© Alicia Durocher, 2020

Dynamique de la formation des coprs multilamellaires et de l'enrobage de bactéries par différents protozoaires

Mémoire

Alicia Durocher

Maîtrise en microbiologie - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

Dynamique de la formation des corps multilamellaires et de l’enrobage de bactéries par

différents protozoaires

Mémoire

Alicia Durocher

Sous la direction de :

Steve Charette, directeur de recherche

ii

Résumé

Plusieurs protozoaires, des eucaryotes unicellulaires ubiquitaires, sont des prédateurs de

bactéries. Cependant, les relations bactéries-protozoaires sont complexes et peuvent

donner lieu à des interactions particulières. Certains protozoaires, dont l’amibe sociale

Dictyostelium discoideum, peuvent produire des corps multilamellaires (CML) lorsqu’ils

digèrent des bactéries. Ces structures avaient initialement été identifiées comme des

déchets métaboliques, mais il a été suggéré qu’elles pourraient avoir des rôles

supplémentaires. Ce ne sont pas toutes les bactéries qui sont digérées par tous les

protozoaires, et certaines bactéries résistantes à la digestion peuvent être enrobées dans

les corps fécaux de ces protozoaires. Les corps fécaux partagent des similitudes avec les

CML. Ce projet de maîtrise visait à éclairer certains aspects des interactions bactéries-

protozoaires, en caractérisant la voie phagocytique d’amibes sociales environnementales

afin d’examiner leur production potentielle de CML, et en analysant l’impact de différentes

caractéristiques bactériennes sur la morphologie de l’enrobage par des ciliés. Ces objectifs

furent atteints en cultivant les protozoaires d’intérêt en présence de bactéries digestibles

(pour la production de CML) ou non (pour l’enrobage) et en faisant appel à diverses

méthodes de microscopie. Nos résultats montrent que les quatre isolats d’amibes sociales

environnementales, qui appartiennent tous au genre Dictyostelium, mais qui présentent des

caractéristiques différentes, peuvent produire des CML lorsque cultivés sur bactéries

digestibles. Pour l’étude de la morphologie de l’enrobage de bactéries, les résultats

suggèrent que l’hydrophobicité de surface et la taille de l’espèce bactérienne seraient les

caractéristiques ayant le plus fort impact sur la morphologie des corps fécaux. Toutefois, il

n’est pas exclu que d’autres facteurs interviennent également, incluant des facteurs qui

n’étaient pas à l’étude dans ce projet. Ces résultats approfondissent notre compréhension

des relations bactéries-protozoaires, mais de nombreuses autres questions sont toujours

sans réponse et le développement de méthodes d’analyse plus raffinées sera primordial

pour répondre à ces questions.

iii

Abstract

Many protozoa, ubiquitous unicellular eukaryotes, are predators of bacteria. However,

bacteria-protozoa relationships are complex and can lead to some particular interactions.

Some protozoa, including the social amoeba Dictyostelium discoideum, can produce

multilamellar bodies (MLBs) upon digesting bacteria. These structures were initially

identified as metabolic waste, but it has been suggested that they could have additional

roles. Not all bacteria can be digested by all protozoa, and some digestion-resisting bacteria

can be packaged into the fecal bodies produced by protozoa. These fecal bodies share

similarities with MLBs. This master’s project was meant to shed a light on some aspects of

bacteria-protozoa interactions, by characterizing the phagocytic pathway of some

environmental social amoebae and by analyzing the impact of bacterial characteristics on

the morphology of bacteria packaging. These objectives were met by cultivating the

protozoa species of interest with either digestible bacteria (for MLB production) or

undigestible bacteria (for packaging) and using diverse microscopy methods. Our results

show that the four environmental isolates of social amoebae, belonging to the Dictyostelium

genus but presenting distinct characteristics, can produce MLBs upon growth on digestible

bacteria. As for the study of bacteria packaging morphology, results suggest that a bacteria’s

surface hydrophobicity and cell size are the characteristics impacting packaging morphology

the most. However, it is not excluded that other factors may intervene as well, including

some not considered in this project. These results bring new understanding to bacteria-

protozoa relationships, but many questions remain. The development of more refined

analysis method will be paramount to answering these.

iv

Table des matières

Résumé................................................................................................................................... ii

Abstract ................................................................................................................................... iii

Table des matières ................................................................................................................ iv

Liste des figures..................................................................................................................... vi

Liste des tableaux ..................................................................................................................vii

Liste des abréviations ........................................................................................................... viii

Liste des sigles ...................................................................................................................... ix

Liste des acronymes............................................................................................................... x

Remerciements..................................................................................................................... xiii

Avant-propos ........................................................................................................................ xv

Introduction ............................................................................................................................. 1

Hypothèse et objectifs de recherche ................................................................................ 11

Chapitre 1: Various dictyostelids from the environment can produce multilamellar bodies 13

1.1 Résumé ....................................................................................................................... 13

1.2 Abstract ....................................................................................................................... 13

1.3 Introduction ................................................................................................................. 14

1.4 Materials and methods ............................................................................................... 15

1.5 Results ........................................................................................................................ 18

1.6 Discussion ................................................................................................................... 25

1.7 Conclusion .................................................................................................................. 28

1.8 Bibliography ................................................................................................................ 28

Chapitre 2 Non-pathogenic bacteria packaged by Tetrahymena: study of fecal pellet

morphology and bacterial factors affecting it ....................................................................... 31

2.1 Résumé ....................................................................................................................... 31

2.2 Abstract ....................................................................................................................... 31

2.3 Introduction ................................................................................................................. 32

2.4 Materials and methods ............................................................................................... 33

2.5 Results and discussion ............................................................................................... 34

2.6 Limitations ................................................................................................................... 41

2.7 References .................................................................................................................. 41

2.8 Additional file ............................................................................................................... 43

Discussion générale ............................................................................................................. 48

v

Discussion du chapitre 1 ................................................................................................... 49

Discussion du chapitre 2 ................................................................................................... 51

Conclusion ........................................................................................................................ 55

Bibliographie ......................................................................................................................... 58

Annexe A: Figure S2 ............................................................................................................ 64

vi

Liste des figures

Figure I.1 : La progression de bactéries digestibles ou non au sein de la voie phagocytique des protozoaires..................................................................................................................1

Figure I.2 : Les compartiments de la voie endocytique de D. discoideum...........................2

Figure I.3 : Le cycle de vie des amibes sociales comporte une phase de croissance unicellulaire et une phase de développement multicellulaire...............................................4

Figure I.4 : Des CML produits par l’amibe sociale D. discoideum........................................6

Figure I.5 : Différentes morphologies peuvent être observées lorsque des bactéries sont enrobées..............................................................................................................................8

Figure 1.1 : Growth of the amoeboid isolates on K. aerogenes..........................................19

Figure 1.2 : Multicellular development of the amoeboid isolates.........................................20

Figure 1.3 : Average cell size (µm2) of the amoeboid isolates….........................................21

Figure 1.4 : H36 staining is positive for all of the amoeboid isolates.....................................22

Figure 1.5 : The H36 antibody displays different protein band patterns in the amoeboid isolates................................................................................................................................23

Figure 1.6 : MLBs produced by amoeboid isolates were visible both inside the cells and in the medium..........................................................................................................................24

Figure 2.1 : DIC and DAPI fluorescence microscopy of pellets produced by T. pyriformis........................................................................................................................36

Figure 2.2 : TEM images of bacteria packaging by Tetrahymena......................................37

Figure 2.3 : Bacterial cells are viable in pellets produced by Tetrahymena........................40

Figure S1 : The material surrounding M. luteus pellets in formation is thick and of undefined nature..................................................................................................................................47

Figure S2 : Des inclusions de nature inconnue sont visibles dans le cytoplasme de Cupriavidus sp.....................................................................................................................64

vii

Liste des tableaux

Tableau 1.1 : Sequence identities in 18S rDNA of the isolates and closest relative..............18

Tableau S1 : Amoeba-resistant bacteria packaged by ciliates.............................................45

Tableau S2 : Characteristics of the four bacteria studied....................................................46

viii

Liste des abréviations

et al.: et alii (et les autres personnes)

OD595: densité optique à 595 nm

sp. : species (espèce)

ix

Liste des sigles

ADN/DNA : acide désoxyribonucléique/deoxyribonucleic acid

AMPc : adénosine monophosphate cyclique

ARB : amoeba-resisting bacteria (bactérie résistante aux amibes)

ARN/RNA : acide ribonucléique/ribonucleic acid

ARNr/rRNA : acide ribonucléique ribosomal/ribosomal ribonucleic acid

ATCC: American Type Culture Collection

BMC : BioMed Central

CML/MLB : corps multilamellaire/multilamellar body

DIC : differential interference contrast (contraste interférentiel)

FRQNT: Fonds de recherche du Québec – Nature et technologie

IBIS : Institut de biologie intégrative et des systèmes

PBS : phosphate-buffered saline (tampon phosphate salin)

PCB : plate-count broth (bouillon de dénombrement)

PCR : polymerase chain reaction (réaction de polymérase en chaîne)

PFA : paraformaldéhyde

PP : protéose peptone

PRB : protozoa-resisting bacteria (bactérie résistante aux protozoaires)

rpm : révolutions par minute

SEM : scanning electron microscopy (microscopie électronique à balayage)

SM : standard medium (milieu standard)

SPP : sucre protéose peptone

TEM : transmission electron microscopy (microscopie électronique à transmission)

TSA : trypticase soy agar (gélose trypticase soya)

TSB: trypticase soy broth (bouillon trypticase soya)

UV : ultra-violet

x

Liste des acronymes

CRI : Centre de recherche en infectiologie

DAPI : 4',6-diamidino-2-phénylindole

xi

À mes parents, pour leur support constant.

xii

Time flows in a strange way on a Sunday. Haruki Murakami

xiii

Remerciements

Merci à mes parents d’avoir toujours cru en moi et d’avoir travaillé fort pour me permettre

de poursuivre mon éducation comme je le désirais. Votre support a été crucial à ma réussite

et vous m’avez toujours poussée à creuser plus loin dans mes apprentissages. Je remercie

également ma sœur Florence, qui a toujours su me remonter le moral dans les moments

plus difficiles. J’aimerais également remercier mon parrain Gilles et ma marraine Jackie pour

leur soutien et leurs encouragements.

Merci à Steve d’être un directeur de maîtrise incomparable. Je me considère très chanceuse

d’avoir un chercheur aussi compréhensif, éclairé et ouvert comme directeur. Je suis très

heureuse d’avoir pu reprendre le flambeau du projet enrobage/CML et je te suis très

reconnaissante de m’avoir sélectionnée pour ça.

Je remercie les membres de mon comité d’encadrement, Caroline Duchaine et Sébastien

Faucher, pour leurs judicieux conseils tout au long de mon parcours de maîtrise. Je suis

très honorée que vous ayez accepté de m’accorder votre temps et j’espère bien que ce

présent document vous satisfera!

Un gros merci à tous les membres du labo Charette que j’ai côtoyés au cours de mon

baccalauréat et de ma maîtrise : Katherine, Marie-Stéphanie, Antony, Sabrina, Alex,

Perrine, Marie-Ange, Nava, Pierre-Étienne, Gabrielle, William et tous les autres. Le labo

Charette a une ambiance de travail incroyable et c’est grâce à vous tous. Un merci tout

spécial à mes co-autrices : Alix, qui m’a montré pas mal tout ce que je sais faire au labo,

Cynthia, qui est toujours d’une grande aide ainsi qu’une voisine de bureau très agréable, et

Valérie, qui répond patiemment à mes mille et une questions pas toujours pertinentes, qui

supporte mes questionnements existentiels et qui m’a offert son soutien constant tout au

long de ma maîtrise.

Merci au FRQNT de m’avoir accordé une bourse de maîtrise et d’avoir permis le

financement de ce projet.

Merci à la plateforme de microscopie de l’IBIS pour leur assistance, particulièrement en

microscopie électronique. Merci également à la plateforme de microscopie du CRI pour leur

aide généreuse!

xiv

Finalement, un énorme merci à mon amoureux, François, de m’avoir endurée tout au long

de ma maîtrise et d’avoir su gérer mon stress quand j’en étais incapable. Merci pour toutes

les fois où tu es venu m’ouvrir la porte des tunnels la fin de semaine et pour tous les allongés

que tu m’as faits. Merci d’avoir écouté toutes mes présentations et de m’avoir convaincue

que j’étais capable de parler en public. Merci d’avoir vu mon potentiel quand je ne le pouvais

pas. Je t’adore et ma maîtrise aurait clairement été beaucoup plus laborieuse sans ta

présence à mes côtés.

xv

Avant-propos

Le chapitre 1 est constitué de l’article « Various dictyostelids from the environment can

produce multilamellar bodies », publié en ligne le 31 juillet 2020 au Canadian Journal of

Microbiology (https://doi.org/10.1139/cjm-2020-0187). Cet article a pour auteurs Alicia F.

Durocher, Cynthia Gagné-Thivierge et Steve J. Charette. J’ai participé à cette publication à

titre de première auteure. J’ai rédigé l’article, créé les figures, sauf les figures 1 et 3 créées

par Cynthia Gagné-Thivierge et la figure 5 créée par Steve Charette, et réalisé toutes les

manipulations présentées à l’exception de l’amplification PCR et du séquençage du gène

de l’ARNr 18S des amibes environnementales, réalisés par Cynthia Gagné-Thivierge, et de

l’immunobuvardage au H36, réalisé par Cynthia Gagné-Thivierge et Steve Charette. J’ai

participé à la conception des expérimentations et à l’analyse des résultats avec les autres

coauteurs. Les numéros des figures et tableaux ont été ajustés par rapport à l’article original

pour leur intégration à ce mémoire.

Le chapitre 2 est constitué de l’article « Non-pathogenic bacteria packaged by Tetrahymena:

study of fecal pellet morphology and bacterial factors affecting it », soumis sous cette forme

le 2 mars 2020 à BMC Research Notes. Puisque la publication de l’article n’a pas été

approuvée sous cette forme, il sera soumis après édition dans un autre journal en temps

opportun. Cet article a pour auteurs Alicia F. Durocher, Alix M. Denoncourt, Valérie E.

Paquet et Steve J. Charette. J’ai participé à cette publication à titre de première auteure.

J’ai rédigé l’article, créé les figures et réalisé toutes les manipulations présentées. J’ai

participé à la conception des expérimentations et à l’analyse des résultats avec les autres

coauteurs. Les numéros des figures ont été ajustés par rapport à l’article original pour leur

intégration à ce mémoire.

