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EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO
MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida
DIEGO ARMANDO CASTILLO FRANCO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
São Paulo, SP, Brasil
Noviembre de 2008
EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO
MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida
DIEGO ARMANDO CASTILLO FRANCO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
São Paulo, SP, Brasil
Noviembre de 2008
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO
MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida
DIEGO ARMANDO CASTILLO FRANCO
Prof. Dr. José Gregorio Cabrera Gómez
Biólogo , Ph.D.
Director
Dr. Rafael Costa Santos Rocha Dra Sonia Regina Silva Queiroz
Biólogo, Ph.D. Ing. Química, Ph.D.
Jurado Jurado
EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO
MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida
DIEGO ARMANDO CASTILLO FRANCO
APROBADO
Dra. INGRID SCHULER, Ph.D JANETH ARIAS
Decana académica Bacterióloga, M.Sc
Facultad de Ciencias Directora de Carrera
A mi Mamá, a mi Hermana y a Lina
vii
AGRADECIMIENTOS
A mi mamá sencillamente por todo. Sin ella nada de esto hubiera sido posible
Al profesor Dr. José Gregorio Cabrera Gómez por permitirme trabajar en su
laboratorio y desarrollar este trabajo.
A la Dra. Sonia Regina Silva Queiroz por todas sus enseñanzas, consejos y
orientaciones durante este trabajo
A la profesora Dra. Luiziana Ferreira da Silva por haberme permitido usar las
instalaciones de su laboratorio para desarrollar parte de este trabajo.
A Nuri Merchán por su apoyo, enseñanza y sobre todo, su amistad.
A todos los compañeros y amigos de laboratorio: Marco, Rafael, Rogerio, Daniela,
Sayuri, Thatiane, Karen, Renata, los cuales siempre estaban dispuestos a ayudar y
dar una mano.
Al personal del laboratorio de genética de microorganismos: Juan, Eric, Fabiana,
Karen y Marcia por la ayuda prestada.
A todas las personas que de una u otra manera hicieron parte colaborando con este
trabajo
viii
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS .................................................................................................... x
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ xi
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................. xiii
RESUMEN ................................................................................................................. xv
1. INTRODUCCION .................................................................................................. 16
2. REVISION BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 18
2.1. Biopolímeros ............................................................................................................... 18
2.2 Polihidroxialcanoatos ................................................................................................... 19
2.2.1 Historia y Producción ............................................................................................ 20
2.2.2. Características químicas y físicas ......................................................................... 22
2.2.3. Aplicaciones ......................................................................................................... 24
2.3 Síntesis de PHA ............................................................................................................ 25
2.3.1 Síntesis de PHASCL ................................................................................................ 26
2.4 Detección y cuantificación de PHA ............................................................................ 28
2.5. Metabolismo de Ácidos Grasos ................................................................................... 29
2.5.1. β-Oxidación de ácidos grasos ............................................................................... 30
2.5.2. Ácidos grasos insaturados .................................................................................... 32
2.6. Pseudomonas spp. ....................................................................................................... 33
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION ................................. 35
4. OBJETIVOS ........................................................................................................... 37
4.1. Objetivo General ......................................................................................................... 37
4.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 37
5. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 38
5.1 Microorganismos y Plásmidos ..................................................................................... 38
5.2 Medios de cultivo ......................................................................................................... 38
5.3.1Medio LB (Luria-Bertani) ...................................................................................... 39
Las siguientes denominaciones fueron dadas a los diferentes medios LB con diferentes
antibióticos: .................................................................................................................... 39
5.2.2 Medio Mineral ....................................................................................................... 39
ix
5.3. Condiciones de cultivo ................................................................................................ 40
5.4 Manipulación de ADN ................................................................................................. 41
5.4.1 Extracción de ADN plasmídico ............................................................................. 41
5.4.2 Digestión de ADN con enzimas de restricción ...................................................... 42
5.4.3 Ligación de ADN .................................................................................................. 42
5.4.4 Preparación de células competentes ...................................................................... 42
5.4.5 Transformación Bacteriana ................................................................................... 42
5.4.6 Electroforesis en gel de agarosa ............................................................................ 43
5.4.7 Purificacion de ADN a partir del gel de agarosa ................................................... 43
5.5 Construcción del plásmido por inserción del fragmento purificado a partir del gel de
agarosa ................................................................................................................................ 43
5.6 Complementación ......................................................................................................... 43
5.7 Ensayos de acumulación de polímero a partir de ácido linoléico................................. 44
5.7.1 Determinación de Masa seca celular (MSC) ......................................................... 44
5.7.2 pH .......................................................................................................................... 45
5.7.3 Cantidad y composición de PHA .......................................................................... 45
6. RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................ 47
6.1 Evaluación en la producción de PHA por mutantes deficientes en la utilización de
ácidos grasos insaturados ................................................................................................... 47
6.2 Clonación del gen fadH1 en pBBR1MCS-5 ................................................................ 48
6.3 Complementación de Pseudomonas putida IPT 046 y los mutantes deficientes en
crecimiento en ácido 4-pentenoico con el gen fadH1. ....................................................... 53
7. CONCLUSIONES .................................................................................................. 60
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 61
9. ANEXOS ................................................................................................................ 70
x
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Compañías involucradas en la investigación y producción de PHA en
el mundo 21
Tabla 2. Propiedades Físicas de PHA y PP 24
Tabla 3. Principales Características metabólicas de Pseudomonas sp. 30
Tabla 4. Microorganismos Utilizados 39
Tabla 5. Plásmidos utilizados 40
Tabla 6. Antibióticos y concentraciones utilizadas 41
Tabla 7. Composición monomérica de PHA acumulados por P. putida IPT046,
AG46, BJ5, CF12, CN25 Y DU54, cultivadas en ácido linoléico 48
Tabla 8. Perfil de crecimiento de IPT 046 y los mutantes frente a las cepas
complementadas con pBBR::fadH1 en MMGGm, MMV y MM4P 52
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Microfotografía electrónica de P. putida con gránulos de PHA 11
Figura 2. Estructura General de los Polihidroxialcanoatos 14
Figura 3. Síntesis de PHB. 17
Figura 4. Vías metabólicas propuestas a partir de diferentes sustratos 19
Figura 5. Ruta metabólica de Biosíntesis de PHA a partir de Ácidos Grasos 20
Figura 6. Hidrolisis de Triglicéridos 21
Figura 7. Modelo de β-Oxidación de Ácidos Grasos 22
Figura 8. Regiones del genoma de diferentes subespecies Pseudomonas putida
donde se encuetra el gen fadH1
Figura 9 Secuencia de la región del amplicón conteniendo el gen fadH1.
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2. pGEM; 3.
pBBR1MCS-5::fadH1 digerido con ApaI; 4. pGEM:fadH1; 5.
pGEM::fadH1 digerido con ApaI 51
Figura 11. Cajas con LBGm, IPTG y X-Gal mostrando colonias transformadas
posiblemente con pBBR1MCS-5::fadH1 51
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2-11. ADN plasmidial
digerido con ApaI 52
Figura 13. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “1” 53
Figura 14. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “2” 54
Figura 15. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “3” 55
Figura 16. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “4” 56
xii
Figura 17. Evaluación de crecimiento de los mutantes complementados en
MM4PGm 56
Figura 18. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y
mutantes complementados. 57
Figura 19. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y
mutantes complementados 58
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
µL microlitro
3HD 3- Hidroxidecanoato
3HDd 3-Hidroxidodecanoato
3HDd∆6 3-Hidroxidodecanoato con insaturación en C
6
3HHx 3-Hidroxihexanoato
3HO 3-Hidroxioctanoato
ADN Ácido desoxirribonucleico (DNA)
CoA Coenzima A
fad fatty acid degradation
IPTG (isopropil-tio-β-D-galactósido)
Gm Gentamicina
Kb Kilopares de bases
kDa kilodalton
LB Luria-Bertani
LBA Luria-Bertani con Ampicilina
LBGm Luria-Bertani con Gentamicina
LBK Luria-Bertani con Kanamicina
mM milimolar
Min minutos
mL mililitro
xiv
MM medio mineral
MM4P medio mineral con ácido 4-pentenóico
MM4PGm medio mineral con ácido 4-pentenóico y gentamicina
MMG medio mineral con glucosa
MMGGm medio mineral con glucosa y gentamicina
MML medio mineral con ácido linoléico
MMV medio mineral con ácido valérico
MSC masa seca celular
NADH Nicotinamida adenina dinucleotido- Forma reducida
P3HB Poli-3-Hidroxibutirato (PHB)
P3HV Poli-3-Hidroxivalerato
P3HB-co-3HV Poli-3-Hidroxibutirato-co-hidroxivalerato
PHA Polihidroxialcanoatos
PHPE Polihidroxipentanoato
PHASCL Polihidroxialcanoatos de cadena corta
PHAMCL Polihidroxialcanoatos de cadena media
PP polipropileno
Rpm revoluciones por minuto
SS solución salina 0.085% (m/v)
X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido)
xv
RESUMEN
La producción de polihidroxialcanoatos conteniendo monómeros insaturados fue
evaluada en Pseudomonas putida IPT 046 y en mutantes mini-Tn5 deficientes en
crecimiento en ácido 4-Pentenóico. El mutante BJ5 presento un porcentaje mayor de
incorporación del monómero insaturado HHd∆6 en comparación a la cepa salvaje.
Mediante la inserción del gen fadH1 (codificador de 2,4-dienoil CoA reductasa) en el
plásmido pBBR1MCS-5 fue posible complementar a los mutantes con este gen el
cual probablemente esta afectados. 5 mutantes que estaban afectados parcialmente en
el crecimiento en ácido 4-pentenóico, restablecieron este fenotipo después de haber
sido complementados con el gen fadH1. Los mutantes que presentaron mayor
incorporación de HHd∆6, no restablecieron el fenotipo de crecimiento en ácido 4-
pentenóico después de la conjugación con el plásmido cargando el gen fadH1, lo que
sugiere la existencia de más genes involucrados en el metabolismo de ácidos grasos
con insaturaciones que se extienden de carbono par hacia impar.
Palabras clave: Polihidroxialcanoatos, Pseudomonas, ácidos grasos insaturados,
fadH1
16
1. INTRODUCCION
Los plásticos de origen petroquímico son ampliamente utilizados debido a su fácil
moldeamiento y alta resistencia química, pero son un problema ambiental, debido a
su alto peso y conformación molecular, la acción de los microorganismos en los
procesos degradadores es mínima, por lo cual permanecen en el ambiente durante
amplios periodos de tiempo.
