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Profesor PatrocinanteDr. Luis Pablo CidCentro de Estudios Científicos
Profesor Co-PatrocinanteDr. Carlos FigueroaInstituto de Anatomía, Histología y PatologíaFacultad de Medicina
EFECTO DE LA INACTIVACIÓN GENÉTICA DEL CANAL DE POTASIO KCNQ1/KCNE3 SOBRE LA SECRECIÓN INTESTINAL
DE CLORURO UTILIZANDO MODELOS MURINOS
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
SANDRA PAULINA VILLANUEVA SUBIABRE
VALDIVIA – CHILE
2013
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, me gustaría agradecer a mi profesor patrocinante, Dr. Luis Pablo Cid, por
aceptarme como integrante de su grupo de trabajo, por su valiosa guía y apoyo en esta etapa
de mi formación profesional.
Agradezco de igual manera al Dr. Francisco Sepúlveda, por su excelente disposición en el
momento de solicitar poder realizar mi tesis en el CECs.
A mi profesor copatrocinante, Dr. Carlos Figueroa y a mi profesora informante, Dra. M. Cecilia
Rauch por aceptar formar parte de esta comisión.
De manera especial quiero agradecer la colaboración de la Dra. Viviana Bustos por haber
realizado los registros de patch clamp y por su constante ayuda. Al Dr. Carlos Flores por su
colaboración con los registros en cámara de Ussing y apoyo en a lo largo de este proceso.
También agradezco al personal de la Unidad de Genómica funcional del CECs por la
generación y cuidado de los transgenes utilizados en este trabajo.
A mis compañeros de laboratorio por su ayuda, compañerismo y por hacer que la estadía en
el laboratorio sea tan enriquecedora y grata.
A mis padres por su apoyo y Andrea por su ayuda en esta última etapa.
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Biofísica y Fisiología Molecular del Centro de
Estudios Científicos, gracias al apoyo del proyecto FONDECYT 1100859 y Financiamiento
Basal Conicyt.
I
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS
ÍNDICE DE CONTENIDOS.....................................................................................
ÍNDICE DE FIGURAS.............................................................................................
ÍNDICE DE TABLAS...............................................................................................
ABREVIATURAS....................................................................................................
1. RESUMEN..........................................................................................................
1.1 Summary............................................................................................
2 INTRODUCCIÓN.................................................................................................
2.1 Propiedades biofísicas de las membranas celulares.........................
2.2 Canales de potasio............................................................................
2.3 Canales de potasio KCNQ1...............................................................
2.4 Subunidades accesorias KCNE.........................................................
2.5 Secreción intestinal de cloruro...........................................................
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II
2.6 Animales genéticamente modificados como herramienta de
estudio...............................................................................................
2.7 Hipótesis............................................................................................
2.7.1 Objetivo General................................................................................
2.7.2 Objetivos específicos.........................................................................
3. MATERIALES Y MÉTODOS...............................................................................
3.1 MATERIALES.................................................................................
3.1.1 Reactivos........................................................................................
3.2 METODOLOGÌA.............................................................................
3.2.1 Vectores de Expresión....................................................................
3.2.1.1 Mutagénesis sitio dirigida Aspartato – Asparragina ………….……
3.2.1.2 Incorporación del epítope Hemaglutinina (HA)...............................
3.2.1.3 Subclonamiento del producto de PCR en el vector pGEM-T….….
3.2.1.4 Transformación de células competentes........................................
3.2.1.5 Purificación del ADN plasmidial......................................................
.. 3.2.1.6 Subclonamiento en el vector pIRES-hCD8....................................
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III
3.2.1.7 Subclonamiento en el vector que posee el promotor de Villina......
3.2.2 Generación de Animales Transgénicos..........................................
3.2.2.1 Purificación de Transgenes............................................................
3.2.2.2 Manipulación de embriones y microinyección................................
3.2.2.3 Extracción de ADN genómico de ratón..........................................
3.2.2.4 Genotipificación de ratones mediante PCR....................................
3.2.3 Transfección de células de ovario de hámster chino (CHO)..........
3.2.4 Estudio de las corrientes en célula única mediante patch clamp...
3.2.4.1 Teoría de la técnica de patch- clamp.............................................
3.2.4.2 Obtención de de corrientes macroscópicas...................................
3.2.4.3 Análisis de datos............................................................................
3.2.5 Estudio de las corrientes transepiteliales en la cámara de Ussing.
3.2.5.1 Fundamentos..................................................................................
3.2.5.2 Animales de experimentación........................................................
3.2.5.3 Experimentos en Cámara de Ussing..............................................
3.2.6 Inmunofluorescencia......................................................................
3.2.6.1 Inmunocitofluorescencia................................................................
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IV
3.2.6.2 Inmunohistofluorescencia...............................................................
3.2.7 Contenido de agua en las heces....................................................
4. RESULTADOS....................................................................................................
4.1 Generación de construcciones de ADN recombinante para
estudios in vitro..................................................................................
4.1.1 Incorporación de la mutación sitio dirigida.........................................
4.1.2 Adición del epítope Hemaglutinina....................................................
4.2 Determinación de corrientes macroscópicas de los complejos
KCNQ1/ HA-KCNE3 y KCNQ1/ HA-KCNE3 D90N............................
4.3 Inmunolocalización de las proteínas de fusión HA-KCNE3 y HA-
KCNE3 D90N.....................................................................................
4.4 Generación de Transgenes HA-KCNE3 y HA-KCNE3 D90N............
4.5 Generación de ratones HA- KCNE3 y HA-KCNE3 D90N y
obtención de líneas transgénicas......................................................
4.6 Efectos generales de la sobre-expresión de la proteína HA-
KCNE3 D90N....................................................................................
4.7 Efectos funcionales de la sobre-expresión de la proteína de fusión
HA-KCNE3 D90N...............................................................................
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V
4.8 Localización subcelular y tisular de HA-KCNE3, HA- KCNE3 D90N
y KCNQ1...........................................................................................
5. DISCUSION........................................................................................................
5.1 Análisis in vitro de la mutación puntual D90N sobre las corrientes
conducidas por KCNQ1.....................................................................
5.2 Estudios ex vivo de la secreción de cloruro en tejido intestinal de
ratones transgénicos.........................................................................
6. BIBLIOGRAFÍA...................................................................................................
7. ANEXOS.............................................................................................................
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VI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Modelo eléctrico de la membrana plasmática de una célula intacta
Figura 2 Topología y Arquitectura del canal de potasio KCNQ1....................
Figura 3 Esquema del tracto digestivo............................................................
Figura 4 Modelo de la secreción intestinal de cloruro.....................................
Figura 5 Mutación sitio dirigida.......................................................................
Figura 6 Esquema general de la generación de animales
transgénicos mediante la técnica de microinyección pronuclear......
Figura 7 Diagrama simplificado de la técnica de patch clamp en
configuración de célula completa......................................................
Figura 8 Esquema de una cámara de Ussing.................................................
Figura 9 Cálculos de diferencia de corriente de corto-circuito (ΔIsc).............
Figura 10 Generación de los vectores pIRES HA-KCNE3 hCD8 y
pIRES HA-KCNE3D90N hCD8.........................................................
Figura 11 Efecto de la mutación D90N de la subunidad accesoria KCNE3
sobre la corrientes conducidas por KCNQ1 en un sistema
de expresión heterólogo.................................................................
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VII
Figura 12 Relación corriente/voltaje (I/V) de los distintos sistemas
heterólogos.......................................................................................
Figura 13 Inmunofluorescencia contra hemaglutinina (HA) de células
CHO transfectadas de forma aguda.................................................
Figura 14 Generación de los vectores Villina HA-KCNE3 y Villina HA-
KCNE3 D90N....................................................................................
Figura 15 Efecto de la expresión de la proteína KCNE3 D90N
sobre la secreción intestinal de cloruro...........................................
Figura 16 Transporte transepitelial registrado en yeyuno de animales
Villina HA- KCNE3 y Villina HA-KCNE3 D90N.................................
Figura 17 Transporte transepitelial registrado en colon distal de animales
Villina HA-KCNE3 y Villina HA-KCNE3 D90N..................................
Figura 18 Distribución de las proteínas de fusión HA-KCNE3 y HA-KCNE3
D90N y de la unidad formadora de poro KCNQ1 en diferentes
tejidos...............................................................................................
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VIII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I Concentración intracelular y extracelular de los
principales iones encontrados en una célula mamífera...................
Tabla II Longitud del intestino y porcentaje de agua presente en las
heces de animales silvestres y transgénicos HA-KCNE3 y
HA-KCNE3 D90N.............................................................................
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.........65
IX
ABREVIATURAS
D90N: mutación aspartato 90 por asparragina.
HA: hemaglutinina.
Isc: corriente de cortocircuito.
Vte: potencial o voltaje transepitelial.
LQTS1: síndrome del QT largo.
I/V: relación corriente/voltaje.
NKCC: triple co-trasportador de sodio, potasio y cloruro.
IPTG: isopropil-β-D- tiogalactopiranósido
X-Gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolil-beta-D-galactosido
PMSG: gonadotrofina sérica de yegua gestante.
HCG: gonadotrofina coriónica humana.
SPF: Specific Patogen Free
FSK: forskolina
IBMX: isobutilmetilxantina
293B: cromanol 293B
CCH: carbacol
1
1. RESUMEN
KCNQ1 es un canal de potasio dependiente de voltaje cuya actividad es regulada por
distintas subunidades accesorias. En el epitelio intestinal KCNQ1 se asocia a KCNE3,
este complejo permite la salida basolateral de potasio independiente de potencial frente
a estímulos que aumentan el AMPc. Estas corrientes hiperpolarizan la membrana y con
ello generan el potencial electromotríz necesario para la adecuada y continua secreción
de cloruro y fluido luminal desde las criptas del colon.
En este trabajo se estudió el efecto fisiológico de la inactivación del canal
KCNQ1/KCNE3, en las corrientes transepiteliales del intestino y su impacto en la
eliminación de fluidos. Para ello se evaluó el efecto de la mutación D90N de KCNE3, en
las corrientes y en la ubicación subcelular en células CHO. Los registros de patch
clamp en configuración célula completa mostraron que la mutación provoca una
disminución de las corrientes medidas a 0mV cercanas al 80%. Se mostró que la
mutación y adición del epítope HA no alteran la localización subcelular de KCNE3.
Además se generó un ratón transgénico que expresó HA-KCNE3 D90N de manera
específica en el epitelio intestinal. La evaluación fisiológica se realizó registrando las
corrientes de Cl- en cámara de Ussing. En cuatro de cinco líneas transgénicas mutantes
se detectó una disminución de las corrientes estimuladas por AMPc y una pérdida de
las corrientes sensibles al inhibidor del complejo KCNQ1/KCNE3, cromanol 293B.
Se demostró que la mutación D90N de KCNE3 tiene un efecto dominante negativo en
las corrientes llevadas por KCNQ1/KCNE3 en el epitelio intestinal. Dado que la pérdida
en la actividad de este no compromete de manera la significativa secreción de fluido
intestinal la función sería compensada por el canal de potasio activado por calcio.
2
1.1 Summary
KCNQ1 is a voltage-gated potassium channel, this pore forming unit associates with
different auxiliary β- subunits, which modulate its activity. In the intestinal epithelium
KCNQ1/KCNE3 leads basolateral potassium efflux that generate voltage independent
currents that contribute to maintain a membrane potential compatible with cAMP-
stimulated chloride and fluid secretion in small intestine and colon crypts.
Were studied the physiological effect of KCNQ1/KCNE3 inactivation in the bowel,
analyzing transmembrane currents and fluid secretion. Whole cell patch clamp studies
of the cotransfection with KCNE3 subunit and KCNQ1 of CHO cells, showed that the
D90N mutation in KCNE3 generates a marked reduction in KCNQ1/KCNE3-mediated
current (1635 ± 670 pA for HA-KCNE3 and 309± 34 pA for HA-KCNE3 D90N (n=4)
measurements at 0 mV). In addition, this mutation and the addition of HA epitope did not
lead to changes in channel activity, voltage dependence or subcellular localization.
Transgenic mice were generated to express D90N-KCNE3 in the intestinal epithelium
under the control of the villin promoter. Short circuit current experiments performed in
Ussing chamber showed an impaired Cl- secretory response to cAMP and abolished
293B-sensitive Clˉ currents in jejunum and colon from five transgenic lines HA-KCNE3
D90N expressing animals when compared with both transgenic lines HA-KCNE3 mice. A
normal Ca-activated secretion elicited by muscarinic activation was observed.
This thesis suggest that the KCNE3 D90N is a dominant negative mutation and is
enough to abolish cAMP- dependent intestinal chloride secretion in transgenic mice. But
it is not essential for fluid secretion in the intestine. KCNQ1/KCNE3 function is probably
compensated by the potassium channel activated by calcium.
3
2. INTRODUCCIÓN
Los canales iónicos son proteínas integrales de membrana que forman un poro acuoso
que facilita el paso de iones desde un lado al otro de ésta en forma selectiva. Son
críticos para el organismo ya que controlan importantes procesos como el potencial de
reposo, la regulación del volumen celular, conducción nerviosa en células excitables,
absorción y secreción de sustancias en células epiteliales. Dependiendo de su
selectividad iónica se clasifican en canales de sodio (Na+), potasio (K+), calcio (Ca+2) y
cloruro (Cl-). También existen canales no selectivos que permiten el paso de cationes
en general.
Debido a su gran importancia fisiológica los canales iónicos están fuertemente
regulados por señales eléctricas como potencial de membrana, ligandos químicos
(como neurotransmisores y calcio intracelular) o señales físicas como por ejemplo
temperatura y tensión de la membrana. Estos factores regulan la apertura, cierre e
inactivación del canal.
2.1 Propiedades biofísicas de las membranas celulares.
La membrana plasmática actúa como barrera entre el medio intracelular y el
extracelular. Su estructura es una bicapalipídica formada principalmente por fosfolípidos
(fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, entre otros) que le otorgan una
4
naturaleza hidrofóbica, haciéndola impermeable a iones y moléculas cargadas
eléctricamente.
El medio intra y extracelular presentan distintas concentraciones iónicas (Tabla I). La
asimetría en el estado estacionario está regulada por procesos de transporte pasivo y
activo. Respecto del primero, en el medio intracelular el mayor número de moléculas no
difusibles, como proteínas, determina que cationes (principalmente K+) se retengan en
el citoplasma para neutralizar estos polianiones y se repelan Cl - hacia el espacio
extracelular, proceso que se conoce como equilibrio Donnan.
El aumento de la concentración intracelular de potasio genera un gradiente químico que
favorece la salida de este catión hacia el espacio extracelular. Este movimiento de
iones a su vez establece un gradiente eléctrico por la acumulación de cargas positivas
en el medio extracelular en la proximidad de la membrana, sin alterar la
electroneutralidad macroscópica de dicho espacio. Así se crea una fuerza electromotriz
que se opone al movimiento de cargas positivas transportadas por el K+ a favor de su
gradiente de concentración.
5
ElectrolitoConcentración
Intracelular (mM)
Concentración
Extracelular (mM)
Na+ 5- 15 145
K+ 140 4
Mg2+ 0,5 1-2
Ca2+ 10-4 1-4
Cl- 5- 30 110
HCO3- 1- 3 20- 30
Tabla I. Concentración intracelular y extracelular de los principales iones
encontrados en una célula mamífera.