1

Introduction

Les protozoaires sont des organismes eucaryotes unicellulaires ubiquitaires et retrouvés

dans des environnements variés, tant naturels que créés par l’Humain (Barker et Brown,

1994). Une grande part d’entre eux sont des prédateurs des bactéries, mais d’autres

groupes trophiques sont possibles. Le groupe des protozoaires est plutôt fonctionnel que

réellement valable d’un point de vue évolutif ou phylogénétique, puisque les organismes

regroupés sous l’appellation « protozoaires » forment un groupe hétéroclite comprenant une

grande diversité de morphologies, de tailles, d’habitats et de modes de vie (Fenchel, 1987).

Ils sont grossièrement classés en quatre groupes selon leur mode de locomotion, soient les

amibes, qui utilisent des pseudopodes; les ciliés, qui se déplacent à l’aide de cils motiles;

les flagellés, qui utilisent des flagelles; et les apicomplexés, qui sont des parasites

obligatoires non motiles. Dans le cadre de mon projet de maîtrise, deux groupes m’étaient

d’un intérêt particulier, les amibes sociales, qui font partie du groupe des amibes, et les

ciliés.

Figure I.1 : La progression de bactéries digestibles ou non au sein de la voie

phagocytique des protozoaires. Lorsque des bactéries digestibles (B. Dig,) ou

pathogènes/non-digestibles (B. Pat.) sont ingérées, elles se retrouvent d’abord dans les

phagosomes du protozoaire, qui fusionnent ensuite avec les lysosomes afin de digérer les

particules phagocytées. Le phagosome/lysosome tardif contient de potentiels restes non

digérés, qui seront ensuite exocytosés sous forme de vésicule (VEs), comme des CML ou

des bactéries enrobées. Image fournie par et reproduite avec la permission de Steve

Charette.

2

La phagocytose est l’ingestion de particules, par exemple des bactéries, par une cellule

eucaryote. Outre les cellules immunitaires des organismes multicellulaires, certains

protozoaires, dont les amibes et les ciliés, sont également capables de phagocytose et

peuvent s’en servir pour se nourrir. La voie phagocytique des protozoaires peut mener à la

digestion de la particule ingérée ou à son exocytose si non digestible (Fenchel, 1987). Les

vacuoles digestives progressent dans la voie phagocytique en traversant différents stades :

la coupe phagocytique se referme après la captation d’une particule pour former un

phagosome, les phagosomes initiaux rencontrent des lysosomes, responsables de

l’acidification de la vacuole, pour former des phagolysosomes, qui deviennent ensuite des

phagosomes tardifs, contenant les restes indigestes qui seront éjectés (Kessin, 2001). La

figure I.1 illustre la progression de bactéries digestibles ou non dans la voie phagocytique

d’un protozoaire. Plusieurs protéines sont impliquées dans la voie phagocytique et

l’utilisation d’anticorps produits contre celles-ci permet l’étude de la phagocytose, de la

digestion et de phénomènes connexes comme la production de corps multilamellaires ou

l’enrobage de bactéries (Mercanti et al., 2006). La figure I.2 présente certaines des protéines

de l’amibe Dictyostelium discoideum détectées par des anticorps, dont l’anticorps H36 qui

a été utilisé dans cette étude.

3

Figure I.2 (page précédente). Les compartiments de la voie endocytique de D.

discoideum. Des cellules ont été cultivées en milieu liquide avant d’être traitées en

immunofluorescence et observées en microscopie confocale. A) Protéine associée à

l’anticorps H36 (rouge), protéine p80 (vert) et protéine Rh-50 (bleu). B) Les protéines H+-

ATPase (rouge), p80 (vert) et Rh-50 (bleu). Dans le panneau A, on peut distinguer la

membrane plasmique en rouge, les lysosomes et post-lysosomes en vert et la vacuole

contractile en bleu. Dans le panneau B, les post-lysosomes (astérisques) peuvent être

distingués des lysosomes grâce à l’absence de H+-ATPase. Cette dernière est aussi

présente dans la vacuole contractile. Échelle: 5 µm. Image fournie par et reproduite avec la

permission de Steve Charette.

Les amibes sociales, parmi lesquelles on retrouve le genre Dictyostelium qui est

particulièrement étudié, se déplacent à l’aide de pseudopodes et se nourrissent

principalement de bactéries dans la nature, malgré que certaines souches de laboratoire

soient capables de croissance axénique. Ces organismes sont, entre autres, retrouvés sur

le sol forestier, dans des endroits humides. La distinction principale des amibes sociales par

rapport au reste des amibes est leur cycle de vie particulier, marqué par une phase de

développement multicellulaire. En conditions de croissance avantageuses, les amibes

sociales croissent de façon unicellulaire. Lors de périodes de famine, les cellules s’agrègent

en amas multicellulaire pour éventuellement former une structure appelée corps fructifère,

tel que montré dans la figure I.3, composée d’une tige constituée de cellules s’étant

sacrifiées et d’une tête contenant des spores prêtes à être dispersées par l’eau ou des

animaux afin de rejoindre un environnement plus favorable (Bonner, 1982; Smith et al.,

2014). 20% des cellules de la population formeront la tige du corps fructifère, tandis que les

cellules restantes deviendront des spores. Chez Dictyostelium, l’agrégation a lieu grâce à

l’AMPc, qui contrôle la chimiotaxie (Kessin, 2001). La formation de corps fructifères illustre

bien la complexité du développement multicellulaire chez les amibes sociales, car il

demande un haut niveau de coopération entre les cellules et peut mener à des phénomènes

inattendus, comme l’altruisme, car 20% des cellules se sacrifient pour former la tige du corps

fructifère; la tricherie, où certaines cellules destinées à mourir pour former la tige rejoignent

plutôt les cellules de la spore; ou même de l’agriculture primitive, observée lorsque des

amibes sociales emportent certaines souches bactériennes avec elles dans la spore (Brock

et al., 2011; Strassmann et al., 2000). Des stratégies de résistance aux tricheurs sont même

apparues (Khare et al., 2009). Il transparaît donc que les interactions entre amibes sociales

4

sont vastes et que plusieurs aspects de ces interactions sont encore potentiellement

inconnus.

Figure I.3 : Le cycle de vie des amibes sociales comporte une phase de

croissance unicellulaire et une phase de développement multicellulaire. Une

fois agrégée, les cellules d’amibes sociales vont progressivement culminer pour former un

corps fructifère permettant la dispersion des spores. Cette figure a été modifiée (traduction)

à partir de celle produite par Tijmen Stam, IIVQ (conversion SVG) et user:Hideshi (version

originale) - en:Image:Dicty Life Cycle H01.png, CC BY-SA 3.0,

https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=1782175.

Contrairement aux amibes qui doivent se déformer pour bouger, les ciliés se déplacent à

l’aide de courts cils et ont une structure cellulaire fixe, incluant une ouverture analogue à

une bouche désignée « cytostome », permettant l’ingestion de particules et de liquide. La

phagocytose a exclusivement lieu à cet endroit, alors que les amibes peuvent phagocyter

une particule à partir de n’importe quel endroit de la membrane cellulaire (Fenchel, 1987).

Les ciliés sont sensibles à la concentration de bactéries dans leur environnement et ne

peuvent se nourrir de bactéries que dans des environnements où celles-ci sont concentrées

(Fenchel, 1980; Iriberri et al., 1994). Parmi ce groupe, on retrouve le genre Tetrahymena,

5

qui est capable d’un haut taux d’ingestion, soit près de 100% de son volume par heure,

comme d’autres ciliés (Fenchel, 1987; Iriberri et al., 1995). Ce genre est donc

particulièrement intéressant pour étudier le processus de phagocytose. Tetrahymena

s’alimente par filtration (filter-feeding) et ses vacuoles alimentaires transitent au travers de

la cellule assez rapidement, en 25 minutes chez T. pyriformis (Thurman et al., 2010). Des

mutants axéniques se nourrissant par macropinocytose sont également disponibles pour la

recherche (Cassidy-Hanley, 2012; Curds et Cockburn, 1968). Dans la nature, le genre

Tetrahymena est associé aux écosystèmes d’eau douce (Fenchel 1987).

Les corps multilamellaires (CML) sont des structures produites par de nombreux types de

cellules eucaryotes, qui serviraient au stockage et à la sécrétion de lipides (Schmitz et

Müller, 1991). Ils sont semblables à des sphères concentriques de membrane, à l’image

des couches d’un oignon, et sont habituellement de forme ronde, tel que montré à la figure

I.4. Chez les protozoaires, leur production a été observée chez des amibes libres et des

ciliés (Berk et al., 2008; Chekabab et al., 2012), ainsi que chez plusieurs souches de l’amibe

sociale Dictyostelium discoideum, principalement chez des souches de laboratoire

axéniques (Barondes et al., 1985; Cooper et al., 1986; Emslie et al., 1998; Fukuzawa et

Ochiai, 1993; Gezelius, 1959; Gezelius, 1961; Hohl, 1965; Marchetti et al., 2004; Mercer et

Shaffer, 1960).

Des structures similaires aux CML produits par D. discoideum sont présentes chez d’autres

organismes, dont les humains. La fonction normale des CML chez l’humain est le transport

de lipides spécialisés vers des sites spécifiques. Par exemple, ils permettent le maintien

d’un film de dipalmytoilphosphatidylcholine à la surface des poumons, assurant leur bon

fonctionnement. À l’inverse, ils peuvent aussi être impliqués dans certaines pathologies,

comme le syndrome de détresse respiratoire, causé par des pneumocytes incapables de

sécréter des corps multilamellaires et qui représente une cause importante de mortalité chez

les prématurés; le psoriasis, où la sécrétion de corps lamellaires est restreinte chez les

cellules de la peau en hyperprolifération; et la maladie de Niemann-Pick, où une

accumulation de corps multilamellaires résulte en l’accumulation de sphingomyéline dans

les lysosomes (Schmitz et Müller, 1991).

6

Figure I.4 : Des CML produits par l’amibe sociale D. discoideum. Les CML ont

une apparence caractéristique, montrant qu’ils sont composés de multiples couches de

membranes concentriques. Image adaptée de Paquet et al., 2013.

Les CML ont une composition particulière en protéines et en lipides qui fournit certains

renseignements quant à leur origine et leur possible fonction. Chez D. discoideum, une

comparaison du profil lipidique des CML, qui sont riches en lipides neutres et en

phospholipides, principalement la phosphatidyléthanolamine et la phosphatidylcholine, avec

ceux de l’amibe les ayant produits et de la bactérie que l’amibe avait consommée a montré

que les CML avaient un profil lipidique plus proche de celui des amibes (Paquet et al., 2013).

Cela suggère que les CML seraient directement/principalement issus du métabolisme de

l’amibe les produisant, plutôt que d’être composés des restes des bactéries qui auraient été

digérées. Diverses protéines ont également été identifiées comme étant associées aux

CML. On retrouve, entre autres, la discoïdine, une lectine endogène impliquée dans

l’adhésion aux substrats extracellulaires; PhoPQ, une protéine hypothétique similaire à

AprA, un répresseur de prolifération sécrété par les cellules de D. discoideum lorsqu’elles

sont en croissance; et SctA, une protéine sécrétée associée aux pycnosomes, des

structures membraneuses produites par D. discoideum (Barondes et al., 1985; Brock et

Gomer, 2005; Denoncourt et al., 2016; Sabra et al., 2016).

Bien qu’initialement identifiés comme des déchets métaboliques (Gezelius, 1959; Hohl,

1965), il est de plus en plus considéré que la formation de CML représente une trop grande

dépense énergétique pour être un simple mode d’évacuation des restes de la phagocytose.

7

Des rôles alternatifs ont été proposés pour les CML, dont celui de réserve de nourriture ou

encore de mode de communication intercellulaire. Il a été observé que lorsque des amibes

naïves D. discoideum DH1-10 étaient exposées aux CML produits par des amibes nourries

avec Klebsiella aerogenes, les amibes naïves ingèrent les CML et ceux-ci semblent être

dégradés (Denoncourt et al., 2017a) suggérant au minimum un rôle de source d’énergie

pour les CML des amibes sociales. Les protéines associées aux CML évoquent aussi une

implication de ces structures dans la communication intercellulaire. La protéine PhoPQ est

particulièrement intéressante pour cette théorie, étant l’analogue de AprA. Chez

D. discoideum, AprA est sécrétée par les cellules en croissance et réprime la prolifération;

cependant, seules les cellules végétatives sont sensibles à l’action chimiorépulsive d’AprA :

la protéine n’a pas d’effet sur les cellules affamées (starved) (Brock et Gomer, 2005; Phillips

et Gomer, 2012). Ainsi, les CML pourraient être impliqués dans la réponse à la famine chez

Dictyostelium et permettre la coordination de l’agrégation des cellules pour la formation des

corps fructifères.

Certaines bactéries sont capables de résister à la phagocytose par les protozoaires.

Certaines vont user de mécanismes pour éviter d’être ingérées, comme une taille

augmentée, une haute vitesse de déplacement ou le camouflage de leurs traits de surface,

entre autres, tandis que d’autres vont être ingérées, mais résisteront à la digestion, seront

capables de se multiplier dans le protozoaire ou produiront des toxines intracellulaires (Matz

et Kjelleberg, 2005). Certaines espèces pathogènes vont infecter la cellule et causer sa

mort, leur permettant de s’échapper. D’autres vont coloniser la cellule, comme

Legionella pneumophila, une bactérie pathogène intracellulaire qui utilise les amibes

comme habitat, menant à sa propagation et parfois à des infections chez les humains (Abu

Kwaik et al., 1998).

La phagocytose pose un stress sur les communautés bactériennes et a donc une influence

sur les caractéristiques de ces communautés (Jürgens et Matz, 2002). Différentes méthodes

peuvent être utilisées par les bactéries pour résister à la phagocytose. La taille d’une

bactérie joue un rôle important dans l’ingestion, car certains protozoaires, par exemple les

ciliés, sont sensibles à la taille des particules ingérées (Fenchel, 1980). Ainsi, certaines

bactéries vont avoir tendance à produire des cellules filamenteuses lorsqu’elles croissent

en présence de protozoaires (Matz et Kjelleberg, 2005). L’agrégation de cellules

bactériennes en microcolonies ou en biofilms peut également être avantageuse pour les

bactéries soumises au stress de prédation.

