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首都圏北部4大学発新技術説明会
迅速かつ簡便にウイルス、微生物類を検出する指示薬の開発
埼玉大学大学院理工学研究科准教授 幡野 健
E-mail: [email protected] & Fax: 048-858-3535
感染における糖鎖の役割
VirusToxin Bacterium
Glycolipid
Glycoprotein
O157の産生するベロ毒素の糖鎖認識
Side view Bottom view
Grobotriaosyl Ceramide (Gb3: Galα1-4Galβ1-4Glcβ-Cer)
Vero toxin (Stx1 and Stx2)
OOH
HOO
HO
OH
OHO O
OH
OH
OHO
OH
OHO
N
OH
HO
これまでの研究成果:糖鎖クラスター効果1)
SiMe
MeSi Si R
R
RR
R
R
Si R
R
R
Si
Si
Si Si
Si RR
RR
RR
RR
RR
RR
Fan(0)3 Dumbbell(1)6 Ball(1)12
OHO
AcHN
OH
OCOOH
HOOH
OHO O
OH
OOHOH
OHO SR :
O SOOH
OHO
OH OH
OHO
OH
OHO O
NHAc
OH
OOHOH
HOOH
OR :
シアリルラクトース
ラクトネオテトラオース
OOH
HO O
OH
HO
OO
OHO
OH OH
OHO
OHHO
SR :
グロボ三糖
OH
ベロ毒素(O157)Tetrahedron Lett., 1999, 40, 7839-7842. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2002, 99, 7669-7674.
インフルエンザBioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18, 4405-4408.
デングウイルスCarbohydr. Res. 2006, 341, 467-473.
1) Y. C. Lee, FASEB J. 1992, 6, 3193–3200.
感染検査に求められる特性
・ 検査が簡単に行える・ 結果が迅速に得られる・ 精度が高い・ 高額機器を用いない・ 安価な方法・ 検査対象が多い
これらの特性を兼ね備えた理想的な検査方法は可能か!?
検出試薬のための分子設計
• 病原体の存在確認糖鎖担持カルボシランデンドリマー群の病原体への特異的認識能・接着能を用いる(従来技術の利用)。
• ビジュアル化発光部位の導入で可能になる?ただ発光するのみ ⇒ 蛍光標識発光が変化する ⇒ 検出薬
(色調、強度の変化色調、強度の変化)↓
この研究の鍵!
シロールのAIE効果
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100Water fraction (vol %))
Em
issio
n In
tens
ity %
Solv.: Water/Acetone mixture;Concentration: 10-6 M; Ex: 360 nm
Si
Ph Ph
PhPh
Ph S
Aggregate-induced Emission2)
2) B. Z. Tang et al., Chem. Commun., 2001, 1740.
糖鎖クラスター効果とAIE効果の融合
SiSi Si R
R
RR
R
R
Ph4
Si
Ph
Ph PhMe Me
Ph 病原体を特異的に認識する蛍光分子
2,3,4,5-TetraphenylsilolesAIE効果
SiMe
MeSi Si R
R
RR
R
R
+
検査試薬と成り得るのか?
Dumbbell(1)6糖鎖クラスター効果
hybridhybrid
シロールデンドリマーへの糖鎖導入
OAc
OO
OAcO
OAc OAc
OAcO
OAcAcO
SAc+
NaOMe
MeOH / DMF
Ac2O
Py
1) NaOMe / MeOH
2) NaOH aq
OHO
HO OHO
OHO
OH
OHO
OH
SLac:
Si Si Si
Ph
Ph
Ph
Ph BrBr3 3
Si Si Si
Ph
Ph
Ph
Ph LacLac3 3
y. 47% (2steps) y. 83%
3) K. Hatano et al., Tetrahedron Lett., 2007, 48, 4365.
シロールデンドリマーの水中でのPL
照射前 365 nm照射
● Silole-Dumbbell(1)6-Lac 1mM aq.
