

faktori koagulacije, imunoglobulini) (Čolak, 2011). Utječu na koloidno-osmotski tlak i time

na raspodjelu vode izmeĎu vaskularnog i meĎustaničnog prostora (Karlson 1988; Štraus

1988). Lipidi su, osim kao izvor energije neophodni za rast, razmnoţavanje, sastavni dio

stanične membrane, i sastavni su dio steroidnih hormona (Cooper i Hausman 2010). Lipidi

krvne plazme prelaze u tkiva i iz tkiva. Predstavljaju najvaţniju grupu masnih tvari sa gledišta

energetskih potreba organizma.

Glukoza je jednostavni šećer monosaharid, koji se nalazi u hrani, krvi i vaţan je izvor energije

za organizme. Ona je završni produkt probave ugljikohidrata. Oksidacijom glukoze proizvodi

se energija za tjelesne stanice. Ureja je diamid karbonske kiseline koji je glavni metabolički

produkt dušikovih tvari. U metabolizmu se razgraĎuje odreĎena količina proteina, a dušik se

izlučuje kao mokraćevina putem urina. Metabolizmom aminokiselina nastaje u amonijak,

NH3, odnosno NH4+. Dnevna količina izlučenog kreatinina nalazi se pod neznatnim utjecajem

mišićnog rada ili volumena izlučenog urina. Njihov laboratorijski nalaz moţe biti

upotrijebljen kao mjera funkcije ekskretornih organa. Kreatinin se normalno proizvodi u

ujednačenim količinama kao rezultat cijepanja fosfokreatina i izlučuje se u urinu. Enzimi,

poput alkalne fosfataze, kreatin kinaze, transaminaze, gama glutamil transpeptidaze, laktat

dehidrogenaze, nalaze se u staničnim membranama i jezgrama i kataliziraju hidrolizu

fosfatnih estera, prijenos fosfatne grupe iz fosfokreatina na ATP, proces provoĎenja amino

grupe iz jedne molekule na drugu, odnosno proces provoĎenja aminokiseline u keto kiselinu

transaminacijom, interkonverziju laktata i piruvata, a nalaze se u gotovo svim tkivima riba.

(Čolak, 2011).

13

2.7. Ekotoksikološki testovi na modelnim organizmima

Kao modelni organizam u ekotoksikološkim testovima često se koriste gujavice. Gujavice

pripadaju razredu Oligochaeta su dvospolci i jedna su od najvaţnijih i najbrojnijih terestričkih

porodica. Karakterizira ih bilateralna simetrija te jasna kolutičavost. Tijelo je zaštićeno

kutikulom ispod koje se nalazi jednoslojni epiderm te sloj prstenastih i uzduţnih mišića koji

im omogućuju kretanje. Tjelesna šupljina (celom) ispunjena je celomskom tekućinom koja

sluţi kao hidrostatski skelet te direktno utječe na pokretanje te ispruţanje tijela. Opt jecajni

sustav je zatvoren te se disanje odvija isključivo preko koţe. Apsorpcija se odvija preko

probavnog sustava, ali i preko koţe.

Njihova uloga u terestričkim zajednicama je višestruka – miješajući slojeve tla doprinose

poboljšavanju kvalitete tla te prozračivanju, povećavajući propusnost tla utječu na hidraulička

svojstva te sudjeluju u mineralizaciji organske tvari čime direktno utječu na kemiju tla

(Edwards i Bohlen, 1996).

Gujavica Eisenia fetida (Savigny, 1826) epigejna je vrsta koja s obzirom na mogućnost

apsorpcije preko kutikule i probavne površine moţe biti izloţena širokom spektru

potencijalno toksičnih onečišćivača. Karakterizira je kratak ţivotni ciklus, brzi reprodukcijski

potencijal, laka dostupnost, jednostavnost za uzgoj te odrţavanje. Upravo iz tih razloga,

prema OECD protokolu (1984) preporučena je kao izvrstan modelni organizam za

ekotoksikološka ispitivanja tla.

2.8. Mehanizam multiksenobiotiĉke otpornosti

Mehanizam multiksenobiotičke otpornosti (MXR; engl. multixenobiotic resistance) kao

pojam u znanosti uveo je akademik Branko Kurelec (1992) te ga je okarakterizirao kao

mogućnost obrane organizma od okolišnih potencijalno štetnih spojeva. MXR omogućuje

zaštitu stanice (organizma) od toksičnih tvari. MXR kao obrambeni mehanizam zasniva se na

aktivnosti ABC transportnih proteina čija je prisutnost utvrĎena u gotovo svim organizmima

od bakterija pa sve do kraljeţnjaka (Kurelec 1992; Litman i sur. 2001; Sauerborn Klobučar i

sur. 2010). ABC transportni proteini (engl. ATP-binding cassette) najveća su porodica dosad

otkrivenih transmembranskih proteinskih porodica. Glavni predstavnici ABC transportera

14

uključeni u MXR mehanizam su: P-glikoprotein (P-gp), MRP (engl. multidrug resistance-

associated protein), BCRP (engl. breast cancer resistance protein) (Bard i sur. 2000; Litman i

sur. 2001). Neki okolišni spojevi, bilo prirodnog ili antropogenog podrijetla, mogu inhibirati

ABC proteine tj. MXR mehanizam. Takve spojeve nazivamo MXR inhibitorima. Oni mogu

djelovati pojedinačno kao jedan spoj ili u sinergiji, kada blokirajući transportnu aktivnost

ABC proteina onemogućuju izbacivanje drugog potencijalno štetnog spoja iz stanice (Epel i

sur. 2008). U konačnici to moţe dovesti do akumulacije štetnih spojeva unutar same stanice,

što predstavlja potencijalnu opasnost za organizam. Upravo zato, mjerenje aktivnosti MXR

mehanizma moţe posluţiti kao izvrstan biomarker za biomonitoring zagaĎenja okoliša MXR

inhibitorima.

Princip samog testa zasniva se na mjerenju fluorescentnog supstrata (u našem slučaju

Rodamin123) akumuliranog u tkivu. Mjerenjem fluorescentnih vrijednosti u cijelom

organizmu dobivamo jasan uvid u stupanj inhibicije MXR mehanizma (Epel i sur. 2008). U

slučaju inhibicije ABC transportera, dolazi do zaostajanja fluorescentnog supstrata u stanici i

njegove akumulacije u organizmu. Ukoliko testiran spoj ili smjesa spojeva nema MXR

inhibitorsko svojstvo, transportni proteini će učinkovito izbacivati fluorescentni supstrat izvan

stanice (organizma), te na taj način sprječavati potencijalno štetan učinak na organizam.

2.9. Mikronukleus test

Onečišćenje okoliša moţe dovesti do pojave citogenetičkih oštećenja, a kao česta metoda za

odreĎivanje genotoksičnog učinka, zbog svoje jednostavnosti i učinkovitosti, koristi se

mikronukleus test. Mikronukleus nastaje zbog oštećenja kromosoma (npr. loma kromosoma)

ili poremećaja funkcije diobenog vretena pa se pojedini dijelovi ili cijeli kromosomi ne uspiju

integrirati u jezgru stanice nastale diobom. Mikronukleus se pod svjetlosnim mikroskopom

moţe vidjeti kao mala jezgra čiji promjer ne prelazi 1/3 promjera glavne jezgre (Fenech 2000;

Fenech 2003). Za razliku od artefakata nastalih bojanjem preparata ne reflektira svjetlost, nije

povezan s jezgrom, boji se jednako kao i stanična jezgra (Fenech 2000; Jiraungkooskul i sur.

2007). Kod riba koje nisu bile izlagane genotoksičnim agensima eritrociti s mikronukleusom

se relativno rijetko pojavljuju te njihova spontana pojava varira ovisno o vrsti ribe. Učestalost

spontano nastalih razina MN-a kreće se od 0,017 % kod orade (Sparus aurata) (Strunjak-

Perović i sur. 2009), 0,02-0,03 % kod šarana (Cyprinus carpio) (Klobučar i sur. 2010), 0,03 %

kod vrste Puntius altus (Jiraungkoosskul i sur. 2007) do 0,06 % kod vrste Trematomus

15

newnesii (van Ngan i sur. 2006). Kod tilapije (Oreochromis niloticus) MN se pojavljuje

prosječno 0,04 % (de Campos Ventura i sur. 2007) s najmanjom frekvencijom u kasnu jesen

(0,0067 %) a najviše u ljeto (0,034 %) (da Silva Souza i Fontanetti 2006). Pojava eritrocita s

mikronukleusima povezana je s utjecajem genotoksikanata u vodi, čak i kad su oni kronično

prisutni i u manjim koncentracijama. Učestalost pojave MN veća je s povećanjem

koncentracije genotoksikanata (Carola i sur. 2014). Izlaganje teškim metalima (bakar i

kadmij) moţe dovesti do pojave jezgrinih nepravilnosti (ENA; eng. erythrocytic nuclear

abnormalities) u eritrocitima riba (Günner 2011). ENA podrazumijevaju morfološke

promjene oblika jezgre crvenih krvnih zrnaca. In vivo i in vitro istraţivanja genotoksičnog

potencijala olova nisu utvrdila povećan broj mikronukleusa u odnosu na ostale nepravilnosti

jezgri, tako da se u istraţivanju Monteiro i sur. (2011) ENA pokazao kao bolji biomarker za

ispitivanje genotoksičnog utjecaja olova. Poredbena istraţivanja stupnja genotoksičnih

učinaka teških metala ( , , , i ) u nezagaĎenoj vodi i vodi zagaĎenoj

nepročišćenim komunalnim otpadnim vodama, te u vodama intenzivne poljoprivredne

proizvodnje ukazuju na mogući genotoksični potencijal i uvjetovanost pojave MN-a i ENA-e

nakon izloţenosti teškim metalima (Omar i sur. 2012).

2.10. Oksidacijski stres

Do oksidacijskog stresa moţe doći na razini stanica, tkiva ili čitavog organizma, što za

posljedicu ima lipidnu peroksidaciju s reaktivnim aldehidima kao krajnjim proizvodima.

Nusproizvod lipidne peroksidacije su reaktivne tvari tiobarbiturne kiseline (eng.

thiobarbituric acid reactive substances; TBARS) i često se koriste kao biomarker

oksidacijskog stresa (Ribera i sur. 2001).

Uzrok oksidacijskom stresu mogu biti patološka stanja kao što su razne ozljede tkiva, šok,

upala, sepsa, ishemija i reperfuzija, tumori, metaboličke bolesti i imunološki poremećaji.

(Ţarković i sur. 2001). Prilikom oksidacijskog stresa dolazi do pomaka ravnoteţe u staničnim

osidacijsko-redukcijskim reakcijama, što dovodi do prekomjernog stvaranja slobodnih

radikala, tj. atoma ili molekula koji u vanjskoj ljusci imaju nespareni elektron (Poli i Parola

1997; Sies 1985). Na taj se način narušava ravnoteţa slobodnih radikala i mogućnost stanice

da ih neutralizira. Kako je redukcija kisika nepotpuna, dolazi do stvaranja niza reaktivnih

kisikovih spojeva (Reactive Oxygen Species, ROS). ROS je zajednički naziv za radikale

kisika kao i za njegove reaktivne neradiklane derivate kao što su superoksidni anion

16

perhidroksilni radikal hidroksilni radikal ( vodikov peroksid ,

hipokloritna kiselina (HClO) i drugi. Uz reaktivne kisikove spojeve, veliki značaj imaju i

reaktivni dušikovi spojevi (RNS; engl. reactive nitrogen species) u koje se ubrajaju dušikovi

slobodni radikali kao što su dušikov(II)oksid ( i dušikov(IV)oksid ( , te spojevi i

molekule kao peroksinitrit ( ) i nitrozilni kation ( ). Neki se reaktivni spojevi mogu

oksidoredukcijskim reakcijama prevesti u još agresivnije oblike. Npr. superoksid moţe

reagirati s vodikovim peroksidom čime nastaje vrlo toksičan hidroksilni radikal (1), a u

reakciji s dušik(II)oksidom (NO) nastaje izuzetno agresivan oblik, peroksinitrit (2).

•- • -

2 2 2 2O + H O OH + O + OH (1)

•- -

2O + NO ONOO (2)

Izvori slobodnih radikala mogu biti endogeni i egzogeni. Endogeni slobodni radikali u

organizmu mogu nastati tijekom metabolizma kisika, fagocitoze, kemotaksije, apoptoze,

koagulacije, hipoksije ili hiperoksije. Egzogeni izvor slobodnih radikala mogu biti dim

cigareta, lijekovi, prehrana, pesticidi, radioaktivno zračenje ili UV-zračenje (Šmuc, 2009) .

Uslijed oksidacijskog stresa najčešće dolazi do oštećenja DNA koja mogu izazvati promjenu

(mutaciju) ili smrt stanice. ROS uzrokuju oštećenja proteina sa sulfhidrilnom skupinom a

lipidna peroksidacija dovodi do kroničnih poremećaja koji mogu ugroziti ţivot jedinke

(Ţarković 2000). Mjerenje razine ovih spojeva antioksidacijske obrane koristi se kao

biomarker toksičnog djelovanja onečišćenja (Ašperger i sur. 2013).

2.11. AMES test

AMES test, kao metodu detekcije mutagena, u znanost je po prvi puta 1973. g. uveo Bruce

Ames. S obzirom na to da većina mutagenih/kancerogenih tvari oštećuje DNA molekulu i

izaziva mutacije, princip AMES testa zasniva se na utvrĎivanju genske mutacije kao odgovora

na djelovanje pojedinog spoja. Test se provodi pomoću posebno konstruiranih test-sojeva

bakterije vrste Salmonella typhimurium koja nosi mutaciju u genu za sintezu histidina, tj.

auksotrofa za histidin (his-). U istraţivanjima se najčešće koriste 2 soja bakterije S.

typhimurium: TA 100 i TA 98. TA 100 je oznaka za uzgojen mutantni soj u genu za histidin

G46. TA 98 je oznaka za uzgojen mutantni soj u genu za histidin D3052. Oba soja su mutanti

u genu za liposaharidnu ovojnicu i genu za popravak DNA. Ovi sojevi dodatno sadrţe R

faktor plazmid (i otpornost na ampicilin) koji ih čini izuzetno osjetljivim na velik broj

17

kancerogena u smislu stvaranja povratnih mutacija, te posebno otpornim na toksičnost

njihovih meĎuprodukata.

Dodatak mutagena u hranjivu podlogu s navedenim sojevima izazvat će mnogo mutacija, a

njihov mali dio predstavljat će i reverziju prvobitne mutacije u genu za biosintezu histidina, te

će u tako mutiranih bakterija ponovo doći do sinteze histidina. Ti se revertanti razmnoţavaju

bez dodatka histidina u hranjivoj podlozi, ubrzo izrastu vidljive kolonije koje se mogu brojat i,

a broj revertanata predstavlja kriterij za mutagenost (ISO 162420 2005; Mortelmans i Zeiger

2000; Pavlica 2012). Ukoliko je pojedini spoj mutagen, vjerojatnost da je istovremeno i

kancerogen iznosi 90 %. Druga vaţna značajka jest da se testiranje spojeva Ames testom

izvodi dvojako: sa i bez metaboličke aktivacije. Naime, enzimski sustavi u jetri i drugim

tkivima sisavaca mogu neke potencijalne karcinogene pretvoriti u njihove aktivne oblike.

Kako bakterije S. typhimurium nemaju tih enzima oni se prilikom testa moraju dodati u

hranjivu podlogu kako bi se mogli detektirati i tzv. premutageni, odnosno prekarcinogeni.

Kako bi rezultati dobiveni AMES testom bili primjenjivi i na eukariotske organizme, kao

aktivacijski metabolički sustav u in vitro testovima na mutagenost uvodi se

postmitohondrijska frakcija (S9) homogenata jetre štakora tretiranih s jednom od tvari koje

induciraju enzimski sustav oksigenaza miješanih funkcija ovisnih o citokromu P450 (Sinal i

sur. 1999; ISO 162420 2005). Direktni mutageni mogu se dokazati u opisanom postupku i bez

dodatka S9 frakcije, te se takav test naziva AMES test bez aktivacije. Najveća prednost

AMES testa u usporedbi sa ţivotinjskim testom na kancerogenost je mogućnost testiranja

sloţenih uzoraka, kako se oni u okolišu jedino i nalaze (voda, zrak, hrana i aditivi, nafta,

pesticidi, kozmetika, lijekovi i dr.).

18

3. MATERIJALI I METODE

3.1. UreĊaj za biološko proĉišćavanje otpadnih voda i lokacije za uzimanje

uzoraka

Na ureĎaju za biološko pročišćavanje (UBP) otpadnih voda grada Virovitice godišnje se

pročisti 1 900 000 otpadnih voda iz grada Virovitice s prigradskim naseljima i 250 000

otpadnih voda Tvornice šećera Viro (TŠ), a aglomeracija koja pripada ureĎaju broji

otprilike 21 000 stanovnika. Projektirani kapacitet UBP-a je 41 000 E.S. (1 E.S.=60gBPK-

5/dan). Hidrauličkom i organskom opterećenju sustava za sakupljanje i odvodnju otpadnih

voda koje pristiţu na UBP od gospodarskih subjekata najviše pridonosi Opća bolnica

Virovitica s 300 postelja u bolničkoj zdravstvenoj zaštiti, 53 postelje u dnevnoj bolnici i 655

zaposlenika (Izvješće financijske revizije za 2011. godinu Drţavnog ureda za reviziju).

Godišnje se u sustav za sakupljanje i odvodnju otpadnih voda isporuči 46 938 m3 bolničkih

otpadnih voda (4,9 % od otpadne vode svih korisnika javne kanalizacije) s korekcijskim

koeficijentom k1=1,68 (korekcijski koeficijent k1 izraţava sastav otpadnih voda kroz

pokazatelje onečišćenja voda prisutnost opasnih i drugih onečiščujućih tvari u otpadnim

vodama, NN 82/10) i prosječnim dnevnim opterećenjem od 40 kg BPK-5. Virkom d.o.o.

Virovitica ispušta godišnje 26 695 m3 otpadne vode (o.v.) od pranja pješčanih filtara za

pripremu vode za piće, Silosi d.d. Virovitica ispuštaju 7 251 m3 o.v. s k1=2,70 i 19,07 kg

BPK-5/dan, Hrvatski duhani d.d. 7 426 m3

o.v. s k1=1,17 i 2,53 kg BPK-5/dan , R.S. Metali

d.d. Pogon Rapid Virovitica 4 121 m3 o.v. s k1=0,29 i 0,11 kg BPK-5/dan, TVIN d.d. 2 346

m3 o.v. s k1=1,08 i 2,98 kgBPK-5/dan i Vitrex d.d. 907 m

3 o.v. s k1=0,51 i 0,11 kg BPK-

5/dan. Na ureĎaj dolazi 30-50 % drugih voda poput procjednih i oborinskih voda. Godišnji

doprinos ostalih gospodarskih subjekata manji je od 900 m3 (Kepec S, 2015). Slika 1.

prikazuje shemu projektiranog i izgraĎenog UBP-a grada Virovitice. Primarno pročišćavanje

otpadnih voda odvija se na automatskoj rešetki s udaljenošću izmeĎu štapova od 5 cm,

uzduţno aeriranom pjeskolovu i mastolovu ukupnog kapaciteta 390 L/sek i volumena od 120

m3. Sekundarno pročišćavanje odvija se u dva bioaeracijska bazena ukupnog volumena 8 000

m3 opremljenih plivajućim turbinama za aeraciju, dvije sekundarne taloţnice sa zgrtačem

aktivnog mulja ukupnog volumena 1 160 m3 i crpilištem aktivnog mulja iz kojeg se dio mulja

(povratni mulj) vraća u bioaeracijske bazene, a višak mulja u lagune šećeranskih otpadnih

voda.

19

Slika 1. Projektirani i izgraĎeni UreĎaj za biološko pročišćavanje otpadnih voda grada

Virovitice (UBP)

IzgraĎeno:

1: Taloţne lagune za karbonatni mulj, 2: Taloţne lagune za zemljani mulj, 3: Kompenzacijska

laguna, 4: Rezervna laguna, 5: Crpilište tehnološke otpadne vode TŠ, 6: Izmjenjivač topline,

7: Anaerobni fermentor, 8: Otplinjač, 9: Lamelni separator, 10: Crpilište anaerobnog mulja,

11: Bioaeracijski bazen, 12: Sekundarna taloţnica, 13: Crpilište aerobnog mulja, 14:

Plinosprem, 15: Baklja za spaljivanje bio-plina, 16: Crpilište komunalne otpadne vode, 17:

Automatska fina rešetka, 18: Aerirani pjeskolov-mastolov, 19: Mjerni ţlijeb

Nije izgraĎeno:

20: Primarni zguščivač mulja, 21: Izmjenjivač topline, 22: Digestor za anaerobnu razgradnju

mulja, 23: Sekundarni zguščivač mulja, 24: Strojna dehidracija mulja, 25: Plinosprem, 26:

Baklja za spaljivanje bio-plina.

11 11

19 18

IZ GRADA

ODVOZ NA DEPONIJU

16

17

7

8 9

5

15

14

6

10

ODVOZ MULJA

1

4

1

2

3

2

Manteč 13

26

22 25

24 23 20

21

O

12 12

20

Kanal Manteč je recipijent pročišćenih otpadnih voda UBP-a, kao i voda Biljnog ureĎaja

Lukač (BU) na kojem se pročišćuju otpadne vode naselja Lukač s 443 stanovnika. Godišnje se

na ovom ureĎaju pročisti 5 000 otpadne vode. Kanal Manteč ulijeva se u Ţupanijski kanal

kod naselja Budrovac, a Ţupanijski kanal ulijeva se u Dravu kod naselja Sopje (Slika 2).

Uzimanje uzoraka za istraţivanja provedeno je u proljeće, ljeto i jesen 2014. godine (Tablica

1, Slika 2.). Na taj je način obuhvaćen reţim rada UBP-a u kojem se pročišćuju komunalne

otpadne vode sa i bez tehnoloških otpadnih voda TŠ-a.

Tablica 1. Prikaz uzoraka prema lokacijama uzorkovanja. Datum i broj uzorkovanih jedinki i

uzoraka prema lokacijama uzorkovanja: a) Ribe - patološko-anatomski pregled,

mikrobiološke, genotoksikološke, histopatološke analize b) Voda - fizikalno-kemijske

analize, analize teških metala i mikrobiološke analize, c) Aktivni mulj za fizikalno-kemijske

analize, analize teških metala i mikrobiološke analize, d) Voda za analitičko-kemijske analize,

e) Sediment za analitičko-kemijske analize. Uzorci vode pod d) su kompozitni uzorci

volumena 1 000 mL uzimani u 08:30, 14:00 i 20:30 sati, dok su uzorci mulja i sedimenta

trenutni, uzimani od 07:00 do 10:00 sati volumena 1 000 mL.

Tablica 1. Prikaz uzoraka prema lokacijama uzorkovanja

a) Ribe b) Voda c) Mulj d) Voda e) Sediment

Oznaka

lokacije

uzorkovanja

prema Slici

2.

22.0

4.2

014.

08.0

7. 2014.

14.1

0. 2014.

22.0

4. 2014.

01.0

7. 2014.

26.0

9. 2014.

22.0

4. 2014.

01.0

7. 2014.

26.0

9. 2014.

22.0

4. 2014.

08.0

7. 2014.

14.1

0. 2014.

22.0

4. 2014.

1 5 4 25 1 1 1

2 1 1 1 3 3 3

3 1 1 1

4 1 1 1 3 3 3 1

5 1 1 1 1

6 1 1 1

7 1 1 1

8 5 6 11 1 1 1

9 20 9 19 1 1 1 1

10 1 1 1

11 1 1 1

21

Slika 2. Prikaz lokacija uzorkovanja

Lokacije uzimanja uzoraka su bile: 1. potok OĎenica prije grada Virovitice, kao vodotok za

koji se pretpostavlja da nije recipijent industrijskih otpadnih voda niti je pod utjecajem

degradacije kakvoće vode zbog poljoprivredne djelatnosti, 2. ulaz gradskih otpadnih voda na

UBP, 3. ulaz tehnoloških otpadnih voda TŠ-a na UBP, 4. izlaz pročišćenih otpadnih voda iz

preljevnog kanala sekundarne taloţnice UBP-a, 5. kanal Manteč nakon prihvata pročišćenih

otpadnih voda sa UBP-a prije BU-a, 6. kanal Manteč nakon BU-a, 7. kanal Manteč

neposredno prije utoka u Ţupanijski kanal, 8. Ţupanijski kanal nakon utoka kanala Manteč, 9.

Ţupanijski kanal nizvodno prema rijeci Dravi u naselju Brezovica, 10. mjesto izljeva

povratnog aktivnog mulja u bioaeracijski bazen UBP-a, 11. mulj s deponije viška aktivnog

mulja i zemlje od pranja šećerne repe. Uzorci vode i mulja uzimani su u sterilne staklene boce

i polipropilenske vrećice, hlaĎeni za vrijeme transporta u laboratorij, a analize su obavljene

odmah nakon dostave u roku od najviše 3 sata.

22

3.2. OdreĊivanje fizikalno-kemijskih pokazatelja

Temperatura vode i otopljeni kisik u vodi mjereni su prilikom uzimanja uzoraka

multiparametarskim mjeračem (HQ40d, Hach Lange, Njemačka) na 10-15 cm dubine.

Koncentracija vodikovih iona mjerena je u laboratoriju pH metrom (MP 220 k, Mettler

Toledo, Njemačka), koji je umjeravan certificiranim otopinama pufera (Mettler Toledo).

Elektroprovodljivost je odreĎivana konduktometrijski (MC226k, Mettler Toledo), a

instrument je umjeren certificiranom puferskom otopinom od 1,413 µS/cm. Suspendirana tvar

odreĎivana je gravimetrijski iz 500 mL homogeniziranog uzorka (ili alikvota) koji se filtrirao

preko filtar papira promjera 47 mm, veličina pora 1,1 µm (Glass-Microfibre disc, Watman 11,

Sigma-Aldrich, SAD). Membranska filtracija uzorka kroz filtar papir, prethodno sušen na 105

°C, 2h, obavljena je vakuum crpkom (MZ 2, Wacuubrand, Njemačka), nakon čega je sušen

na 105 °C, min. 2h (UNE 400, Memmert, Njemačka) do konstantne teţine. Nakon svakog

sušenja i hlaĎenja u eksikatoru, filtar papir je vagan (Ohaus Discovery, Švicarska). Umnoţak

razlike odvaga i razrjeĎenja daje vrijednost suspendirane tvari (mg/L).

Kemijska potrošnja kisika uz korištenje kao oksidansa (KPKCr) odreĎena je

spektrofotometrijski (UV/VIS, HACH DR 5000). Za eliminaciju klorida dodaje se , a

za digestiju 3 mL otopine koja se dobije miješanjem otopine i otopine u 98

%-tnoj . Digestija je provedena pri 148 °C kroz 2h u termoreaktoru (TR 300, Merck,

Njemačka). KPKCr je očitana spektrofotometrijski (Hach DR 5000, Njemačka) i baţdarnim

pravcem postavljenim u deset koncentracijskih vrijednosti (0 do 1 000 mgO2/L pri 620 nm).

Za pripremu standardne otopine KPK korišten je .

Potrošnja (KPKMn) odreĎena je kuhanjem 100 mL (ili alikvota) uzorka uz dodatak 5

mL razrjeĎenja 1+3 i 15 mL 0,002 mol/L (0,01 N) . Nakon kuhanja od 10

minuta dodano je 15 mL 0,005 mol/L i titrirano s 0,002 mol/L , a rezultat je

izraţen u mg .

Biokemijska potrošnja kisika u pet dana (BPK-5) odreĎena je tako da se, uvaţavajući

izmjeren KPK i/ili KPKMn, izračunalo razrjeĎenje uzorka otpadne ili površinske vode. Uzorci

su razrijeĎeni aeriranom otopinom za razrjeĎivanje, tj. demineraliziranom vodom u koju je

dodana fosfatna pufer otopina. Iz razlike u vrijednostima otopljenog kisika prvog i petog

23

dana, i uz uvaţavanje stupnja razrjeĎenja uzorka, izračunata je potrošnja kisika za biološku

oksidaciju organske tvari u uzorku u pet dana u mg /L.