8

Figure I.5 : Différentes morphologies peuvent être observées lorsque des

bactéries sont enrobées. Lorsque la bactérie L. pneumophila est enrobée par le cilié

Tetrahymena tropicalis, les vésicules contenant les bactéries présentent diverses

morphologies (A). Celles-ci peuvent contenir plus (B) ou moins (C) de membrane entre les

cellules bactériennes, voire très peu (D). Figure tirée de Berk et al., 2008.

L’enrobage de bactéries est un phénomène observé lorsque des bactéries ayan t résisté à

la digestion suite à leur phagocytose par un protozoaire sont expulsées dans les corps

fécaux produits par cet eucaryote (Denoncourt et al., 2014). La structure formée est

constituée d’un agrégat de cellules bactériennes au centre, entouré d’une ou plusieurs

couches de membrane, tel que montré à la figure I.5. Ces couches de membranes

retiennent les cellules bactériennes ensemble, mais offrent également une protection très

9

avantageuse pour celles-ci. Éventuellement, lorsque les bactéries recommencent à se

diviser, la membrane est rompue et les bactéries retrouvent leur forme libre (Gourabathini

et al., 2008).

Les avantages de l’enrobage pour les bactéries sont nombreux. Il a été observé que

l’enrobage peut procurer aux bactéries une résistance à la gentamicine, à certains produits

chlorés, à un pH faible, à des cycles de gel-dégel, à la sonication, à la dessiccation et aux

rayons UV (Berk et al., 1998; Berk et al., 2008; Brandl et al., 2005; Espinoza-Vergara et al.,

2019; Gourabathini et al., 2008; Koubar et al., 2011; Raghu Nadhanan et Thomas, 2014).

De plus, l’enrobage peut favoriser la survie à long terme en conditions de famine, dans

certains cas jusqu’à 6 mois (Espinoza-Vergara et al., 2019; Koubar et al., 2011). Certaines

espèces pathogènes sont également plus virulentes après avoir été éjectées de l’enrobage

(Espinoza-Vergara et al., 2019; Faulkner et al., 2008).

Parmi les bactéries ayant déjà été identifiées comme capables d’être enrobées, on retrouve

principalement des espèces pathogènes, incluant L. pneumophila, Vibrio cholerae, Listeria

monocytogenes, Salmonella enterica, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni ainsi que

Escherichia coli O157:H7 (Berk et al., 1998; Berk et al., 2008; Brandl et al., 2005; Espinoza-

Vergara et al., 2019; Gourabathini et al., 2008; Marciano-Cabral et Cabral, 2003; Raghu

Nadhanan et Thomas, 2014; Smith et al., 2012; Trigui et al., 2016). Pour certaines de ces

bactéries, les mécanismes spécifiques nécessaires à l’enrobage ont été identifiés. Chez L.

pneumophila, le système Dot/Icm est essentiel pour la résistance à la digestion et

l’enrobage, tandis que chez V. cholerae, le gène ompU codant pour une protéine de la

membrane externe est indispensable pour survivre à la digestion (Berk et al., 2008;

Espinoza-Vergara et al., 2019). Chez E. coli, aucun facteur précis permettant l’enrobage n’a

été identifié, mais l’enrobage semble être lié à la virulence, étant donné que des souches

non virulentes d’E. coli sont facilement digérées par Tetrahymena, tandis que des souches

pathogènes diarrhéagéniques sont enrobées par ce cilié (Berk et al., 2008; Smith et al.,

2012). Cependant, même si peu d’études se sont penchées sur l’enrobage chez les

bactéries non pathogènes, certaines d’entre elles ont pu être identifiées comme pouvant

être enrobées. Parmi celles-ci, on retrouve Mycobacterium smegmatis, une mycobactérie

faisant partie de la flore humaine normale et généralement considérée non virulente, qui

peut être enrobée par T. pyriformis (Denoncourt et al., 2017b). Il a également été montré

que l’amibe sociale D. discoideum pouvait enrober des souches appartenant aux genres

Microcococcus, Cupriavidus, Rathayibacter et Microbacterium, toutes non pathogènes

10

(Paquet et Charette, 2016). Malgré ces développements, aucune étude extensive de

l’enrobage de bactéries non pathogènes par des ciliés n’a été conduite jusqu’à maintenant.

L’enrobage représente également des avantages potentiels dans un contexte d’infections,

particulièrement pour les infections respiratoires et gastro-intestinales. En effet, une

protection contre divers types de stress est procurée aux bactéries par l’enrobage, dont

certains types associés à la propagation des bactéries pathogènes. Une résistance contre

la dessiccation et les rayons UV pourrait avantager des bactéries en contexte

d’aérosolisation, qui est une voie de propagation possible pour certains agents pathogènes

respiratoires, par exemple Mycobacterium tuberculosis et L. pneumophila (Muder et al.,

1986; Riley, 1957). De plus, l’enrobage réunit plusieurs cellules bactériennes en une seule

particule, habituellement d’un diamètre qualifié de respirable (<10 µm), ce qui pourrait

également faciliter la propagation d’infections respiratoires (Berk et al., 1998; Macher, 1999;

Nicas et Sun, 2006). Il a également été souligné qu’une résistance accrue aux pH faibles

pourrait protéger les bactéries enrobées contre l’acide gastrique et permettre l’apparition

d’infections gastro-intestinales plus aisément (Espinoza-Vergara et al., 2019). Cependant,

aucun cas d’infection humaine associé à l’enrobage de bactéries n’a été reporté jusqu’à

présent, mais il serait difficile d’identifier une telle infection avec les moyens disponibles pour

le moment.

Différentes morphologies d’enrobage sont possibles. Les bactéries enrobées peuvent être

entourées de plusieurs couches de membrane, d’une seule couche, de fragments ou même

ne pas être recouvertes de membrane dans certains cas (figure I.5) (Berk et al., 2008).

L’analyse de l’enrobage en microscopie électronique à balayage (SEM) a révélé dans

certains cas que le matériel membraneux retenant les cellules était similaire à un filet ou

une toile (Denoncourt et al., 2017b; Smith et al., 2012). Il n’a pas encore été déterminé quels

facteurs influencent cette morphologie, mais il a été observé que des différences étaient

présentes selon le protozoaire et la bactérie impliqués dans l’enrobage. Par exemple, la

même bactérie enrobée par deux protozoaires différents ne produira pas nécessairement la

même morphologie d’enrobage. Si on compare l’enrobage de L. pneumophila par une

amibe comme Acanthamoeba castellanii à celui produit par un cilié comme Tetrahymena

tropicalis, on observe que l’enrobage par A. castellanii est abondant en membranes et que

seules quelques bactéries sont enrobées, tandis qu’avec T. tropicalis il y a beaucoup moins

de membrane, mais beaucoup plus de bactéries (Berk et al., 1998; Berk et al., 2008). À

l’inverse, le même protozoaire ne produira pas forcément la même morphologie d’enrobage

11

avec toutes les bactéries qu’il enrobe. Quand Campylobacter jejuni est enrobé par

T. pyriformis, une bonne quantité de membrane est présente autour de l’amas de cellules;

avec Mycobacterium smegmatis, l’enrobage ne produit qu’une mince couche de membrane

(Denoncourt et al., 2017b; Trigui et al., 2016).

L’enrobage de bactéries illustre la complexité des relations bactéries-protozoaires, car c’est

une interaction extrêmement spécifique. Différentes souches de la même espèce ne seront

pas nécessairement toutes enrobées au même degré, tel que montré par Espinoza-Vergara

et collaborateurs avec quatre souches de Vibrio cholerae (Espinoza-Vergara et al., 2019).

Des souches de la même espèce ne sont même pas toujours toutes enrobées, comme c’est

le cas pour E. coli, dont les souches pathogènes sont souvent enrobées, contrairement aux

souches non pathogènes qui sont digérées plus efficacement (Berk et al., 2008; Smith et

al., 2012). Également, une bactérie enrobée par un protozoaire en particulier ne sera pas

nécessairement enrobée par tous les protozoaires, pas même par ceux similaires à celui

qui l’a enrobé (Espinoza-Vergara et al., 2019).

Hypothèse et objectifs de recherche

L’hypothèse de recherche guidant ce projet de maîtrise était que la production de CML et

de bactéries enrobées serait un phénomène répandu chez les protozoaires, possible avec

différentes bactéries. La recherche sur la production de CML chez les amibes sociales s’est

jusqu’à maintenant limitée à l’espèce D. discoideum et généralement à des souches de

laboratoire capables de croissance axénique. Bien que des hypothèses intéressantes aient

été émises quant au rôle des CML de Dictyostelium, leur production pourrait être un artéfact

de laboratoire. Il serait important de montrer que la production de ces structures est possible

avec d’autres espèces d’amibes sociales pour solidifier ces hypothèses. L’enrobage de

bactéries a jusqu’à maintenant été principalement étudié avec des souches bactériennes

pathogènes. Cependant, il a été montré que la pathogénicité n’est pas nécessaire à la

résistance à la digestion et que les lacunes de la voie phagocytique permettraient à

certaines bactéries d’éviter la digestion (Thurman et al., 2010). De plus, l’enrobage de

bactéries non pathogènes a été démontré possible avec D. discoideum (Paquet et Charette,

2016), mais aucune étude ne s’est penchée sur la question de façon exhaustive avec les

ciliés.

Pour répondre à cette hypothèse de recherche, deux objectifs spécifiques étaient visés.

Ceux-ci étaient :

12

A. Caractériser la voie phagocytique d’amibes sociales isolées de l’environnement.

B. Observer la morphologie des bactéries enrobées produites par deux protozoaires de

types ciliés du genre Tetrahymena lorsque mis en co-culture avec 4 bactéries aux

caractéristiques différentes (forme et taille de la cellule, résultat du test de Gram,

hydrophobicité de surface).

L’objectif A vise à comparer les caractéristiques de la voie phagocytique d’amibes sociales

issues de l’environnement, non axéniques, à celle de D. discoideum DH1-10, une souche

axénique bien caractérisée et déjà identifiée comme étant productrice de CML (Paquet et

al., 2013). Il était attendu que certaines de ces souches produisent également des CML, ce

qui aiderait à solidifier les théories selon lesquelles les CML auraient un rôle particulier chez

les amibes sociales, tel que décrit par Denoncourt et al., 2017a.

L’objectif B vise à éclaircir les facteurs contrôlant la morphologie de l’enrobage de bactéries.

Les caractéristiques à l’étude ont été sélectionnées pour leur potentiel à influencer

l’enrobage : la taille et la forme de la cellule sont soupçonnées de déterminer de quelle façon

les cellules peuvent être disposées dans la vacuole alimentaire des ciliés et éventuellement

dans la structure excrétée; la composition de la paroi bactérienne pourrait influencer la

quantité de membrane présente autour des cellules, car l’origine de cette membrane est

pour le moment inconnue, bien qu’il ait été proposé que des cellules déjà mortes avant

l’ingestion pourraient être la source de cette membrane (Berk et al., 2008); et

l’hydrophobicité a déjà été identifiée comme importante pour la résistance à la digestion en

général, mais l’effet de cette caractéristique sur l’enrobage est toujours inconnu (Siegmund

et al., 2018).

13

Chapitre 1: Various dictyostelids from the environment

can produce multilamellar bodies

Alicia F. Durocher1,2,3, Cynthia Gagné-Thivierge1,2,3 and Steve J. Charette1,2,3*

1. Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes, Pavillon Charles-Eugène-Marchand,

Université Laval, Québec, QC, Canada

2. Centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de

Québec, Université Laval, Québec, QC, Canada

3. Département de biochimie, de microbiologie et de bio-informatique, Faculté des sciences

et de génie, Université Laval, Québec, QC, Canada

1.1 Résumé

Les corps multilamellaires (CML), des structures composées de couches membranaires

concentriques, sont produits par divers protozoaires incluant certains ciliés, amibes libres et

amibes sociales. Il fut initialement supposé que les CML de l’amibe sociale

Dictyostelium discoideum soient des déchets, mais des rôles en communication

intercellulaire ou comme réserves de nourriture ont été proposés. Parmi les dictyostélides,

ce phénomène a seulement été observé chez D. discoideum, principalement avec des

souches de laboratoire, habituellement en culture axénique. Il fut supposé que d’autres

amibes sociales puissent produire des CML. Quatre isolats d’amibes sociales

environnementales ont été caractérisés. Toutes les souches, appartenant au genre

Dictyostelium, produisaient des CML similaires à ceux d’une souche de laboratoire de

D. dictyostelium, selon nos analyses en microscopie (épifluorescence et TEM).

Conséquemment, des CML pourraient être produits par des dictyostélides variés,

semblablement aux souches de laboratoire, supportant un rôle des CML dans le cycle de

vie de ces amibes.

1.2 Abstract

Multilamellar bodies (MLBs), structures composed of concentric membrane layers, are

known to be produced by different protozoa including species of ciliates, free-living amoebae

and Dictyostelium discoideum social amoebae. Initially believed to be metabolic waste,

potential roles like cell communication and food storage have been suggested for

D. discoideum MLBs, which could be useful for the multicellular development of social

amoebae and as a food source. However, among dictyostelids, this phenomenon has only

14

been observed with D. discoideum, and mainly with laboratory strains usually grown in

axenic conditions. It was thought that other social amoebae may also be able to produce

MLBs. Four environmental social amoeba isolates were characterized. All strains belong to

the Dictyostelium genus including some likely to be Dictyostelium giganteum. They have

distinctive phenotypes comprising their growth rate on Klebsiella aerogenes lawns and the

morphology of their fruiting bodies. They all produce MLBs similar to those produced by a

D. discoideum laboratory strain when grown on K. aerogenes lawns, as revealed by analysis

using the H36 antibody in epifluorescence microscopy as well as by transmission electron

microscopy. Consequently, this study shows that MLBs are produced by various dictyostelid

species, which further supports a role for MLBs in the lifestyle of amoebae.

1.3 Introduction

Multilamellar bodies (MLBs) are composed of concentric lipid membrane layers. They are

involved in lipid storage and secretion in many eukaryotic cells (Schmitz and Müller, 1991).

MLBs can be produced as part of the phagocytosis process and secreted by D. discoideum

social amoebae upon feeding on digestible bacteria (Paquet et al., 2013).

In starvation conditions, such as when preys become inaccessible, D. discoideum enters a

multicellular phase beginning with aggregation of the cells to form a migrating slug, leading

to the creation of spore-containing fruiting bodies to withstand long-term starvation (Kessin,

2001). MLB production is mostly observed during the unicellular vegetative state, although

MLBs can also be produced by aggregating cells (Hohl, 1965). Different MLB morphologies

are possible depending, among others, on the density of membrane layers or the type of

bacteria phagocytosed by D. discoideum cells (Denoncourt et al., 2014; Hohl, 1965; Paquet

et al., 2013).