6
Si consideramos un modelo donde canales de potasio se encuentran permanentemente
conduciendo iones, el gradiente electroquímico tendería a desaparecer en el tiempo. En
la célula, el transporte activo primario ayuda a mantener este potencial electroquímico
movilizando iones en contra de su gradiente de concentración utilizando como fuente de
energía la hidrólisis de ATP. La bomba Na+/K+ intercambia potasio y sodio en contra de
su gradiente de concentración de forma electrogénica, ya que ingresan dos cargas
positivas (potasio) y salen tres (sodio). Como resultado, la concentración de K+
intracelular es mayor que la extracelular e inversa para la del sodio, lo que genera un
gradiente de salida para los iones potasio y uno de entrada para los iones Na +. El
potencial de reposo de la célula es muy cercano al potencial de equilibrio del potasio ya
que en estas condiciones los canales predominantemente abiertos son los que
conducen este catión. El potasio se moverá hacia el extracelular a favor del gradiente
químico hasta generar un potencial eléctrico opuesto de igual magnitud lo que detendrá
su movimiento neto. Este potencial denominado potencial de equilibrio se calcula
usando la ecuación de Nerst:
E= RT ln [ion]extracelular
zF [ion]intracelular
,donde E es el potencial de equilibrio o reposo para un determinado ion; R es la
constante universal de los gases (8,314 JK−1mol−1); T corresponde a la temperatura
absoluta (273,16 + T(ºC)); F es la constante de Faraday, el número de coulombs o
carga eléctrica por mol de electrones (9,648×104 Cmol−1 ) y z es la carga del ion.
7
El rápido flujo de iones de un lado a otro de la membrana a través de un canal iónico
genera una corriente eléctrica (I, amper (A)), donde la membrana plasmática actúa
como un capacitor (C, faradio (F)). Desde un punto de vista biológico, un capacitor
permite separar dos soluciones altamente conductivas (medio intracelular y
extracelular) y almacenar energía potencial entre los compartimentos (cargas negativas
en el medio intracelular y positivas en el extracelular). Los canales iónicos actúan como
un conductor (conductancia (g)), que al abrirse bajan la resistencia (R, ohm (Ω)) al paso
del ion específico que transportan. La figura 1 muestra un diagrama de un circuito
eléctrico que representa a una célula.
8
Figura 1. Modelo eléctrico de la membrana plasmática de una célula intacta. Los
canales iónicos actúan como una conductancia que disminuyen la resistencia al flujo
de iones (g=1/R) en función del potencial de equilibrio. En este voltaje el flujo neto de
iones es cero. El esquema se enseña el potencial de equilibrio para potasio (EK), para
cloruro (ECl) y potencial de equilibrio para sodio (ENa). También se muestra la bomba
de sodio- potasio, que tiene como función generar y mantener los gradientes de Na+ y
K+ transcelular. El potencial reposo de la membrana celular es resultado del gradiente
y apertura de vías conductivas selectivas a de K+.
9
2.2 Canales de potasio.
Los canales de potasio son la familia de canales más amplia y diversa. Cumplen
funciones esenciales en todos los tipos celulares como la mantención del potencial de
reposo celular, propagación del impulso nervioso, repolarización cardiaca, contracción
muscular y mantención de la homeostasis de potasio a través del transporte de éste
tanto en intestino como en riñón. Se clasifican en grandes grupos: canales de potasio
dependientes de voltaje, canales de potasio activados por calcio, canales Kir o
rectificadores internos y canales K2P o de tipo background.
Los canales dependientes de potencial poseen un sensor de voltaje, que es un arreglo
de aminoácidos cargados positivamente en un segmento de transmembrana que
detectan los cambios de voltaje de ésta y median el cambio conformacional de la
proteína que determina el estado abierto o cerrado del canal. Dentro de este grupo se
encuentran Kv, KCNQ, EAG, entre otros.
En los canales activados por calcio la regulación de la apertura y cierre del canal está
directa o indirectamente relacionada con la concentración intracelular de calcio. Se
clasifican dependiendo de su conductancia en canales de gran conductancia (BK),
conductancia intermedia (IK) y de pequeña conductancia (SK).
Los canales rectificadores de potasio Kir generan una mayor conductancia de potasio
hacia el medio citoplasmático a potenciales de membrana hiperpolarizantes más que
despolarizantes. Lo anterior ocurre porque, a potenciales despolarizantes existe un
bloqueo del poro del canal por Mg2+ y poliaminas intracelulares como espermina y
putrescina, lo que disminuye el flujo de salida de los iones de potasio.
10
Por último, los canales K2P tienen como principal característica la presencia de dos
dominios de poro. Éstos ayudan a mantener el potencial de reposo celular ya que están
abiertos cuando la célula se encuentra a estos potenciales. Ejemplos de esta familia
son los canales TALK, TASK-2, TREK-1, entre otros. La apertura de estos canales
puede ser regulada por la presión de oxígeno, pH, los lípidos, el estiramiento mecánico,
los neurotransmisores y receptores acoplados a proteínas G.
2.3 Canales de potasio KCNQ1.
KCNQ1 (Kv 7.1) es parte de la superfamilia de canales de potasio dependientes de
voltaje. Se encuentra principalmente en corazón, oído interno, tráquea, colon, entre
otros tejidos (Kunzelmann y Mall, 2002). La secuencia codificante de este canal fue
clonada por primera vez en 1996 por Wang y colaboradores (Wang et al., 1996) a partir
de pacientes con la patología cardiaca LQTS1. Este síndrome se caracteriza por un
retardo en la repolarización cardiaca (intervalo entre el complejo QRS- y onda T del
electrocardiograma) y puede generar arritmias y muerte súbita.
El canal KCNQ1 estructuralmente se caracteriza por ser un homotetrámero, que es la
unidad funcional que conduce los iones (también denominada subunidad alfa). Cada
monómero tiene tiene un peso molecular de 75 KDa (676 residuos aminoacídicos) y
está formado por seis dominios de transmembrana, uno formador de poro (6TM/1P)
(Heitzmann y Warth, 2008) y sus extremos amino y carboxilo son citoplasmáticos,
(Figura 2). Cada segmento de transmembrana se denomina S, así el sensor de voltaje
se localiza en S4 y el dominio P, formador del poro entre S5 y S6. En sistemas de
11
Figura 2. Topología y Arquitectura del canal de potasio KCNQ1. A) A la izquierda
se muestra la topología de la proteína auxiliar KCNE, cada subunidad β posee un
dominio de transmembrana con el extremo amino-terminal extracitoplasmático y el
extremo carboxilo- terminal citoplasmático. A la derecha, monómero KCNQ1, cada
proteína está formada por seis dominios de transmembrana (S), donde el sensor de
voltaje se encuentra en (S4) y la región formadora de poro se forma entre S5 y S6.
B) Arquitectura de una canal KCNQ1/KCNE funcional, el complejo está formado por
cuatro subunidades formadoras de poro y dos subunidades auxiliares que conducen
potasio a favor de su gradiente de concentración. Modificación de Jespersen T.,
Grunnet M. and Olesen S.-P. (2005) The KCNQ1 potassium channel: from gene to
physiological function. Physiology (Bethesda)., 20, 408-416.
12
expresión heterólogos transfectados con KCNQ1 éste se activa lentamente a
potenciales despolarizantes (0 a 40 mV).
In vivo este canal se ensambla con proteínas auxiliares o subunidades β generando
canales funcionales. Estas proteínas accesorias regulan el mecanismo de compuerta
del canal y su localización subcelular. Es así que dependiendo del tejido, KCNQ1 se
asocia a diferentes subunidades β, que modulan diferencialmente la amplitud y cinética
de las corrientes (Grunnet et al., 2003; Melman et al., 2004; Panaghie et al., 2006;
Peretz et al., 2002).
2.4 Subunidades accesorias KCNE
Los canales de potasio KCNQ1 forman complejos con subunidades auxiliares β o
regulatorias, las que modifican algunas de sus características biofísicas como vida
media, selectividad iónica, dependencia a voltaje, cinéticas de activación y
desactivación. Los cambios en tales características derivados de la expresión
diferencial en los tejidos de las subunidades β tienen importantes efectos fisiológicos.
La coexpresión del canal KCNQ1 con KCNE1 en corazón y oído interno enlentece
notablemente tanto la cinética de activación como la de desactivación del canal. En
colon, por su parte, la subunidad alfa se acopla a KCNE3 generando un poro
constitutivamente abierto, con una mínima dependencia a voltaje (Nakajo y Kubo,
2007).
La familia de genes KCNE codifican para las subunidades β de distintos canales de
potasio sensibles a voltaje, ubicados tanto en la membrana basolateral como en la
13
apical de la células epiteliales (Grahammer et al., 2001; Heitzmann et al., 2004). Éstas
forman un grupo de cinco péptidos KCNE1 a KCNE5, que tienen como características
comunes ser pequeños (106 a 177 residuos aminoacídicos), tener sólo un segmento
transmembrana de aproximadamente 25 residuos, poseer el extremo NH2-terminal
extracitoplasmático y C-terminal intracelular (Gage y Kobertz, 2004; Grunnet et al.,
2003). Se ha visto que para KCNE1 y 3 la modulación de la actividad ejercida sobre
KCNQ1 se debe a una interacción física entre la unidad accesoria y el dominio de
compuerta de KCNQ1 (Boulet et al., 2007; Melman et al., 2004). Esta modulación
estaría determinada por aminoácidos ubicados en el segmento transmembrana,
específicamente treonina 58 para KCNE1 y valina 72 para KCNE3 (Melman et al.,
2001). Uno de los mecanismos postulados es que estas proteínas afectan el
movimiento de compuerta sensible a voltaje de KCNQ1 (Nakajo y Kubo, 2007).
Entre las subunidades accesorias beta, la más estudiada es KCNE1 (MinK) la que se
expresa principalmente en corazón. Esta proteína accesoria afecta la amplitud y
cinética del canal KCNQ1, otorgándole actividad a potenciales de membrana positivos.
Así la apertura del canal permite la repolarización de los cardiomiocitos (Grahammer et
al., 2001; Kaczmarek y Blumenthal, 1997). En tejidos no excitables, como el epitelio del
colon, se ha propuesto que KCNQ1 se asocia con otra proteína auxiliar, KCNE3 o
Mirp2. Esta proteína está formada por 103 aminoácidos, tiene un peso molecular de
alrededor de 12 KDa y se expresa mayoritariamente en oído interno, estómago, íleon,
yeyuno y colon.
14
Las proteínas KCNQ1 y KCNE3 fueron detectadas en la membrana basolateral de las
células de la cripta del intestino delgado y colon, donde ocurre la secreción intestinal de
electrolitos (Dedek y Waldegger, 2001; Liao et al., 2005). Al coexpresarse estas
proteínas en diferentes sistemas heterólogos (células de ovario de hámster chino
(CHO), células T84 y ovocitos de Xenopus laevis), las corrientes de potasio evocadas
presentan una mínima dependencia a voltaje y tienen una relación corriente/voltaje (I/V)
lineal. Esto significa que a potenciales de reposo de la célula el complejo
KCNQ1/KCNE3 es capaz de conducir potasio de forma continua, facilitando la
secreción apical de cloruro. En cambio las corrientes evocadas sólo por KCNQ1, sin la
subunidad KCNE3, se activan lentamente a potenciales positivos y tienden a cero a
potenciales de reposo, por lo que no es funcional a los potenciales fisiológicos en las
células epiteliales del colon.
2.5 Secreción intestinal de cloruro.
Entre las funciones del intestino se encuentran la movilización de nutrientes, sales y
agua desde la mucosa hasta los capilares sanguíneos y viceversa. Su arquitectura
facilita estas actividades al tener una gran área donde realizarlas. La pared del tracto
digestivo convencionalmente se describe en capas: mucosa que comprende el epitelio,
lámina propia y capa muscular interna; submucosa formada principalmente por tejido
conectivo; la capa muscular externa y serosa (figura 3).
El intestino tradicionalmente se divide en duodeno, yeyuno, íleon y colon. Cada
segmento tiene funciones altamente especializadas, así por ejemplo en el duodeno se
15
realiza la mayor parte de las reacciones de digestión enzimática de los alimentos, en
yeyuno e íleon se produce la absorción de nutrientes, mientras que en el colon se
absorbe principalmente agua y sodio. El transporte de nutrientes y electrolitos se realiza
tanto en la superficie epitelial como en las criptas de Lieberkühn. La secreción de sales
ocurre en las células columnares y globosas ubicadas principalmente en las criptas y
superficie epitelial (Kunzelmann et al., 2001). En el colon la secreción de electrolitos
facilita el transporte del mucus fuera de las criptas y mantiene la hidratación del tejido.
Las células secretoras del colon presentan en la membrana basolateral la bomba sodio-
potasio. Esto genera un gradiente electroquímico que favorece la entrada de Na+, el que
es capaz de conducir el flujo de un K+ y dos Cl- a través del triple co-trasportador de
sodio, potasio y cloruro (NKCC). De esta manera la célula puede acumular Cl - sobre su
potencial de equilibrio (Kunzelmann et al., 2001). La secreción de cloruro hacia el lumen
intestinal se produce por la apertura del canal de Cl- CFTR (canal mutado en la Fibrosis
Quística (Cheng et al. ,1990)), presente en la membrana apical del epitelio.
16
Figura 3. Esquema del tracto digestivo. A) Modelo extendido del sistema digestivo
de ratón, en el que se muestran los distintos órganos y porciones que forman el
intestino delgado y colon. B) Arquitectura de la pared mucosa intestinal formada por la
mucosa, submucosa, muscular externa y serosa. Adaptación de Treuting P. M., Dintzis
S. M. y Montin K. S. (2012) Comparative Anatomy and Histology, A Mouse and Human
Atlas, 160 pp y http://www.virtualmedicalcentre.com.
17
La secreción de sales ocurre en las células columnares y globosas ubicadas
principalmente en las criptas y superficie epitelial (Kunzelmann et al., 2001). En el colon
la secreción de electrolitos facilita el transporte del mucus fuera de las criptas y
mantiene la hidratación del tejido.
Las células secretoras del colon presentan en la membrana basolateral la bomba sodio-
potasio. Esto genera un gradiente electroquímico que favorece la entrada de Na+, el que
es capaz de conducir el flujo de un K+ y dos Cl- a través del triple co-trasportador de
sodio, potasio y cloruro (NKCC). De esta manera la célula puede acumular Cl - sobre su
potencial de equilibrio (Kunzelmann et al., 2001; Schroeder et al., 2000). La secreción
de cloruro hacia el lumen intestinal se produce por la apertura del canal de Cl- CFTR
(canal mutado en la Fibrosis Quística (Cheng et al. ,1990)), presente en la membrana
apical del epitelio.
Para que esta secreción de cloruro sea sostenida, es necesaria la apertura de canales
basolaterales de potasio que mantengan el potencial eléctrico de la membrana. En las
criptas del colon se expresan los canales de potasio KCNN4 y KCNQ1, regulados por
Ca2+ y AMPc respectivamente (Jespersen et al., 2005). La apertura de estos canales
mantiene el potencial electromotriz para la salida apical continua de cloruro (Flores et
al., 2007; Vallon et al., 2005). El modelo que se ha propuesto para la secreción de
cloruro por las células del epitelio intestinal se muestra en la figura 4.
18
Figura 4. Modelo de la secreción intestinal de cloruro. La bomba sodio/potasio
basolateral genera la gradiente electroquímica que favorece la entrada de sodio a
través del triple co-transportador NKCC1 el que acumula cloruro por sobre su
potencial de equilibrio. El cloruro es subsecuentemente secretado por medio de CFTR
localizador en la membrana apical. El flujo continuo de cloruro es mantenido por los
canales de potasio KCNQ1/KCNE3 y KCNN4, regulados por AMPc y Ca2+
respectivamente. Los canales de potasio hiperpolarizan la célula y reciclan este catón
a través de la membrana basolateral. Paralelamente a la secreción de cloruro ocurre
la secreción paracelular de sodio.
19
2.6 Animales genéticamente modificados como herramienta de estudio.
Los animales genéticamente modificados proveen de poderosa herramienta para
estudiar la función de una determinada proteína in vivo. El desarrollo de la tecnología
de ADN recombinante a permitido generar distintas metodologías para intervenir el
material genético de los seres vivos. Para la generación de modelos murinos las
principales técnicas utilizadas son la micro-inyección pronuclear y la modificación
genética dirigida (gene targeting) mediante la recombinación homóloga.