Za odreĎivanje amonijaka u vodi korištena je spektrofotometrijska metoda (655 nm) sa

salicilatom nakon dodavanja salicilat-citratne otopine i otopine pripremljene od NaOH i

(izosan G) u 40 mL uzorka (ili alikvota). Nitriti su odreĎivani

spektrofotometrijski (520 nm) metodom s Za odreĎivanje nitrata korištena je

spektrofotomerijska metoda u UV području (220 nm) uz dodatak 1 N HCl. Ortofosfati su

odreĎivani spektrofotometrijski (690 nm) metodom s . Ukupni dušik

odreĎivan je korištenjem kivetnog testa Hach Lange LCK 238. Za odreĎivanje ukupnog

fosfora korišteni su Hach Lange kivetni testovi LCK 348 i LCK 349. OdreĎivanje ukupnog

dušika i fosfora provedeno je zagrijavanjem na 100 °C (Hach DRB 200).

Za odreĎivanje koncentracije teških metala uzorak mulja je osušen i homogeniziran, a 2-3 g

uzorka razoreno je koncentriranom (Merck). Sadrţaj kadmija, bakra, olova, cinka,

kroma i nikla u vodi i mulju odreĎen je grafitnom tehnikom (AA 600, Perkin Elmer, SAD),

dok je sadrţaj cinka odreĎivan induktivno-spregnutom plazmom (ICP-OES 2100 DV, Perkin

Elmer). Kalibracijske krivulje napravljene su u četiri točke i to za Cd (raspon od 0,05-2 µg/L),

Cr (raspon 5-50 µg/L), Cu (raspon od 10-100 µg/L), Ni (raspon od 5-50 µg/L), Pb (raspon od

1-20 µg/L), Zn (raspon od 5-100 µg/L). Sadrţaj ţive odreĎen je hidridnom tehnikom (FIAS

100, Perkin Elmer). Kalibracijske krivulje za ţivu napravljene su u četiri točke u rasponu od

1-10 µg/L. Svi osnovni standardi su od 1 000 mg/L, single element, Merck. Ţeljezo je

odreĎeno spektrofotometrijskom Hachovom metodom na valnoj duljini od 510 nm. Svaki

uzorak analiziran je u tri replike.

3.3. Analitika vode i sedimenta

Uzorci vode i sedimenta uzimani su u polikarbonatne boce od 250 mL koje su do analize

drţane na temperaturi od 4 °C. Uzorci vode u 1/3 od ukupnog volumena uzimani su u tri

vremenska termina (08:00, 14:00 i 20:30 sati) sa dva lokaliteta: ulaz komunalnih otpadnih

voda na UreĎaj (lokalitet 2) i izlaz pročišćenih otpadnih voda (4). Uzorkovanje sedimenta

izvršeno je ujutro na tri lokacije: izlaz pročišćenih otpadnih voda (4), kanal Manteč kao

prijemnik pročišćenih otpadnih voda (5) i Ţupanijski kanal (9). Analiza vode obavljena je

24

nakon filtriranja uzorka kroz PTEF filtar s porama od 0,2 µm. Usporedno s analizom uzoraka

vode izvršena je i analiza ultra čiste vode i sedimenta. Za analize uzoraka sedimenta korištena

je metoda prema Darwano i sur. (2014). Za odreĎivanje farmaceutika u vodi i sedimentu

korišteni su ultra čisti reagensi LC MS čistoće. OdreĎivanje farmaceutika izvršeno je

tekućinskom kromatografijom ultra visoke djelotvornosti s kvadrupolnom time-of-flight

(TOF) masenom spektrometrijom (UHPLC-QTOF-MS). Istraţivanja su provedena na 1290

UHPLC sistemu (Agilent Technologies, SAD) pri čemu je korišten automatski uzorkivač

G4226A, binarna crpka G4220B i termostatirana kolona G1316C. Razdvajanje ispitivanih

analita izvršeno je pomoću kolone RP ACQUITY UPLC, HSST3 (15 mm x 2,1 mm, 1,8 µm).

Volumen injektiranja bio je 100 µL a temperatura komore kolone postavljena je na +50 °C. U

slučaju ESI (ESI(+)), mobilna faza sastojala se od otopine A (mM ) i otopine

B (100 % ). Korišten je gradijent eluacije protoka 0,4 mL/min. Analiti su odreĎivani

korištenjem instrumenta 6550 i-Funnel Q-TOF-LC/MS (Agilent Technologies) u 4 GHz

ratom detektora s moći razlučivanja 40 000 i <2 ppm točnosti. Radilo se u pozitivnom (ESI+)

ionskom modu QTOF masenog spektrometra (Agilent 6550) a ioni su generirani pomoću

dualnog izvora iona AJS ESI (Agilent Jet Stream). Baţdarni pravci izraĎeni su direktnim

injektiranjem standardnih otopina sedam različitih koncentracijskih vrijednosti s

koeficijentom korelacije >0,999 kao prihvatljivim kriterijem linearnosti. Testiranjem vršnih

vrijednosti slijepe probe i tri koncentracijske vrijednosti izračunata je preciznost, te je

evaluirana u četiri replike. Uvjeti rada bili su slijedeći: temperatura plina poklopca +375 °C,

temperatura plina 125 °C, vrući plin 12 L , kapilarni napon 3 500 V, fragmentor 400

V i raspršivač 2,413 bara. Korekcija prilikom mjerenja za svako očitanje na osi mase bila je

automatska. Analize su izvedene u MS i MS/MS modulu s fiksnom energijom sudara i

rasponom mase 50 do 1 000 m/z.

3.4. Ţivotinjske vrste i obrada tkiva

3.4.1. Ribe

Rukovanje ţivotinjama obavljeno je u skladu s Direktivom Vijeća 86/609/EEZ i Pravilnikom

o zaštiti ţivotinja koje se koriste u pokusima ili u druge znanstvene svrhe (NN 47/11).

25

Ribe su lovljene mreţama i udicama u potoku OĎenica na mjestu gdje voda nije pod

utjecajem otpadnih voda, na mjestu gdje se kanal Manteč koji je recipijent pročišćenih

otpadnih voda ulijeva u Ţupanijski kanal, i nizvodno iz Ţupanijskog kanala kod naselja

Brezovica (Slika 2.). Gdje god je to bilo moguće, ribe su u mreţi drţane u vodi na mjestu

ulova do prijevoza u laboratorij. Ribe su prevezene u laboratorij u posudama s vodom uz

stalnu aeraciju do trenutka razudbe.

Odrasle spolno zrele gujavice (Eisenia fetida) sa razvijenim klitelumom odabrane su na

uzgajalištu Eršek u Donjoj Bistri te su dopremljene u laboratorij gdje su odrţavane u

kontroliranim uvjetima (tama, ± 21 °C), u tlu nepromjenjenog sastava (kompost, ilovača i

treset jednakih udjela). Gujavice su hranjene jednom tjedno organskom hranom iz

kontroliranog uzgoja bez pesticida uz redovito vlaţenje tla.

3.4.1.1. Ribe, pregled i uzimanje tkiva za analize

Najbrojnija ulovljena vrsta bila je babuška (Carassius gibelio), zatim slijedi somić (Ictalurus

nebulosus), klen (Squalius cephalus), deverika (Abramis brama), bjelica (Rutilus rutilus),

uklija (Alburnus alburnus) i linjak (Tinca tinca). Od svih ulovljenih riba 35 % je bilo

muţjaka, a 42 % ţenki, dok za 23 % riba spol nije odreĎen. Rezultati analiza koje se odnose

na ribe u ovom radu prikazani su samo za babušku zbog najvećeg broja ulovljenih jedinki

ove vrste.

Slika 3. Babuška (Carassius gibelio), ulovljena 08.07.2014. u Ţupanijskom kanalu nizvodno,

muţjak, duţine 202 mm, teţine 223 g.

26

Ribama je odreĎena teţina (g) i duţina od vrha glave do račvanja repne peraje (mm), te im je

iz repne arterije/vene izvaĎena krv. Za biokemijske analize krv je ubrizgana u tubice

presvučene antikoagulansom litij-heparinom, centrifugirana na 12 000 x g kroz 90 s (StatSpin,

Idexx, SAD), a dobivena plazma pohranjena je na -20 °C do analiza. Heparinizirane

mikrohematokritske kapilare punjene su krvlju, zatvorene punilom i centrifugirane na 12 000

x g kroz 120 s najkasnije do 20 minuta po vaĎenju krvi. Hematokrit (Hct) je odreĎen kao

volumni postotak crvenih krvnih zrnaca u krvi (Wedemeyer and Yasutake, 1977). Za

MN/ENA test tri krvna razmaza po ribi osušena su na zraku, fiksirana 95 %-tnim metanolom

kroz 3 minute i obojena MayGrünwald/Giemsa bojanjem.

Ribe odreĎene za pregled ţrtvovali smo prekomjernom dozom anestetika MS-222 (Sigma-

Aldrich). Zdravstveni pregled riba obuhvaćao je opći klinički pregled, mikroskopski pregled

nativnih preparata obrisaka koţe, peraja i škrga, te patološko-anatomsku pretragu. Materijal

škrga, bubrega, jetre i slezene nacijepljen je na Tryptone Soya Agar (Oxoid, UK), krvni agar

(Certifikat d.o.o, Osijek, Hrvatska), Mac-Conkey Agar (Oxoid). Materijal škrga i koţe

nacijepljen je i u 0,09 % NaCl za dodatnu mikrobiološku pretragu.

27

Tablica 2. Biometrijski podaci riba prema terminu i mjestu ulova

Babuška Klen Deverika Uklija Linjak Bjelica Somić

Pro

ljeć

e

Potok OĎenica (Slika 2., lokacija uzorkovanja 1)

Broj riba 5

Teţina (g) 77,0±21,4

Duljina

(mm) 155,2±17,0

Ţupanijski kanal na utoku kanala Manteč (Slika 2., lokacija uzorkovanja 8)

Broj riba 5

Teţina (g) 55,6±6,4

Duljina (mm)

144,0±8,7

Ţupanijski kanal u naselju Brezovica (Sika 2., lokacija uzorkovanja 9)

Broj riba 14 6

Teţina (g) 397,3±213,5 243,5±54,8

Duljina (mm)

259,1±49,1 250,7±23,0

Lje

to

Potok OĎenica (Slika 2., lokacija uzorkovanja 1)

Broj riba 3 1

Teţina (g) 92,0±26,1 28,0

Duljina

(mm) 187,7±15,3 144,0

Ţupanijski kanal na utoku kanala Manteč (Slika 2., lokacija uzorkovanja 8)

Broj riba 5 1

Teţina (g) 58,0±22,4

Duljina

(mm) 141,6±17,5

Ţupanijski kanal u naselju Brezovica (Slika 2., lokacija uzorkovanja 9)

Broj riba 9

Teţina (g) 159,9±57,5

Duljina

(mm) 190,3±24,6

Jese

n

Potok OĎenica (Slika 2., lokacija uzorkovanja 1)

Broj riba 18 7

Teţina (g) 118,3±77,8 80,7±48,9

Duljina

(mm) 176,9±35,2 176,7±32,8

Ţupanijski kanal na utoku kanala Manteč (Slika 2., lokacija uzorkovanja 8)

Broj riba 8 1 2

Teţina (g) 20,3±13,5 54 19,5±21,9

Duljina

(mm) 102,1±25,9 164 76,5±2,1

Ţupanijski kanal u naselju Brezovica (Slika 2., lokacija uzorkovanja 9)

Broj riba 19

Teţina (g) 182,05

Duljina (mm)

192,5±30,9

Podaci teţine i duljine ulovljenih jedinki izraţeni su kao srednja vrijednost ± standarna

devijacija.

28

Za pripremu histoloških preparata izdvojena su tkiva škrga, slezene, bubrega i jetre koja su do

analiza fiksirana u 10 %-tnom neutralnom formalinu.

3.4.1.2. Histološke analize

Nakon fiksacije, tkiva su uklopljena u parafinske blokove koja su zatim rezana na rezove

debljine 3 µm. Dobiveni rezovi deparafinirani su ksilolom i padajućim koncentracijama

etanola, obojeni hemalaunom i eozinom, isprani i dehidrirani rastućim koncentracijama

etanola i ksilola te uklopljeni u kanadski balzam (Švob 1974). Parafinski blokovi korišteni su

za bojanje PAS metodom po McManusu (Pearse 1968) za prikaz lokalizacije mukoznih

stanica i glikogena. Metoda se zasniva na oksidaciji polisaharida s perjodnom kiselinom uz

nastanak aldehidnih skupina, a nakon tretiranja sa Schiffovim reagensom dodani bazični

fuksin veţe se duţ lanca polisaharida dajući crvenu do purpurnu boju. Histološki preparati

pregledani su na Olympus BX51 svjetlosnom mikroskopu. Patološko-histološke alteracije

mjerene su pomoću računalnog programa Microsoft AnalySIS Imaging System.

3.4.1.3. Analize krvi riba

Koncentracije glukoze (GLU), uree (URE), kreatinina (CRE), kolesterola (CHOL),

triglicerida (TRIG), ukupnih bjelančevina (TP), albumina (ALB), aktivnosti alanin

aminotransferaze (ALT), alkalne fosfataze (ALP), gama-glutamil transferaze (GGT)

odreĎivane su komercijalnim testovima Beckman Coulter (Olympus Life and Material

Science Europe, Irska) i biokemijskim analizatorom Olympus AU 640 (Olympus, Japan).

Aktivnost superoksid dizmutaze (SOD) i glutation peroksidaze (GSH-Px) odreĎivane su

Randox komercijalnim reagensima na Olympus AU 640 biokemijskom analizatoru. Aktivnost

paraoksonaze (PON 1) u plazmi testirana je modificiranom metodom hidrolize paraoxona

prema Charlton-Menys i sur. (2006) na Olympus AU 640.

3.4.1.4. Istraţivanje genotoksiĉnosti

Istraţivanje genotoksičnosti provedeno je na eritrocitima babuški primjenom mikronukleus

testa (MN test) i analizom nepravilnosti jezgre eritrocita (ENA test). Nakon sušenja krvnih

29

razmaza na zraku, fiksirani su 95 %-tnim metanolom (3 minute), a zatim obojani May-

Grünwald/Giemsa bojama. Svjetlosnim mikroskopom (Olympus BX51, povećanje 1000x)

pretraţeno je 1000 eritrocita po jednom krvnom razmazu. Morfološke promjene eritrocita

pretraţivane su prema Carrasco i sur. (1990) i Carrola i sur. (2014), a uključivale su

polimorfne jezgre (nepravilna i nekonzistentna oblika), segmentirane jezgre, jezgre

bubreţastog oblika, jezgre s vakuolama, jezgre s pupovima, jezgre s invaginacijama i

binuklearne eritrocite. Sve navedene kategorije morfoloških promjena prikazane su zbirno kao

ukupne nepravilnosti eritrocitnih jezgri, a rezultati su prikazani u ‰.

3.4.2. Gujavice

3.4.2.1. Gujavice, predtretman: Test kontakta na filtar papiru

Gujavice (190-270 mg) rasporeĎene su u staklenke obloţene navlaţenim filtar papirom kako

bi u periodu od 24 h očistile sadrţaj probavila. Nakon faze čišćenja, gujavice su stavljene na

predtretman u trajanju od 8 h, tijekom čega su izlagane trima koncentracijama otpadnih voda;

originalnom uzorku, uzorku razrijeĎenom 100x te 1000x. Predtretman je obuhvaćao stavljanje

gujavica u Petrijeve zdjelice (promjera 90 mm) dna obloţenog filtar papirom te navlaţenog sa

1,2 mL testirane koncentracije uzorka vode. Kontrolna skupina preko filtar papira izlagana je

volumenu od 1,2 mL destilirane vode.

3.4.2.2. Mjerenje MXR inhibitornog potencijala gujavica nakon izlaganja otpadnim

vodama i otpadnom mulju

Nakon 8-satnog predtretmana započet je tretman (24 h) u kojem je filtar papir navlaţen sa 1,2

mL mješavine testne otopine te 10 µM fluorescentnog supstrata rodamina (R123, Sigma-

Aldrich, Njemačka). Negativna kontrolna skupina izlagana je 10 µM R123, dok je pozitivna

kontrolna skupina izlagana mješavini 50 µM modelnog MXR inhibitora - MK571 te 10 µM

R123. Nakon završenog tretmana svaka gujavica pojedinačno isprana je destiliranom vodom

kako na kutikuli ne bi zaostao fluorescentni supstrat, izvagana je te homogenizirana (Ultra-

Turray T18. IKA, Njemačka) u 1 mL hladne destilirane vode. Homogenat je centrifugiran

Eppendorf 5417C centrifugom (Njemačka) pri brzini od 9 000 x g kroz 10 min. Po 200 µL

30

dobivenog supernatanta u duplikatima preneseno je u crne mikroploče (Nunc, Thermo Fisher

Scientific, Njemačka). Uz pomoć spektrofotofluorimetra FLUOstar OPTIMA Platereader

(BMG Labtech, UK) izmjerene su fluorescentne vrijednosti pomoću kojih smo dobili uvid u

aktivnost MXR mehanizma. Valna duljina korištena prilikom mjerenja ekscitacije R123

iznosila je 490 nm, dok je za emisiju ta vrijednost bila 544 nm. Tijekom svake faze uzorci su

drţani u tami kako bi se spriječila fotodegradacija R123. Svaka koncentracija testirana je sa

po 7 gujavica (n = 224 gujavice po ekspoziciji). Dobivene jedinice fluorescence izraţene su u

odnosu na masu svake gujavice pojedinačno te pretvorene u postotke.

Ručnim miješanjem sa tlom prikupljenim sa uzgajališta Eršek, napravljene su dvije

koncentracije aktivnog mulja: 30% i 70% te su raspodijeljene u dvije staklenke od 3 L.

Odrasle jedinke gujavica sa razvijenim pojasom izdvojene su te nasumično rasporeĎene u

staklenke sa otpadnim muljem. Gujavice su uzorkovane nakon 24 h, 48 h te 7-dnevnog

izlaganja mješavini tla, kada su uklonjene iz staklenke, isprane destiliranom vodom kako bi se

uklonio višak zemlje, te su stavljene na filtar papir navlaţen sa 1,2 mL 10 µM R123. Nakon

24-satnog izlaganja fluorescentnom supstratu, gujavice su isprane destiliranom vodom kako bi

se višak fluorescentnog supstrata uklonio sa kutikule. Pokus je proveden na isti način kao i za

otpadnu vodu.

3.4.2.3. Mjerenje oksidacijskog stresa nakon izlaganja gujavica otpadnim vodama i

otpadnom mulju

U svrhu odreĎivanja oksidacijskog stresa uzrokovanog otpadnim vodama grada Virovitice,

mjerili smo koncentraciju malondialdehida (MDA) kao pokazatelja lipidne peroksidacije.

Korištena metoda zasniva se na reakciji tiobarbiturne kiseline (TBA) sa MDA uslijed čega

nastaje crveni pigment. Svakoj gujavici pojedinačno odreĎena je masa, nakon čega je

homogenizirana u hladnom fosfatnom puferu (PBS) čiji je volumen iznosio tri udjela

volumena mase. Homogenat je zatim centrifugiran na 9 000 x g kroz 10 min. Supernatant

(250 µL) razrijeĎen je sa 500 µL smjese 10 % trikloroctene kiseline (TCA) te 0.01 %

butiliranog hidroksitoluena (BHT). Uzorci su vorteksirani na ledu te hlaĎeni 15 min na 4 °C.

Nakon hlaĎenja ponovno su centrifugirani. Odvojeno je 700 µL uzorka koji je razrijeĎen sa

500 µL TBA. Smjesa je zatim grijana 30 min na 99 °C. Kako bi se reakcija zaustavila, uzorci

su ohlaĎeni na 4 °C te je 200 µL supernatanta u duplikatima preneseno u crne mikroploče

kako bi se uz pomoć spektrofotofluorimetra izmjerila apsorbancija. Valna duţina prilikom

31

mjerenja apsorbancije postavljena je na 535 nm. Svaka koncentracija, uključujući i kontrolnu

skupinu izlaganu destiliranoj vodi, testirana je sa po 5 gujavica (n = 160 gujavica po

ekspoziciji). Vrijednost apsorbancije izraţena je u odnosu na kalibracijsku krivulju odreĎenu

na temelju prireĎenih standardnih otopina MDA poznatih koncentracija. Jedinice apsorbancije

izraţene su u odnosu na masu svake gujavice pojedinačno te pretvorene u postotke.

Nakon 24 h, 48 h i 7 dana izlaganja otpadnom mulju, gujavice su nasumično uzorkovane iz

zemlje, isprane destiliranom vodom s ciljem uklanjanja zemlje sa kutikule te su u periodu od

3 h stavljene na filtar papir navlaţen sa 1,2 mL destilirane vode kako bi se ispraznilo

probavilo. Izlaganje je provedeno na isti način kao i za otpadnu vodu.

3.5. Ames test

Kako bi se pripremila minimalna podloga za uzgoj sojeva TA 98 i TA 100, autoklaviralo se

15 g agara i 930 mL destilirane vode. Po završetku autoklaviranja otopini agara ohlaĎenoj na

oko 70°C doda se 20 ml sterilne otopine Vogel-Bonner medija (10 g MgSO4 x 7 H2O; 100 g

limunske kiseline x H2O; 500 g K2HPO4 i 175 g NaHNH4 PO4 x 4 H2O) i 50 mL sterilne

40% otopine glukoze. Nakon temeljitog miješanja, minimalna podloga se ravnomjerno

raspodjelila u Petrijeve zdjelice.

Dan prije testa hranjivi medij (0,8 % Bacto bogati medij i 0,5 % NaCl) sa bakterijskim

kulturama stavljen je u inkubatorsku tresilicu (frekvencija 250 pomaka/min, 37 °C). Nakon

12-15 sati inkubacije prekida se dioba bakterija uranjanjem posude s kulturom u ledenu kupelj

ili friţider (+4 °C) gdje se čuva do upotrebe. Koncentracija bakterija od 1 do 2 x 109 bakterija

u 1 ml medija podesila se mjerenjem turbiditeta pomoću spektrofotofluorimetra FLUOstar

OPTIMA platereader (BMG Labtech, Aylesbury, UK) na valnoj duţini 650 nm.

Prilikom priprave tzv. S9 smjese, dodano je 8 mM MgCl2, 33 mM KCl, 5 mM glukoza-6-

fosfat, 4 mM NADP, 100 mM natrij fosfatni pufer pH 7,4. 100 µL uzorka koji ispitujemo

(prethodno profiltriranog 0.2 µm filterom), 0,1 mL bakterijske suspenzije (1 – 2 x 109

bakterija) i 2,0 mL površinskog agara (0,6 % agar, 0,5 % NaC1, termostatirano na 45 °C)

pomiješa se u mikrobiološkoj epruveti i izlije (u duplikatu) u sterilne Petrijeve zdjelice s 20

ml minimalne podloge. Negativne kontrole su prirodni-spontani broj revertanata (TA 100 od

100 - 200; TA 98 od 20 - 50). Pozitivne kontrole (dijagnostički mutageni) koriste se u potvrdi

svojstva povećanja broja revertanata (His-

u His+) odreĎenog bakterijskog soja S.

typhimurium koja je istovremeno povezana s djelotvornošću (bioaktivacijskim potencijalom)

32

S9 frakcije u S9 mix. Za TA 100 koristi se benzo(a)piren (BaP), a za TA 98 koristi se 2-

aminofluoren (2-AF). Kod ispitivanja mutagenog potencijala direktnih mutagena tj. tvari za

koje nije potrebna metabolička aktivacija (- S9 mix) kao pozitivne kontrole koriste se direktni

mutageni. To su za TA 100 metil metansulfonat (MMS), a za TA 98 NOPD. Nakon

inkubacije 48 h (u mraku) na temperaturi od 37 °C broje se kolonije, koje su dobro vidljive

na ploči. Brojanje kolonije izvodi se ručno ili na automatskom brojaču kolonija. Broj

revertanata na ploči s ispitivanim spojem iznad broja spontanih mutanata mjerilo je

mutagenosti testiranog spoja. Ako je broj induciranih mutacija dvostruko veći od kontrole i

ako se unutar toga povećanja moţe utvrditi doza-odgovor, smatra se da je ispitivani spoj

mutagen. Za očekivati je da će broj revertanata u pozitivnoj kontroli biti povećan najmanje

10-puta u odnosu na negativnu kontrolu.

Pri interpretaciji rezultata bitno je znati da je temeljni kriterij u Ames testu broj pozitivnih

(His+) kolonija (revertanata) na ploči, koji u slučaju mutagene tvari mora biti najmanje

dvostruko veći od broja spontanih revertanata (kontrole). U skladu s tim kriterijem modelni

mutageni, odnosno premutageni koji se koriste kod kontrole postupka, moraju rezultirati s

brojem revertanata koji je uvjerljivo viši od broja spontanih revertanata.

3.6. Mikrobiološke analize vode, mulja i tkiva riba

Mikrobiološke analize provedene su prema metodama potank o opisanim u slijedećim

normama i pravilnicima: HRN EN ISO 6222:2000; HRN EN ISO 9308-1:2000/Corr.1:2008;

HRN EN ISO 7899-2:2000; HRN EN ISO 16266:2008; HRN EN ISO 6579:2003/Corr.

1:2008; HR EN ISO 11290-1:1999/A1:2008; HR EN ISO 11290-1:1999/A1:2008; HRN EN

ISO 26461-2:2008; HRN EN ISO 7954:2002, ISO 21527-1:2008.

Za odreĎivanje ukupnog broja bakterija u otpadnim i površinskim vodama korišten je Tryptic

Glucose Yeast agar (Biolife, Italija). Bakterije su inkubirane na 37 °C (Memmert, tip BE 400

i INB 500, Njemačka) i na 22 °C (Memmert, tip IPP 400). Porasle bakterijske kolonije koje su

se inkubirale na 37 °C brojane su nakon 48 sati, a bakterije koje su inkubirane na 22 °C

nakon 72 sata. Broj koliformnih bakterija odreĎivan je metodom membranske filtracije uz

pomoć mikrobiološke podloge m-Les Endo Agar (Biolife), inkubacija je izvršena na 37 °C

kroz 24 sata, a za potvrdne testove korišteni su Triple Sugar Iron agar (Biolife), Mac Conkey

Broth Purple (Biolife) i Bactident Oxydase trakice (Merck). Fekalni koliformi i E. coli

odreĎivani su membranskom filtracijom na selektivnoj mikrobiološkoj podlozi m-Faecal

33

coliform agar (Biolife), inkubacija je izvršena na 44 °C kroz 24 sata, a za potvrdne testovi

korišteni su Triple Sugar Iron agaru USP (Biolife), Mac Conkey Broth Purple Brothu

(Biolife), Simmons Citrate agaru (Biolife), Bacitiden Oxidase trakicama (Merck), DEV

Tryptophan Brothu (Merck), Kovačevim reagensom (Biolife) i bojenjem po Gramu. Osim

navedenih testova, koliformne bakterije i E. coli su u završnom dijelu istraţivanja ispitivani

po Colilert enzimatskoj metodi (Idexx, SAD) za odreĎivanje najvjerojatnijeg broja

koliformnih bakterija i E. coli, uz inkubaciju na 37 °C kroz 24 sata. Koliformne bakterije

metaboliziraju hranjivi indikator i uzorak postaje ţut, a E. coli metabolizira drugi hranjivi

indikator tako da uzorak pod UV svjetlom postaje fluorescentan. Crijevni enterokoki su

odreĎivani metodom membranske filtracije pomoću selektivne mikrobiološke podloge Slanetz

Bartley Agar (Biolife) koji sadrţi 2,3,5-trifeniltetrazolium klorida (TTC). Inkubacija je

izvršena na 37 °C kroz 48 sati. Za potvrĎivanje enterokoka korištene su podloge Esculin Iron

Agar (Biolife), Triple Sugar Iron Agar i katalaza test. Za utvrĎivanje Pseudomonas

aeruginosa korištena je metoda membranske filtracije i mikrobiološka podloga Pseudomonas

Selective Agar (Biolife), inkubacija je izvršena na 37 °C kroz 24 sata, a za potvrĎivanje je

korišten Tryple Sugar Iron Agar, oksidaza i katalaza test, DEV Tryptophan Broth u kojem se

utvrĎivao nastanak piocijanina dodatkom kloroforma, te Simmons Citrate Agar. Za

odreĎivanje Salmonella spp. nakon umnaţanja bakterija koje su zadrţane na sterilnom

membranskom filtru u puferiranoj peptonskoj vodi korištene su podloge Salmonella Shigela

Agar (Biolife), Rappaport Vassiliadis Soy Broth (Biolife), Xylose-Lysine-Deoxycholate

(XLD) Agar (Biolife), Triple Sugar Iron Agar, Lisine Iron Agar (Biolife) uz biokemijsku

identifikaciju (laktoza, glukoza, urea) i serološku tipizaciju. Sulfitoreducirajuće

klostridije odreĎivane su pomoću SPS Agara (Liofilchem, Italija). Kvasci i plijesni dokazivani

su porastom na Sabouraud Dextrose Agar s kloramfenikolom (Biolife). Prisutnost Listeria

monocytogenes odreĎivana je nakon primarnog i sekundarnog obogaćivanja u bujonu Fraser

Broth (Biolife) na 30 °C kroz 24 sata, korištenjem podloga Agar Listeria Ottaviani Agosti

(Biolife), Rapid L.Mono (Bio-Rad, SAD), krvnog agara Columbia Agar Base (Biolife), a za

identifikaciju vrsta iz roda Listeria API Listeria (bioMérieux, SAD).

