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R E V I S TA P O R T U G U E S ADE

CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

RPCV (2001) 96 (540) 183-189

Efeito da Ribavirina na replicação do vírus da peste suína africana

Effect of Ribavirin on the African swine fever virus replication

M. Luísa Valdeira

Departamento de Microscopia Electrónica do Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Estrada de Benfica, 701, 1500 Lisboae Centro de Genética e Biologia Molecular da Faculdade de Farmácia de Lisboa. Av. das Forças Armadas, 1600 Lisboa.

Resumo: Foi estudado o efeito de diferentes concentraçõesde Ribavirina na infecção pelo vírus da peste suína africana(VPSA) em células CV1. Os resultados indicam que a infec-ciosidade do VPSA é inibida a concentrações de Ribavirinasuperiores a 15 µg/ml que não são tóxicas para a célulahospedeira. Estudos de incorporação de timidina, uridina emetionina radioactivas em células infectadas na presença dadroga indicam que a síntese do RNA e das proteínas viraissão afectadas, enquanto que o DNA viral se mantém inaltera-do. A observação por microscopia electrónica de célulasinfectadas a vários tempos, em presença da Ribavirina, mos-tra que a morfogénese do vírus se processa de igual modo nascélulas infectadas sem qualquer tratamento, no entanto o apa-recimento de estruturas aberrantes e de unidades de membranade forma irregular nas áreas de replicação viral é relevante,quando as células são tratadas com o antiviral. O possívelmecanismo inibidor será discutido.

Summary: The effect of different concentrations of Ribavi-rin was studied in CV1 cells infected with African swine fevervirus. Ribavirin inhibits the infectivity of ASFV at a concen-tration of 15 µg/ml, that is not toxic for the host cells. Incor-poration studies of radioactive tymidine, uridine andmethionine in infected and drug treated cells indicate that theviral RNA and protein synthesis are inhibited, but viral DNAis made in the same extend. Samples of infected cells, at dif-ferent times post-infection, treated with Ribavirin, werefixed, processed and observed by electron microscopy. Theresults indicate that the morphogenesis of the virus is done inthe same way in presence or absence of the drug. However,in the first case, we could observe more aberrant structuresand irregular unit membranes inside replication areas. Thepossible inhibitor mechanism will be discussed.

infectados cronicamente ou em espécies animaisresistentes ao vírus não neutralizam o vírus (DeBoer, 1967), assim todos os esforços para produziruma vacina têm falhado. Por esta razão é importantea pesquisa de compostos com actividade antiviralque possam ser úteis como agentes profiláticos outerapêuticos.

A Ribavirina (1- ß- D- ribofuranosido - 1,2,4- tria-zol- 3 - carboxamida) é um ribonucleósido purínicosintético (Wikowski et al., 1975) que é actualmenteusado como fármaco de excelência para o tratamen-to de várias infecções virais. É um antiviral de largoespectro com baixa toxicidade que raramente causaresistência a vírus DNA e RNA (Sidwell, 1980 e DeClercq, 2001). Pode ser administrado por via oral,intravenosa ou em forma de nebulizador. Assim, estáa ser administrado a doentes para o tratamento dasinfecções respiratórias causadas pelo vírus sincicialrespiratório (Shigeta, 2001), em combinação com ointerferão-alfa para infecções crónicas de hepatites Be C (Carreno et al., 2001 e Fang et al., 2001), deadenovírus (McCarthy et al. 1995 e Bordigoni et al.,2001), de Hantavirus (Rodriguez-Rodriguez, e Ra-mirez-Ronda, 1995 e Murphy et al., 2001), do vírusMachupo da família Arenoviridae (Kilgore, 1997) edo vírus La Crosse (McJunkin et al. 1997). Igual-mente são descritas inibições pela Ribavirina do ví-rus herpes por Hahn et al. (2001), do vírus da febrehemorrágica por Fisher-Hoch et al. (1995), do vírusWest Nile por Jordan et al. (2000), dos enterovíruspor Rawlinson (2001) e do vírus Nipah por Chong etal. (2001).