While MLBs were originally considered to be metabolic waste, it was noted that the formation

of MLBs represents a cost for the cell that seems too large for simple waste evacuation.

Biochemical analyses of both lipids and proteins found in these structures as well as

functional analyses of D. discoideum MLBs were performed using, among others, the H36

antibody which binds to proteins on the MLBs. These analyses suggested additional roles

for MLBs, including extracellular nutrient storage and a potential intermediary in

communication between cells (Denoncourt et al., 2016; Denoncourt et al., 2017a; Paquet et

al., 2013). Lipid analysis in particular showed that MLB lipids were mostly of amoeboid origin,

15

suggesting that although bacteria are necessary for MLB production, the process could be

controlled by amoebae.

MLB production has been observed in a few protozoa so far, including free-living amoeba

such as Acanthamoeba and ciliates including Tetrahymena (Berk et al., 2008; Chekabab et

al., 2012). In the case of the dictyostelid group, MLBs have only been observed with strains

of the D. discoideum species (Barondes et al., 1985; Cooper et al., 1986; Emslie et al., 1998;

Fukuzawa and Ochiai, 1993; Gezelius, 1959; Gezelius, 1961; Hohl, 1965; Marchetti et al.,

2004; Mercer and Shaffer, 1960). Considering that some of these strains were severely

modified at the phenotypic level to stand axenic growth, it cannot be excluded that MLB

production by dictyostelids could be a laboratory artifact without the observation of the same

phenomenon with amoebae retrieved from the environment and from species other than

D. discoideum. Observing MLB production with different environmental strains would

strengthen current theories about their additional roles.

It was hypothesized that environmental dictyostelids can produce MLBs as well as

D. discoideum laboratory strains, as the possible roles suggested for these structures would

be useful to wild strains of social amoebae (Denoncourt et al., 2016; Denoncourt et al.,

2017a). Intercellular communication is essential to coordinating multicellular development,

and a role as food storage could be beneficial in starvation periods. This study aimed to

characterize the phagocytic pathway of environmental social amoebae and compare it to

that of D. discoideum DH1-10, a common laboratory strain (Cornillon et al., 2000). All

environmental isolates, from various dictyostelid species, were found to produce MLBs

similar to the laboratory strain.

1.4 Materials and methods

Isolation of social amoebae. Samples of soil from temperate deciduous forest ground were

taken from different places in Quebec City, Canada. Soil samples were serially diluted in

water (1/10, 1/100 and 1/1000). A volume of 150 µl of each dilution was mixed with a volume

of 150 µl of Klebsiella aerogoenes bacteria grown overnight and plated on 10-cm diameter

Petri dish containing SM medium (10 g/L bacteriological peptone, 1 g/L yeast extract, 2.2

g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 1 g/L MgSO4, 20 g/L agar, 1% glucose), followed by incubation

at room temperature. K. aerogenes bacteria were generously gifted by Pierre Cosson

(Benghezal et al., 2006). After 4 to 5 days of incubation, a part of the biomass from the

border of phagocytic plaques displaying fruiting bodies was sampled using a micropipette

16

tip and inoculated on the center of an SM medium Petri dish containing fresh bacterial lawns.

12 isolates were obtained using this method.

Amoeba strains. 4 strains (JLJV2, E1, E2 and 3.2-2) displaying various phenotypes of

fruiting bodies and speed of growth on bacterial lawn were selected from the 12 initially

isolated upon confirming that they could be serially cultivated on bacterial lawns and kept

frozen at -70°C.

18S identification. PCR amplification of 18S rRNA gene was conducted using primers Euk-

4/18-F (5’-CTGGTTGATYCTGCCAGT-3’) (Hendriks et al., 1989) and EukR (5’-

TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3’) (Medlin et al., 1988). For JLJV2 and 3.2-2,

Accustart II polymerase (Quantabio, USA) was used for PCR amplification while E1 and E2

were amplified with GoTaq polymerase (Promega, USA). Hybridization was conducted at

55 °C or 60 °C. PCR products were sequenced using Sanger technology (ABI3730xl DNA

analyser). Sequences obtained were analyzed with BLAST to allow identification of the

amoeba strains, along with comparison of the percent identity between isolates (Altschul et

al., 1990).

Characteristics of environmental amoebae growth on bacterial lawn. For each amoeba

strain, 40 cells suspended in HL5 medium were plated on a 15-cm Petri dish of SM agar

along with 300 µl of a K. aerogenes suspension at an optical density at 595 nm of 2. Two

plates were prepared per isolate and were incubated in the dark at room temperature. The

growth rate of 10 phagocytic plaques of each isolate was measured over the course of a

week at least once a day, or more as necessary, judging from the rate of growth of the

plaques. Appearance of fruiting bodies was also evaluated at the end of the incubation using

a Motic SMZ-168 series stereomicroscope equipped with a Moticam Pro 252A camera

(Motic, Canada). Additional pictures were taken with an iPhone 6S through the

stereomicroscope eyepiece.

H36 immunofluorescence. Cells were harvested from the periphery of a phagocytic plaque,

suspended in HL5 medium and cell density was adjusted to 500 000 cells/ml. 500 000 cells

of each strain were placed on a sterile coverslip and left to adhere for 2 to 3 hours. Once the

cells had adhered to the coverslip, H36 immunofluorescence was conducted as previously

described (Paquet et al., 2013). The H36 antibody was detected with an Alexa 568-coupled

anti-mouse IgG secondary antibody (Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada). Samples

were also stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to facilitate observations and

17

discrimination between cells and cellular debris. Samples were observed with a Zeiss Axio

Observer Z1 microscope equipped with an Axiocam camera (Carl Zeiss, Canada), in

differential interference contrast (DIC) and epifluorescence microscopy at 630X

magnification. H36 immunofluorescence was reproduced at least 3 times for each amoeboid

isolate. Average cell size for all isolates was also determined based on the measure of 30

cells per isolates from immunofluorescence picture using Fiji (Schindelin et al., 2012;

Schindelin et al., 2015). To verify H36 staining of MLBs, the cell suspension was centrifuged

at 200 x g for 5 minutes, to concentrate most of the amoeboid cells in the pellet and recover

mostly MLBs in the supernatant fraction. The supernatant was collected and placed on the

coverslip and processed for immunofluorescence in the same way as the samples in which

no amoeboid cells were removed.

Western blot of H36. Cells were harvested from the border of phagocytic plaques using

micropipette tips. The biomass was resuspended in 4 ml of HL5 in a 15 ml Falcon tube and

centrifuged at 200 x g for 5 minutes. The supernatant containing bacteria was discarded.

Amoebae were washed an additional time using same volume of HL5 and centrifugation

force to remove the remaining bacteria. The amoebae were resuspended in 4 ml of HL5 and

an aliquot was used to count the amoebae with a hemocytometer. The cells were centrifuged

again and resuspended to a concentration of 300 000 cells/15 µl in HL5 mixed with one-half

volume of 3x TEX loading buffer (0.22 M Tris, pH 6,8, 23.5% glycerol, 9% SDS and traces

of Bromophenol blue). A control lysate was also prepared at 300 000 cells/15 µl with axenic

D. discoideum DH1-10 cells grown in HL5.

The solubilized proteins were separated on 12% SDS-PAGE in reducing conditions (5%

(v/v) 2-mercaptoethanol added to the samples loaded on the gel). Proteins in the gels were

electrotransferred to a nitrocellulose membrane and then stained with Ponceau S to confirm

the quantity of proteins on the membrane. The latter was then immersed in 50 ml TBS (10

mM Tris, pH 7.4, and 150 mM NaCl) for 5 min and after that incubated with TBSM (TBS with

7% skim milk) 2 h at room temperature to block non-specific binding. The membrane was

washed five times for 5 min with TBST (TBS with 0.1% Tween 20) and was incubated for 90

min at room temperature with H36 (ascite diluted 1:10,000 in TBST). The membrane was

then washed three times for 5 min in TBST and was incubated for 1 h at room temperature

with goat anti-mouse IgG IRDye 680RD (Li-cor, USA) according to the manufacturer’s

instructions. The membrane was washed six times for 5 min in TBST. The protein bands

were acquired with the Odyssey Fc Imaging System (Li-cor, USA).

18

Transmission electron microscopy (TEM). Samples from amoeboid cultures on SM medium

supplemented with a K. aerogenes lawn were collected from the periphery of phagocytosis

plaques and resuspended in 1X glutaraldehyde, then processed as previously described

(Paquet et al. 2013). Observations were made using a transmission electron microscope

(either JEOL 1230 with E1 and E2 or FEI Tecnai Spirit G2 with JLJV2 and 3.2-2) at 80 kV.

TEM micrographs were used to measure average MLB size (n= 38).

1.5 Results

The amoeba used in this study were isolated from forest soil in Quebec City, QC, Canada.

A precise 18S identification was only possible for isolate JLJV2, which was identified as

Dictyostelium discoideum (Table 1.1). For the other isolates, a partial identification was

attained. All strains were found to be Dictyostelium species, similar to D. giganteum,

D. bruneum, D. gargantuum and D. purpureum, but closest to D. giganteum. Percent identity

was high between all isolates, with JLJV2 being the most distinct from the other strains.

However, it should be noted that only a 797 bp forward sequence could be obtained for

isolate E2. Thus, only forward sequences were compared to obtain the percent identity

between the isolates. For identification of the isolates, forward and reverse sequences were

used with JLJV2, E1 and 3.2-2.

Table 1.1. Sequence identities in 18S rDNA of the isolates and closest relative.

Isolate

name JLJV2 E1 E2 3.2-2 Closest relative (% identity)

JLJV2 93.6% 93.6% 94.8% Dictyostelium discoideum, 99.94%

E1 97.4% 98.5% Dictyostelium giganteum 99.09%

E2 98.2% Dictyostelium giganteum 98.03%

3.2-2 Dictyostelium giganteum, 98.93%

Strains E1, E2 and 3.2-2 had a much higher growth rate than D. discoideum DH1-10, used

in this study for comparison, as measured by phagocytic plaque growth rate on

K. aerogenes. JLJV2 grew at a similar rate than DH1-10 (Figure 1.1). Growth rates were

statistically different between all strains except DH1-10 and JLJV2, as shown by a p-value

under 0.05 following analysis with the Mann-Whitney U test or Student’s t-test.

19

Figure 1.1. Growth of the amoeboid isolates on K. aerogenes. The graph presents

the growth rate of phagocytic plaques (mm/h) for the various isolates and DH1-10 on

K. aerogenes. The mean for the growth of 20 phagocytic plaques per condition is shown with

the standard deviation. Asterisks (*) indicate p < 0.05 between two values.

Typical multicellular development of the amoeboid isolates is presented in Figure 1.2.

Strains E2 and 3.2-2 produced similar abundant fruiting bodies. These structures were quite

large and tall compared to those produced by DH1-10. The strain JLJV2 produced short

fruiting bodies, similar to the ones of DH1-10 but with a lower abundance. E1 had the most

distinctive multicellular development, as this strain was defective for the culmination step of

fruiting body development (Figure 1.2C). Only slugs, mounds and occasional finger

formations could be observed for this isolate.

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.20

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

DH1-10 JLJV2 E1 E2 3.2-2

Gro

wth

ra

te (

mm

/h)

20

Figure 1.2. Multicellular development of the amoeboid isolates. Typical images

of fruiting bodies and phagocytosis plaques produced by each strain are presented. Top row

shows stereomicroscope images taken with a Motic Camera (scale: 1 mm, 100x) while the

bottom row shows images taken through the eyepiece of the stereomicroscope (scale: 2 mm,

A and B: 100x, C to E: 64x).

JLJV2 and DH1-10 cells were of a similar size, while E1 and 3.2-2 were larger and E2 was

the strain with the smallest cells (Figure 1.3). Cell sizes were significantly different from one

another, as indicated by a p-value under 0.05 following analysis of variance using either the

Mann-Whitney U test or Student’s t-test, except for these pairs: DH1-10 and JLJV2, DH1-

10 and 3.2-2, and E1 and 3.2-2.

21

Figure 1.3. Average cell size (µm2) of the amoeboid isolates. Asterisks (*) indicate

p < 0.05 between two values.

In D. discoideum grown axenically in HL5, the proteins recognized the by H36 antibody are

mostly present in membranes but are excluded from phagocytic cups and phagosomes

(Denoncourt et al., 2016; Mercanti et al., 2006). MLB staining has also been reported with

this antibody (Denoncourt et al., 2016; Paquet et al., 2013). Figure 1.4 shows fluorescence

images of H36 staining which was positive for cells of all wild isolates and DH1-10. Staining

is concentrated at the plasma membrane for all strains, as is typically observed with axenic

DH1-10 (Mercanti et al., 2006), with some cytoplasmic signal observed in some strains.

Inserts for JLJV2, E1, E2 and DH1-10 show characteristic staining of MLBs, with staining

for JLJV2, E2 and DH1-10 forming a ring around the MLB (Paquet et al., 2013). H36 staining

of MLBs was not observed with isolate 3.2-2.

22

Figure 1.4. H36 staining is positive for all of the amoeboid isolates. JLJV2 (A),

E1(B), E2 (C) and 3.2-2 (D) cells show a staining pattern similar to that observed with DH1-

10 (E) upon immunofluorescent staining with the H36 antibody (red), as well as DAPI staining

(blue). Scale bars equivalent to 10 µm. The H36 antibody labels several structures inside the

cells, so it is not possible to be sure which intracellular elements marked by the antibody

correspond to MLBs (Denoncourt et al. 2017). All pictures taken at 630X magnification.

Inserts show H36 staining on MLBs produced by the associated isolate, except for 3.2-2

where no MLB could be conclusively targeted with H36 staining.

23

The H36 antibody recognizes N-acetylglucosamine-1-phosphate, a post-translational

modification that can be found on many proteins (Denoncourt et al., 2016). A Western blot

was performed to determine the profile of bands detected by H36 with the amoeboid isolates

(Figure 1.5). The first interesting observation is that the band pattern obtained for DH1-10 is

different between cells cultured axenically in HL5 and cells grown in the presence of

bacteria. An intense band at around 30 kDa and other additional bands are visible for cells

grown in the presence of bacteria compared to axenic cells. JLJV2 has a band profile

equivalent to that of DH1-10. For their part, E1, E2 and 3.2-2 have a different band pattern

compared to DH1-10. In addition, even if their band pattern is similar, E1, E2 and 3.2-2 show

some differences with a few bands common to two out of three isolates again suggesting

that they are distinct strains.