Biološki materijal na kojem su izvršena mikrobiološka ispitivanja bili su jetra, slezena, škrge i

bubreg riba sa kojih je izvršena inokulacija na Tryptone Soya Agar (Oxoid), Blood Agar

(Certifikat d.o.o., Hrvatska) i Mac Conkey Agar (Oxoid). Nakon inkubacije na 22 °C kroz 48-

72 sata izolirane su reprezentativne kolonije kolonije i reinkubirane na svjeţim podlogama.

Čiste kolonije bojane su po Gramu i utvrĎivana su njihova morfološka, fiziološka i

34

biokemijska svojstva. Izolati su podvrgnuti su standardiziranom identifikacijskom sustavu za

Enterobacteriaceae i druge Gram-negativne štapiće, API 20E (bioMérieux, Francuska) i

Bruker Biotyper MALDI-TOF MS analizama (Bruker Daltonics, Billerica, SAD).

Mikroepruvetice API 20E traka sa dehidriranim supstratima inokulirane su sa bakterijskom

suspenzijom koja je reagirala sa medijem. Tijekom inkubacije metabolizam je proizvodio

promjene u boji koje su bile spontane ili potaknute dodatkom reagenasa. Reakcije su

očitavane prema tablici uz upute, a identifikacija je dobivena prema Indeksu analitičkog

profila putem identifikacijskog programa (apiweb, bioMérieux). API 20E testovi provedeni su

u skladu s uputama proizvoĎača uz nekoliko prilagodbi za bakteriološka ispitivanja riba:

vrijeme inkubacije povećano je na 48-72 sata uz temperaturu od 22 °C, te je u ugljikohidratne

mikroepruvetice dodano sterilno mineralno ulje (Topić Popović i sur., 2007).

3.6.1. Maldi TOF MS

Bakterijski izolati (jedna eza bakterijske kulture) naneseni su kao tanki film na čelične ploče

(Bruker Daltonics) sa 24 mjesta, u dvije replike, te osušeni na sobnoj temperaturi. Zatim je na

koloniju naneseno 2 µL MALDI matrice (zasićena otopina α-cijano-4-hidroksicinamične

kiseline u 50 % acetonitrila i 2,5 % trifluoroctene kiseline) i osušeno u digestoru. Ioni su

generirani sa 337–nm dušikovim laserom i hvatani u pozitivan linearni mod u masenom

rasponu od 2 do 20 kDa. Pozitivni ioni ekstrahirani su akceleriranim naponom od 20 kV u

linearnom modu. Svaki spektar je zbroj iona dobivenih laserskim snimkama iz pet različitih

područja istog izvora. Uhvaćeni spektri analizirani su korištenjem MALDI Biotyper ureĎajem

i Bruker Biotyper 2.0 softverom (Bruker Daltonics). MALDI Biotyper baza podataka sadrţi

3 740 spektara sa 319 rodova i 1 946 vrsta mikroorganizama. Za svaku od 24 ploče bio je

uključen bakterijski standardni test za kalibraciju i validaciju instrumenta.

Kriterij za identifikaciju bio je kako slijedi: vrijednost od 2,300 do 3,000 ukazuje na visoku

sigurnost identifikacije bakterija, vrijednost od 2,000 do 2,299 ukazuje na sigurnu

identifikaciju roda sa vjerojatnom identifikacijom vrsta, vrijednost 1,700 do 1,999 ukazuje na

vjerojatnu identifikaciju roda, a vrijednost < 1,700 se smatra nepouzdanom. Nazočnost ili

odsustvo specifičnih peak-ova smatra se očitanjem za svaki izolat. Identifikacija izolata

korespondira sa vrstama referentnog soja koji se najbolje podudara sa bazom podataka.

35

3.6.2. OdreĊivanje osjetljivosti izolata bakterija prema antimikrobnim

lijekovima

Osjetljivost izolata bakterija prema antimikrobnim lijekovima odreĎivana je pomoću

kvalitativne Kirby-Bauer disk difuzijske metode na Mueller Hinton agaru (Oxoid). Na

površinu hranjivog agara inokuliranog bakterijskom suspenzijom postavljeni su diskovi

natopljeni standardiziranom količinom (µg) slijedećih antibiotika: oksitetraciklin (OTC30,

amoksicilin (AMC30), oksolinska kiselina (OA2), eritromicin (E15), sulfametoksazol (SX50),

florfenikol (FFC30), norfloksacin (NOR10) i flumekvin (UB30). Inokulum je suspendiran u 5

mL sterilnog 0,85 % medija (bioMerieux) uz MacFarland standard 0,5. Za očitavanje

promjera zone inhibicije i izraţavanje rezultata korištene su standardizirane tablice

proizvoĎača. Osjetljivost na antibiotike izraţavana je kao: osjetiljiv na antibiotik (susceptible,

S), umjereno osjetljiv (intermediate, I) i otporan na antibiotik (resistant, R).

3.7. Statistiĉka obrada rezultata

Za sve prikupljene rezultate provodila se standardna deskriptivna statistika pomoću SigmaStat

i SigmaPlot Statistical softvera verzija 11.0 (Jandel Corp., SAD). Razina statističke

značajnosti odreĎena je na p < 0,05. Normalnost raspodjela provjeravana je Shapiro-Wilk

testom, dok je statistička značajnost razlike u srednjim vrijednostima pojedinih parametara

analizirana Kruskal-Wallis testom. Analize i korelacije izmeĎu parametara krvi odreĎivane su

pomoću t-testa, Mann-Whitney Rank Sum Testa i Spearman Rank Order Correlation testa.

Povezanost pojedinih parametara sa obiljeţjima sezone analizirana je i Pearsonovim

koeficijentom korelacije. Statističke obrade obavljene su u paketima SPSS 13.0 for Windows

(SPSS Inc., SAD) i Microsoft Excel 2007. Analiza glavnih komponenti (PCA) korištena je za

opis glavnih izvora varijacija i odnosa izmeĎu varijabli (SPSS 13.0 for Windows).

36

4. REZULTATI

4.1. Analiza uzoraka otpadnih i površinskih voda

4.1.1. Rezultati mjerenja temperature vode, suspendirane tvari, pH i

elektroprovodljivosti

Rezultate mjerenja temperature vode, suspendirane tvari, pH vrijednosti i

elektroprovodljivosti vode prikazuje Tablica 3.

Tablica 3. Temperatura vode, suspendirana tvar, pH i elektroprovodljivost

Proljeće Lokacija

uzorkovanja

(prema Slici 2.)

Temperatura

vode (°C)

Suspendirana

tvar (mg/L)

pH

vrijednost

(pH jed.)

Elektropro-

vodljivost

(µS/cm)

Ljeto

Jesen

1

13,9 37,7 8,13 529

17,7 27,9 7,94 518

13,8 17,7 8,08 576

2

13,9 126,8 7,74 1 532

17,7 48,4 7,76 1 254

19,7 82,5 7,73 1 095

3

- 295,0 6,97 4 980

- - - -

- 304 6,9 4 150

4

20,6 31,1 7,80 1 369

18,9 10,9 7,58 1 054

19,8 23,4 8,05 1 441

5

18,6 171 7,89 1 412

16,5 56,3 7,70 974

13,8 8,5 8,05 1 399

6

18,6 172,3 7,87 1 295

16,4 35,2 7,73 936

14,2 16,0 8,09 1 384

7

13,9 3,6 7,42 699

19,0 <5 7,28 664

9,9 2,2 7,34 729

8

15,6 3,6 7,54 879

20,0 30,4 7,39 544

10,2 6,7 7,47 787

9

16,5 8,6 7,65 810

22,0 9,0 7,31 758

9,3 1,8 7,50 971

37

Vrijednosti suspendirane tvari komunalnih, šećeranskih i pročišćenih otpadnih voda pokazuju

visoku učinkovitost uklanjanja suspendirane tvari iz otpadnih voda. Koncentracija

suspendirane tvari voda u pročišćenim otpadnim vodama koje se prelijevaju iz sekundarnih

taloţnica u Kanal Manteč kao njihov recipijent, sukladna je sa Pravilnikom o graničnim

vrijednostima emisije otpadnih tvari (NN 80/13, NN 43/14). Zakiseljenost tehnoloških

otpadnih voda Tvornice šećera (TŠ) veća je od zakiseljenosti komunalnih otpadnih voda, a

zbog manjeg učešća u ukupnom hidrauličkom opterećenju UreĎaja (UBP), pH vrijednost

pročišćenih otpadnih voda bila je od 7,58 do 8,05. pH vrijednost na svim mjernim postajama

prema kriterijima Uredbe o standardu kakvoće voda (NN 73/13) bila je vrlo dobra ili dobra.

4.1.2. Rezultati mjerenja otopljenog kisika, kemijske potrošnje kisika (KPKCr i

KPKMn) i biološke potrošnje kisika (BPK-5)

U potoku OĎenica, kao vodotoku za koji se drţi da nije pod utjecajem otpadnih voda, kako

pokazuje Tablica 4, prilikom svakog je mjerenja izmjerena visoka koncentracija otopljenog

kisika u vodi. Uzimanje uzorka otpadne vode koja dolazi iz grada Virovitice na UBP

izvršeno je nakon podizanja otpadne vode puţnim crpkama i nakon uklanjanja krupnih

nečistoća pomoću automatske rešetke. Do obogaćivanja otpadne vode kisikom iz zraka došlo

je na puţnim crpkama. Prema izvršenim ispitivanjima, pročišćena otpadna voda u pravilu je

sadrţavala niske vrijednosti otopljenog kisika (< 0,5 mg /L). Uklanjanje ugljika na UBP-u

bilo je visoko, a pročišćena otpadna voda bila je sukladna sa Pravilnikom o graničnim

vrijednostima emisije otpadnih tvari (NN 80/13, NN 43/14). Zajedničko pročišćavanje

komunalnih i šećeranskih otpadnih voda provodilo se u travnju za vrijeme razdoblja

proizvodnje šećera iz šećerne trske, i u rujnu kada se šećer proizvodio iz šećerne repe.

Uvaţavajući hidrauličko opterećenje komunalnih i šećeranskih otpadnih voda u terminima

provoĎenja istraţivanja, prosječni stupanj redukcije KPK vrijednosti iznosio je 93,64 % a

BPK-5 93,75 %. Tablica 4. pokazuje i izmjerene vrijednosti KPKMn i BPK-5 u uzorcima iz

potoka OĎenica i vodotoka koji su recipijent pročišćenih otpadnih voda. Vrijednosti ovih

parametara bile su najveće na prvom mjernom mjestu nakon ispuštanja pročišćenih otpadnih

voda, dok su nizvodno zbog procesa autopurifikacije ove vrijednosti bile niţe.

38

Tablica 4. Otopljeni kisik, kemijska potrošnja kisika (KPKCr i KPKMn) i biološka potrošnja

kisika (BPK-5)

Proljeće Lokacija

uzorkovanja

(prema Slici 2.)

Otopljeni kisik

(mg /L)

KPKCr KPKMn BPK-5 Ljeto

Jesen

1

9,66 43,16 15,63 19,85

8,14 42,69 15,70 19,00

8,91 - 9,18 10,75

2

5,93 369,91 69,66 310

5,28 339,32 53,00 254

4,96 174,34 - 117,45

3

- 7.536 1.678 6.153

- - - -

0,9 4.418 - 3.980

4

0,39 42,63 20,63 36,75

0,28 53,66 27,86 41,22

4,05 63,63 - 39,33

5

2,24 57,55 30,64 48,26

5,11 64,16 31,43 41,66

1,23 - 18,14 17,5

6

2,72 71,96 31,64 58,23

6,07 52,24 30,17 35,20

2,32 43,08 16,68 34,7

7

4,86 32,49 8,85 25,00

1,83 17,83 3,56 2,18

3,91 19,49 6,36 3,84

8

1,91 22,2 16,93 15,07

1,07 96,6 13,00 14,20

2,48 24,15 10,96 7,85

9

9,29 18,49 11,93 12,84

4,37 23,67 10,09 4,73

2,48 18,77 11,64 7,60

4.1.3. Rezultati mjerenja amonijaka, nitrita, nitrata i ukupnog dušika

UreĎaj za biološko pročišćavanje (UBP) nije tehnološki izveden za tercijarno pročišćavanje

otpadnih voda. Do uklanjanja dušika iz otpadnih voda ipak dolazi, ali ne u dovoljnoj mjeri da

bi se njegova vrijednost dovela ispod 10 mg/L kako je propisano Pravilnikom o graničnim

vrijednostima emisije otpadnih tvari (NN 80/13, NN 43/14). Na Slici 3. prikazane su

vrijednosti dušikovih spojeva za sve ispitane uzorke. Najniţe vrijednosti izmjerene su u

uzorcima iz potoka OĎenica.

39

Slika 4. Koncentracija amonijaka, nitrita, nitrata i ukupnog dušika u pročišćenoj otpadnoj vodi

i vodotocima (Slika 2., Lokacije uzorkovanja 1-9)

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9

mgN

H4

+-N

/L

Amonijak

proljeće ljeto jesen

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

mgN

O2- -

N/L

Nitriti

proljeće ljeto jesen

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9

mg

NO

3- -

N/L

Nitrati

proljeće ljeto jesen

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9

mgN

/L

Ukupni dušik

proljeće ljeto jesen

40

Usporedbom vrijednosti dušikovih spojeva u uzorcima otpadnih voda koje dolaze na ureĎaj i

pročišćenih otpadnih voda moţe se pratiti u kojoj mjeri se mijenjaju koncentracije amonijaka,

nitrita, nitrata i ukupnog dušika i utvrditi stupanj procesa nitrifikacije i denitrifikacije.

4.1.4. Rezultati ispitivanja ortofosfata i ukupnog fosfora

Temeljem Uredbe o standardu kakvoće voda (NN 73/13), potok OĎenica (Lokacija

uzorkovanja 1) po sadrţaju ortofosfata i ukupnog fosfora bio je u kategoriji vrlo dobrog i

dobrog ekološkog stanja. Koncentracija fosfora u izlaznom toku s UBP-a u ljeti i jesen nije

bila u potpunosti sukladna s vaţećim zakonskim propisima i vodopravnoj dozvoli

(maksimalna dopuštena koncentracija ukupnog fosfora u pročišćenim otpadnim vodama = 1

mg/L). U uzorcima vode iz Ţupanijskog kanala (Slika 2., lokacija uzorkovanja 9), najviše

vrijednosti fosfora izmjerene su u jesenskom terminu uzorkovanja (Slika 5.).

Slika 5. Koncentracija ortofosfata i ukupnog fosfora u pročišćenoj otpadnoj vodi i vodotocima

(Slika 2., Lokacije uzorkovanja 1-9)

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5 6 7 8 9

mg

PO

43

- -P

/L

Ortofosfati

proljeće ljeto jesen

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8 9

mgP

/L

Ukupni fosfor

proljeće ljeto jesen

41

4.1.5. Rezultati mjerenja teških metala

Prema rezultatima koje prikazuje Tablica 5, najveći sadrţaj ţeljeza od 23 675 µg/L izmjeren

je u šećeranskoj otpadnoj vodi u vrijeme kampanje prerade šećerne repe. Visoka vrijednost od

8 388 µg/L utvrĎena je u uzorku potoka OĎenica u proljeće. Naniţe koncentracije ţeljeza

izmjerene su u pročišćenoj otpadnoj vodi. Najviše koncentracije kadmija i bakra izmjerene su

u kanalu Manteč nakon ispuštanja pročišćenih otpadnih voda (Slika 2., lokacije uzorkovanja 5

i 6). Najviša vrijednost kroma izmjerena je u šećeranskoj otpadnoj vodi u proljeće, dok su

prosječne vrijednosti kroma za svaku mjernu postaju komparabilne. Najveći sadrţaj ţive i

olova izmjeren je u komunalnoj otpadnih vodi koja dolazi na UreĎaj, pročišćenoj otpadnoj

vodi i šećeranskoj otpadnoj vodi, a s povećanjem udaljenosti od ureĎaja koncentracija ţive se

smanjuje. U šećeranskim otpadnim vodama odreĎena je najviša koncentracija nikla.

Tablica 5. Koncentracija ţeljeza, kadmija, kroma, ţive, olova, nikla, cinka i bakra u uzorcima

voda (μg/L)

Proljeće Lokacija uzorkovanja

(prema Slici 2.) Fe Cd Cr Hg Pb Ni Zn Cu Ljeto

Jesen

1

8 388 0,06 6,08 <0,20 1,86 10,00 23,00 56,00

984 0,33 7,53 2,99 4,56 6,00 43,00 34,00

750 0,16 4,03 0,94 5,86 4,65 2,58 7,75

2

30 0,10 14,87 6,25 4,27 6,00 128,0 90,00

984 <0,20 6,84 3,25 0,58 3,00 70,00 35,00

558 0,28 1,10 0,31 1,31 1,96 28,59 13,30

3

9 197 0,24 17,56 4,23 3,17 76,00 46,00 43,00

- - - - - - - -

23 675 0,41 5,86 <0,20 6,84 <1,00 18,59 18,50

4

50 0,06 14,81 0,50 1,41 14,00 44,00 46,00

155 <0,20 2,27 5,79 0,44 4,00 26,00 60,00

32 0,14 1,12 <0,20 1,46 <1,00 <1,00 4,90

5

703 0,80 7,70 0,87 5,58 31,00 90,00 270,0

215 <0,20 <1,00 1,74 0,48 4,00 28,00 27,00

140 <0,10 <1,00 <0,20 1,97 2,94 7,52 5,13

6

419 1,62 12,77 1,21 5,83 38,00 101,00 274,00

390 <0,20 5,37 <0,20 0,58 4,00 26,00 21,00

370 0,14 1,54 <0,20 2,16 <1,00 5,50 6,10

7

207 0,03 7,84 <0,20 2,98 19,00 37,00 80,00

440 <0,20 7,10 <0,20 0,83 3,00 32,00 21,00

472 0,34 <1,00 <0,20 2,46 <1,00 <1 3,40

8

138 0,03 11,14 0,83 1,95 10,00 29,00 81,00

1 710 <0,20 5,15 1,62 0,33 4,00 27,00 21,00

764 0,30 <1,00 <0,20 2,38 <1,00 16,15 4,14

9

128 0,05 12,91 0,45 2,14 8,00 27,00 61,00

490 <0,20 1,30 <0,20 0,53 2,00 30,00 20,00

464 0,177 2,72 <0,20 2,38 <1,00 16,15 4,14

42

Vrijednosti teških metala u muljevima (Slika 6.) u svim su istraţivanim uzorcima bile niske,

osim na jesen. Koncentracija teških metala u svim je ispitivanim terminima bila značajno veća

u aktivnom mulju UBP-a nego u mulju na deponiji tvornice šećera. U aktivnom mulju su se,

prema izmjerenim vrijednostima, isticale visoke vrijednosti cinka, olova i bakra, posebice u

uzorcima uzetima na jesen.

Slika 6. Koncentracija teških metala u muljevima

4.1.6. Rezultati mjerenja farmaceutika

Prema Tablica 6., prosječni udio mjerenih antibiotika u ukupnoj koncentraciji odreĎivanih

farmaceutika u otpadnim vodama koje dolaze na UreĎaj bio je 13,62 %, a u pročišćenim

otpadnim vodama 27,45 %. Srednja vrijednost antibiotika u komunalnim otpadnim vodama

iznosila je 15 367,45 ng/L s udjelom sulfa lijekova od 0,049 % (76,05 ng/L), dok je u

pročišćenim otpadnim vodama srednja vrijednost antibiotika bila 7 715,39 ng/L a udio sulfa

lijekova 0,839 % (64,76 ng/L). U komunalnim otpadnim vodama koje dolaze na UreĎaj

proljeće ljeto jesen proljeće ljeto jesen

Aktivni mulj s ureĎaja Mulj s deponije

Cd 1,39 0,31 5,52 0,05 0,15 0,27

Cr 36,13 3,43 131,00 4,06 8,21 4,74

Hg 2,42 3,12 0,00 0,25 0,23 1,98

Pb 15,93 0,00 810,00 4,00 6,64 5,62

Ni 100,00 9,00 0,00 2,25 10,69 1,57

Zn 466,00 418,00 1685,00 32,25 36,93 77,17

Cu 336,00 149,00 590,00 18,22 17,63 13,80

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

µg

/L

Cd

Cr

Hg

Pb

Ni

Zn

Cu

43

koncentracija antibiotika od jutra prema večeri povećala se za gotovo pet puta, dok je bila

konstantna u pročišćenim vodama. Koncentracija sulfa lijekova od jutra do večeri se

prepolovila, dok je bila stalna u pročišćenim otpadnim vodama. Prosječne vrijednosti

sulfametoksazola bile su komparabilne za svaku lokaciju uzorkovanja, osim večeri. Prosječna

vrijednost eritromicina u komunalnim otpadnim vodama bila je 19,57 ng/L, dok su vrijednosti

eritomicina u pročišćenim otpadnim vodama bile ispod granice detekcije. Koncentracija

ukupnih farmaceutika, antibiotika i sulfametoksazola u sedimentu se smanjivala s

udaljavanjem od UBP-a, dok eritromicin nije utvrĎen niti na jednoj lokaciji uzorkovanja

sedimenta.

Tablica 6. Koncentracija odreĎivanih farmaceutika u vodi (ng/L) i sedimentu (ng/g)

Voda

Ulaz komunalnih otpadnih voda Izlaz pročišćenih otpadnih voda

Jutro Podne Večer Jutro Pola dana Večer

Farmaceutici 112 333,45 107 688,88 118 557,90 21 085,90 35 383,55 27 830,73

Antibiotici 5 479,82 14 287,57 26 334,96 7 545,84 7 949,07 7 651,23

Sulfa lijekovi 90,88 87,88 49,39 65,71 60,12 68,44

Sulfametoksazol 57,74 67,81 26,55 51,68 51,02 53,14

Eritromicin 2,27 43,94 12,5 0 0 0

Sediment

Prijemnik pročišćenih otpadnih voda

Kanal Manteč Ţupanijski kanal

Farmaceutici 158 789,49 33 446,11 28 210,90

Antibiotici 144,54 17,51 18,58

Sulfametoksazol 19,6 5,07 0,99

Eritromicin 0 0 0

44

4.2. Ţivotinjske vrste i obrada tkiva

4.2.1. Ribe

4.2.1.1. Zdravstveni status riba

Općim kliničkim pregledom i patološko-anatomskom pretragom riba uhvaćenih tijekom

različitih godišnjih doba na tri reprezentativna mjesta uzorkovanja nisu utvrĎeni znakovi

bolesti. Na škrgama babuški iza prijemnika pročišćenih voda (kroz sva godišnja doba)

ustanovljene su hemoragične promjene uz opseţno izlučivanje sluzi i edem. Mikroskopskim

pregledom na nativnim preparatima škrga, koţe i peraja kod riba ulovljenih u potoku OĎenica

(Slika 2., Lokacija uzorkovanja 1) u proljeće je ustanovljena slaba invadiranost ektoparazitom

Dactylogyrus spp. Na ribama ulovljenima u Ţupanijskom kanalu na utoku kanala Manteč

(Slika 2. Lokacija uzorkovanja 8) u jesenskom razdoblju utvrĎeni su ektoparaziti

Dactylogyrus spp. (na jednoj ribi) i Gyrodactylus spp. (na dvije ribe). Najjača invadiranost

ektoparazitom Dactylogyrus spp. uz oštećenja na koţi (oštećenja ljuski, krvarenja na perajama

i repu), aneurizme na škrgama i telohaneloza po svim perajama utvrĎena je kod riba

ulovljenih u Ţupanijskom kanalu kod naselja Brezovica (Slika 2., lokacija uzorkovanja 9).

4.2.1.2. Histologija škrga, bubrega, jetre i slezene

Histopatološki nalaz riba iz efluenta otkriva strukturne i funkcionalne promjene na tkivu

škrga, ponajviše na sekundarnim lamelama Na tkivu škrga babuški ulovljenih u proljeće, ljeto

i jesen, nalaze se promjene u smislu sljepljivanja vršaka susjednih sekundarnih lamela u

potoku OĎenica, do sljepljivanja lamela i tvorbi „mosta“ koji premošćuje interlamelani

prostor (kanal Manteč i Ţupanijski kanal). Lamelarna fuzija primijećena je u proljeće. Ljeti su

se isticale atrofične i nekrotične lezije, dok je u jesen utvrĎena hipertrofija epitelnih i

interlamelarnih stanica. Ribe ulovljene u Ţupanijskom kanalu imale su izrazitu hiperplaziju i

hipertrofiju epitelnih i interlamelarnih stanica.

45

Slika 7. Škrge babuški ulovljenih u proljeće (a, b, c), ljeto (d, e, f) i jesen (g, h, i). Skala: a, b,

c: 0,5 mm; d, e, f: 0,2 mm; g, h, i: 0,1 mm. (a) Sljepljivanje vršaka nekoliko susjednih

sekundarnih lamela (potok OĎenica). (b) Sljepljivanje lamela; lateralni rubovi spojenih lamela

u nizu tvore “most” koji premošćuje interlamelani prostor (kanal Manteč). (c) Kovrčanje

lamela i meĎulamelarno premošćivanje (Ţupanijski kanal). (d) Lamelarni crteţ s pravilno

rasporeĎenim mukoznim stanicama u meĎulamelarnom prostoru (potok OĎenica). e)

Razdvajanje sekundarnih lamela praćeno hemoragičnim promjenama, oštećenjem kapilara i

hipersekrecijom mukoznih stanica (kanal Manteč); skraćenje sekundarnih lamela, atrofične i

nekrotične promjene stanica u interlamelarnom prostoru i potpornom hrskavičnom tkivu. (f)

Hipertrofija i hiperplazija stanica u interlamelarnom prostoru, skraćivanje/poduljivanje

sekundarnih lamela; hiperplazija mukoznih stanica (Ţupanijski kanal). (g) Pravilna histološka

slika škrga (potok OĎenica). (h) Hipertrofija epitelnih i interlamelarnih stanica, nekroza i jaka

infiltracija limfocitima; interlamelarni edem, odvajanje od primarne lamele (kanal Manteč).

(i) Hiperplazija i hipertrofija mukoznih stanica (Ţupanijski kanal).