Vários Autores têm estudado o mecanismo deacção deste antiviral. Streeter et al. (1973) e Fran-chetti e Grifantini (1999) descrevem uma inibiçãodirecta na inosina-5’-monofosfato desidrogenase(IMP-DH) impedindo assim a conversão do IMPatravés da xantina-5’-monofosfato a guanosina-5’-monofosfato (GMP), levando à depleção dos níveisintracelulares de GTP e dGTP. Mas outros mecanis-mos têm sido propostos, tais como a inibição datranscrição e/ou elongação do RNA (Fernandez-Larsson et al., 1989; Toltzis et al., 1988; Jordan etal., 1999; Rankin et al., 1989), a inibição da forma-ção de um “cap” no extremo 5’ do mRNA viral pelamRNA guaniltransferase para o mRNA do vírus davacina (Goswami et al., 1979) ou um efeito potencia-

Introdução

O vírus da peste suína africana (VPSA) é um vírusDNA icosaédrico com invólucro que replica no cito-plasma de células infectadas. Morfologicamente émuito semelhante aos iridovírus que infectam verte-brados (Carrascosa et al., 1984), mas a estrutura doseu DNA lembra a do genoma dos poxvírus (Viñuela,1987). Sendo assim, o VPSA é o único membro deuma nova família, Asfarviridae, género Asfivirus.

O VPSA é responsável por uma doença infecciosae grave no suíno doméstico que causa grandesprejuízos económicos (Costa, 1990). Um dos aspe-ctos mais surpreendentes é que os anticorpos especí-ficos contra o VPSA detectados em suínos

Materiais e métodos

Células e vírusAs células CV1 obtidas de rim de macaco “African

Green” (Cercopithecus aethiops) foram mantidas emmeio de manutenção Eagle (MEM) com 10% desoro de vitela recém-nascida (NCS) proveniente daGibco, Scotland e gentamicina (50 µg/ml). A estirpeLisboa 60 do VPSA (Manso Ribeiro e Rosa Azevedo,1961) adaptada a crescer em células de macaco foiproduzida nestas células (Valdeira et al., 1990).

Compostos químicosA amostra utilizada de Ribavirina foi cedida

gentilmente pelo Dr. W. Kirkpatrick da ICN Pharma-ceuticals (Covina, Califórnia). As soluções a estudarforam preparadas na altura, por dissolução da drogano meio MEM.

Ensaios de citotoxidadeLamelas com 5x105 células em tubos de Leighton

foram tratadas com as diferentes concentrações deRibavirina durante 24, 48 e 72 horas. Ao fim destetempo o meio com a droga foi removido, as célulaslavadas com novo meio, e coradas com azul tripanoa 0,1% em tampão PBS-A. As células que coravam(não viáveis) foram contadas para cada concentraçãodo inibidor em 200 células distribuídas por 2 lamelasdiferentes.

O efeito citotóxico também foi determinado fazendoo exame microscópico das culturas celulares tratadascom a Ribavirina durante 4 dias, utilizando um mi-croscópio invertido de contraste de fase.

Efeito de diferentes concentrações de ribavirinana replicação do VPSA

Titulação pelo método de Reed e Muench (1938)do vírus produzido em presença do inibidor

5x106 células em monocamada celular recém-con-fluente foram inoculadas com 10 pfu/célula durante2 h a 4 °C com agitação frequente. Decorrido estetempo, o vírus foi removido e as células foram lava-das e incubadas com novo meio MEM com ou sem adroga. O vírus extracelular foi colhido, clarificado etitulado, quando as células testemunha, infectadas esem tratamento, apresentavam efeito citopático totalà observação microscópica.

