本間 正充

国立医薬品食品衛生研究所・変異遺伝部

遺伝毒性を如何に評価、解釈するのか？

日本環境変異原学会第41回大会（静岡）シンポジウム「変革期を迎えている安全性評価」

TOPICS

一般化学物質と医薬品の遺伝毒性リスク評価の違い

ICHガイドライン vs. OECDガイドライン

ICH-M7（医薬品中の遺伝毒性不純物のリスク評価）

OECD 遺伝毒性試験ガイドライン (2012. 2)

Ames

58.8

73.9

54.0

79.0

MLA

73.1

39.0

74.0

32.0

Chrom.Ab.

65.6

44.9

52.0

68.0

MN(Vitro)

78.7

30.8

Sens.

Spec.

Sens.

Spec.

Krikland et al., Mutat. Res. 584, 1, 2005

ZeigerReg. Tox. Pharm. 28, 85, 1998

Reports

Sens. (Sensitivity): % of positive results among rodent carcinogens.Spec. (Specificity): % of negative results among rodent non-carcinogens.

In Vitro 遺伝毒性試験とげっ歯類発がん性試験との一致率

ＩＣＨS2 (R1)ガイドラインの主要変更点

In vitro mammalian cell assay:Reduction in top concentration from 10 mM to 1 mM

Two options provided for the test battery:Option 1: Battery with in vitro mammalian cell assay

Option 2: Battery without in vitro mammalian cell

assay, but two in vivo endpoints

Sens.

Spec.

Sens.

Spec.

Sens.

Spec.

66

45

61

68

59

74

CA Test

CA Test Survey for 307 approved pharmaceuticals in Japan from 1999 to 2006

Kirkland et al., Mutat. Res. 584, 1, 2005Ref.Ames Test

Kirkland et al., Mutat. Res. 584, 1, 2005

Original (10 mM or 5 mg/ml, whichever is lower)

Revision (1 mM or 0.5 mg/ml, whichever is lower)

染色体異常試験とげっ歯類発がん性試験との一致率の予測（最高用量変更後）

Options Name Suggested values RationaleOption 1 called “OECD” 10 mM or 5000 µg/mL,

whichever is lowercurrent criteria

Option 2 called “ICH” 1 mM or 500 µg/mL, whichever is lower,

currently suggested in ICH S2(R1) for pharmaceuticals

Option 3 called “DK” 1 mM or 500 µg/mL, whichever is higher,

mostly based on re-analysis of NTP database and recent experiments (Fowler and Kirkland). This proposal was with drawn by David Kirkland in favour of Option 6)

Option 4 called “BG” 10 mM or 1000 µg/mL, whichever is lower,

based on extrapolation made from the use of 1000 mg/kg in vivo, and the need to test higher concentrations for low molecular weight compounds

Option 5 called “BG-GD” 10 mM or 2000 µg/mL, whichever is lower,

based on extrapolation made from the use of 2000 mg/kg in vivo for short term treatment, and the need to test higher concentrations for low molecular weight compounds

Option 6 called “VTEL” 4 mM alone when molecular weight is known, and 2000 µg/mL, when molecular weight is unknown

Compromise that takes all other options into account, relies on molarity only except when no information is available on molecular weight, applies a 2.5 fold reduction to the current top concentration, and a 4-fold safety factor to “DK” proposal (based on the analysis of existing data)

Option 7 called “Alternative VTEL” (AVTEL)

4 mM or 2000 µg/mL, whichever is lower

VTEL proposal with a “cap” at 2000 µg/mL to avoid very high concentration in µg/mL for high molecular weight molecules.

OECDでの最高用量の提案（2011.3)

OECDでの最高用量の決定（2012.4)

BG-GD: 10 mM or 2000 μg/mL, whichever is lower, with the 5000 μg/ml limit maintained for mixtures ("mixtures" to be defined).

AGENDA ITEM 23: 61. The WNT approved the top dose for soluble compounds in the absence of cytotoxicity in in vitro mammalian genotoxicity TGs, as proposed by the Secretariat in document ENV/JM/TG(2012)34:

62. Japan strongly recommended that Streamed Summary Document be developed for in vitro mammalian genotoxicity testing and offered to support the work on these document.

Oxolinic acid (MW 261)(Antimicrobial drug)

No concern for Clastogenicity Concern for Clastogenicity?

Pharmaceutical for urinary tract infection

Daily dosages : 12-20mg/kg

Agricultural chemical and animal drug ADI : 0.021mg/kg

CA positive in equal or more than 2.5 mM in CHL cells without S9

Negative in CA as a pharmaceutical

(ICH)

Positive in CA as a chemical (OECD)

ICH vs. OECD

The EG members considered that, for industrial chemicals, for which negative in vitro results might not be followed by further testing, the most prudent course for public health is to maximize the sensitivity of the test battery even at the expense of lower specificity. This is in contrast to pharmaceuticals that are almost always evaluated in vivo.