Figure 1.5. The H36 antibody displays

different protein band patterns in the

amoeboid isolates. Proteins from cell

extracts were separated on a 12% SDS-

PAGE and transferred on a nitrocellulose

membrane. Before performing the western

blot (WB) with the H36 antibody, the proteins

on the membrane were stained with

Ponceau S to confirm equivalent amount of

proteins in each lane. On the image of the

western blot, letters correspond to bands

specific to E1, E2 and 3.2-2 individually or in

pairs.

24

25

Figure 1.6 (page précédente). MLBs produced by amoeboid isolates were

visible both inside the cells and in the medium. MLBs present inside (A) and outside

(B) JLJV2 cells, inside (C) and outside (D) E1 cells, inside (E) and outside (F) E2 cells, and

inside (G) and outside (H) 3.2-2 cells. Magnification: A, 13500X; B, 18500X; C, 2500X; D,

4000X; E, 2500X; F, 6000X; G, 4800X; H, 18500X.

Figure 1.6 presents TEM images of MLBs produced by each amoeboid isolate, both in

formation inside the cells and secreted in the medium. The MLBs produced by JLJV2, E1,

E2 and 3.2-2 all had a similar appearance whether inside or outside the cells. Some MLBs

produced by JLJV2 and E1 contained tighter membrane layers. This morphology was

observed both inside and outside of the cell. All strains also produced looser MLBs, including

some that were not entirely round. Some MLBs presented “U-shaped” layers of membrane,

such as in Figure 1.6F and H. MLBs may also include amorphous material as previously

described (Denoncourt et al. 2016). The size of MLBs was on average 1.1 0.3 by 1.3

0.3 µm, a size close to that of a bacterium, which is in accordance with MLB sizes that have

been reported previously, ranging from 0.1 to about 2 µm (Schmitz and Müller, 1991).

1.6 Discussion

The production of MLBs by all isolates studied suggests that these structures could be

produced by dictyostelids in general. These results support theories proposing a

supplementary role for MLBs beyond being a metabolic byproduct by demonstrating that

MLB production is not an artefact resulting, among other reasons, of the axenization of the

laboratory strains (Denoncourt et al., 2016; Denoncourt et al., 2017a).

Identification of the species based on 18S sequencing was not entirely conclusive, which

was expected as there is a high level of homogeneity within social amoebae. This is

particularly the case for the species D. giganteum and D. purpureum, which seem to exist

in multi-clonal groups with different genotypes (Sathe et al., 2010). Percent identity between

the isolates is also high, as expected from the identification obtained. JLJV2 is the only strain

fairly identified as D. discoideum and its sequence was consequently not as similar to the

other isolates. However, because the four isolates displayed very divergent phenotypes,

especially for the growth rates and fruiting body characteristics as seen in Figures 1.1, 1.2

and 1.3, it is plausible that this study has analyzed the production of MLB from four distinct

dictyostelid species. Strain E1 was particularly interesting due to its culmination defect.

Culmination of fruiting bodies is controlled by many genes (Kessin, 2001; Loomis, 2015),

26

and since a full genome sequencing of E1 was not conducted, the exact reasons for this

defect are unknown. It was, however, interesting to compare this likely mutant strain to

culminating strains, and it should be noted that while being defective for culmination, the

strain still produces MLBs similar to other strains. It should therefore be considered in future

studies on the role of MLBs that if they are indeed involved in intercellular communication,

they do not seem to be involved in culmination, or that at least a culmination defect does not

hinder their production.

In a previous study, analysis of the lipid composition of the membranes constituting MLBs

showed that they were of amoeboid origin, rather than being formed from bacterial remains,

as was suggested earlier (Hohl, 1965; Paquet et al., 2013). Subsequently, some proteins

associated with MLBs, such as discoidin, a lectin involved in adhesion, or SctA, a

constitutively secreted protein, suggest that these bodies could play a role in intercellular

communication (Barondes et al., 1985; Denoncourt et al., 2016). PhoPQ, a hypothetical

protein similar to AprA, has been detected in MLBs. AprA, which regulates proliferation in

Dictyostelium discoideum, can act as a chemorepellent for vegetative cells, but the effect is

not observed on starved cells (Brock and Gomer, 2005; Phillips and Gomer, 2012). As

starvation triggers multicellular development in social amoebae, the presence of PhoPQ in

MLBs is particularly interesting for a possible role in intercellular communication. A study

has also shown that naïve D. discoideum cells exposed to MLBs produced by another

D. discoideum population will ingest and degrade these MLBs, which could indicate a role

as food storage (Denoncourt et al., 2017a). MLBs could therefore be more than a byproduct

of bacteria digestion.

These results demonstrate that other Dictyostelium species are able to produce MLBs,

opening the door to new research questions. For example, it can be asked if MLBs produced

by one species can be recognized by another species, have an effect on it or can be

phagocytosed and digested by this second Dictyostelium species. As a first step to answer

these questions, a biochemical characterization of MLBs from these isolates would be

mandatory to see if they are similar to those produced by D. discoideum (Barondes et al.,

1985; Denoncourt et al., 2016; Paquet et al., 2013) and, for example, see if cell signaling

molecules are found in these MLBs. However, a limitation for studies of this kind is the fact

that these environmental isolates are not axenic, compared to laboratory strains, and that

axenic cultures can be useful for some experiments (Denoncourt et al., 2017a; Paquet et

al., 2013). Axenization was attempted for these strains using HL5 medium, which is routinely

27

used for D. discoideum culture. It was partly conclusive for isolate JLJV2, which was the

only isolate to grow in axenic medium. However, axenic JLJV2 cells appeared damaged

when observed in TEM (data not shown).

Although we used environmental isolates, the production of MLBs was only observed in a

laboratory setting. It was, however, shown here that H36 staining could be used to detect

MLBs from JLJV2, E1 and E2. This finding could be used in further research to detect MLBs

directly from environmental samples. However, since H36 is also detected in amoeboid

cells, another marker could be used. This alternative marker would be especially useful as

the H36 antibody detects a post-translational protein modification rather than a specific

protein (Denoncourt et al., 2016), which likely explains the difference in the signal observed

depending on the amoeboid strain, as shown by our results with 3.2-2. Although 3.2-2 is

similar to E1 and E2 based on sequence identity, no H36 signal could be detected from

MLBs. The post-translational modification recognized by H36 may not be present in 3.2-2

MLB proteins as suggested by the difference seen in the band patterns recognized by H36

in western blot for E1, E2 and 3.2-2, especially the d band specific to E1 and E2 (Figure

1.5).

Another candidate for antibody detection of MLBs would be SctA, a protein found in

pycnosomes, which could be embedded into MLBs. SctA could be an interesting target for

detection of dictyostelid MLBs in the environment, as the protein is constitutively secreted

and is not found in significant quantities inside cells (Denoncourt et al., 2016; Sabra et al.,

2016). SctA staining of MLBs produces a less intense fluorescent signal than what is

observed with H36, but the specificity to MLBs could allow an easier detection. In fact,

detection of SctA combined with the use of H36 to label MLBs would be an interesting

approach for analysis of environmental samples. SctA staining was not attempted here as

the sctA gene has not been detected in the genome of D. giganteum. However, it has been

identified in other Dictyostelium species, such as D. discoideum and D. purpureum, as

determined using BLAST (Altschul et al., 1990). Additional antibodies could be developed

to facilitate detection of MLBs from complex samples. Identification of MLBs directly in

environmental samples would be crucial to support theories of a supplementary role for

MLBs.

28

1.7 Conclusion

Our results suggest that MLBs can be produced by various dictyostelid species from the

forest soil environment, similarly to the laboratory strain production of these structures. Such

results are conclusive with proposed roles for MLBs, such as intercellular communication or

food storage. As new research constantly unveils new levels of complexity in the lifestyle of

social amoebae, MLBs could be a crucial element to understanding the particularities of

these microorganisms.

1.8 Bibliography

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31

Chapitre 2 Non-pathogenic bacteria packaged by

Tetrahymena: study of fecal pellet morphology and

bacterial factors affecting it

Alicia F. Durocher1,2,3, Alix M. Denoncourt1,2,3, Valérie E. Paquet1,2,3 and Steve J.

Charette1,2,3*

1. Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes, Pavillon Charles-Eugène-Marchand,

Université Laval, Québec, QC, Canada

2. Centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de

Québec, Hôpital Laval, Québec, QC, Canada

3. Département de biochimie, de microbiologie et de bio-informatique, Faculté des sciences

et de génie, Université Laval, Québec, QC, Canada

2.1 Résumé

Les protozoaires sont les prédateurs des bactéries, mais certaines évitent la digestion une

fois ingérées. Certaines bactéries résistantes peuvent être enrobées dans les corps fécaux

des protozoaires, les protégeant de certains stress. Selon la bactérie et le protozoaire

impliqués, les corps fécaux présentent différentes morphologies. Nous avons évalué

comment certaines caractéristiques bactériennes (forme, taille, Gram, hydrophobicité)

influencent cette morphologie. La résistance à la digestion par les ciliés

Tetrahymena pyriformis et T. thermophila de quatre bactéries non pathogènes,

Microbacterium oxydans, Micrococcus luteus, Cupriavidus sp. et Cellulosimicrobium funkei,

a été étudiée. Pour chaque souche, les corps fécaux avaient une morphologie différente.

Parmi les caractéristiques examinées, la taille et l’hydrophobicité semblaient influencer

davantage la morphologie, car l’ingestion de petites bactéries hydrophobes conduisait à des

corps fécaux plus ronds, denses et réguliers. Ces résultats indiquent que l’enrobage de

bactéries n’est pas restreint aux bactéries pathogènes et que les interactions bactéries-

protozoaires sont uniques et complexes.

2.2 Abstract

Objective: Protozoa are natural predators of bacteria, but some bacteria can evade

digestion once phagocytosed. Some of these resistant bacteria can be packaged in fecal

pellets produced by protozoa, protecting them from physical stresses and biocides.

32

Depending on the bacteria and protozoa involved in the packaging process, pellets can have

different morphologies. In the present descriptive study, we evaluated how some bacterial

characteristics (shape, size, Gram staining, hydrophobicity) could influence pellet

morphology.

Results: To assess this, four non-pathogenic bacteria, Microbacterium oxydans,

Micrococcus luteus, Cupriavidus sp. and Cellulosimicrobium funkei, were studied for their

capacity to resist digestion and be packaged by the ciliates Tetrahymena pyriformis and

T. thermophila. A different pellet morphology was obtained for each bacterial strain studied.

Of the bacterial characteristics chosen, size and surface hydrophobicity seemed to influence

pellet morphology the most, as the ingestion of small, hydrophobic bacteria resulted in

rounder, denser and more regular pellets. These results support the idea that bacteria

packaging is not restricted to pathogenic species and that bacteria-protozoa interactions,

including those leading to bacteria packaging, are unique and complex.

2.3 Introduction

A vast number of protozoa, which are ubiquitous unicellular eukaryotes, prey on bacteria.

Some bacteria can resist predation by protozoa and survive digestion in the phagocytic

pathway (Greub and Raoult, 2004). This can result in bacteria being included in fecal pellets

expelled by protozoa, a phenomenon known as bacteria packaging. This forms a typically

spherical cluster of bacteria, usually covered by one or more layers of membrane, depending

on both bacterial and protozoan species (Berk et al., 2008; Denoncourt et al., 2014; Paquet

and Charette, 2016). Packaging of different bacterial species by the same protozoan can

result in different pellet morphologies; pellets can include very little or abundant membrane

layers surrounding bacteria (Denoncourt et al., 2017b; Trigui et al., 2016). Pellet morphology

also differs between protozoan species as those produced by amoebae tend to contain

fewer bacteria and more membrane than ciliate-produced ones. (Berk et al., 1998; Berk et

al., 2008).

Bacteria packaging, which grants resistance to chemical and physical stresses, has mostly

been studied with pathogens so far (Brandl et al., 2005; Espinoza-Vergara et al., 2019;

Gourabathini et al., 2008; Koubar et al., 2011; Raghu Nadhanan and Thomas, 2014; Trigui

et al., 2016). However, non-pathogenic bacteria have been shown to be packaged by the

social amoeba Dictyostelium discoideum (Paquet and Charette, 2016).

33

Tetrahymena ciliates are useful organisms to study bacteria packaging, as pellets can be

expelled within less than an hour (Denoncourt et al., 2017a). With the exception of

M. smegmatis packaging by Tetrahymena (Denoncourt et al., 2017b), no extensive study of

non-pathogenic bacteria packaging by ciliates is available. Consequently, there is little

evidence that ciliates can package non-pathogenic bacteria like they do pathogenic ones.

Bacterial packaging could promote the survival of bacteria in harsh environments or act as

a reservoir, as pellets can stay intact for weeks (Espinoza-Vergara et al., 2019; Koubar et

al., 2011).

In the present study, four non-pathogenic bacterial species resistant to digestion in amoeba

(Paquet and Charette, 2016) were co-cultured with two ciliates, Tetrahymena pyriformis and

T. thermophila. The pellets produced were characterized with regards to bacterial features.

2.4 Materials and methods

Strains. Tetrahymena strains used were T. pyriformis ATCC 30202, grown axenically in SPP

medium at 25°C, and T. thermophila CU428.2, grown axenically in PP medium at 30 °C

(Gorovsky et al., 1975; Orias et al., 2000). Cells were subcultured when reaching

confluence. Bacterial stock cultures were grown as needed on Tryptic Soy Agar (TSA)

(EMD, Canada) and incubated for 48h, at the appropriate temperature. Strains used were

Microbacterium oxydans US1 (30 °C), Micrococcus luteus (37 °C), Cellulosimicrobium

funkei (30°C), and Cupriavidus sp. (25 °C) (see Additional file 1 for details).

Hydrophobicity assay. The surface hydrophobicity assay was conducted as described in

Rosenberg et al. and results were analyzed as presented in Bonifait et al. (Bonifait et al.,

2010; Rosenberg et al., 1980). The assay was conducted 5 times for each species.