Las medidas que se han adoptado para solucionar el problema de acumulación de
basuras plásticas engloba desde el reciclaje hasta la incineración de las mismas, las
cuales no son soluciones muy viables debido a que los procesos son costosos, no
abarcan todos los desechos y generan emanaciones gaseosas nocivas para el
ambiente, las cuales en los últimos años están siendo mas restringidas por las nuevas
legislaciones medioambientales.
La sobrepoblación humana, combinado con el actual estilo de vida exige el uso
racional, eficiente y auto sostenible de fuentes naturales para producir sustancias
amigables para el medio ambiente como los Polihidroxialcanoatos (PHA).
Los polihidroxialcanoatos (PHA) constituyen una familia de poliésteres acumulados
intracelularmente, en forma de gránulos, los cuales representan una alternativa
biotecnología para la producción de plásticos biodegradables y biocompatibles.
Los PHA poseen una amplia gama de propiedades que permiten su aplicación en
diversas áreas. Son termoplásticos, insolubles en agua, no tóxicos, biocompatibles y
biodegradables. Estos poliésteres son una alternativa ecológica a los plásticos
derivados del petróleo.
Estos polímeros son clasificados en dos grandes grupos dependiendo de su
conformación: PHASCL (short chain length), los cuales están constituidos por
monómeros de 3 a 5 carbonos; y PHAMCL (médium chain length) que de 6 hasta 16
carbonos.
17
La posibilidad de usar diferentes sustratos renovables para la producción de PHA
hace más atractivo el proceso, ya que dentro de las grandes posibilidades se
encuentran el uso de carbohidratos, pasando por alcoholes, hasta aceites vegetales,
los cuales están constituidos por triglicéridos y radicales con cadenas de ácidos
grasos saturados e insaturados.
Dentro de los diferentes PHA producidos, el primero en ser descubierto y
caracterizado fue el poli-3hidroxibutirato (P3HB), siendo objeto de varios estudios
los cuales revelaron, entre otros resultados, una gran diversidad de microorganismos
producen este polímero de características cristalinas y pertenecientes al grupo de
PHASCL..
Los PHAMCL son poliésteres que presentan propiedades elastioméricas. Son
producidos por diferentes especies de Pseudomonas y presentan características
diferentes al P3HB y a sus copolímeros, los cuales son cristalinos. Es por esto que
los PHAMCL son necesarios para cubrir las necesidades que el P3HB y sus
copolímeros no abarcan.
Para la producción sostenible de PHAMCL se buscan sustratos que cumplan con las
condiciones para la obtención del polímero, por lo cual, entre las mejores opciones,
está el uso de ácidos grasos derivados a partir de aceites vegetales, debido a que son
de bajo costo, son renovables y además, su constitución presenta insaturaciones, las
cuales sirven como precursores de monómeros insaturados para la incorporación al
polímero, modificando sus propiedades químicas y así proporcionarle características
propias que amplían su aplicación industrial. Además de eso, las insaturaciones
sirven como blanco para modificaciones químicas posteriores.
Este trabajo tiene como propósito evaluar la producción de PHAMCL conteniendo
monómeros insaturados por mutantes de P. putida IPT046 afectados en el
crecimiento en ácido 4-pentenóico.
18
2. REVISION BIBLIOGRÁFICA
2.1. Biopolímeros
Una amplia variedad de polímeros son sintetizados a partir de materia viva,
productos agrícolas y de procesos biotecnológicos Dependiendo de su estructura
química, estos polímeros se clasifican en: ácidos nucléicos, poliamidas,
polisacáridos, poliésteres, politioésteres, polianhídridos, poli-isoprenoides y
polifenoles (STEINBÜCHEL, 2001).
Los bioplásticos son poliésteres producidos por una amplia variedad de
microorganismos, cultivados bajo unas condiciones específicas (MADISON &
HUISMAN, 1999). Las propiedades físico-químicas de estos materiales dependen
del microorganismo productor y del sustrato suministrado (HA & CHO, 2002).
Además de su obtención natural, los bioplásticos son de gran importancia gracias a
su biodegradabilidad, la cual es debida al metabolismo de organismos presentes en
la naturaleza, que transforman los materiales poliméricos en compuestos de bajo
peso molecular como CO2 y H2O.
Los plásticos biodegradables son clasificados en 3 grandes grupos:
Polímeros químicamente sintetizados: son susceptibles a la acción de
microorganismos y no pueden ser usados con fines comerciales debido a su
alta tasa biodegradativa y propiedades físicas. Ej.: Ácido poliglicólico, poli
(e-caprolactona), alcohol polivinílico, etc. (KHANNA & SIVRASTAVA,
2004).
Plásticos biodegradables a base de almidón: en este tipo de plástico, el
almidón actúa como complemento y a la vez sirve como relleno y agente
adherente para crear una mezcla entre almidón y plástico (almidón-
polietileno). Las bacterias del suelo degradan el almidón y también alteran la
matriz del plástico, aumentando la biodegradabilidad pero generando nuevos
19
compuestos recalcitrantes que quedarán en el ambiente durante largos
periodos de tiempo (KHANNA & SIVRASTAVA, 2004).
Polihidroxialcanoatos: Son los únicos polímeros 100% biodegradables
(KHANNA & SIVRASTAVA, 2004).
2.2 Polihidroxialcanoatos
Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son una familia de poliésteres compuestos
principalmente de ácidos R-3 hidroxialcanoicos acumulados en forma de gránulos
intracelulares, que pueden representar hasta el 80% de la masa seca celular (Fig. 1),
los cuales sirven como fuente de carbono, energía y equivalentes reductores.
(MADISON & HUISMAN, 1999) Son producidos bajo condiciones desbalanceadas
de cultivo, es decir, con exceso en la fuente de carbono y limitación en los elementos
esenciales (N, S, O, P, Mg) (ANDERSON & DAWES, 1990).
1µm
Figura 1. Microfotografía electrónica de P. putida con gránulos de PHA (Luengo et al. 2003)
La acumulación de este polímero se puede considerar una estrategia desarrollada por
las bacterias para su supervivencia en ambientes cambiantes. Además de servirle a la
célula como fuente de carbono, los PHA también sirven como fuente de energía para
20
el proceso de enquistamiento (Azotobacter sp.) y de esporulación (Bacillus sp.), para
la protección de complejo nitrogenasa en las bacterias fijadoras de nitrógeno, ya que
el PHA actúa como compuesto oxidable y también es constituyente de la membrana
citoplasmática de bacterias (ALMEIDA et al., 2004; ANDERSON & DAWES,
1990, FILIPOV, 2000).
Los PHA pueden ser clasificados en dos grandes grupos: (i) de cadena corta (HASCL-
“HydroxyAcids of Short-Chain-Length”), teniendo de 3 a 5 átomos de carbono en la
cadena principal, y (ii) de cadena media (HAMCL-“HydroxyAcids of Medium-Chain-
Length”) teniendo de 6 a 16 átomos de carbono en la cadena principal
(STEINBÜCHEL & VALENTIN, 1995).
2.2.1 Historia y Producción
El primer hidroxialcanoato en ser estudiado fue el poli 3-hidroxibutirato (P3HB), el
cual fue descubierto por Lemoigne en 1926 (LEMOIGNE, 1926). En 1964 se
identifico El ácido 3-hidroxi-2-butenóico producido por una bactéria del género
Nocardia (ANDERSON & DAWES, 1990). En 1972, a partir de estudios en aguas
residuales, se confirmó la presencia de otras sustancias como los ácidos 3-
hidroxivalérico (3HV), 3-hidroxihexanóico (3HHx) y 3-hidroxiheptanóico (3HHep)
mediante la extracción con cloroformo (WALLEN y ROHDWEDDER, 1974). En
1976, la empresa inglesa Imperial Chemical industries (ICI) empezó estudios para
producir polihidroxibutirato (P3HB) a partir de Ralstonia eutropha, depositando en
1981, una patente para la producción del copolímero P (3HB-co-3HV). Este
copolímero es conocido como BIOPOL® y es obtenido a partir de glucosa y ácido
propiónico (BYROM, 1990). Cargill Dow Polymers comercializa sus resinas
“EcoPla” in Japón. Algunas de las marcas que están en el mercado actualmente son
NODAXTM
(Copolímero de hidroxibutirato e hidroxihexanoato) y BIOCYCLETM
(homopolímero de hidroxibutirato, copolímero de hidroxibutirato e hidroxivalerato)
producido por la empresa brasilera PHB Industrial S.A. desde el año 2000, con una
capacidad inicial de producción de 50 toneladas por año, la cual se encuentra en fase
de ampliación (NONATO et. al., 2001) (LEMOS et. al., 2006).
21
La empresa estadounidense Procter & Gamble desarrolló y comercializó en 2004, un
copolímero de P3HB y 3HA con radicales laterales con más de 3 carbonos utilizando
microorganismos genéticamente modificados (NODA et al. 2004).
Debido a su crecimiento económico y demográfico en la segunda mitad del siglo
XX, China se ha convertido en una de los países que más produce y a su vez,
consume plásticos en el mundo (Tabla 1). En este país asiático se están desarrollando
varias investigaciones para la obtención de PHA, contando con el 50% de las
empresas a nivel mundial que producen este biopolímero (CHEN, 2008).
Tabla 1. Compañias involucradas en la investigación y producción de PHA en el mundo (CHEN, 2008)
Compañia Clases de PHA Escala (ton/año) Periodo
ICI, UK PHBV 300 1980 hasta 1990
Chemie Linz, Austria PHB 20-100 1980s
BTF, Austria PHB 20-100 1990s
Biomers, Alemania PHB Desconocido 1990s - presente
BASF, Alemania PHB, PHBV Escala piloto 1980s - presente
Metabolix, USA Desconocido Desconocido 1980s - presente
Tepha, USA Desconocido PHA como Bio-
Implantes
1990s - presente
ADM, USA (con Metabolix) Desconocido 50,000 2005 - presente
P&G, USA PHBHHx Hecho por encargo 1980s - presente
Monsanto, USA PHB, PHBV Planta de producción
de PHA
1990s
Kaneka, Japón (with P&G) PHBHHx Desconocido 1990s - presente
Mitsubishi, Japón PHB 10 1990s
Biocycles, Brasil PHB 100 1990s - presente
22
DSM, Holanda Desconocido Desconocido 2006-Presente
Zhejiang TianAn, China PHBV 1000 1990s - presente
Beijing TianZhu Biomaterials, China PHBHHx PHA como Bio-
Implantes
2003 - presente
Jiangmen Biotech Ctr, China PHBHHx Desconocido 1990s
Tianjin Northern Food, China PHB Escala piloto 1990s
Shantou Lianyi Biotech, China PHB Escala piloto 1990s to 2005
Jiangsu Nan Tian Group, China PHB Escala piloto 1990s - presente
Shenzhen O’Bioer, China P(3HB-co-4HB) Desconocido 2004 - presente
Tianjin Guo Yun, China P(3HB-co-4HB) Escala piloto 2004 - presente
Shandong Lukang, China PHAMCL Escala piloto 2005 - presente
Shijiazhuang Pharma Group, China Desconocido Desconocido 2006-Presente
2.2.2. Características químicas y físicas
Como se mencionó anteriormente, los PHA son poliésteres compuestos por
monómeros de (R)-3-hidroxiácidos, generalmente lineales, en los cuales, el grupo
carboxilo forma un enlace éster con el grupo hidroxilo con del monómero siguiente.