Con la primera técnica se generan los animales denominados transgénicos. Esta se
basa en la introducción de la secuencia codificante de una proteína exógena junto con
un promotor específico (transgen) a través de la microinyección pronuclear. La inserción
en el genoma ocurre al azar obteniéndose crías transgénicas con distintos grados de
expresión de la proteína, lo que se conoce como descendencia variegada (Ohtsuka et
al., 2012). Lo anterior es consecuencia del sitio y número de copias en las que se
integra el transgen. Así para minimizar los efectos posicionales del transgen es
imprescindible el análisis de distintas líneas transgénicas. La incorporación del transgen
en células de la línea germinal permite transmitir la proteína recombinante a las
siguientes generaciones. A estos animales se les denomina fundadores y son los que
dan origen a las líneas de ratones transgénicos independientes que serán estudiadas.
El segundo sistema consiste en la micro-inyección del transgen en células madre
embrionarias. El transgen posee una secuencia génica exógena que mediante
recombinación homóloga es capaz de modificar un gen de forma dirigida y en una copia
única. Esta técnica permite la generación de animales nulos o knockout, donde una
20
secuencia génica es delecionada o interrumpida, lo que trae como consecuencia la
anulación de la expresión de una proteína. Otro modelo basado en la recombinación
homóloga, son los ratones knockin. En estos se remplaza la secuencia génica
endógena por una modificada, por ejemplo con mutaciones puntuales. El desarrollo
posterior de esta tecnología ha permitido generar modelos murinos condicionales,
donde la introducción del vector puede estar restringida a tejidos específicos o
inducibles en alguna etapa puntual del desarrollo del animal.
Esta tesis tiene como objetivo estudiar el efecto de la pérdida de función del canal
KCNQ1/KCNE3 en el epitelio intestinal. Para ello se aprovechará la mutación puntual
aspartato por asparragina en la posición 90 de la subunidad accesoria KCNE3 (KCNE3
D90N) descrita por Abbott y Goldstein (2002). Estos autores postularon que la
reducción de alrededor de cuatro veces densidad de corriente conducida por el canal de
potasio KCNQ1/KCNE3 en sistemas heterólogos ocurre por un mecanismo dominante
negativo. Esto último significa que la presencia de la proteína mutante condiciona la
pérdida de función del canal.
La generación de una animal transgénico permite estudiar la dominancia negativa de la
mutación, ya que en este modelo la expresión de la proteína transgénica provocará una
falta de función aun cuando persista la expresión de la proteína endógena. Además la
utilización de un promotor específico para intestino permite estudiar el rol de KCNQ1 en
la secreción intestinal de cloruro en el colon, por pérdida de función de este canal. Esta
técnica, a diferencia del ratón nulo o knockout, evita el desarrollo de potenciales
21
fenotipos asociados a la pérdida de la expresión de la proteína en otros tejidos donde
ésta se expresa. Además el hecho que esta proteína tenga un efecto dominante
negativo permite generar animales donde la funcionalidad nativa de la proteína sea
remplazada por la del alelo mutante incluso en animales heterocigotos.
2.7 Hipótesis.
La expresión de la mutante KCNE3 D90N en el epitelio intestinal del ratón tiene un
efecto dominante negativo sobre las corrientes de potasio conducidas por el canal
KCNQ1.
2.7.1 Objetivo General.
Evaluar el efecto de la expresión la mutante KCNE3 D90N en el intestino de ratón
sobre las corrientes de potasio conducidas por el canal KCNQ1.
2.7.2 Objetivos específicos.
1. Generar una proteína de fusión que contenga el epítope Hemaglutinina (HA) en el
extremo 5' del cDNA codificante para KCNE3 y una mutación puntual sitio dirigida en
el aminoácido 90 de esta proteína.
2. Evaluar la localización subcelular y funcionalidad electro-fisiológica del canal KCNQ1/
HA-KCNE3 D90N en un sistema heterólogo.
3. Generar un ratón transgénico que exprese la proteína de fusión HA- KCNE3 D90N
acoplado a un promotor tejido específico para el epitelio intestinal, determinar su
ubicación subcelular y el efecto en las corrientes transepiteliales del intestino.
22
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES.
3.1.1 Reactivos.
5x Green go Taq reaction buffer (Promega), 5-bromo-4-chloro-3-indolil-beta-D-
galactosido (X- Gal) (Gibco-invitrogen), 6x DNA Loading Dye (Fermentas), Agar
(Sigma- Aldrich), Agarosa (Lafken), Agarosa ultrapura (Invitrogen), Ampicilina
(Sigma), dATP (Fermentas), dCTT (Fermentas), dGTP (Fermentas), dTTP
(Fermentas), EDTA (Sigma), Elutip-D Columns y Elutip-D prefilters (Whatman),
Etanol (Merck), Extracto de levadura (Merck), Gene ruler 1 Kb DNA ladder
(Fermentas), Isopropanol (Merck), Isopropil-β-D- tiogalactopiranósido (IPTG)
(Fermentas), MgCl2 (Sigma-Aldrich), MgSO4 (Toboyo), Peptona (Merck), pGEM®- T
Vector System (Promega), Plasmid Midi Kit (Qiagen), Quiaex II Gel extraction Kit
(Quiagen), SDS (Sigma), Tris – HCl (Sigma), Wizard Plus Midipreps DNA
Purification System (Promega).
Enzimas de restricción: BamHI, BsiWI, DpnI, EcoRI, MluI, SalI, SpeI, XbaI, XhoI
(Fermentas).
Otras enzimas: KOD polimerasa (Toyobo), Proteinasa K (Bioline), SAP (Shrimp
Alkaline Phosphatase, Fermentas), T4 DNA ligasa (Fermentas), Taq polimerasa.
23
3.2 METODOLOGÍA.
3.2.1 Vectores de Expresión.
El cDNA de hKCNQ1 y hKCNE3 en el vector pRAT fue facilitado por el Dr. Steve A.
Goldstein (Institute for Translational Medicine University of Chicago, USA), hKCNQ1
fue subclonado en el vector pCR3.1, mientras que la subunidad β fue insertada en el
vector pIRES-hCD8 donado por Dr. Florian Lesage, Institut de Pharmacologie
Moléculaire et Cellulaire, Sophia Antipolis, Valbonne, France).
3.2.1.1 Mutagénesis sitio dirigida Aspartato - Asparragina
La mutagénesis se basó en el método Quick-Change (Stratagene, La Jolla, Ca,
USA) esquematizado en la Figura 5. La mutación puntual aspartato (D) por
asparragina (N) fue generada mediante la extensión de partidores en orientaciones
opuesta, que contienen el cambio nucleotídico necesario para sustituir un residuo 90
aspartato por asparragina (guanina por alanina). Los partidores utilizados fueron:
sentido 5'- CAA GCG TAG TAA CCC CTA TCA TG -3' y antisentido 5'- GAT AGG
GGT TAC TAC GCT TGT CC -3'.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en el termociclador Axygen
Maxygen. La mezcla de la reacción contuvo pIRES- KCNE3-CD8 40 ng/uL como
templado; 0,375 mM de cada partidor; 0,623 mM de dNTPs y 0,5 U de la enzima
KOD en un volumen final de 20 μL. Esta reacción se realizó bajo las siguientes
condiciones: denaturación inicial a 94ºC por 2 minutos, seguida de 15 ciclos de
denaturación a 94ºC por 15 segundos, alineamiento a 60ºC por 30 segundos y
elongación a 72ºC por 30 segundos. La elongación final se realizó a 72ºC por 3
24
minutos. Posteriormente el producto de PCR fue digerido con la enzima DpnI, que
tuvo como función degradar el DNA parental. Esto quiere decir que no incorporó la
mutación D90N.
25
Figura 5. Mutación sitio dirigida. El vector que contiene el blanco de la mutación ( ) es
denaturado y alineado con los partidores mutagénicos. Posteriormente, ocurre la
elongación de los partidores por la polimerasa KOD. De esta forma se genera un vector que
incorpora la mutación deseada. Luego el producto de PCR es tratado con la endonucleasa
DpnI, la que reconoce y digiere exclusivamente el DNA que se encuentra metilado en la
secuencia GamTC. Así se digerirá el ADN molde (azul) pero no el plásmido mutado (negro)
que proviene de una reacción de PCR y que por lo tanto no se encuentra metilado. Luego
se transforman bacterias Escherichia coli DH5α con el ADN tratado para la reparación del
vector.
26
3.2.1.2 Incorporación del epítope Hemaglutinina (HA).
A través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa el constructo fue
flanqueado por las enzimas EcoRI- BsiWI (5') y MluI- BamHI (3'). Además se le
añadió en el extremo amino terminal (en seguida del triplete ATG) la secuencia
codificante para el epítope HA (5'- YPYDVPVYA -3') utilizando los partidores E3-
EcoRI-BsiHA (5'- GAA TTC CGT ACG ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC
TAC GCT GAG ACT ACC AAT GGA ACG GAG ACC -3') y E3-MluI- BamHI (5'- ACT
CGT GGA TCC TTA GAT CAT AGA CAC ACG GTT C -3'). Las condiciones de la
reacción de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, con la
diferencia que la temperatura de alineamiento para estos partidores fue de 56ºC. Las
construcciones se denominaron HA-KCNE3 D90N y HA-KCNE3, las que fueron
verificadas por secuenciación automática (Macrogen, Korea).
3.2.1.3 Subclonamiento del producto de PCR en el vector pGEM-T.
Para este procedimiento se utilizó el Kit pGEM®- T Vector System (Promega).
pGEM-T es un vector de clonamiento linealizado que posee un residuo de timina
desapareado en ambos extremos 3'. Este nucleótido facilita la ligación de productos
de PCR ya que impide la recircularización espontánea del vector. Por lo anterior,
pGEM-T es un vector de amplificación de gran eficiencia, que permite la selección
de colonias que han incorporado el vector por medio de genes de resistencia a
ampicilina y kanamicina. La posterior identificación de colonias que han incorporado
el inserto de ADN en estudio se determina por la coloración de éstas. El vector
posee el gen que codifica para la enzima β- galactosidasa, el que se encuentra
27
interrumpido por el sitio de clonamiento múltiple. Si el vector se recirculariza sin
incorporar el ADN en estudio, al inducirse el gen lacZ con isopropil-β-D-
tiogalactopiranósido (IPTG) en presencia del análogo de galactosa 5-bromo-4-cloro-
3-indolil-beta-D-galactosido (X-Gal) se dará origen a colonias azules. En los vectores
recombinantes se interrumpirá el gen lacZ y se generarán colonias blancas, ya que
son incapaces de metabolizar X-Gal.
Para poder insertar el producto de PCR generado en el punto 3.2.1.2 en el vector
pGEM-T primero se debió adicionar el nucleótido adenosina en los extremos 5'.
Esto se realizó usando 6 uL de los productos HA-KCNE3 D90N o HA-KCNE3, 2mM
de MgCl2; 1,0 uL de Buffer Taq 10X; 0,2 mM dATP y 5 U/μL de Taq DNA polimerasa
en un volumen final de 10 μL, que se incubó por 30 min a 70ºC. Posteriormente se
llevó a cabo la reacción de ligación de HA-KCNE3 o HA-KCNE3 D90N con el vector
pGEM-T en una relación molar 3:1 inserto con respecto al vector, según la fórmula:
Concentración de Inserto = Concentración de Vector x Tamaño del Inserto (Kb) x 3
Tamaño del Vector (Kb)
,donde se usaron 15 ng del inserto, 50 ng del vector pGEM-T que se incubaron con
20 U/μL de la enzima T4 DNA ligasa (Promega) por 16 h a 4ºC.
28
3.2.1.4 Transformación de células competentes.
El producto de ligación se amplificó en bacterias Escherichia coli DH5α, las que se
transformaron usando la metodología de golpe térmico. Esto consistió en
descongelar lentamente las bacterias a 4ºC, posteriormente a alícuotas de 50 μL se
les agregaron 2 μL de reacción de ligación que se incubaron por 30 min. Luego se
sometieron a un golpe térmico a 42ºC por 90 s y se mantuvieron a 4ºC por 180 s.
Posteriormente se añadieron 400 μL de medio de cultivo Luria-Bertani (LB) sin
antibiótico y se incubaron por 1h a 37ºC y 225 rpm. Transcurrido este tiempo se
cultivaron las bacterias en placas con agar LB suplementado con ampicilina/ IPTG/
X-Gal (100 μg/mL, 20 μL/mL y 50 μg/mL respectivamente). Éstas se incubaron a
37ºC por 16h.
Las colonias blancas se cultivaron en 5 mL de medio LB- ampicilina por 16 h a 37ºC
y 225 rpm. De estas células se extrajo el producto de la reacción de ligación pGEM-
T HA-KCNE3 o pGEM-T HA-KCNE3 D90N.
3.2.1.5 Purificación del ADN plasmidial.
El ADN proveniente de la amplificación bacteriana se extrajo usando la metodología
de lisis alcalina en pequeña escala con dodecilsulfato sódico (SDS). 5 mL del cultivo
de colonias blancas en medio de cultivo LB- ampicilina se centrifugaron por 10 min a
20ºC y 5000 rpm (Centrifuga 5804R, Eppendorf). Se eliminó el sobrenadante y
resuspendió el sedimento con la Solución I (10mM EDTA, 25mM Tris-HCl pH 7,5 y
200 μg/mL de RNAsa A). Luego se agregaron 500 μL de solución de lisis (0,2 M
29
NaOH, SDS 1%) y después de unos minutos se añadieron 500 uL de solución de
neutralización (Acetato de potasio 1,32 M pH 4,8). La mezcla se centrifugó por 10
min a 12000 rpm (centrifuga 5415C, Eppendorf), para eliminar el debris celular y se
conservó el sobrenadante que contenía el ADN plasmidial. Luego éste se precipitó
con isopropanol y se eluyó el exceso de sales con etanol al 70%. Por último se
resuspendió el ADN plasmidial con agua nanopura estéril.
3.2.1.6 Subclonamiento en el vector pIRES-hCD8.
Para extraer el fragmento que contenía la secuencia codificante para HA-KCNE3
D90N o HA- KCNE3 insertas en pGEM-T se realizó una reacción de digestión con
las enzimas EcoRI y BamHI (10 μL de DNA extraído; 0,6 μL de BamHI (10 U/μL,
Fermentas); 0,3 μL de EcoRI (10 U/μL, Fermentas); 4 μL de buffer Tango 10X
(Fermentas); ajustándose a 20 μL de volumen final con agua nanopura estéril por 1
hora a 37ºC. Con esta reacción se generó un producto de 357 pb para cada una de
las construcciones, las que se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al
1% en tampón TAE 1X teñido con bromuro de etidio. Posteriormente se purificaron
ambos fragmentos utilizando un sistema de minicolumnas (Wizard® SV Gel and
PCR Clean-Up System, Proemga). La concentración aproximada de DNA se
determinó mediante el sistema de captación de imágenes LabWorks (UVP, Inc).
El DNA extraído fue ligado en el vector pIRES-hCD8 el que previamente había sido
digerido con las enzimas EcoRI y BamHI y desfosforilado con SAP (Fermentas), así
se evitó la recircularización del vector, aumentado la eficiencia de la reacción de
ligación.
30
Tanto para HA-KCNE3 D90N o HA-KCNE3 se usó la relación molar 1:5, donde se
utilizaron 20 ng/μL de vector desfosforilado, T4 ligasa (4U/μL; Fermentas), tampón
T4 10X en un volumen final de 10 μL, incubándose por 16 horas a 4ºC. Además se
realizó una reacción de control de la religación del vector a la que no se le incorporó
el inserto. Posteriormente se transformaron bacterias E. coli DH5α de las que se
purificó el vector. La incorporación de cada inserto se evaluó por ensayos con
enzimas de restricción y secuenciación automática
3.2.1.7 Subclonamiento en el vector que posee el promotor de Villina.
El procedimiento fue similar al descrito en el punto anterior. Esta vez las
construcciones pGEMT- HA-KCNE3D90N y pGEMT- HA-KCNE3 fueron digeridas
con las enzimas BsiWI y MluI (2 μL de DNA extraído; 0,3 μL de BsiWI 10 U/μL,
Fermentas; 0,6 μL de MluI 10 U/μL, Fermentas) al igual que el vector Villina, que
posteriormente fue desfosforilado y ligado a cada fragmento de cDNA en relación 5:1
utilizando 50 ng/μL de vector. Luego usando 5 μL de esta reacción fueron
transformadas bacterias DH5α, de las que se purificaron los vectores Villina- HA-
KCNE3 D90N y Villina- HA-KCNE. La secuencia de los vectores fue verificada por
secuenciación automática (Macrogen, Korea).