Oštećenja na bubrezima odnose se na promjene nefrona i tubularnom sistemu. Različiti stadiji

atrofije i nekroze glomerula zabiljeţeni su tijekom sezona, a najveće promjene su bile

46

izraţene u ljeto i jesen (Slika 8.). U ljetnim mjesecima u kanalu Manteč, histološka slika

bubrega babuški pokazuje peritubularnu dilataciju i povećan broj malih intenzivno bazofilnih

nakupina stanica u blizini tubula, kao i povećanu infiltraciju makrofaga izmeĎu bubreţnih

kanalića. U Ţupanijskom kanalu tijekom ljetne sezone primijećeni su tipični multifokalni

granulomi, a vidljiva je tubularna degeneracija i znakovi smanjena lumena kanalića. U jesen

kod babuške iz Ţupanijskog kanala uočena je teška nekroza bubreţnog epitela, edem

bubreţnih tubula i prisutnost velikih eozinofilnih granula unutar stanica, te različiti stupnjevi

atrofije i nekroze glomerula.

Slika 8. Tkivo bubrega babuški ulovljenih u ljeto (a, b) i jesen (c, d) u kanalu Manteč (a,c) i

Ţupanijskom kanalu (b, d). Skala: 0,1 mm. (a) Peritubularna dilatacija (široka strelica),

bazofilne nakupine stanica (pune strelice), infiltracije makrofaga (srcolika strelica). (b)

Multifokalni granulomi (široke strelice), tubularna degeneracija (srcolika strelica), oštećenje

glomerula (puna strelica). (c) bazofilni nefroni (puna strelica), suţeni lumen nefrona (srcolika

strelica). (d) nekroza epitela (široke strelice), edem tubula (dugačke strelice), eozinofilne

granule (pune strelice), atrofija i nekroza glomerula (puna strelica).

47

Tkivo jetre babuški iz efluenta bilo je zahvaćeno patološkim promjenama tijekom ljeta i u

jesen, u obliku kariolize, binuklearnih hepatocita i distenzije sinusoida (Slika 9.). Promjene su

uočljive u riba iz kanala Manteč, kao i nizvodno, u riba iz Ţupanijskog kanala, pogotovo u

smislu nekroza i upalnih promjena.

Slika 9. Tkivo jetre babuški ulovljenih u ljeto (a, b) i jesen (c, d), u kanalu Manteč (a,c) i

Ţupanijskom kanalu (b, d). Skala: 0,1 mm. (a) Hepatociti gusto zbijeni, nejasnih obrisa;

gubitak staničnih membrana (srcolika strelica), karioliza (puna strelica), binuklearni hepatociti

(široka strelica). (b) Različiti stadiji apoptoze hepatocita; promjene na jezgrama u vidu

promjera i gustoće kromatina (srcolika strelica); ţarišna nekroza jetre (puna strelica). (c)

Vakuolarno proširenje sinusoida (d) Upalna leukocitna infiltracija (puna strelica); krvne

stanice izmeĎu hepatocita (srcolika strelica); anizokarioza i piknotične jezgre (široka strelica).

Histopatološke promjene na slezeni zapaţene su tijekom proljeća, u vidu intracelularnih

vakuola i granulomatoznih lezija kod riba iz efluenta i Ţupanijskog kanala (Slika 10.).

48

Slika 10. Tkivo slezene babuški ulovljenih u proljeće , u kanalu Manteč (a,b) i Ţupanijskom

kanalu (c). Skala: a, b: 0,05 mm; c: 0,1 mm. (a) Pravilna histološka struktura; ravnomjerna

raspodjela i dobra organiziranost melanomakrofagnih centara (MMC) (puna strelica) i

proširene sinusoide (široka strelica). (b) Intracelularne vakuole. (c) Granulomatozne lezije

(srcolika strelica) i smanjenje broja i veličina MMC (široka strelica).

4.2.1.3. Hematologija, biokemijski parametri u krvi riba

Vrijednosti GGT, GSH-Px i PON 1 u većini uzoraka nisu bile mjerljive, vjerojatno radi

hemolize, pa stoga nisu prikazane. Vrijednosti Hct (Tablica 7.) uglavnom nisu pokazivale

statistički značajne razlike izmeĎu skupina. Spearman Rank Order Correlation test pokazao

je kako varijable Hct za ribe iz Ţupanijskog kanala u ljeti i jesen imaju tendenciju pada, dok

ostale rastu (negativni koeficijent korelacije i p < 0,05).

Usporedba vrijednosti URE, CRE, TP, ALB, GLU, ALT, ALP, TRIG, CHOL i SOD babuški

kroz sezone prikazana je na Slici 11. One Way Analysis of Variance test pokazao je

signifikantnost (p < 0,05) za CHOL u plazmi riba iz Manteča u odnosu na ribe iz Ţupanijskog

kanala u jesen, te CHOL u plazmi riba iz OĎenice u ljeti u odnosu na ribe iz Ţupanijskog

kanala u jesen. Signifikantne razlike uočene su i za CRE i TRIG u plazmi riba iz OĎenice

(proljeće/jesen), za CRE u riba iz OĎenice (proljeće) u odnosu na Manteč (jesen). Isto tako,

TRIG je pokazivao signifikantnost u plazmi riba iz Manteča (proljeće/jesen). U proljeće je

zamijećen signifikantan rast vrijednosti URE, TP, ALB i TRIG u riba iz Manteča u usporedbi

sa svim ostalim babuškama, kao i signifikantan pad vrijednosti SOD u usporedbi sa

babuškama iz ostala dva kanala.

Spearman Rank Order Correlation test pokazao je kako parovi varijabli sa p vrijednostima

ispod 0,05 i pozitivnim koeficijentom korelacije, poput SOD u riba iz Ţupanijskog kanala

49

(proljeće/ljeto) imaju tendenciju da se zajedno povećavaju. Za parove varijabli sa negativnim

koeficijentom korelacije i sa p < 0,05, jedna varijabla ima tendenciju rasta, dok sve druge

padaju, poput: URE u riba iz Ţupanijskog kanala (proljeće/jesen), TRIG u riba iz Ţupanijskog

kanala (proljeće/jesen), ALT u riba iz Ţupanijskog kanala (proljeće)/OĎenice (jesen), SOD u

riba iz Ţupanijskog kanala (ljeto/jesen), Hct u riba iz Ţupanijskog kanala (proljeće/jesen).

Tablica 7. Vrijednosti hematokrita krvi babuške kroz sezone

Lokacija uzorkovanja

Proljeće

Ljeto Jesen

OĎenica (Lokacija uzorkovanja 1

prema Slici 2.) 33,60 ± 14,52 29,00 ± 13,21 36,06 ± 11,48

Manteč (Lokacija uzorkovanja 8 prema

Slici 2.) 42,00 ± 8,37 27,20 ± 18,36 27,86 ± 3,85(*)

Ţupanijski kanal nizvodno (Lokacija

uzorkovanja 9 prema Slici 2.) 47,14 ± 7,26 37,56 ± 10,08 42,44 ± 6,38(*)

Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD); vrijednosti

označene sa (*) su signifikantne (p < 0,05).

50

Slika 11. Biokemijski parametri i parametri oksidacijskog stresa; (log10 osnovne skale) u

plazmi babuški po sezonama prema mjestu ulova (Slika 2., lokacije uzorkovanja 1, 8, 9) URE

(urea), CRE (kreatinin), TP (ukupne bjelanjčevine), ALB (albumin), GLU (glukoza), ALT

(alanin aminotransferaza), ALP (alkalna fosfataza), TRIG (trigliceridi), CHOL (kolesterol),

SOD (aktivnost superoksid dismutaze).

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

URE CRE TP ALB GLU ALT ALP TRIG CHOL SOD

log

10 o

snovvn

e s

kale

Proljeće

1.

8.

9.

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

URE CRE TP ALB GLU ALT ALP TRIG CHOL SOD

log

10 o

snovn

e s

kale

Ljeto

1.

8.

9.

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

URE CRE TP ALB GLU ALT ALP TRIG CHOL SOD

log

10 o

snovn

e s

ka

le

Jesen

1.

8.

9.

c

a

b

b

d

c c

a

a

d d

a

b

a

51

Stupci pogreške predstavljaju standardnu devijaciju srednje vrijednosti. Razlike u

vrijednostima parametara označenih istim malim slovima (a, b, c, d) statistički su značajne (p

< 0,05).: a-prosječna vrijednost TRIG-a u proljeće bila je u krvi riba iz Ţupanijskog kanala

nizvodno 3,3 mmol/L, a u jesen 4,1 mmol/L; b-prosječna vrijednost SOD-a na istoj lokaciji

bila je u proljeće 502,5 U/L, u ljeto 505,3 U/L, a u jesen 299,8 U/L; c – prosječna vrijednost

CRE u potoku OĎenica bila je u proljeće 50 µmol/L, u jesen 30,3 µmol/L a u Ţupanijskom

kanalu nizvodno u jesen 34,4 µmol/L; d- prosječna vrijednost CHOL u potoku OĎenica u ljeto

iznosila je 3,5 mmol/L, u jesen 4,5 mmol/L, a u jesen u Ţupanijskom kanalu nizvodno 9,1

mmol/L.

4.2.1.4. Procjena genotoksiĉnosti (ENA i MN test)

Statistička analiza učestalosti pojave eritrocita sa nepravilnim jezgrama (ENA) pokazala je

najviše srednje vrijednosti kod riba iz Manteča u proljeće (13,19 ‰) i ljeto (12,77 ‰). Znatno

niţe vrijednosti zabiljeţene su u OĎenici (1,74-2,39 ‰) dok se prosječna učestalost ENA kod

babuški iz Ţupanijskog kanala kretala od 5,64 u proljeće do 7,57 ‰ u jesen. MeĎutim

statistički značajna razlika (p < 0,05) utvrĎena je samo u jesen izmeĎu riba iz Ţupanijskog

kanala i Manteča (Slika ). Učestalost pojave mikronukleusa (MN) bila je niska te su se srednje

vrijednosti kretale od 0,04 do 0,16 ‰.

Slika 12. Učestalost eritrocita sa nepravilnim jezgrama (‰) kod babuške; ab (p < 0,05)

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Proljeće Ljeto Jesen

Ođenica

Manteč

Kanal

a

b

52

4.2.2. Gujavice

4.2.2.1. Gujavice: Test kontakta na filtar papiru

Prilikom izlaganja gujavica otpadnoj vodi pomoću filtar papir kontakt testa došlo je do

statistički značajne akumulacije fluorescentnog supstrata R123 u tkivima, što upućuje na

pristutnost MXR inhibitora u svim ispitivanim uzorcima. Razlika u jačini inhibicije ABC

transportera razlikovala se ovisno o sezoni uzorkovanja (Slika 14., Slika 15., Slika16.).

Najveća akumulacija R123 zabiljeţena je prilikom izlaganja gujavica otpadnoj vodi

uzorkovanoj u proljeće, posebice nakon izlaganja uzorku broj 1 (OĎenica) razrijeĎenom 100 x

(pribliţno 2,7 puta povećana u odnosu na kontrolne vrijednosti) te uzorku broj 10 (aktivni

mulj) razrijeĎenom 10 000 x (pribliţno 2,9 puta povećana u odnosu na kontrolne vrijednosti).

Vrijednosti akumulacije R123 u tkivu gujavica izlaganih otpadnoj vodi uzorkovanoj u ljeto

bile su nešto niţe, no i dalje statistički značajne. U ljetnim mjesecima najveći inhibitorni

potencijal uzrokovao je uzorak broj 1 razrijeĎen 100 x (akumulacija R123 pribliţno 2,2 puta

povećana u odnosu na kontrolne vrijednosti) te uzorak broj 4 razrijeĎen 100 x (pribliţno 1,7

puta povećana u odnosu na kontrolne vrijednosti). Jesensko uzorkovanje ukazalo je na najveći

inhibitorni potencijal uzoraka broj 1 i 9 razrijeĎenih 100 x (akumulacija R123 2,6 te 1,8 puta

povećana u odnosu na kontrolne vrijednosti, pojedinačno).

53

Slika 13. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h tretmana izlaganja otpadnoj vodi uzorkovanoj u proljeće 2014. god. Isprekidana

linija označava kontrolnu vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ± SD, *p ≤

0,05.

Slika 14. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24h tretmana izlaganja otpadnoj vodi uzorkovanoj u ljeto 2014.god. Isprekidana linija

označava kontrolnu vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ± SD,*p ≤ 0,05.

54

Slika 15. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h tretmana izlaganja otpadnoj vodi uzorkovanoj u jesen 2014. god. Isprekidana

linija označava negativnu kontrolnu vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ±

SD, *p ≤ 0,05.

4.2.2.2. Mjerenje lipidne peroksidacije u gujavicama nakon izlaganja otpadnim vodama

i otpadnom mulju

Izlaganje gujavica uzorcima otpadnih voda ukazalo je na statistički značajno povećanje

TBARS koncentracije u tkivima gujavica. Najveća TBARS koncentracija zabiljeţena je

nakon izlaganja gujavica 100 x razrijeĎenim uzorcima otpadne vode (Slika 16., Slika 17.,

Slika 18.). Navedeno razrijeĎenje uzrokovalo je najveće povećanje TBARS koncentracije

prilikom izlaganja gujavica uzorcima 2 i 3 prikupljenim u proljeće 2014 (pribliţno 1,6,

odnosno 1,5 puta u odnosu na kontrolne vrijednosti). TBARS vrijednosti u ostalim mjesecima

bile su nešto niţe, no još uvijek statistički značajne. Najveća TBARS koncentracija u

proljetnim uzorcima izmjerena je nakon izlaganja gujavica 100 x razrijeĎenom uzorku broj 1

(pribliţno 1,3 puta povećana) te uzorku broj 2 (pribliţno 1,5 puta povećana). U jesen, najveće

povećanje koncentracije iznosilo je pribliţno 1,4 puta u odnosu na kontrolu, te je zabiljeţeno

u uzorcima 2 i 4 (UBP-ulaz i UBP-izlaz).

55

Slika 16. TBARS koncentracija u tkivu gujavice E. fetida nakon izlaganja uzorcima otpadne

vode (nerazrijeĎenim, razrijeĎenim 100 x i 10.000 x) uzorkovane u proljeće 2014. g. Simboli:

' = 24-h izlaganje, '' = 48-h izlaganje, ''' = 7-d izlaganje. Isprekidana linija označava kontrolnu

vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ± SD, *p ≤ 0,05.

56

Slika 17. TBARS koncentracija u tkivu gujavice E. fetida nakon izlaganja uzorcima otpadne

vode (nerazrijeĎenim, razrijeĎenim 100 x i 10.000 x) uzorkovane u ljeto 2014. g. Simboli: ' =

24-h izlaganje, '' = 48-h izlaganje, ''' = 7-d izlaganje. Isprekidana linija označava kontrolnu

vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ± SD, *p ≤ 0,05.

Slika 183. TBARS koncentracija u tkivu gujavice E. fetida nakon izlaganja uzorcima otpadne

vode (nerazrijeĎenim, razrijeĎenim 100 x i 10.000 x) uzorkovane u jesen 2014. g. Simboli: ' =

24-h izlaganje, '' = 48-h izlaganje, ''' = 7-d izlaganje. Isprekidana linija označava kontrolnu

vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ± SD, *p ≤ 0,05.

4.2.2.3. Razina inhibicije MXR proteina uslijed izlaganja otpadnom mulju

Porast akumulacije R123 zabiljeţen je prilikom izlaganja objema koncentracijama

dehidriranog aktivnog mulja (Slika 19., Slika 20., Slika 21.). Najveća koncentracija R123

izmjerena je u tkivima gujavica izlaganima 24 h većoj koncentraciji aktivnog mulja, čiji je

porast iznosio priblţno 2,2; 1,1; 1,8 u odnosu na kontrolne vrijednosti, ovisno o periodu

uzorkovanja (proljeće; ljeto; jesen). 24-satno izlaganje gujavica manjoj koncentraciji aktivnog

mulja (30 %) rezultiralo je takoĎer statistički značajnim porastom R123 akumulacije u

tkivima, i to pribliţno 0,9; 0,8; 1,0 puta većim u odnosu na kontrolne vrijednosti izmjerene u

57

proljeće, ljeto, jesen. Sedmi dan pokusa koncentracija fluorescentnog supstrata u tkivima

gujavica bila je slična kontrolnim vrijednostima, stoga statistički nije značajna.

Slika 19. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u

proljeće. Isprekidana linija označava negativnu kontrolnu vrijednost, dok puna linija označava

pozitivnu (MK571) kontrolnu vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ± SD, *p ≤

0,05.

Slika 20. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u ljeto.

58

Isprekidana linija označava negativnu kontrolnu vrijednost, dok puna linija označava

pozitivnu (MK571) kontrolnu vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ± SD, *p ≤

0,05.

Slika 21. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u

jesen. Isprekidana linija označava negativnu kontrolnu vrijednost, dok puna linija označava

pozitivnu (MK571) kontrolnu vrijednost. Podaci su izraţeni kao srednja vrijednost ± SD, *p ≤

0,05.

4.2.2.4. Razina oksidacijskog stresa uslijed izlaganja otpadnom mulju

Tijekom izlaganja gujavica E. fetida dvjema koncentracijama dehidriranog aktivnog mulja,

koncentracije u gujavicama izlaganima niţoj koncentraciji (30 %) bile su više nego li je to bio

slučaj prilikom izlaganja većoj koncentraciji (70 %). Nakon samo 24 h izlaganja niţoj

koncentraciji došlo je do statistički značajnog porasta TBARS-a u tkivu gujavice. Najveće

TBARS koncentracije zabiljeţene su nakon 48 h izlaganja manjoj koncentraciji aktivnog

mulja, te su pojedinačno prema redu uzorkovanja iznosile povećanje od pribliţno 1,9 ( Slika

22., Slika 23., Slika 24.) puta u odnosu na kontrolne vrijednosti. Trend smanjivanja TBARS

vrijednosti u gujavicama 7. dan trajanja pokusa zabiljeţen je u svim ispitanim uzorcima.

Zanimljivo, tijekom testiranja veće koncentracije (70 %) dehidriranog aktivnog mulja, niti u

jednom od uzoraka nije zabiljeţen statistički značajan porast TBARS-a.

59

Slika 22. Koncentracija TBARS-a u tkivu gujavice E. fetida nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja

dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u proljeće. Isprekidana linija označava

negativnu kontrolnu vrijednost.

Slika 23. Koncentracija TBARS-a u tkivu gujavice E. fetida nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja

dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u ljeto. Isprekidana linija označava

negativnu kontrolnu vrijednost.

60

Slika 24.. Koncentracija TBARS-a u tkivu gujavice E. fetida nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja

dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u jesen. Isprekidana linija označava

negativnu kontrolnu vrijednost.

4.3. AMES test

Iz rezultata koje prikazuju Tablica 8, Tablica 9, Tablica 10 moţe se vidjeti da je laboratorijski

postupak ispravan: na pločama bez bakterija nije bilo spontanih revertanata koji bi ukazivali

na onečišćenje; broj spontanih revertanata bio je unutar očekivanih vrijednosti za TA 98 i TA

100 soj; izravni i neizravni mutageni spojevi uzrokovali su očekivano visoki broj revertanata.

Na temelju dobivenih rezultata utvrĎeno je da u svim testiranim uzorcima otpadnih voda ne

dolazi do pojave dvostruko većeg broja revertanata te da jednako tako rezultati ne ukazuju na

prisustvo premutagenih i/ili mutagenih tvari, prema meĎunarodno prihvaćenim kriterijima za

bakterijski Ames test.

61

Tablica 8. Rezultati analize mutagenog potencijala uzoraka otpadne vode uzorkovane u

proljeće Ames bakterijskim testom. Rezultati predstavljaju brojeve pozitivnih (His+)

revertanata po test ploči, uz pripadajuće srednje vrijednosti.

Uzorak

Salmonella typhimurium

TA 98 TA 100

br. His+

revertanata

Srednja

vrijednost

br. His+

revertanata

Srednja

vrijednost

1 25

27 26

205

177 191

2 23

21 22

209

225 217

3 20

34 27

225

230 227,5

4 29

30 29,5

220

195 207,5

5 19

25 22

233

202 217,5

6 25

29 27

221

240 230,5

7 25

22 23,5

252

210 231

8 19

18 18,5

196

186 191

9 28

23 25,5

209

271 240

10 20

28 24

194

226 210

Kontrole postupka

Kontrola bez bakterija 0

0 0

0

0 0

Kontrola-spontani

revertanti

29

33

22

28

178

180

200

186

Kontrola NOPD (20

µg/po ploči)

› 1300

› 1300

› 1 300

Kontrola 2-AF (20

µg/ploči)

› 1 800

› 1 800

› 1 800

62

Tablica 9. Rezultati analize mutagenog potencijala uzoraka otpadne vode uzorkovane u ljeto

Ames bakterijskim testom. Rezultati predstavljaju brojeve pozitivnih (His+) revertanata po

test ploči, uz pripadajuće srednje vrijednosti.

Uzorak

Salmonella typhimurium

TA 98 TA 100

br. His+

revertanata

Srednja

vrijednost

br. His+

revertanata

Srednja

vrijednost

1 15

13 14

125

133 129

2 19

24 21,5

120

129 124,5

3 21

23 22

135

129 132

4 19

24 21,5

139

132 135,5

5 25

23 24

117

125 121

6 27

24 25,5

132

139 135,5

7 20

17 12,3

135

129 132

8 22

26 24

118

125 121,5

9 25

29 27

132

126 129

10 16

19 17,5

127

135 131

Kontrole postupka

Kontrola bez bakterija 0

0 0

0

0 0

Kontrola-spontani

revertanti

16

17

21

18

122

129

127

126

Kontrola NOPD (20

µg/po ploči)

› 1 300

› 1 300

› 1300

Kontrola 2-AF (20

µg/ploči)

› 1 800

› 1 800

› 1 800

63

Tablica 10. Rezultati analize mutagenog potencijala uzoraka otpadne vode uzorkovane u jesen

Ames bakterijskim testom. Rezultati predstavljaju brojeve pozitivnih (His+) revertanata po

test ploči, uz pripadajuće srednje vrijednosti.

Uzorak

Salmonella typhimurium

TA 98 TA 100

br. His+

revertanata

Srednja

vrijednost

br. His+

revertanata

Srednja

vrijednost

1 13

15 14

119

138 128,5

2 9

12 10,5

132

141 136,5

3 9

17 13

129

165 147

4 18

15 16,5

177

155 166

5 19

10 14,5

137

138 137,5

6 7

20 13,5

137

143 140

7 12

19 15,5

139

127 133

8 15

19 17

172

145 158,5

9 20

20 20

165

157 161

10 10

13 11,5

197

164 180,5

Kontrole postupka

Kontrola bez bakterija 0

0 0

0

0 0

Kontrola-spontani

revertanti

14

14

16

14,6

135

121

143

133

Kontrola NOPD (20

µg/po ploči)

› 1 300

› 1 300

› 1300

Kontrola 2-AF (20

µg/ploči)

› 1 800

› 1 800

› 1 800

64

4.4. Mikrobiološke analize vode, mulja i tkiva riba

Slika 25. pokazuje log10 vrijednosti broja pojedinih skupina bakterija po mL vode ili g mulja

na svim lokacijama uzorkovanja za svaki vremenski period. Za mulj s deponije (Slika 2.,

lokacija uzorkovanja 11) prikazane su log10 vrijednosti broja pojedine skupine bakterija u 1

gramu uzorka.

Najveći broj ukupnih kolonija na 37 °C i 22 °C, ako se isključi aktivni mulj na UBP-u i kruti

otpadni mulj s deponije, zabiljeţen je u jesen u šećeranskim i pročišćenim otpadnim vodama.

U OĎenici je u svim ispitivanim terminima prisutnost ovih bakterija bila najmanja. U

istraţenim uzorcima voda u kanalu Manteč nakon Biljnog ureĎaja Lukač (Slika 2. lokacija

uzorkovanja 6) u proljeće i ljeto dolazi do povećanja broja kolonija na 37 °C i 22 °C. Za

razliku od jesenskog perioda, u Ţupanijskom kanalu nakon ulijevanja kanala Manteč, kao

prijemnika pročišćenih otpadnih voda, dolazi do povećanja broja kolonija na 37 °C i 22 °C.

Koliformnim bakterijama, fekalnim koliformima, bakterijom E. coli i enterokokima najviše su

bile zagaĎene komunalne otpadne vode a učinkovitost UPB-a u smanjenju njihovog broja bila

je preko 90 %. U Ţupanijskom kanalu u proljeće i ljeto broj koliformnih bakterija bio je

nizvodno povećan, a isti trend bio je sa E. coli u jesen. U proljetnom i jesenskom periodu broj

koliformnih bakterija, fekalnih koliforma, E. coli i enterokoka bio je veći u potoku OĎenica

nego u Ţupanijskom kanalu u koji se ulijeva prijemnik pročišćenih otpadnih voda, čime

postaje upitna teza da se radi o mikrobiološki nezagaĎenom potoku.

65

Slika 25 . Rezultati mikrobioloških ispitivanja vode i mulja (Slika 2., lokacija uzorkovanja 1-9

(voda), lokacija uzorkovanja 10-11 (mulj))

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

log

10 c

fu/m

L

Broj kolonija na 37 °C

proljeće ljeto jesen

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

log

10 c

fu/m

L

Broj kolonija na 22 °C

proljeće ljeto jesen

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

log

10 c

fu/1

00

mL

Koliformne bakterije

proljeće ljeto jesen

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

log

10 c

fu/1

00 m

L

Fekalni koliformi

proljeće ljeto

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

log

10

cfu

/10

0 m

L

E.coli - uzorkovanje u jesen

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

log

10 c

fu/1

00

mL

Crijevni enterokoki

proljeće ljeto jesen

66

Rezultate ispitivanja bakterija Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocitogenes i Salmonella

sp. u uzorcima vode i mulja prikazuje Tablica 11, a u Tablicama 12.-14, Slikama 27.-29.

prikazan je postotak bakterijskih izolata u uzorcima vode i mulja.

Tablica 11. Prisutnost Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes i Salmonella sp. u

uzorcima vode i mulja

Proljeće Lokacija uzorkovanja (Prema Slici

2.)

Psudomonas

aeruginosa/100

mL

Listeria monocytogenes/100 mL Salmonella sp./100 mL

Ljeto

Jesen

1

neg(-) neg(-) -

neg(-) neg(-)

neg(-)

9,8x101 neg(-) neg(-)

2

2,0x103 neg(-)

poz(+)

3,0x103 poz(+) neg(-)

1,7x105 neg(-), L.inocua,L.grayi poz(+) poz(+)

3

neg(-) neg(-)

-

- - -

neg(-) neg(-) neg(-)

4

neg(-) neg(-)

neg(-)

neg(-) neg(-) neg(-)

2,0x102 neg(-) neg(-)

5

neg(-) neg(-)

-

neg(-) neg(-), L.ivanovii poz(+) neg(-)

1,1x103 neg(-), L.ivanovii poz(+) poz(+)

6

neg(-) neg(-)

-

1,5x101 neg(-), L.ivanovii poz(+) neg(-)

1,7x103 neg(-), L.welchimeri poz(+) neg(-)

7

neg(-) neg(-)

-

neg(-) neg(-) neg(-)

neg(-) neg(-) neg(-)

8

neg(-) neg(-) -

neg(-) neg(-), L.ivanovii poz(+) neg(-)

neg(-) neg(-), L.ivanovii poz(+) neg(-)

9

neg(-) neg(-)

-

neg(-) neg(-) -

2,0x101 neg(-) neg(-)

10

neg(-) neg(-) -

3,0x103 neg(-), L.inocua poz(+) neg(-)

>2,4x104 neg(-), L.grayi poz(+) poz(+)

11

neg(-) neg(-) -

- neg(-), L.inocua poz(+) neg(-)

1,0x102 neg(-), L.grayi poz(+) poz(+)

67

Najveći broj Pseudomonas aeruginosa prisutan je u komunalnim otpadnim vodama a iz

uzoraka šećeranskih otpadnih voda, kanala Manteč na mjestu ulijevanja u Ţupanijski kanal i

Ţupanijskog kanala nizvodno ova bakterija nije izolirana. U uzorcima iz potoka OĎenica

izoliran je veći broj Pseudomonas aeruginosa nego iz Ţupanijskog kanala. Na UBP-u se iz

otpadnih voda ukloni više od 99 % ovih bakterija.

Listeria monocytogenes pronaĎena je samo u komunalnim otpadnim vodama ljeti. Salmonella

sp. izolirana je u proljeće i ljeto u komunalnim otpadnim vodama i u jesen u uzorcima

muljeva.