Co-cultures. Co-culture assays were conducted in 6-well plates. Bacteria were suspended

in plate count broth (PCB) (Berk et al., 2008; Brandl et al., 2005; Gourabathini et al., 2008;

Trigui et al., 2016) at an OD595 of 1. Tetrahymena cells were transferred from their growth

medium to PCB medium. 3 x 105 ciliates were added to each co-culture (one strain per co-

culture) along 300 µl of one of the bacterial suspensions, for a ratio of 1 protozoa:1000

bacteria in a total volume of 3 ml of PCB. Co-cultures were incubated for 4h, at 25 °C with

T. pyriformis and at 30 °C with T. thermophila.

Cell fixation and 4-,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. This procedure was

performed as previously described (Trigui et al., 2016). Once stained, samples were

34

observed with an Axio Observer Z1 microscope equipped with an Axiocam MRm camera

(Zeiss).

LIVE/DEAD staining. 1 ml of co-culture was centrifuged for 2 min at 600 x g. The supernatant

containing the fecal pellets was collected. Staining with LIVE/DEAD bacterial viability stain

(Life Technologies, Invitrogen) was done as previously described (Trigui et al., 2016).

LIVE/DEAD staining was reproduced twice for each co-culture.

Transmission electron microscopy (TEM) processing. Samples from co-cultures, some

incubated longer than 4h to ensure optimal pellet retrieval, were fixed for 3 h in 0.1 M sodium

cacodylate buffer (pH 7.3) containing 2% glutaraldehyde and 0.3% osmium tetroxide. After

centrifugation, sample pellets were resuspended with a micropipette in cooled molecular

biology agarose (BioRad) diluted to 3% in phosphate buffered saline. Once solidified,

samples were cut into cubes of about 3-5 mm and processed for TEM as previously

described (Paquet et al., 2013).

2.5 Results and discussion

Four different bacterial species were chosen to evaluate at a descriptive level the diversity

of non-pathogenic bacteria packaging morphology with Tetrahymena ciliates. The reasoning

for choosing these strains as well as their characteristics are presented in Tables S1 and S2

of the Additional file (section 2.8).

Surface hydrophobicity was deemed an interesting characteristic in regards to packaging as

it has been suggested that hydrophobic bacteria are less digestible by Tetrahymena

(Siegmund et al., 2018). Hydrophobic bacteria could thus be more easily packaged.

Hydrophobicity assays (Table S2 of the Additional file 1) revealed that M. oxydans and

M. luteus are hydrophobic while C. funkei and Cupriavidus sp. are not. Analysis of variance

for the hydrophobicity percent yielded a p-value of 3.51 x 10-7, indicating that the difference

between the results is statistically significant.

Based on DIC and epifluorescence observations, pellets produced with M. oxydans and

M. luteus were round and regular. M. oxydans pellets were densely packed with bacteria

while M. luteus pellets were not as dense (Figure 2.1A, B, C and D). With Cupriavidus sp.,

pellets were less regular and tight, and contained fewer bacteria (Figure 2,1E and F).

C. funkei pellets were round, regular and similar to those containing M. oxydans upon DIC

observation (Figure 2.1G). However, DAPI staining revealed a very diffuse fluorescent signal

35

for whole pellets with a few bacteria producing a stronger signal (Figure 2.1H). For each

bacterial species studied, the pellets produced had a specific morphology observed in every

replicate (n ≥ 3).

TEM observations confirmed the morphologies observed with DIC and epifluorescence

microscopy. With M. oxydans, images showed round pellets densely filled with bacteria and

only one continuous membrane-like layer, consistent with epifluorescence observations

(Figure 2.2A). Intracellular pellets were very similar to the expelled ones (Figure 2.2B). TEM

showed intact, sometimes mid-division cells in the pellets. It has been reported that

M. oxydans is not efficiently digested by T. pyriformis and is not its preferred prey, which

could explain why it resisted digestion by T. pyriformis in this experiment and suggests a

similar resistance to digestion by T. thermophila (Raghupathi et al., 2018).

Pellets produced with M. luteus were quite round and regular, but not as dense as with

M. oxydans (Figure 2.2C). The continuous layer surrounding the bacteria was thinner than

that surrounding M. oxydans cells. Some pellets still inside Tetrahymena appeared to have

thicker material around the pellet, instead of the thin layer around ejected pellets, suggesting

that TEM processing may damage ejected pellets or that unknown conditions after ejection

influence the layer thickness (Figure 2.2D and Figure S1). Pellets in formation seemed to

contain more partially digested bacteria than ejected ones (Figure 2.2D). However, this

observation may be biased by the angle at which samples are cut. Also, pellets containing

damaged bacteria might be less sturdy than those containing intact bacteria and therefore

fall apart once ejected, maybe due to the extracellular material sometimes observed

between cells.

36

Figure 2.1. DIC and DAPI fluorescence microscopy of pellets produced by

T. pyriformis. Pellets produced in a co-culture of T. pyriformis and M. oxydans (A and B),

M. luteus (C and D), C. funkei (E and F), and Cupriavidus sp. (G and H). DIC images are

shown in A, C, E, and G and DAPI fluorescence images in B, D, F, and H. All pictures were

taken at 630X magnification. Scale bars: 10 µm.

37

38

Figure 2.2 (page précédente). TEM images of bacteria packaging by

Tetrahymena. Pellets produced in a co-culture of T. pyriformis and M. oxydans (A),

T. thermophila and M. luteus (C), T. pyriformis and C. funkei (E), and T. thermophila and

Cupriavidus sp. (G). In the case of C. funkei, since no expelled pellet was observed, a pellet

in a late food vacuole prior exocytosis is shown. T. pyriformis containing M. oxydans (B),

T. thermophila containing M. luteus (D), T. pyriformis containing C. funkei (F), and

T. thermophila containing Cupriavidus sp. (H) are also shown. Arrowheads point to the outer

layer around the pellets when it is present. Multiple arrowheads are used when the layer is

not continuous. Arrows point to thicker layers observed around pellets in formation.

Magnification: A, 2500X; C, 4000X; E and G, 3000X. Pictures B, D, F and H were taken at

1000X magnification.

With Cupriavidus sp., pellets were irregular and sparse (Figure 2.2E). Rather than a

continuous layer, as seen with M. oxydans and M. luteus, only dispersed chunks of

extracellular material enveloped the scattered bacteria in each pellet. Tetrahymena vacuoles

contained structures similar to expelled pellets, with little extracellular polymers and sparsely

filled with bacteria (Figure 2.2F). Cupriavidus sp. was the only Gram-negative bacteria

tested here and generated a different pellet morphology than the other species. This strain

of Cupriavidus also contains intracellular inclusions, as seen in TEM micrographs, and was

isolated from a biofilm, unlike the other bacteria (Berthiaume et al., 2014). These

characteristics could influence pellet morphology.

With C. funkei, no excreted pellets were found in TEM, however, another sample from the

same co-culture was observed in DIC and epifluorescence and numerous external pellets

were visible (data not shown). However, packaged bacteria were present in late-stage

vacuoles, ready for exocytosis (Figure 2.2G and H). Phagocytic vesicles are deemed late-

stage vacuoles when the vacuole membrane does not touch its contents (Faulkner et al.,

2008). It was considered that pellets in late-stage vacuoles have the same morphology as

ejected pellets, as no more digestive activity can affect them. As the preparation of TEM

samples, including centrifugation steps, is suspected of damaging some pellets, the

contents of late-stage vacuoles may be a more reliable way of observing pellet morphology,

since the ciliate cell protects fragile pellets. TEM observations of these vacuoles confirmed

that very few C. funkei cells remained whole in late-stage vacuoles and that pellets were

mainly composed of either partially digested, compacted bacteria, or unidentified material.

In both cases, pellets lacked a surrounding membrane-like layer. A similar phenomenon of

particle compaction in vacuoles had previously been reported with T. pyriformis (Denoncourt

39

et al., 2017a). This concurs with epifluorescence observations, and the faint fluorescent

observed may be due to partially digested bacteria.

C. funkei seems to be more digestible by Tetrahymena, judging from the numerous

degraded cells in vacuoles, which could explain the difference in pellet morphology between

C. funkei and other species. Another difference is that M. oxydans is hydrophobic while

C. funkei is hydrophilic. Hydrophobic bacteria have been shown to evade digestion by

ciliates (Siegmund et al., 2018). Furthermore, the smallest bacteria studied, M. oxydans and

M. luteus, both produced denser pellets than the other strains. The size, digestibility and

hydrophobicity of bacteria may be better factors explaining pellet morphology, with

packaging of hydrophobic, non-digestible bacteria more likely to produce dense pellets.

No clear difference in morphology could be detected between pellets produced by either

Tetrahymena species for the four bacteria further studied. Figures 2.1 and 2.2 show

representative results of observations with both species. This suggests that pellet

morphology is more influenced by the bacteria consumed than the ciliate species, at least

for the two species studied.

Based on LIVE/DEAD observations (Figure 2.3), for all bacteria except M. oxydans, pellets

mostly contained intact bacteria with a few damaged cells. Most M. oxydans pellets

contained almost exclusively either intact or damaged bacteria. It was suggested that the

number of bacteria within a digestive vacuole could impact digestion efficacy, as bacteria

present in high numbers in vacuoles are more likely to evade digestion than in low numbers

(Thurman et al., 2010). Figure 2.3A shows that most of the “all intact” pellets were bigger

ones and all of the “all damaged” pellets were small pellets. Although these “all damaged”

pellets contained more bacteria than the numbers reported in Thurman et al., who found

that vacuoles containing 6 cells or less were digested most efficiently, the same tendency

was observed (Thurman et al., 2010). The bacterial species they tested could be more easily

digested by Tetrahymena than M. oxydans. Even when M. oxydans cells were damaged,

they were still not entirely digested as they were expelled inside pellets, indicating that while

M. oxydans may be killed by Tetrahymena, it cannot be digested. This could explain a

previous report that upon grazing on a multispecies biofilm, T. pyriformis exhibited low

preference for M. oxydans (Raghupathi et al., 2018).

40

Figure 2.3. Bacterial cells are viable in pellets produced by Tetrahymena.

Pellets produced in a co-culture of T. pyriformis and M. oxydans (A) or M. luteus (B). Pellets

produced in a co-culture of T. thermophila and C. funkei (C). Figure 3C is a composite of 2

different images as no single image contained more than one pellet. Pellets produced in a

co-culture of T. pyriformis and Cupriavidus sp. (D). Samples were stained with LIVE/DEAD

bacterial viability stain. All pictures were taken at 630X magnification and are merged images

of SYTO 9 (green; viable cells) and propidium iodide (red; dead cells) fluorescence.

C. funkei LIVE/DEAD results were inconsistent with TEM observations. LIVE/DEAD staining

showed that most bacterial cells inside pellets were intact, while TEM showed that most cells

were digested and only a few cells remained whole. TEM observations seem to be more

reliable due to the difficulty of observing many pellets in LIVE/DEAD samples, as staining

requires centrifuging non-fixed samples, which could damage pellets, while abundant still-

A

M. oxydans

B

M. luteus

C

Cupriavidus sp.

D

C. funkei

41

in-transit pellets were analyzed in TEM. The “pellets” seen in LIVE/DEAD m icroscopy may

be the contents of early digestive vacuoles from lysed Tetrahymena cells, which are also

sensitive to higher speed centrifugation. Diffuse fluorescent signal was often observed

surrounding C. funkei “pellets” in LIVE/DEAD microscopy, which could be cytoplasmic

content.

Overall, this study demonstrates that non-pathogenic bacteria can be packaged in fecal

pellets produced by Tetrahymena ciliates and that this packaging presents morphological

variability linked to the packaged bacterium. These pellets are majorly composed of a single

membrane-like covering layer as with packaged Mycobacterium smegmatis (Denoncourt et

al., 2017b; Trigui et al., 2016), whereas with Campylobacter jejuni, bacteria are surrounded

by abundant membrane layers (Denoncourt et al., 2017b; Trigui et al., 2016).

2.6 Limitations

As packaging can only be ultimately confirmed via TEM, only the four most interesting strains

were selected to pursue analyses, with an emphasis on characteristic diversity and not

necessarily the greatest pellet production, considering the descriptive nature of this study.

These results suggest that hydrophobicity and cell size probably impact the morphology of

pellets produced by Tetrahymena. However, no direct link between the factors studied and

pellet morphology could be established, as it is more likely that many factors contribute to

produce a specific morphology, including some that were not considered here.

2.7 References

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2.8 Additional file

The four bacteria used in this study were selected from a list of 20 non-pathogenic bacteria

resistant to Dictyostelium discoideum amoeba predation (Paquet and Charette, 2016).

These 20 bacteria were co-cultured with Tetrahymena pyriformis and Tetrahymena

thermophila to assess whether they could also be packaged by ciliates, as described in the

materials and methods section of the main text. All 20 bacteria could be packaged in at least

one of the conditions tested based on differential interference contrast (DIC) observation

(Table S1). Pellets can be identified via DIC microscopy as spherical aggregates of bacteria

44

with a characteristic physical relief (Figure 1 of the main manuscript), however, to confirm

the presence of a layer around the pellet, TEM observation is usually necessary.

M. oxydans US1, M. luteus, C. funkei and Cupriavidus sp. were chosen because of their

pellet production, which was good or great in the conditions selected for the final study

(incubation at 25 °C with T. pyriformis or 30 °C with T. thermophila, 48h old bacterial pre-

cultures), because of their different characteristics as presented in Table S2, and because

of their ease of manipulation. Some bacteria that were efficiently packaged needed specific

care compared to the other strains, such as Rhodococcus spp. or Cupriavidus necator, and

were thus discarded as candidates for this study to standardize manipulations.

45

Table S1. Amoeba-resistant bacteria packaged by ciliates. Various non-pathogenic

bacteria presenting an amoeba-resisting phenotype identified by Paquet et al., 2016 were co-cultured

with two ciliate species. The production of bacteria-containing pellets was quantified by observing 10

fields on a slide and counting the visible pellets. The extent of pellet production of each co-culture

based on DIC observations is graded by color: counts of 20+ visible pellets were considered excellent

pellet production (dark green); 10-19 pellets, good (light green); 3-9 pellets, intermediate (yellow);

and 0-2 pellets, mediocre (orange). If no pellet was visible in the initial co-culture upon observation

with an inverted microscope (red), it was considered that there was no pellet production and no slide

was further prepared or observed. Thus, classifications from excellent to mediocre all yielded some

pellets, visible in the co-culture before sampling.