31
3.2.2 Generación de Animales Transgénicos.
3.2.2.1 Purificación de Transgenes.
Los clones del vector Villina HA- KCNE3 D90N y Villina HA-KCNE3 fueron crecidos
en medio LB. Posteriormente se purificó el ADN con el sistema Plasmid Midi Kit
(Qiagen). Luego cada vector se digirió con la enzima de restricción SalI (20 μg de
ADN extraído; 3 μL de SalI 10 U/μL, Fermentas) para minimizar el tamaño del
transgen propiamente tal y eliminar el vector del transgen. Posteriormente se
separaron los fragmentos por electroforesis en gel de agarosa ultrapura al 1%
(Invitrogen), obteniéndose bandas de 3 Kb y 9,5 Kb. Este último fragmento contenía
el transgen que fue purificado desde el gel de agarosa con el sistema Quiaex II Gel
Extraction Kit (Quiagen). Finalmente se usó el sistema Elutip-D (Whatman), el que
consiste en una columna donde el DNA es retenido y las impurezas son lavadas con
una solución baja en concentración de sales (0,2M NaCl; 20mM Tris-HCl; 1mM
EDTA). Luego se eluyó el ADN aumentando la fuerza iónica de la solución (1M
NaCl; 20mM Tris-HCl; 1mM EDTA). El ADN fue precipitado con etanol 100% (Meck).
Por último el transgen fue resuspendido en tampón TE de baja concentración de
sales (1 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,1 mM EDTA). De esta forma cada transgen quedó
linealizado y a un pH que no afecta la supervivencia de los embriones
microinyectados con los trangenes Villina- HA- KCNE3 D90N y Villina- HA-KCNE3.
Luego se cuantificó cada transgen purificado y fueron diluidos hasta alcanzar una
concentración de 500 moléculas de DNA/pL, lo que se calculó mediante la fórmula:
32
Concentración de Tg (moléculas/pL)= Concentración de Tg (g/pL) X Nº de Avogadro
Peso molecular del Tg
Así el transgen se encuentra en condiciones de pH, tamaño y concentración óptimas
para ser microinyectado.
3.2.2.2 Manipulación de embriones y microinyección.
La manipulación de los animales y microinyección se llevó a cabo por personal
calificado de la Unidad de Genómica Funcional del Centro de Estudios Científicos.
Para ejecutar la microinyección de los transgenes Villina HA- KCNE3 D90N y Villina
HA-KCNE3 se preparó a la hembra donadora (de 3 a 4 semanas de vida, cepa
C57/CBA) con un tratamiento hormonal que aumentó la cantidad de óvulos
disponibles para la fecundación, proceso que se conoce como superovulación. Esto
se consiguió inyectando intraperitonealmente 0,1 ml de solución gonadotrofina sérica
de yegua gestante (PMSG) (50 UI/ml). Transcurridas 46 horas desde la primera
inyección se administró una dosis de 0,1 ml de una solución de gonadotrofina
coriónica humana (hCG) (50 UI/ml).
La hembra se mantuvo en apareo con un macho reproductor. Al día siguiente se
sacrificó y se le extrajeron los embriones, los que fueron sumergidos en medio de
mantención hasta el momento de la microinyección. Al mismo tiempo se aparearon
hembras de 6 a 9 semanas (cepa C57BL/6/CBA) con machos infértiles. Estas
hembras fueron receptoras de los embriones microinyectados. La microinyección se
realizó 24 horas post-coito y entre 4 a 5 horas antes de la fusión de los pronúcleos.
33
El transgen se inyectó en el pronúcleo masculino, ya que es más grande y por ende
más fácil de manipular. Luego fueron implantados entre 10 a 15 embriones por
oviducto de las hembras receptoras. A los 21 días post-implantación se obtuvieron
crías. El proceso general se resume en la figura 6.
3.2.2.3 Extracción de ADN genómico de ratón.
El ADN genómico se extrajo a partir de una biopsia de cola de ratón de 15 días de
vida. Primero se digirió el tejido con 10 μL de Proteinasa K (10 mg/mL; Sigma) en
500 μL de solución TEL (50 mM Tris-HCl pH 8,0 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,5%
SDS) que se incubó por 12h a 55ºC en agitación constante a 850 rpm.
Posteriormente, se centrifugó a 14.000 rpm por 15 min y se conservó el
sobrenadante al que se le agregaron 500 μL de etanol 100% (Merk). Éste fue
centrifugando nuevamente a 12.000 rpm por 10 min, se eliminó el sobrenadante y se
secó el precipitado a temperatura ambiente. Luego fue resuspendido con tampón TE
(10 mM Tris pH 8,0; 1 mM EDTA) y dejado en agitación constante a 800 rpm por 2 h
a 50ºC. El DNA genómico que almacenó a -20ºC hasta su posterior uso.
34
Figura 6. Esquema general de la generación de animales transgénicos
mediante la técnica de microinyección pronuclear. Primero, una hembra es
estimulada hormonalmente originando el proceso de superovulación. Una vez que
los óvulos son fertilizados, los embriones son retirados y microinyectados con el
transgen. Luego se implantan en una hembra receptora donde siguen su desarrollo
de forma regular. Una vez que las crías han cumplido dos semanas de vida se les
realiza una genotipificación mediante PCR que permite identificar a los animales
que han introducido el transgen en su genoma de manera estable (gris oscuro).
35
3.2.2.4 Genotipificación de ratones mediante PCR.
El ADN genómico extraído anteriormente fue sometido a una reacción de PCR con
el fin de poder identificar los animales transgénicos. De esta forma se seleccionaron
las líneas que incorporaron los transgenes Villina HA-KCNE3 D90N y Villina HA-
KCNE3 de manera estable. Los partidores utilizados flanquean la secuencia
codificante para HA-KCNE3. Partidor sentido pVillina (5'- GGT CGA GGC TAA AGA
AGA G -3') y antisentido phKCNE3 (5'- CTA CGC TTG TCC ACT TTG C -3') lo que
generó un producto de amplificación de 590 pb. La mezcla de la reacción contuvo
0,5 μL de ADN genómico como templado; 10 μM de cada partidor; 4 mM de dNTPs y
0,4 μL de enzima Taq polimerasa en un volumen final de 20 μL. El programa del
termociclador fue el siguiente: denaturación inicial a 94ºC por 5 min, seguido de
veinticinco ciclos de denaturación a 94ºC por 30 segundos, alineamiento a 58ºC por
30 segundos, elongación a 72ºC por 30 segundos y por último una elongación final a
72ºC por 5 min.
La visualización de los productos de PCR se realizó a través de una electroforesis
en gel de agarosa al 1% (Lafken) teñido con bromuro de etidio (Sigma- Aldrich). El
tamaño del producto de PCR se determinó por comparación con un patrón de peso
molecular de 1Kb (GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, Fermentas).
3.2.3 Transfección de células de ovario de hámster chino (CHO).
Las células de ovario de hámster chino (CHO; American Type Cell Culture) fueron
cultivadas en medio Ham's F12 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino
36
inactivado (Hyclone, Thermo). Estas fueron cultivadas en placas de polietileno de
100 mm y subcultivadas al alcanzar entre un 60-80 % de confluencia.
La transfección transitoria de hKCNQ1 y HA-KCNE3 D90N o HA-KCNE3 (1 μg/μL de
cada cDNA) se realizó por electroporación 24 horas post-subcultivo (1 pulso de 160V
por 15 ms; GenePulser Xcell, Bio Rad). Las células fueron incubadas a 37ºC en
atmósfera húmeda y 5,0 % de CO2, y fueron utilizadas para los estudios 24 a 48h
post transfección.
3.2.4 Estudio de las corrientes en célula única mediante patch clamp.
3.2.4.1 Teoría de la técnica de patch clamp.
El método electrofisiológico de patch clamp fue desarrollado en 1976 por Neher y
Sackmann (Neher y Sakmann, 1992). Permite detectar la corriente iónica que fluye a
través de un canal aislando eléctricamente una zona de membrana para registrar la
corriente que es conducida a través de ésta. El patch clamp se basa en la formación
de un sello de alta resistencia establecido entre una micropipeta de vidrio y la región
de membrana que hace contacto con ésta, alcanzando el orden de los giga ohm
(1GΩ= 109Ω). Este sello de alta resistencia permite tanto el estudio de corrientes que
fluyen a través de un solo canal (10-12 A) como las corrientes que fluyen a través de
todos los canales de cualquier célula (corrientes totales o macroscópicas). La
técnica ha permitido estudiar los canales iónicos en todos los tipos celulares
independiente de su tamaño.
37
En la configuración de célula completa (figura 7) existe continuidad entre la solución
de pipeta y el interior celular por lo que es posible dializar el contenido intracelular.
Lo anterior permite manejar las concentraciones iónicas, osmolaridad y pH
intracelulares como también agregar fármacos o ligandos. Otra ventaja de esta
técnica es que permite controlar las soluciones que bañan a la célula, haciendo
posible caracterizar biofísica y farmacológicamente a los canales iónicos.
38
Figura 7. Diagrama simplificado de la técnica de patch clamp en configuración
de célula completa. La técnica de patch clamp utiliza una micropipera de una
apertura de 1 μm de diámetro que se pone en contacto con la membrana plasmática
formando un sello de baja resistencia (A). Al aplicar succión se forma el gigasello
(B), si se aumenta la succión se rompe la membrana (C), permitiendo el acceso del
electrodo al espacio intracelular. La baja resistencia del electrodo permite tener un
buen acceso eléctrico a la célula (D). Modificación de
http://shermanlab.uchicago.edu/patch.html.
39
3.2.4.2 Obtención de corrientes macroscópicas.
Las placas de polietileno que contenían las células CHO co-transfectadas y
marcadas con microesferas con el anticuerpo anti- CD8 (Invitrogen Dynal ASA)
fueron montadas en un microscopio invertido (DM IL Type DFC290, Leica). La
medición de las corrientes se realizó por medio de un amplificador Axopatch 200B
(Axon Instruments) usando una configuración de célula completa. Todos los
experimentos se mantuvieron a temperatura ambiente (22 ± 2 ºC). La solución de
baño fue perfundida por gravedad usando un perfusor local y la mantención
constante del volumen de la solución de baño en la placa se hizo por medio de una
bomba peristáltica. Las pipetas de borosilicato (Harvard apparatus) utilizadas para
las mediciones fueron pulidas para obtener una resistencias de pipeta que varió
entre 3-5 MΩ. Las corrientes registradas fueron digitalizadas mediante un
computador equipado con un conversor análogo-digital/digital-análogo Digidata
1320A (Axon Instruments). Se utilizó el programa de generación de pulsos Clampex
10.1 (Axon Instruments).
La solución de pipeta utilizada en los experimentos de patch-clamp contenía: 6 mM
KCl, 134 mM K-gluconato, 1 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 1 mM Na3ATP y 10 mM
HEPES, pH 7,4 mientras que la solución de baño contuvo: 135 mM Na- gluconato, 4
mM KCl, 1 mM K-gluconato, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 33 mM sacarosa y 10 mM
HEPES/Tris, pH 7,4. Se usó un protocolo de pulso en donde la corriente de
mantención fue de -80 mV. Los pulsos de voltaje fueron desde los -100 mV hasta
+80 mV, con incrementos de 20 mV (Alzamora et al., 2011).
40
3.2.4.3 Análisis de datos.
El análisis de los datos fue realizado por medio de los software Clampfit 10.1 (Axon
Instruments) y SigmaPlot v.11 (Systat Software Inc.). Los potenciales de reversión
obtenidos de los registros de corriente fueron corregidos con respecto al potencial de
unión liquida para el potasio. Los experimentos electrofisiológicos fueron repetidos al
menos tres veces cada uno y los datos fueron entregados como el promedio ± error
estándar promedio. Las diferencias fueron evaluadas a través del test ANOVA
considerando como diferencias significativas un valor p <0,05.
3.2.5 Estudio de las corrientes transepiteliales en la cámara de Ussing.
3.2.5.1 Fundamentos.
En el año 1949 Hans Ussing ideó un sistema que permite determinar el transporte
electrogénico de iones en un epitelio in vitro. Consiste en un sistema de dos
hemicámaras de tamaño idéntico que carecen de un lado. Entre estas hemicámaras
se monta el epitelio en estudio que es mantenido a 37ºC y gasificado con CO2 5% y
O2 95% (Figura 8). Para medir el transporte iónico electrogénico epitelial es
necesario eliminar el gradiente electroquímico de los iones que se movilizan a través
de la membrana, por lo que el tejido es mantenido en una solución idéntica en
ambas hemicámaras, generándose un potencial de reposo. A través de electrodos
de Agº- AgCl, dispuestos a ambos lados del tejido, se mide el potencial transepitelial
generado por la distribución asimétrica de iones producto de los mecanismos de
41
Figura 8. Esquema de una cámara de Ussing. El tejido es montado entre las dos
cámaras separando el espacio apical del basolateral que contienen la solución de
trabajo. Un baño termoregulado mantiene la temperatura de la solución a 37ºC.
Cada cámara se encuentra en contacto con dos electrodos, uno de voltaje (V) y otro
de corriente (I). Modificación de Peña-Münzenmayer, G. (2005). Localización
basolateral del canal de cloruro CIC-2 en líneas celulares epiteliales,Tesis de
pregrado, Escuela de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Univ. Austral de Chile,
64pp.
Puente de agar KCl
Suministro de Aire
Electrodo de voltaje (V)
Electro de corriente (I)
Cámara basolateralCámara apicalTejido
V+ I+ I- V-
Solución de trabajo
42
transporte iónico. Esta metodología permite registrar el efecto de la adición de
agonistas o inhibidores de canales iónicos.
La corriente inyectada para interrumpir el transporte pasivo de iones, consecuencia
de la diferencia de potencial, se denomina corriente de corto-circuito (Isc). Mediante
la ley de Ohm (ΔV = ΔI x R) es posible calcular el potencial eléctrico transepitelial
(Vte), que es la diferencia de potencial entre la mucosa y serosa del epitelio.
3.2.5.2 Animales de experimentación.
Los ratones utilizados en este trabajo corresponden a híbridos C57BL/6/ CBA de 7 a
8 semanas de vida. Estos fueron criados en las dependencias del Laboratorio de
Genómica Funcional del Centro de Estudios Científicos (CECs), en condiciones de
SPF (Specific Patogen Free), alimentados ad libitum con pellet Harlan y sometidos a
ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. Los métodos utilizados para la mantención,
manipulación y eutanasia de los animales fueron aprobados por el Comité de Ética
del CECs y siguen la línea del Comité Asesor de Bioética de CONICYT. Las
carcasas fueron enviadas a dependencias de la Universidad Austral de Chile, donde
fueron incineradas.
3.2.5.3 Experimentos en Cámara de Ussing.
Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical. Yeyuno y colon distal
fueron disectados cortando a lo largo de la inserción mesentérica y lavados con PBS
43
para remover contenido fecal. En el colon distal fue separada la capa muscular
raspando cuidadosamente a lo largo del tejido con un portaobjetos de vidrio. La
mucosa aislada fue montada en un soporte para tejido de 0,1 cm² de área epitelial
efectiva, en tanto el yeyuno fue disectado y montado intacto sobre el soporte. Ambos
tejidos fueron puestos en la cámara de Ussing y sumergidos con solución de baño
(NaCl 120 mM, NaHCO3 25mM, KH2PO4 3,3mM, K2HPO4 0,8 mM, MgCl2 1,2 mM,
CaCl2 1,2 mM y glucosa 10mM) mantenida a 37ºC y gasificada con CO2 5% y O2
95%.