ΦFL = 92%
レクチン結合活性 -測定法-
SiloleDumbbell(1)6-Lac
OH
OO
OH
HOOH
OOHO
OH
OHLac= S
Si
Ph Ph
SiSi PhPh
Lac
Lac
Lac
Lac
Lac
Lac
PL spectrum measurement ofSilole-Dendrimers
Measured at 5 ℃
Dendrimer solution: 3 mlConc. 0.6 μM in HEPES buffer (pH = 7.4)
PNA solutionConc. 20.0 μM in HEPES buffer (pH = 7.4)
peanut agglutinin (PNA): a Lac binding lectin
PL強度変化によるPNA検出4)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
400 450 500 550 600Wavelength (nm)
Inte
nsity
(a.u
.)
0 μL10 μL20 μL30 μL40 μL50 μL
Figure PL spectra of Silole-Dumbbell(1)6-Lac in the presence of different amounts of PNA (from 0 to 50 μL). Concentration: 0.6 μM in HEPES buffer (5 μM, pH = 7.4). Excitation: 360 nm.
4) K. Hatano et al., Tetrahedron Lett., 2009, 50, 5816; 幡野ほか、ウイルス, 微生物類の検出方法, 特願 2008-283976
発光強度変化と発光強度差4)
-1
-0.9
-0.8
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
00 0.1 0.2 0.3 0.4
[PNA] (μM)
(I-
I 0)/
I 0
Figure Plots of relative fluorescence intensity [(I-I0)/I0] of solution of Silole-Dumbbell(1)6-Lac at 474 nm vs concentration of PNA.
(A) (B)
Figure Pictures of photoluminescence of the HEPES buffer solution of Silole-Dumbbell(1)6-Lac in the (A) absence and (B) presence of PNA. Excitation: 360 nm.
95%が消光
4) K. Hatano et al., Tetrahedron Lett., 2009, 50, 5816; 幡野ほか、ウイルス, 微生物類の検出方法, 特願 2008-283976
レクチン特異性と希釈効果
0
100
200
300
400
500
600
700
800
400 450 500 550 600
Wavelength (nm)
Inte
nsity
(a. u
.)
0 μL
20 μL
40 μL
60 μL
80 μL
(A)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
400 450 500 550 600Wavelength (nm)
Inte
nsity
(a. u
.)
0 μL20 μL
40 μL
60 μL
80 μL
(B)
Figure PL spectra of Silole-Dumbbell(1)6-Lac. (A): Presence of different amounts of WGA (from 0 to 80 μL). Concentration: 0.6 μM in HEPES buffer (5 μM, pH = 7.4). Excitation: 360 nm. (B): Addition of different amounts of blank solution (from 0 to 80 μL). Excitation: 360 nm.
WGA滴下 Blank滴下
2%だけ消光
Stx1 B(ベロ毒素)の検出試験
Figure PL spectra of Silole-Dumbbell(1)6-Gb3. Presence of different amounts of Stx1 B (from 0 to 60 μL). Silole-Dumbbell(1)6-Gb3 Conc.: 0.7 μM, Stx1 Conc.: 1.2 μM, PBS Buffer: 10 μM, Excitation: 360 nm.
Stx1 B:同志社大学 西川喜代孝教授より提供
検出検査所要時間
Figure WGA溶液の滴下時間の変化によるSiloleDumbbell(1)6-Lc3の蛍光強度の変化SiloleDumbbell(1)6-Lc3 Conc.: 0.7 μΜ, WGA Conc.: 7.0 μM, HEPES buffer, Temp.: 5℃Ex = 360 nm, Em = 474 nm
異なる発光色のシロール誘導体
Tamao et al., Chem. Eur. J., 2000, 6(9), 1683.
青色発光
緑色発光
赤色発光
Si
Ph
R R
Ph
Si
Ph
R R
Ph
OMeMeO
Si
Ph
R R
Ph
S SS S
緑色発光デンドリマーによるWGA検出
0
200
400
600
800
1000
400 450 500 550 600 650
Wavelength (nm)
Intensity (a.u.) WGA0μl
WGA10μl
WGA20μl
WGA30μl
WGA40μl
WGA50μl
Figure PL spectra of AnisiylSilole-Dumbbell(1)6-Lc3. Presence of different amounts of WGA (from 0 to 50 μL). Dendrimer Conc.: 0.7 μM, WGA Conc.: 10 μM; Buffer: HEPES (5 μM, pH = 7.4); Ex: 378 nm
Si Si Si
Ph
R2
Ph
R2 YY
Y
Y
Y
Y
OMeR2 =
Y = WGAと接着する糖鎖
2
494 nm
シロール混合系へのWGAの添加
0
200
400
600
400 500 600
Wavelength (nm)
Intensity (a.u.)
