CINETICA DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA Y EFECTO DE LA TEMPERATURA EN EL PROCESO DE ELABORACION DE ALCOHOL

Laboratorio de alimentos fermentados

Profesora: Elvia Hernndez Hernndez

Equipo 2Contreras Rizo Gustavo

Duran Espinosa Sandra ErandiLino Len Cipactli

Martnez Cruz Mara Guadalupe Morales Carrillo Violeta

RESUMEN: En esta prctica evaluamos el efecto de la temperatura en la fermentacin alcohlica para esto utilizamos como inoculo la levadura Saccharomyces cerevisiae. Y un medio de cultivo a base de glucosa con pH 4.5 esto se coloco en un fermentador que se esterilizo a 121 C durante 15 minutos al igual que los medios y se les realizo una prueba de esterilidad para evitar cualquier contaminacin y que esto alterara nuestros resultados dando negativa esta prueba se procedido a colocar el medio con el inoculo en condiciones estriles en el fermentador.

Se coloco el fermentador en un un bao mara con una temperatura de 30 que fue a la que le toco trabajar a nuestro equipo pero a otros equipos les asignaron otra temperatura que son las dos que comnmente se ocupan en la produccin de etanol a nivel industrial para producir bebidas alcohlicas

La fermentacin se llevo a cabo por 72 horas a partir del tiempo cero se empezaron a tomar muestras cada 24h, a las cuales se les realizo pruebas con el fin de conocer la concentracin de levaduras, de etanol y azucares reductores.

INTRODUCCION:La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricacin de pan, cerveza y vino. El ciclo de vida de las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemacin. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en la clula formndose un asca que contiene cuatro ascosporas haploides. S. cerevisiae es uno de los modelos ms adecuados para el estudio de problemas biolgicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad slo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas tcnicas. Adems de su rpido crecimiento, la dispersin de las clulas y la facilidad con que se replican cultivos y aslan mutantes, destaca por un sencillo y verstil sistema de transformacin de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulacin con las mnimas precauciones. S. cerevisiae es un sistema gentico que, a diferencia de la mayora de los otros microorganismos, presenta dos fases biolgicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementacin. Las utilidades industriales ms importantes de esta levadura son la produccin de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dixido de carbono y etanol durante el proceso de fermentacin. Bsicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metablicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energtico, y por tanto no realiza la fermentacin. Desde el punto de vista cientfico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la clula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de divisin celular (aproximadamente dos horas). Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varan desde los carbohidratos hasta los aminocidos. Entre los azcares que puede utilizar estn monosacridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre

otros. Tambin son capaces de utilizar disacridos como la maltosa y la sacarosa y trisacridos como la rafinosa. Uno de los azcares que no puede metabolizar es la lactosa. (es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae)

La fermentacin alcohlica (denominada tambin como fermentacin del etanol o incluso fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya frmula qumica es: CH3-CH2-OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, etc.[] Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible.[][] La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentacin.[] Una de las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico.

SABOURAUD- AGAR.

Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y conservacin de hongos patgenos y saprfitos. Tambin es til para el cultivo de levaduras.

Fundamento:Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutneas (piel, pelo, etc.). En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH cido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias.Adems, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento.

DETERMINACION POR GRADO ALCOHOLICO

El dicromato de potasio oxida al etanol a cido actico, este procedimiento es de gran utilidad. El producto de la oxidacin del etanol con dicromato de potasio, en presencia de cido sulfrico, es el acido actico:

2Cr2O7 + 3C2H5OH + 16H 4Cr + 3 CH3COOH + 11 H2O

Para oxidar completamente el etanol a cido actico se requiere una adecuada concentracin de iones hidrgeno. Si sta no es suficiente, el alcohol se oxida a acetaldehdo o una mezcla de acetaldehdo y cido actico. El dicromato en exceso se determina reduciendo con una disolucin valorada de sulfato ferroso amoniacal:

Cr2O7 + 6 Fe + 14 H 2CR + 6 Fe + 7 H2O

El punto final de la valoracin no es muy definido visualmente por lo que se utiliza la 1,10ofenantrolina, como indicador redox.

DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES

Fundamento: El acido 3,5 dinitrosalicilico en presencia de calor reduce el cido 3-amino-5 nitrosalicilico por los azucares reductores presentes, desarrollndose un color amarillo caf el cual es estable hasta por 24 horas. La lectura se realiza a 575 nm. Este mtodo permite medir las unidades reductoras presentes en los azucares.(Miller) Los azcares reductores pueden reducir al cido 3,5dinitrosaliclico (DNS) bajo determinadas condiciones. Preparar el reactivo DNS: 100ml de solucin DNS 2mM en NaOH 0,2N y 250ml de solucin de tartrato de sodio y potasio 4hidrato 2,12M. Mezclar ambas soluciones y se llevar a 500ml.Si la muestra contiene protenas stas pueden producir falsos negativos, para evitarlos desproteinizar 5ml de leche aadiendo 1 ml de cido actico 1N; centrifugar a 4.000 x g durante 10 minutos. Si en la muestra es posible la presencia de di, tri o polisacridos con ms de un componente reductor, neutralizar con NaOH 1N para evitar una posterior hidrlisis cida (se sobre estimara la cantidad del sacrido).Aadir 4,475ml de agua destilada y 25ml de muestra 500l de reactivo DNS. Mantener la mezcla en bao de agua hirviendo durante 5 minutos y medir a continuacin absorbancia a 540nm, interpolando el valor obtenido con los valores calculados para soluciones de sacrido de concentracin conocida.

AZUL DE METILENO AL 0.5 % (Conteo diferencial de levaduras).

Las coloraciones de acuerdo a la complejidad se subdividen en 2 tipos que son la TINCIN SIMPLE y la TINCIN DIFERENCIAL.

TINCION SIMPLE se emplea un solo colorante, que puede ser azul de metileno, cristal violeta o carbol fucsina. Y en ella la clula se tie uniformemente (aunque en algunos casos puede distinguirse grnulos en el interior de la clula teidos con mayor intensidad, lo que indica la presencia de entidades qumicas activas).Con este tipo de tincin se crea un contraste con el medio donde se est haciendo el frotis o tincin y se puede observar la morfologa y la disposicin bacteriana. La importancia est en que es muy fcil de aplicar.

Un ejemplo de uso de tincin simple es cuando se utiliza azul de metileno de esta forma se pueden ver levaduras y diferenciar las vivas de las muertas. Las levaduras muertas se tien en su interior y se ven del mismo color del tinte que se aplico, debido a los enlaces que forma el azul de metileno (base) con las cargas que estn dentro de la clula como protenas. Las levaduras vivas no se tien por dentro debido a los enlaces que forma el colorante con la membrana celular y de esta manera no entra el colorante al interior de la clula.

OBJETIVOS:

Analizar el efecto de la temperatura en la fermentacin de un mosto con Saccharomyces Serevisiae

Estudiar los factores que intervienen en una fermentacin alcohlica Observar cmo influye el O2 en la produccin de Biomasa

RESULTADOS:Cuadro 1. Condiciones de cultivo

Tiempo horas

Contenido alcohlico (mL de sulfato ferroso

Alcuota grado alcohlico

Azucares reductores (absorbancia)

Diluciones

Levaduras viables (#)

Levaduras no viables(#)

Levaduras totales (#)

Dilucin

O 59.2 5 mL 0.244 (2/100)(2/12)

3.48x1010

4.8x109 3.96x1010

(1/5)(1/2)

24 18.2 3 mL 0.1955 (2/100)(2/10)

9x1010 5x109 9.5x1010

(1/10)(1/2)

48 8 3 mL 0.1805 (2/100)(2/6)

1.5x1011

1.5x1010

1.5x1011

(1/15)(1/2)

72 0 3 mL 0.075 1/100 1.6x1011

1.74x1011

1.74x1011

(1/20)(1/2)

Ecuacin de la recta: Y=6.583x10-4X-0.0494r2=0.99

Despejando la ecuacin de la recta para calcular las concentraciones de azcares en el mosto de acuerdo a la absorbancia.

X=Y+0.04946.583x10-4Para obtener los valores de Azucares reductores (% p/v), sustituimos los valores de Y en la ecuacin anterior, el resultado se multiplica por el factor de dilucin, se pasa a gramos y se obtiene el promedio. X=0.244+0.04946.583x10-4=445.69g/mL(300)1000000=0.13370x100=13.37%

X=0.1955+0.04946.583x10-4=372.01 g/mL(250)1000000=0.93002x100=9.30%

X=0.1805+0.04946.583x10-4=349.23 g/mL(150)1000000=0.52384x100=5.23%

Concentracin de Glucosa (g/mL)

Absorbancia 540 nm

0 0300 0.091600 0.334900 0.541200 0.763

X=0.075+0.04946.583x10-4=188.97g/mL(100)1000000=0.01889x100=1.88%

Para obtener el Contenido alcohlico (% v/v) utilizamos la siguiente formula

Contenido alcohlico=(25-(2518.2mL57.93mL=5.71%

Contenido alcohlico=(25-(258.2mL57.93mL=7.15%

Contenido alcohlico=(25-(250mL57.93mL=8.33%

GRFICAS:

Grafica 1. Por cultivo a 30C

Grafica 1a. Por cultivo 24C

DISCUSIN:

De acuerdo al cuadro 1 observamos que hubo crecimiento de Saccharomyces cerevisiae debido a que la cuenta de levadura tiende a aumentar conforme pasa el tiempo, de tal forma que las 24 horas de incubacin ya se encuentra en la fase exponencial y para las 72 horas empieza la fase estacionaria, esto se debe a que la temperatura ptima es de 30C para el crecimiento de sta levadura.