La diferencia de potencial eléctrico transepitalial (Vte) fue medida usando un par de
electrodos conectados a la cámara con agar 150 mM KCl, los que fueron
estabilizados por 20 minutos antes de comenzar los experimentos. Para equilibarar
los electrodod el Vte fue ajustado a cero, utilizando como referencia el electrodo de
voltaje ubicado en la membrana basolateral. La diferencia de Vte del tejido fue
registrada de forma continua usando un amplificador EVC4000 (World Precision
Instruments, Sarasota, FL, USA). El registro se obtuvo bajo la configuración current
clamp, los pulsos de corriente impuestos fueron de ±10 μA a intervalos de 300 ms
cada 1 s, los que fueron generados con el programa Aquaire & Analize 2.3
(Physiologic Instruments, Inc.). La adquisición del voltaje fue registrada con el
programa mencionado anteriormente.
Con el voltaje registrado (ΔVte) se calculó la resistencia transepitelial (Rte) usando la
ley de Ohm:
Rte =ΔVte /ΔI
44
Esta resistencia se normalizó al área del soporte para tejido (0,1 cm2), expresándose
los valores en Ω·cm2. La corriente de corto-circuito (Isc) se calculó según la ley de
Ohm, con los datos calculados de Vte y Rte.
Isc = Vte /Rte
El protocolo aplicado fue: inyección apical de amilorida (10μM) sólo en el colon
distal. 5 minutos después se aplicó basolateralmente, tanto en colon distal como
yeyuno, forskolina (FSK; 1μM) e isobutilmetilxantina (IBMX; 100μM), transcurridos
10 minutos se agregó cromanol 293B (293B; 10μM) y por último 10 minutos después
se aplicó carbacol (CCH; 100μM). Los animales control corresponden a hermanos
de camada silvestres de cada una de las líneas.
Los valores de diferencia de Isc fueron obtenidos por la brecha generada en las Isc
después de la alcanzar el estado estacionario posterior a adición de la droga y antes
de la adición de ésta (Flores et al., 2007).
ΔIsc amilorida: máxima Iscamilorida – Isc basal
ΔIsc inducida por AMPc: mínima IscFSK+IBMX - máxima Iscamilorida
ΔIsc inhibibles por cromanol 293B: mínima IscFSK+IBMX - máxima Isc293B
ΔIsc inducida por CCH: máxima Isc293B - mínima IscCCH
La figura 9 ilustra estos cálculos.
45
Figura 9. Cálculos de diferencia de corriente de corto-circuito (ΔIsc). Trazas
representativas de la secreción de Cl- en colon distal de un animal silvestre. Se
muestra el registro continuo de la corriente de cortocircuito (μA/cm²) en función del
tiempo (min) obtenido en cámara de Ussing. Los rectángulos muestran la adición
apical de 10μM amilorida y basolatral de 100μM isobutilmetilxantina (IBMX)+ 1μM
forskolina (FSK), 100 μM cromanol 293B (293B) y 100μM carbacol (CCH). ΔIsc
amilorida: máxima Isc amilorida – Isc basal; ΔIsc inducida por AMPc: mínima Isc FSK+IBMX
- máxima Isc amilorida; ΔIsc inhibibles por cromanol 293B: mínima Isc FSK+IBMX - máxima
Isc 293B; ΔIsc inducida por CCH: máxima Isc293B - mínima IscCCH.
46
3.2.6 Inmunofluorescencia.
3.2.6.1 Inmunocitofluorescencia.
Células CHO transfectadas con 1μg los cDNA de hKCNQ1 y HA-KCNE3 D90N o
HA-KCNE3 o sólo con las subunidades β, HA-KCNE3 D90N o HA-KCNE3, fueron
cultivadas sobre cubreobjetos circulares de vidrio de 10mm por 24 a 48 horas. Luego
las células fueron fijadas por 20 minutos con paraformaildehído (PFA) al 2% y
lavadas 3 veces con tampón fosfato salino (PBS) por 5 minutos. Posteriormente se
embebieron en glicina 50 mM por 5 min, con el fin de reducir su auto-florescencia.
Luego, se bloqueó con gelatina 0,2% por 30 min. Después se incubó con el
anticuerpo Anti-HA (Roche) diluido en una proporción 1:500 en solución de bloqueo
por toda la noche a 4ºC en una cámara húmeda para evitar la deshidratación de las
muestras. Se lavó tres veces con PBS por 5 min cada vez y se incubó con el
anticuerpo secundario Alexafluor-488-anti-rat IgG (Molecular Probes) diluido 1:500.
Por último se montaron los cubre objetos con solución de montaje (Dako) sobre un
portaobjetos (Peña-Münzenmayer et al., 2005; Cornejo et al., 2009).
A las células transfectadas sólo con las subunidades accesorias también se les
realizó inmunodectección del epítope HA intracelularmente. Estas células siguen el
protocolo previamente descrito y sólo debieron ser permeabilizadas con Tritón al
0,2% por 5 min después de ser tratadas con glicina. A partir de este paso el
procedimiento siguió como se mencionó anteriormente.
47
3.2.6.2 Inmunohistofluorescencia.
Los tejidos fueron disectados y sumergidos inmediatamente en PFA 4% y luego se
les realizaron cortes de 5 μm de grosor. Primero se rehidrató el tejido, para ello los
cortes se sumergieron en soluciones que disminuyen seriadamente su polaridad
(Xilol por 10 min, etanol 100% por 2 min, etanol 96% por 2 min, alcohol 75% por 2
min). El siguiente paso fue lavar con Tris- HCl 50 mM pH 7,8 y post-fijó con PFA 4%
por 20 min. Se lavó con PBS tres veces por 5 min y se bloqueó con Tris-HCl 50 mM
pH 7,8 más 10% de suero normal de cabra (NGS) y 5% de suero fetal bovino (BSA)
por 1 hr a temperatura ambiente. Luego se incubó con Anti- HA (1:300) o Anti-
KCNQ1 (1:200), en el caso de este último se debió permeabilizar con 0,3% de Tritón
X-100 (Sigma), por toda la noche a 4ºC en cámara húmeda. Posteriormente se
lavaron los cortes con Tris-HCl 50 mM pH 7,8 tres veces por 5 min. Luego se incubó
con el correspondiente anticuerpo secundario diluído en solución de bloqueo en una
proporción de 1:1000 para Alexafluor-488-anti-rat IgG y 1:500 para Alexafluor-568-
goat anti-rabbit IgG por 1h temperatura ambiente y se montaron con solución de
montaje (Dako).
Todas las imágenes de fluorescencia fueron capturadas por microscopía confocal
(Olympus FV1000). Las muestras fueron excitadas con láser a 488 nm y se
colectaron las señales emitidas entre 505 y 550 nm para el anticuerpo Alexafluor-
488. En el caso del anticuerpo Alexafluor- 568 se excitó a 543 nm y capturaron las
señales emitidas entre 560 y 615 nm. Se usó el objetivo C-Apochromat 63x/1.2
48
water, de inmersión en agua. El porcentaje de intensidad del láser y la apertura del
pinhole se ajustaron dependiendo de la intensidad de la señal de fluorescencia.
3.2.7 Contenido de agua en las heces.
Se analizaron las fecas de ratones WT y de los transgénicos que expresan las
proteínas HA-KCNE3 y HA-KCNE3 D90N. Las muestras frescas fueron colectadas
en tubos eppendorf previamente pesados en balanza analítica. Las muestras fueron
pesadas inmediatamente después de haber sido colectadas (peso inicial). Luego se
mantuvieron a 37ºC por 48 hrs y volvieron a pesar (peso final). Para calcular el
porcentaje de agua de las heces se resta el peso del envase al peso inicial (pi) y
final (pf), luego estos valores se ingresan a la fórmula:
% de agua en las fecas= pf – pi x 100
pi
49
4. RESULTADOS
4.1 Generación de construcciones de ADN recombinante para estudios in vitro.
Para estudiar la función de la subunidad accesoria KCNE3 se generó la mutación
sitio dirigida en el residuo aspartato 90 que fue reemplazado por asparragina. Se
usaron células CHO transfectadas de forma aguda con los cDNA hKCNQ1 y
hKCNE3.
4.1.1 Incorporación de la mutación sitio dirigida.
La mutación puntual aspartato por asparragina (D90N) se generó mediante la
técnica basada en PCR, Quick Change. Para ello se usó como templado el cDNA
de hKCNE3 inserto en el vector pIRES-hCD8. Los partidores utilizados fueron
E3D90N for y E3D90N rev, los que promovieron la sustitución nucleotídica G301T.
La incorporación de la mutación fue corroborada por secuenciación automática.
4.1.2 Adición del epítope Hemaglutinina.
Con el objetivo de poder diferenciar la proteína endógena de la transgénica, se
adicionó el epítope hemaglutinina en el extremo 5' del cDNA de hKCNE3. Para
obtener la secuencia codificante de la subunidad accesoria fusionada al epítope HA,
se realizó una reacción de PCR en la que se incorporó el epítope hemaglutinina
después del codón de inicio y los sitios de restricción EcoRI y BsiWI río arriba del
50
codón ATG. Además se agregaron los sitios de restricción MluI y BamHI después del
codón de término (figura 10A y B). Este proceso se realizó en la subunidad nativa
como mutante. Los productos de PCR de 360 pb se visualizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa a una concentración de 1% teñido con bromuro de
etidio (figura 10C). Los controles negativos de las reacciones de PCR sólo se
diferencian de la reacción experimental por la falta del templado correspondiente
para cada caso, el que fue reemplazado por agua.
Los productos de PCR fueron insertados en el vector pGEM-T con los que se
transformaron bacterias competentes DH5α. Posteriormente se purificaron los
vectores y digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Estos
fragmentos se insertaron en el vector pIRES-hCD8 que previamente había sido
digerido con las enzimas EcoRI y BglII. Se generaron las construcciones pIRES-
HAKCNE3 D90N y pIRES-HAKCNE3 ambas de 5475 pb (Figura 10D, E y F). Estas
construcciones poseen el promotor de citomegalovirus (pCMV) que dirige la
expresión de la proteína de fusión. Además contiene la secuencia codificante para el
receptor de membrana CD8, que permite identificar las células que expresan el
vector y que por lo tanto se utilizarán para los registros electrofisiológicos. La adición
del epítope y sitios de restricción fueron verificadas por secuenciación automática.
De esta forma se generaron las construcciones para realizar los estudios
electrofisiológicos y de inmunodetección del epítope HA en células CHO.
51
polyA hCD8
IRES
HA- KCNE3 D90N
IRES
pCMVAmp r
pIRES HA-KCNE3D90N hCD8
EcoRI
BamHI
polyA hCD8
IRES
HA- KCNE3
IRES
pCMVAmp r
pIRES HA-KCNE3 hCD8
EcoRI
BamHI
Figura 10. Generación de los vectores pIRES HA-KCNE3 hCD8 y pIRES HA-
KCNE3 D90N hCD8. A y B) Mediante PCR al cDNA de hKCNE3 se le agregó el
epítope hemaglutinina (HA) y los sitios de restricción para las enzimas EcoRI,
BsiWI, MluI y BamHI. Además se le realizó una mutación sitio dirigida generándose
el cambio de residuo de aspartato 90 a asparragina (estrella) (B). C) Corresponde a
una electroforesis de un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. El carril
1 corresponde al estándar de peso molecular de 1Kb; 2 es el producto de PCR del
cDNA HA-KCNE3 y 3 al producto de PCR HA-KCNE3 D90N, ambos de 363 pb.
52
D y E) Representan los vectores de expresión resultantes de la inserción de los
productos de PCR HA-KCNE3 y HA-KCNE3 D90N en el vector pIRES-hCD8,
utilizando los sitios de restricción EcoRI y los extremos compatibles entre BamHI y
Bglll. F) Ensayo de restricción con EcoRI y BamHI de los vectores pIRES HA-KCNE3
hCD8 y pIRES HA-KCNE3 D90N hCD8. Carril 1: estándar de peso molecular de
1Kb, carril 2: digestión de pIRES HA-KCNE3 hCD8, carril 3: digestión del vector
pIRES HA-KCNE3D90N hCD8. Electroforesis en gel de agarosa al 1% y
visualización por bromuro de etidio. Los fragmentos de 4900 pb corresponden al
vector pIRES hCD8, mientras que los de 363 pb corresponden al cDNA de las
proteínas de fusión.
53
4.2 Determinación de corrientes macroscópicas de los complejos KCNQ1/ HA-
KCNE3 y KCNQ1/ HA-KCNE3 D90N.
El análisis funcional de los complejos transfectados se realizó mediante la técnica de
patch clamp en su configuración de célula completa. Se utilizaron células CHO co-
transfectadas con los vectores que contienen hKCNQ1 y las diferentes formas de
KCNE3 (nativa, con el epítope HA y portando HA y la mutación D90N). Se aplicó un
protocolo de pulsos cuadrados de voltaje de 0,5 segundos de duración desde -100
mV hasta +80 mV. La figura 11 muestra una imagen representativa de las familias
de corrientes registradas para los complejos KCNQ1/KCNE3 nativa, KCNQ1/HA-
KCNE3 y KCNQ1/HA-KCNE3 D90N. En los 3 casos se observan corrientes
independientes de potencial que aumentan al aplicar potenciales de membrana
despolarizantes y que se activan de forma prácticamente inmediata.
54
Figura 11. Efecto de la mutación D90N de la subunidad accesoria KCNE3 sobre
la corrientes conducidas por KCNQ1 en un sistema de expresión heterólogo.
A), B) y C) corresponden a familias de corrientes representativas registradas en
células CHO co-transfectadas de forma aguda con los cDNA KCNQ1 y KCNE3, HA-
KCNE3D90N o HA- KCNE3. Potencial de mantención es -80mV, el rango de pulsos
va desde -100 a +80 mV, con incrementos de 20 mV.
55
En la Figura 12 se muestran las curvas que relacionan la corriente con el voltaje
aplicado a la membrana en que se observa un comportamiento similar entre los
complejos KCNQ1/KCNE3 nativa y KCNQ1/ HA-KCNE3. La diferencia más notoria
es la disminución de las corrientes conducidas por el complejo que porta la
subunidad mutante. Un índice de lo anterior es representado por las corrientes
medidas a 0 mV, las que fueron: 1493 ± 659 pA para los complejos nativos, 1635 ±
670 pA para los portadores de subunidad HA-KCNE3 y 309 ± 34 pA para los
complejos formados con la subunidad HA- KCNE3 D90N. Estos resultados indican
que el cambio en la intensidad de la corriente es independiente del epítope HA y que
se debe genuinamente a la presencia de la mutación. Una disminución de las
corrientes totales de una célula puede ser secundario a un menor número de
canales en la membrana, por ejemplo por mutaciones que afectan la destinación o
que provocan fallas en el plegamiento de la proteína del canal (Cheng et al., 1990).
Lo anterior llevó a realizar estudios de inmunolocalización utilizando anticuerpos
anti-HA.
56
Figura 12. Relación corriente/voltaje (I/V) de los distintos sistemas heterólogos.
Los valores promedio de las corrientes registradas a potenciales que varían entre
-100 mV a +80 mV. Los cuadrados grises corresponden a las corrientes conducidas
por el complejo KCNQ1/KCNE3; círculos negros al complejo KCNQ1/HA- KCNE3 y
triángulos complejos KCNQ1/ HA-KCNE3 D90N. n=4.
KCNQ1/ HA-KCNE3KCNQ1/ HA-KCNE3 D90NKCNQ1/ KCNE3
57
4.3 Inmunolocalización de las proteínas de fusión HA-KCNE3 y HA- KCNE3
D90N.
Con el fin de evaluar el efecto del la mutación puntual D90N y la adición del epítope
hemaglutinina sobre la localización subcelular de la proteína KCNE3 se realizaron
ensayos de inmunolocalización dirigidos contra el epítope HA.
La línea celular CHO fue transfectada en forma aguda con los vectores pIRES HA-
KCNE3, pIRES HA-KCNE3 D90N por separado o co-transfectadas con pCR3.1-
KCNQ1 sobre cubreobjetos de vidrio de 10mm de diámetro. Se generaron cuatro
sistemas de expresión heteróloga, uno donde se expresa la proteína de fusión HA-
KCNE3, otro con HA-KCNE3 D90N y dos donde se expresa cada subunidad
accesoria fusionada al epítope HA junto con la unidad formadora de poro KCNQ1.