Bacteriaa Source T. t.b T p.c

Cupriavidus basilensis (isolate 2)

Isolated from drinking water pipes (Berthiaume et al., 2014)

Cupriavidus sp. (isolate 1) Isolated from drinking water pipes (Berthiaume et al., 2014)

Micrococcus luteus (Norway) Janet Martha Blatny et al. (Norwegian University of Science and Technology, Norway)

Micrococcus luteus US4 USDA

Rathayibacter tritici (LBUM-572)

Martin Filion et al. (Moncton University, Canada)

Rhodococcus erythropolis US1

USDA

Rhodococcus erythropolis US2

USDA

Rhodococcus fascians US1 USDA

Rhodococcus fascians US2 USDA

Cupriavidus necator US1 USDA

Duganella zoogloeoides (LBUM-382)

Martin Filion et al. (Moncton University, Canada)

Kocuria kristinae Janet Martha Blatny et al. (Norwegian University of Science and Technology, Norway)

Microbacterium oxydans US1

USDA

Micrococcus luteus Pierre Cosson (Geneva University, Switzerland)

Micrococcus luteus 8_4_14 X2

Janet Martha Blatny et al. (Norwegian University of Science and Technology, Norway)

Micrococcus luteus D_1_6 X2

Janet Martha Blatny et al. (Norwegian University of Science and Technology, Norway)

Micrococcus luteus US3 USDA

Rhodococcus erythropolis Janet Martha Blatny et al. (Norwegian University of Science and Technology, Norway)

Rhodococcus pyridinivorans Janet Martha Blatny et al. (Norwegian University of Science and Technology, Norway)

Cellulosimicrobium funkei Janet Martha Blatny et al. (Norwegian University of Science and Technology, Norway)

a: bacterial pre-cultures were grown for at least 48 hours before co-culture. b: T. thermophila, co-cultures at 21 °C and 30 °C have been tested. c: T pyriformis, co-cultures at 21 °C and 25 °C have been tested.

46

Table S2 presents the characteristics of the four selected bacteria. Gram staining was

deemed an interesting characteristic as it was thought that cell wall composition may impact

digestion by ciliates. Size and shape of the cell were considered as these characteristics

may directly influence how cells are organized in Tetrahymena digestive vacuoles.

Hydrophobicity was chosen as a characteristic of interest based on a report that hydrophobic

bacteria could evade digestion by Tetrahymena more efficiently (Siegmund et al., 2018). It

was hypothesized that this characteristic may also be determinant in a bacteria packaging

context.

Table S2. Characteristics of the four bacteria studied

Gram Shape Size Hydrophobicity (%)

Microbacterium oxydans US1 + Rod 1 µm x 0.25 µm 46.76 ± 3.704

Micrococcus luteus + Coccus 0,5 µm 51.09 ± 18.00

Cellulosimicrobium funkei + Rod 1 µm x 0.5 µm 0* ± 2.88

Cupriavidus sp. - Rod 2 µm x 0.5 µm 0* ± 2.19

*The values obtained (as percentages) were all or in majority negative and were thus

considered as 0% hydrophobicity as previously reported (Gauthier-Levesque et al., 2016).

Figure S1 illustrates how some still-transiting pellets inside Tetrahymena cells co-cultivated

with M. luteus had a thicker membrane layer surrounding bacterial cells than expelled M.

luteus pellets. This difference could be due to pellets being partly degraded once they are

expelled from ciliate cells.

47

Figure S1. The material surrounding M. luteus pellets in formation is thick and

of undefined nature. A T. thermophila vacuole containing a M. luteus pellet still in

formation. An arrowhead points the thick outer layer. Picture taken at 5000X magnification.

REFERENCE

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48

Discussion générale

La production de CML et l’enrobage de bactéries sont deux phénomènes complexes liés à

la voie phagocytique des protozoaires. Bien qu’un lien entre ces deux phénomènes n’ait pas

encore été montré, il est plausible que ceux-ci soient reliés, étant donné que ces deux

structures sont produites par la voie phagocytique de divers protozoaires. Notre

compréhension de ceux-ci est encore incomplète. La formation des CML est mieux

comprise que la formation de l’enrobage de bactéries, mais le rôle de ces premiers n’a pas

encore été élucidé. De plus, alors que l’enrobage de bactéries a été observé avec plusieurs

genres de protozoaires, appartenant tant aux amibes qu’aux ciliés, la caractérisation de la

production de CML a jusqu’à maintenant été limitée surtout aux amibes sociales

appartenant à l’espèce D. discoideum, principalement chez des souches de laboratoire

(Barondes et al., 1985; Cooper et al., 1986; Emslie et al., 1998; Fukuzawa et Ochiai, 1993;

Gezelius, 1959; Gezelius, 1961; Hohl, 1965; Marchetti et al., 2004; Mercer et Shaffer, 1960).

Il serait pertinent d’explorer les liens entre les deux phénomènes. Bien qu’il semble probable

que l’enrobage de bactéries et la production de CML soient liés d’une quelconque façon, il

n’existe pas à ce jour de preuve véritable de cette relation. On peut par contre remarquer

que l’enrobage de bactéries chez D. discoideum produit de multiples couches similaires à

celles des CML autour des bactéries évacuées (Paquet et Charette, 2016). L’amibe libre

A. castellanii peut également produire des CML lorsque cultivée avec certaines souches

d’E. coli (Chekabab et al., 2012). Comme pour D. discoideum, l’enrobage produit par

A. castellanii est similaire morphologiquement aux couches des CML produits par cette

amibe, formant plusieurs épaisseurs de membrane autour des bactéries intactes (Berk et

al., 1998). La production de CML, ou du moins d’une structure similaire, a déjà été observée

avec Tetrahymena lorsque celui-ci était cultivé avec des bactéries digestibles (Berk et al.,

2008). Est-ce que la production de CML chez les ciliés et amibes libres a moins souvent été

observée parce qu’elle est plus rare, ou parce qu’elle est moins étudiée? D’autres facteurs

pourraient entrer en jeu : par exemple, la production de CML est souvent étudiée avec des

cultures sur tapis bactériens, étant donné que les amibes sociales y croissent facilement,

tandis que les ciliés sont gardés en culture liquide. Puisque la concentration de cellules

bactériennes est plus élevée en culture solide qu’en liquide, cela pourrait possiblement

favoriser la formation de CML en culture solide, comme le ratio bactéries:protozoaires

pourrait avoir une influence dans la voie phagocytique, tel qu’il sera discuté plus tard. De

plus, si on considère le possible rôle des CML dans la communication intercellulaire, il serait

49

logique que les amibes sociales, qui doivent coordonner la croissance multicellulaire à

certaines étapes de leur cycle de vie, en produisent plus, ou plus souvent, que les ciliés et

amibes libres qui vivent uniquement sous forme de cellules seules. Un autre aspect qui

devrait être considéré dans la production de CML par différents protozoaires est leur façon

de s’alimenter. Puisque les ciliés s’alimentent par filtration, ils produisent de nombreux

phagosomes remplis de bactéries et de leur milieu de culture. Il paraîtrait donc logique qu’ils

produisent des CML afin d’évacuer l’excédent. Cependant, si les CML ont effectivement

d’autres rôles que la gestion des déchets utiles au développement multicellulaire des

amibes sociales, cela pourrait expliquer que les ciliés semblent en produire moins.

Plusieurs méthodes restent à développer ou à améliorer pour la poursuite de l’étude de

l’enrobage de bactéries et des CML. Il serait primordial de trouver une façon simple de

purifier les CML ou les bactéries enrobées, car les méthodes actuellement employées sont

longues et complexes (Denoncourt et al., 2016; Paquet et al., 2013). Il serait également

idéal d’établir un protocole standardisé pour produire des CML/bactéries enrobées en

grande quantité pour procéder à diverses analyses.

Discussion du chapitre 1

Le chapitre 1 portait sur la caractérisation d’amibes sociales isolées de l’environnement et

de leur voie phagocytique. Les observations réalisées ont révélé que chacun des quatre

isolats à l’étude, c’est-à-dire JLJV2, E1, E2 et 3.2-2, appartenaient au genre Dictyostelium

et produisaient des CML lorsque cultivés sur tapis de K. aerogenes. Dans l’est de l’Amérique

du Nord, plusieurs espèces d’amibes sociales sont présentes dans les sols forestiers

tempérés, appartenant aux genres Dictyostelium, Polysphondilium et Acytostelium

(Swanson et al., 1999).

Plusieurs limites doivent être considérées dans l’interprétation des résultats obtenus, entre

autres pour les résultats de séquençage et l’identification subséquente. Il fut impossible

d’obtenir une séquence reverse (fin de la séquence visée du 18S) pour l’amibe E2; ainsi,

seule la première séquence put être utilisée pour identifier l’espèce de cette amibe, ce qui

explique que le pourcentage d’homologie pour cet isolat soit le plus faible parmi les isolats

étudiés. De plus, seulement la séquence forward fut utilisée pour comparer le pourcentage

d’identité des isolats entre eux, afin d’éviter un biais négatif pour la souche E2. Il pourrait

donc être intéressant de poursuivre les efforts de séquençage pour cette souche, par

exemple en utilisant le clonage pour s’assurer de n’avoir qu’une séquence, cependant, étant

50

donné que l’identité des souches à l’étude n’était pas le point focal de mon projet de maîtrise,

il fut considéré que l’obtention de la séquence forward était suffisante pour l’analyse à

réaliser. De plus, les autres caractéristiques des souches utilisées (vitesse de croissance,

apparence des corps fructifères, taille des cellules, localisation de l’anticorps H36)

permettent d’illustrer la diversité des souches utilisées, même sans une identification

complète de l’espèce précise.

Les résultats obtenus pour la détection de CML à l’aide de l’anticorps H36 étaient

partiellement concluants. Étant donné que cet anticorps reconnaît une modification

protéique plutôt qu’une protéine elle-même, il ne peut pas être exclu que la protéine

reconnue sur les CML des divers isolats n’est pas la même, ce qui expliquerait également

l’absence de signal avec les CML de 3.2-2. D’autres marqueurs, comme la protéine SctA,

pourraient également être envisagés éventuellement pour remplacer ou complémenter

l’utilisation de H36. L’identification d’un anticorps universel permettant de reconnaître les

CML de tous les dictyostélides serait idéale afin d’identifier ces structures dans un

échantillon environnemental, mais un tel anticorps n’existe potentiellement pas pour le

moment. Il est très probable que la composition des CML soit unique à chaque espèce, ou

à quelques espèces très rapprochées, particulièrement si ceux-ci ont un rôle à jouer dans

la communication intercellulaire, ce qui leur permettrait de communiquer seulement avec la

population de leur espèce plutôt qu’avec d’autres espèces en compétition. Considérant que

la protéine SctA est présente dans les CML de D. discoideum DH1-10, mais que le gène

codant pour cette protéine est absent du génome de D. giganteum, espèce à laquelle

appartiendraient certains de nos isolats produisant des CML, suggère fortement que la

composition des CML pourrait différer d’une espèce à l’autre. Ainsi, il serait nécessaire

d’analyser la composition de CML provenant de différentes espèces avant d’entreprendre

la recherche d’un marqueur « universel ». Un mélange de différents anticorps serait

probablement la meilleure solution, qui pourrait être composé d’anticorps contre les

protéines les plus souvent retrouvées lors de l’analyse des CML proposée. L’utilisation d’un

anticorps reconnaissant plusieurs épitopes, comme l’anticorps H36, pourrait également

potentiellement permettre la détection de plus de CML, étant donné qu’il est moins

spécifique, mais comporte le risque d’engendrer des faux positifs.

De façon générale, il serait également souhaitable de déterminer la composition protéique

et lipidique de CML produits par de nombreuses espèces et souches d’amibes sociales, afin

de les comparer aux informations déjà disponibles, car de nouvelles pistes quant à leur

51

véritable rôle sont probablement présentes dans leur composition spécifique. Par exemple,

le degré de variation dans ces compositions d’une espèce à l’autre pourrait être révélateur.

Il a déjà été démontrée que des amibes naïves pouvaient digérer les CML produits par

d’autres amibes de la même espèce, D. discoideum DH1-10 (Denoncourt et al., 2017a). Il

serait pertinent de tester la phagocytose et la digestion de CML inter-espèces, par exemple

entre les différents isolats utilisés ici, ou même entre différentes souches d’une seule

espèce. La compatibilité entre les CML produits par différentes espèces pourrait être

révélatrice de leur rôle potentiel dans le cycle de vie des amibes sociales.

Discussion du chapitre 2

Le chapitre 2 de ce mémoire traitait de l’enrobage de quatre souches bactériennes, soient

M. oxydans, M. luteus, Cupriavidus sp. et C. funkei, par deux ciliés, T. pyriformis et

T. thermophila, et des facteurs influençant la morphologie de cet enrobage. Les

caractéristiques qui semblaient avoir l’effet le plus marqué sur la morphologie étaient

l’hydrophobicité de surface et la taille de la bactérie.

Les bactéries utilisées dans cette étude ont été sélectionnées à partir d’une liste de 20

bactéries, basée sur les résultats d’enrobage obtenus avec D. discoideum lors d’essais avec

136 souches bactériennes appartenant à 19 genres différents (Paquet et Charette, 2016).

Ces bactéries ont été mises en co-culture avec T. pyriformis et T. thermophila dans

différentes combinaisons de conditions (température, âge de la culture bactérienne utilisée).

Les bactéries sélectionnées pour la poursuite de l’étude étaient toutes enrobées assez

facilement et étaient faciles à manipuler. Certains isolats de la liste initiale qui étaient très

bien enrobés présentaient des caractéristiques qui rendaient leur utilisation plus complexe.

Par exemple, certains produisaient des colonies très sèches sur gélose, ce qui rendait leur

mise en suspension ardue, ajoutant un paramètre de variabilité imprévisible, qui pouvait

nuire à l’étude des interactions bactéries-ciliés. En raison de cette particularité, la

suspension bactérienne résultante contenait souvent de petits amas de bactéries agrégées,

faciles à confondre avec des bactéries enrobées. Donc, autant par souci de standardiser

les manipulations que pour simplifier les observations, ces bactéries n’ont pas été choisies

pour poursuivre l’étude. De plus, il ne peut pas être exclu que cette tendance à l’agrégation

puisse faciliter l’enrobage, ce qui aurait compliqué l’interprétation des résultats obtenus

étant donné que cette caractéristique s’ajoutait à celles à l’étude. Considérant que l’étude

des interactions bactéries-protozoaires est déjà complexe, il n’était pas souhaitable d’utiliser

des bactéries complexifiant davantage les analyses alors que des alternatives étaient

52

possibles. Cependant, il pourrait être pertinent de faire d’autres tests avec ces bactéries,

afin d’explorer comment cette tendance à l’agrégation pourrait les favoriser lorsqu’elles sont

confrontées aux ciliés.