WGA0μl
WGA10μl
WGA20μl
WGA30μl
WGA40μl
WGA50μl
Si Si Si
Ph
R1
Ph
R1 XX
X
X
X
X1
R1 =
X = PNAと接着する糖鎖
Figure PL spectra of Silole-Dumbbell(1)6-Lac/AnisiylSilole-Dumbbell(1)6-Lc3. Presence of different amounts of WGA (from 0 to 50 μL). Dendrimer Conc.: 0.35 μM; WGA Conc.: 10 μM; Buffer: PBS (pH = 7.4, 10 μM)
Si Si Si
Ph
R2
Ph
R2 YY
Y
Y
Y
Y
OMeR2 =
Y = WGAと接着する糖鎖
2
486 nm
476 nm
WGA滴下による発光の色調変化5)
0 μl 10 μl 20 μl 30 μl 40 μl 50 μl
WGA滴下量
UVランプ (365 nm)照射時の発光写真
5) 幡野ほか、発光の色調変化による複数微生物の同時検出方法、特願2010-45452.
発光色変化による複数微生物の同時検出の原理
Si Si Si
Ph
R3
Ph
R3 ZZ
Z
Z
Z
Z
S SR3 =
Z = ウイルス(C)と接着する糖鎖
3
(赤色発光)
Si Si Si
Ph
R1
Ph
R1 XX
X
X
X
X1
R1 =
X = ウイルス(A)と接着する糖鎖
(青色発光)
Si Si Si
Ph
R2
Ph
R2 YY
Y
Y
Y
Y
OMeR2 =
Y = ウイルス(B)と接着する糖鎖
2
(緑色発光)
5) 幡野ほか、発光の色調変化による複数微生物の同時検出方法、特願2010-45452.
この検出薬の特徴
○ 利点
・ 単純な方法で短時間で検査結果が分かる
・ 特殊機器が不要(ハンディUVランプのみ)
・ 糖鎖の置換より別のウイルス・毒素に対応可
・ 治療薬、予防薬に比べ少量でよい(>170回/1㎎)
・ 毒性、水に対する溶解度を気にしなくて良い
○ 可能な検査対象(糖鎖との関連あるもの)
・ インフルエンザ、コロナウイルス、エイズウイルス、
ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス・・・
・ コレラ菌、淋菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ肺炎菌、
ネズミチフス菌、ブドウ状球菌、肺炎双球菌、ヘリコバク
ター・ピロリ菌、腸炎ビブリオ・・・
従来検査方法と本方法の比較
検査方法必要機器(価格)
検査の簡便さ
検査所要時間
検出対象 検査費用 検出感度
PCR法×
PCR装置(300万円程)
×熟練が必要
△数時間
◎多数
×数千円
◎102~103個/mL
イムノクロマト法
◎不要
◎誰でも可
○30分
×制限あり
×数千円
○105~107個/mL
培養法
×培養装置(500万円程)
×熟練が必要
×数日以上
◎多数
◎数百円
◎103個/mL
本方法
〇紫外線ランプ
(1万円程)
◎誰でも可
◎5分
〇50以上
◎数百円(予想)
?~1013個/mL(改善可)
知的財産権およびお問い合わせ先
発明の名称 :ウイルス,微生物類の検出方法
出願番号 :特願2008-283976 出願人:国立大学法人埼玉大学
発明者:幡野 健, 松岡浩司, 照沼大陽
--------------------------------------------------------
発明の名称 :発光の色調変化による複数微生物の同時検出方法
出願番号 :特願2010-45452出願人:国立大学法人埼玉大学
発明者:幡野 健, 森 祥太, 佐伯 整, 松岡浩司, 照沼大陽
【お問い合わせ先】埼玉大学 総合研究機構地域オープンイノベーションセンター 知的財産・技術移転推進部門
048-858-9106、 FAX 048-858-9120eメール [email protected]