(MADISON & HUISMAN, 1999) (Fig. 2).
Hasta el momento se han identificado más de 150 ácidos hidroxialcanoicos,
saturados, insaturados, halógenos, aromáticos, etc. (STEINBUCHEL & VALENTIN,
1995) los cuales son incorporados a la cadena lateral del PHA y a su vez cambian sus
propiedades físicas, llevándolas a ser usadas en nuevas aplicaciones tecnológicas.
Esta variabilidad depende del tipo de sustrato que se suministra, especificidad en la
polimerización y las diferentes rutas metabólicas que conllevan la formación de los
monómeros (MADISON & HUISMAN, 1999) (SILVA-QUEIROZ, 2007).
23
Figura 2 Estructura General de los Polihidroxialcanoatos (LEE, 1996)
La masa molecular de los PHA es del orden de 50kDa hasta 100kDa, esto depende
de la naturaleza del polímero (MADISON & HUISMAN, 1999). Intracelularmente,
el P3HB, existe en unos estados líquidos y amorfos, mientras que, después de su
extracción mediante el uso de solventes orgánicos, éste pasa a un estado cristalino,
confiriéndole características rígidas, pero a su vez quebradizo. Su punto de fusión es
relativamente alto (180° C), pero cerca del punto de degradación térmica (200° C)
(KIM & LENZ, 2001).
Debido a su conformación estructural, los PHASCL y PHAMCL, difieren en sus
características termoplásticas y elastioméricas. Los PHASCL son catalogados como
termoplásticos, mientras que los PHAMCL, por tener menor cristalinidad y puntos de
fusión menores son reconocidos como elastómeros (POIRIER et al., 2001). Los
24
PHAMCL tienen un alongamiento para ruptura mayor que 100%, mientras que los
PHASCL poseen un alongamiento para ruptura menor que 5%; la incorporación de
unidades de 3HV al P3HB permite aumentar la maleabilidad y resistencia,
alcanzándose valores de alongamiento para ruptura cerca de 50% (SUDESH et al.,
2000).
Tabla 2 Propiedades físicas de PHA y PP. Modificado de REHM, 2007. Tg(Temperatura de transición
vítrea) Tm( Temperatura de cristalización)
Propiedades PHAMCL PHASCL PP
Tm (°C) 177 61 176
Tg (°C) 2 -36 -10
Cristalinidad (%) 70 30 60
Elongación (%) 5 300 400
Las características del medio ambiente también repercuten en la producción de los
biopolímeros. Varios estudios han demostrado la influencia que tienen los campos
magnéticos en el rendimiento productivo de los microorganismos (ZHI-YONG et al.,
2007; TAKEHIRO et al., 2003). CHEN & LI (2008) determinaron que
definitivamente existe una influencia de los campos magnéticos estáticos en la
producción de PHB.
2.2.3. Aplicaciones
El mercado de los PHA se puede clasificar en dos grandes grupos: (i) Envases
desechables biodegradables, con un mayor volumen de demanda, debido a que son
producidos bajo formas predeterminadas, pero en donde los productos petroquímicos
tienen ventaja debido a su excelente procesabilidad y bajo costo de producción. En
este grupo, el objetivo fundamental es crear un mercado “ecológico” donde su
biodegradabilidad le confiera un valor agregado al producto terminado, ya que según
Nonato y colaboradores (2001), el PHB puede ser vendido a US$5.83 por Kilo,
siendo mucho más barato que el polímero producido por Biomol® cuyos precios
25
oscilan entre US$10-20 por kilo, dependiendo de la naturaleza de este. Algunos
productos comerciales fabricados a partir de PHA son botellas, recipientes para
cosméticos, bolígrafos, palos de golf, entre otros. (ii) Área farmacéutica, ya que
desde 1990, los PHA están siendo estudiados como posibles microencapsulados para
liberación controlada de medicamentos. Algunas sustancias de origen natural como
el colágeno ya fueron utilizadas para tratamiento de tejidos cardiacos afectados, pero
se observó una baja eficiencia en la reparación debido a que durante el
procedimiento quirúrgico, las partículas pueden migrar de lugar del implante antes
del crecimiento del nuevo tejido (GALEGO et al., 2000). En el campo de la
oncología, los PHA también están siendo evaluados en diferentes tratamientos, como
por ejemplo, el P3HB y el PHPE son utilizados como microesferas portadores de
NzPC, un colorante fotosensibilizador el cual es usado en terapia fotodinámica. (RÉ
et al., 2005). Diversas pruebas han sido realizadas y han mostrado que el P3HB es
biocompatible, debido a que R-3-Hidroxibutirato es un constituyente normal de la
sangre en concentraciones entre 0.3 y 1.3 mM, así mismo, estudios demuestran que
no existe alteración en los parámetros funcionales, bioquímicos y fisiológicos en los
pacientes, además de presentar propiedades mecánicas iguales o mejores que los
termoplásticos convencionales. Los PHAMCL, gracias a sus características
elastioméricas, poseen aplicaciones potenciales como precursores de moléculas con
propiedades anti-reumáticas, analgésicas, radiopotenciadores, anti-tumorales, además
en biopelículas médicas y dispositivos especiales como soporte de fármacos, nuevos
tipos de suturas, soporte regenerativo de tejidos vasculares, etc. (POUTON &
AKHTAR. 1996; ZINN et al. 2001; SANCHEZ et al. 2003; SHISHATSKAYA et al.
2001; LUENGO et al. 2003).
2.3 Síntesis de PHA
En diversos grupos de bacterias ha sido estudiada profundamente la biosíntesis de
PHA. Algunas rutas metabólicas han sido descritas especialmente para 4
microorganismos: Cupriavidus necator, Rhodospirillum rubrum, Pseudomonas
26
oleovorans y Pseudomonas aeruginosa. (STEINBÜCHEL, 1996; STEINBÜCHEL
& LÜTKE-EVERSLOH, 2003).
2.3.1 Síntesis de PHASCL
En Cupriavidus necator la formación de PHASCL, polímero con cadenas de hasta 5
carbonos, ocurre por la acción de 3 diferentes enzimas producidas a partir de genes
organizados en un operón conocido como phaCBA. Dos moléculas de Acetil-CoA
producidas a partir de la degradación de la fuente de carbono suministrada son
condensadas a acetoacil-CoA por la acción de la β-tiolasa (phaA). La molécula de
acetoacil-CoA es reducida en la posición 3 por la acetoacil-CoA reductasa NADH
dependiente (phaB), produciendo (R)-3-hidroxibutiril CoA. La reacción final
involucra la polimerización de dos moléculas de (R)-3- hidroxibutiril CoA mediante
la formación de un enlace éster gracias a la enzima PHB polimerasa (phaC) (Figura
3). Esta enzima es muy activa en monómeros que contienen menos de 5 átomos de
carbono. (STEINBÜCHEL, 1991; ZINN et al., 2001; SUDESH et al., 2000).
Figura 3. Síntesis de PHB. (1) β-Cetotiolasa (2) acetoacil CoA reductasa (3)PHB polimerasa
2.3.2. Síntesis de PHAMCL
Uno de los factores clave en la síntesis de PHAMCL es la enzima pha sintasa del
grupo II, producida por Pseudomonas, la cual es diferente a la pha sintasa producida
por C. necator en cuanto a la afinidad que tiene por sustratos que poseen de 6 a 16
átomos de carbono (AMARA & REHM, 2003).
27
Distintas vías metabólicas han sido propuestas para la biosíntesis de PHAMCL a partir
de diferentes tipos de sustrato (Figura 4).
A partir del metabolismo de carbohidratos, son producidas moléculas de acetil-CoA,
las cuales, vía malonil-CoA, son incorporadas a la biosíntesis de novo de ácidos
grasos, donde es generado el 3-hidroxiacil, el cual es transportado de la ACP (Acyl
carrier Protein) para la coenzima A (CoA) y ahí, es polimerizado por la acción de la
pha sintasa (REHM et al. 1999).
Figura 4. Vías metabólicas propuestas a partir de diferentes sustratos
(http://mbel.kaist.ac.kr/lab/index_en.html)
El metabolismo de los ácidos grasos (β-oxidación) es una de las vías más comunes
para producir PHA de cadena media. La composición de estos polímeros está
directamente relacionada con la estructura de la fuente de carbono. Cuando el
sustrato posee de 6 a 12 átomos de carbono, los monómeros de PHA poseen la
28
misma longitud, o tienen 2, 4 o 6 carbonos menos. Cuando se suministran ácidos
grasos de 13 a 18 carbonos, la composición del PHA no es relacionada con la
longitud del sustrato, debido a que el monómero más largo que es incorporado
posee 12 o 14 carbonos, aunque en su estructura puede presentar insaturaciones
(ÁVILA-LEÓN, 2007). Aun no está claro si una epimerasa, 3-cetoacil reductasa o
enoil-CoA hidratasa (Figura 5) es la encargada de realizar el transporte de
intermediarios de la β-oxidación para la síntesis de PHAMCL (GOMEZ, 2000).
Figura 5. Ruta metabólica de Biosintesis de PHA a partir de Ácidos Grasos
(http://mbel.kaist.ac.kr/lab/index_en.html)
2.4 Detección y cuantificación de PHA
Diferentes técnicas han sido empleadas para la detección de gránulos de polímero
intracelular. Los colorantes lipofílicos negro de Sudán (SCHLEGEL et al. 1970)
azul de Nilo A, y rojo de Nilo (KRANZ et al. 1997) son utilizados ampliamente.
Este último produce una fuerte fluorescencia naranja a una longitud de onda de
29
543nm han sido utilizados para distinguir colonias acumuladores de PHA de las
colonias que no acumulan el polímero. (SPIEKERMAN et al. 1999).
El método cuantitativo para detección de polihidroxialcanoatos es mediante
cromatografía de gases, utilizando como patrón interno ácido benzóico, el cual
establece tiempos de retención determinados para cada uno de los tipos de
estructuras y cantidad de carbonos presentes en ellas. Para realizar esta
cuantificación es necesario extraer los PHA de las células previamente y
despolimerizarlos mediante métodos como metánolisis para formar metil-ésteres
(BRAUNEGG et al., 1978) o propanólisis para formar propil-ésteres (RIIS & MAI,
1988)
La cuantificación de los Polihidroxialcanoatos también se realiza mediante en
análisis espectroscópico de Resonancia Magnética Nuclear con C13
(C13
-NMR). Esta
técnica es muy útil para PHASCL, pero presenta complicaciones con PHAMCL
saturados e insaturados debido a la equivalencia de los cambios químicos en los
átomos de carbono y los patrones protónicos del espectro de NMR.