Incorporação de timidina, uridina e metioninanas células infectadas

Usaram-se culturas infectadas com 10 pfu/célulaem presença de 15 µg/ml de Ribavirina. A diferentestempos post-infecção o meio foi removido para seradicionado novo meio com 5% de NCS dialisadocontendo 10 µCi/ml de [metil-3H]-timidina (Amers-ham, 50-60 Ci/mmol), 10 µCi/ml de [5 -3H]-uridina(Amersham, 25-30 Ci/mmol) ou meio contendo 5%da concentração normal de metionina com 1 µCi/mlde [35S] - metionina (Amersham, >800 Ci/mmol).

Foram feitos pulsos de marcação de 30 min, adiferentes tempos de infecção, com os diferentes

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dor de análogos dos nucleósidos das purinas queimpedem a replicação dos vírus da Imunodeficiênciahumana e dos vírus herpes (Hartman et al., 1991;Neyts et al. 1998). Contudo, o efeito observado amaioria das vezes foi a depleção intracelular de GTPe dGTP.

Quanto à sua farmacocinética, sabe-se que apósadministração oral de 1 g/dia de Ribavirina, o picode concentração ocorre após 2,5 horas da ingestão. Aconcentração plasmática varia entre 1,7–5,3 mM,com a concentração média de 3,1 mM. A eliminaçãoda ribavirina é renal, e apenas uma pequena percen-tagem é de eliminação fecal. A meia-vida de elimi-nação é de aproximadamente 24 horas. Estudos emhumanos e animais mostraram acumulação do fár-maco nos tecidos, especialmente nos eritrócitos.Relativamente à sua toxicidade, tem-se investigado asua actividade teratogénica em animais de experi-mentação. A alta frequência de mal formaçõescongénitas ocorre em ratos, com susceptibilidadepara diferentes órgãos e sistemas. Têm sido observa-dos alguns defeitos crânio-faciais. A embriotoxicida-de pode ocorrer quando a via de administração é aoral, possivelmente devido à activação do complexoatravés do tracto gastro-intestinal ou do metabolismohepático. No entanto, quando foram dadas váriasdoses de ribavirina a embriões de camundongosdurante estádios diferentes da sua organogénese foimostrado que a dose de 10 mg/kg não tem nenhumefeito tóxico. Todos os embriões sobreviveram aotratamento sem malformações ou redução do pesocorporal fetal após 18 dias de gestação. Por outrolado, a dose de 200 mg/kg foi altamente letal e umagrande parte dos embriões não sobreviveram, exceptoaqueles em estádios avançados de desenvolvimento.Entretanto, doses entre 50 e 150 mg/kg produziramaumento progressivo na frequência de malformações.A dose de 175 mg/kg produziu atraso de crescimento(Harnden, 1985; Fields, 1996).

Diferentes estudos descrevem que a replicação doVPSA é inibida pela 5 - iodo - 2’- deoxiuridina (Gil -Fernández et al., 1979), rifampicina (Dardiri et al.,1971; Valdeira e Alves de Matos, 1981), ácido fosfo-noacético (Moreno et al., 1978 e Villinger et al.,1990), drogas lisossomotrópicas, inibidores de prote-ases e da síntese de lípidos (Geraldes e Valdeira,1985; Valdeira et al., 1998; Bernardes et al., 1998).Ácidos gordos tais como oleico, linoleico e álcoollinolénico (Sola et al., 1986a) e análogos daadenosina (Gil Fernández e De Clerq, 1987) têm sidoreferidos como inibidores selectivos da replicaçãodeste vírus. A adsorção do VPSA também é inibidapela suramina (Sola et al., 1986b). Recentemente,apenas foram descritos efeitos virucidas contra oVPSA com desinfectantes como: hipoclorito desódio, sais de amónio quaternário e compostos comiodo (Shirai et al., 2000) e Fabregas et al. (1999)demonstraram o efeito inibidor de extractos de microalgas marinhas contra este vírus.

Deste modo, e na tentativa de encontrar antiviraiseficientes no combate a esta doença, estudamos oefeito da Ribavirina na replicação do VPSA em célu-las em cultura por diferentes metodologias.

