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Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Escuela de Graduados
DT-diaforasa impide la formación de oligómeros
de αααα-sinucleína inducida por aminocromo
Tesis para optar al grado de Doctor en Bioquímica de
Sergio Patricio Cárdenas Muñoz.
Director de Tesis: Dr. Juan Ernesto Segura Aguilar
Santiago, Chile
2008
2
ÍNDICE
Indice 2
Indice de figuras 4
Lista de abreviaturas 6
Resumen 8
Abstrac 9
Introducción 10
Enfermedad de Párkinson 10
Oxidación de dopamina 10
DT-diaforasa 14
α-Sinucleína 15
Hipótesis 19
Objetivo general 19
Objetivos específicos 19
Materiales y métodos 20
Reactivos 20
Reactivos de biología molecular 22
Enzimas, anticuerpos y reactivos relevantes 22
Expresión y purificación de α-sinucleína recombinante 23
Preparación de bacterias competentes 24
Transformación de bacterias 24
Reacción de polimerización en cadena (PCR) 25
Inducción de la expresión y purificación de α-sinucleína 25
SDS-PAGE 28
Western blot 28
Tinción con plata 29
Tinción con azul de coomasie 29
Síntesis y purificación de aminocromo en resina Sephadex G-25-
80
29
Síntesis y purificación de aminocromo en resina CM-Sephadex C-
50-120
30 1H-NMR 30
3
Determinación de la actividad de DT-diaforasa sobre aminocromo
puro
31
Determinación de concentración de proteínas por método
Bradford
31
Ensayos de agregación 32
Dicroísmo circular 32
Fluorescencia de tioflavina T 33
Microscopía electrónica de transmisión 33
Cinética de unión de aminocromo con α-sinucleína 33
Resultados 35
Expresión y purificación de α-sinucleína humana recombinante 35
Síntesis y purificación de aminocromo 41
Inducción de la agregación de α-sinucleína durante la oxidación
de dopamina catalizada por tirosinasa
53
Agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo 56
Efecto de la reducción de aminocromo con un electrón en la
agregación de α-sinucleína
69
Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α-sinucleína
inducida por aminocromo
78
Discusión 86
Expresión y purificación de α-sinucleína recombinante humana 86
Síntesis de aminocromo 88
Inducción de agregación de α-sinucleína por aminocromo 90
Efecto de la reducción de aminocromo con un electrón sobre la
agregación de α-sinucleína
96
Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α-sinucleína
inducida por aminocromo
98
Proyecciones 100
Conclusiones 104
Mecanismo propuesto 105
Bibliografía 106
4
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Etapas de la oxidación de la dopamina hasta
aminocromo y neuromelanina
11
Figura 2. Ciclo rédox del aminocromo durante su reducción con un
electrón.
12
Figura 3. Esquema de expresión y purificación de α-sinucleína
humana recombinante en bacterias en tratamiento sin hervido de
muestras.
27
Figura 4. Determinación de expresión y pureza de α-sinucleína
humana recombinante de bacterias de expresión BL21(DE3)pLysS
pRK172/α-syn en tratamiento sin hervido de proteínas.
38
Figura 5. Esquema de expresión y purificación de α-sinucleína
humana recombinante en bacterias en tratamiento con hervido de
muestras
39
Figura 6. Determinación de expresión y pureza de α-sinucleína
humana recombinante de bacterias de expresión BL21(DE3)pLysS
pRK172/α-syn en tratamiento con hervido de proteínas.
40
Figura 7. Determinación de aparición de aminocromo por
oxidación de dopamina a distintos pH y distintos tiempos.
47
Figura 8. Separación de aminocromo por columna de exclusión
por tamaño a pH 6,0.
48
Figura 9. Espectros de absorción de eluidos derivados de la
oxidación de la dopamina.
49
Figura 10. Espectro H-NMR de eluido que contiene aminocromo
en D2O.
50
Figura 11. Separación de aminocromo por columna de excusión
por tamaño a pH 7,5.
51
Figura 12. Separación de aminocromo en columna de intercambio
catiónico.
52
Figura 13. Determinación de α-sinucleína en presencia de por
dopamina y tirosinasa
55
Figura 14. Agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo 63
5
purificado.
Figura 15. Determinación por microscopía electrónica de
estructuras globulares inducidas por aminocromo.
64
Figura 16. Determinación de la cinética de fibrilación de α-
sinucleína en presencia y ausencia de aminocromo.
65
Figura 17. Determinación de la estructura secundaria de α-
sinucleína en presencia y ausencia de aminocromo.
66
Figura 18. Inhibición de fibrilación e inducción de oligómeros de α-
sinucleína por aminocromo.
67
Figura 19. Determinación de la agregación α-sinucleína a
polímeros de bajo peso molecular por aminocromo.
68
Figura 20. Efecto de la citocromo C reductasa sobre la agregación
de α-sinucleína inducida por la dopamina al oxidarse con
tirosinasa.
73
Figura 21. Efecto del citocromo C reductasa sobre la agregación
de α-sinucleína inducida por aminocromo.
74
Figura 22. Efecto de la citocromo C reductasa sobre los cambios
en la velocidad de fibrilación de α-sinucleína que ejerce el
aminocromo, medidos por fluorescencia de tioflavina T.
75
Figura 23. Efecto de la citocromo C reductasa en los cambios
conformacionales de la α-sinucleína inducidos por el aminocromo.
76
Figura 24. Determinación de la disminución de los oligómeros de
α-sinucleína por la reducción de aminocromo con un electrón.
77
Figura 25. Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α-
sinucleína inducida por aminocromo.
82
Figura 26. Efecto de la DT-diaforasa sobre los cambios en la
velocidad de fibrilación de α-sinucleína que ejerce el aminocromo,
medidos por fluorescencia de tioflavina T.
83
Figura 27. Efecto de la DT-diaforasa en los cambios
conformacionales de la α-sinucleína inducidos por el aminocromo.
84
Figura 28. Determinación de oligómeros de α-sinucleína en la
incubación de α-sinucleína con aminocromo al reducirse por la DT-
diaforasa.
85
6
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ARE: elementos de respuesta antioxidante
BSA: Albúmina de suero de bovino
BCIP: 5-5bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
DAT: Transportador de dopamina
dATP: Desoxiadenosina trifosfato
dCTP: Desoxicitosina trifosfato
dGTP: Desoxiguanosina trifosfato
DTT: Ditiotreitol
dTTP: Desoxitimidina trifosfato
D2O: Óxido de deuterio
EP: Enfermedad de Parkinson
EROs: Especies reactivas de oxígeno
gr: Gramos
hrs: horas
Hz: Hertz
IPTG: Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosa
kDa: kilodalton
LB: Medio Luria-Bertoni
M: Molar
MES: Ácido morfolinoetano sulfónico
min: Minutos
ml: mililitros
NADH: Nicotinamida dinucleótido reducida
NADPH: Nicotinamida dinucleótido fosfato reducida
NBT: Azul de nitro tetrazolio
ng: nanogramos
nm: nanometro
nM: nanomolar
nmoles: nanomoles
O.N.: Toda la noche
P.A.: Grado para análisis
7
PCR: Reacción de polimerización en cadena
ppm: partes por millón
rpm: revoluciones por minuto
SDS: dodecil sulfato de sodio
SDS-PAGE: Gel de electroforesis de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio
seg: segundos
SOD: Superóxido dismutasa
TCA: Ácido Tricloroacético
TEMED: N,N,N´,N´-Di(dimetilamino)etano
TioT: tioflavina T
tris: tris-(hidroximetil)-aminometano
USA: Estados unidos de américa
VMAT: Transportador vescicular de monoaminas
xg: por gravedad
λ: Longitud de onda
µg: microgramos
µl: microlitros
µM: Micromolar
µmoles: micromoles
8
RESUMEN
La agregación de α-sinucleína se ha relacionado por varios autores con
la enfermedad de parkinson. Recientemente, se ha evidenciado por estudios in
vitro que la dopamina al oxidarse induce la agregación de α-sinucleína a
estructuras protofibrilares neurotóxicas, inhibiendo la formación de fibras de α-
sinucleína, mecanismo que se ha relacionado con la detoxificación de las
protofibras. Antecedentes sugieren que es el aminocromo, un derivado de la
oxidación de la dopamina, el responsable de estas acciones. Sin embargo,
todos los experimentos con aminocromo han sido realizados en presencia de
dopamina y agentes oxidantes.
En esta tesis se intentó demostrar por estudios in vitro que: (i) El
aminocromo puro puede inducir la agregación de α-sinucleína a protofibras,
inhibiendo la formación de fibras. (ii) La reducción de este aminocromo por la
enzima DT-diaforasa es un mecanismo protector que previene la formación de
protofibras de α-sinucleína. En esta tesis se desarrolló un método nuevo para
purificar aminocromo usando cromatografía de intercambio iónico. Para
demostrar que el aminocromo fue separado de dopamina y agentes oxidantes,
usamos espectroscopía UV-visible y 1H-NMR. El aminocromo se incubó con α-
sinucleína en distintas condiciones, observando: (i) agregación de α-sinucleína
a estructuras oligoméricas (precursoras de protofibras) por Western blot,
microscopía electrónica y dicroísmo circular y (ii) inhibición de fibrilación de α-
sinucleína, determinado por fluorescencia con tioflavina T, dicroísmo circular y
microscopía electrónica. Finalmente, se incubó aminocromo y α-sinucleína en
presencia de DT-diaforasa y se observó inhibición de la agregación de α-
sinucleína tanto a oligómeros como a fibras. Esta inhibición de la agregación de
α-sinucleína fue determinado por Western blot, microscopía electrónica,
fluorescencia con tioflavina T y dicroísmo circular. Además, se demostró que al
reducir aminocromo con un electrón por otra flavoenzima solo se disminuyó
levemente la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo.