2.5. Metabolismo de Ácidos Grasos
Los triglicéridos son lípidos formados por la unión de tres moléculas de ácidos
grasos con una molécula de glicerol mediante un enlace éster. Los ácidos grasos
constituyentes de la estructura del glicerol difieren generalmente en su estructura.
Los aceites están compuestos de triglicéridos, los cuales por acción de lipasas, son
hidrolizados a ácidos grasos. (Figura 6) El glicerol es fosforilado y oxidado a
dihidroxiacetona fosfato, el cual es un intermediario de la glicólisis, para convertirse
finalmente en acetil-CoA, molécula precursora de diferentes vías metabólicas, entre
ellas, ciclo de Krebs y Biosíntesis de novo de ácidos grasos. (ROMERO, 2006).
30
Figura 6. Hidrolisis de Triglicéridos (http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/fatty.htm)
2.5.1. β-Oxidación de ácidos grasos
Un amplio grupo de bacterias pueden crecer y dividirse en ácidos grasos de cadena
larga que son oxidados a Acetil-CoA por una vía metabólica denominada β-
oxidación (WHITE, 2OOO). Esta ruta consiste en una serie de 4 reacciones, al final
de las cuales, el acil-CoA será reducido a dos carbonos, liberados en forma de
Acetil-CoA. (Figura 7).
En el modelo propuesto para E. coli por DiRUSSO y colaboradores (1999) los ácidos
grasos entran a la célula mediante un mecanismo de translocación que involucra a
dos enzimas: FadL, que sirve como receptor de los ácidos grasos y ayuda a su paso a
través de la membrana externa; y fadD (Acil-CoA Sintetasa), proteína encargada de
la activación del ácido graso internalizado. La oxidación de esta molécula activada se
da mediante la acción de las proteínas fadF y fadG (Acil-CoA deshidrogenasa), las
cuales tienen afinidad por sustratos de cadena media-larga y cadena corta
respectivamente. El producto generado es un enoil-CoA (Acil-CoA con insaturación
en la posición 2). El producto del gen fadE es una flavoproteína encargada del
transporte de electrones necesarios en la acción de las Acil-CoA deshidrogenasas.
31
Figura 7. Modelo de β-Oxidación de Ácidos Grasos Modificado de DiRusso, 1999
Las enzimas que continúan con el proceso oxidativo de los ácidos grasos están
agrupados en un complejo multienzimático conocido como el operón fadBA, en el
cual son producidas las siguientes enzimas: 2-enoil-CoA hidratasa, 3-hidroxiacil-
CoA deshidrogenasa, 3-oxoacil-CoA tiolasa, 3-hidroxiacil-CoA epimerasa y 3-cis-
2-trans-enoil-CoA isomerasa. Este complejo está compuesto por una subunidad alfa
32
de 78 kDa y una subunidad beta de 42 kDa. (PRAMANIK et al., 1979; KUNAU et
al. 1995).
2.5.2. Ácidos grasos insaturados
Los principales ácidos grasos presentes en los aceites vegetales son el ácido oleico el
cual presenta una instauración en el carbono 9 (C18:1∆9) y el ácido linoléico, el cual
posee dos insaturaciones (C18:2∆9,12
). Estos dos ácidos grasos representan más del 70%
de la composición general de estas sustancias de origen natural. (VANZIN, 2008).
La oxidación de estos ácidos grasos requiere de dos enzimas más, enoil-CoA
isomerasa y 2,4 dienoil-CoA reductasa para que el proceso de degradación continúe.
La enzima enoil-CoA isomerasa es la responsable por la conversión de compuestos
cis-3-enoil-CoA para trans-2-enoil-CoA, debido a que la acil-CoA deshidrogenasa
no reconoce moléculas con conformación cis. Esta enzima actúa en las
insaturaciones que se extienden de un carbono impar hacia un carbono par. Después
de esta isomerización el ciclo de oxidación continúa normalmente. (KUNAU, 1987).
La enzima 2,4 dienoil-CoA reductasa dependiente de NADH es especifica cuando el
doble enlace se extiende de un carbono par hacia uno impar. Partiendo de esta
premisa, el ácido linoleico, que posee dos insaturaciones (C18:2∆9,12
) es oxidado
hasta 3-cis-dodecenoil-CoA. Luego una enoil-CoA isomerasa actúa, generando 2-
trans-6-cis-dodecadienoil-CoA, el cual entra de nuevo al ciclo de β-oxidación y se
produce 2-trans-4-cis-decadienoil-CoA. Es aquí cuando es necesaria la reducción de
este compuesto mediante la 2,4 dienoil-CoA producida a partir del gen fadH, para
generar 3-trans-decenoil-CoA, molécula la cual es intermediaria del ciclo de β-
oxidación. Es así como las insaturaciones (dobles enlaces) son manipulados por
isomerasas cuando se extienden de carbonos impares a pares, por isomerasas y
reductasas cuando las insaturaciones se extienden de carbonos pares a impares
(STRYER, 1998; SCHULZ & KUNAU, 1987),
33
2.6. Pseudomonas spp.
Pseudomonas spp., es un género de bacterias aeróbicas, Gram-negativas,
quimioheterótrofas, móviles y de forma bacilar (MERCADO-BLANCO, 2007)
adaptadas a un gran variedad de ambientes debido a sus simples requerimientos
nutricionales y por la misma razón ampliamente distribuido en el suelo formando
asociaciones con plantas. Crecen a pH casi neutro y en temperaturas mesofílicas,
hasta 43° C. Se ha reportado que muchas especies de Pseudomonas crecen
eficientemente en medios químicamente definidos conteniendo diferentes
compuestos alifáticos (carbohidratos, ácidos grasos, ácidos dicarboxílicos y
tricarboxílicos, alcoholes) y aromáticos como fuente de carbono (MARTÍNEZ-
BLANCO et al., 1990; MIÑAMBRES et al., 1996).
Metabólicamente, las especies pertenecientes a este género bacteriano presentan
características muy similares entre sí, las principales pruebas bioquímicas se
encuentran resumidas en la Tabla 2.
Muchas especies de Pseudomonas pertenecientes al grupo I de homología rRNA
producen PHA con diversos grupos funcionales tales como halógenos, alquilos
ramificados, fenilos, fenoxilos, olefinas y ésteres, cuando son cultivados con las
correspondientes sustancias químicas (KIM et al. 2000).
Tabla 3. Principales Caracteristicas metabólicas de Pseudomonas (BERGEY, 2005)
Prueba Bioquimica Resultado
Oxidasa (+)
Indol (-)
Rojo de Metilo (-)
Voges Proskauer (-)
Citrato (+)
Catalasa (+)
34
Clasificación científica de Pseudomonas sp (BERGEY, 2005).
Dominio: Eubacteria
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gamma Proteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Género: Pseudomonas
Las Pseudomonas poseen una amplia variedad de enzimas lipolíticas, las cuales son
de vital importancia para su metabolismo. P. fluorescens y P. aeruginosa presentan
enzimas hidrolíticas de tipo éster enantioselectivas, las cuales las hacen participes de
los procesos de biotransformación y esterificación.
Los primeros reportes de la producción de PHAMCL por Pseudomonas fueron en la
especie P. oleovorans, describiendo la producción de polímero conteniendo 3-
hidroxioctanoato por la metabolización de ácidos grasos de cadena media, larga y
también en alcanos (KESSLER Y PALLERONI, 2000). Hoy en dia se tiene
conocimiento de la capacidad productora de todas las Pseudomonas fluorescentes
(BALLISTRERI et al. 2001).
El efecto de la temperatura en el crecimiento y en la posterior producción de PHA
también ha sido estudiado en Pseudomonas (HABA et al. 2006) mostrando que a
diferentes temperaturas la composición monomérica del polímero puede ser
modificada.
35
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Los plásticos se han convertido en un material de uso cotidiano en la sociedad. Estas
sustancias son de origen petroquímico y han sido producidos desde hace más de 100
años. Debido a la sobrepoblación humana la demanda de estos se ha incrementado
en los últimos años y sumado a los altos costos del petróleo los cuales rondan los
US$110 por barril[ http://www.opec.org/home/basket.aspx consultado agosto 2008],
hacen que muchas investigaciones se dirijan a desarrollar nuevas tecnologías
productoras de materiales con características similares a los productos petroquímicos
y a la vez no tenga un impacto negativo en el medio ambiente.
Millones de toneladas de residuos son producidos diariamente por las actividades
humanas, entre los cuales, los plásticos aportan un gran porcentaje de estos desechos.
En el caso de Bogotá, se producen diariamente 23 mil toneladas de basura, de las
cuales, el 30% corresponden a residuos plásticos. Diversos programas de reciclaje
están en funcionamiento aliviando de cierta manera este problema, pero, debido a la
gran cantidad de desechos producidos, estos esquemas parecen no dar abasto,
además de no ser totalmente limpios, debido a que generan una cantidad
considerable de nuevas emisiones nocivas a la atmósfera.
Tomando en cuenta esto, los biopolímeros, en especial los PHA aparecen como una
de las opciones más viables, debido a su alta tasa de biodegradabilidad y a su
generación a partir de sustancias naturales, productos de la agricultura, en general, de
productos renovables.
Sin embargo, la producción y el precio de los bioplásticos sigue siendo demasiado
altos como para poder desplazar a los plásticos tradicionales, debido a que la
infraestructura de producción es completamente nueva y específica para este
producto.
36
El uso de sustratos baratos y de fácil adquisición como los aceites de origen vegetal,
los cuales confieren monómeros de diferentes conformaciones, como insaturaciones
y radicales acilos que poseen mayor numero de átomos de carbono, que pueden ser
incorporados a la estructura de los PHA para así, proporcionarles nuevas
características y así permitir que las insaturaciones puedan ser blanco para nuevas
modificaciones.
El estudio de los genes involucrados en la degradación de los ácidos grasos permite
modular la composición de los monómeros constituyentes de los PHAMCL, y así,
pensar una producción de polímeros hechos a la medida.
37
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Evaluar la incorporación de monómeros insaturados a PHAMCL producidos por
mutantes de Pseudomonas putida IPT 046 afectados en el crecimiento en ácido 4-
pentenóico, así como los genes afectados en estos mutantes.
4.2 Objetivos específicos
Determinar la composición de los PHA producidos por los mutantes de P.
putida IPT 046 incapaces de crecer en acido 4-pentenoico utilizando como
fuente de carbono ácido linoléico.