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isótopos radioactivos, que foram terminados poradição de 2 volumes de PBS-A gelado às culturas.As monocamadas celulares foram raspadas para tu-bos contendo o mesmo tampão gelado e sedimen-tadas a 1500 g. O sedimento foi ressuspenso emtampão hipotónico (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM KCl, 5 mM MgCl2 e 1 mM EDTA) com 0,5%NP40 para lisar as células. O sobrenadante - frac-ção citoplasmática - foi colhido e precipitado comácido tricloroacético (TCA) a 10% (p/v) durante 30min a 0 °C tendo sido previamente adicionada albu-mina sérica bovina (BSA) na concentração final de 1mg/ml. O sedimento, contendo os núcleos - fracçãonuclear - foi ressuspenso em PBS-A e precipitadoigualmente com TCA. Os precipitados foram ressus-pensos em TCA a 5% (p/v) para serem filtrados emfiltros de fibra de vidro (Whatman GF/C). Os fil-tros foram lavados 2 vezes com TCA a 5% frio du-rante 5 min à temperatura ambiente e 2 vezes comálcool-éter (1:1). Depois de secos, os filtros foramcolocados em frascos de cintilação e contados em 5ml de cintilador de tolueno [0,4% (p/v) de PPO e0,01 % (p/v) de dimetil - POPOP em tolueno] e a ra-dioactividade foi lida num contador de cintilaçãoBeckman LS - 100.

Microscopia electrónicaCélulas CV1 sub-confluentes foram infectadas com

VPSA (10 pfu/célula) em presença de 15 µg/ml de Ri-bavirina para uma adsorção de 2 h a 4 °C. Findo estetempo, o vírus foi removido e colocado meio DMEcom 2% de NCS com a mesma concentração do inbi-dor e as células infectadas foram incubadas a 37 °C.

Para o estudo da morfogénese do vírus em presençada Ribavirina foram colhidas amostras a vários tem-pos post-infecção. As amostras foram fixadas com3% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído emtampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,3 durante 2horas. Posteriormente foi feita uma pós - fixaçãodurante 60 min com 1% de tetróxido de ósmio nomesmo tampão e o “block staining” com 1% deacetato de uranilo em tampão ácido acético-acetatode sódio 0,1 M pH 5. Todos estes passos foramfeitos à temperatura de 4 °C.

As células foram infiltradas em Agar e pequenosfragmentos foram desidratados numa série deconcentrações crescentes de etanol para seremimpregnados em EPON - ARALDITE.

Secções finas foram contrastadas em acetato deuranilo e citrato de chumbo e observadas nummicroscópio electrónico Jeol 100 C a 80 kv.

Resultados

Citotoxidade da ribavirinaO Quadro I mostra o efeito da Ribavirina nas células

CV1 durante 72 horas de tratamento. A citotoxidadeé mínima na concentração de 50 µg/ml da droga,mas o número de células não viáveis aumenta com aconcentração de 100 µg/ml.

Durante 4 dias as culturas celulares tratadas com adroga foram examinadas num microscópio invertido

de contraste de fase, e classificadas pelo grau deefeito citotóxico usando uma escala de 0 (célulasnormais) a 6 (células mortas), Quadro II. Depois de2 dias de tratamento, as células não mostraram alte-rações morfológicas a concentrações de Ribavirinaiguais ou inferiores a 50 µg/ml, embora a droga mos-trasse um ligeiro efeito citostático. Pelo contrário, aconcentrações de 80 µg/ml ou superiores, as célulasarredondavam e destacavam-se do vidro, mostrandogranulações no seu interior e o número de célulasmortas e degeneradas aumentava depois de 24 horasda presença do inibidor. Depois de 3 dias a maioriadas células estava morta com a concentração de 160µg/ml. Estes resultados e os do teste de viabilidadecom o azul de tripano, indicam que deve ser usada aconcentração máxima de 50 µg/ml nos ensaios deactividade antiviral.

Inibição da produção viral em presença daribavirina

Como se pode verificar (Fig. 1) a Ribavirina reduziua replicação viral a partir da concentração de 20µg/ml. Entre 20 e 30 µg/ml a multiplicação do VPSAé inibida 94%, enquanto às concentrações de 35 e 50µg/ml as inibições do “yield” viral atingem os 99 e100 % respectivamente.