9
ABSTRACT
The aggregation of α-synuclein have been related with Parkinson´s
disease for many scientifics. Recently, many in vitro studies have produced
evidences that the oxidation of dopamine induces the aggregation of α-
synuclein to neurotoxic protofibers and inhibits the fibrilization α-synuclein,
mechanisms which prevent the protofibrils formation. There are antecedents
sugesting that aminochrome, a product derived of the oxidation of dopamine, is
the responsible of this process. However, all the experiments with aminochrome
have been performed in the presence of dopamine and oxidizing agents.
The aim of this thesis was to demostrate with in vitro studies that: (i) The
aminochrome can induce the aggregation of α-synuclein to protofibers, inhibiting
the fibrils formation. (ii) The reduction of aminochrome by DT-diaphorase is a
protective mechanism to the formation of protofibers of α-synuclein. In this
thesis was developed a new method to purify aminochrome by using ionic
interchange chromatography. To demostrate that the aminochrome was
separated from dopamine and oxiding agents, we used UV-visible spectroscopy
and 1H-NMR. The aminochore was incubated with α-synuclein in different
conditions, detecting: (i) aggregation of α-synuclein to oligomers (precursors of
the protofibrils) for Western blot, electronic microscopy and circular dicroism and
(ii) inhibition of α-synuclein fibrilization detected with tioflavine T fluorescence,
circular dicroism and electronic microscopy. Finally, α-synuclein and pure
aminochrome was incubated with DT-diaphorase, showing that the aggregation
of α-synuclein to both, protofibers and fibrils was inhibited determined by
Western blot, tioflavine T fluorescence, circular dicroism and electronic
microscopy. Moreover, it was observed that the reduction of aminochrome with
one electron only decrease the aggregation of α-synuclein induced for
aminochrome.
10
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Parkinson
La enfermedad de Parkinson (EP), también conocida como Parkinson
Idiopático, es una enfermedad neurodegenerativa que afecta cerca del 2% de la
población sobre los 65 años (Lucking et al., 2000). Sintomáticamente, esta
enfermedad se caracteriza por: (i) temblor en extremidades durante el reposo;
(ii) bradikinesia; (iii) rigidez muscular, lo que conlleva dificultades al caminar,
escribir, hablar y perdida de expresión facial; (iv) flexión postural. La descripción
de la enfermedad se remonta al año 1817 por James Parkinson, sin embargo,
aún se desconoce el origen de la enfermedad (Siegal et al., 1999).
Fisiopatológicamente, esta enfermedad se caracteriza por la muerte de las
neuronas dopaminérgicas de la vía nigro-estriatal y por la aparición de
inclusiones proteicas dentro de estas neuronas, conocidas como cuerpos de
Lewy. Si bien, se ha observando que para el desarrollo de esta enfermedad
influyen factores genéticos, medioambientales y toxinas endógenas (Stanley,
2003), aún no se logra identificar el factor gatillante de ésta. Se ha aceptado
que el estrés oxidativo es un factor común involucrado directamente en los
procesos neurodegenerativos (Krostrzewa y Segura-Aguilar, 2002; Jenner,
1998). Para explicar la especificidad en la neurodegeneración dopaminérgica,
se han buscado mecanismos que puedan inducir estrés oxidativo
específicamente en estas células. Curiosamente, la oxidación de su
neurotransmisor dopamina es un mecanismo específico de estas células, capaz
de generar gran cantidad de radicales libres y especies reactivas del oxígeno
(EROs).
Oxidación de dopamina
El neurotransmisor dopamina es una catecolamina que a pH 7,4 y 37ºC
puede ser oxidada por oxígeno a través de una serie de pasos hasta
aminocromo, una quinona descrita como precursora del pigmento
neuromelanina (Zecca et al., 2001). Las etapas de la oxidación de la dopamina
son: (i) oxidación de dopamina a dopamina-o-quinona. Esta reacción puede ser
11
catalizada por metales como manganeso (Segura-Aguilar y Lind, 1989) o hierro
(Linert et al, 1996), enzimas como tirosinasa (Del Mármol y Beermann, 1996;
Cavalieri et al., 2002), prostaglandina H sintetasa (Hasting, 1995); (ii) La cadena
alifática se cicla espontáneamente en condiciones fisiológicas, transformando
su amina primaria a amina secundaria. La molécula formada se llama
leucoaminocromo; (iii) oxidación espontánea del leucoaminocromo hasta
aminocromo (Mason, 1948). Cada etapa, se representa en la figura 1
En las neuronas dopaminérgicas la oxidación de dopamina esta muy
controlada, ya que se cuentan con una serie de mecanismos para evitarla: (i)
Una vez sintetizada o recaptada, esta catecolamina es rápidamente
almacenada en las vesículas dopaminérgicas que mantienen un pH ácido,
evitando su oxidación al incorporar un H+ en las moléculas de dopamina. Estas
vesículas tienen el transportador vesicular de monoamínas (VMAT) que
transporta dopamina hacia el interior de la vesícula con gran eficiencia, de
manera de prevenir los aumentos de dopamina libre citoplasmática (Sulzer et
al., 2000); (ii) La dopamina puede ser metabolizada por la enzima
monoaminooxidasa A (MAO A), la cual es una enzima mitocondrial y puede
explicar en gran parte la disminución en los niveles de la dopamina no
almacenada en vesículas (Siegal et al., 1999); (iii) La dopamina en el espacio
extracelular puede ser metabolizada por la enzima catecol-o-metil transferasa
(COMT) catabolizando rápidamente la dopamina que difunde fuera del espacio
sináptico a 3-metoxitiramina (3-MT). (iv) conjugación de dopamina-o-quinona y
Figura 1. Etapas de la oxidación de la dopamina hasta aminocromo y neuromelanina
neuromelanina
aminocromo Dopamina-o-Quinona Dopamina
Dopamina-o-
semiquinona
polimerización
Peroxidasas H2O2
ciclado oxidación
Leukoaminocromo
I II III
12
aminocromo con glutatión, catalizado por glutatión transferasa-M2-2 (GST-M2-
2) y glutatión transferasa-M1-1 (GST-M1-1), generando una molécula muy
estable aun en presencia de moléculas oxidantes biológicas como radical
superóxido y peróxido de oxígeno (Baez et al., 1997; Segura-Aguilar et al.,
1997).
La sustancia nigra debe su nombre al color oscuro de esta zona debido a
la presencia de neuromelanina, la cual se concentra dentro de las neuronas
dopaminérgicas. La neuromelanina es un pigmento oscuro generado por la
polimerización de especies derivadas de la oxidación de la dopamina, como el
aminocromo (Sulzer et al., 2000). Esto evidencia que en estas neuronas, la
dopamina se oxida a pesar de los mecanismos descritos anteriormente. Este
pigmento aparece desde los 3 años de edad y aumenta constantemente
durante la vida, lo que nos sugiere una constante oxidación de dopamina desde
los primeros años de vida.
Tal como se describió anteriormente, la oxidación de la dopamina genera
especies reactivas, pero hay un segundo evento que es capaz de generar
grandes cantidades de EROs a partir de una pequeña cantidad de sustrato.
Este evento es la reducción del aminocromo con un electrón a
leucoaminocromo-o-semiquinona. Esta reducción, puede ser catalizada por una
serie de flavoenzimas reductasas presentes en las neuronas dopaminérgicas,
como citocromo C reductasa, citocromo P450 reductasa y otras flavoenzimas
(figura 2). Este leucoaminocromo-o-semiquinona, es un radical libre tan reactivo
en presencia de oxígeno, que no se ha podido mantener estable para su
análisis. (Baez et al., 1995; Segura-Aguilar et al., 1989; Segura-Aguilar et al.,
1998). Tal como se muestra en la figura 2, esta semiquinona puede volver a
oxidarse en presencia de oxígeno, generando el radical superóxido en un ciclo
rédox que solo termina al depletarse los niveles de NADH/NADPH y oxígeno
(Baez et al., 1995; Segura-Aguilar et al., 1998).
Leucoaminocromo -o- semiquinona
O2.-
NAD(P)H NAD(P)+
Flavoenzimas reductasas
Aminocromo O2
13
A partir de pequeñas cantidades de aminocromo, este ciclo rédox puede
ser capaz de: (i) liberar grandes cantidades del radical superóxido, lo que
implica un aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno. Si este peróxido
reacciona con hierro se induce la generación del radical hidroxilo, radical muy
reactivo y responsable de daño oxidativo en proteínas, lípidos y
oligonucleótidos. La sustancia nigra contiene una alta concentración de hierro
comparado con otras regiones cerebrales y aumenta con la edad hasta 10
veces en las últimas décadas de la vida (Zecca et al., 2001). Mas aún, se
encuentra aumentado en cerebros post-mortem de pacientes con EP (Sofic et
al., 1989; Oakley et al., 2007; Gerlach et al., 1994); (ii) provocar una
disminución en los niveles de NADPH, lo que puede generar una gran déficit en
los mecanismos de biosíntesis celular. Además, el NADPH es esencial para la
regeneración de glutatión reducido, molécula pilar en mecanismos antioxidantes
celulares (Berg et al., 2002); y (iii) provocar una disminución en los niveles de
NADH y oxígeno, lo que conlleva a un déficit energético por la disminución en la
síntesis de ATP (Graumann et al., 2002).
A la fecha, varios autores han mostrado evidencias del aumento de
EROs, inducción de daño oxidativo y muerte celular al promover la oxidación de
la dopamina en células. Al incubar células con D-anfetamina y metanfetamina,
drogas que inducen un aumento citoplasmático y extracelular de dopamina
(Sulzer et a, 1995), se indujo un aumento intracelular de EROs observando
daño oxidativo en proteínas, vacuolización de organelos intracelulares,
degeneración de neuritas y muerte celular (Cubells et al., 1994; Lotharius y
O´Malley, 2001; LaVoie y Hasting, 1999; Ricaurte et al., 1984; Sonsalla et al.,
1996). Además, se demostró que algunos de estos eventos pueden ser
evitados al depletar la dopamina de estas células previo a la incubación con D-
anfetamina y metanfetamina (Lotharius y O´Malley, 2001). Por otro lado, se
observó que la inducción de EROs y muerte celular mediada por 1-methyl 4-
phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), un inhibidor del complejo I
mitocondrial, se potencia por dopamina (Lotharius y O´Malley, 2000).