Evaluar el efecto de la sobreexpresión del gen fadH1 en Pseudomonas putida
IPT 046.
Evaluar el efecto de la complementación de los mutantes obtenidos a partir
de Pseudomonas putida IPT 046 con el gen fadH1;
Evaluar los genes afectados en estos mutantes
38
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Microorganismos y Plásmidos
Las cepas utilizadas y plásmidos que fueron utilizados están descritos en las tablas 4
y 5
Tabla 4. Microorganismos utilizados
Microorganismos Caracteristicas
Escherichia coli XL1-Blue PHA-, Lac-, Gms, Kans
Escherichia. coli S17-1 PHA-, F- 80dlacZ M15 (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1hsdR17(rk-,
mk+) phoAsupE44 -thi-1 gyrA96 relA1 (SIMON et al., 1983)
Pseudomonas putida IPT 046 Glu+, PHA+, Lin+, Val+, 4Pen+, Gms, Kans (GOMEZ, 1996)
Pseudomonas putida AG46,AK1,
BG45, BJ5, CF12, CN25, DG45,
DM26, DR52, DW4, DX38
Pseudomonas putida IPT 046, mutantes obtenidos con el plásmido
pUTKm2 conteniendo transposon mini-Tn5 Glu+, PHA+, Lin+, Val+,
4Pen+, Gms, Kanr (SILVA-QUEIROZ, 2007)
Pseudomonas putida AM1, CM29,
CM51, CR4, DU54, EB50
Pseudomonas putida IPT 046, mutantes obtenidos con el plásmido
pUTKm2 conteniendo transposon mini-Tn5 Glu+, PHA+, Lin+, Val+, 4Pen-
, Gms, Kanr (SILVA-QUEIROZ, 2007)
Tabla 5. Plásmidos utilizados
Plásmido Características
pGEM:fadH1 pGEM conteniendo el gen fadH1 (SILVA-QUEIROZ, 2007)
pBBR1MCS-5 Gmr lac POZ, MCS, Mob (KOVACH et al. 1995)
5.2 Medios de cultivo
Los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave durante 20 minutos a 121°
C, 1 atm.
En la preparación de los medios minerales, la fuente de carbono y el agar-agar fueron
esterilizados y adicionados después de la esterilización de la solución de sales.
39
5.3.1Medio LB (Luria-Bertani)
(SAMBROOK et al., 1989)
Triptona 10,0 g/L
Extracto de Levadura 5,0 g/L
Cloruro de Sodio (NaCl) 5,0 g/L
Agar-Agar 20,0 g/L
Las siguientes denominaciones fueron dadas a los diferentes medios LB con
diferentes antibióticos:
LBA: medio LB con ampicilina
LBGm: medio LB con gentamicina
5.2.2 Medio Mineral (RAMSAY et al. 1990)
(NH4)2SO4 1,00 g/L
Na2HPO4 3,50 g/L
KH2PO4 1,50 g/L
MgSO4.7H2O 0,20 g/L
CaCl2.2H2O 0,01 g/L
Citrato férrico amoniacal 0,06 g/L
Solución de elementos traza 1,00 mL/L
Cada litro de solución de elementos traza contiene:
H3BO3 0,30 g
CoCl2.6H2O 0,20 g
ZnSO4.7H2O 0,10 g
MnCl2.4H2O 0,03 g
NaMoO4.2H2O 0,03 g
NiCl2.6H2O 0,02 g
CuSO4.5H2O 0,01 g
Las siguientes denominaciones fueron dadas a los diferentes medios minerales con
diferentes fuentes de carbono:
40
MMGGm: Medio mineral con glucosa (1g/L) y gentamicina (15µL/mL)
MM4P: Medio mineral con ácido 4-pentenóico (1g/L)
MM4PGm: Medio mineral con con ácido 4-pentenóico (1g/L) y gentamicina
(15µL/mL)
MMV: Medio mineral con ácido valérico (1g/L)
MML: Medio Mineral con ácido linoléico (2,5g/L)
MMLGm: Medio Mineral con ácido linoléico (2,5g/L) y gentamicina
(15µL/mL)
5.3. Condiciones de cultivo
Las bacterias del género Pseudomonas fueron reactivadas en medio LB durante 24
horas, 30°C 150rpm. Luego fueron sembradas en agar LB durante 24 horas a 30°C.
Posteriormente fueron sembradas en agar MMGGm, MM4P, MM4PGm, MMV
durante 72 horas a 30° C. También se cultivó P. putida IPT 046 en MML y
MMLGm.
Escherichia coli fue cultivada en medio LB suplementado con antibiótico, durante
24 horas a 37° C, 150 rpm.
Los antibióticos fueron preparados de acuerdo a SAMBROOK et al. (1989),
esterilizados mediante filtración por membrana de 0.22µm (Millipore®) y
posteriormente adicionados a los medios de cultivo en las concentraciones indicadas
en la tabla 5.
Tabla 6. Antibióticos y concentraciones utilizadas
Antibiótico
Solución Stock
(mg/mL)
Concentración final
(µg/mL)
Ampicilina
Gentamicina
100 (en H20)
15 (en H20)
100
15
41
5.4 Manipulación de ADN
5.4.1 Extracción de ADN plasmídico
Fueron utilizados para la extracción de ADN plasmídico los siguiente kits, siguiendo
las recomendaciones del fabricante:
- DNA plasmídico: Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen Corp. ) y Qiaprep®
Spin Miniprep (Qiagen).
También fue utilizado el método BIRBOIM & DOLY (1979), modificado. E. coli
cargando el plásmido de interés fue cultivada “overnight” en 25mL de LB con el
antibiótico al cual es resistente. El cultivo celular fue centrifugado en alícuotas de
1,5mL por 5 minutos a 13000 rpm. El sobrenadante fue descartado y las células
fueron resuspendidas en 100µL de solución GETL [Lisozima 4mg/mL; Glucosa
50mM; EDTA de calcio y sodio (etileno diamino tetracetato) 10mM; Tris/HCL
(hidrocloruro de hidroximetil aminometa) 25mM; pH 8,0] enfriado previamente,
agitadas vigorosamente e incubadas en baño de hielo durante 5 minutos. Se
adicionaron 200µL de SDS en NaOH 0,2M, se mezcló por inversión y se incubó
durante 5 minutos en baño de hielo. Para la precipitación de ADN cromosómico y
proteínas, se adicionaron 150µL de solución de acetato de potasio (Acetato de
potasio 60mL; Ácido acético 11.5mL; H2O 8.5mL) enfriado previamente y
nuevamente incubada durante 5 minutos en baño de hielo. Después de esto, la
solución fue centrifugada durante 10 minutos, 6000rpm, 4° C. El sobrenadante,
conteniendo el ADN plasmidial fue transferido para un nuevo tubo, donde se realizó
la extracción con fenol/cloroformo (250µL de fenol y 250µL de cloroformo), luego
se centrifugó durante 10 minutos, 13000rpm, 4° C. En seguida fue hecha la
precipitación con etanol absoluto (750µL), se incubó durante 15-30 minutos en baño
de hielo para luego centrifugar durante 20 minutos, 13000rpm, 4° C. Posteriormente
se realizó un lavado con etanol 70% para luego centrifugar durante 10 minutos,
13000 rpm, 4° C y el “pellet” fue secado en incubadora a 65° C hasta que todo el
42
etanol remanente se evaporara. El “pellet” fue resuspendido en 30µL de solución TE
(Tris 10Mm, EDTA 1Mm, pH 7.5) para luego ser almacenado a -20° C.
5.4.2 Digestión de ADN con enzimas de restricción
Para la digestión de ADN fue utilizada la enzima ApaI, siguiendo las indicaciones
del fabricante (Invitrogen Corp.) Después del tiempo indicado, la enzima fue
inactivada a 65° C durante 10 minutos.
5.4.3 Ligación de ADN
Las reacciones de ligación fueron realizadas usando la enzima T4 DNA ligasa
(Fermentas Inc.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5.4.4 Preparación de células competentes
Las cepas de E.coli XL1-Blue y/o E.coli S17-1 fueron inoculadas en 25mL de medio
LB, conteniendo MgCl2 10mM, MgSO4 10mM, e incubadas en agitador rotativo a
37° C hasta lograr una DO650= 0.3-0.5. En tubos estériles fueron centrifugados 8mL
de cultivo por 15min, 5000rpm, 4° C. El “pellet” obtenido fue resuspendido en un
tampón de transformación (Tris 10mM; CaCl2 50mM; MgCl2 10mM; MgSO4 10mM;
pH 8,0) Las células se mantuvieron durante 15 minutos en hielo y nuevamente fueron
centrifugadas. Para la obtención de las células competentes, el “pellet” obtenido fue
nuevamente resuspendido en 0,8mL de tampón de transformación, y posteriormente
fue dividido en alícuotas de 200µL y mantenido en hielo. Las células fueron usadas
de inmediato.
5.4.5 Transformación Bacteriana
Para cada 200µL de células competentes, se adicionaron 10µL de ADN, se incubaron
en baño de hielo durante 30 minutos, posteriormente esta solución fue sometida a un
choque térmico a 42° C durante 90 segundos y enfriada inmediatamente en hielo. Se
adicionaron 600µL de medio LB y se incubaron durante 1 hora a 37° C. Los clones
transformados fueron seleccionados en medios de cultivo con el antibiótico
apropiado. Los reactivos IPTG (isopropilβ-D-tio-galactósido) e X-Gal (5-bromo-4-
43
cloro-3-indolil-β-D-galactósido) fueron adicionados para diferenciar los clones
recombinantes conteniendo el fragmento de interés.