Il a été mentionné que les interactions entre bactéries et protozoaires sont très spécifiques

(Denoncourt et al., 2014). Cette spécificité est illustrée dans le tableau S1 du matériel

supplémentaire : certaines bactéries sont très bien enrobées par un des ciliés, mais pas du

tout par l’autre, comme dans le cas de M. luteus D_1_6 X2, ou encore très peu enrobées

par l’un des ciliés. On remarque également que plusieurs souches de M. luteus sont

étudiées, mais que l’enrobage est très différent d’une souche à l’autre : certaines sont très

facilement enrobées, comme la souche qui a été sélectionnée pour étudier la morphologie

de l’enrobage, tandis que d’autres ne le sont presque pas. Il avait déjà été reporté que

différentes souches de la même espèce bactérienne pouvaient avoir des sorts différents

lors de la phagocytose, mais cela avait surtout été étudié avec des variantes pathogènes et

non pathogènes de la même bactérie, soit E. coli (Berk et al., 2008; Smith et al., 2012). Les

résultats de la présente étude illustrent bien que la pathogénicité n’est pas nécessaire à

l’enrobage et que d’autres facteurs peuvent influencer ce phénomène. En effet, les souches

utilisées dans cette étude n’étaient pas pathogènes contre les humains ou mammifères, et

ne nuisaient pas à la croissance des ciliés. Il pourrait être intéressant de caractériser ces

isolats de M. luteus pour mettre en lumière les caractéristiques permettant à certaines

souches de mieux résister à la digestion et d’être enrobées, par exemple la production d’une

capsule. Somme toute, les résultats engendrés avec les bactéries du criblage initial et les

quatre bactéries sélectionnées supportent que la pathogénicité n’est pas requise pour

l’enrobage, ce qui avait déjà été envisagé par d’autres études (Denoncourt et al., 2017b;

Paquet et Charette, 2016).

Les possibles implications de l’enrobage dans la propagation d’infections, notamment via

l’air ou par la voie gastrique, restent à explorer. De récents développements suggèrent que

l’enrobage pourrait aider V. cholerae à survivre dans l’estomac (Espinoza-Vergara et al.,

2019), tandis qu’il est suggéré depuis un certain temps que la protection offerte par

l’enrobage aux bactéries pourrait favoriser leur résistance aux conditions adverses de

l’aérosolisation, comme la dessiccation et les rayons UV (Gourabathini et al., 2008).

Cependant, pour le moment, peu d’études se sont penchées sur la question. Il a été suggéré

que des cellules de V. cholerae ayant été enrobées seraient plus infectieuses que des

cellules planctoniques, selon les résultats obtenus avec un modèle murin (Espinoza-

53

Vergara et al., 2019). Des résultats similaires sont ressortis d’une étude avec

L. pneumophila, lors de l’infection in vitro de pneumocytes avec des bactéries ayant été

enrobées par T. tropicalis (Koubar et al., 2011). Il serait intéressant de poursuivre dans cette

voie, ainsi que de modéliser l’effet possible de l’enrobage sur la transmission d’infections

respiratoires via l’aérosolisation de bactéries enrobées.

Les résultats obtenus avec M. oxydans, M. luteus, Cupriavidus sp. et C. funkei montrent

également que chaque relation protozoaire-bactérie est unique. Chacune de ces bactéries

a produit une morphologie d’enrobage différente. Cependant, étant donné la complexité des

relations bactéries-protozoaires et de l’enrobage, il n’a pas été possible de déterminer avec

précision quels facteurs influençaient cette morphologie. L’hydrophobicité de surface et la

taille des cellules bactériennes semblent être les caractéristiques les plus importantes pour

la morphologie, mais il ne peut être exclu que les autres données considérées, la forme de

la cellule et le résultat au test de Gram, aient également un effet. De plus, d’autres

caractéristiques n’ayant pas été considérées pourraient avoir influencé cette morphologie,

comme la capacité des bactéries à être digérées par les ciliés utilisés ou des activités

métaboliques spécifiques à une des bactéries à l’étude.

La capacité à être digérées des bactéries pourrait être une caractéristique intéressante à

quantifier pour des projets futurs. La bactérie la mieux enrobée selon nos résultats,

M. oyxdans, a déjà été identifiée comme grandement résistante à la digestion par

Tetrahymena (Raghupathi et al., 2018). Une bactérie moins digestible a plus de chance de

se retrouver enrobée qu’une bactérie qui est dégradée dans la voie phagocytique , étant

donné qu’elle risque plus de se retrouver dans les phagosomes tardifs. L’obtention d’un

pourcentage décrivant la capacité de survie à la digestion permettrait de comparer les

bactéries plus objectivement. Cela pourrait être réalisé en comparant le taux de survie de

monocultures de bactéries à ce même taux en co-culture avec le protozoaire d’intérêt. Il

faudrait déterminer un intervalle de co-culture suffisant pour s’assurer que les protozoaires

aient le temps d’ingérer et digérer les bactéries, puis lyser les protozoaires pour récupérer

les bactéries à l’intérieur au moment d’évaluer la viabilité, par exemple à l’aide d’une lyse

au sucrose 40% suivi d’un traitement à la saponine, qui peut tuer les cellules de

D. discoideum sans affecter la viabilité des bactéries (Benghezal et al., 2006). Une telle

méthode est cependant peu précise et ne permet pas de distinguer entre les bactéries

évitant la digestion et celles évitant l’ingestion elle-même. Il faudrait donc également

considérer par quel mécanisme la bactérie résiste à la digestion (Matz et Kjelleberg, 2005):

54

une bactérie qui ne se fait pas ingérer (trop grosse, trop rapide, filamenteuse) ne sera pas

enrobée. Une autre façon d’évaluer le pourcentage de digestion serait de comparer la

proportion de la bactérie d’intérêt se retrouvant dans les post-lysosomes versus la

proportion de billes de latex se retrouvant dans ces structures. Comme les billes de latex ne

sont pas digestibles par les protozoaires, celles-ci représentent un contrôle négatif de

digestion (Denoncourt et al., 2017a). Les post-lysosomes peuvent être détectés chez

D. discoideum à l’aide de l’anticorps H161 (Ravanel et al., 2001); cependant, un tel anticorps

n’est pas disponible chez tous les protozoaires et devrait être développé pour employer

cette technique.

Également, d’autres caractéristiques comme des activités métaboliques spécifiques

pourraient intervenir et influencer l’enrobage. Par exemple, lorsque les bactéries

pathogènes L. pneumophila et C. jejuni sont enrobées, l’enrobage est composé de couches

de membranes abondantes (Berk et al., 2008; Trigui et al., 2016), contrairement à ce qui

est observé ici avec des bactéries non pathogènes. Cependant, des bactéries non

pathogènes pourraient aussi possiblement avoir des activités métaboliques intervenant

dans l’enrobage ou dans la résistance à la digestion. Par exemple, il fut observé que la

souche de Cupriavidus sp. utilisée contenait des inclusions d’une nature inconnue (voir

figure S2 dans l’annexe A). Puisque l’espèce spécifique de Cupriavidus de cette souche n’a

pas été identifiée, il n’est pas possible de spécifier leur nature, mais l’espèce

Cupriavidus necator (précédemment appelée Alcaligenes eutropha, entre autres noms)

peut produire du polyhydroxyalkanoate, un plastique, et l’accumuler dans des inclusions

similaires à celles observées à notre souche (Anderson et Dawes, 1990; Vandamme et

Coenye, 2004). Il est envisageable que de telles inclusions puissent avoir un effet sur la

digestion par le protozoaire et possiblement favoriser l’enrobage.

Il serait primordial d’améliorer les protocoles de TEM présentement utilisés afin de les

optimiser pour les échantillons de bactéries enrobées. Tel qu’exposé au chapitre 2, le

processus actuel de préparation des échantillons semble endommager les bactéries

enrobées une fois éjectées. Bien qu’une solution provisoire ait été proposée, soit de

comparer les phagosomes tardifs aux bactéries enrobées exocytosées pour confirmer leur

intégrité, et d’observer les phagosomes tardifs seulement s’il le faut, un protocole mieux

adapté serait impératif pour la poursuite de l’étude de l’enrobage. Possiblement qu’en

altérant la vitesse ou le nombre de centrifugations requises pour la préparation

55

d’échantillons, l’intégrité de l’enrobage serait mieux préservée. Des tests d’optimisation

seraient nécessaires pour confirmer cela.

Une perspective intéressante serait d’étudier l’enrobage de bactéries avec des amibes ou

des ciliés issus de l’environnement, à grande échelle. Une souche de T. tropicalis issue d’un

biofilm de tour de refroidissement a déjà été utilisée pour étudier l’enrobage de

L. pneumophila, une bactérie pathogène associée à cet environnement (Berk et al., 2008),

mais il serait intéressant de tester plus d’isolats environnementaux avec plusieurs bactéries,

notamment des bactéries issues du même milieu que les protozoaires isolés. Une telle

étude permettrait de dresser un portrait plus représentatif de l’impact que l’enrobage de

bactéries pourrait avoir dans un environnement naturel et des possibles implications de cet

enrobage pour la santé humaine, par rapport à une étude centrée autour d’organismes qui

n’auraient pas nécessairement de contacts dans un environnement autre qu’un laboratoire .

Outre les caractéristiques de la bactérie elle-même, d’autres facteurs pourraient influencer

l’enrobage et constituent une perspective intéressante pour la poursuite de l’étude de

l’enrobage. Par exemple, le ratio bactéries:protozoaires pourrait être important dans la

formation de l’enrobage. Il a été observé que le nombre de bactéries présentes dans les

vacuoles alimentaires des ciliés pouvait interférer avec l’efficacité de la digestion (Thurman

et al., 2010). La taille du cilié à l’étude est un autre paramètre qui devrait être considéré,

particulièrement dans l’optique d’un effet potentiel du ratio bactéries:protozoaires (Fenchel,

1987). Étant donné que l’efficacité de la digestion dépend du nombre de bactéries par

vacuoles, au même ratio bactéries:protozoaires, et en assumant que les ciliés ingèrent

toutes les bactéries à leur disposition, un cilié de petite taille contiendrait plus de bactéries

dans ses vacuoles qu’un cilié de plus grande taille. Potentiellement, les petits ciliés

produiraient plus de bactéries enrobées que les gros ciliés au même ratio, car l’efficacité de

digestion serait moindre chez ces petits ciliés. Ainsi, il pourrait être intéressant de non

seulement tester différents ratios, mais également de les étudier avec des ciliés de

différentes tailles, idéalement similaires pour leurs autres caractéristiques.

Conclusion

En conclusion, ce projet de maîtrise a permis de mettre en lumière certains aspects des

interactions bactéries-protozoaires. Deux objectifs étaient visés : d’abord, de caractériser la

voie phagocytique d’amibes sociales environnementales (objectif A), puis, d’étudier l’impact

de certaines caractéristiques bactériennes sur la morphologie de l’enrobage produit par

56

deux ciliés du genre Tetrahymena (objectif B). En répondant à l’objectif A, présenté au

chapitre 1, il a été montré que des amibes sociales du genre Dictyostelium isolées de

l’environnement étaient capables de produire des CML. Ceci permet d’élargir notre

compréhension de ce phénomène et d’étoffer les théories voulant que les CML puissent

jouer un rôle important dans le métabolisme des amibes sociales. L’atteinte de l’objectif B,

présenté au chapitre 2, permit d’identifier l’hydrophobicité et la taille de la cellule bactérienne

comme facteurs d’intérêt dans la détermination de la morphologie de l’enrobage de

bactéries. Les résultats obtenus sont en accord avec l’hypothèse guidant ce projet, soit que

la production de CML et de bactéries enrobées serait un phénomène répandu chez les

protozoaires, possible avec différentes bactéries.

Malgré ces résultats, plusieurs aspects des relations protozoaires-bactéries restent à

éclaircir. En particulier, l’étude de la production de CML par diverses souches

environnementales d’amibes sociales a permis de mettre en évidence certains des

paramètres limitants qui font que pour le moment, la recherche de CML dans des

échantillons environnementaux reste un défi. Les outils nécessaires pour ce genre d’analyse

ne sont pas encore disponibles et leur développement serait primordial pour la poursuite de

l’étude de la production de CML. En effet, il serait essentiel de montrer in situ la production

de CML par des amibes sociales environnementales pour affirmer que ces structures ont

un rôle dans leur cycle de vie, que ce soit dans la communication intercellulaire ou comme

réserve de nourriture. Le développement de tels outils serait donc la prochaine étape pour

l’étude des CML et de leur production.

Plusieurs aspects restent à élucider en ce qui a trait à l’enrobage de bactéries. Bien que nos

résultats aient identifié l’hydrophobicité et la taille des bactéries comme des facteurs

déterminants pour la morphologie de l’enrobage, l’influence d’autres facteurs, incluant

certains qui n’ont pas été explorés dans ce projet de maîtrise, ne peut être exclue. Pour la

suite de la recherche sur l’enrobage, il peut être considéré que M. oxydans et M. luteus

seraient des bactéries intéressantes comme modèles pour étudier plus en profondeur

l’enrobage et ses ramifications. Ces deux souches étaient facilement enrobées par les ciliés

utilisés dans cette étude et l’enrobage était assez résistant aux traitements nécessaires pour

l’analyse, comparativement aux autres bactéries utilisées. Cependant, le raffinement des

méthodes utilisées pour minimiser les dommages à l’enrobage, entre autres en TEM, serait

capital pour la poursuite de l’analyse de l’enrobage de bactéries.

57

Les interactions protozoaires-bactéries sont complexes et spécifiques. Bien que ce projet

ait permis d’acquérir une nouvelle compréhension du sujet, bien d’autres questions restent

encore en suspens.

58

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Annexe A: Figure S2

Figure S2: Des inclusions de nature inconnue sont visibles dans le

cytoplasme de Cupriavidus sp. Les têtes de flèches indiquent deux inclusions. Les

inclusions semblent être rigides étant donné que les échantillons de TEM étaient souvent

abimés autour des inclusions, tel qu’indiqué par la flèche dans le bas de la figure. Certaines

espèces de Cupriavidus peuvent produire et accumuler des plastiques, mais sans

identification de cette souche, la nature des inclusions ne peut être confirmée.