Figura 2. Ciclo rédox del aminocromo durante su reducción con un electrón.
14
DT-diaforasa
La DT-diaforasa (E.C.1.6.99.2, NAD(P)H quinona oxidoreductasa;
NQO1), es la única flavoenzima capaz de reducir quinonas con 2 electrones.
Esta enzima, utiliza indistintamente NADPH o NADH como cofactor y es
inhibida específicamente por dicumarol (Hosoda et al., 1974). Esta enzima
posee el 97% de la actividad reductasa total de neuronas dopaminérgicas de la
sustancia nigra de cerebro de rata (Schultzberg et al., 1998; Segura-Aguilar et
al., 1989). Se ha sugerido que la DT-diaforasa es una enzima protectora frente
a la toxicidad de la oxidación de la dopamina en neuronas dopaminérgicas,
debido a su capacidad para reducir aminocromo. Varios estudios apoyan esta
idea: (i) La toxicidad del cobre en células derivadas de sustancia nigra de rata
es dependiente de la inhibición de la actividad de la DT-diaforasa (Paris et al.,
2001); (ii) el efecto citotóxico del inhibidor específico de la MAO-A, amiflamina,
aumenta 2,4 veces en presencia del inhibidor específico de la DT-diaforasa,
dicumarol (Hurtado-Guzmán et al., 2002); (iii) la toxicidad del salsolinol en
cultivo de células derivadas de sustancia nigra de rata aumentó 2,5 veces en
presencia de dicumarol. (Martinez-Alvarado et al., 2001); (iv) solo
administración de manganeso junto a dicumarol en el haz nigro-estriatal de
cerebro de rata produce una conducta rotacional contralateral en la rata
estimulada con apomorfina, de igual manera que lo observado en ratas
lesionadas unilateralmente con hidroxidopamina. Estas mismas ratas mostraron
una rotación ipsilateral al ser estimuladas con d-amfetamina (Segura-Aguilar et
al., 2002); (v) se observó que un 10 % de pacientes con EP en china
presentaba el polimorfismo C609T de la DT-diaforasa, presentándolo como un
factor de riesgo para desarrollar EP (Jiang et al., 2004); (vi) el hierro y dopamina
en presencia de dicumarol, induce una neurodegeneración mayor al 50 % sobre
células derivadas de hipotalamo de rata (Paris et al., 2005) ; (vii) la exposición
de células derivadas de sustancia nigra de rata con dopamina y reserpina, a
concentraciones capaces de inhibir VMAT y dicumarol, inducen una muerte
mayor que cuando se incubó dopamina junto reserpina a concentraciones que
15
solo inhibieron el transportador VMAT ya que reserpina demostró ser un
inhibidor de la DT-diaforasa (Ki= 34 µM) (Fuentes et al., 2007).
αααα-Sinucleína y EP
Otra característica de la EP es la aparición de grandes estructuras
eosinófilas compuestas de proteínas dentro de las neuronas dopaminérgicas
llamadas cuerpos de Lewy. Los cuerpos de Lewy son inclusiones esféricas de
8-30 µmetros de diámetro de ubicación perinuclear, compuestas por varios tipos
de proteínas como proteínas del citoesqueleto, del sistema ubiquitin-proteásico
y de shock térmico. El mayor componente de los cuerpos de Lewy son
homopolímeros fibrilares de una proteína citoplasmática llamada α-sinucleína.
La α-sinucleína tiene importancia en los estudios sobre el mecanismo de
generación de la EP, debido a los siguientes antecedentes: (i) polímeros
fibrilares de α-sinucleína son el principal componente de los cuerpos de Lewy
(Spillantini et al.,1998); (ii) se ha observado que los polimorfismos A53T, A30P y
E46K en la α-sinucleína causan una forma autosómica dominante de EP
familiar de desarrollo temprano (Polimeropoulos et al., 1997; Krüger et al., 1998;
Zarranz et al., 2003); y (iii) una porción de la α-sinucleína (residuos 61-95),
conocido como el componente no-Aβ de la placa (NAC), fue identificado como
un componente de la fracción insoluble del homogenizado de un cerebro con
enfermedad de Alzheimer (Masliah et al., 1996) .
La α-sinucleína es una proteína citoplasmática de 140 aminoácidos con
expresión ubicua en todo el sistema nervioso central. Se ubica principalmente
en los terminales presinápticos (revisado en Lücking y Brice, 2000). Esta
proteína monomérica se encuentra normalmente unida a membrana con una
conformación preferentemente de hélice-α (Elezier et al., 2001) ó en el
citoplasma con conformación de ovillo al azar (Weinreb et al., 1996). Aún se
desconoce la función de esta proteína, pero se ha asociado con la regulación
de la liberación de dopamina al espacio sináptico provocada por estímulos
nerviosos (Abeliovich et al., 2000) y con una función relacionada con la
regulación de la plasticidad neuronal (George et al., 1995; Petersen et al., 1999;
Hsu et al., 1998; Bayer et al., 1999; Seo et al., 2002). Bajo ciertas condiciones,
16
como aumento en la temperatura, aumento de la concentración de α-sinucleína,
disminución del pH, presencia de solventes orgánicos, estrés oxidativo,
presencia de metales como hierro y cobre, presencia de toxinas exógenas
como MPTP y rotenona ó factores genéticos como los polimorfismos en la α-
sinucleína, se induce la agregación de la α-sinucleína hasta estructuras
fibrilares tipo amiloides, las cuales son muy similares a las observadas como
componente de los cuerpos de Lewy (Uversky et al., 2001a; Hashimoto et al.,
1998; Giasson et al., 1999; Munishkina et al., 2003, Souza et al., 2000;
Hashimoto et al., 1999; Uversky et al., 2001b y 2001c; Giasson et al., 2000;
Conway et al., 2000b; Paik et al,1999; Vila et al., 2000; Betarbet et al., 2000).
Estas estructuras están compuestas de muchas unidades proteicas que
adquieren conformación sábana-β plisada y de esta manera pueden formar
fibras de 50-700 nanometros (nm) de largo y entre 5-15 nm de diámetro
(Conway et al., 2000b; Spillantini et al., 1998).
Se ha evidenciado ampliamente que agregados de α-sinucleína son
altamente tóxicos para la neurona y que la agregación de la α-sinucleína está
relacionada con neurodegeneración y el desarrollo de problemas motores en
modelos animales. La expresión de α-sinucleína humana en ratones
transgénicos indujo la aparición de inclusiones que contenían α-sinucleína.
Estas inclusiones provocaron una disminución en la cantidad de terminales
dopaminérgicos en el núcleo estriado y déficit motor en ratones (Masliah et al.,
2000; Lee et al., 2002). La expresión de α-sinucleína humana en Drosófilas
indujo la aparición de inclusiones proteicas citoplasmáticas compuestas de
fibras similares a los cuerpos de Lewy. En estas moscas se observó
degeneración específica de neuronas dopaminérgicas, un mecanismo
dependiente de la edad, y problemas motores (Feany and Bender, 2000). Ratas
que expresaron α-sinucleína humana, tanto la forma nativa como las variantes
A30P y A53T, mostraron degeneración específica de neuronas dopaminérgicas
y una aparición de inclusiones no fibrilares de α-sinucleína (LoBianco et al.,
2002). Se ha observado que agregados de α-sinucleína interfieren con la
actividad mitocondrial, incrementando la producción de radicales libres y
17
disminuyendo la cantidad de ATP disponible. Esto fue observado en cultivos
celulares humanos (Sherer et al., 2002) y murinos (Hsu et al., 2000), y se
observó muerte celular en cultivos celulares derivados de humanos, SH-SY5Y
(El-Agnaf et al., 1998). Sin embargo, las evidencias sugieren que los
agregados de α-sinucleína que inducen toxicidad no son las fibras, sino unas
estructuras oligoméricas posiblemente precursoras de las fibras llamadas
protofibras (Spillantini et al., 1998; Conway et al., 2001b). Se sugirió que la
formación de fibras, y luego de cuerpos de Lewy, es un mecanismo protector de
la célula para detoxificarla de los oligómeros, ó protofibras de α-sinucleína
(Olanow et al., 2004). Tompkins y Hills propusieron que las neuronas
dopaminérgicas de la sustancia nigra que contienen cuerpos de Lewy son
menos vulnerables a la apoptosis que las neuronas dopaminérgicas sin cuerpos
de Lewy (Tompkins y Hills, 1997). De hecho, se han descrito pacientes con EP
sin presencia de cuerpos de Lewy. Dentro de este grupo se encuentran los
pacientes con EP familiar por polimorfismo en el gen de la parkina (Mori et al.,
1998). Los cuerpos de Lewy podrían corresponder a una estructura celular
protectora llamada agresoma (Tanaka et al., 2004). Existe gran similitud entre
los cuerpos de Lewy y los agresomas con respecto a organización, contenido
proteico y localización intracelular (Lee y Lee, 2002; Fabunmi et al., 2000). Los
agresomas tienen como función eliminar proteínas citoplasmáticas mal
empaquetadas o polimerizadas que no pueden ser degradadas por el sistema
ubiquitin-proteásico (Johnston et al., 1998). Por lo tanto, la toxicidad estaría
relacionada con la formación de oligómeros o protofibras de α-sinucleína y la
fibrilación de α-sinucleína, de esta manera la formación de los cuerpos de Lewy
sería un mecanismo protector.