Si observamos la figura 1 se aprecia en la curva de crecimiento un aumento de la concentracin de biomasa, tambin encontramos la fase exponencial que es de gran importancia, debido a que en esta se forma etanol que es un metabolito primario; la curva de contenido de azcares decrece debido a que la levadura la utiliza para la produccin de etanol, por tal motivo el contenido de etanol va en aumento.

En la figura 2 tenemos el crecimiento microbiano a dos temperaturas de acuerdo a la bibliografa la temperatura ptima de crecimiento para Saccharomyces cerevisiae es de 30C por sta razon a la temperatura de 24C el crecimiento es lento y se observa con mayor amplitud la fase de latencia, mientras que a la temperatura de 30C su crecimiento es ms rpido y llega antes a la fase exponencial.

En la figura 4 observamos que la concentracin de azcares conforme pasa el tiempo disminuye debido a que la poblacin de levaduras va en aumento y el consumo del sustrato (azcares) es mayor, principalmente a la temperatura de 30C. Para la temperatura de 24C hay una disminucin de la concentracin de azcares sin embargo no se nota tan pronunciada porque esos resultados estn mal calculados; corrigindolos se obtiene la figura 4a en donde tambin se aprecia la disminucin de la concentracin de azcares y observamos que no hay gran diferencia en la produccin de azcares reductores a diferentes temperaturas.

Grfica 3 tenemos el contenido alcohlico para la temperatura de 30C que va en aumento conforme pasa el tiempo debido a que tenemos una fase exponencial en el crecimiento y es ah en donde se forman los metabolitos primarios, en este caso el etanol para la temperatura de 24C los resultados varan demasiado, obteniendo una curva que disminuye con respecto al tiempo, esto podra significar una titulacin inadecuada una mala manipulacin de la muestra, o simplemente un descuido para hacer los clculos por parte del equipo 3, con quines comparamos resultados.

CONCLUSIN:

Se analizo que en efecto, la temperatura influye en el rendimiento y en la velocidad con la que se produce etanol. Se trabajo con 24C y 30C, la temperatura optima de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae es de 30C y 40C para su mxima produccin de etanol.

Se estudio que la produccin de etanol en una fermentacin depende del inoculo, de la composicin del medio de cultivo, de las condiciones ambientales, del crecimiento microbiano, etc.

En esta prctica se analiz lo importante que es controlar los factores como temperatura, pH, agitacin, cantidad de oxigeno, concentracin de sustrato y la adicin de micronutrientes al medio; ya que al variar alguno de estos factores el resultado podra no ser el deseado.

Segn los resultados obtenidos durante la prctica, la fermentacin alcohlica puede realizarse en las siguientes condiciones: Temperatura: 30C, pH: 4.5 en ausencia de oxgeno, dado que bajo estas condiciones se obtuvo un mayor rendimiento, lo cual es coherente ya que la literatura reporta que una fermentacin alcohlica debe realizarse a un pH entre 3.5-5.5 y una temperatura de 30C ya que es la temperatura optima de Saccharomyces cerevisiae.

Una fermentacin alcohlica debe llevarse a cabo en condiciones aspticas para evitar el crecimiento de microorganismos indeseables y que se desarrolle el proceso en excelentes condiciones. Adems de tener mucho cuidado durante la fermentacin, tambin se debe tener cuidado al determinar azucares, alcohol, levaduras viables y no viables ya que estas determinaciones son la prueba de que la fermentacin se llevo a cabo correctamente.La fermentacin alcohlica es de suma importancia a nivel industrial tanto en bebidas alcohlicas como en la produccin de biocombustibles.

REFERENCIAS:

(es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae)http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/sabouraudgluagar.htm

ANEXOS:

Imgenes (Izq y Der.)

Fermentador al tiempo cero; el

medio de cultivo muestra poca

turbidez y ausencia de

Imgenes: Fermentador despus de

24h (Der) y 48h (Izq); el medio

de cultivo muestra ms

turbidez y abundancia de

espuma (produccin de CO2) conforme transcurre el

tiempo.

Observacin al microscopio de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Determinacin de azcares reductores: Dilucin de acuerdo al cuadro de la preparacin de las

Determinacin de azcares reductores: Duplicado de la dilucin de acuerdo al cuadro de la preparacin de las muestras de

Determinacin del grado alcohlico por oxidacin de dicromato.

Color verde botella, luego aadir la solucin de sulfato ferroso amoniacal.

Determinacin del grado alcohlico por oxidacin de dicromato. Esta toma fu hecha con ms exposicin a la luz.