Las células se analizaron 24 a 48 horas después de realizada la transfección. Se
usó como anticuerpo primario anti-HA de rata (clon 3F10) y como anticuerpo
secundario Alexafluor-488. Las imágenes se capturaron con microscopia confocal
utilizando el láser de 505 nm para excitar las muestras y con una intensidad que
dependió de la magnitud de la señal fluorescente.
Como se muestra en la figura 13, cuando se co-transfectó el cDNA de cada
subunidad accesoria con el vector que codifica para la unidad formadora de poro
KCNQ1 (figura 13 paneles A y B), la señal de fluorescencia verde correspondiente a
las proteínas de fusión se encontró en la membrana citoplasmática de las células
CHO (hacia el espacio extraceleular), independientemente si se trata de la
subunidad mutante o no. Mientras que cuando sólo se transfectaron los cDNA que
58
Figura 13. Inmunofluorescencia contra hemaglutinina (HA) de células CHO
transfectadas de forma aguda. A) y B) células CHO transfectadas por
electroporación con los complejos KCNQ1/ HA-KCNE3 y KCNQ1/ HA-KCNE3
D90N, C) y D) corresponden a células CHO transfectadas únicamente con la
subunidad accesoria silvestre o mutante. En ambas no se observa señal en la
membrana en ausencia de la unidad formadora de poro KCNQ1. La
inmunolocalización se realizó contra el anticuerpo anti- hemaglutinina (HA) y fue
visualizado mediante el anticuerpo secundario Alexafluor- 488 24 horas post-
transfección, sin permeabilización de las células. E) y F) corresponden a células
transfectadas sólo con las subunidades auxiliares y permeabilizadas con tritón 2%
antes de la inmunoreacción contra HA. Las barras corresponden a 10 μm.
59
codifican para las proteínas HA-KCNE3 o HA-KCNE3 D90N, no se observó señal de
la fluorescencia para el epítope HA (figura 13, paneles C y D). Al repetir estos
experimentos permeabilizando las células CHO transfectadas con las proteínas de
fusión y realizando la inmunolocalización del epítope HA, se observan agregados
citoplasmáticos correspondientes a las proteínas transfectadas (figura 13E y 13F).
Así se puede concluir que la subunidad KCNE3 sólo es capaz de localizarse en la
membrana celular cuando se encuentra asociada a la unidad formadora de poro
KCNQ1 y que la adición del epítope HA y la mutación D90N no afectan el
direccionamiento celular de esta proteína.
Con estos antecedentes y los obtenidos en los estudios electrofisiológicos se contó
con una herramienta que permitiría potencialmente por un lado eliminar las
corrientes endógenas del complejo KCNQ1/KCNE3 in vivo y por otro determinar la
ubicación en el epitelio intestinal de las subunidades portadoras del epítope HA.
Para lo anterior lo primero que se requería era la generación de transgenes con un
promotor tejido específico para el epitelio intestinal, que comandaran la expresión de
las proteínas de fusión.
60
4.4 Generación de Transgenes HA-KCNE3 y HA-KCNE3 D90N.
La generación del vector que contiene el transgen con la proteína de fusión utilizó el
vector pHCECSensor (Sandoval et al., 2011) como base. Este plásmido posee el
promotor tejido específico de la proteína Villina, que guía la expresión del transgen
hacia el epitelio del tracto intestinal. El cDNA de HA-KCNE3 o HA- KCNE3 D90N se
insertó en el vector utilizando los sitios de restricción MluI y BsiWI que flanquean la
región codificante de la proteínas de fusión en los vectores pIRES- HA-KCNE3 y
pIRES- HA-KCNE3 D90N. Estos sitios también se encuentran presentes en el vector
pHCECSensor. Al ligar los fragmentos se obtuvieron los vectores Villina HA-KCNE3
y Villina HA-KCNE3 D90N, ambos de 12,5 Kb. El proceso se esquematiza en la
figura 14A y B. La secuencia nucleotídica de los vectores generados fue verificada
por secuenciación automática.
Posteriormente los vectores se amplificaron en bacterias E.coli DH5α. El ADN
extraído fue tratado con la enzima SalI, de esta forma se acotó el segmento del
vector que se purificó y microinyectó. Los transgenes se purificaron a través de un
sistema de micro-columnas y posteriormente se cuantificaron. Estos transgenes
fueron diluidos en una solución de baja concentración de sales quedando con una
concentración final de 500 moléculas/pL.
61
Figura 14. Generación de los vectores Villina HA-KCNE3 y Villina HA-
KCNE3D90N. Al cDNA de cada proteína de fusión incluida en el respectivo vector
pGEMT fue liberado utilizando los sitios de corte de las enzimas de restricción BsiWI
y MluI. De igual forma fue liberado el ADN codificante para la proteína
pHCECSensor del vector de mismo nombre. Usando la enzima T4 ligasa fueron
ligados los fragmentos generando los vectores Villina HA-KCNE3 (A) y Villina HA-
KCNE3D90N (B).
HA-KCNE3D90N
Villina HA-KCNE3
Villina
Villina pHCECSensor
Villina pHCECSensor +
+
SalI
SalI
SalI
SalI
SalI
SalI
SalI
SalI
SalI
MluI
MluI
SalI
SalI
BsiWI
BsiWI
pHCECSensor
pHCECSensor
HA-KCNE3
HA-KCNE3 D90N
A
B
62
C) Corresponde a un ensayo de restricción con la enzima SalI que liberó el transgen
que posteriormente fue microinyectado en embriones de ratones. Los fragmentos
fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1% por 30 minutos a 80
mV. Carril 1: digestión de Villina- HAKCNE3; carril 2: estándar de peso molecular de
1Kb; carril 3: digestión del vector Villina HA-KCNE3 D90N. Tanto en el carril 1 y 3 se
observan fragmentos de 9600 pb que corresponde al transgen y el fragmento de
3000 pb aprox. que corresponde al vector pHCECS. El ADN fue visualizado por
tinción con bromuro de etidio.
63
4.5 Generación de ratones HA- KCNE3 y HA-KCNE3 D90N y obtención de líneas
transgénicas.
La microinyección del transgen se realizó en la Unidad de Genómica Funcional del
CECs, por personal altamente calificado. El proceso se inicia preparando el transgen
en una concentración y solución que no dañe los embriones en los que será
inyectado. La microinyección del transgen purificado se efectúa en el pronúcleo
masculino a través de una micropipeta, luego los embriones son reimplantados en la
hembra receptora, donde seguirán con su proceso natural de desarrollo.
Transcurridas tres semanas nació la primera generación de ratones a los que se les
denominó F0 y que posteriormente fueron genotipificados por PCR.
Así para el transgen HA- KCNE3 se obtuvieron 2 individuos trasngénicos de un total
de 37 crías, mientras que para el transgen HA-KCNE3 D90N se obtuvieron 6 crías
transgénicas de un total de 32. Estos animales que portan los transgenes en su
genoma son los fundadores que posteriormente dieron lugar a cada línea de ratones
en estudio. En el caso de los transgénicos Villina HA-KCNE3 las líneas se
denominaron 796c y 921c, mientras que para los transgénicos Villina HA-KCNE3
D90N las líneas obtenidas fueron 842c, 843c, 996c, 981c, 004d y 005d. Al cumplir
las ocho semanas de vida los F0 fueron cruzados con ratones C57BL/6 (WT). Sus
crías fueron denominadas F1 y con ellas se realizaron los análisis posteriores.
64
4.6 Efectos generales de la expresión de la proteína HA-KCNE3 D90N.
A primera vista los animales transgénicos no presentaron diferencias fenotípicas con
los animales nativos, respecto a tamaño y crecimiento. Además estos fueron viables,
fértiles y aparentemente no poseían enfermedades asociadas a la expresión del
transgen. Tampoco se observan diferencias notables en el tamaño de cada
individuo.
Al analizar anatómicamente el intestino de los animales no se encontraron
diferencias significativas en el largo del colon. Los promedios para cada modelo
estudiado fueron: 6,4 ± 0,5 cm WT, n=5; 6,4 ± 0,3 cm HA-KCNE3, n=5; 6,8 ± 0,1 cm
HA-KCNE3 D90N, n=12. Intestino delgado: 29,1 ± 0,9 cm WT, n=5; 29,1 ± 1,2 cm
HA-KCNE3, n=5; 32,0 ± 0,9 cm HA-KCNE3D90N, n=11. Estudiando el contenido de
agua en las heces tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas
entre los distintos modelos animales analizados (61 ± 6% WT, n=5; 45 ± 3% HA-
KCNE3, n=2 ; 45 ± 9% HA-KCNE3D90N, n=8). Los datos separados por líneas de
cada transgen se presentan en la Tabla II.
65
Genotipo(n)
Longitud intestino
delgado (cm)
Longitud
colon (cm)
% de H2O
heces
WT (5) 29,1 ± 0,9 6,4 ± 0,5 61 ± 6
HA-KCNE3
796c (2) 30,6 ± 0,1 6,5 ± 0,7 42
921c (3) 28,1 ± 1,1 6,4 ± 0,8 48
HA-KCNE3D90N
842c (3) 34,5 ± 0,4 6,8 ± 0,1 44 ± 16
843c (3) 31,3 ± 3,5 6,7 ± 0,2 43 ± 22
981c (1) 36 6,8 55
996c (2) 27,8 ± 0,4 7,0 ± 0,5 n.o
004d (1) 28,4 7,6 45
No existen diferencias estadísticas en cada caso, longitud del intestino delgado el
valor p = 0,121; longitud del colon p = 0,583 y % de agua en las heces p = 0,420.
Entre paréntesis se indican la cantidad de animales analizados. n.o= no observado.
Tabla II. Longitud del intestino y porcentaje de agua presente en las heces de
animales silvestres y transgénicos HA-KCNE3 y HA-KCNE3D90N.
66
4.7 Efectos funcionales de la expresión de la proteína de fusión HA-KCNE3
D90N.
Para estudiar el rol de la subunidad mutante sobre el funcionamiento secretorio del
intestino se evaluaron las corrientes de cortocircuito (Isc) y el potencial transepitelial
(Vte) en cámara de Ussing. En la figura 15 se muestran registros del V te a través del
yeyuno y colon de ratones silvestres (hermanos de camada de los transgénicos) y
de una de las líneas transgénicas representativas para Villina HA-KCNE3 (796c) y
Villina HA-KCNE3 D90N (843c). Los cambios en el potencial transepitelial
observados frente a los distintos estímulos farmacológicos, reflejan cambios en la
secreción de Cl-.
En el colon distal de los animales WT y HA-KCNE3 se observó que la aplicación de
amilorida provoca un cambio positivo en el V te secundario al bloqueo de la absorción
electrogénica de Na+. Luego la aplicación basolateral de IBMX (100μM) más
forskolina (1μM) provoca un cambio negativo en el V te consistente con un aumento
en la secreción de Cl- activada por AMPc, la cual es revertida al utilizar cromanol
293B (100 μM), un bloqueador de los canales KCNQ1/KCNE3. A diferencia de lo
descrito, en los animales que expresan la proteína HA-KCNE3 D90N se observó una
disminución de la secreción de Cl- inducible por AMPc y la aplicación de 293B no
provocó cambios en el Vte. Finalmente la aplicación de carbacol, que produce por un
aumento de la secreción de cloruro calcio dependiente, es similar en los tres
modelos animales. En yeyuno los cambios en V te son menores, sin embargo la
tendencia general de la secreción de cloruro activada por AMPc es similar a la
observada en el colon.
67
Figura 15. Efecto de la expresión de la proteína KCNE3 D90N sobre la
secreción intestinal de cloruro. Trazos representativos de la secreción de Cl- en
colon distal (A, B y C) y en yeyuno (D,E y F). Se muestra el registro continuo del
potencial transepitelial en función del tiempo obtenido en cámara de Ussing. Las
flechas indican la adición basolateral de 100μM isobutilmetilxantina (IBMX)+ 1μM
forskolina (FSK) (1), 100 μM cromanol 293B (C293B) (2) y 100μM carbacol (CCH)
(3), en tejidos de ratones silvestres (WT) (A y D) y que expresan las proteínas
recombinantes HA-KCNE3 D90N (B y E) y HA-KCNE3 (C y F), de las líneas
transgénicas 843c y 796c respectivamente. En los ensayos realizados en colon
distal se agregó apicalmente 10μM amilorida (*) con el fin de bloquear los canles
ENaC y con ello las corrientes de sodio.
68
En las figuras 16 y 17 se muestran los cambios en las Isc al aplicar el protocolo
recientemente descrito en yeyuno y colon de las líneas transgénicas Villina HA-
KCNE3 (796c) y Villina HA-KCNE3 D90N (843c). En yeyuno las corrientes de
cortocircuito activadas por AMPc, por calcio y las sensible al 293B no difieren entre
los ratones WT y los 796c. En el mutante 843c sin embargo destaca la falta de
corrientes sensibles al cromanol y la caída de un un 70 % de la secreción activada
por AMPc (figura 16).
En colon distal (Figura 17), al comparar las corrientes de cortocitcuito activadas por
AMPc y sensibles a 293B no se encontraron diferencias estadísticamente
significativas entre los animales WT y 796c, mientras que en los ratones Villina HA-
KCNE3 D90N 843c la Isc activadas por AMPc presentaron una disminución del 50% y
las Isc sensibles a 293B fueron totalmente anuladas. La inhibición de las corrientes
conducidas por ENaC y las activadas por aumento de calcio intracelular, no
presentaron diferencias significativas en los tres modelos animales en estudio.
Los animales transgénicos tienen la desventaja de presentar efectos posicionales
para la expresión del transgen. Para descartar que las respuestas observadas son
consecuencia del sitio integración y número de copias del transgen se analizaron las
distintas líneas transgénicas obtenidas para cada modelo. En el caso de los
animales Villina HA-KCNE3 no se encontraron diferencias estadísticamente
significativas de las Isc entre ellas (líneas 796c y 921c) en yeyuno y colon distal. Al
comparar las líneas transgénicas que expresan la proteína mutante, se observó un
comportamiento similar de las Isc para el protocolo aplicado en yeyuno y colon entre
las líneas 842c, 843c, 996c y 981c. La línea 004d presentó una mayor respuesta a
las corrientes inducibles por AMPc y un aumento de la sensibilidad a 293B en
69
Figura 16. Transporte transepitelial registrado en yeyuno de animales Villina-
HAKCNE3 y Villina-HAKCNE3 D90N. Resumen de las diferencias de corrientes de
corto-circuito (ΔIsc) registradas en yeyuno después de agregar basolateralmente
isobutilmetilxantina y forskolina (IBMX+ FSK), cromanol 293B (293B) y carbacol
(CCH). Se utilizaron los promedio de las mediciones de animales silvestres (WT
n=5) y se seleccionaron las líneas representativas 796c (n=2) y 843c (n=2) para los
animales Villina HA-KCNE3 y Villina HA-KCNE3 D90N respectivamente. Diferencias
estadísticamente significativas (*, p< 0,05) fueron determinadas por análisis ANOVA,
después de la adición de 293B (p= 0,001).
70
Figura 17. Transporte transepitelial registrado en colon distal de animales
Villina-HAKCNE3 y Villina- HAKCNE3 D90N. Resumen de las diferencias de
corrientes de corto-circuito (ΔIsc) medidas en animales silvestres (WT n=5) y que
sobre- expresan las proteínas HA-KCNE3 línea 796c (n= 2) y HA-KCNE3 D90N
línea 843c (n=3) después de agregar en forma apical amilorida y basolateral
isobutilmetilxantina y forskolina (IBMX+ FSK), cromanol 293B (293B) y carbacol
(CCH). Diferencias estadísticamente significativas (*, p< 0,05) fueron determinadas
por ANOVA luego de la aplicación de FSK más IBMX (p= 0,007) y después de la
agregar de 293B (p= 0,001).
71
ambos tejidos analizados, por ello esta línea fue descartada para estudios
posteriores.