Aún no esta muy claro el mecanismo tóxico de los oligómeros sobre la
célula. Se ha descrito que los oligómeros de α-sinucleína pueden agregarse
entre sí y formar estructuras tipo anillo, lo que no se ha observado para la forma
monomérica ó fibrilar. Estas estructuras de anillo pueden incorporarse en las
membrana y formar poros (Volles et al., 2001; Volles y Lansbury, 2002; Ding et
al., 2002) e incluso romper paredes de organelos celulares (Gosavi et al., 2002).
Si esto ocurriera en mitocondrias y vesículas dopaminérgicas se podría explicar
18
el daño mitocondrial y estrés oxidativo observado en la EP, ya que la
perforación de las vesículas dopaminérgicas liberarían gran cantidad de
dopamina al citoplasma provocando así un gran evento oxidativo, tal como ya
se describió anteriormente.
Se ha observado que ciertas modificaciones oxidativas en la α-sinucleína
monomérica, como oxidaciones en las metioninas (Uversky et al., 2002) ó
nitración de tirosinas (Uversky et al., 2005), inducen la agregación de α-
sinucleína hasta oligómeros estabilizados de α-sinucleína, previniendo la
formación de fibras. (Fink, 2006). Este mismo fenómeno ocurre con la forma
A30P de α-sinucleína sin necesidad de modificación oxidativa (Conway et al.,
2000a). En el año 2001, Lansbury y colaboradores demostraron que la
dopamina induce la agregación de α-sinucleína a oligómeros estables, que no
forman fibras, en un mecanismo que fue inhibido por antioxidantes (Conway et
al., 2001). Esto sugirió que fue una molécula derivada de la oxidación de la
dopamina la que indujo esta agregación. En publicaciones recientes, se ha visto
que el aminocromo en presencia de dopamina y agentes oxidantes induce la
formación de oligómeros de α-sinucleína (Norris et al., 2005; Cappai et al.,
2005).
Estos antecedentes, nos llevaron a proponer que la reducción de aminocromo
con un electrón puede aumentar la formación de oligómeros estabilizados de α-
sinucleína, y que la DT-diaforasa puede prevenir esta formación de oligómeros.
19
HIPÓTESIS
La DT-diaforasa inhibe in vitro la agregación de αααα-sinucleína inducida
durante el metabolismo reductor de aminocromo con u n electrón.
OBJETIVO GENERAL
Demostrar por estudios in vitro, que la reducción de aminocromo con un
electrón aumenta la agregación de α-sinucleína observada durante la oxidación
de la dopamina y luego demostrar que la DT-diaforasa es capaz de prevenir
esta agregación de α-sinucleína.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Obtener α-sinucleína humana recombinante.
2. Preparar y purificar aminocromo.
3. Comprobar por estudios in vitro, que el aminocromo puro es capaz de
inducir la agregación de α-sinucleína humana estabilizando la estructura
oligomérica e inhibiendo la fibrilación de α-sinucleína.
4. Comprobar por estudios in vitro, que la reducción de aminocromo con un
electrón aumenta la capacidad del aminocromo de inducir la agregación
de α-sinucleína.
5. Demostrar por estudios in vitro, que la DT-diaforasa disminuye la
agregación de α-sinucleína inducida por la reducción de aminocromo con
un electrón.
20
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
Reactivo Proveedor
Triptona-peptona Difco (Kansas city, Missouri, USA)
Agar Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)
Extracto de levadura Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)
Glicerol Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)
Metanol (P.A.) Merck (Darmstadt, Alemania)
Etanol (P.A.) Merck (Darmstadt, Alemania)
Metanol (Grado técnico) TCL (Santiago, Chile)
Etanol (Grado técnico) TCL (Santiago, Chile)
Isopropanol (P.A.) Merck (Darmstadt, Alemania)
Cloruro de sodio Merck (Darmstadt, Alemania)
Hidróxido de sodio Merck (Darmstadt, Alemania)
Ácido clorhídrico Merck (Darmstadt, Alemania)
Persulfato de amonio Merck (Darmstadt, Alemania)
Ácido acético glacial Merck (Darmstadt, Alemania)
Cloruro de calcio, Merck (Darmstadt, Alemania)
Ácido nítrico Merck (Darmstadt, Alemania)
Ácido tricloroacético Merck (Darmstadt, Alemania)
Carbonato de sodio Winkler (Santiago, Chile)
Tween 20 Winkler (Santiago, Chile)
Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosa
(IPTG)
Winkler (Santiago, Chile)
Tampón Tris-base Winkler (Santiago, Chile)
Sulfato amonio Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Tampón MES Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Glicina Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Resinas Sephadex G25-80 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
21
Resina CM Sephadex c-50-120 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Resina DEAE Sephadex a-50-120 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
ácido sulfosalicílico Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Formaldehído Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Ponceaou S Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Dicumarol Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA)
Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
D2O Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Albúmina de suero de bovino (BSA) Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Acrilamida Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA)
bis-acrilamida Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA)
TEMED Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA)
coomasie brilliant blue G-250 Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA)
membrana de nitrocelulosa de 0,2
µm de poro Trans-Blot
Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA)
coomasie brilliant blue R250 Biorad Laboratories (Hercules, CA, USA)
azul de bromofenol J.T. Baker (Pillipsburg, USA)
dicromato de potasio J.T. Baker (Pillipsburg, USA)
Nitrato de plata TCL (Santiago, Chile)
Ampicilina USbiological (Swampscott, USA)
Cloranfenicol (Inyectable) Laboratorio Chile (Santiago, Chile)
leche descremada calcio plus Svelty de Nestle chile SA. (Santiago,
Chile)
ácido fosfórico Mallinckodt Baker S.A. (Xalostoc, Estado
de México, México)
22
Reactivos de biología molecular
dATP,dTTP, dGTP y dATP Promega Inc. (Madison, WI, USA)
Taq polimerasa Promega Inc. (Madison, WI, USA)
agarosa Invitrogen corp. (California, USA)
bacterias DH5α Invitrogen corp. (California, USA)
Plasmidio BL21(DE3)pLys S Invitrogen corp. (California, USA)
kit UltraCleanTM Mini Plasmid
prep
MoBio Lab. Inc., (Solana Beach, USA)
Ditiotreitol (DTT) Fisher Chemical (Pittsburg, PA, USA)
Dodecil sulfato de sodio (SDS) Qbiogen Inc. (Irvine, CA, USA)
Tampón Tris Winkler (Santiago, Chile)
Oligonucleótidos partidores de
PCR
Centro de síntesis y análisis de biomoléculas
TAG Copenhagen A/S Symbion, Fruebjergvej
3 DK-2100 Copenhagen, Dinamarca
BCIP/NBT Zimed Laboratories Inc (Sn. Francisco, CA,
USA)
Anticuerpos, enzimas y reactivos relevantes
Nombre Reactivo Número
catalogo
Proveedor
citocromo C C-2506 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
Nicotinamida adenina
dinucleótido (NADH)
N-4505 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
dopamina CH-9470 Fluka Biochemica (Buchs, Swizerland)
menadiona M-5625 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
anticuerpo policlonal anti
α-sinucleína preparada
PC325 Oncogene Res. Prod. (San Diego,
USA)
23
en cobayo
anticuerpo policlonal anti
α/β-Synuclein humana
preparada en cabra
SC-7012 Santa Cruz Biotechnology Inc.
(California, USA)
IgG anti-goat-AP SC-2351 Santa Cruz Biotechnology Inc.
(California, USA)
IgG anti-guinea pig-AP A5062 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
citocromo C reductasa
tipo I
C-3381 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
superóxido dismutasa
(SOD)
S-4761 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
catalasa C-9322 Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
tirosinasa T-3824-
50kU
Sigma-aldrich co. (St. Louis, USA)
α-sinucleína humana
recombinante
575001 Calbiochem (La jolla, CA, USA)
DT-diaforasa Extraida de citosol de hígado de rata y
purificada por el Dr. Segura-Aguilar
según se describe en Beyer et al,
1996
Expresión y purificación de αααα-sinucleína humana recombinante
Para la expresión de α-sinucleína recombinante, se ocupó el plasmidio
de expresión en bacterias pRK172/α-syn wt donado generosamente por el Dr.
Ischiropoulos (Centro Médico de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, USA).
Para el clonamiento y amplificación de este plasmidio, se ocuparon bacterias
DH5α. La expresión de la proteína recombinante se realizó en bacterias
BL21(DE3)pLysS, las que incluyen un plasmidio para expresión de lisosima el
24
cual sirve para disminuir la concentración de α-sinucleína en la bacteria y así
evitar su agregación por alta concentración.
Preparación de bacterias competentes
Se sembró bacterias DH5α en placas con agar-LB (1,5 % Agar, 1 %
triptona peptona, 0,5 % extracto de levadura, 1 % NaCl. Todo ajustado a pH
7,0 con NaOH) ó bacterias BL21(DE3)pLysS en placas de agar-LB con 35
µM/ml de cloranfenicol y se dejó crecer por 16-20 Horas (hrs). Se picaron
colonias al azar, transfiriendo cada una a 100 ml de medio LB (1 % Triptona
peptona, 0,5 % Extracto de levadura, 1 % NaCl; todo ajustado a pH 7,0 con
NaOH). Se crecieron por 3 hrs. a 37 ºC con agitación fuerte y se centrifugaron a
2000 xg. por 10 minutos (min) a 4 ºC. Se extrajeron completamente los
sobrenadantes y cada precipitado se lavó con 10 ml de solución 0,1 M CaCl2
frío. Se centrifugaron a 1400 xg por 10 min. a 4 ºC eliminando completamente
los sobrenadantes. Los precipitados se resuspendieron en 4 ml de CaCl2 frío y
se mantuvieron por 24 hrs. a 4 ºC para la transformación de bacterias.