In vitroほ乳類細胞遺伝毒性試験の最高用量の選択に対するOECD-WNTの見解(テストガイドライン 473, 476 and 487)

Conclusions

Base

+

toluene

Pd catalyst/ Ligand 1) conc H2SO4

LiOt-Bu THF

1) NaBH4 / MgCl2 /MeOH

F3C

XCN

NH2

F3C

NH

CN F3C

NH

O

NH2

F3C

NH

O

NH

O

O

2) aqHCl

F3C

NH

HN O

O

F3C

N

HN O

O

OO

Sodium carbonate Tetrahydrofuran

Cl

O

O

F3C

N

N

O

O

O O

F3C CF3

Br

F3C CF3

Methylene chlorideNaOH/TBAB

1)

2) Ethanol/water

2) Ethanol/water

1)

Step 1 Step 2

Step 3 Step 4 Step 5

Step 6

Cl

O

O

X=Cl, Br

3) Ethanol/water

2) toluene/heptane(1) (2)

(3) (4)

(5)

合成過程の合成過程の試薬、反応中間体、副産物

医薬品の分解物

医薬品中に含まれる遺伝毒性不純物のリスク評価と管理

不純物

遺伝毒性?

ICH-M7ガイドライン

遺伝毒性閾値とTTC

用量

反応

用量

反応

閾値あり化合物(非遺伝毒性物質）

閾値なし化合物(遺伝毒性物質）

閾値 閾値なし

用量

反応

閾値を問わない化合物(遺伝毒性物質）

安全性量 実質安全性量(VSD) 安全性量？

TTC

TTC算出の根拠

発がん性が最も感受性の高い毒性エンドポイントであるという仮定に基づいて、発がん性データベース（Carcinogenic Potency Database: CPDB）から得られるTD50データの分布解析から求められている。

実際のリスク評価の際のユニットリスクの算定には、線形マルチステージモデルなどの数理モデルによるフィッティングを行って求められるが、TD50からの直線外挿により、VSD（10-5～10-6

リスク）を求め、その分布を解析。

Tum

or O

ccur

renc

e

Dose

0

0.2

0.4

0.6

0.8

10-6

TD50VSD(LMS)VSD(TD50)

Multi-Stage Model

Linear extra

polation from TD 50

Tum

or O

ccur

renc

e

Dose

0

0.2

0.4

0.6

0.8

10-6

TD50VSD(LMS)VSD(TD50)

Multi-Stage Model

Linear extra

polation from TD 50

Log10 Dose

Rel

ativ

e Fr

eque

ncy

Distribution of TD 50Distribution of VSD(10-6 from TD 50)

0.15 ug/day(≒0.0025 ug/kg/day)

85 %ile

Log10 Dose

Rel

ativ

e Fr

eque

ncy

Distribution of TD 50Distribution of VSD(10-6 from TD 50)

0.15 μg/day(≒0.0025 ug/kg/day)

85 %ile

63 %le

1.5 μg/day

VSD with 10-5 risk (μg/person/day ) = Weight (kg) X TD50(μg/kg)/50,0001.25 mg/kg/day (TD50) → 1.5 µg/day (TTC)

*COCは除く

発がん物質のTTCレベル(Generic TTC)

アフラトキシンAflatoxin様化合物

アゾキシAzoxy化合物

ニトロソNitroso化合物

2,3,7,8-dibenzo-p-dioxinおよびその類似体（TCDD）

ステロイド類

<COC（Cohort of Concern)>

TTCレベル リスクレベル 対象物質

0.15μg/人/日 10-6 食事中に低レベルで存在する遺伝毒性/要注意構造を持つ発がん物質*

1.5μg/人/日 10-5 医薬品に含まれる遺伝毒性/要注意構造を持つ発がん物質*

新しいTTC の導入(Generic TTC to Adjusted TTC)

曝露期間に応じた許容レベル（Less than Lifetime TTC)

化合物の特徴に応じた許容レベル（Compound-specific TTC)

Haberの法則

曝露期間

曝露

レベ

ル

T1 T2

C1

C2

C1 x T1 = C2 x T2

曝露期間

曝露

レベ

ル

高濃度短期間曝露と低濃度長期間曝露の生涯累積用量は同価である

LTL-TTCレベル（10-5リスク x 追加安全係数)