5.4.6 Electroforesis en gel de agarosa
Para el análisis de ADN se utilizó gel de agarosa 0.8 % (m/v) con bromuro de etidio
0.01% (v/v). Se usó solución TAE [Tris-base 242g; Ácido Acetico Glacial 57.1mL;
EDTA de calcio y sodio (etileno diamino tetracetato) 0.5M (100mL); H2O 1000mL]
como tampón de corrida. Las muestras de ADN fueron aplicadas en los geles con
1/10 del volumen del colorante de corrida Blue Green Loading Dye I (LCG
Biotecnolgia). Las corridas electroforéticas fueron realizadas a 90V, 80mA, 80W
durante 1 hora. El marcador de corrida fue GeneRuler 1Kb DNA ladder Plus
0,5µg/µL (Fermentas Inc.). Los geles fueron observados bajo Luz UV (254nm) en
transiluminador (Ultralum 100)
5.4.7 Purificacion de ADN a partir del gel de agarosa
Para la purificación de ADN del gel de agarosa fue utilizado el kit de purificación
QIAquick® Gel extraction kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante
5.5 Construcción del plásmido por inserción del fragmento purificado a partir
del gel de agarosa
El plásmido pBBR1MCS-5 fue digerido con la enzima de restricción ApaI y ligado
al fragmento fadH1 purificado utilizando la enzima de ligación T4 DNA ligasa
(Fermentas Inc.). El plásmido fue transferido por transformación para E. coli S17-1
y XL1-Blue
5.6 Complementación
E.coli S17-1::pBBR1MCS-5::fadH1 fue sembrada en LBGm mientras que P. putida
IPT046 y los mutantes mini-Tn5, fueron sembradas en LB. Colonias aisladas fueron
inoculadas en 25mL de medio LBGm para el caso de E. coli y en 25mL de medio
LB para el caso de Pseudomonas. Después de 24 horas de cultivo a 37° C, 150rpm
las células (25mL) fueron centrifugadas durante 10 minutos, 5000 rpm. Cada uno de
los “pellets” obtenidos fueron resuspendidos en 10mL de solución salina (SS) y
44
centrifugados de nuevo durante 10 minutos, 5000 rpm. Estos “pellets” fueron
nuevamente resuspendidos en 1mL de SS. Fueron sembrados 100µL de E.coli S17-1
en agar MMGGm y homogenizados utilizando espátula de Drigalski. Una vez seca
esta capa, fueron sembrados 100µL de suspensión celular de P. putida IPT046 y los
mutantes en cada una de las cajas e incubadas a 30° C durante 24 horas.
Las colonias crecidas fueron repicadas en una nueva caja con MMGGm e incubadas
durante 24 horas, 30° C. Después de este periodo, las colonias aisladas fueron
sembradas en MMGGm, MM4P, MM4PGm y MMV para evaluar el crecimiento.
5.7 Ensayos de acumulación de polímero a partir de ácido linoléico
Células de Pseudomonas putida IPT 046 y de los mutantes fueron sembradas en
placas con agar LB. Colonias aisladas de estas placas fueron inoculadas en 25mL de
medio LB en agitación continua 30° C, 24h, 150rpm. Una alícuota de este cultivo
(6%) fue transferida para 50mL de MM con glucosa (5g/L), en agitación 30° C, 24h,
150rpm. Después de este tiempo, las células fueron lavadas y resuspendidas en
solución salina. Esta suspensión fue utilizada para inocular 50mL de MM sin fuente
de nitrógeno y con ácido linoleico (2.5 g/L) como fuente de carbono. Después de 48
horas de cultivo fueron analizados: masa seca celular, pH y composición de PHA.
5.7.1 Determinación de Masa seca celular (MSC)
10 mL de suspensión celular fueron centrifugados (10000rpm, 10 min, 4° C). El
“pellet” obtenido fue resuspendido en solución tween 80 a 0,1% (v/v) y nuevamente
centrifugado. Fue resuspendido en SS y filtrado a través de membranas de poro
0.45µm (Millipore®). La membrana con las células fue secada en un horno durante 4
horas a 100° C. Luego de este tiempo, las membranas fueron colocadas en un
desecador durante 20 minutos a temperatura ambiente. Pasado este periodo, fue
determinada la masa celular con la siguiente ecuación:
MS= [(MMC – MM + HM)/VOL] X 1000
Donde:
45
MMC= masa de la membrana y células después del secado
MM= masa de la membrana
HM= humedad relativa media del lote de membranas
VOL= volumen de suspensión centrifugado
5.7.2 pH
El pH fue determinado a partir del sobrenadante obtenido de la centrifugación, en un
potenciómetro (Mettler modelo Delta 350) utlizando patrones de pH de 4,0; 7,0 y 9,0
(Ingold – Mettler Toledo Int. Inc.).
5.7.3 Cantidad y composición de PHA
Para determinar la cantidad y la composición de PHA, fue el método de propanólisis
descrito por Riis y Mai (1988), en donde se tomaron 20mg de células liofilizadas, se
adicionaron 2mL de solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,1N en propanol (1:4) v/v,
2mL de 1,2-dicloroetano y 200μL de solución de 40g/L de ácido benzoico en
propanol, como patrón interno. Los tubos fueron cerrados, agitados y sometidos por
3 horas a 100o
C en baño de María, agitándolos después de los primeros 30 minutos.
Se enfriaron a temperatura ambiente y se les adicionó 4mL de agua Milli-Q, agitando
vigorosamente por 30seg. La fase acuosa (superior) se descartó y la fase orgánica
(inferior) que contiene los propil-ésteres fue analizada en cromatógrafo de gases
HP6890 Series GC System equipado con una columna HP-5 (5% fenil- metil-
siloxano, 30m de alto; 0,25 mm de diámetro; 0,25 µm de espesor del filme). El
análisis fue llevado a cabo bajo las siguientes condiciones: Gas de arrastre: Helio
(0,8 ml/min), temperatura del inyector: 250 ºC, temperatura del detector: 300 ºC,
sistema de detección: Ionización de llama (FID), programa de temperatura: 100ºC
por 1 minuto, aumento de la temperatura hasta 185ºC a 8 ºC por min y 185 ºC por 15
minutos. Fue usado ácido benzóico como patrón interno y polímeros producidos por
P. oleovorans fueron utilizados como patrones externos. Para el análisis de
monómeros conteniendo insaturaciones, especialmente en la región de 12 carbonos,
46
se usó el mismo factor de respuesta del componente saturado con 12 carbonos, es
decir, el 3HDd.
47
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Evaluación en la producción de PHA por mutantes deficientes en la
utilización de ácidos grasos insaturados
Este ensayo se realizó seleccionando 5 mutantes que presentaron, en una evaluación
pasada (SILVA-QUEIROZ, 2007) mayor incorporación de monómeros insaturados
(3HDd∆6) en comparación con Pseudomonas putida IPT046 y usando como fuente
de carbono ácido linoléico (Tabla 6). Todos los mutantes evaluados mostraban un
crecimiento mínimo en ácido 4-pentenóico.
Tabla 6. Composición monomérica de PHA acumulados por P. putida IPT 046, AG46, BJ5, CF12, CN25 Y
DU54, cultivadas en ácido linoléico*
Cepas
bacterianas
MSC
(g/L)
pH PHA (mol%) PHA
(%MSC) 3HHx 3HO 3HD 3HDd 3HDd∆6
IPT 046 0,77 6.72 12,73 31.06 32,75 2,95 20,49 26.11
AG46 0,72 6,70 10,36 30,10 32,75 4,93 21,86 24,21
BJ5 0,87 6,98 8,67 25,78 33,57 4,35 27,6 25,43
CF12 0,83 6,87 10,62 27,59 34,95 3,38 23,42 30,74
CN25 0,67 6,65 10,84 26,67 31,85 4,72 21,75 27,49
DU54 0,93 6,94 9,70 26,20 34,51 4,61 24,95 42,70
*Los resultados corresponden al valor medio de dos replicas
La cepa salvaje (IPT 046) acumuló cerca de un 26% de biomasa en forma de PHA.
3HD y 3HO fueron, respectivamente, los monómeros producidos en mayor
porcentaje. Si bien se conoce que a partir de la β-oxidación del ácido linoléico no se
produce 3HDd, este monómero fue detectado en proporciones mínimas en todos los
microorganismos evaluados. La producción de este compuesto probablemente se da
debido a la biosíntesis de ácidos grasos, en donde, moléculas de Acetil-CoA
producidas a partir del metabolismo del ácido linoléico son condensadas hasta
formar compuestos de mayor peso molecular. La fracción molar de 3HDd∆6
producida por IPT046 fue de 20,49mol %.
48
Los mutantes AG46 y CN25 mostraron una gran similitud en cuanto a la producción
de 3HDd∆6, presentando valores de 21,86 mol% y 21, 75 mol% respectivamente.
Estos valores no difieren mucho de los mostrados por la cepa salvaje IPT 046.
Los mutantes CF12 y DU54 presentaron una fracción molar de 3HDd∆6
correspondiente a 23,42% y 24,95% respectivamente, mostrando valores mayores a
los producidos por la cepa salvaje. Por otro lado, el mutante DU54 acumuló cerca del
42% de masa seca en forma de PHA, además de producir 34,5 mol % de 3HD.
El mutante BJ5 mostró la mayor incorporación de 3HDd∆6 con respecto a la cepa
salvaje, con un valor de 27,6 mol %, sugiriendo algún cambio en el metabolismo de
ácidos grasos, en relación a las enzimas involucradas en reducir los dobles enlaces de
las insaturaciones que se extienden de un carbono par hacia un impar, presentada en
el ácido linoléico.
6.2 Clonación del gen fadH1 en pBBR1MCS-5
En 2007, SILVA-QUEIROZ utilizó la secuencia del gen fadH de E. coli y buscó por
secuencias similares en los genomas de Pseudomonas que han sido secuenciadas y
encontró en todas al menos un gen fadH. En Pseudomonas aeruginosa se
identificaron dos genes, denominados fadH1 y fadH2. Gracias a la elaboración de
un dendograma, logró clasificar estos genes en dos grupos: fadH1 presentes en todas
las Pseudomonas y fadH2 presente solamente en P. aeruginosa. Mediante el
alineamiento de las secuencias del gen fadH1 de diferentes subespecies de P. putida,
fueron diseñados iniciadores para la amplificación de este. ADN genómico de
Pseudomonas putida KT2440 y Pseudomonas putida IPT O46 fueron usados como
molde para realizar esta amplificación, obteniendo amplicones de 2,6Kb del genoma
de Pseudomonas putida KT2440, mientras que, a partir del genoma de
Pseudomonas putida IPT O46 no obtuvo ninguno, sugiriendo una diferencia en esa
región del genoma. Esta hipótesis se fundamenta en el estudio de nuevos genomas
secuenciados de diferentes sub-especies de Pseudomonas putida, los cuales muestran
49
que en regiones adyacentes al gen fadH1 se encuentran diferencias significativas
(Fig. 8), por lo cual, es recomendable rediseñar los iniciadores para la amplificación
de esta región genómica de P. putida IPT046. El producto de esta amplificación fue
ligado al vector de clonación pGEM T-Easy® (ver Anexo I) y transferido para E.
coli XL1-Blue mediante transformación (SILVA-QUEIROZ, 2007).
Figura 8. Regiones del genoma de diferentes subespecies Pseudomonas putida donde se encuetra el gen
fadH1
A partir de esto, uno de los objetivos de este trabajo fue la construcción del
plásmido pBBR1MCS-5::fadH1, con el fin de expresar el gen fadH1 en P. putida y
los mutantes obtenidos a partir de esta. La construcción de este plásmido se llevo a
cabo en dos etapas. La primera consistió en la obtención del fragmento de DNA de
interés (fadH1) el cual estaba inserido en el vector de clonación pGEM T-Easy®
(SILVA-QUEIROZ, 2007).