68

Tablica 12. Postotak izolata u uzorcima vode (1-9) i mulja (10-11) u proljeće (API 20E i

MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF MS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Aeromonas bestiarum - - - 2,44 - - - - - - -

Aeromonas caviae - - - - - - - - - - 2,44

Aeromonas hydrophila - 2,44 - - - - - - - - -

A. hydrophila ssp. - - - - 2,44 - - - - - -

Aeromonas media - - - 2,44 - - - - - - -

Aeromonas popoffii - 2,44 - - 2,44 - 4,88 - 2,44 - -

Aeromonas sorbia - - - - - - - 2,44 - - -

Aeromonas sp. - 2,44 - - - - - - - - -

Aeromonas sp. (2) - - - - 2,44 4,88 - 7,32 - - -

Aeromonas veronii - - - 2,44 - - - - - - -

Bacillus simplex - - - - - - 2,44 - - - -

Lysinibacillus fusirormis - - - - 2,44 2,44 - - - - -

Lysinibacillus sfaericus - - - - - - - - - - 2,44

Myroides odoratimimus 4,88 - - - - - - - - - -

Proteus vulgaris - - 7,32 - - - - - - - -

Providencia alcalifaciens - - 2,44 - - - - - - 2,44 -

Providencia retgeri 4,88 - - - - - - - - 7,32 -

Pseudomonas kilonensis - - - - - - - - - - 2,44

Pseudomonas thievervale - - - - - - - - - - 2,44

Serratia liquefaciens - 2,44 - - - - - - - - -

Shewanella baltica - - - - - - - - 2,44 - -

Shewanella profunda - - - - - 2,44 - - - - -

Shewanella putrefaciens - - - - - - - - 2,44 - -

API 20E 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

A.hydrophila group 1 - 3,85 - 11,54 11,54 3,85 3,85 11,54 7,69 - 7,69

A.hydrophila group 2 - 7,69 - - - 3,85 - 3,85 - - -

Ps.fluorescens/putida - - - - - - - - - 7,69 -

Serratia liquefaciens - 3,85 - - - - - - - - -

Shewanella putrefaciens - - - - - 3,85 3,85 - 3,85 - -

Slika 26. Postotak izolata MALDI-TOF MS/API 20E u uzorcima voda i mulja u proljeće

2,44

2,44

2,44

2,44

2,44

12,2

2,44

2,44

14,64

2,44 2,44 4,88 2,44

4,88

7,32

4,88

12,2

2,44

2,44

2,44

2,44

2,44

2,44

MALDI-TOF MS Aeromonas bestiarumAeromonas caviaeAeromonas hydrophilaA. hydrophila ssp.Aeromonas mediaAeromonas popoffiiAeromonas sorbiaAeromonas sp.Aeromonas sp. (2)Aeromonas veroniiBacillus simplexLysinibacillus fusirormisLysinibacillus sfaericusMyroides odoratimimusProteus vulgarisProvidencia alcalifaciensProvidencia retgeriPseudomonas kilonensisPseudomonas thievervaleSerratia liquefaciensShewanella balticaShewanella profunda

61,55 15,39

7,69

3,85 11,55

API 20E

A.hydrophilagroup 1

A.hydrophilagroup 2

Ps.fluorescens/putida

Serratialiquefaciens

Shewanellaputrefaciens

69

Tablica 13. Postotak izolata u vode (1-9) i mulja (10-11) u ljeto (API 20E i MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF MS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Aeromonas caviae - - - - - 2,22 - - - - -

Aeromonas hydrophila - - 2,22 4,44 - 2,22 - 2,22 - 2,22 2,22

Aeromonas veronii - - 2,22 - 4,44 - 8,89 6,67 2,22 - -

Alcaligenes faecalis - 2,22 - - - - - - - - -

Bacillus cereus - - - - 4,44 2,22 - - - - 2,22

Bacillus megaterium - - - - - - - - 2,22 - 4,44

Enterobacter cowanii - - - - - - - - 4,44 - -

Escherichia coli - - 2,22 2,22 - - - - - - -

Klebsiella oxitoca - - - - - - - - - 2,22 -

Klebsiella pneumoniae - - - - - - - - - 4,44 -

Morganella morganii 2,22 - - - - - - - - - -

Protues mirabilis - 6,67 - - - - - - - - -

Providencia rettgeri - - 2,22 2,22 - - - - - - -

Pseudomonas oleovorans - - - - - 4,44 - - - - -

API 20E 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

A.hydrophila group 1 - 6,90 6,90 - 6,90 6,90 - - - - -

A.hydrophila group 2 10,3 3,45 - 6,90 - 3,45 13,8 3,45 - - 3,45

Bordetella/Alcaligenes/M

oraxella spp. - - - - - - 3,45 - - - -

Klebsiela ornithinolytica - - - 3,45 - - - - - - -

Klebsiella oxitoca - - - - - - - - 3,45 - -

Klebsiella terrigena - - - - - - - - 3,45 - -

Pantoea spp. 2 - - - - - - - 3,45 - - -

Rachnella aquatilis - - - - - - - 3,45 - - -

Serratia marcescens - - 3,45 - - - - - - - -

Vibrio cholerae - - - - - - - 3,45 - - -

Slika 27. Postotak izolata u uzorcima vode i mulja MALDI-TOF MS/API 20E - ljeto

2,22

15,54

24,44

2,22

8,88

6,66 4,44

4,44 2,22

4,44

2,22 6,67

4,44 4,44

MALDI-TOF MS Aeromonas caviae

Aeromonas hydrophila

Aeromonas veronii

Alcaligenes faecalis

Bacillus cereus

Bacillus megaterium

Enterobacter cowanii

Escherichia coli

Klebsiella oxitoca

Klebsiella pneumoniae

Morganella morganii

Protues mirabilis

Providencia rettgeri

Pseudomonasoleovorans

27,6

44,8

3,45

3,45

3,45

3,45

3,45 3,45

3,45 3,45

API 20E A.hydrophila group 1

A.hydrophila group 2

Bordetella/Alcaligenes/Moraxella spp.KlebsielaornithinolyticaKlebsiella oxitoca

Klebsiella terrigena

Pantoea spp. 2

Rachnella aquatilis

Serratia marcescens

Vibrio cholerae

70

Tablica 14. Postotak izolata u vode (1-9) i mulja (10-11) u jesen (API 20E i MALDI-TOF

MS)

MALDI-TOF MS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Actinobacter tandoii - - - - - - - - - 2,38 -

Aeromonas bestiarum 2,38 - - - - - - - - - -

Aeromonas caviae - - - - - - - 2,38 - - -

Aeromonas hydrophila - - - - 7,14 4,76 - 2,38 - - -

Aeromonas ichthiosmia - - - - 2,38 - - 2,38 - - -

Aeromonas media 2,38 - - - - - - - - - 2,38

Aeromonas veronii - - - - - 2,38 2,38 - 2,38 - -

Alcaligenes faecalis - - - - - - - - - 2,38 -

Bacillus megaterium - - - - - 2,38 - - - - -

Buttiauella gaviane 2,38 - - - - - - - - - -

Candida auilliermondii

(ana) (Pkichia

gulliermondii (telo)

- - - - - - - - 2,38 - -

Citrobacter braakii - - - - - - 2,38 - - - -

Comamonas testosteroni - - 4,76 - - - - - - - -

Delftia acidovorans - - 2,38 - - - - - - - -

Enterobacter asburiae - - - 2,38 - - - - - - -

Enterobacter cloacae - - - - - - - - - - 2,38

Enterobacter ludwigii - - - - - - 2,38 - - - -

Klebsiella pneumoniae - - - 2,38 - - - - - - -

Myroides odoratus 2,38 - - - - - - - - - -

Proteus vulgaris - - - - - - - 2,38 - - -

Providencia retgerii - - - 2,38 - - - - - - -

Providencia rustigianii - - 2,38 - - - - - - - -

Ps. chlororaphis - - - - - - - - 4,76 - -

Psudomonas putida - 2,38 - - - - 2,38 - - - -

Psudomonas vulgaris - 7,14 - - - - - - - - -

Roultella ornithinolytica - - - 2,38 - - - - - - -

Stenotrophomonas

maltophilia - - - - - - - - - - 2,38

Wauteriella falsenii - - - - - - - - - 2,38 -

API 20E 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

A.hydrophila group 1 11,5 - - - 7,69 3,85 - 3,85 - - 3,85

A.hydrophila group 2 - - - - 3,85 3,85 3,85 - 3,85 - 3,85

Citrobaccter braakii - - - - - - 7,69 - - - -

Enterobacter cloacae - - - - - - - - - - 3,85

Enterobacter sakazakii - - - - - - - - - - 3,85

Klebsiella oxitoca - - - 11,5 - - - - - - -

Klebsiella terrigena - - - 3,85 - - - - 7,69 - -

Ps. fluorescens/putida - - - - - - 3,85 - - - -

Serratia fonticola 3,85 - - - - - - - - - -

Serratia odorifera 1 - - - - 3,85 - - - - - -

71

Slika 28. Postotak izolata u uzorcima vode i mulja MALDI-TOF MS/API 20E - jesen

Rezultati bakteriološkog ispitivanja briseva s koţe i škrga riba prikazani su na Slici 29. Broj

aerobnih bakterija na +37 °C i +22 °C, koliforminih bakterija i enterokoka na svim ispitanim

2,38 2,38 2,38

14,28

4,76

4,76

7,14

2,38 2,38

2,38 2,38 2,38

4,76

2,38 2,38

2,38

2,38

2,38

2,38

2,38

2,38

2,38

4,76

4,76

7,14

2,38 2,38 2,38

MALDI-TOF MS

Actinobacter tandoii

Aeromonas bestiarum

Aeromonas caviae

Aeromonas hydrophila

Aeromonas ichthiosmia

Aeromonas media

Aeromonas veronii

Alcaligenes faecalis

Bacillus megaterium

Buttiauella gaviane

Candida auilliermondii/Pkichia gulliermondii

Citrobacter braakii

Comamonas testosteroni

Delftia acidovorans

Enterobacter asburiae

Enterobacter cloacae

Enterobacter ludwigii

Klebsiella pneumoniae

Myroides odoratus

Proteus vulgaris

Providencia retgerii

Providencia rustigianii

Ps. chlororaphis

Psudomonas putida

Psudomonas vulgaris

Roultella ornithinolytica

Stenotrophomonas maltophilia

Wauteriella falsenii

30,74

19,25

7,69 3,85

3,85

11,5

11,54

3,85

3,85

3,85

API 20E

A.hydrophila gr. 1

A.hydrophila gr.2

Citrobaccter braakii

Enterobacter cloacae

Enterobacter sakazakii

Klebsiella oxitoca

Klebsiella terrigena

Ps. fluorescens/putida

Serratia fonticola

Serratia odorifera 1

72

lokacijama značajnije je veći u ljeto a kvasaca i plijesni u jesen. E. coli nije utvrĎena a

Pseudomonas aeruginosa izoliran je na škrgama riba iz Ţupanijskog kanala nakon utoka

efluenta.

Slika 29. Prikaz mikrobiološke analize briseva s organa riba; K-koţa, Š-škrge

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1. 8. 9. 1. 8. 9.

LJETO JESEN

log

10cfu

/1m

L

Broj kolonija na 37 °C i 22 °C

Broj kolonija u 1 ml na 37˚C K

Broj kolonija u 1 ml na 37˚C Š

Broj kolonija u 1 ml na 22˚C K

Broj kolonija u 1 ml na 22˚C Š

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1. 8. 9. 1. 8. 9.

LJETO JESEN

log

10cfu

/100 m

L

Koliformne bakterije

Koliformne bakterije K

Koliformne bakterije Š

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1. 8. 9. 1. 8. 9.

LJETO JESEN

log

10cfu

/10

0 m

L

Crijevni enterokoki

Enterokoki K Enterokoki Š

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1. 8. 9. 1. 8. 9.

LJETO JESEN

log

10 c

fu/1

mL

Kvasci i plijesni

Kvasci K Kvasci Š Plijesni K Plijesni Š

73

U Tablicama 15.-17. i Slikama 30.-32. prikazan je postotak izolata briseva s organa riba u

proljeće.

Tablica 15. Postotak izolata briseva s organa riba u proljeće (API 20E i MALDI-TOF MS) Š-

škrge, S-slezena, J-jetra, B-bubreg

MALDI-TOF MS 1. 8. 9.

Š J B Š J Š SL J

A.salmonicida spp. Salomicida 2,82

Acinetobacter generi 0,70

Acinetobacter guilouiae 0,70

Acinetobacter johnsonii 2,82

Acinetobacter pittii 2,11

Acinetobacter tondoii 0,70

Aeromonas bestiarum 14,1 2,82 0,70 1,56

Aeromonas encheleia 1,56

Aeromonas johnsonii 0,70

Aeromonas media 2,82

Aeromonas popoffii 0,70 1,56

Aeromonas sorbia 0,70 7,82 0,47

Aeromonas veronii 2,82 0,70 1,56 0,47

Jonthinobacterium lividum 0,70

Pseudomonas fragi 5,64

Pseudomonas graminis 2,82 2,82

Pseudomonas orientalis 0,70

Rheinheimera soli 14,1 2,11

Shewanella baltica 14,1 5,63 0,47

API 20E 1. 8. 9.

Š J B Š J Š SL J

A.hydrophila group 1 5,13 5,13 3,37

A.hydrophila group 2 2,56 12,8 12,8 4,72 12,8 12,8

Ochrobactrum anthropi 12,8 4,05

Ps.fluorescens/putida 5,13 5,13

Pseudomonas aeruginosa 0,67

Slika 30. Postotak izolata briseva s organa riba u proljeće (API 20E i MALDI-TOF MS)

2,8

0,7

0,7 2,8

2,1 0,7

19,2

1,6

0,7

2,8

2,3 9,0 5,6

0,7

5,6 5,6

0,7

16,2

20,2

MALDI-TOF MS A.salmonicida spp. SalomicidaAcinetobacter generiAcinetobacter guilouiaeAcinetobacter johnsoniiAcinetobacter pittiiAcinetobacter tondoiiAeromonas bestiarumAeromonas encheleiaAeromonas johnsoniiAeromonas mediaAeromonas popoffiiAeromonas sorbiaAeromonas veroniiJonthinobacterium lividumPseudomonas fragiPseudomonas graminisPseudomonas orientalisRheinheimera soliShewanella baltica

13,6

58,5

16,9

10,3

0,7 API 20 E

A.hydrophila group 1

A.hydrophila group 2

Ochrobactrum anthropi

Ps.fluorescens/putida

Pseudomonas aeruginosa

74

Tablica 16. Postotak izolata briseva s organa riba u ljeto (API 20E i MALDI-TOF MS)

Š-škrge, S-slezena, J-jetra, B-bubreg

MALDI-TOF MS OĎenica (1) Ţupanijski k. (8) Ţupanijski k. (9)

Š S J Š S J B Š S J B

Acitenobacter johnsonii 2,82 5,65 2,26 6,46

Aeromonas ichthiosmia 5,65

Aeromonas veronii 2,82 5,65 11,3 7,53 3,23 5,65 6,78 11,3

Enterobacter amnigenus 1,61

Enterobacter cloacae 3,76 4,52

Klebsiella oxitoca 5,65 2,26

Pseudomonas fulva 2,82

Shewanella putrefaciens

veronii 2,26

API 20E OĎenica (1) Ţupanijski k. (8) Ţupanijski k. (9)

Š S J Š S J B Š S J B

A.hydrophila group 1 3,13 1,88 1,34 4,70

A.hydrophila group 2 2,35 4,70 1,57 6,27 6,27 2,69 4,70 3,76 9,40

Enterobacter cloacae 1,57 1,88

Enterobacter sakazakii 3,13 1,88

Flavimonas oryzihabitans 1,88 2,68

Klebsiela oxytoca 4,70 1,88

Ochrobactrum anthropi 2,35

Pantoea ssp 1 9,40 3,13 1,34

Photobactrum damsela 2,35

Ps.fluorescens/putida 2,35

Serratia odorifera 1 1,57

Vibrio colerae 1,34 3,76

Slika 31. Postotak izolata s organa riba (MALDI-TOF MS/API 20 E)

17,19

5,65

54,26

1,61

8,28

7,91

2,82

2,26

MALDI-TOF MS Acitenobacter johnsonii

Aeromonas ichthiosmia

Aeromonas veronii

Enterobacter amnigenus

Enterobacter cloacae

Klebsiella oxitoca

Pseudomonas fulva

Shewanella putrefaciens

veronii

11,05

41,71

3,45 5,01

4,56

6,58

2,35

13,87

2,35

2,35 1,57

5,1

API 20E A.hydrophila group 1

A.hydrophila group 2

Enterobacter cloacae

Enterobacter

sakazakiiFlavimonas

oryzihabitansKlebsiela oxytoca

Ochrobactrum

anthropiPantoea ssp 1

Photobactrum

damselaPs.fluorescens/putida

Serratia odorifera 1

Vibrio colerae

75

Tablica 17. Postotak izolata briseva s organa riba u jesen (API 20E i MALDI-TOF MS)

Š-škrge, S-slezena, J-jetra, B-bubreg

MALDI-TOF MS OĎenica (1) Ţupanijski k. (8) Ţupanijski k. (9)

Š S J Š S J B Š S J B

Acitenobacter johnsonii 3,33 5,00 2,50 6,67

Aeromonas ichthiosmia 5,00

Aeromonas veronii 3,33 5,00 1,67 10 10 1,67 5,00 7,50 10,0

Enterobacter amnigenus 1,67

Enterobacter cloacae 3,33 2,50

Klebsiella oxitoca 5,00

Klebsiella oxitoca 5,00

Pseudomonas fulva 3,33

Shewanella putrefaciens veronii

2,50

API 20E OĎenica (1) Ţupanijski k. (8) Ţupanijski k. (9)

Š S J Š S J B Š S J B

A.hydrophila group 1 3,04 3,03 1,82 4,55

A.hydrophila group 2 2,27 4,55 1,52 6,06 6,06 3,03 4,55 4,55 9,09

Enterobacter cloacae 1,52 1,82

Enterobacter sakazakii 3,04 1,82

Flavimonas oryzihabitans 1,82 1,52

Klebsiela oxytoca 4,55 1,82

Ochrobactrum anthropi 2,77

Pantoea ssp 1 9,09 3,03

Photobactrum damsela 2,77

Ps.fluorescens/putida 2,77

Serratia odorifera 1 1,52

Vibrio colerae 1,52 4,55

Slika 32. Postotak izolata briseva s organa riba u jesen (API 20E i MALDI-TOF MS)

17,5

5

54,17

1,67

5,83 5

5

3,33 2,5

MALDI-TOF MS Acitenobacter

johnsonii

Aeromonas

ichthiosmia

Aeromonas veronii

Enterobacter

amnigenus

Enterobacter cloacae

Klebsiella oxitoca

Klebsiella oxitoca

Pseudomonas fulva

Shewanella

putrefaciens veronii

12,44

41,68

3,34 4,86

3,34

6,37

2,77

12,12

2,77

2,77 1,52

6,07

A.hydrophila gr.1

A.hydrophila gr.2

Enterobacter

cloacaeEnterobacter

sakazakiiFlavimonas

oryzihabitansKlebsiela oxytoca

Ochrobactrum

anthropiPantoea ssp 1

Photobactrum

damselaPs.fluorescens/putid

aSerratia odorifera 1

76

4.5. Osjetljivost izdvojenih sojeva prema antimikrobnim lijekovima

Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima bakterija izoliranih iz vode i mulja na

lokacijama uzorkovanja prema Slici 2. za sva tri ispitivana perioda (proljeće, ljeto, jesen)

prikazana je na Slici 33. Izvršeno je ispitivanje osjetljivosti na oksitetraciklin (OTC30),

amoksicilin (AMC30), oksolinsku kiselinu (OA2), eritromicin (E15), sulfametoksazol (SX50),

florfenikol (FFC30), norfloksacin (NOR10) i flumekvin (UB30). Osim prema amoksicilinu,

većina je sojeva, čak i iz referentnog potoka OĎenica (1), pokazala neosjetljivost prema

sulfametoksazolu i eritromicinu, što ukazuje na onečišćenje potoka OĎenica antimikrobnim

lijekovima. Neosjetljivost na pretraţivane antimikrobne lijekove bila je najizraţenija u

izolatima iz aktivnog mulja.

Proljeće Ljeto Jesen

Slika 33. Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima u vodi i mulju

Oznake: neosjetljivost R (=1); umjerena osjetljivost I (=2); najveća osjetljivost S (=3)

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1.

0

2

OTC

SM

X

AM

C

FFC

E

OA

NO

R

UB

1.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

2.

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

2.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

2.

0

2

4OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

3.

0123OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

3.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

3.

77

Slika 33. nastavak

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

4.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

4.

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

4.

0123OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

5.

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

5.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

5.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

6.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

6.

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

6.

0

2

4OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

7.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

7.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

7.

-1

1

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

8.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

8.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

8.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9.

0

2

4OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

9.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9.

78

Slika 33. Nastavak

0

1

2

3OTC

SM

X

AM

C

FFC

E

OA

NO

R

UB

10.

0123OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

10.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

10.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

11.

0

2

4OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

11.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

11.

79

Najveću osjetljivost, bakterijski izolati iz tkiva riba lovljenih u potoku OĎenica, pokazali su

prema flumekvinu, oksolinskoj kiselini i norfoksacinu, u području od najveće do umjerene

osjetljivosti bili su oksitetraciklin, florfenikol i eritromicin, a u području izmeĎu umjerene

osjetljivost i neosjetljivosti bili su sulfametaksazol i amoksicilin (Slika 34).

Proljeće Ljeto Jesen

Slika 34. Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima bakterija poraslih iz briseva organa

riba u potoku OĎenica (Slika 2., lokacija uzorkovanja 1) prema sezonama i vrsti tkiva.

Oznake: neosjetljivost R (=1); umjerena osjetljivost I (=2); najveća osjetljivost S (=3); Š-

škrge, B-bubreg, J-jetra, SL-slezena

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/Š

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/Š

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/Š

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/B

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/B

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/J

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/J

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/J

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

1/SL

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

1/SL

80

Najveću osjetljivost, bakterijski izolati iz tkiva riba lovljenih neposredno nakon izlijevanja

kanala Manteč u Ţupanijski kanal, u sve tri sezone, pokazali su na norfoksacin, zatim

oksolinsku kiselinu i flumekvin, u području izmeĎu najveće i umjerene osjetljivosti bili su

oksitetraciklin i florfenikol, umjerena osjetljivost pokazala se prema eritromicinu, a u

području izmeĎu umjerene osjetljivosti i neosjetljivosti bili su amoksicilin i sulfametaksazol

(Slika 35).

Proljeće Ljeto Jesen

Slika 35. Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima sojeva bakterija poraslih iz briseva

organa riba na lokaciji uzorkovanja 8 (Ţupanijski kanal) prema slici 2.. Oznake: neosjetljivost

R (=1); umjerena osjetljivost I (=2); najveća osjetljivost S (=3); Š-škrge, B-bubreg, J-jetra,

SL-slezena

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

8/Š

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

8/Š

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

8/Š

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

8/B

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

8/B

0

1

2

3OTC

SMX

AM

C

FFC

E

OA

NOR

UB

8/J

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

8/J

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

8/SL

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

8/SL

81

Najveću osjetljivost, bakterijski izolati iz tkiva riba lovljenih u Ţupanijskom kanalu nizvodno,

pokazali su prema flumekvinu, oksitetraciklinu, oksolinskoj kiselini i florfenikolu, u

području izmeĎu najveće i umjerene osjetljivosti bili su prema eritromicinu i

sulfametaksazolu, a u području od umjerene osjetljivosti i neosjetljivosti bili su prema

amoksicilinu (Slika 36).

Proljeće Ljeto Jesen

Slika 36. Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima sojeva bakterija poraslih iz briseva

organa riba na lokaciji uzorkovanja 9. (Ţupanijski kanal nizvodno) prema Slici 2.. Oznake:

neosjetljivost R (=1); umjerena osjetljivost I (=2); najveća osjetljivost S (=3); Š-škrge, B-

bubreg, J-jetra, SL-slezena

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/Š.

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/Š

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/Š

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/B

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/B

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/B

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/SL

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/J

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/J

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/SL

0

1

2

3OTC

SMX

AMC

FFC

E

OA

NOR

UB

9/SL

82

Bakterije izolirane iz organa svih ulovljenih riba na sve tri lokacije bile su neosjetljive do

umjereno osjetljive na antimikrobne lijekove amoksicilin i sulfametaksazol. Umjereno

osjetljive do najviše osjetljive bile su na slijedeće antimikrobne lijekove: eritormicin,

florfenikol, oksitetraciklin, oksolinska kiselina, norfloksacin i flumekvin. Od svih bakterija iz

roda Aeromonas, čak je 50 % bilo rezistentno prema sulfametoksazolu, koji se pokazao kao

antimikrobni lijek koji je polučio najveću neosjetljivost u svim izolatima iz riba (osim

amoksicilina, za koji je neosjetljivost očekivana).

83

5. RASPRAVA

Ovo multidisciplinirano istraţivanje obuhvatilo je fizikalno-kemijsku, mikrobiološku i

ekotoksikološku karakterizaciju vode, mulja i sedimenta pod utjecajem UBP-a, kao i analize

vezane za indikatorske organizme, posebno ribe i gujavice, pokazujući specifične i

nespecifične promjene koje efluent izaziva u biološkim sustavima u ispitivanim medijima.

Ovakav multidisciplinarni pristup izabran je zbog mogućih pogrešnih intepretacija

pojedinačnih analiza i stoga podrazumijeva širi ekološki pristup te u konačnici daje

pretpostavke o mogućim posljedicama na ljudsko zdravlje.

Iako većina ekoloških studija uzima u obzir samo ograničenu količinu bioloških odgovora,

parametri koji pojedinačno ne pokazuju jednoznačan odgovor na onečišćujuće tvari, u

kombinaciji sa ostalim parametrima mogu biti korisni indikatori odgoĎenog utjecaja na okoliš

(Bernet i sur. 2000). Taj se utjecaj moţe pokazati ili kao izravan štetni učinak na stanice i/ili

tkiva, modifikacija fizioloških ili biokemijskih reakcija, povećanje infekcija uzrokovanih

fakultativnim patogenima ili kao smanjena otpornost organizma na infekcije (Schmidt-

Posthaus i sur. 2001). Stoga njihova determinacija na razini cijelog organizma moţe otkriti

subletalne i kronične učinke.

Rezultati ovog istraţivanja potvrĎuju hipotezu da učinci antibiotika, patogenih bakterija i

promjene bioloških odgovora vezanih za učinkovitost rada ureĎaja za pročišćavanje otpadnih

voda seţu daleko nizvodno od UBP-a.

Količina otpadne vode u procesu prerade šećerne repe moţe biti značajna, sa velikim

potencijalom zagaĎenja, posebno u odnosu na količinu zemlje i otpadaka koji dolaze sa

mehanizacijom dok se repa vadi za vrijeme kiše, a koja dospjeva u tvornicu sa korijenom, kao

i veliku količinu mulja koja ulazi u sustav putem pranja repe (Cheesman 2004). Posljedično, u

efluentu se značajno povećava suspendirana tvar, KPKCr , BPK-5 i amonijak. Prerada sirovog

šećera iz šećerne trske (proljeće) nije imala isti utjecaj na efluent kao prerada šećerne repe,

najviše zbog manje količine vode tijekom prerade, jer se ne koristi kao u preradi šećerne repe

za predpranje. MeĎutim, u procesu prerade šećerne trske ekstremne vrijednosti nitrata, dušika,

fosfata i fosfora dospijevaju efluentom u vodotoke (El-Shafai i sur. 2004). Tako povišeni

dušik i fosfor mogu rezultirati obraštajem algama, smanjenjem otopljenog kisika u vodi, što

djeluje štetno ili dovodi do uginuća riba i drugih vodenih organizama. Ingaramo i suradnici

(2009) predlaţu tri indeksa za učinak na okoliš proizvodnje šećerne trske: indeks potrošnje

vode koji uzima u račun efikasnost korištenja vode; indeks promjena u okolišu koji evaluira

84

povećanje KPK iznad dopuštene vrijednosti po lokalnom zakonodavstvu, indeks promjena

okolišu koji izračunava specifični porast KPK u efluentu s obzirom na potrošnju svjeţe vode.