Transformación de bacterias
Se transfirió 200 µl de bacteria competente en un tubo estéril y se agregó
50 ng de plasmidio. Se incubó en hielo por 30 min, luego en un baño a 42 ºC
por 90 segundos (seg) y finalmente se trasladó al hielo, manteniéndolo por 2
min. Se agregó 800 µl de medio LB y se incubó por 45 min a 37 ºC. Las
bacterias transformadas se sembraron en placas de Agar-LB con antibiótico
(para DH5α pRK172/α-syn, 100 µg/ml Ampicilina; para BL21(DE3) pLysS,
pRK172/α-syn, 100 µg/ml Ampicilina + 35 µg/ml cloranfenicol). Se dejó crecer
por 16-20 hrs y se picaron 10 colonias al azar por placa. Cada colonia picada se
creció por separado en 10 ml de medio LB con el antibiótico respectivo, por toda
la noche (O.N.) a 37 ºC con agitación fuerte. El plasmidio de cada cultivo se
extrajo con el kit de extracción plasmidial UltraCleanTM Mini Plasmid prep, según
las instrucciones del proveedor. Una alícuota de cada colonia cultivada fue
almacenada a –80 ºC en medio LB-glicerol al 15% (15% Glicerol, 1 % triptona
peptona, 0,5 % extracto de levadura, 1 % NaCl. Todo ajustado a pH 7,0 con
25
NaOH). La presencia del plasmidio con inserto en las colonias seleccionadas se
confirmó realizando una reacción de PCR con partidores específicos para α-
sinucleína humana.
Reacción de polimerización en cadena (PCR)
Cada reacción de PCR se realizó mezclando 1x de tampón de taq
polimerasa comercial, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada uno de los
deoxinucleótidos (dTTP, dGTP, dCTP, dATP), 0,4 µM de cada partidor
específico, 1 U de Taq polimerasa (Promega, Madison, USA) y 300 ng de
plasmidio templado, según instrucciones del proveedor de la enzima taq
polimerasa. Cada mezcla de reacción contenida en tubos para PCR, se puso
en un equipo termociclador Techgene modelo ftgene5d (Techne Inc, Burlington,
USA) para correr el programa de PCR descrito a continuación. Se inició con una
denaturación por 5 min a 95 ºC, luego con 30 ciclos de amplificación que
incluyen: 30 seg a 95 ºC, 30 seg. a 57 ºC y 1 min a 72 ºC, y se terminó con 10
min a 72 ºC. Los partidores específicos que se usaron fueron Ha-syn F: 5´-
AGGACTTTCAAAGGCCAAGG-3´ y Ha-syn R: 5´-
TCCTCCAACATTTGTCACTTGC3´. Este juego de partidores sirve para
transcribir un fragmento de 186 pb correspondiente a los nucleótidos 441-627
del mensajero para α-sinucleína Humana (número de acceso NM_000345 de la
base de datos Blast) y fueron diseñados en nuestro laboratorio usando el
programa Gene Runner (Hastings software Inc., New York, USA).
Inducción de la expresión y purificación de αααα-sinucleína recombinante
humana
La inducción de la expresión y purificación de α-sinucleína recombinante
humana se realizó en varias etapas, tal como se describe a continuación y se
representa en el esquema 3: (i) Los clones BL21(DE3) pLysS, pRK172/α-syn wt
se cultivaron en 10 ml de medio LB a 37 ºC O.N. con agitación fuerte. Se
subcultivaron en 500 ml de medio LB creciendo por 4 hrs a 37 ºC con agitación
fuerte hasta una densidad óptica de 0,4. Para inducir la expresión se agregó
isopropyl-beta-D-tiogalactopiranosa (IPTG) hasta una concentración de 0,5 mM
y se incubó durante la noche a 30 ºC con agitación fuerte; (ii) Se centrifugó por
26
5 min a 2000 xg a 4 ºC, eliminando el medio LB. Se resuspendió el precipitado
en 50 ml de 25 mM Tris-HCl pH 8,0. Se volvió a centrifugar por 5 min a 20000
xg a 4 ºC y el precipitado se resuspendió en 5 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,5,
50mM NaCl, 5% glicerol; (iii) La suspensión bacteriana se congeló
sumergiéndola en nitrógeno líquido y luego se descongeló sumergiéndola en un
baño de agua a 70ºC. Este paso se repitió 3 veces. Se agregó 1,5 mg de
lisozima y se incubó por 20 min a la temperatura del medio ambiente (no
controlada); (iv) Se agregó sulfato de amonio al 30% de saturación y se
centrifugó a 20000 xg por 20 min. a 4 ºC conservando el sobrenadante
(sobrenadante I); (v) Al sobrenadante I, se agregó sulfato de amonio hasta
lograr un 50% de saturación. Se centrifugó a 20000 xg por 20 min a 4 ºC,
conservando el precipitado (precipitado II); (vi) El precipitado II se resuspendió
en tampón 25 mM Tris-HCl pH 8. Se paso por una columna con 30 x 0,7 cm de
resina Sephadex G-25-80, conservando solo las fracciones de elución que
absorbieron a 280 nm de longitud de onda (eluidos G-25); (vii) Estos eluidos se
juntaron y se cargaron en una columna con 15 ml resina DEAE Sephadex A50-
120 previamente equilibrada en 25 mM tampón Tris-HCl pH 8,0. Se recuperó
cada eluido determinando la presencia de proteínas con el reactivo de Bradford.
Solo eluyó la proteína con tampón 50 mM Tris-HCl pH 8,0 + 500 mM NaCl. Se
identificó la presencia de α-sinucleína por Western blot incubado con
anticuerpo policlonal anti-α-sinucleína y la pureza por geles de poliacrilamida
con SDS (SDS-PAGE) al 10%, teñidos con azul de coomasie y/ó tinción con
plata. La concentración de α-sinucleína se determinó midiendo la absorbancia a
280 nm considerando ε280nm = 5600 M-1 cm-1(Hoyer et al, 2002).
27
Precipitado I Sobrenadante I
Sulfato de amonio 50% saturación
Precipitado II Sobrenadante II
Resuspendido I
Eluido G-25
Eluido DEAE A-50
25 mM Tris pH 8
Paso por columna con Sephadex G-26-80
Separación por columna con DEAE-Sephadex A-50-120
vii
vi
v
Sulfato de amonio 30% saturación
BL21(DE3)pLysS pRK172/α-syn wt (densidad optica de 0,4)
0,5mM de IPTG . O.N. horas a 30ºC con agitación
Centrifugación 2000 xg
precipitado de bacterias
25 mM Tris pH 7,5; 50 mM NaCl; 5% glicerol
Lisis bacteriana
Congelado(N2 liq)/ descongelado (70º)
300 µg/ml lisozima
Resuspendido bacteriano
iii
i
iv
ii
28
Figura 3. Esquema de expresión y purificación de αααα-sinucleína humana recombinante en bacterias. SDS-PAGE
Se ocuparon geles de poliacrilamida en condiciones desnaturantes (SDS-
PAGE) a distintas concentraciones, según el experimento. SDS-PAGE como gel
separador 10-12 % de acrilamida/bis-acrilamida (de proporción 29:1), 375 mM
Tris-HCl pH 8,8, 0,1 % dodecil sulfato de sodio (SDS), 0,1 % persulfato de
amonio, 0,04 % TEMED) y como gel concentrador 5 % acrilamida/bis-acrilamida
( de proporción 29:1), 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1 % SDS, 0,1 % persulfato de
amonio, 0,1 % TEMED). Las muestras proteicas se incubaron en un baño de
agua caliente a 100 ºC por 5 min. con tampón desnaturante (50 mM Tris-HCl pH
6,8, 100 mM ditiotreitol (DTT), 2 % SDS, 0,1 % azul de bromofenol, 10 %
glicerol) y se cargaron en gel SDS-PAGE previamente montado en un equipo
de electroforesis con tampón de corrida (25 mM Tris-HCl pH 8,3, 250 mM
glicina, 0,1 % SDS). Se corrió por 20 min a 50 volt y luego 60 min a 100 Volt.
Western blot
Luego de la electroforesis, el gel SDS-PAGE se montó sobre una
membrana de nitrocelulosa de 0,2 µm de poro, dentro de un equipo de electro
transferencia. Se transfirió en solución de transferencia (39 mM glicina, 48 mM
Tris-HCl pH 8,3, 0,037 % SDS, 20 % metanol) a 300 mA por 1 hr Luego de la
electro transferencia, la membrana se bloqueó con 0,5 % leche descremada
Svelty en TBS-Tween (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,025 % Tween
20) por 4 hrs Se incubó con anticuerpo policlonal de coballo anti α-sinucleína o
anticuerpo de cabra anti α/β-Sinucleína toda la noche con agitación suave a la
temperatura del ambiente del laboratorio y se lavó con TBS-Tween por 5 min 2
veces. Se lavó con TBS (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl ) por 5 min. Se
incubó con anticuerpo secundario acoplado a fosfatasa alcalina. Se lavó 3
veces con TBS por 5 min cada lavado y finalmente se incubó cada membrana
con 5 ml de solución de BCIP/NBT, preparada según indicaciones del
proveedor.
29
Tinción plata
Las proteínas se fijaron incubando el gel SDS-PAGE en 136 mM de
ácido sulfosalicílico, 0,7 M TCA y 30 % metanol por 60 minutos. El gel se lavó 3
veces en 10 % etanol, 5 % ácido acético por 5 minutos cada lavado. Se incubó
en 3,4 mM de K2Cr2O7; 3,2 mM HNO3 por 5 min en oscuridad. Se lavó 3 veces
con agua por 1 min cada lavado. Se incubó por 25 minutos en 120 mM de
AgNO3 en oscuridad. Se lavó 3 veces con agua por 1 min cada lavado. Se
incubó por 10-20 min en 280 mM de Na2CO3 en 0,05% de formaldehído. Se
detuvo la reacción con 1% de ácido acético.
Tinción con azul de Coomasie.