Los datos fueron presentados utilizando los resultados obtenidos para la línea Villina
HA-KCNE3 796c y Villina HA-KCNE3 D90N 843c. Estas líneas transgénicas fueron
consideradas representativas porque que presentan un comportamiento
electrofisiológico promedio para cada transgen, un numero de datos (n) superior a
las demás líneas transgénicas e histología sin alteraciones.
Estos resultados muestran que la mutación D90N de la subunidad accesoria KCNE3
inhibe las corrientes endógenas conducidas por KCNQ1 in vivo y que esta mutación
tiene un efecto dominante negativo sobre las corrientes conducidas por el complejo
en estudio. De esta forma se generó un modelo murino donde las corrientes de
potasio estimulables por aumento de la concentración intracelular de cAMP están
inactivadas.
72
4.8 Localización subcelular y tisular de HA-KCNE3, HA- KCNE3 D90N y KCNQ1.
Se analizaron cortes histológicos de duodeno, yeyuno y colon de los ratones
transgénicos en estudio. En ellos se evaluó la expresión de las proteínas de fusión
HA-KCNE3 y HA-KCNE3 D90N por inmunofluorescencia. No se observaron
diferencias entre las líneas de cada unas de los modelos. En la figura 18 se
muestran resultados representativos de una línea de cada transgénico, para la
localización subcelular y tisular de las proteínas de fusión HA-KCNE3 y HA-
KCNE3D90N (verde) y de la unidad formadora de poro KCNQ1 (rojo). La señal
correspondiente al epítope HA en los ratones que expresan la proteína mutante fue
encontrada a lo largo del intestino, desde el duodeno hasta el colon distal y a lo largo
del eje cripta- superficie. En las criptas la señal se detectó en la membrana
basolateral, siendo más difícil de definir la ubicación subcelular de la proteína de
fusión en la superficie de las vellosidades. En los animales que expresan HA-KCNE3
la señal se observó principalmente en yeyuno, en menor medida en duodeno, sin
embargo no se detectó señal en colon distal en las dos líneas analizadas.
Para la detección de KCNQ1 en colon se usó un anticuerpo policlonal dirigido contra
el extremo carboxilo terminal de la proteína. La fluorescencia fue detectada en la
membrana basolateral de la base de las criptas y no se observaron cambios en el
patrón de expresión entre los animales WT y los transgénicos.
73
Figura 18. Distribución de las proteínas de fusión HA-KCNE3 y HA-KCNE3
D90N y de la unidad formadora de poro KCNQ1 en diferentes tejidos. Las
proteínas de fusión fueron localizadas usando inmunofluorescencia contra el epítope
HA (verde) en duodeno (A-C), yeyuno (D- F) y colon distal (G- I) en animales
silvestres (primera fila) y transgénicos Villina HA-KCNE3 (segunda fila) y Villina HA-
KCNE3D90N (tercera fila). Las proteínas de fusión se ubicaron en la membrana
basolateral de las células del tracto intestinal, con mayor presencia en yeyuno en el
caso de los transgénicos Villina HA-KCNE3. Mientras que en transgen que expresa
la proteína mutante se detectó intensamente yeyuno y colon. La inmunolocalización
de KCNQ1 (rojo) se realizó sólo en colon distal donde no se observaron diferencias
en el patrón de distribución de la proteína KCNQ1 entre los animales silvestres y
transgénicos. Los cuadrados muestran un aumento de cada imagen. Las barras
representan 40 μm.
74
5. DISCUSIÓN
El trasporte de electrolitos en el colon de los mamíferos envuelve tanto procesos
absortivos como secretorios. Este transporte es caracterizado por la absorción de
NaCl, K+, agua y ácidos grasos de cadena corta, proceso que se efectúa
principalmente en la superficie de los enterocitos. Los que los procesos secretorios
de Na+, Cl-, K+, HCO3- y mucus en tanto son más pronunciados en las células de la
cripta.
La secreción colónica de cloruro sigue el esquema general de la mayoría las
glándulas secretorias del tracto gastrointestinal y de otros órganos. La captación de
Cl- ocurre basolateralmente a través del triplecotransportador Na+/2Cl-/K+ que
acumula cloruro por sobre su potencial de equilibrio, facilitando su salida luminal por
medio de CFTR, canal que es estimulado por AMPc.
El rol de los canales basolaterales de K+ es suministrar la fuerza electromotriz
necesaria para que la salida luminal de Cl- sea continua. Siendo los canales de
potasio KCNQ1/KCNE3 activado por AMPc y KCNN4 dependiente de Ca2+ los que
mantienen esta secreción.
El objetivo de esta tesis fue evaluar el rol del canal KCNQ1/KCNE3 en la secreción
intestinal de cloruro, específicamente la de la subunidad accesoria KCNE3. La
estrategia diseñada para dilucidar esta función fue la generación de un modelo
animal donde la actividad del complejo estaba anulada. Existen dos formas de
75
conseguir este objetivo, producir un animal knock out para esta proteína o generar
un animal transgénico por microinyección pronuclear, donde una proteína mutante
suprime la actividad del canal de una forma dominante.
Dadas las herramientas técnicas disponibles en la Unidad de Genómica Funcional
del Centro de Estudios Científicos se optó por la micro-inyección pronuclear de una
mutante dominante negativa. Este modelo tiene la ventaja de incorporar la proteína
mutante de una manera tejido específica, a través de un promotor que guía la
expresión de la mutante en el tejido que se desea estudiar. Así se evita que el
modelo generado posea alteraciones en órganos que podrían interferir o no ser
relevantes para la investigación como ocurre en los animales knock out.
Para la generación de estos ratones transgénicos primero se investigó si en la
literatura existían reportes de mutaciones de KCNE3 que eliminaran la actividad de
KCNQ1. Luego se seleccionó un promotor que indujera de una manera robusta y
específica la expresión de la mutante en el epitelio intestinal. Por último se diseñó
una forma para poder discriminar entre la proteína endógena y la proteína exógena
en el ratón transgénico.
Afortunadamente existían publicaciones donde se describía que el cambio del
residuo aminoacídico aspartato 90 por asparragina (D90N) de la proteína KCNE3
reducía alrededor de cuatro veces la corriente conducida por KCNQ1 (Abbott y
Goldstein, 2002). Schroeder y colaboradores (Schroeder et al., 2000) utilizaron el
epítope hemaglutinina para estudiar la localización subcelular del KCNE3, sin
analizar el efecto en la electrofisiología del canal. Teóricamente esta proteína de
fusión cumplía con las características necesarias para generar el ratón transgénico,
76
pero se debía corroborar el efecto de la mutación puntual D90N de KCNE3 sobre las
corrientes conducidas por el complejo y si la adición del epítope HA influía sobre las
corrientes o sobre su localización subcelular. Por ello la primera etapa de este
trabajo comprende los estudios funcionales del canal mutante en un sistema de
expresión heterólogo.
5.1 Análisis in vitro de la mutación puntual D90N sobre las corrientes
conducidas por KCNQ1.
La consecuencia de la mutación D90N de KCNE3 no está resuelta, ya que existen
discrepancias entre dos grupos. Abbott y Goldstein (2002), postularon que esta
mutación reducía las corrientes del complejo KCNQ1/KCNE3 cerca de cuatro veces
al expresarlo en células CHO. En contraste en el 2004 se publicó un artículo (Gage y
Kobertz, 2004) donde se describió que la mutación estudiada no producía cambios
en la densidad de las corrientes conducidas por el canal al expresarlo en ovocitos de
Xenopus laevis. Otro punto relevante es que en ambos trabajos se utilizó esta
proteína fusionada al epítope hemaglutinina en el extremo amino terminal. El primer
grupo señaló que éste no influía en la densidad de corriente conducida por el
complejo, mientras que el segundo postuló que el epítope contribuye a la formación
del complejo KCNQ1/KCNE3.
Regularmente para los estudios electrofisiológicos de patch clamp se utilizan
ovocitos de Xenopus laevis o líneas celulares de origen mamífero para expresar el
canal de interés. La expresión de proteínas en ovocitos se realiza mediante la
transfección de RNA, mientras que en células de mamífero ocurre por transfección
77
de un vector de expresión que posee un promotor viral que comanda la expresión
del cDNA a estudiar. En este punto una importante ventaja que presentan los
ovocitos con respecto a las células de mamíferos es que en los primeros la inyección
de RNA permite controlar la proporción en que cada proteína que es traducida. Por
otro lado si se quiere estudiar proteínas expresadas en células de mamífero la
ventaja del sistema de expresión en éstas es que se acercan más al medio natural
de la proteína estudiada y por lo tanto todas las modificaciones post-traduccionales
se asemejan más al sistema in vivo.
Mediante PCR se generó la mutación puntual D90N sobre el cDNA de KCNE3.
Además a través de esta misma técnica se incorporó el epítope HA en el extremo 5',
justo después del codón de inicio. A modo de control se generó HA-KCNE3 de la
forma descrita anteriormente. Para los estudios in vitro se utilizó el vector pIRES-
hCD8 con el objetivo de expresar las proteínas en estudio. Este vector posee el
promotor de citomegalovius (pCMV) cuya principal característica es tener una alta
tasa de expresión en cultivos in vitro. El cDNA de HA-KCNE3 o HA-KCNE D90N fue
insertado río abajo del promotor. Además la construcción posee la secuencia
codificante para hCD8 río abajo de la secuencia IRES, que permite la traducción de
esta proteína. hCD8 es esencial para poder identificar las células transfectadas con
la proteína de fusión a través del anticuerpo anti-CD8 unido a microesferas
magnéticas. Estas esferas pueden ser visualizadas por microscopía óptica. Así las
células a las que estén unidas corresponden a aquellas que expresan la proteína en
estudio y en ellas se realizan los registros de corrientes macroscópicas de potasio
por patch clamp.
78
La elección de la línea celular donde se realizó la expresión de los cDNA para los
estudios electrofisiológicos por patch clamp se basó en los siguientes criterios: las
células debían ser de un tamaño celular homogéneo, tener buena eficiencia de
expresión, buena accesibilidad para formar el giga-sello entre la pipeta y la célula,
baja corriente endógena del canal en estudio y viabilidad mientras se realizan los
ensayos electrofisiológicos (Gamper et al., 2005). Por las razones anteriormente
detalladas las líneas celulares mamíferas de elección en electrofisiología son las
células embrionarias humanas de riñón (HEK293) y células de ovario de hámster
chino (CHO).
La línea celular escogida fue células de ovario de hámster chino (CHO). Estas son
de fácil cultivo, transfección y resistentes a los tratamientos electrofisiológicos.
Además han sido utilizadas en una gran cantidad de trabajos para estudios de los
canales KCNQ1 (Schroeder et al., 2000; Gage y Kobertz, 2004; Ehrlich et al., 2005),
pues no presentan expresión de la unidad formadora de poro y tampoco de las
subunidades accesorias KCNE. El principal problema de las células HEK293 para
estos experimentos es que se ha detectado una baja eficiencia de la expresión de
KCNQ1 y KCNE3 en este sistema, por lo que fueron descartadas para la
investigación.
La co-transfección del cDNA de HA-KCNE3 D90N y KCNQ1 mostró una reducción
cercana al 80% de la corriente de potasio conducida por el complejo KCNQ1/KCNE3
(309 ± 34 pA para los complejos formados con la subunidad HA- KCNE3D90N y
1493 ± 659 pA para el complejo silvestre, n=4. Mediciones registradas a 0mV). Al
comparar las corrientes registradas para complejo KCNQ1/KCNE con las de
KCNQ1/HA-KCNE3 no se encontraron mayores diferencias en la densidad de
79
corriente (1493 ± 659 pA y 1635 ± 670 pA para los complejos nativos y con la
subunidad HA-KCNE3 respectivamente, n=4, registradas a 0 mV) ni en la
dependencia a voltaje (Figuras 11 y 12). Con estos datos se puede descartar que la
incorporación de HA influya sobre las características biofísicas del canal.
Una posibilidad que explique la reducción de las corrientes macroscópicas medidas
para KCNQ1/HA-KCNE3 D90N es la reducción de la expresión del canal en la
membrana celular. Mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta contra HA se
pudo demostrar que la localización subcelular del complejo se mantuvo a pesar de la
presencia del epítope HA y de la mutación puntual D90N de la subunidad accesoria.
Al transfectar el cDNA de la subunidad β en células CHO estas proteínas no fueron
detectadas en la membrana celular, independientemente si se trataba de la
subunidad mutante o no. En contraste, al co-transfectar la subunidad accesoria con
la unidad formadora de poro KCNQ1, se observó inmunoreactividad correspondiente
a las proteína de fusión HA-KCNE3 y HA-KCNE3 D90N en la membrana plasmática
(figura 13), datos que corroboran lo descrito anteriormente por Schroeder et al.
(2000).
Estos resultados ratifican que la mutación puntual D90N efectivamente reduce la
corriente conducida por KCNQ1 y que el epítope HA no influye sobre estas, ni sobre
su localización subcelular. Además muestran que la subunidad accesoria sólo es
capáz de localizarse en la membrana citoplasmática cuando se acopla a una unidad
formadora de poro como KCNQ1 independientemente si se trata de la proteína
silvestre o mutante.
80
5.2 Estudios ex vivo de la secreción de cloruro en tejido intestinal de ratones
transgénicos.
A pesar del gran avance de las técnicas in vitro, éstas no han sido capaces de
mostrar en su totalidad las interacciones entre células y tejidos. El desarrollo de la
biología molecular y de las técnicas de manipulación genética han permitido la
generación de animales genéticamente modificados. Los modelos animales son de
gran utilidad ya que permiten estudiar, por ejemplo, el efecto de una proteína en un
sistema integrado. Habitualmente se utilizan ratones ya que se encuentran bien
caracterizados, tienen un ciclo de vida corto, el número de crías es mayor que los
obtenidos en otros modelos murinos y al ser pequeños reducen costos de
mantención y espacio.
Los animales genéticamente modificados son una gran herramienta para el estudio
de enfermedades y procesos fisiológicos. De acuerdo a las necesidades de la
investigación, se pueden obtener ratones deficitarios en un gen (nulos o knockouts)
o con mutaciones puntuales (knockins) por recombinación homóloga. Otro modelo
de animales genéticamente modificados son los ratones transgénicos obtenidos por
microinyección nuclear de zigotos de un gen ya sea silvestre o mutado o proveniente
de otra especie.
En este trabajo se usó el modelo de microinyección pronuclear de la proteína HA-
KCNE3 D90N, ya que permite expresar de manera tejido específica la proteína en
estudio. Además permite determinar si la mutación D90N ejerce un efecto dominante
negativo en la función del canal. Si esta hipótesis fuese correcta, la expresión de la
proteína exógena desplazaría la funcionalidad normal del canal de potasio
reduciendo las corrientes conducidas por éste, como se mostró que ocurría en las
81
células CHO. Sin embargo, este sistema presenta importantes desventajas. La
principal es que la secuencia foránea se inserta al azar dentro del genoma y en un
número de copias indeterminado. Asimismo, dependiendo del sitio de inserción el
gen puede expresarse o no, o bien interferir en la secuencia de otros genes que
pueden afectar el normal desarrollo y funcionamiento del animal (efectos
posicionales). Por esta razón es indispensable la generación de distintas líneas
transgénicas, donde se pueda comparar el efecto de la expresión de la proteína
exógena y descartar los efectos propios de cada inserción.
Una vez esclarecido el efecto la mutación D90N de proteína KCNE3 sobre la
densidad de corriente conducida por KCNQ1 en células CHO y que el epítope
añadido no afecta el funcionamiento ni localización subcelular de la proteína, se
comenzaron a generar los vectores para la microinyección del transgen en los
embriones de ratones.
82
En este estudio se usó el promotor de la proteína villina, que es un potente promotor
específico para el epitelio intestinal. Villina es una proteína estructural de las células
polarizadas. Se expresa en todas las células del epitelio intestinal (Pinto et al., 1999)
tanto en el eje horizontal (desde el duodeno hasta el colon) como en el vertical (eje
cripta- vellosidad) y tiene como función polimerizar los microfilamentos de actina
formando estructuras que mantienen la organización de las microvellosidades de las
células absortivas. La secuencia del promotor utilizado corresponde a 9 Kb del
promotor nativo que abarca 3,5 Kb río arriba del sitio de inicio de la transcripción y
5,5 Kb del primer intrón, siendo una zona de regulación cis del gen de la proteína
villina. Este promotor ya había sido utilizado con anterioridad en el grupo de trabajo
(Sandoval et al., 2011), donde se determinó su utilidad y especificidad como
promotor intestinal.