Luego de realizar una comparación de los sitios de restricción donde actuaban
diferentes endonucleasas dentro del pGEM T-Easy® y la secuencia amplificada del
50
gen fadH1 (Figura 9), se determinó que todas las enzimas tenían sitio de corte dentro
de la región codificadora, y por tanto no eran adecuadas para la clonación. La única
excepción fue la enzima ApaI, la cual presenta un sitio de corte dentro del amplicón
pero no en la región codificadora. Asi ApaI fue seleccionada para realizar la
clonación del gen fadH. Para la clonación del gen fadH1 se realizó la extracción del
plásmido y posteriormente se utilizó la enzima de restricción ApaI para separar el
gen fadH del resto del plásmido
TGTCCCATCCTTTTGTCAGCATGAGCGAACCCTCCGGGCGCACTGAGTAGGCGCCACGTTCCATGGGTGGATGAT
CAAACGTGCTTGAAGAGTCTGGCAGAGCCGCGTTGTCTGGCAAATGCGCGGGGAGACTGTTTGGCGATCAAGCCA
GGCGAACCTTATAGCGCTGAAGTTCTGGAGCCTTCCCGACAGTCGCTGCCTCTGCTGTTCATCACGATCATTAAC
TTGTCAGTTTTGATCATTGAGGCAATTCAAACGGCTGTTTAATGTCGCAGGCAGACAAACGACGGGGCCCGCCAC
CCAGTGAGGTGCCCGCATTCCGTGATCACGCCATCAGGGGACCTTTCCATGGCCGCCGACCGCTACCCGCACCTG
CTTGCTCCGCTGGACCTGGGCTTTACCACCTTGCGCAACCGCACCCTGATGGGCTCGATGCACACCGGCCTCGAA
GAGCGCCCCGGCGGCTTCGAGCGCATGGCAGCTTACTTTGCCGAGCGCGCCCGGGGCGGCGTTGGCCTGATGGTC
ACGGGCGGCATTGCGCCCAATGATGAAGGCGGGGTGTATTCCGGTGCGGCAAAGCTCAGCACCGAGGAAGAGGCC
GACAAGCACCGCATCGTCACCGAGGCGGTGCACGCTGCCGGTGGCAAGATCTGCCTGCAGATACTGCATGCCGGG
CGCTACGCCTACAGCCCACGGCAGGTGGCACCTAGCGCGATCCAGGCGCCGATCAACCCGTTCAAGCCCAAAGAG
CTGGATGAGGCGGGCATCGAGAAGCAGATCGCCGACTTCGTCAATTGTGCCGTGCTGGCTCAGCGTGCCGGTTAC
GACGGCGTCGAAATCATGGGTTCGGAAGGCTACTTCATCAACCAGTTCCTGGCCGCCCACACCAACCACCGCACC
GACCGCTGGGGCGGCAGTTATGAAAACCGCATGCGCCTGGCAGTGGAAATCGTCAGCCGGGTGCGTGGCGCGGTA
GGGCCGAACTTCATCATCATCTTCCGCCTGTCGATGCTCGACCTGGTCGAGGGTGGCAGCACCTGGGACGAGATC
GAGCTGCTGGCCAAGGCCATCGAGCAGGCCGGCGCGACCTTGATCAACACCGGAATCGGTTGGCACGAGGCGCGT
ATTCCGACCATCGCCACCAAAGTGCCGCGTGCGGCCTTCAGCAAAGTCACCGCCAAGTTGCGCGGCGTGGTGAGC
ATTCCGCTGATCACCACCAACCGCATCAACACCCCGGAAGTGGCCGAGGCAGTGCTGGCCGAGGGCGATGCGGAC
ATGGTCTCGATGGCGCGACCGTTTCTCGCCGACCCGGACTTCGTCAACAAGGCCGCTGCCGGTCGTGCGGATGAA
ATCAACACCTGCATCGGCTGCAACCAGGCCTGCCTGGACCATACCTTCGGCGGCAAGCTGACCAGTTGCCTGGTC
AACCCGCGGGCCTGCCACGAGACCGAACTCAACTACTTGCCTGTACGTACGGTGAAACGCATTGCCGTGGTCGGC
GCCGGCCCGGCTGGCCTGGCGGCGGCCACCGTGGCGGCCGAGCGGGGCCACGCGGTGACCCTGTTTGACGCCGCC
AGCGAAATCGGTGGCCAGTTCAACGTGGCCAAGCGGGTGCCGGGCAAGGAAGAATTCTTCGAAACGCTGCGTTAC
TTCCGCAACAAGGTCAAAAGCACGGGCGTCGACCTGCGCCTGAATACCCGCGTGGATGTGCAGGCACTGGTGGGC
GGCGGCTTTGATGAAGTCATCCTGGCTACCGGCATCGCCCCGCGTACCCCGGACATCGCGGGCGTGGAGCATGCC
AAGGTGCTCAGCTACCTGGACGTGCTGCTCGAGCGCAAGCCGGTGGGCAAGTCGGTGGCCGTGATTGGCGCGGGA
GGTATCGGCTTCGATGTGTCCGAGTACCTGGTGCATCAGGGCGTGGCCACCAGTCAGGACCGAGCGGCATTCTGG
AAAGAGTGGGGCATCGATACCCATCTTCAGGCGCGAGGTGGTGTGGCCGGGATCAAGGCCGAGCCGCATGCTCCG
GCGCGGCAGGTGTACCTGTTGCAGCGCAAGAAATCCAAGGTGGGCGACGGGCTCGGCAAGACGACCGGCTGGATT
CACCGCACCGGGTTGAAGAACAAGGGGGTGCAGATGCTCAACAGTGTCGAGTATCTGGGTATCGACGATGCCGGC
CTGCACATTCGTGTGGACGGCGGCGAGCCCCAGGTGCTGGCGGTGGATAACGTGGTGATCTGTGCCGGGCAAGAT
CCGCTGCGCGAGCTGCAGGAAGGGCTGGTGGCGGCGGGGCAGTCGGTGCACCTGATCGGCGGCGCGGATGTGGCG
GCCGAGCTGGATGCCAAGCGGGCGATCAACCAAGGCTCGCGGTTGGCGGCTGAGCTCTGAGGTTGTCGGGGCTGC
GTGAGCCCGACACCTGCACGCGTGGGAGCGGGCATGCCCGCGAAACAGGTGACGCGGTGGATGGCACCGGCATTG
CCGGTGTTCGCGGGTGAACCCGCTCCTACGACGGGCTGTGCCGGGGCATCGATGCCTGTGTCGAGCCACCCTGGC
ACTGTGATGCCTCGGCGGGGGCGGGTCATCGATTACAAGCGCTTGCGGGATTACCCTGTAAACTGCGATCCATG
Figura 9 Secuencia de la región del amplicón conteniendo el gen fadH1.En rojo están
señalados los sitios reconocidos por endonucleasas
51
El plásmido pGEM T-Easy ® fue digerido con la enzima de restricción ApaI y el
fragmento de 2,6Kb fue purificado a partir del gel de agarosa después de la
electroforesis. El vector pBBR1MCS-5 fue también digerido con la endonucleasa
ApaI . y enseguida ligado al fragmento previamente purificado utilizando utilizando
la enzima T4 DNA Ligasa. El producto de ligación fue transferido por
transformación para E. coli XL1-Blue Los clones transformantes fueron
seleccionados en cajas de Petri con agar LBGm, IPTG y X-Gal. Varias colonias
blancas fueron seleccionadas y fueron sembradas en una caja de Petri con agar
LBGm, IPTG y X-Gal utilizando palitos de madera. (Figura 10)
Figura 10. Cajas con LBGm, IPTG y X-Gal mostrando colonias transformadas posiblemente con
pBBR1MCS-5::fadH1
Se seleccionaron 10 colonias que presentaron un color blanco debido a que estas
colonias recombinantes no producen β-galactosidasa, con lo cual no pueden
degradar X-Gal, por lo tanto no presentan coloración azul. Se realizó extracción de
ADN plasmídico de estas colonias. Posteriormente se realizó una digestión con
enzima de restricción ApaI y seguido a esto una electroforesis en gel de agarosa
permitió ver que en los pozos 5,7 y 8, habian 2 bandas, una de 5Kb
aproximadamente, la cual corresponde al plásmido pBBR1MCS-5 y otra banda de
2,6 Kb, correspondiente al gen fadH1 (Figura 11)
52
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2-11. ADN plasmidial digerido con ApaI
La figura 12 muestra electroforesis en gel de agarosa donde se resumen los
principales pasos de la clonación del gen fadH1 en el vector pBBR1MCS-5. Las
corridas 2, 3 y 5 corresponden respectivamente al plásmido pGEM T-easy®,
pBBR1MCS-5::fadH1 y pGEM::fadH1 digeridos con endonucleasa ApaI. Las
corridas 4 y 6 muestras los vectores pGEM::fadH1 y pBBR1MCS-5::fadH1.
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2. pGEM; 3. pBBR1MCS-5::fadH1 digerido con
Apa1; 4. pGEM:fadH1; 5. pGEM::fadH1 digerido con ApaI; 6. pBBR1MCS-5::fadH1
53
6.3 Complementación de Pseudomonas putida IPT 046 y los mutantes deficientes
en crecimiento en ácido 4-pentenoico con el gen fadH1.
Para la complementación de P. putida IPT 046 y los mutantes, inóculos de estos y de
E. coli S17-1:pBBR1MCS-5::fadH1 fueron sometidas a conjugación en medio
mineral con glucosa como fuente de carbono y gentamicina, que es una marca de
resistencia del plásmido pBBR1MCS-5. Cada una de las cepas no podría crecer en
este medio, porque E. coli S17-1 no crece en medio mínimo con glucosa como
fuente de carbono y P. putida IPT 046 junto con los mutantes, no crece en medio
con gentamicina, por lo cual, en este medio de cultivo solo podrían crecer bacterias
del género Pseudomonas que hubieran recibido el plásmido mediante conjugación.