Efeito da ribavirina nas sínteses de ácidosnucleicos e proteínas

Como se pode observar (Fig. 2) foram quantificadasas incorporações de [3H]-timidina, [3H]-uridina e[35S] - metionina em células infectadas com o VPSAem presença da droga e os resultados indicam que asíntese de RNA e das proteínas (Figs. 2 B e C) éafectada pela presença do inibidor, enquanto a síntesedo DNA não mostra alterações significativas (Fig. 2A). A quantidade da incorporação de uridina às 9 hpié reduzida a 50%, mas a incorporação de metioninaà mesma hora pós infecção é inibida 60%.

As inibições referidas em presença da Ribavirinasão específicas, porque em células não infectadas(resultados não mostrados) tratadas com a droga, assínteses das proteínas e dos ácidos nucleicos sãoidênticas ao controle, sem qualquer tratamento.

Efeito da ribavirina na morfogénese do VPSAAs observações ao microscópio electrónico de

células infectadas em presença da Ribavirina,

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Cada valor (média ± desvio padrão) representa o nº de células nãoviáveis, em presença da Ribavirina, sendo calculado de contagensde 200 células, para cada tempo de incubação e concentração doinibidor.

Quadro I - Citotoxidade da Ribavirina

Ribavirina

(µg/ml)

Tempo de incubação (h)

24 48 72

0

25

50

100

0,23±0,4

0,24±0,34

0,25±0,37

0,48±0,49

0,63±0,23

0,22±0,37

0,78±0,83

2,58±0,25

0,36±0,49

0,21±0,25

0,54±0,51

1,48±0,58

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indicam que este inibidor interfere com a replicaçãodo VPSA nas fases tardias de infecção, visto que nostempos precoces da infecção (adsorção e descapsidação)as imagens observadas indicam que estes estádios seprocessam de modo igual ao controlo, sem qualquertratamento.

Na Fig. 3 A, podem ser observadas áreas do cito-plasma perto do núcleo com material floculento efibrilar onde se vêem numerosos ribossomas. À voltadessas áreas, as fábricas de vírus, estão as mitocôn-drias, os lisossomas, porções do retículo endoplás-mico e vesículas. Dentro dessas áreas tambémexistem membranas poligonais abertas ou fechadas epartículas virais. Alguns destes viriões têm umnucleóide central e denso.

A Fig. 3 B, mostra o efeito da Ribavirina nas células

infectadas com o VPSA às 12 hpi. Nestas condiçõessó muito raramente são visualizadas partículas viraiscompletas e parece que o número de ribossomasdentro da fábricas virais é superior à testemunha. Noentanto, aparecem estruturas aberrantes e unidadesde membrana de forma irregular, sendo o seu aspectogeral idêntico ao que se observa nas células infectadassem tratamento no que respeita ao material membra-nar, fibrilar e floculento que originará os futuros viriões.

Discussão

Os resultados aqui apresentados mostram que aRibavirina inibe a multiplicação do VPSA numa fasetardia do ciclo replicativo viral em células CV1 emcondições nas quais, as células não infectadas etratadas com a droga, não apresentam alterações nassínteses das proteínas e ácidos nucleicos. As concen-trações usadas, entre 5 e 50 µg/ml, são semelhantesàs usadas por outros Autores no estudo da actividadeantiviral deste inibidor.

Inibições selectivas como esta são descritas poroutros investigadores (Byhan et al., 1978, Rankin etal., 1989 e Murphy et al., 2001) que concluíram queas inibições dos vírus que estudaram (vírus domosaico do tabaco, reovírus e Hantavirus) tambémapresentam inibições dos mesmos componentesvirais.