ICH-M7で提唱するTTCレベル

Duration of treatment < 1 month >1 - 12

months >1 - 10 years >10 years to lifetime

Daily intake[µg/day]

120 20 10 1.5

治験薬

上市医薬品

懸念すべきクラス（COC） vs. 懸念が少ないクラス（COLC)

Distribution of VSD

Log10Dose

Rel

ativ

e Fr

eque

ncy Distribution of TD50Distribution of VSD

(10-6 from TD50)

0.15 ug/ day

85 % tile

COC (Cohort of Concern)

COLC (Cohort of Less Concern)

CPDBと医薬品不純物の化学物質構造の比較

CPDB化合物 医薬品中不純物して検出しうる化合物

(Galloway et al, in preparation)

Alert Name

Number in

CPDB % in CPDB

Number in Synthetic Routes

% in Synthetic Routes

Daily dose Resulting in a 1 in 100,000 Excess Cancer Risk (µg)

Min. 10% 25% Med. 75% 90% Max.

Aromatic amine or amide, N hydroxylamine 43 21.6 125 20.8 0.40 0.824 2.30 14.94 67.71 279.24 3636

N-Nitro or N-nitroso compound 34 17.1 0 0.0 0.009 0.04 0.098 0.35 2.81 8.98 38.52Aromatic nitro compound 33 16.6 88 14.6 0.017 0.77 4.95 13.68 139.80 296.88 793.20

Alkylating agent 19 9.5 156 25.9 2.94 3.65 6.65 45.36 79.95 1149 1656

Aromatic azo compound 9 4.5 8 1.3 1.13 1.13 1.95 4.62 73.02 844.80 844.80

Epoxide 5 2.5 13 2.2 1.79 1.79 5.355 36.84 36.84 36.84 36.84

Halogenated alkene 5 2.5 0 0.0 0.44 0.44 2.865 12.24 20.1 21.48 21.48

構造クラス別の許容レベル（10-5リスク)とその分布

(Galloway et al, in preparation)

DNA反応性不純物のハザード評価の手順

I. 不純物の分類

II. 構造活性相関（SAR） 解析

III. エームス試験

IV. In vivo 試験によるフォローアップ

不純物分類 定義予想される管理方法

カテゴリー 1 遺伝毒性発がん物質

カテゴリー 2

遺伝毒性不明、親化合物関連しないアラート構造を有する

カテゴリー 3

遺伝毒性を有するが発がん性不明

カテゴリー 4 遺伝毒性不明、親化合物と類似したアラート構造を有する

カテゴリー 5 構造アラートの特徴なし

TCCもしくは

他の手法

非変異原物質として評価

I. 遺伝毒性不純物の分類と管理方法

II. 構造活性相関（(Q)SAR） 解析

ICH-M7(Step2 Document)互いに相補的な2種類の(Q)SAR予測モデルを用いるべきである。１つは専門的な経験に基づくルールベースの方法、2つ目は統計ベースの手法である。

DEREKOncologicHazardExpertToxtree

MCASESciQSAR (MDL-QSAR)VEGATOPKATLazarLeadScopeADMEWORKS

ルールベース

統計ベース

IV. In vivo 試験によるフォローアップ

ICH-M7(Step2 Document)エームス試験の陽性結果がin vivo条件下でも起こりうる妥当性を検証するためには、in vivo遺伝子突然変異試験により不純物を試験することを推奨する。他のin vivo試験を選択には、

不純物の遺伝毒性メカニズムや、組織特異性を考慮した科学的妥当性を考慮する。

（トランスジェニック突然変異試験、Pig-a試験、小核試験、ラット肝UDS試験、コメット試験等）

III. エームス試験

DNA反応性不純物の安全性確認のためのフローチャート

不純物含量はTTCレベルを超えているか ?

(Q)SAR？

エームス？

不純物の含量をTTC以下に減らす。もしくはin vivo遺伝子突然変異試験を行い、生体影響を評価する。

はい

はい

陽性

いいえ

いいえ

いいえ

更なる検討は不要

更なる検討は不要 （ただし、1日曝露量が1mg/dayを超える場合はQ3A/Bのガイダンスに従い遺伝毒性の評価を考慮する。）

更なる検討は不要

不純物の分類クラス 4, 5 クラス 1,2

クラス3

TTCもしくは個別管理非変異原物質として評価

まとめ化学物質のリスク評価

一般化学物質（食品添加物、残留農薬） vs. 医薬品（不純物）

リスク vs. ベネフィット

曝露量評価

曝露期間

対照物質の化学構造

一般化学物質

リスク・ベネフィット

困難

一生涯

多様

医薬品

リスク・ベネフィット

容易

生涯以下

制限付