El gel SDS-PAGE con las proteínas separadas se sumergió en solución
de coomasie (0,25 % de azul brillante de Coomasie R250; 10 % ácido acético;
45 % metanol) por 4 hrs a temperatura ambiente. La solución de Coomasie se
recuperó y se agregó al gel solución de desteñido de tinción de coomasie (10 %
ácido acético; 45 % metanol). Se incubó por 5 hrs a temperatura ambiente con
dos cambios de solución de desteñido entre medio.
Síntesis y Purificación de aminocromo en resina Sep hadex G-25-80
Se incubó 0,5 µmoles de dopamina y 1 ng de tirosinasa en 0,1 ml de 25
mM MES pH 6,0 por 10 min a 25 ºC. Para purificar el aminocromo formado, se
cargó la solución de incubación en una columna con 6 x 0,4 cm de resina
Sephadex G-25-80 el cual se eluyó con 3 ml de tampón 25 mM MES pH 6,0. El
eluido de la columna fue recuperado en alícuotas de 100 µl. Cada alícuota fue
monitoreada espectrofotométricamente por absorbancia a 280 nm, 478 nm y
600 nm de longitud de onda (λ). El aminocromo se recuperó puro entre 700-
1100 µl de eluido. La determinación de la presencia y pureza de aminocromo
fue determinada por espectroscopia UV-visible y 1H-NMR. La determinación de
la concentración de aminocromo fue determinada espectroscópicamente
usando el valor de 3058 M-1cm-1 como coeficiente de extinción molar a 478 nm
de λ (Segura-Aguilar et al, 1989)
30
Síntesis y Purificación de aminocromo en resina CM- Sephadex C-50-120
Se incubó 7,5 µmoles de dopamina y 15 ng de tirosinasa en 1,5 ml de 25
mM MES pH 6,0 por 10 min a 25 ºC. Para purificar el aminocromo formado, se
cargó la solución de incubación en una columna con 17 x 0,7 cm de resina CM-
Sephadex C-50-120 el cual se eluyó primero con 13 ml de tampón 25 mM MES
pH 6,0 y luego con 10 ml de tampón 25 mM MES pH 6,0, 300 mM NaCl. El
eluido de la columna fue recuperado en alícuotas de 500 µl. Cada alícuota fue
monitoreada espectrofotométricamente por absorbancia a 280 nm, 478 nm y
600 nm de longitud de onda. El aminocromo se recuperó puro entre 5-7 ml de
eluido con 25 mM MES pH 6,0; la dopamina se recuperó solo después de 5 ml
de 25 mM MES pH 6,0, 300 mM NaCl. La determinación de la presencia y
pureza de aminocromo fue determinada por espectroscopia UV-visible y 1H-
NMR.
H-NMR
Se hidrató y equilibró resina Sephadex G-25-80 con oxido de deuterio.
Se incubó 5 µmoles de dopamina y 10 ng de tirosinasa en 1 ml de óxido de
deuterio por 15 min a 25 ºC. Se cargó la solución de incubación en una columna
con 6 x 0,4 cm de resina Sephadex G-25-80 equilibrada en oxido de deuterio.
La columna se eluyó con oxido de deuterio. Cada alícuota fue monitoreada
espectrofotométricamente por absorbancia a 478 nm de longitud de onda. Se
recuperó la alícuota que absorbió a 478 nm de λ y se comprobó su espectro de
absorción con picos a 220, 295 y 478 nm. Se almacenó en hielo e
inmediatamente se transportó en un envase térmicamente aislado para su
determinación por resonancia magnética nuclear de protones.
Los espectros de 1H-NMR fueron realizados usando instrumento z-
gradient Bruker Avance 400 instrument, operándolo a 400 MHz con supresión
de la señal de agua. El programa de pulso fue zg-30 y la duración de el
experimento fue de 300 minutos. La obtención y análisis de los espectros de 1H-
NMR, fueron realizados por el Dr. Patricio Iturriaga (Departamento de Química,
facultad de Ciencias. Universidad de Chile)
31
Determinación de actividad reductasa de DT-diaforas a sobre aminocromo
puro
Para determinar parámetros cinéticos, se incubó 0,3-6 µg/ml de DT-
diaforasa con 250 µM NADH, 5-50 µM de aminocromo, en presencia o
ausencia de 10 µM de dicumarol, en 25 mM de Tris-HCl pH 7,5. La reacción se
realizó en el siguiente orden. Se preparó dentro de una cubeta plástica para
absorción UV-visible el medio de reacción: NADH y tampón en presencia o
ausencia de dicumarol y se midió esta solución como blanco de absorción.
Luego se agregó el aminocromo y se comenzó a medir las absorciones a 478
nm y 600 nm cada 0,5 seg por un tiempo de 90 seg en el equipo
espectroscópico UV-visible Agilent 8453. A los 15-20 seg se agregó la DT-
diaforasa y se determinó la disminución en la absorbancia a 478 nm de λ
(aminocromo absorve a 478 nm de λ). Cada valor de absorción a 478 nm se
transformó a concentración de aminocromo usando el coeficiente de extinción
molar de 3058 M-1 . cm-1. Las velocidades iniciales correspondieron a las
pendientes de los primeros puntos de las curvas dibujadas al graficar
concentración de aminocromo versus tiempo. Se consideró un aumento en la
absorbancia a 600 nm como polimerización de aminocromo a neuromelanina
(Riley P.A., 1997; Linert et al., 1996). Las constantes catalíticas para la DT-
diaforasa sobre el aminocromo se obtuvieron del gráfico Lineweaver-burk,
graficando los recíprocos de las velocidades iniciales versus los recíprocos de
las concentraciones de aminocromo. Los ensayos enzimáticos se realizaron
manteniendo todos los reactivos, menos enzima y aminocromo, a 37 ºC, hasta
la medición.
Determinación de concentración de proteína por méto do Bradford
Se preparó una curva de calibración con 1-500 µg/ml de albúmina de
suero de bovino (BSA) en agua. Se mezcló 200 µl de cada solución de BSA con
800 µl de solución de Bradford (0,01 % coomasie brilliant blue G-250, 8,5%
ácido fosfórico, 5 % etanol). Se incubó 2 min y se midió la absorbancia en
espectroscopio UV-visible Agilent 8453 a 595 nm. Se graficó concentración
32
versus absorbancia a 595nm generando la curva estándar. Se tomó una
alícuota de 20 µl de DT-diaforasa y se diluyó hasta 200 µl con agua. Se agregó
800 µl de solución de Bradford. Se incubó a temperatura ambiente por 2 min y
se midió absorbancia a 595 nm, interpolando el valor de absorbancia en la
curva de calibración, considerando el factor de dilución de la DT-diaforasa.
Ensayos de agregación
Condiciones de incubación que no inducen fibrilación de α-sinucleína
sola (incubación por horas sin agitación y baja concentración de α-sinucleína):
5-10 µM α-sinucleína humana recombinante fue incubada en 25 mM Tris-HCl
pH 7,5 por 4 hrs a 37ºC sin agitación en presencia o ausencia de: (i)100 µM de
dopamina y 10 ng/ml de tirosinasa; (ii) 10 µM de aminocromo; (iii) 250 mM de
NADH; (iv) 2,5 µg/ml de DT-diaforasa y/ó (v) 50 µg/ml NADH citocromo C
reductasa. Además, algunos ensayos incluyeron 25 ng/ml de superóxido
dismutasa y 25 ng/ml de catalasa. La determinación de agregación por se
realizó por Western blot.
Para ensayos de microscopía electrónica con baja concentración de
aminocromo y sin agitación, se incubó 30 µM de α-sinucleína en presencia o
ausencia de: (i) 10 µM de aminocromo, (ii) 500 µM NADH, (iii) 10 µg/ml de
citocromo C reductasa y/ó (iv) 5 µg/ml de DT-diaforasa en 25 mM Tris-HCl pH
7,5 por 5 días a 37ºC sin agitación.
Condiciones extremas que inducen fibrilación de α-sinucleína sola ( con
agitación y alta concentración): 100 µM α-sinucleína humana recombinante, fue
incubada en 20 mM MES pH 6,5, 100 mM NaCl por 4 días a 37 ºC con agitación
fija de 200 rpm en presencia o ausencia de: (i) 100µM de aminocromo, (ii) 500
mM de NADH, (iii)100 ng/ml de DT-diaforasa y/ó (iv) 10 µg/ml NADH citocromo
C reductasa, realizando determinación de agregación por Western blot,
microscopía electrónica, dicroísmo circular y fluorescencia de Tioflavina T.
Dicroísmo circular
33
A partir de cada medio de incubación de los ensayos de agregación, se
tomó una alícuota que se diluyó hasta un volumen de 200 µl en MES 20 mM pH
6,5, logrando una solución de 5 µM de α-sinucleína. Las mediciones se
realizaron a 25ºC en una cubeta de cuarzo de 0,1 cm en un espectro
polarímetro Jasc0 J-810. La tabla de datos fue transferida al programa
Sigmaplot 8.02 para graficar y analizar los resultados.
Fluorescencia de tioflavina T
A partir de cada medio de incubación de los ensayos de agregación, se
tomó una alícuota que se diluyó formando una solución de medición de 0,25 µM
de α-sinucleína, 5µM de tioflavina T (TioT) 50 mM MES pH 6,5. La
fluorescencia de TioT fue medida en un equipo Cary eclipse Varian
inmediatamente después de formar la solución de medición. La mezcla se
excitó a 446 nm de longitud de onda y se obtuvo la fluorescencia entre 460-600
nm. A cada muestra, se determinó la intensidad de la fluorescencia de TioT a
480 nm. Los datos fueron procesados y analizados usando el programa
sigmaplot 8.02.
Microscopía electrónica de transmisión.