O modo de acção da Ribavirina na replicação doVPSA parece ter pontos comuns relativamente aoutros vírus. A inibição do RNA do VPSA não resultada falta de nucleótidos da guanosina, como foi pro-posta para os sistemas celulares animais, quandoforam tratados com esta droga, pois não se observouinibição da síntese do RNA da célula hospedeira. Ainibição do VPSA pode resultar da impossibilidadeda guanilação do “capping” do mRNA viral, tal comofoi demonstrado para o vírus da vacina (Goswami et

Quadro II - Observação microscópica das culturas celulares tratadas com diferentes concentrações de Ribavirina, durante 4 dias.

Para cada concentração foram observadas três culturas celulares.A citoxidade foi registada em alterações morfológicas (2), em efeito citóstático (3), granulação (3), efeito rounded-up (5) e morte celular(6). +, positivo;-, negativo.

Fig. 1 - Inibição da replicação do VPSA por várias concentra-ções de Ribavirina. Células CV1 foram infectadas com 10 pfu/célula durante 2 h a 4 °C. Depois da adsorção foi adicionado meiocom o inibidor nas concentrações indicadas e as células infectadasforam incubadas a 37 °C durante 24 h, após o que o vírus foicolhido e titulado. Cada valor representa a média de duas experi-ências independentes.

Concentração de Ribavirina (µg/ml)

Títu

lo v

iral (

ID50

/ml x

104 )

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Fig. 2 - Efeito da ribavirina na incorporação de [3H]-timidina, [3H]-uridina e [35S] - metionina. A vários tempos post - infecção,células CV1 foram incubadas com 10 µCi/ml de [3H]-timidina (A), 10 µCi/ml de [3H]-uridina (B) ou 1 µCi/ml de [35S] - metionina (C).As células foram solubilizadas com SDS e os citoplasmas foram isolados. A radioactividade TCA-precipitável incorporada na fracçãocitoplasmática foi lida nas células tratadas (•) ou não (o) com 15µg/ml de Ribavirina. Cada valor representa a média de duas experiênciasindependentes.

Fig. 3 - Morfogénese do VPSA em presença da ribavirina. Células CV1 foram infectadas com VPSA (10 pfu/célula). Depois da adsorçãodurante 2 h a 4 °C em presença ou não da droga, as células foram incubadas a 37 °C durante 12 h com ou sem inibidor. Nas célulasinfectadas com a Ribavirina (b) podem ver-se estruturas aberrantes (seta longa) e unidades de membrana de forma irregular (cabeça deseta). Nas células infectadas na ausência do inibidor (a) o aspecto das fábricas do VPSA. A barra representa 0,4 µm.

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al ., 1979), visto que a síntese proteica do VPSA foimais sensível à Ribavirina do que a síntese do RNA.

A morfogénese do VPSA é feita em presença daRibavirina dum modo semelhante à testemunha semtratamento, mas apresenta estruturas aberrantes eunidades de membrana de forma irregular. Resultadosidênticos foram observados por Moss et al. (1971)com o vírus da vacina quando foi inibido pelaRifampicina. Neste caso, foram vistas ao microscó-pio electrónico membranas acumuladas nas áreas dereplicação viral em células infectadas com o vírus davacina em presença desta droga. A acção da Rifampi-cina foi discutida, sendo o bloqueio explicado pelainibição da síntese proteica causada pela droga oupor uma acção mais directa no processo de morfogé-nese, visto que depois da remoção da droga os viriõesmaduros eram formados. O VPSA é inibido pela Ri-fampicina (Dardiri et al., 1971; Valdeira e Alves deMatos, 1981) e o mecanismo de acção proposto por

esta droga parece ter certas semelhanças com a acti-vidade da Ribavirina, portanto é possível propor umamesma explicação para o efeito ultrastrutural desteinibidor nas células infectadas com o VPSA.

Os resultados apresentados podem servir de basepara estudos mais completos relativamente a estadroga no ciclo replicativo do VPSA, visto que está aser usada no tratamento de várias infecções virais,nomeadamente nos doentes infectados com o HIV-1(Bernier et al., 1997; Puoti et al., 2001) e com outrosvírus como já foi referido na introdução.

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