Un punto importante es determinar la concentración en la que inyectará el DNA
foráneo, la pureza y la concentración de sales en las que se disuelve el transgen,
para poder maximizar la eficiencia de la micro-inyección y aumentar la viabilidad de
los embriones (Brinster et al., 1985). Usando las condiciones previamente
establecidas por la Unidad de Genómica Funcional del CECs se lograron obtener 2
líneas para los animales transgénicos Villina HA-KCNE3 y 6 para los transgénicos
Villina HA-KCNE3D90N. Las colonias conseguidas fueron híbridas C57BL/6/CBA ya
que se ha probado que los embriones transfectados de estos animales tienen una
mayor sobre-vida y que las hembras producen un mayor número de crías por
camada (8 a 10 crías), aumentando las posibilidades de obtener animales
genéticamente modificados (Andersen ML y Tufik S, 2010).
83
Una forma rápida y eficaz para probar la efectividad de la transgénesis y evaluar los
efectos electrofisiológicos de la proteína exógena mutante fue a través de
experimentos en una cámara de Ussing. Esta técnica permite manipular por medio
de fármacos la actividad de los canales involucrados en la secreción de cloruro
intestinal, permitiendo conocer el efecto fisiológico de la mutación en KCNE3. En
una primera instancia se buscó probar que los animales genotipificados por PCR
que habían sido positivos para la presencia de los transgenes HA-KCNE3 o HA-
KCNE3 D90N exhibían un fenotipo de corrientes acordes con su genoma y con los
resultados obtenidos en los estudios de transfección aguda en células CHO.
Estudios recientes (Alzamora et al., 2011) han mostrado que el β-estradiol reduce
los niveles de expresión y actividad del complejo KCNQ1/ KCNE3, por lo que se
prefirió utilizar ratones machos adultos para los estudios de corrientes de corto
circuito.
Los experimentos en la cámara de Ussing utilizan la capacidad de ciertos fármacos
para bloquear o activar los canales comprometidos en la secreción de cloruro en el
intestino. En primer lugar se aplicó apicalmente amilorida droga que es capaz de
bloquear físicamente el poro de los canales epiteliales de sodio (ENaC) que se
encuentran en la membrana luminal de las vellosidades del colon y que tienen como
principal función absorber sodio. Así es posible aislar las corrientes de cloruro de las
de Na+. Posteriormente se aplicó basolateralmente forskolina e IBMX. La primera es
un agonista de la adenilato ciclasa, activa directamente el sitio catalítico de esta
enzima, mientras que el antagonista de la enzima AMPc fosfodiesterasa, IBMX,
inhibe la hidrólisis de AMPc. De esta forma aumenta la concentración intracelular de
AMPc estimulando las corrientes inducibles por AMPc: CFTR y el complejo
84
KCNQ1/KCNE3 y con ello la secreción luminal de Cl-. La tercera etapa del protocolo
consistió en añadir de forma basolateral cromanol 293B a la solución de baño, este
anti-arrítmico es un bloqueador las corrientes de cloruro estimuladas por AMPc, pero
tiene una mayor especificidad por el complejo KCNQ1/KCNE3 (IC50= 3μM) que por
CFTR (IC50= 19μM). La concentración de cromanol 293B (10μM) utilizada en este
trabajo evita que CFTR sea inhibido por esta droga. Por último se utilizó carbacol, un
agonista de los receptores muscarínicos. Al estimular estos receptores se induce un
aumento de la concentración intracelular de Ca2+ que activan los canales KCNN4.
De esta forma se hiperpolariza la membrana celular favoreciendo la secreción apical
de cloruro.
Al estudiar los animales transgénicos Villina HA-KCNE3 D90N se determinó que el
epitelio intestinal no presentaba respuestas a cromanol 293B comportándose de
forma similar a los estudios hechos en yeyuno de animales nulos para KCNQ1
(Vallon et al., 2005) y colon de animales nulos para KCNE3 (Preston et al., 2010). En
estos tres modelos se observa una pérdida completa de la sensibilidad en el tejido
intestinal de las corrientes inhibibles por cromanol 293B y una reducción cercana al
50% de las corrientes inducibles por aumentos de la concentración de AMPc en
yeyuno y cercanas al 30% en el caso del colon distal.
Al desglosar los resultados por línea transgénica no se observan diferencias
importantes entre ellas (Anexos 1 y 2), a excepción de los encontrados en la línea
Villina HA-KCNE3 D90N 004d. En ésta, la ΔIsc para corrientes sensibles a C293B
sólo se redujo alrededor de un 50% en comparación con los animales WT, por lo que
fue descartada para los siguientes estudios. La gran variabilidad de los valores de
ΔIsc para las corrientes inducibles por FSK y CCH entre las distintas líneas podría ser
85
consecuencia de que los animales analizados son híbridos y del bajo número de
animales estudiados. Esta situación se puede corregir realizando retrocruzas de los
animales Villina HA-KCNE3 D90N con animales C57 hasta alcanzar un background
genético cercano al 100% C57, hecho que es aplicable también para los
transgénicos Villina HA-KCNE3 y sus respectivos controles.
El estudio de la localización tisular de las proteínas HA-KCNE3 y HA-KCNE3 D90N
se realizó a través de inmunofluorescencia contra el epítope HA. En yeyuno se
observó que las proteínas de fusión se distribuyeron a lo largo del eje cripta-
vellosidad, no sólo en la base de la cripta como había sido descrito anteriormente
para la proteína nativa en ratas por Liao et al. (2005) o por Preston et al. (2010) en
ratones. En colon los animales Villina HA-KCNE3 D90N presentaron
inmunoreactividad en las criptas colónicas, pero en mayor medida en la superficie de
las vellosidades, mientras que en los animales Villina HA-KCNE no se detectó señal
correspondiente a la proteína de fusión en colon. Sin embargo la unidad formadora
de poro se localizó en la base de las criptas del colon como ocurrió en los dos
modelos animales descritos anteriormente (Figura 18).
86
El patrón de expresión reportado para las proteínas de fusión, esto es, una mayor
presencia de HA-KCNE3 y HA-KCNE3 D90N en la superficie de las vellosidades
intestinales con respecto a las criptas, concuerda con el patrón de expresión descrito
previamente para proteínas acopladas al promotor de Villina (Pinto et al., 1999),
donde se observa una gradiente de expresión que tiene su máximo nivel en la
superficie de las vellocidades del yeyuno. La falta de inmunoreacción el epitelio del
colon distal también podría ser consecuencia del promotor utilizado, ya que se ha
descrito una baja eficiencia de expresión de las proteínas asociadas a este promotor
en esta porción del intestino (Madison et al., 2002).
Otro análisis que se realizó fue la medición del contenido de agua de las heces
como un índice global del proceso secretorio de fluido intestinal. Se esperaba que si
se comprometía la secreción secundariamente a la pérdida de la función del
KCNQ1/KCNE3 hubiese una disminución en el contenido acuoso de las heces.
Aunque no se encontraron diferencias significativas entre los animales WT y los que
expresan las proteínas HA-KCNE3 y HA-KCNE3D90N, ambos modelos transgénicos
presentaron una disminución de aproximadamente 15 puntos porcentuales en dicho
contenido acuoso (Tabla II). Estos resultados requieren aumentar el número de
muestras analizadas para establecer si las diferencias son estadísticamente
significativas.
Como se mencionó se esperaba que al no haber un adecuado reciclaje de potasio,
producto de la inactivación de KCNQ1/KCNE3 por mutación puntual de esta última,
disminuiría la secreción de cloruro y con ello la de agua hacia el lumen, lo que se
traduciría en obstrucciones intestinales. La inexistencia de este efecto puede dar
cuenta que habría un efecto compensatorio por parte del canal de potasio
87
basolateral dependiente de calcio, KCNN4. Flores et al. (2007) describió un proceso
similar en animales nulos para KCNN4 (KCNN4-/-) donde se observó una
disminución estadísticamente significativa del contenido de agua de las heces de los
animales KCNN4-/- respecto a los WT, sin embargo tampoco fueron reportadas
obstrucciones intestinales en estos animales. Un punto interesante sería estudiar los
niveles de expresión de los distintos canales presentes en estas células, ya que
podría ocurrir un cambio en los niveles de expresión de estos con el fin de mantener
una adecuada secreción de cloruro y agua. También sería interesante generar líneas
de transgénicos a partir de la cruza de los animales Villina HA-KCNE3 D90N x
KCNN4 -/- y examinar la viabilidad y secreción intestinal de estos animales.
Analizando morfológicamente los animales transgénicos no se encontraron
diferencias importantes con los animales nativos, pero si se halló un pequeño
aumento en el largo del intestino, tanto en colon como yeyuno para los animales
Villina HA-KCNE3 D90N. En los animales que expresan HA-KCNE3 no se
encontraron diferencias al compararlos con los WT (Tabla II). Aunque estos datos
no son estadísticamente significativos es un resultado que debe estudiarse, ya que
hay reportes en los que se muestra que la deleción de KCNQ1 y de las subunidades
accesorias en estómago conducen a hiperplasia de este tejido (Lee et al., 2000;
Roepke et al., 2011) y podría ocurrie algo similar al inhibir las corrientes conducidas
por KCNQ1 en colon.
En resumen, se pudo establecer que efectivamente la mutación de aspartato por
asparragina en la posición 90 de la subunidad auxiliar KCNE3 se expresa de forma
88
dominante negativa y que es suficiente para anular las corrientes sensibles a C293B
en el intestino in vivo y que la adición de HA no afecta la función ni localización del
canal. Sin embargo la actividad del canal KCNQ1/KCNE3 no sería indispensable
para promover la secreción intestinal de cloruro. La pérdida a la activación de
KCNQ1 mediante AMPc, podría ser consecuencia de que el residuo 90 de KCNE3
estaría directamente involucrado en la vía de activación del canal a través de AMPc.
Algo similar a lo planteado por Kurokawa et al., (2003), quien postuló que KCNE1
era indispensable para la fosforilación del complejo KCNQ1/KCNE1 por la proteína
quinasa A (PKA) estimulada por AMPc después de estimulación β- adrenérgica en
cardiomiocitos y que dicha respuesta es anulada cuando KCNE1 presenta la
mutación D76N, análoga a D90N en KCNE3. O bien esta mutación podría perjudicar
el movimiento de compuerta y la conducción iónica del potasio, reduciendo la
densidad de corriente del complejo KCNQ1/KCNE3.
Este modelo animal podría ser útil para estudios de distintas patologías como
fibrosis quística, o para la evaluación de drogas u hormonas, como el efecto de los
estrógenos sobre la secreción de cloruro intestinal. Además el hallazgo del aumento
del largo del intestino de estos animales, aunque no presentaran diferencias
significativas con los animales WT, proporciona una idea sobre que este modelo
podría ser utilizado para analizar la relación entre las proteínas KCNQ1 y/o de
KCNE3 en hiperproliferación celular. Existen diversos estudios que relacionan la
actividad de canales de potasio en procesos como inducción, mantención y
progresión de carcinoma de colon tanto en ratones como en humanos (Ousingsawat
et al., 2007; Becchetti, 2011).
89
Otro punto importante a dilucidar es el origen de la corriente de potasio que
mantiene el remanente de la corriente de cloruro estimulada por AMPc (50% para
yeyuno y 30% en colon) presente en los modelos nulos para KCNQ1, KCNE3 y
dominante negativo para KCNE3 luego de la aplicación de forskolina. Estos estudios
requieren generar líneas transgénicas puras, con una base genética cercana al
100% C57BL/6, ya que se ha probado que diferencias en el background genético
influyen en los niveles de expresión y actividad de canales iónicos implicados en el
sistema de secreción de cloruro intestinal, como es el caso de CFTR y KCNN4
(Rozmahel et al., 1996; Flores et al., 2010). Dado el bajo número de líneas
transgénicas se recomienda mantenerlas todas para los estudios finales,
exceptuando la línea transgénica 004d, cuyo fenotipo fue muy distinto al de las
demás líneas que sobre-expresan la proteína mutante.
La falta de expresión de la proteína fusión en colon distal de los ratones Villina HA-
KCNE3 con respecto a las cinco líneas transgénicas de los animales Villina HA-
KCNE3 D90N, representa un problema ya que la expresión de la proteína HA-
KCNE3 sería usada como control de la proteína mutante. La baja expresión de un
transgen asociado al promotor de Villina a nivel del colon distal había sido reportada
por Madison et al. (2002). Al comparar el comportamiento electrofisiológico de la
secreción de clururo en yeyuno de los animales WT con los Villina HA-KCNE3, no se
observan cambios significativos entre estos, por lo que suponemos que a nivel de
colon distal tampoco deberían obeservarse grandes cambios consecuencia de la
sobreexpresión de KCNE3. A pesar de lo anterior, creemos que es necesario
generar líneas transgénicas que expresen la proteína HA-KCNE3 en colon distal,
para tener un adecuado control de los experimentos.
90
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7. ANEXOS
Genotipo
(n)
ΔIsc Inhibible
por AMPc (μA)
ΔIsc Inducible
por 293B (μA)
ΔIsc Inhibible por
CCH (μA)
WT (5) -28,9 ± 9,2 22,6 ± 8,4 -19,2 ± 8,1
HA- KCNE3
796c (2) -26,7 ± 9,8 23,0 ± 4,0 -25,4 ± 12,2
921c (1) -27,7 9,5 -13,6
HA-KCNE3 D90N
842c (3) -4,1 ± 1,6 1,8 ± 0,9 -29,2 ± 14,6
843c (2) -12,2 ± 9,1 0,7 ± 0,5 -20,9 ± 1,6
981c (1) -2,5 0,2 -9,9
996c (2) -15,2 ± 6,1 0,9 ± 0,1 4,2 ± 18,7
004c (1) – 25,2 -34,5
Tabla I. Diferencias de corrientesde corto-circuito medidas en yeyuno por
cámara de Ussing luego de la aplicación de amilorida, forskolina más IBMX,
cromanol 293B y carbacol en animales silvestres y distintas líneas de los
transgénicos HA-KCNE3 y HA-KCNE3D90N.
Los valores corresponden al promedio ± el error promedio estándar. Entre paréntesis
se muestra la cantidad de animales analizados.
98
Los valores corresponden al promedio ± el error promedio estándar. Entre paréntesis
se muestra la cantidad de animales analizados.
Genotipo(n)
Δ Isc Amilorida (μA)
ΔIsc Inhibible
por AMPc (μA)
ΔIsc Inducible
por 293B (μA)
ΔIsc Inhibible
por CCH (μA)
WT (5) 8,0 ±10,8 -99,8 ± 22,8 80,3 ± 26,7 -112,3 ± 39,6
HA-KCNE3
796c (2) 8,15 ± 6,0 -111,1 ± 21,6 71,34 ± 0,4 -153,6 ± 64,5
921c (2) 21,4 ± 7,3 -105,1 ± 4,6 68,1 ± 20,8 -155,4 ± 22,1
HA-KCNE3 D90N
842c (3) 15,5 ± 3,7 -38,5 ± 13,5 1,8 ± 0,9 -129,7 ± 4,2
843c (3) 10,7 ± 2,0 -44,3 ± 12,0 7,2 ± 1,6 -139,9 ± 14,3
981c (1) 2,8 -58,4 2,2 -116,2
996c (2) 17,0 ± 4,0 -38,7 ± 7,8 5,1 ± 3,8 -137,6 ± 18,3
004c (1) 14,4 -71,2 20,1 -13
Tabla II. Diferencias de corrientes de corto-circuito medidas en colon distal
por cámara de Ussing luego de la aplicación de amilorida, forskolina más
IBMX, cromanol 293B y carbacol en animales silvestres y distintas líneas de
los transgénicos HA-KCNE3 y HA-KCNE3D90N.