Grillas de cobre de 300-mesh, previamente cubiertas con Formvar fueron
invertidas sobre una gota de 10 µl del medio de incubación de α-sinucleína por
1 min. El exceso de líquido se extrajo con papel filtro, las grillas fueron
invertidas en una solución acuosa de acetato de uranilo al 2 % por 5 min. El
exceso de solución se extrajo con papel filtro y se dejó secar a temperatura
ambiente por 15 min. Las grillas fueron examinadas a 80 kvolt y campos
visuales representativos fueron fotografiados a 30000 x y 33000 x de
amplificación en un microscopio electrónico de transmisión EM900
Cinética de unión aminocromo con αααα-sinucleína
Se prepararon soluciones de 15 µM de aminocromo en 25 mM tris pH 7,5. Se
determinó absorvancia a 478 nm de λ. Se agregó 0, 5, 10 ó 15 µM de α-
sinucleína en experimentos por triplicado y se midió la absorvancia cada 30 min
34
por un plazo de 2 hrs. Se transformó cada absorvancia obtenida a la
concentración de aminocromo correspondiente, con el coeficiente de extinción
molar. Se determinó la velocidad de disminución de aminocromo por minuto a
cada concentración de α-sinucleína. Se graficó las velocidades de desaparición
de aminocromo por tiempo (µM/min) en relación a las cantidades de α-
sinucleína usadas. Se comprobó que la relación fue lineal con un R= 0,993. De
esta manera se obtuvo la velocidad de desaparición de aminocromo por tiempo
por miligramo de α-sinucleína (nmoles de aminocromo/min/mg de α-sinucleína)
35
RESULTADOS
Objetivo específico 1. Obtener αααα-sinucleína humana recombinante. Expresión y purificación de αααα-sinucleína humana recombinante
El primer objetivo de esta tesis fue la obtención de α-sinucleína humana
recombinante pura y con una concentración adecuada para los ensayos a
realizar durante la tesis. Se escogió la expresión de proteína recombinante en
bacteria por costos, factibilidad de implementación en el laboratorio y debido a
que la α-sinucleína humana no es glicosilada en condiciones fisiológicas.
Como vector de expresión en células procariontes, se usó el plasmidio
pRK172/α-syn WT, el cual ya tiene incorporada la secuencia completa de la
proteína α-sinucleína humana. La bacteria para expresar la proteína fue la
BL21(DE3)pLysS, la cual posee un plasmidio de baja expresión de lisozima. La
función de este plasmidio es la de disminuir el nivel de expresión de la proteína
que se necesita expresar. La α-sinucleína ha demostrado ser una proteína que
puede agregarse al aumentar su concentración, por lo cual se optó por no
inducir una expresión muy alta de esta proteína en la bacteria. Para expresar y
purificar la α-sinucleína, se usó la técnica descrita por Conway et al. (2000)
modificada según se describe en materiales y métodos (figura 3). En la figura 4
A se observa la carga de alícuotas de las fracciones 5 a 11 provenientes de la
última etapa de purificación de la α-sinucleína en un gel SDS-PAGE al 12%,
teñido con azul de Coomasie. Ni las fracciones anteriores ni las posteriores
mostraron presencia de proteínas. En esta figura se observó que en todos los
eluidos hay gran cantidad de bandas de proteínas de distintos tamaños, lo que
nos demostró una falencia que nuestra técnica de purificación. El Western blot
de la figura 4 B nos mostró bandas de proteínas de alrededor de 18 kDa
reconocidos por anticuerpo anti-α-sinucleína. Por la marca y tamaño en el gel,
fueron identificados como monómeros de α-sinucleína. La figura 4 nos
demostró que con nuestra técnica de purificación, obtuvimos fracciones ricas
36
en α-sinucleína pero no puras. A continuación se modificó este protocolo de
purificación, incorporando una etapa de hervido del extracto de proteínas
totales de la lisis bacteriana por 25 min. La figura 5, nos muestra el protocolo de
expresión y purificación de α-sinucleína recombinante humana modificado, el
cual incluye la etapa de hervido del extracto proteico de bacterias (Etapa IIIb en
figura 5). La figura 6 A, corresponde al gel SDS-PAGE teñido con azul de
coomasie, que muestra alícuotas de las diferentes etapas de purificación de α-
sinucleína que incluye hervido de muestras. Esta figura nos muestra que luego
del hervido del extracto de proteínas, se logró eliminar la mayor parte de las
proteínas contaminantes en la purificación de la α-sinucleína (comparar carril 1
del 2). La precipitación con sales (etapas IV y V) permitió concentrar la α-
sinucleína (carril 3). La resina Sephadex G25-80 desalinizó las proteínas (carril
4) y la resina de intercambio aniónico completó la purificación de la α-
sinucleína (carril 5). La tabla 6 B, muestra la absorción espectrofotométrica a
260 y 280 nm de λ de cada solución obtenida luego de distintas etapas de la
purificación de la α-sinucleína y que corresponden a las mismas soluciones que
se analizaron por SDS-PAGE de la figura 6 A. En esta tabla, la razón de
absorbancias a 260 nm con 280 nm nos sirvió para determinar la disminución
de oligonucleótidos. Como puede observarse en la tabla, las distintas etapas de
purificación fueron eliminando paulatinamente la contaminación con
oligonucleótidos y solo luego de la última etapa de purificación, se logró
eliminar completamente la presencia de estos. También se determinó la pureza
de las proteínas en un gel de electroforesis de poliacrilamida al 12% en
condiciones desnaturantes resuelto por tinción con plata (figura 6 C). En este
gel se comparó la proteína recombinante purificada por nosotros, con una
comercial. Luego de la última etapa de purificación, se obtuvieron 2 fracciones
desde la columna con DEAE Sephadex a-50-120 que contenían α-sinucleína.
Las denominamos fracciones 500-I y 500-II. En el gel de la figura 6 C, se cargó
2, 4 y 6 µl de la fracción 500-I en los carriles 1, 2 y 3 respectivamente; se cargó
2, 4 y 6 µl de la fracción 500-II en los carriles 4, 5 y 6 respectivamente; y 2 y 4
µg de una α-sinucleína comercial en los carriles 7 y 8 respectivamente. Las
37
bandas de la proteína purificada por nosotros muestran la misma migración que
la α-sinucleína comercial. El gel muestra la aparición de una banda única, del
tamaño descrito para monómeros de α-sinucleína y no aparece otra banda, aún
cargando mas cantidad de proteína. La intensidad de las bandas de la proteína
comercial observadas en figura 6 C fueron similares al de la proteína que
nosotros obtuvimos, lo que nos sugirió que las concentraciónes de ambas
proteínas fueron similares (1 µg/µl o 68µM). La determinación de la
concentración se realizó espectrofotométricamente midiendo la absorción a 280
nm de longitud de onda, tomando en cuenta el coeficiente de extinción molar
5600 M-1 cm-1 (Hoyer et al., 2002). Con nuestra purificación, se logró una
cantidad de 3 ml de una solución de 60-70 µM de α-sinucleína partiendo de 500
ml de bacteria BL21(DE3)pLysS; pRK172/α-syn en medio Luria-Bertonni
inducida con 0,5 mM de IPTG.
38
Figura 4. Determinación de expresión y pureza de αααα-sinucleína humana recombinante de bacterias de expresión BL21(DE3)pLysS pRK172/αααα-syn en tratamiento sin hervido de proteínas.
Fracciones consecutivas de la purificación de α-sinucleína según esquema de la figura 3 luego de pasar por una columna con resina DEAE-Sephadex A-50-120. (A) Gel SDS-PAGE al 10% teñido con azul de coomasie, que muestra las fracciones 5-11 obtenidas de la columna. (B) Membrana con proteínas electrotransferidas del SDS-PAGE de la figura 4 A y tratada con anticuerpo policlonal anti-α-sinucleína.
5 6 7 8 9 10 11
A
71
kDa
41,8
202
17,8
30,6
6,9
41,8
71
kDa
202
17,8
30,6
6,9
5 6 7 8 9 10 11
B
39
Figura 5. Esquema de expresión y purificación de αααα-sinucleína humana recombinante en bacterias.
Esta figura muestra el esquema purificación de α-sinucleína recombinante que incluye la etapa de hervido (IIIB). Las demás etapas de la purificación son similares a las descritas en materiales y métodos.
BL21(DE3)pLysS pRK172/α-syn wt (densidad óptica de 0,4)
0,5mM de IPTG. 4 horas a 37ºC con agitación
Centrifugación 2000 xg
precipitado de bacterias
25 mM Tris pH 7,5; 50 mM NaCl; 5% glicerol
Lisis bacteriana
Congelado (N2 liq)/ descongelado (70º)
300 µg/ml lisozima
Resuspendido bacteriano
I
II
III
IIIb
Sulfato de amonio 30% saturación Precipitado I Sobrenadante I
Sulfato de amonio 50% saturación Precipitado II Sobrenadante II
Resuspendidos I
25 mM Tris pH 8
Paso por columna con Sephadex G-26-80
IV
V
VI
Eliminación
Sobrenadante 0
Hervido por 25minutos en baño de agua caliente
Eluido G-25
Eluido DEAE A-50
Separación por columna con DEAE-Sephadex A-50-120
VII
40
Figura 6. Determinación de expresión y pureza de αααα-sinucleína humana recombinante de bacterias de expresión BL21(DE3)pLysS pRK172/αααα-syn en tratamiento con hervido de proteínas.