U radu pogona za proizvodnju šećera potrebno je voditi računa o navedenenim postavkama.

Otpadne vode nakon prerade šećerne repe (Slika 2., Lokacija uzorkovanja 3) nadmašuju

gradske otpadne vode koje dolaze na UBP (Slika 2., Lokacija uzorkovanja 2) po vrijednosti

mnogih parametara, kao što su suspendirana tvar, KPKCr, KPKMn ,BPK-5, nitrati, nitriti, dok

se podudaraju u koncentraciji amonijačnog i ukupnog dušika. Do manje kontaminacije od

strane šećeranskih otpadnih voda moglo bi se doći uvoĎenjem naknadnog korištenja voda u

proizvodnom procesu, recikliranjem i regeneracijom već korištene vode od pranja šećerne

repe i iz tehnološkog procesa proizvodnje šećera.

Daljnji utjecaj na okoliš moţe se procijeniti mjerenjem indeksa utjecaja na okoliš kojim se

odreĎuju vrijednosti KPK u efluentu iznad dopuštenih vrijednosti (Ingaramo i sur. 2009). U

ovom radu KPK opada ispod dopuštenih vrjednosti u efluentu (Slika 2., lokacija uzorkovanja

4) i nizvodno (Slika 2., lokacije uzorkovanja 5-9).

UsporeĎujući koncentracije nitrita, ukupnog dušika i ukupnog fosfora u nezagaĎenim vodama

(Slika 2., lokacija uzorkovanja 1), ulaz netretirane gradske otpadne vode na ureĎaj za

pročišćavanje (Slika 2., lokacija uzorkovanja 2) i ulaz otpadne vode iz šećerane na ureĎaj za

pročišćavanje (Slika 2., lokacija uzorkovanja 3) sa literaturnim podacima (El-Shafai i sur.

2004), naše vrijednosti bile su značajno veće, uglavnom zbog visokih vrijednosti ukupnog

dušika na svim mjestima. Iako se u naš referentni vodotok, (Slika 2., lokacija uzorkovanja 1)

ne ulijevaju pročišćene otpadne vode, rezultati istraţivanja ukazuju na onečišćenje usljed

drugih antropoloških djelovanja (poljoprivredna proizvodnja, otpad animalnog podrijetla, i

slično).

Veliki broj ispitivanja obavljen je na ribi babuška koja je na svim mjestima izlova ulovljena u

najvećem broju u odnosu na druge vrste. Babuška naseljava nizinske rijeke, često u zajednici

sa podvodnom vegetacijom, prisutna je u poplavnim područjima, vrlo je tolerantna na niske

koncentracije kisika i visoke koncentracije različitih zagaĎivala (USFWS 2012). Riba

ulovljena na mjestima uzorkovanja nije značajno varirala s obzirom na biometrijske

vrijednosti i nalaze zdravstvenog pregleda, iako su babuške iz udaljenijih lokacija od ureĎaja

bile više infestirane nametnicima nego ribe izlovljene u kanalu u koji se ulijeva efluent, što se

moţe pripisati njihovoj mogućnosti migracije preko vodotoka pri traţenju boljih lokacija sa

hranom.

Od svih pronaĎenih nametnika na ribama u ovom radu prevalentni su jednorodni metilji

(Monogenea), škrţni paraziti koji svojom pojavnošću nisu preferirali samo specifične dijelove

85

istraţivanih vodotoka. Do istih rezultata došli su Billard i Khan (2003), koji su ustanovili da

su škrţni paraziti prisutni na ribama bez obzira na to jesu li one izloţene utjecaju komunalnih

ili industrijskih otpadnih voda. Osim toga, Kelly i Janz (2008) su ustanovili da je stupanj

infestacije, mjeren kao abundancija i biomasa intestinalnih nametnika i brojnost jednorodnih

metilja na škrgama štuka (Esox lucius), bio najveći u kontrolnoj skupini štuka, srednji u slabo

izloţenim štukama, dok ribe drţane pri visokoj izloţenosti nisu nosile nikakve parazite, što

korespondira s našim nalazima na ribama iz kanala koji prima efluent. Temperatura vode nije

bila značajno povezana sa brojnošću ovih ektoparazita, iako su male do srednje infestacije

zabiljeţene u proljeće i ljeto. MeĎutim, postojala je i negativna korelacija izmeĎu prevalencije

jednorodnih metilja i koncentracije olova u vodi, posebno u u proljeće (u efluentu otpadnih

voda) i u ljeto (nezagaĎena voda), kao što su ranije utvrdili Bayoumy i sur. (2008). Isti autori

su takoĎer zapazili i značajnu pozitivnu korelaciju infestacije jednorodnim metiljima i

koncentracija nikla u vodi, čemu idu u prilog i ova istraţivanja. Onečišćujuće tvari kao što su

teški metali mogu smanjiti imunološke sposobnosti riba koje obitavaju u tim vodama, čineći

ih tako osjetljivijima na nametnike (Overstreet, 1993), pa infestacija babuške jednorodnim

metiljima stoga sluţi kao pomoćni bioindikatorski model.

Strukturne i funkcionalne promjene naĎene u tkivu škrga babuški, posebno u kanalu u koji se

ulijeva pročišćena otpadna voda (Slika 2., lokacija uzorkovanja 5), odnose se u velikoj mjeri

na sekundarne lamele (škrţne listiće), što ukazuje na onečišćenje okoliša, kao što je i

pretpostavljeno u hipotezi ovog rada. Kompaktnost sekundarnih lamela i formiranje

interlamelarnih mostova smanjuje ukupnu respiratornu površinu škrga, što rezultira

smanjenjem kapaciteta difuzije, a time i izmjene plinova dišnog područja. Munshi i Singh

(1971) drţe da se nakon duţe izloţenosti onečišćivačima u riba stvara adaptivni fiziološki

odgovor koji priječi prolazak iritansa u krvotok, a utvrdili su da pod utjecajem ksenobiotika

dolazi do odvajanja epitelnih stanica, nakon čega slijedi reasocijacija i reagregacija u vidu

interlamelarnih mostova, kao i u ovom istraţivanju. Flores-Lopes i Thomaz (2011) takoĎer su

uočili nekoliko vrsta promjena tkiva škrga uzrokovanih različitim razinama degradacije

okoliša, kao što su odizanje epitela, nekroza, fuzija, hipertrofija, hiperplazija i proliferacija

škrţnih lamela. Ribe u ovom istraţivanju, izlovljene iz kanala koji prima efluent (Slika 2,

lokacija uzorkovanja 5), bile su izloţene visokim koncentracijama kroma, nikla i cinka

(Tablica 5). U ranijim radovima utvrĎeno je smanjenje dišnog području šarana koji su bili

izloţeni teškim metalima (Mustafa i sur. 2012; Schjolden i sur. 2007; Srivastava i Punia 2011;

Ţikić i sur. 1997). Histopatološke promjene na tkivu škrga mogu biti u vezi sa ksenobioticima

86

u efluentu, povećanom koncentracijom teških metala, mikrorganizmima na škrgama i

narušenom kvalitetom vode te mogu posluţiti kao vaţno ishodište u razlikovanju različitih

mjesta zagaĎenja (Omar i sur. 2013). Poznato je da se topljivi i suspendirani teški metali,

naročito bakar, lako apsorbiraju putem škrga riba i mogu uzrokovati štetne promjene strukture

tkiva (Mustafa i sur. 2012). U riba iz efluenta u ljeto i jesen oštećenja strukture škrga

uključuju skraćenja sekundarnih lamela, atrofiju i upalne procese sa nekrozom. Slični rezultati

dobiveni su u studijama praćenja stanja okoliša i potvrĎena su laboratorijskim ispitivanjima

(Georgieva i sur. 2010; Barišić i sur. 2015). Škrge riba iz efluenta bile su izloţene

progresivnijim promjenama koje uključuju epitelnu hiperplaziju s lamelarnom fuzijom,

hipertrofiju epitela i proliferaciju mukoznih stanica. Takve promjene na škrgama zabiljeţili su

i drugi autori (Marioara i sur. 2009; Parvathi i Sarsu 2011; Nikalje i sur. 2012) koji ih opisuju

kao tipične lezije na škrgama nakon produljene izloţenosti različitim teškim metalima.

Oštećenja tkiva jetre variraju u odnosu na godišnja doba, lokacije i vrstu zagaĎivala i

pokazuju bioakumulacijski karakter (Kessabi i sur. 2014), što dovodi do postupnog

propadanja stanica. Dilatacija sinusoida, pronaĎena u jetri riba na lokaciji s najvećim

utjecajem efluenta u jesen, vjerojatno je posljedica dugotrajnog zagušenja krvi i začepljenja

sinusoida koje su se proširile kako bi omogućile lakši protok metabolita i antioksidanata

(Nikalje i sur. 2012). Uočeni upalni klasteri izmeĎu jetrenih lobula mogu ukazivati na reakciju

na bakterijske podraţaje, kao što je Aeromonas spp. izoliran iz vode i tkiva jetre (Topić

Popović i sur. 2015). Uslijed toksičnog utjecaja teških metala dolazi do teškog oštećenja tkiva

bubrega i disfunkcije bubrega u raznih vrsta riba (Omar i sur. 2013). U ovom radu uočeno je

da do najvećih promjena dolazi na ribama iz efluenta ljeti, kad je u bubreţnom tkivu

ustanovljen povećan broj bazofilnih bakterija, dok je u jesen prevladavala nefroza. Prema

Cormieru i sur. (1995) razvoj nefroze i bazofilnog klastera moţe posluţiti kao opći

pokazatelj ekološkog stanja nefrotoksičnosti. TakoĎer, vakuolarna degeneracija slezene

utvrĎena je kod riba pod najvećim utjecajem efluenta i pokazatelj je onečišćenja teškim

metalima (Georgieva i sur. 2010).

Hematologija riba moţe biti vrijedan alat za klinička ispitivanja. Pod uvjetom da se

primjenjuju standardizirane tehnike, moguće je usporeĎivati parametre iz krvi riba izmeĎu

nezagaĎenih kontrolnih voda i populacija izloţenih onečišćivačima, s tim da je za odreĎene

vrste poznat i dostupan skup referentnih vrijednosti (Clauss i sur. 2008).

Osnovne vrijednosti hematokrita šarana (Cyprinus carpio) su od 28-32%, a pod uvjetima

stresa i povišenih temperatura vode vrijednost hematokrita se povećava (Hrubec i Smith 2000;

87

Stoskopf 1993). Iako u ovom istraţivanju nisu naĎene značajne razlike izmeĎu grupa babuški,

najviše ukupne vrijednosti zabiljeţene su u proljeće u Ţupanijskom kanalu nizvodno. Ribe iz

efluenta imale su najviše vrijednosti Hct-a u proljeće, ali ove vode su takoĎer imale najviše

vrijednosti koncentracije bakra (270 µg/L), slično nalazima Mustafa i sur. (2012), gdje su Hct

vrijednosti u šarana bile značajno povećane uslijed nedostatka kisika i uz visoke vrijednosti

Cu kojima su bili izloţeni. Visoke vrijednosti suspendirane tvari, KPKMn, BPK-5 i dušika u

kanalu u koji se ulijeva efluent u proljeće (kada je tvornica šećera preraĎivala sirovi šećer iz

šećerne trske), uz niske vrijednosti otopljenog kisika, zasigurno doprinose oslabljenoj

osmoregulaciji i oštećenju stanica škrga. Onečišćena voda tako uzrokuje dodatni stres sa

mogućom adrenergičnom stimulacijom krvotvornih organa uzrokujući oslobaĎanje

pohranjenih eritrocita u krvotok (Mustafa i sur., 2012). Iako imaju visoku toleranciju na teške

metale i otpornost na gubitak iona (Schjolden i sur. 2007), povišene koncentracije teških

metala moguće su pridonijele povećanju metabolita u plazmi babuški u našem istraţivanju

(TRIG ,CHOL, ALB, URE, TP u ribama iz efluenta u proljeće).

CHOL u plazmi značajno je varirao u jesen (ribe iz kanala u koji se ulijeva efluent u odnosu

na ribe iz Ţupanijskog kanala), kada su pojedinačne koncentracije bile najniţe i najviše kroz

sva sezonska doba i lokacije. Iako sezonska variranja vrijednosti CHOL u šarana ranije nisu

ustanovljena (Svetina i sur. 2002), koncentracija CHOL u krvi riba umjereno osjetljivih na

prisutnost zagaĎivala najvjerojatnije ovise o koncentraciji onečišćujućih tvari. Gluth i Hanke

(1985) izloţili su šarane subletalnim koncentracijama različitim organskim pesticidima i

zapazili smanjenje kolesterola u svim slučajevima. Do sličnog smanjenje CHOL dolazi i

nakon dugotrajnog izlaganja šarana ţivi (Heath 1995). Trigliceridi u plazmi takoĎer pokazuju

značajne razlike u riba iz kanala u koji se ulijeva efluent u proljeće u odnosu na ulovljenu ribu

u jesen, gdje su jesenske vrijednosti bile najniţe na svim mjestima uzorkovanja i u svim

sezonskim dobima. Takav drastičan pad moţe biti povezan i sa nedostatkom hrane u kanalu u

koji se ulijeva efluent, tim više što su GLU i CHOL takoĎer imali svoje minimalne vrijednosti

u tom kanalu u jesen. Ovi parametri predstavljaju glavne energetske metabolite koji se često

koriste u procjeni zdravlja riba i procjeni stresora u prirodi (Čoţ-Rakovac i sur. 2005).

TakoĎer, takve su rezerve energije ribama potrebne da ublaţavaju učinke stresa i sluţe kao

energetski puferi (Topić Popović i sur. 2012). Stoga, s obzirom na pad tih vrijednosti, vrlo je

vjerojatna imunosupresija i slabljenje imunološkog sustava šarana u kanalu u koji se ulijeva

efluent u jesen (Javed i Usmani 2015). MeĎutim, budući da ALT i ALP aktivnosti nisu bile

povišene u kanalu u koji se ulijeva efluent, štetni učinci, zbog polupropusnosti membrane koje

sprječavaju gubitak enzima iz oštećenog tkiva (jetre), mogu biti prolaznog karaktera (Topić

88

Popović i sur. 2006.). Visoku toleranciju šaranskih vrsta na teške metale moguće je objasniti

njihovom sposobnošću da izbjegnu hipoksiju i gubitak iona iz plazme (Schjolden i sur.

2007). Utjecaj teških metala doprinosi strukturnom i funkcionalnom oštećenju tkiva škrga,

kao i povećanju vrijednosti nekih metabolita plazme. Značajan porast vrijednosti URE, TP,

ALB i TRIG zapaţen je u riba iz kanala koji prihvaća efluent (Slika 2., lokacija uzorkovanja

5).

Povećanje koncentracije URE vjerojatno je posljedica inhibicije izlučivanja dušikovih

otpadnih produkata i nakupljanja URE u krvi (Bernet i sur. 2000), kao i histopatoloških lezija

na škrgama. Premda se povezuje s onečišćenjem, povišen TP u vezi je i s nutritivnim statusom

riba, kao što i povećanje vrijednosti organske tvari u pročišćenim otpadnim vodama moţe

dovesti do povećanje biomase beskraljeţnjaka (Bernet i sur. 2000), zbog čega dolazi do

povećanja TP i ALB. Uočena je jasna razlika izmeĎu riba koje su bile pod utjecajem efluenta i

riba koje nisu povezane s otpadnim vodama, a stres je na jetru imao štetne učinke. Slični

rezultati vezani za oštećenja tkiva uzrokovana stresom potvrĎeni su u radu Li i sur. (2011).

Oštećenja bubrega pod utjecajem stresa doseţu do riba lovljenih nizvodno od UBP-a na

posljednjoj mjernoj postaji (Slika 2., lokacija uzorkovanja 9), što pokazuju i vrijednosti CRE i

URE.

Potencijalno toksični spojevi u okolišnim uzorcima mogu inducirati oksidacijski stres kod

mikroorganizama, biljaka te mnogih kraljeţnjaka i beskraljeţnjaka. Oksidacijski stres nastaje

uslijed pomaka ravnoteţe u oksidacijsko-redukcijskim procesima, što rezultira stvaranjem

slobodnih radikala. Slobodni radikali najčešće obuhvaćaju reaktivne vrste kisika (ROS) i

molekulu . Nagli porast koncentracije slobodnih radikala moţe rezultirati oštećenjem

svih vrsta bioloških molekula (proteina, membranskih lipida, ugljikohidrata, nukleinskih

kiselina), što se u konačnici očituje u promjenama strukture i funkcije stanice, tkiva, organa

(Sohal i sur. 2002; Del Rio i sur. 2005). Budući da je SOD jedan od glavnih antioksidacijskih

enzima koji sluţe za detoksikaciju ROS-a, smanjenje njegove aktivnosti mijenja redoks status

stanica što se moţe pripisati inhibiciji radikala superoksida (Ural, 2013) implicirajući

smanjenu sposobnost da zaštiti stanice. Komunalne otpadne vode pokazuju smanjenjenu

SOD aktivnost, odraţavajući oštećenost SOD proteina zbog hiperprodukcije ROS-a (Karadag

i sur. 2014). U proljeće je zabiljeţeno značajno smanjenje SOD-a u riba koje su ulovljene u

kanalu prijemniku efluenta. U ovom radu SOD aktivnost je bila sezonskog karaktera, a SOD

vrijednosti varirale su najviše u Ţupanijskom kanalu s tendencijom povećanja u proljeće i u

ljeto, u ljeto su imale tendenciju pada, dok su se u jesen povećavale. Najveće ukupne

vrijednosti SOD-a izmjerene su u proljeće i ljeto u riba iz Ţupanijskog kanala nizvodno. U

89

pokusima s vodnim organizmima obično dolazi do povećanja enzimske aktivnosti

antioksidanasa, a visoka vrijednost SOD-a ukazuje na sposobnost riba za zaštitu od toksičnog

učinka radikala superoksidnog aniona (Huang i sur. 2007). Dokazano je to nakon izlaganja

zebrice (Danio rerio) fenolima, gdje je trend SOD aktivnosti u početku biopovišen, a s

vremenom je došlo do aklimatizacije (Zhang i sur. 2014.).

Hematološki i biokemijski parametri u riba mogu se značajno promijeniti pod utjecajem

različitih stresora. Premda promjene prikazane u ovom radu ukazuju da je kvaliteta vode

jedan od najvaţnijih čimbenika koji utječu na ukupnu fiziologiju istraţivanih riba, njihova

oštećenja su nespecifična za širok raspon tvari, što nameće potrebu evaluacije i s drugim

indikatorima i biomarkerima. U tom smislu se za procjenu onečišćenja voda često koristi MN

i ENA (Klobučar i dr, 2003;. Talapatra i Banerjee, 2007; Pavlica i sur, 2008;. Güner i

Muranh, 2011; Omar i sur., 2012; Carrola i sur., 2014). Tvorba mikronukleusa posljedica je

kromosomskih oštećenja ili disfunkcije diobenog aparata, a moţe nastati od acentričnih

dijelova kromosoma ili cijelih kromosoma koji su isključeni iz glavne jezgre tijekom stanične

diobe (Udroiu, 2006). Iako mehanizam formiranja nije u potpunosti objašnjen, ENA se

smatra genotoksičnim analogom mikronukleusa. U ovom istraţivanju prisutnost MN-a

zabiljeţena je svega kod nekoliko riba na sva tri mjesta uzorkovanja s vrlo niskim

frekvencijama. Razina ENA bila je veća (iako ne značajno) kod riba ulovljenih u kanalu koji

prihvaća vodu s prijemnika pročišćenih otpadnih voda što korespondira sa višim

koncentracijama teških metala. Diskrepanciju izmeĎu MN i ENA opisali su i drugi autori

(Günner i Muranh 2011; Monteiro i sur. 2011), koji su utvrdili značajnu indukciju nuklearnih

abnormalnosti, ali ne i mikronukleusa kod riba koje su bile izloţene bakru, kadmiju i olovu.

Gujavice E. fetida učinkovita su vrsta za program biomonitoringa koji ima za cilj prevenciju

degradacije ekosustava uslijed antropogenih aktivnosti (Tondoh i sur. 2007). One mogu

preţivjeti u vrlo zagaĎenom okolišu zbog sposobnosti staničnog izbacivanja ksenobiotika

posredstvom transportnih proteina i detoksikacijskim enzimima. Iako se uglavnom koriste

kao indikatori otpadnih voda koje su kontaminirane organskim antropogenim onečišćenjem

u tlu (Kinney i sur. 2010), utvrĎeno je da akumuliraju toksikante na razinama iznad onih

objavljenih za otpadne vode (Markman i sur. 2007). Mehanizam obrambene funkcije MXR i

akumulacija fluorescentnih supstrata u tkivu gujavica moţe biti smanjen specifičnim

inhibitorima (Bošnjak i sur. 2014). Zaštitna funkcija mehanizma MXR moţe biti inhibirana

sa više onečišćivača prisutnih u okolišu (Kurelec 1997; Markman i sur. 2007). Prisutnost u

okolišu kemosenzitivnih tvari ili inhibitora obrambenog sustava MXR u različitim

90

organizmima (vodeni, kopneni) moţe uzrokovati povećanje intracelularne akumulacije i

toksičnih učinaka drugih ksenobiotika normalno odstranjenih pomoću MXR transportnih

proteina [P-glikoproteina (P-GPS), MRPs]. Ekotoksikološki značaj MXR inhibicije potvrĎen

je in vivo studijama koje su pokazale povećanu proizvodnju mutagenih metabolita u

školjkama i povećan broj apoptotičnih stanica u embrijima morskih jeţinaca nakon izlaganja

modelu MXR inhibitora. TakoĎer je potvrĎeno da su MXR inhibitori prisutni kod

konvencionalnih i novih umjetnih zagaĎivala, pa tako neki pesticidi i sintetički mošusni mirisi

pokazuju izrazito snaţan inhibitorni potencijal MXR-a na ekološki relevantnim

koncentracijama (Smital i sur. 2004). Biotest je pokazao prisutnost MXR inhibitora u svim

ispitivanim uzorcima, posebno u razrijeĎenim uzorcima. Time smo potvrdili koncept da se

mjerenje inhibicije MXR-a moţe koristiti kao vrijedan biomarker onečišćenja okoliša (Epel i

sur. 2008, Hackenberger i sur. 2012).

U vodama nizvodno od UBP-a lokalno stanovništvo lovi ribu za rekreaciju i prehranu.

Njihovom konzumacijom otvara se mogućnost štetnog utjecaja na zdravlje ljudi, premda

korištenje pročišćene otpadne vode nije nepoznato u uzgoju riba (El-Shafai i sur. 2004;

Harnisz i Tucholski 2010). Mikrobiološka kvaliteta voda u kojima ribe obitavaju odraţava se

na mikrobiološku floru riba. Ako ukupan broj heterotrofnih aeroba prelazi 5x104/mL vode, to

predstavlja rizik ulaska humanih patogena u jestiva tkiva riba (Mara i Cairncross 1989).

Ukupan broj bakterija i intestinalnih enterokoka utvrĎenih u ovom radu bio je značajno veći u

vodi iz kanala koji prima otpadnu vodu u usporedbi s druga dva mjesta uzorkovanja riba

(potok OĎenica i Ţupanijski kanal, Slika 2., lokacije uzorkovanja 1, 9). Da bi se riba mogla

konzumirati, broj fekalnih koliformnih bakterija u vodi ne bi smio prijeći 103/100 mL (WHO

2006). Fekalni koliformi su na sve tri lokacije izlova riba bili ispod navedne vrijednosti, a u

najvećem broju bili su pronaĎeni u potoku OĎenica (3,2 x 102/100 mL). Relativno niska

razina fekalnih koliforma moţe se akumulirati u ribljem probavnom sustavu, uzrokujći rizik

transmisije do konzumenata preko kontaminiranih tkiva u slučajevima neodgovarajućih

higijenskih postupaka u pripremi riba (El-Shafai i sur. 2004; Harnisz i Tucholski 2010).

Rezultati identifikacije izolata iz vode i riba uzorkovanih na tri lokacije po API 20E i

MALDI-TOF MS testovima umnogome korespondiraju. Većina očitanja ukazuje na

Aeromonas spp. Poznato je da izolati roda Aeromonas iz okoliša imaju širu fenotipsku

raznolikost nego izolati dobiveni iz kliničkih uzoraka (Donohue i sur. 2007). Iako API 20E

pokazuje ograničenu osjetljivost za razlikovanje vrsta, grupirajući sve Aeromonas vrste u A.

hydrophila grupa 1 ili grupa 2, i uz manu sporih fenotipskih reakcija, to je vrijedan prvi korak

za preliminarnu identifikaciju bakterija. MALDI-TOF MS spektar pokazuje mnoge

91

interspecijske sličnosti, svaku Aeromonas vrstu definira pripadajućom jedinstvenom

distribucijom mase, koja korespondira sa spektrom “otiska prstiju” ili sa njihovim m/z

potpisom. MALDI-TOF MS se pokazala kao visoko reproducibilna metoda za brzo

razlikovanje Aeromonas spp. i sličnih vrsta, kao i diferencijaciju usko povezanih vrsta roda

Aaeromonas, gdje spektri različitih izolata iste vrste dolaze grupirani zajedno. Klaster analiza

m/z potpisa grafički opisuje kako su vrste slične jedna drugoj kao otisci prstiju, ukazuje na

visok početni stupanj povezanosti, nakon čega slijede vrste sa slijedećim najvećim stupnjem

povezanosti (Donohue i sur. 2006; Eddabra i sur. 2012; Topić Popović i sur. 2015a).

U vodenom okolišu su najzastupljenije mezofilne bakterije roda Aeromonas, uključujući

kloriranu vodu za piće, fekalnu otpadnu vodu, podzemnu vodu, zagaĎene i nezagaĎene

vodotoke (Huddleston i sur. 2006). Imajući u vidu da je većina bakterijskih izolata sa tkiva

riba, kao i iz uzoraka vode i mulja u ovom radu iz roda Aeromonas, potrebno je naglasiti da

ove bakterije mogu biti uzročnici zoonoza. Tako su npr. A. salmonicida ssp. salmonicida, A.

hydrophyila, A. sobria i A. caviae riblji patogeni (Austin i Austin, 1999) koji mogu uzrokovati

bolest kod riba preko koţnih infekcija i sistemskih infekcija, dok A. hydrophyila unesen

hranom u ljudi moţe urokovati gastroenteritis, proljev i sistemske infekcije (Austin i Austin

1999; Cabello i sur. 2013; Goni-Urriza i sur. 2000; Huddleston i sur. 2006; Lehane i Rawlin

2000). Sa popularnošću rekreativnog ribolova u vodama nizvodno od UBP-a, moguće je

očekivati više infekcija vezanih za vrste iz roda Aeromonas, dok njihova dijagnostika i

liječenje mogu biti sloţeni, posebno uzimajući u obzir rezistentnost ribljih patogena na

antbiotke. Onečišćenje okoliša antimikrobnim i ostalim antibiotskim tvarima značajno

doprinosi širenju otpornosti na antibiotike (Huddleston i sur. 2006), posebno kroz širenje

rezistentnih plazmida izmeĎu nepovezanih bakterija (Kostich i Lazorchak, 2008).