Después de esto, las bacterias recombinantes fueron repicadas en un nuevo
MMGGm con el fin de aislar el clon recombinante y descartar cualquier interferencia
de las cepas utilizadas para la conjugación. Luego de esto, colonias aisladas de cada
uno de los microorganismos fueron repicadas en MMGGm, MMV y MM4P, con el
objetivo de evaluar el crecimiento en ácido graso insaturado. (Ver Tabla 8)
Tabla 8. Perfil de crecimiento de IPT 046 y los mutantes frente a las cepas complementadas con
pBBR::fadH1 en MMGGm, MMV y MM4P
Sin plásmido pBBR1MCS-5::fadH1
MMGGm MMV MM4P MMGGm MMV MM4P
IPT 046 - +++ +++ +++ +++ +++
AG46 - ++ + ++ + -
AK1 - +++ + ++ ++ -
AM1 - - - ++ - -
BG45 - ++ + ++ + +
BJ5 - ++ - ++ - -
CF12 - ++ ++ ++ ++ +/-
CM29 - ++ + ++ ++ -
CM51 - ++ + ++ ++ +/-
CN25 - +++ ++ ++ ++ +
CR4 - ++ + ++ - +
DG45 - ++ + ++ - +
DM26 - ++ + ++ - +/-
DR52 - ++ ++ ++ + +
DU54 - ++ ++ ++ + +
54
DW4 - ++ + ++ + +/-
DX38 - ++ + ++ + +
EB50 - ++ + ++ + +
Esta tabla muestra una comparación del crecimiento en MMGGm, MMV y MM4P
de P. putida IPT 046 y los mutantes cuando están complementados con
pBBR1MCS-5::fadH1 y cuando no poseen el plásmido. En el caso de la cepa salvaje
y los mutantes sin complementar, no presentaron crecimiento en MMGGm, mientras
que las cepas que si poseen el plásmido con la resistencia a gentamicina crecieron
normalmente en este medio.
Cuando se cultivaron los microorganismos en MMV, estos presentaron un
crecimiento variable. AM1 y AM1::pBBR1MCS-5::fadH1 no mostraron ningún tipo
de crecimiento (ver Fig. 11), sugiriendo que la mutación generada por la inserción
del transposon mini-Tn5 afectó algún gen del metabolismo de los ácidos grasos. En
el caso de IPT 046 y de los mutantes, presentaron un crecimiento acorde con los
resultados de SILVA-QUEIROZ en 2007. Los microorganismos conteniendo el
plásmido presentaron unos resultados, los cuales mostraron que la tasa de
crecimiento en MMV disminuía o se inhibía, como en el caso de
AG46::pBBR1MCS-5::fadH1 y BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1(Ver Fig.13),
BG45::pBBR1MCS-5::fadH1(Ver Fig.14), CR4::pBBR1MCS-5::fadH1,
DG45::pBBR1MCS-5::fadH1, DM26::pBBR1MCS-5::fadH1 (Ver Fig.15) y
DR52::pBBR1MCS-5::fadH1, DU54::pBBR1MCS-5::fadH1, DW4::pBBR1MCS-
5::fadH1, DX38::pBBR1MCS-5::fadH1, EB50::pBBR1MCS-5::fadH1 (Ver Fig. 16).
Estos resultados sugieren que de alguna manera, la presencia del plásmido altera el
metabolismo normal de ácidos grasos, lo cual no se puede comprobar hasta realizar
una prueba, teniendo como control, estos microorganismos conteniendo el plásmido
pBBR1MCS-5.
La evaluación de crecimiento en MM4P mostró que la cepa salvaje y la cepa salvaje
complementada con pBBR1MCS-5::fadH1 crecieron normalmente en este sustrato.
55
Algunos mutantes mostraron un crecimiento regular en MM4P, tal es el caso de
CN25 (Ver Fig.14) DR52 y DU54 (Ver Fig.16) mientras que otros mutantes
mostraron un crecimiento mínimo, como es el caso de AG46, AK1 (Ver Fig.13)
BG45, CF12, CM29, CM51 (Ver Fig.14) CR4, DG45, DM26 (Ver Fig.15) DW4,
DX38 y EB50 (Ver Fig.16). Dos mutantes (AM1 y BJ5) no mostraron ningún
crecimiento en este medio.
Los mutantes complementados con el gen fadH1 y cultivados en MM4P, mostraron
un crecimiento menor en comparación a IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, con
excepción de las cepas AM1::pBBR1MCS-5::fadH1, BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1 y
CM29::pBBR1MCS-5::fadH1, los cuales no presentaron crecimiento.
Figura 13. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO NO. “1”. 1. IPT 046, 2. AG46, 3. AK1, 4. AM1, 5. BJ5, 6.
IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. AG46::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. AK1::pBBR1MCS-5::fadH1, 9.
AM1::pBBR1MCS-5::fadH1, 10. BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1
56
Figura 14.EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO NO. “2”. 1. IPT 046, 2. BG45, 3. CF12, 4. CM29, 5. CM51,
6. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. BG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. CF12::pBBR1MCS-5::fadH1, 9.
CM29::pBBR1MCS-5::fadH1 y 10. CM51::pBBR1MCS-5::fadH1
Figura 15. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “3”. 1. IPT 046, 2. CN25, 3. CR4, 4. DG45, 5. DM26,
6. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. CN25::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. CR4::pBBR1MCS-5::fadH1,
9.DG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 10. DM26::pBBR1MCS-5::fadH1
Figura 16. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “4” 1.IPT 046, 2. DR52, 3.DU54, 4. DW4, 5. DX38, 6.
EB50, 7. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. DR52::pBBR1MCS-5::fadH1, 9. DU54::pBBR1MCS-
5::fadH1, 10. DW4::pBBR1MCS-5::fadH1, 11. DX38::pBBR1MCS-5::fadH1, 12. EB50::pBBR1MCS-
5::fadH1.
57
Seguido de esto, el paso siguiente fue evaluar el crecimiento de los mutantes
complementados con el plásmido pBBR1MCS-5::fadH1 en MM4PGm, con el fin de
evidenciar una posible expresión de este gen. (Tabla 9) (Fig. 17) Una vez que sin la
presión selectiva del antibiótico para mantener el plásmido en la célula, la no
complementación de los mutantes podría resultar de la pérdida del plásmido y no de
la incapacidad del gen fadH1 para complementar el mutante.
Tabla 9. Perfil de crecimiento de los mutantes recombinantes en MM4PGm
Microorganismo recombinante
MM4PGm
AG46::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
AK1::pBBR1MCS-5::fadH1 -
AM1::pBBR1MCS-5::fadH1 -
BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1 -
BG45::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
CF12::pBBR1MCS-5::fadH1 -
CM29::pBBR1MCS-5::fadH1 -
CM51::pBBR1MCS-5::fadH1 -
CN25::pBBR1MCS-5::fadH1 -
CR4::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
DG45::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
DM26::pBBR1MCS-5::fadH1 -
DR52::pBBR1MCS-5::fadH1 -
DU54::pBBR1MCS-5::fadH1 -
DW4::pBBR1MCS-5::fadH1 +++
DX38::pBBR1MCS-5::fadH1 -
EB50::pBBR1MCS-5::fadH1 -
58
Figura 17. Evaluación de crecimiento de los mutantes complementados en MM4PGm.
1. AG46::pBBR1MCS-5::fadH1, 2. BG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 3. CR4::pBBR1MCS-5::fadH1, 4.
DG45::pBBR1MCS-5::fadH1 y 5. DW4::pBBR1MCS-5::fadH1
Después de 72 horas de incubación, las cepas que presentaron un crecimiento mayor
fueron AG46::pBBR1MCS-5::fadH1, BG45::pBBR1MCS-5::fadH1,
CR4::pBBR1MCS-5::fadH1, DG45::pBBR1MCS-5::fadH1 y DW4::pBBR1MCS-
5::fadH1. Estos mutantes presentaban un crecimiento menor que IPT 046 cuando
eran cultivados en MM4P (SILVA-QUEIROZ, 2007).
A partir de estos resultados, se comparó el crecimiento en MM4PGm de IPT
046::pBBR1MCS-5::fadH1 con los mutantes complementados que crecieron en
MM4PGm (Fig. 18 y 19).
Figura 18. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y mutantes complementados
en MM4PGm. Cajas A y B. 1,3,5. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1; 2. AG46::pBBR1MCS-5::fadH1; 4.
BG45::fadH1
A B
59
Figura 19. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y mutantes complementados
en MM4PGm. Cajas A y B. 1,3,5. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1; 2. CR4::pBBR1MCS-5::fadH1; 4.
DG45::pBBR1MCS-5::fadH1; 6. DW4::pBBR1MCS-5::fadH1
En estas cajas se observó que existía una tasa de crecimiento muy similar entre las
cepas recombinantes, resaltando que las colonias que están en los extremos de las
cajas crecieron más debido a la disponibilidad de sustrato. Por otro lado, las colonias
que se encuentran en el interior de la caja mostraron un crecimiento uniforme. Estos
resultados son compatibles con una mutación en el gen fadH en estos mutantes, pues
el fenotipo salvaje es restablecido. Además de eso, una vez que los mutantes
presentaron algún crecimiento en ácido 4-pentenóico, están parcialmente afectados,
lo que sugiere la existencia de más de un gen fadH en P. putida.
Por otro lado, no hubo crecimiento de los demás mutantes complementados en
MM4PGm. Esto sugiere que la mutación generada por la inserción del transposon
mini-Tn5 afectó otro gen del metabolismo de ácidos grasos.
Inicialmente se creía que el gen fadH debería codificar para la enzima mas
importante en la metabolización de ácidos grasos con insaturaciones extendiéndose
desde carbono par hacia impar y que, mutantes afectados en este gen, deberían
presentar una mayor incorporación de 3HDd∆6 . Entre tanto, el mutante BJ5,
presentó una mayor producción de 3HDd∆6 (Ver Tabla 6) pero no fue
complementado con el gen fadH1, lo cual sugiere la existencia de otros genes
involucrados específicamente en el metabolismo de estos ácidos grasos.
A B
60
7. CONCLUSIONES
Los ensayos de producción de polímero de los mutantes de Pseudomonas
putida IPT 046, utilizando ácido linoléico (99% de pureza) como fuente de
carbono demostraron un mayor porcentaje de incorporación de 3HDd∆6 por
parte del mutante BJ5 demostrando que es posible alterar la incorporación de
monómeros insaturados por mutaciones en genes relacionados con el
metabolismo de ácidos grasos insaturados.
Los oligonucleótidos diseñados a partir del alineamiento de secuencias del
genoma de P. putida KT2440 para la amplificación del gen fadH1 no son los
indicados para utilizarlos en P. putida IPT046 debido a que se encontraron
diferencias en las regiones adyacentes al gen de interés en varios genomas
que fueron evaluados.
Los mutantes afectados parcialmente en el crecimiento en ácido 4-pentenóico
que fueron complementados con el gen fadH1 sugieren la existencia de más
de un gen fadH en P. putida. encargado de la reducción de las insaturaciones
que se extienden de un carbono par hacia impar en los ácidos grasos.
Los ensayos de producción de polímero y de complementación indican la
existencia de otros genes que pueden estar involucrados en el metabolismo de
ácidos grasos insaturados, ya que los mutantes que presentaron mayor
incorporación de monómeros insaturados no fueron complementados con el
gen fadH1.
61
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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70
9. ANEXOS
ANEXO I. Esquema del plásmido pGEM T-Easy
ANEXO II. Esquema del plásmido pBBR1MSC-5