Od svih bakterijskih izolata sa tkiva riba u ovom radu, najveću rezistetnciju pokazale su

bakterije roda Aeromonas na AMC i SMX. AMC je vrlo sličan ampicilinu, na koji su te

bakterije prirodno neosjetljive (Harnisz i Tucholski, 2010), stoga je ovaj rezultat donekle bio

očekivan. Jedan od mogućih razloga za visoku rezistenciju na SMX je taj što on sam nije

aktivan protiv Aeromonas spp., ali u kombinaciji sa trimetoprimom je uglavnom učinkovit

(Goni-Urriza i sur. 2000). Učestalost rezistencije Aeromonas spp. iz okoliša na SMX u

ovom radu je bila značajno veća nego u sličnim studijama (Huddleston i sur. 2006; Imzlin i

sur. 1996; Kampfer i sur. 1999), najvjerojatnije zato jer su naši izolati prethodno bili izloţeni

antibioticima i kemoterapeuticima zbog ispuštanja bolničkih otpadnih voda i njihovog

utjecaja na sastav efluenta. Moguće je da se iz istog razloga pojavljuju izolati iz roda

Aeromonas rezistentni na oksitetraciklin i eritromicin. Harnisz i sur. (2011) su utvrdili da su

92

bakterije rezistentne na tetraciklin pouzdan indikator antimikrobne rezistencije i

mikrobiološke kvalitete površinskih voda pod antropološkim utjecajem. U ovom radu

prikazana je antimikrobna osjetljivost na svim mjestima uzorkovanja za sve izolate i sva

ispitivana godišnja doba. Najveća prosječna neosjetljivost pokazala se prema AMC, zatim

prema SMX, E, FFC, OTC, OA, NOR i UB. Rezistentnost bakterija na antimkrobne tvari

moţe biti i veća, budući da analize uglavnom prikazuju rezistenciju uzgojivih bakterija koje

čine samo mali udio ukupnih bakterija prisutnih u vodenom okolišu (Cabello i sur. 2013).

TakoĎer, otpornost na antibiotike presudna je za nastajanje zaraznih bolesti, dok putevi

površinskim vodama mogu predstavljati ključnu rutu širenja gena otpornih na antibiotke

(Pruden i sur. 2012). Ovim smo potvrdili hipotezu da je u vodi, mulju i ribama pod utjecajem

komunalnih i industrijskih otpadnih voda moguća prisutnost bakterija rezistentnih na

antibiotike, a koje su patogene i za ljude. Sukladno hipotezi, prisutnost visokih koncentracija

SMX-a u vodi, takoĎer naĎenog i u sedimentu, doprinosi značajno većoj rezistenciji bakterija

roda Aeromanas u okolišu prema ovom antibiotiku. Njegova srednja vrijednost od 50,70 ng/L

korespondira sa srednjom vrijednosti od 48,40 ng/L izmjerenom u vodama zagaĎenim

urbanim i ruralnim aktivnostima u Kini (Xu i sur. 2014). Isti autor navodi srednju vrijednost

SMX-a od 16,10 ng/g za odgovarajući sediment, dok vrijednosti u sedimentu iz ovog rada

(Slika 2, lokacije uzorkovanja 4, 5, 9) opadaju sa udaljenošću od UBP-a (19,60>5,07>0,99

ng/g). U područjima onečišćenim antibioticima (Xue i sur. 2013), razina SMX-a u vodama

bila je do 191 ng/L, no ipak nije pronaĎen u sedimentu. Isti autor navodi 43,5 ng/L

eritromincina (E) u vodi, što je dvostruko više nego u otpadnoj vodi koja dolazi na UBP u

Virovitici, što dokazuje da SMX i E predstavljaju relativno visoki ekološki rizik za osjetljive

vodne organizme. Često sulfonamidi, napose SMX, pokazuju najveću učestalost i

koncentraciju u odnosu na druge antimikrobne tvari testirane u vodama (Chen i Zhou 2014).

U sedimentu dugoročno dolazi do akumulacije antimikrobnih tvari kojima su izloţeni bentički

i ostali vodni organizmi. U sedimentima se dugoročno akumuliraju lijekovi, postajući izvorom

kontaminacije za bentičke i ostale vodne organizme Gibs i sur. (2013) opisuju vjerojatni

uzrok padajućeg trenda pojavljivanja eritromicina i ostalih antibiotika u vodama zbog učinka

razrjeĎenja podzemnim vodama i sorpcije na dnu sedimenta. U sedimentu ukupna

koncentracija antibiotika istraţenih u ovom radu opada od 144,55 do 18,58 ng/g sa

udaljenošču od ureĎaja za pročišćavanje otpadnih voda, što je komparabilno s radom Chen i

Zhou (2014) (101,0 do 12,4 ng/g). Iako se pretpostavlja da su bolnice glavni izvor

farmaceutika u gradskim otpadnim vodama, farmaceutici dospijevaju u vode i iz drugih izvora

(kućanstava i dr.), npr. u Velikoj Britaniji 70 % i u SAD-u 75 %. Gotovo 70 % ukupnih

93

antibiotika se ispuštaju nepromijenjeni kao aktivni spojevi (Kümmerer 2009). Često su

njihovi metaboliti, zbog svoje biotransformacije, bolje topljivi u vodi nego njihovi lipofilni

osnovni spojevi. To moţe objasniti veće udjele sulfa lijekova i SMX u jutarnjim satima kad se

usporede sa sredinom dana i večeri. Antimikrobne supstance, ukoliko dospiju u okoliš,

nepovoljno utječu na vodne i kopnene organizme, a samim time i na ljudsku populaciju.

94

6. ZAKLJUĈAK

Rezultati ovog istraţivanja ukazuju da učinci antibiotika, patogenih bakterija i promjene

bioloških odgovora vezanih za ureĎaj seţu daleko nizvodno od UBP-a. Pročišćene otpadne

vode, u površinskim vodama kao njihovom prijemniku, mijenjaju okolišne parametre i

doprinose opterećenju ksenobioticima, što ima vaţnu ulogu u slici antimikrobne otpornosti.

Histološka analiza tkiva riba u vodama koje su pod utjecajem pročišćenih otpadnih voda,

vrijednosti hematoloških pokazatelja i biokemijskih pokazatelja plazme krvi riba, pokazuju

značajne promjene uvjetovane kompleksnošću okolišnih stresora, što doprinosi njihovom

cjelokupnom fiziološkom stanju. Promijenjeni fiziološki parametri najviše se očituju

oštećenjima škrga, stanica jetre i povećanjem SOD aktivnosti u krvi, dok istraţivanja

metabolita i enzima plazme, posebice CHOL i TRIG pokazuju jaku povezanost sa godišnjim

dobima i radom postrojenja tvornice šećera (prerada šećerne repe). Prisutnost teških metala u

okolišu doprinosi promjenama morfologije tkiva u vidu gubitka stanične i strukture tkiva, kao

i strukturne heterogenosti različitih ribljih organa. Navedene promjene su u korelaciji s

razinom oksidacijskog stresa potvrĎenim ovim istraţivanjem. Metaboličke promjene u razini

jetrenih enzima potvrĎuju uočene patohistološke lezije tkiva jetre. Zdruţeno interpretirani

rezultati patohistoloških i biokemijskih analiza mogu posluţiti kao vrijedan biomarker u

utvrĎivanju zdravstvenog statusa riba i utjecaja onečišćenja slatkovodnih ekosustava. U ovom

istraţivanju utvrĎena je visoka tolerancija babuške na vode smanjene kakvoće zbog utjecaja

pročišćenih komunalnih, bolničkih i industrijskih otpadnih voda. Dokazano je da su biološki

odgovori na onečišćenje i štetni učinci na parametre krvi i tkiva riba prisutni i u udaljenim

dijelu vodotoka nizvodno od UBP-a. PotvrĎeno je da je stanični mehanizam efluksa

posredstvom ABC transportnih proteina u gujavici izvrstan biomarker onečišćenja okoliša i

predlaţe se njeno korištenje u studijama biomonitoringa. Rezultati mikrobioloških analiza

ukazuju na dominaciju bakterija roda Aeromonas koje su pokazale visoki stupanj

neosjetljivosti na antimikrobne lijekove.

Iako je u ovom istraţivanju dokazana vrijednost multidisciplinarnog pristupa problemima

utjecaja pročišćenih otpadnih voda na biotu, potrebno je i nadalje razvijati biomarkere

osjetljivosti vrsta, identifikaciju najranjivijih razvojnih stadija i populacija, sa ciljem praćenja

zdravstvenog statusa istraţivanih organizama, patogenih i toksičnih onečišćivača u svrhu

integralnog pristupa upravljanju vodenim sustavima.

95

7. POPIS SIMBOLA I KRATICA

– amonijev molibdat tetrahidrat

- srebro(II)-sulfat

- natrij diklorizocijanurat (Izosan G)

– sulfanilna kiselina

- kalij-hidrogen-ftalat

– mravlja kiselina

– metilni alkohol

– amonijev formiat

– vodikov peroksid

- sulfatna kiselina

– nitratna kiselina

kalij bikromat

– kalij-permanganat

– kemijska potrošnja kisika po bikromatu

– kemijska potrošnja kisika po permanganatu

ALB – albumin

ALP – alkalna fosfataza

ALT – alanin amonotransferaza

AMC30 – amoksicilin

BU – Biljni ureĎaj Lukač

CHOL – kolesterol

CRE – kreatinin

E15 – eritromicin

ENA – eritrociti sa nepravilnim jezgrama (test), (engl. erythrocyte nuclear abnormalities)

FFC30 – florfenikol

GGT – gamma-glutamil transferaza

GLU – glukoza

GSH-Px – glutation peroksidaza

– kloridna kiselina

– ţiva(II)-sulfat

96

MALDI-TOF MS (engl. Matrix-assisted laser induced desorption ionization-time of flight-

mass spectrometry) - masena spektrometrija - matricom potpomognuta laserska

desorpcija/ionizacija i analizator vremena leta

MN – mikronukleus (test)

– natrijev klorid

– natrijev hidroksid

NOR10 – norfloksacin

o.v. – otpadna voda

OA2 – oksolinska kiselina

OTC30 – oksitetraciklin

SOD – superoksid dizmutaza

SX50 – sulfametaksazol

TBARS - reaktivna supstanca tiobarbiturne kiseline (engl. thiobarbituric acid reactive

substances)

TP – ukupne bjelančevine

TRIG – trigliceridi

TŠ – Tvornica šećera Viro

UB30 – flumekvin

UBP – UreĎaj za biološko pročišćavanje otpadnih voda grada Virovitice

UHPLC-QTOF-MS - kvadrupolna time of flight masena spektrofotometrija

URE – urea

97

8. LITERATURA

1. Affonso EG, Polez VLP, Correa CF, Mazon AF, Araujo MRR, Moraes G, Rantin FT

(2002) Blood parameters and metabolites in the teleost fish Colossoma macropomum

exposed to sulfide or hypoxia. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:

Toxicology & Pharmacology 133, 3, 357-382.

2. Allen DA, Austin B. i Colwell RR (1983) Numerical taxonomy of bacterial isolates

associated with a freshwater fishery. Journal of General Microbiology 129, 2049-

2062.

3. Ašperger D i sur. (2013) Analitika okoliša, HINUS & Fakultet kemijskog inţenjerstva

i tehnologije, Zagreb

4. Austin B, Austin D (1987) Bacterial fish pathogens: Disease in farmed and wild fish,

364 pp., Ellis Horwood Limited, Chichester, England

5. Austin B, Austin D, (1999). Bacterial fish pathogens: disease in farmed and wild fish.

3rd ed. Springer-Praxix series in aquaculture and fisheries 455 pp.

6. Bard, SM. (2000) Multixenobiotic resistance as a cellular defense mechanism in

aquatic organisms, Aquat Toxicol 48, In: Laird, L(ed), 357–389

7. Barišić J, Dragun Z, Ramani S, Filipović Marijić V, Krasnići N, Čoţ-Rakovac R,

Kostov V, Rebok K, Jordanova M (2015) Evaluation of histopathological alterations

in the gills of Vardar chub (Squalius vardarensis Karaman) as an indicator of river

pollution. Ecotox Environ Safe 118: 158-166.

8. Bayoumy EM, Osman HAM, Laya F, El-Bana, Hassanain MA (2008) Monogenean

parasites as bioindicators for heavy metals status in some Egyptian Red Sea fishes,

Global Veterinaria 2: 3, 117-122.

9. Bernet D, Schmidt-Posthaus D, Wahii H, Burkhardt-Holm P (2000) Effect of

wastewater on fish health: an integrated approach to biomarker responses in brown

trout (Salmo trutta L.). Aquat Ecosyst Stress Recover 8, 143-151.

10. Bernet SM, Schmidt H, Wahli T, Burkhardt-Holm P (2001). Effluent from a sewage

treatment works causes changes in serum chemistry of brownt trout (Salmo truta L.).

Ecotox Environ Safe 48: 140-147.

11. Bhatia M, Goyal D (2013) Analyzing remediation potential of wastewater through

wetland plants. Environ Prog Stress Recover 8, 143-151.

98

12. Billard SM, Khan RA (2003). Chronic stress in cunner, Tautogolabrus adspersus,

exposed to minicipal and industrial effluents. Ecotox Environ Safe 55: 1, 9-18.

13. Biswas S, Rolain JM (2013) Use of MALDI_TOF mass spectrometry for

identification of bacteria that are difficult to culture. Journal of Microbiological

Methods 92, 1, 14-24.

14. Bošnjak I, Bielen A, Babić S, Šveer L, Topić Popović N, Strunjak-Perović I, Čoţ-

Rakovac R, Sauerborn Klobučar R (2014) First evidence of the P-gycoprotein gene

expression and multixenobitic resistance modulation in earthworm. Arhives of

Industrial Hygiene and Toxicology 65, 67-75.

15. Braga PAC, Tata S, Goncalves dos Santos V, Barreiro JR, Vilczaki Schwab N, Veiga

dos Santos M, Nogueira Eberlina M, Ramires Ferreira C (2012) Bacterial

identification: from the agar plate to the mass spectrometer. RSC Advances 4, 994-

1008.

16. Cabello FC, Godfrey HP, Tomova A, Ivanova L, Dolz H, Millnao A, Buschmann AH

(2013) Antimicrobial use in aquaticulture re-examined: its relevance in antimicrobial

resistane and to animal and human health. Microbiol 15 (7), 1917-1942.

17. Cabral JPS (2010) Water microbiology. Bacterial pathogens and water. International

Journal of Environmental Research and Public Health 7, 3657-3703.

18. Carrasco KR, Tilbury KL, Myers MS (1990) Assessment of the piscine micronucleus

test as an in sistu biological indicator of chemical contminant effects. Can J Fish

Aquat Sci 47, 2123-2136.

19. Carrola J, Santos N, Rocha MJ, Fontainhas-Fernandes A, Pardal MA, Monteiro RA,

Rocha E (2014) Frequency of micronuclei and of other nuclear abnormalities in

erythrocytes of the grey mullet from the Mondego, Douro and Ave estuaries-Portugal.

Environ Sci Pollut Res Int

20. Charlton-Menys V, Liu Y, Durrington PN (2006) Semiautomated method for

determination of serum paraoxonase actxvity using paraoxon as supstrate. ClinChem

52, 453-457.

21. Cheesman OD (2004). Environmental impacts of sugar production: the cultivation and

processign of sugarcane and sugar beet. Surrey, UK: CABI Bioscientce UK Centre.

22. Chen K, Zhou JL (2014) Occurrence and bahavior of antibiotics in water and

sediments trom the Huangpu River, Shangai, Chine. Chemosphere 95, 604-612.

23. Christensen PJ (1977) The history, biology and taxonomy of the Cytophaga group.

Canadian Journal of Microbiology 23, 1589-1653.

99

24. Clauss TM, Dove AD, Arnold JE (2008) Hematologic disorders of fish. Vet Clin

North Am Exot Anim Pract

25. Cooper GM, Hausman RE (2010) Stanica: Molekularni pristup. Medicinska naklada,

Zagreb

26. Cormier SM, Neiheisel TW, Wernsing P, Racine RN, Reimschuessel R (1995) New

nephron development in fish from polluted waters: a possible biomarker.

Ecotoxicology 4, 3: 157-68.

27. Couillard CD, Counteney CC, Maodaonaid RW (2008) Chemical-environment

interactions affecting the risk of imapcts on aquatic organisms; a review with a

Canadian perspective-interacitons affecting vulnerability. Environ Rev 16, 19-44.

28. Čolak S (2011) Biokemijski profil hemolimfe triju vrsta dekapodnih rakova.

Disertacija, pp. 130, Sveučilište u Zagrebu, Agronomski fakultet, Zagreb.

29. Čoţ-Rakovac R, Strunjak-Perović I, Hacmanjek M, Topić Popović N, Lipej Z,

Šoštarić B (2005) Blood chemistry and histological properties of wild and cultured sea

bass (dicentrarchus labrax) in the North Adriatic Sea. Vet. Res Commun 29: 677-687.

30. Čoţ-Rakovac R, Šmuc T, Topić Popović N, Strunjak-Perović I, Hacmenjak M, Jadan

M. (2008). Novel methods for assessing fish blood biochemical data. Journal of

Applied Ichthyology 24, 1, 77-80.

31. da Silva Souza T, Fontanetti CS (2006) Micronucleus test and observation of nuclear

alterations in erythrocytes of Nile tapia exposed to waters affected by refinery effluent.

Mutat Res 605: 87-93.

32. Dallinger R, Prosi F, Segner H, Back H (1987) Contaminated food and uptake of

heavy metals by fish: a review and proposla for further research. Öecologia 73: 91-98.

33. Darwano H, Duy SV, Sauv S (2014) A new protocol for the analysis of farmaceutical

pesticides and hormones in sedimentand suspended particulate matter from rivers and

municipal wastewaters. Arch Environ Contam Toxicol 66(4), 582-593.

34. de Campos Ventura B, de Fransceschi de Angelis D, Marin-Morales MA (2007)

Mutagenic and genotoxic effects of the Atrazine herbicide in Oreochromis niloticus

(Perciformes, Cichllidae) detected by the micronuclei test and the comet assay. Pestic

Biochem Phys 90: 42-51.

35. Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N (2005) A review of fecent studeis on

malondialdehyde as tocic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr

Metab Cardiovasc Dis 15(4): 316-328.

100

36. Donohue MJ, Smallwoods AW, Pfaller S, Rodgers M, Shoemake JA (2006) The

development of a matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry-based

method for the protein ffingerprinting and identification of Aeromonas species using

whole cells. J Microbiol Methods 65, 380-389.

37. Eddabra R, Prevost G, Scheftel JM (2012) Rapid discrimination of environmental

Vibrio by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-fliht mass spectrometry.

Microbiol Res 167, 226-230.

38. Edwards CA i Bohlen PJ (1996) Biology and ecology of earthworms. 3rd ed.

Chapman & Hall, London, UK.

39. El-Bouri K, Johnston S, Rees E, Thomas I, Bme-Mannathoko N, Jones C, Reid M,

Ben-Ismaeil B, Davies AR, Harris LG, Mack D (2012) Comparison of bacterila

identification by MALDI-TOF mass spectrometry and coventional diagnostic

microbiology methods. British Journal of Biomedical Science. 69, 2, 47-55.

40. El-Shafai SA, Gijzen HJ, Nard FA, El-Gohary FA (2004) Microbial quality of tilapia

reared in fecal-contaminated ponds. Environ Res 95, 231-238.

41. Epel D, Luckenbach T, Stevenson CN, Macmanus-Spencer LA, Hamdoun A, Smital T

(2008) Efflux transporters: newly appreciated roles in protection against pollutants.

Environ Sci Technol 42, 3914–3920.

42. Esteban S, Gorga M, Petrović M, Gonzalez-Alonzo, Barcelo D, Vacarcel Y (2014)

Analysis and accurrence of endocrine-disrupting compaunds and estrogenic activity in

the surface waters of Central Spain. Sci Total Environ 466-467, 939-951.

43. Fenech M (2000) The in vitro micronucleus technique. Mutat Res 455:81-95.

44. Fenech M (2003) HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the

cytokinesis-bolck micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures.

Mutation Res Genetic Tox Environ Mutagen 534: 65-75.

45. Ferri J, Topić Popović N, Čoţ-Rakovac R, Beer-Ljubić B, Strunjak-Perović I, Škeljo

F, Jadan M, Petrić M, Barišić J, Šimpraga M, Stanić R (2011) The effect of artificial

feed of blood biochemistry profile and liver histology of wild saddled bream, Oblada

melanura (Sparidae). Marine Environmental Reasearch 71, 3, 218-224.

46. Flores-Lopes F, Thomaz AT (2011) Histopathologic alterations observed in fish gills

as a tool in environmental monitoring. Braz J Biol 71 (1), 179-188.

47. Frerichs GN, Roberts RJ (1989) The bacteriology of teleosts. In: Roberts, RJ (ed.),

Fish Pathology 289-319. London: Bailliere Tindall.

101

48. Garrido L, Sanchez O, Ferrera I, Tomas N, Mas J (2014) Dynamics of microbi8al

diversity profiles in waters of different qualities. Approximation to an ecological

quality indicator. Sci Tot Environ 468-469, 1154-1161.

49. Georgieva E, Arnaudov A, Velcheva I (2010) Clinical, hematological and

morphological studies on ex situ induced copper intoxication in Crucian carp

(Carassius gibelio). J Cent Eur Agr 11(2):165-172.

50. Gibs J, Heckathorn HA, Meyer MT, Klapinski FR (2013) Occurence and partioninig

of antibiotic compounds found in the water column and bottom sediments from a

stream receving two wastewater treatment plant effluents in Northern New Yersey. Sci

Total Environ 458-460, 107-116.

51. Glancer-Šoljan M, Landeka Dragičević T, Zanoški M, Šoljan V (2005) Biotehnologija

i okoliš, Interna skripta. Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet,

Zagreb.

52. Gluth G, Hanke W (1985) A comparison of physiological changes in carp, Cyprinus

carpio, induced by several pollutants at sublethal concentrations. I. The dependency on

exposure time. Ecotox Environ Safe 2, 179-188.

53. Goni-Uriza M, Pineau L, Capdepury M, Roques C, Caumette P, Quentin C (2000)

antimicrobial resistance of mesophilic Aeromonas spp. strains isolated from two

European rievers. J Antimicrob Chemother 46, 297-301.

54. Günner U, Muranh FDG (2011) Micronucleus test, nuclear abnormalities and

accumulation of Cu and Cd on Gambusia affinis (Baird & Girard, 1853). Turkish

Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 11, 615-622.

55. Hackenberger BK, Velki M, Stepić S, Hackenberger DK (2012) First evidence for the

presence of efflux pump in the earthworm Eisenia andrei. Ecotoxicology and

Environmental Safety 75, 1, 40–45.

56. Harnisz M, Tucholski S (2010) Microbial quality of common carp and pikeperch

fingerlingculturated in a pond fed with treated wastewater. Ecol Eng 36, 466-470.

57. Heath AG (1995) Water Pollution and Fish Physiology. Boca Raton, Florida: CRC

Press Inc.

58. Hrubec TC, Smith SA (2000) Hematology of fish. In Schalm's Veterinary

Hematology, 5th ed. (Feldman BF, Zinkl JQ and Jain NC, eds) pp. 1120-1125.

Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins.

102

59. Huang DJ, Zhang YM, Song G, Long J, Liu JH, Ji WH (2007) Contaminants-induced

oxidative damage on the carp Cyprinus carpio collected from the Upper Yellow River,

China Environ Monit Assess 128: 483-488.

60. Huddleston JR, Zak JC, Jeter RM (2006) Antimicrobial suspectibilities of Aeromonas

spp. isolated from environmental sources. Appl Environ Microbiol 72 (11), 7036-

7042.

61. Imziln B, Lafdal YMO, Jana M (1996) Effect of wastewater stabilization ponds on

antimicrobial susceptibility and haemolysin occurrence among mitile Aeromonas

strains. World J Microbiol Biotechnol 12, 385-390.

62. Ingaramo A, Heluane H, Colombo M, Cesca M (2009) Water and wastewater eco-

efficiency indicators for the sugar cane industry. J Clean Prod 17, 487-495.

63. ISO (International Organization for Standardization) 16240, 2005. Water quality -

Determination of the genotoxicity of water and waste water – Salmonella/microsome

test (Ames test). Geneva, Switzerland. (n.d.).

64. Javed M, Usmani N (2015) Stress response of biomolecules (carbohyddrate, protein

and lipid profiles) in fish Channa punctatus inhabiting river polluted by thermal power

plant effluent. Saudi J Biol Sci 22: 237-242.

65. Jiraungkoorskul W, Sahaphong S, Kosai P, Kim MH (2007) Micronucleus test: the

effect of ascorbic acid on cadmium exposure in fish (Puntius altus). research J Environ

Toxicol 1: 27-36.

66. Kampfer P, Christmann C, Swings J, Huys G (1999) In vitro susceptibilities of

Aeromonas genomic spacies to 69 antimicrobial agensts. Sys Appl Microbiol 22, 662-

669.

67. Karadag H, Firat O, Firat O (2014) Use of oxidative stress biomarkers in Cyprinus

carpio L. for the evaluation of water pollution in ataturk Dam Lake (Adiyaman,

Turkey). B Environ Contam Tox 92: 289-293.

68. Karlson P (1988). Biokemija, pp. 396, Školska knjiga, Zagreb

69. Kaur R, Dua A (2014) Adverse effeccts on histology of liver and kidney in fish

Chamma punctatus exposed to wastewater from Tung Dhab drain in Amritsar, India J

Evnivron Biol 35, 265-293.

70. Kelly JM, Janz DM (2008). Altered energetics and parasitism in juvenile notrhern pice

(Esox lucius) ingabiting metal-mining contaminated lake. Ecotox Environ Safe 70: 3,

357-369.

71. Kepec S (2015). Virkom d.o.o. Virovitica, Izvještaj 2013./2014.g, Laboratorij.

103

72. Kessabi K, Hwas Z, Sassi A, Said K, Messaoudi I (2014) Heavy metal accumulation

and histomorphological alterations in Aphanius fasciatus (Pisces, Cyprinodontidae)

from the Gulf of Gabes (Tunisia). Environ Sci Pollut R 21, 24: 14099-14109.

73. Kinney CA, Furlong ET, Kolpin DW, Zaugg SD, Burkhardt MR, Bossio JP, Werner

SL (2010) Eartworm: Diagnostic indicators of wastewater-derived anthropogenic

organic contaminants in terrestrial environments. In: Contaminants of Emerging

Concern in the Envvironment. Ecological and Human Health Conciderations (ed.

Halden, R). ACS Sympsium Series pp 297-317.

74. Klobučar GI, Stambuk A, Pavlica M, Sertić Perić M, Kutuzović Hackenberger B,

Hylland K (2010) Genotoxicity monitoring of feshwater environments using caged

carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology 19(1): 77-84. doi: 10.1007/s 1007/s 10646-009-

0390-6. Epub Jul 21.

75. Klobučar GIV, Pavlica M, Erben R, Papeš D (2003) Application of the micronucleus

and comet assays to mussel Dreissena polymorpha haemocytes for genotoxicity

monitoring of freshwater environments. Aquatic Toxicology 64, 15-23.

76. Koeman JH, Köhler-Günther, Kurelec A, Riviere JL, Verstee G, Walker CH (1993)

Applications and objectives of biomarker research. In. Peakall DB Shugart LR (eds)

Biomarkers. Springer. Berlin Hidelberg New-York, pp 1-13.

77. Kolkwitz R, Marsson M (1902) Grundsätze für die biologische Beurteilung des

Wassers nach seiner Flora und Fauna. Mitteilungen aus der Königlichen

Prüfungsanstadt für Wasserversorgung und Abwässerbeseitigung 1; 33-72.

78. Kolkwitz R, Marsson M (1908). Ökologie der pflantzlichen Saprobienüä.

79. Kolkwitz R, Marsson M (1909). Ȍkologie der tierichen Saprobien. International

Revue der gesamten Hydrobiologie und Hydrographie 2; 126-152.

80. Kostich MS, Lazorchak JM (2008) Risks in aquatic organisms posed by human

pharmaceutical use. Sci Total Environ 389 (2-3), 329-339.

81. Kümmerer K (2009) Antibiotics in the aquatic environment - a review part 1.

Chemosphere 75, 417-434.

82. Kurelec B (1997) A new type of hazardous chemical: The chemosensitizers of

multixenobiotic resistance. Environmental Health Perspectives 105, 4, 855-860.

83. Kurelec B (1992) The multixenobiotic resistance mechanism in aquatic organisms.

Crit Rev Toxicol 22(1):23–43.

84. Lehane L, Rawlin GT (2000) Topically acquired bacterial zoonoses form fish: a

review. Med J Aust 173(5), 256-259.

104

85. Li Z-H, Velisek J, Grabic R, Li P, Kolarova J, Randak T (2011) Usae of hematological

and plasma biochemical parameters to assess the chronic effects of a fungicide

propiconazole on a freshwater teleost. Chemosphere 83, 572-578.

86. Liebmann H (1962). Biologie des Trinkwasseer, Badewasser, Fischwasser, Vorfluters

und Abwasser U. Handbuch der Frischwasser- und Abwasserbiologie, knjiga 1.

München: Oldenbourg.

87. Litman T, Druley TE, Stein WD, Bates SE (2001) From MDR to MXR: new

understanding of multidrug resistance systems, their properties and clinical

significance. Cell Mol Life Sci 58(7), 931-59.

88. Lucas FS, Therial C, Conçalves A, Servais P, Rocher V, Mouchel JM (2014)

Vaariation of raw wastewater microbiological yuality in dry and wet weater

conditions. Environ Sci Pollut Res 21 (8), 5318-5328.

89. Mara D, Cainccross S (1989) Guidelines for the Safe use of Wastewater and Exccreta

in Agriculture and Aquaculture: Measures for Public Health Protection. p.187, World

Health Organization, Geneva, Switzerland.

90. Marioara N, Dumitrescu G, Petculescu-Ciochină L, Bănăţean-Dunea I., Moţ M,

Tăpălagă I, Lunca M, Boca L (2009) Pathological tissue lesions induced by chronic

cadmium intoxication in silver Crucian carp Carassius auratus gibelio. SPASB 42, 2:

84-90 .

91. Markman S, Guschina IA, Barnsley S, Buchanan KL, Pascoe D, Muller CT (2007)

Endocrine disrupting chemicals accumulate in earthworms exposed to sewage

effluent. Chemosphere 70, 119-125.

92. Martin-Carnahan A, Joseph SW (2005) Order XII. Aeromonadales ord. nov, 2nd

edition In: Brenner, DJ, Krieg NR, Staley JT, Garrity GM (Eds.), Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology, Vol.2. New York: Springer.

93. Martone-Rocha S, Piveli RP, Matte GR, Boria MC, Dropa M, Monita M, Peternella

FA, Matte MH (2010) Dynamics of Aeromonas species isolated from wastewater

treatment system. J Water Health 08.4, 703-711.

94. Monteiro V, Cavalcante DGSM, Vilela MBFA, Sofia SH, Martinez CBR (2011) In

vivo and in vitro eyposures for the evaluation of the genotoxic effedt sf lead on the

neotropical freshwater fish Prochilodus lineatus. Aquat Toxicol 104, 291–298.

95. Mortelmans K, Zeiger E (2000) The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay.

Mutation Research 455, 29-60.

105

96. Munshi JSD, Singh RK (1971) Investigation of the effect of insecticides and other

chemical substances on the respiratory epithelium of predatory and weed fishes .

Indian J Zool 22, 127-134.

97. Mustafa SA, Davies SJ, Jha AN (2012) Determination of hypoxia and dietary copper

mediated sub-lethal toxicity in carp. Cyprinus carpio, at different levels of biological

organization. Chemosphere 87, 413-422.

98. Naidoo S, Olaniran A (2014) Treated Wastewater Effluent as a Source of Microbial

Pollution of Surface Water Resources. Int J Environ Res Public Health 11(1), 249-270.

99. Nikalje SB, Muley DV, Angadi, SM (2012) Histopathological changes in liver of

freshwater major carp, Labeo rohita after acute and chronic exposure to textile mill

effluent. The Bioscan 7, 2: 215–220.

100. Novotny L, Dvorska L, Lorencova A, Beran V, Pavlik I (2004) Fish: a potential

source of bacterila pathogens for human beings. Veterinarni Medicina 49, 9, 343-358.

101. OECD (Organization for Economic Cooperation and Development. (1984). OECD

Guidelines for Testing of Chemicals. Section 2. Effects on Biotic Systems. Test No.

207: Earthworms, Acute Toxicity Tests (Filter Paper Test and Artificial Soil Test).

Paris: OECD.

102. Omar WA, Zaggkizk KH, Abdel-Khalek AA, Abo-Hegab S (2013) Risk Assessment

and Toxic Effects of Metal Pollution in Two Cultured and Wild Fish Species from

Highly Degraded Aquatic Habitats. Arch Environ Contam Toxicol 65(4): 753-764.

103. Omar WA, Zaghloul KH, Abdel-Khalek A, Abo-Hegab S (2012) Genotoxic effects of

metal pollution in two fish species, Oreochromis niloticus and Mugil cephalus, form

highly degraded aqutatic habitats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen 746: 7-

14.

104. Overstreet RM (1993) Parasitic deseases of fishes and their relationship with toxicants

and other environmental factors. In: Couch JA, Fournie JW (eds), Pathobiology of

Marine and Estuarine Organisms, CRC, Press, pp 111-156.

105. Pantle E, Back H (1955) Die biologische überwachung der Gewäser und die

Darstellung der Ergebnise. Gas- und Wasserschaft 96: 1-604.

106. Parvathi KS, Sarsu C (2011) Effect of chromium on histological alteration of gill, liver

and kidney of freshwater teleost, Cyprinus carpio. Int J Fish Aquac 6(1):1-5.

107. Pavlica M, Podrug M, Štambuk A, Cjetko P, Klobučar GIV (2008) Seasonal

variability in micronuclei induction in haemocytes of mussels along the eastern

Adriatic coast. Polish Journal of Environmental Studies 17, 5, 765-771.

106

108. Pavlica M (2012) Genetika. Poglavlje 14. Genske mutacije. Web udţbenik. I izdanje,

Udţbenici zagrebačkog sveučilišta, elektronička izdanja. Zagreb.

109. Pearse, AGE (1968) Histochemistry, theoretical and applied. 3rd ed.J.and Churchill

Ltd. London.

110. Pejić S (2014) Prisutnost i uklanjanje mikroorganizama u vodama različitog porijekla -

završni rad, p.21. Sveučilište Josipa Jurja Strossmyera u Osijeku, Prehrambeno-

tehnološki fakultet, Osijek.

111. Polak-Juszczak L (2012) Bioaccumulation of mercury in the trophic chain of flatfish

from the Baltic Sea. Chemosphere 89: 585-591.

112. Polard T, Jean S, Merlina G, Laplanche C, Pinelli E, Gauthier L (2011) Giemsa versus

acridine orange staining in the fish micronucleus assay and validation for use in water

quality monitoring. Ecotoxicology and Environmental Safety 74, 1, 144-149.

113. Poli G, Parola M (1997) Oxidative damage and fibrogenesis. Freee Rad Biol Med, pp.

22:287-305.

114. Pruden A, Arabi M, Stortenboom HN (2012) Corelation between upstream human

activities and riverine antibiotic resistane genes. Environ Sci Technol 46, 11541-

11549.

115. Republika Hrvatska, Drţavni ured za reviziju, Područni ured Virovitica (2013.)

Izvješće o obavljenoj financijskoj reviziji Opće bolnice Virovitica za 2011.

116. Ribera I, Dolédec S, Downie IS, Foster GN (2001) Effecct of land disturbance and

stress on species trait of ground beetle assemblages. Ecology, A publication of the

ecological society of America.

117. Ringo E, Strom E (1994) Microflora of Arctic charr, Salvelinus alpinus (L.):

gastrointestinal microflora of free-living fish and effect of diet and salinity on

intestinal microflora. Aquaculture and Fisheries Management 25, 623-629.

118. Sauerborn Klobučar R, Ţaja R, Franjević D, Brozović A, Smital T (2010) Presence of

ecotoxicologically relevant Pgp and MRP transcripts and proteins in cyprinid fish. Arh

Hig Rada Toksikol 61:175-182.

119. Savigny JC (1826) Analyse d'un Mémoire sur les Lombricus par Cuvier . Mém Acad

Sci Inst France 5: 176-184.

120. Schjolden J, Sørensen J, Nilsson GE, Poléo ABS (2007) The toxicity of copper to

crucian carp (Carassius carassius) in soft water. Sci Total Environ 384: 1-3, 239-251.

121. Schmidt-Posthaus H, Bernet D, Wahli T, Burkhardt-Holm P (2001) Morphological

organ alterations and infectious diseases in brown trout Salmo trutta and rainbow trout

107

Oncorhynchus mykiss exposed to polluted river water. Diseases of Aquatic Organisms

44: 161-170.

122. Servais P, Garcia-Armisen T, George I, Billen G (2007) Fecal bacteria in the rivers of

the Seine drainage network; souce, fate and modeling. Sci Total Environ 375, 153-

167.

123. Sies H (1985) Oxidative stress. Orlando: Academic press.

124. Sinal CJ, Webb CD, Bend JR (1999) Differential in vivo effects of alpha-

naphthoflavone and beta-naphthoflavone on CYP1A1 and CYP2E1 in rat liver, lung,

heart, and kidney. J Biochem Mol Toxicol 13(1): 29-40.

125. Sladeček V (1973) System of water quality from the biological point of view. Arhiv

für Hydrobiologie, Beiheft Ergebnisse der Limnologie 7: 1-218.

126. Smital T, Luckenbach T, Sauerborn Klobučar R, Hamboun MA, Vega LR, Epel D

(2004) Emerging contaminats - pesticides, PPCPs, microbial degradation products and

natural substances as inhibitors of multixenobiotic defence in aquatic organisms.

Mutation Research 552, 101-117.

127. Sohal RS (2002) Role of oxidative stress and protein oxidation in the aging process.

Free Radic Biol Med 37.

128. Southgate P (1990) Disease in aquaculture. In: Brown, L. (ed.), Aquaculture for

Veterinarians, Fish Husbandry and Medicine.91-128. Oxford: Pergamon Press.

129. Southgate P (1993) In Aquaculuture for Veterinarians, p 92. New York: Brown, L. Ed;

Pergamon Press.

130. Srivastava R, Punia P (2011) Effect of heavy metal on biochemical and hematologic

parameters in Cyprinus carpio and its use as a bioindicator of pollution stress. J

Ecophysiol Occup Health 11(1-2), 21-28.

131. Stepić S (2010) Promjene toksičnih učinaka smjesa pesticida na molekularne markere

izloţenosti kompostne gujavice (Eisenia andrei), disertacija. Sveučilište Josipa Jurja

Strossmayera u Osijeku i Institu RuĎer Bošković Zagreb.

132. Stoskopf M (1993) Clinical pathology of carp, goldfish, and koi. In Fish Medicine

(Stoskopf, M., ed), pp. 450-453. Philadelphia: W. B. Saunders.

133. Stoskopf MK (1993) Fich medicine. pp 882, W.B. Saunders Co, Philadelphia.

134. Strunjak-Perović I, Čoţ-Rakovac R, Topić Popović N, Jadan M (2009) Seasonality of

nuclear abnormalities in gilthead sea bream Sparus aurata (L.) erythrocytes. Fish

Physiology and Biochemistry 35, 287-291.

108

135. Svetina A, Matašin Z, Tofant A, Vučemilo M, Fijan N (2002) Haematology and some

blood chemical parameters of young carp till the age of three years. Acta Vet Hun 50:

4, 459-467.

136. Šimunić I, Senta A, Tomić F (2006) Potreba i mogućnost navodnjavanja

poljoprivrednih kultura u sjevernom dijelu Republike Hrvatske. Agronomski glasnik .

137. Šmuc T (2009) Kiselo-bazna svojstva Mn(III) meso-tetrakis((N-butil)piridin-2-il)

porfirina u vodenom mediju. Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutsko-biokemijski

fakultet, Zagreb.

138. Štraus B (1988) Medicinska biokemija. p. 1058. Jugoslavenska medicinska naklada,

JUMENA, Zagreb.

139. Švob M (1974) Histološke i histokemijske metode. Svjetlost, Sarajevo.

140. Talapatra SN, Banerjee SK (2007) Detection of micronucleus and abnormal nucleus in

erytrocyte from the gill and kidney of Labeo bata cultivated in sewage-fed fish farms.

Food and Chemical Toxicology 45, 210-215.

141. Tondoh JE, Monin LM, Tiho S, Czuzdi C (2007) Can earthworms be used as bio-

indicators of land-use perturbations in semi-deciduous forest?. Biology and Fertility of

Soils 43, 585-592.

142. Topić Popović N (1997) Bakterije riba iz creskoga jezera Vrana. Magistarski rad, pp

108. Sveučilište u Zagrebu, Zagreb.

143. Topić Popović N, Čoţ-Rakovac R, Strunjak-Perović I (2007) Commercial

phoenotypic tests (API 20E) in diagnosis of fish bacteria. Vet Med 52 (2), 49-53.

144. Topić Popović N, Kazačinski L, Strunjak-Perović I, Čoţ-Rakovac R, Jadan M,

Cvrtila-Fleck Ţ, Barišić J (2012) Fatty acid and proximate composition of bluefin tuna

(Thunnus thynnus) muscle with regard to plasma lipids. Aquatic Res 43: 722-729.

145. Topić Popović N, Srebočan E, Čoţ-Rakovac R, Hacmenjek M, Strunjak-Perović I,

Jadan M (2008) Blood biochemistry of captive Atlantic bluefin tuna Thunnus thynnus

farmed in Adriatic Sea. Journal of Applied Ichthyology. 24, 614-616.

146. Topić Popović N, Strunjak-Perović I, Čoţ-Rakovac R, Hacmenjak M (2006) Plasma

metabolites and enzymes of bluefin tuna Thunnus thynnus and liver histology. Period

Biolog 108: 2, 127-131.

147. Topić Popović N, Strunjak-Perović I, Sauerborn Klobučar R, Barišić J, Babić S, Jadan

M, Kepec S, PKazazić S, Matijatko V, Ber Ljubić B, Car I, Repec S, Stipaničev D,

Klobučar GIV, Čoţ-Rakovac R (2015). Inpact of treated wastewater on organismic

biosensors at various levels of biological organization. Sci Total Environ 23-37.

109

148. Truhaut R (1977) Ecotoxicology: objectives, principles and perspectives. Ecotoxicol

Environ Saf 1(2): 151-73.

149. Udroiu I (2006) The micronucleus test in piscine erythrocytes. Aquatic Toxicology 79,

201-204.

150. Ural MS (2013) Chlorpyrifos-induced changes in oxidant/antioxidant status and

haematological parameters of Cyprinus carpio carpio: Ameliorative effect off

lycopene. Chemosphere 90: 2059-2064.

151. USFWS, U.S.Fish & Wildlife Service (2012) Federal and state endangered and

threatented species expenditures.

152. Van Gastel CA, Van Brummelen TC (1994) Incorporation of the biomarker concept in

ecotoxicology cells for a redefinition of terms. Ecotoxicology vol 5, pp 217-225.

153. Van Ngan P, Gomes V, Passos MJACR, Ussami KA, Campos DYF, da Silva Rocha

AJ, Pereira BA (2006) Biomonitoring of the genotoxic potential (micronucleus and

erythrocyte nuclear abnormalities assy) of the Admiralty Bay water surrounding the

Brazilian Antarctic Research Station "Comandante Rerraz", King George Island. Polar

Biol 30: 209-217.

154. van Straalen N (2003) Ecotoxicology becomes stress ecology. Environmental Science

& Technology 37: 324A-330A.

155. Varela AR, Manaia CM (2013) Human health implications of clinically relevant

bacteria in wastewater habitats. Enivironmental Science and Pollution Research, 20, 6,

3550-3569.

156. Wedemeyer GA, Yastuake WT (1977) Clinical methods for the assessment of the

effects of environmental stress on fish health. Technical Papers of the U.S. Fish and

Wildlife Service, Washington, DCop.1-18.

157. WHO (1993) Environmental health criteria 155: Biomarkers and risk assessment:

concepts and principles. World Health Organisation, Geneva.

158. WHO (2006) Wastewater and Excreta Use in Aquaculture (160 pp.). World Health

Organisation, Geneva.

159. Wiesmann U, Su Choi I, Dombrowki EM (2007) Fundamentals of Biological

Wastewater Treatment. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA.

160. Xue B, Zhang R, Wang Y, Liu X, Li J, Zhang G (2013) Antibiotic contamination in a

typical developing city in south Cihna: occurence and ecological risks in the Yonjang

River impacted by tributary discarge and anthropogenic activiteis. Ecotoxicol Environ

Saf 92, 229-236.

110

161. Zelikoff JT (1993) Metal pollution-induced immunomodulation in fish. Annu rev Fish

Dis 3:305-325.

162. Zhang Q, Wu J, Chen S, Feng Y (2014) Influences of organic pollutants in water on

antioxidant enzyme in zebrafish. J. Chem. Pharm. Res.6: 4, 1014-1021.

163. Ţarković N (2000) Mechanismus der Tumorentstehung. Pharmazeutische Zeitung,

145: 239-286.

164. Ţarković N, Lončarić I, Čipak A, Jurić G, Wonisch W, Borović S, Weag G, Vuković

T, Ţarković K (2001) Patofiziološke značajke sekundarnih glasnika slobodnih radikala

i oksidativni stres. U: Oksidativni stres i djelotvornost antioksidansa. Medicinska

naklada, Zagreb.

165. Ţikic V, Štajn AS, Ognjanović BJ, Palovic SZ, Saičić ZS (1997) Activities of

superoxide dismutasae and catalase in erythrocytes and transaminases in the plasma of

carps (Cyprinus carpio) exposed to cadmium. Physiol Res 46 (5), 391-394.

111

9. ŢIVOTOPIS

Slavko Kepec je roĎen 01. listopada 1958. godine u Virovitici. Osnovnu školu završio je u

Suhopolju, a gimnaziju u Virovitici. Diplomirao je 1982. godine na Prirodoslovno-

matematičkom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu, smjer biologija i stekao zvanje diplomirani

inţenjer biologije.

Nakon završetka fakulteta zaposlio se kao profesor biologije i kemije u Centru za odgoj i

usmjereno obrazovanje u Virovitici. Na Filozofskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu poloţio

je predmete iz pedagoško-psihološke skupine predmeta za rad u školi.

1985. godine zapošljava se u Gradskom društvu crvenog kriţa u Virovitici na poslovima

provoĎenja akcija dobrovoljnog darivanja krvi i tečajeva iz prve pomoći za vozače.

Od 1991. godine do danas zaposlen je u poduzeću Virkom d.o.o. Virovitica na radnom mjestu

voditelj laboratorija. Poslovi koje obavlja odnose se na pripremu i kontrolu kakvoće vode za

piće. Radi na poslovima praćenja rada ureĎaja za biološko pročišćavanje otpadnih voda i

provoĎenju analiza otpadnih voda.

Popis radova:

1. Kepec S (1997) Prikaz rezultata ispitivanja vode za piće, otpadnih voda i ureĎaja za

biološko pročišćavanje otpadnih voda sustava vodoopskrbe i odvodnje Virovitice,

Hrvatska vodoprivreda, Zagreb

2. Kepec S (1998) Praćenje učinkovitosti uklanjanja ţeljeza i amonijaka, Hrvatska

vodoprivreda, Zagreb

3. Kepec S (2000) Osvrt na kakvoću vode za piće na području bivše općine Virovitica,

Hrvatska vodoprivreda, Zagreb

4. Kepec S (2002) Rezultati ispitivanja kakvoće vode za pi8će u javnom vodoopskrbnom

sustavu Virovitice, Zbornik radova znanstveno-stručnog skupa „Voda i javna

vodoopskrba“, Mlini

5. Kepec S (2002) Prikaz tehnološke linije gradskog dijela ureĎaja za biološko

pročišćavanje otpadnih voda s osvrtom na strukturu troškova njegovog rada, Zbornik

radova VIII. Stručno poslovnog skupa Hrvatske grupacije vodovoda i kanalizacije,

Šibenik

112

6. Kepec S, Markić M, Beslić M, Majnarić B, Siposz L (2006) Analiza rada samoispirnih

filtara u Hrvatskoj. Zbornik radova stručno-poslovnog skupa Suvremene tehnologije i

ureĎaji za pročišćavanje otpadnih voda, Poreč

7. Topić Popović N*, Strunjak-Perović I, Sauerborn Klobučar R, Barišić J, Babić S, Jadan

M, Kepec S, P.Kazazić S, Matijatko V, Beer Ljubić B, Car I, Repec S, Stipaničev D,

Klobučar GIV, Čoţ-Rakovac R (2015) Impact of treated wastewater on orgnismic

biosensors at various levels of biological organization, Science of the Total Environment,

538: 23-37

8. Topić Popović N, Benussi Skukan A, Dizidara P, Strunjak-Perović I, Kepec S, Barišić J*,

Čoţ-Rakovac R (2015) Prediction of Listeria monocitogenes growth as function of

environmental factors, Acta Alimentaria, Vol.44 (3), pp. 443-453

9. Topić Popović N*, P.Kazazić S, Strunjak-Perović I, Barišić J, Sauerborn-Klobučar R,

Kepec S, Čoţ-Rakovac R (2015) Detection and diversity of aeromonads from treated

wastewater and fish inhabiting effluent and downstream waters, Ecotoxicology and

Environmental Safety 120, 235-242

113

10. POPIS SLIKA I TABLICA

10.1. Popis slika

Slika 1. Projektirani i izgraĎeni UreĎaj za biološko pročišćavanje otpadnih voda grada

Virovitice (UBP)

19

Slika 2. Prikaz lokacija uzorkovanja 21

Slika 3. Babuška (Carassius gibelio), ulovljena 08.07.2014. u Ţupanijskom kanalu

nizvodno

Slika 4. Koncentracija amonijaka, nitrita, nitrata i ukupnog dušika u pročišćenoj otpadnoj

vodi i vodotocima (Slika 2., Lokacije uzorkovanja 1-9)

39

Slika 5. Koncentracija ortofosfata i ukupnog fosfora u pročišćenoj otpadnoj vodi i

vodotocima (Slika 2., Lokacije uzorkovanja 1-9)

40

Slika 6. Koncentracija teških metala u muljevima 42

Slika 7. Škrge babuški ulovljenih u proljeće (a, b, c), ljeto (d, e, f) i jesen (g, h, i) 45

Slika 8. Tkivo bubrega babuški ulovljenih u ljeto (a, b) i jesen (c, d) u kanalu Manteč (a,c)

i Ţupanijskom kanalu (b, d)

46

Slika 9. Tkivo jetre babuški ulovljenih u ljeto (a, b) i jesen (c, d), u kanalu Manteč (a,c) i

Ţupanijskom kanalu (b, d)

47

Slika 10. Tkivo slezene babuški ulovljenih u proljeće , u kanalu Manteč (a,b) i Ţupanijskom

kanalu (c)

48

Slika 11. Biokemijski parametri i parametri oksidacijskog stresa; (log10 osnovne skale) u

plazmi babuški po sezonama prema mjestu ulova (Slika 2., lokacije uzorkovanja

1, 8, 9)

50

Slika 12. Učestalost eritrocita sa nepravilnim jezgrama (‰) kod babuške 51

Slika 13. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h tretmana izlaganja otpadnoj vodi uzorkovanoj u proljeće 2014. god.

52

Slika 14. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24h tretmana izlaganja otpadnoj vodi uzorkovanoj u ljeto 2014.god.

53

Slika 15. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h tretmana izlaganja otpadnoj vodi uzorkovanoj u zimu 2014. god

53

Slika 16. TBARS koncentracija u tkivu gujavice E. fetida nakon izlaganja uzorcima otpadne

vode (nerazrijeĎenim, razrijeĎenim 100 x i 10.000 x) uzorkovane u proljeće 2014.

g.

54

Slika 17. TBARS koncentracija u tkivu gujavice E. fetida nakon izlaganja uzorcima otpadne

vode (nerazrijeĎenim, razrijeĎenim 100 x i 10.000 x) uzorkovane u ljeto 2014. g

55

Slika 18. TBARS koncentracija u tkivu gujavice E. fetida nakon izlaganja uzorcima otpadne

vode (nerazrijeĎenim, razrijeĎenim 100 x i 10.000 x) uzorkovane u jesen 2014. g.

56

Slika 19. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja dvjema koncentracijama otpadnog mulja

uzorkovanog u proljeće

57

Slika 20. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja dvjema koncentracijama otpadnog mulja

uzorkovanog u ljeto

57

114

Slika 21. Akumulacija fluorescentnog supstrata Rodamina 123 u tkivu gujavice E. fetida

nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja dvjema koncentracijama otpadnog mulja

uzorkovanog u jesen

58

Slika 22. Koncentracija TBARS-a u tkivu gujavice E. fetida nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja

dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u proljeće

59

Slika 23. Koncentracija TBARS-a u tkivu gujavice E. fetida nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja

dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u ljeto

59

Slika 24. Koncentracija TBARS-a u tkivu gujavice E. fetida nakon 24 h, 48 h i 7 d izlaganja

dvjema koncentracijama otpadnog mulja uzorkovanog u jesen

60

Slika 25. Rezultati mikrobioloških ispitivanja vode i mulja 65

Slika 26. Postotak izolata MALDI-TOF MS/API 20E u uzorcima voda i mulja - proljeće 68

Slika 27. Postotak izolata u uzorcima vode i mulja MALDI-TOF SE/API 20E - ljeto 69

Slika 28. Postotak izolata u uzorcima vode i mulja MALDI-TOF SE/API 20E - jesen 71

Slika 29. Prikaz mikrobiološke analize briseva s organa riba; K-koţa, Š-škrge 72

Slika 30. Postotak izolata briseva s organa riba u proljeće (API 20E i MALDI-TOF MS) 73

Slika 31. Postotak izolata s organa riba (MALDI-TOF MS/API 20 E 74

Slika 32. Postotak izolata briseva s organa riba u jesen (API 20E i MALDI-TOF MS) 75

Slika 33. Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima u vodi i mulju 78

Slika 34. Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima bakterija poraslih iz briseva organa

riba u potoku OĎenica (Slika 2., lokacija uzorkovanja 1) prema sezonama i vrsti

tkiva

79

Slika 35. Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima sojeva bakterija poraslih iz briseva

organa riba na lokaciji uzorkovanja 8 (Ţupanijski kanal) prema Slici 2.

80

Slika 36. Osjetljivost prema antimikrobnim lijekovima sojeva bakterija poraslih iz briseva

organa riba na lokaciji uzorkovanja 9. (Ţupanijski kanal nizvodno) prema Slici 2.

81

115

10.2. Popis tablica

Tablica 1. Prikaz uzoraka prema lokacijama uzorkovanja 20

Tablica 2. Biometrijski podaci riba prema terminu i mjestu ulova 27

Tablica 3. Temperatura vode, suspendirana tvar, pH i elektroprovodljivost 36

Tablica 4. Otopljeni kisik, kemijska potrošnja kisika (KPKCr i KPKMn) i biološka

potrošnja kisika (BPK-5)

38

Tablica 5. Koncentracija ţeljeza, kadmija, kroma, ţive, olova, nikla, cinka i bakra u

uzorcima voda (μg/L)

41

Tablica 6. Koncentracija odreĎivanih farmaceutika u vodi (ng/L) i sedimentu (ng/g) 43

Tablica 7. Vrijednosti hematokrita krvi babuške kroz sezone 49

Tablica 8. Rezultati analize mutagenog potencijala uzoraka otpadne vode

uzorkovane u proljeće Ames bakterijskim testom

61

Tablica 9. Rezultati analize mutagenog potencijala uzoraka otpadne vode

uzorkovane u ljeto Ames bakterijskim testom

62

Tablica 10. Rezultati analize mutagenog potencijala uzoraka otpadne vode

uzorkovane u jesen Ames bakterijskim testom

63

Tablica 11. Prisutnost Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes i

Salmonella sp. u uzorcima vode i mulja

66

Tablica 12. Postotak izolata u uzorcima vode (1-9) i mulja (10-11) u proljeće (API

20E i MALDI-TOF MS)

68

Tablica 13. Postotak izolata u vode (1-9) i mulja (10-11) u ljeto (API 20E i MALDI-

TOF MS)

69

Tablica 14. Postotak izolata u vode (1-9) i mulja (10-11) u jesen (API 20E i MALDI-

TOF MS

70

Tablica 15. Postotak izolata briseva s organa riba u proljeće (API 20E i MALDI-TOF

MS)

73

Tablica 16. Postotak izolata briseva s organa riba u ljeto (API 20E i MALDI-TOF

MS)

74

Tablica 17. Postotak izolata briseva s organa riba u jesen (API 20E i MALDI-TOF

MS)

75