(A) Gel SDS-PAGE al 10 % teñido con azul de coomasie que muestra proteínas totales de alícuotas de las diferentes etapas de purificación de α-sinucleína humana recombinante esquematizadas en figura 5. (1) Extracto de lisis bacteriana: Extracto total de las bacterias luego de la lisis (etapa III). (2) Sobrenadante 0: Extracto de lisis bacteriana hervido por 25 minutos en baño de agua caliente (etapa IIIb). (3) Precipitado II: Sobrenadante 0 purificado por precipitación con sulfato de amonio al 30 % y luego precipitado con sulfato de amonio al 50 %. (4) Eluido G-25: Precipitado II que se pasó por columna con resina Sephadex G-25-80, rescatando las fracciones que absorbieron a 280 nm de λ. (5) Eluido DEAE A-50: El eluido G-25 se cargó y purificó en columna con resina DEAE-Sephadex A-50-120. (B) Tabla que muestra las absorbancias a 260nm y 280 nm de λ de los extractos observados en la figura 3 A cargados en carriles 2, 3, 4 y 5. (C) carga de alícuotas de 2, 4 y 6 µl de la fracción 500-I (carriles 1-3), de 2,4 y 6µl de la fracción 500-II (carriles 4-6) y de 2 y 4 µl de una α-sinucleína comercial de concentración 1 mg/ml (68 µM) (carriles 7 y 8) en un gel SDS-PAGE al 12 %, tenido con tinción de plata.
260nm/280nm Abs<260nm> Abs<280nm> 2 2,3007 0,53309 0,23171 3 1,5357 0,17904 0,11659 4 1,32 0,22107 0,16747 5 0,77825 1,54E-02 1,97E-02
A
1 2 3 4 5
190
60
50
40
25 20
120
85
15,10
1 2 3 4 5 6 7
C
60
15
40
25
120
10
50
85
190
B
41
Objetivo específico 2. Preparar y purificar aminocromo.
Síntesis y purificación de aminocromo
Para el desarrollo de esta tesis, fue necesario el trabajo con aminocromo
puro, sin embargo, por su inestabilidad no es un reactivo comercial y no existe
ninguna técnica descrita a la fecha para su síntesis y purificación. Por lo
anterior, fue necesario diseñar y montar una técnica para la síntesis y
purificación de aminocromo.
El primer paso fue buscar una condición en que se pueda estabilizar el
aminocromo, aumentando el tiempo de polimerización. Se incubó 5 mM de
dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa a distintos pH, a temperatura ambiente
por hasta 4 hrs y se determinó espectroscópicamente la presencia de
aminocromo por absorción a 478 nm de λ (Segura-Aguilar J. et al, 1998) y de
melanina determinada por absorción a 600 nm (Riley P.A., 1997; Linert et al,
1996). La figura 7, nos muestra los espectros de absorción en un rango entre
400-800 nm de λ de las soluciones de dopamina y tirosinasa incubadas por (i)
10 min; (ii) 60 min y (iii) 240 min a distintos pH: línea negra, 50 mM de tampón
acetato pH 4,0; línea roja, 50 mM tampón acetato pH 5,0; línea azul, 20 mM
MES pH 6,0; línea celeste, 25 mM Tris-HCl pH 7,0 y línea morada, 25 mM Tris-
HCl pH 8,0. La figura 7 A nos muestra que con 10 min de incubación a pH 4,0,
apareció un pico bajo los 400 nm, lo que puede significar que la dopamina fue
oxidada hasta dopamina-o-quinona (Segura-Aguilar y Lind, 1989), pero no
hubo formación de aminocromo. En cambio a pH 5,0, se observó una señal de
aminocromo algo distorsionada a los 400 nm de λ, lo que indica que apareció
una señal de dopamina-o-quinona, pero enmascarada por la señal de
aminocromo. A pH 6,0 sólo apareció una señal de aminocromo, bastante mayor
que la señal a pH 5,0. A pH 7,0 la señal de aminocromo es levemente mayor
que la señal a pH 6,0, pero apareció un pico alrededor de los 430 nm de λ, y
además, se observó un aumento en las absorbancias a 600 nm de λ lo que nos
sugirió la polimerización del aminocromo. A pH 8,0 no se apreció señal de
aminocromo, sino una gran absorción en todo el espectro visible, típico de la
melanina (Riley P.A., 1997; Linert et al, 1996). Luego de 1 hr, la incubación a
42
pH 4,0 mostró una leve señal de aminocromo y desapareció la señal de
dopamina-o-quinona. A pH 5,0, se observó una señal de aminocromo de similar
intensidad que a los 10 min y sin presencia de la señal de dopamina-o-quinona
ni de melanina, lo que nos indica que a este pH el aminocromo demoró mas en
generarse pero fue estable por al menos 1 hr A pH 6,0 se observó una señal de
aminocromo mucho mayor que a pH 5,0 y de similar intensidad que a 10 min.
Se observó un leve aumento a 600 nm de λ. Las incubaciones a pH 7,0 y 8,0
mostraron un espectro típico de melanina, aunque a pH 7,0 aún apareció la
señal de aminocromo. Luego de 4 hrs de incubación a pH 4,0 y 5,0, las señales
de aminocromo mantienen la misma intensidad que con 1 hr de incubación y no
se observa aparición de melanina. A pH 6,0, la señal correspondiente a
aminocromo mantuvo la misma intensidad que luego de 10 y 60 min de
incubación, la que es mayor a lo observado a pH 4,0 y 5,0, pero luego de 4 hrs
de incubación, comenzó a aparecer melanina. A pH 7,0 y 8,0, no se observó
señal de aminocromo, solo espectro correspondiente a melanina. Por los
resultados obtenidos, se decidió realizar la oxidación de dopamina por
tirosinasa a pH 6,0, ya que a este pH la reacción es rápida con alto rendimiento
y el aminocromo es estable por al menos 4 hrs.
El siguiente paso fue separar el aminocromo de la tirosinasa y la
melanina. Como la resina Sephadex G-25-80 se utiliza para separar proteínas
de sales por el retardo que sufre las moléculas de bajo tamaño, se propuso que
esta resina podría ser útil para separar el aminocromo y dopamina de
moléculas de mayor tamaño como la tirosinasa y el pigmento de melanina. Se
realizó una separación en esta columna tal como se describe en materiales y
métodos. Para seguir la separación, cada eluido fue medido
espectroscópicamente, determinando la absorbancia a 280 nm, 478 nm y 600
nm de λ (la absorbancia a 280 nm nos mostraría la aparición de la tirosinasa,
dopamina y de melanina; la absorbancia a 478 nm nos mostraría la aparición
de aminocromo; la absorbancia a 600 nm nos mostraría la aparición de
melanina). Como se puede observar en la figura 8 A, entre 300-500 µl de
elución apareció una pequeña señal de absorción a 280 nm, que no absorbió ni
a 478 nm ni a 600 nm (señal I). Entre los 800–1100 µl de elución apareció una
43
gran señal a 280 nm que se complementó con una señal a 478 nm (Señal II).
Entre los 1100-1300 µl de elución, apareció una señal que absorbió a 280 nm,
478 nm y 600 nm en igual magnitud (Señal III). Finalmente sobre los 2100 µl de
elución, se observó una absorción solo a 280 nm (señal IV). Por el bajo retardo,
se pensó que la señal I podría corresponder a los eluidos que contenían la
tirosinasa. Para corroborar esto, se agregó 500 nanomoles (nmoles) de
dopamina a la fracción que eluyó entre 400-500 µl, la cual mostró la mayor
intensidad de la señal I. Se incubó por 10 min a 25 ºC y se midió la absorción a
478 nm de λ. Tal como se aprecia en la tabla 8 B, la dopamina se oxidó a
aminocromo. Como contraparte, la adición de 500 nmoles de dopamina a la
fracción que eluyó entre 600-700 µl y que no absorvió a 280 nm de λ, no
mostró aparición de señal a 478 nm de λ luego de 10 min de incubación. Esto
nos corroboró que la señal I contenía tirosinasa. La señal II por su absorción a
280 nm y 478 nm podría corresponder a aminocromo en presencia o ausencia
de dopamina. La señal IV, indicó la presencia de una sustancia que solo
absorbió a 280 nm de λ y que se encontraba en gran cantidad, por el hecho de
observarse en un gran volumen de elusión. Por lo anterior, se pensó que esta
señal podría corresponder a la dopamina. Para corroborar esto, se agregó 1 ng
de tirosinasa a la fracción que eluyó entre 2200-2300 µl que mostró la señal IV
y se incubó por 10 min. Tal como se muestra en la tabla 8 B, esta solución
mostró un aumento en la absorción a 478 nm indicando que hubo oxidación de
dopamina a aminocromo. Como contraparte, la incorporación de tirosinasa a la
fracción que eluyó entre 1700-1800 µl (antes de la aparición de la señal IV), no
mostró un aumento de absorbancia a 478 nm luego de 10 min de incubación.
La señal III, muestra una absorción a 280 nm, 478 nm y 600 nm de λ de similar
intensidad, lo que nos indicó la presencia de melanina. Todo lo anterior nos
hizo pensar que la señal II correspondió a eluidos con aminocromo libre de
dopamina, tirosinasa y melanina.
Se tomó una alícuota de la fracción con señal II y se determinó su
espectro electromagnético en la región UV-visible, realizándole un barrido de
absorbancias entre 200-800 nm de λ. La figura 9 A, muestra este espectro, en
44
donde se observaron 3 picos claramente identificables a 220 nm, 297 nm y 477
nm de λ. Para determinar si este espectro puede corresponder a una mezcla de
aminocromo con dopamina, se determinaron y graficaron los espectros de
dopamina sola, alícuota de la fracción de II de la separación y una mezcla de
ambas en la figura 9 B. El espectro de 100 µM de dopamina pura mostró una
absorbancia a 220 nm y 280 nm pero no a 297 nm y 478 nm (espectro azul,
figura 6 B). La alícuota de la fracción II mostró el espectro rozado de la figura 9
B con los picos ya descritos anteriormente. La mezcla de una alícuota de la
fracción II y dopamina, mostró un espectro que es la combinación de los 2
espectros de las soluciones por separado. Se aumento la señal a 220 nm, pero
las señales a 297 nm y 478 nm de longitud de onda de la fracción II sola no se
vieron modificadas. Por parte de la dopamina la señal fue a 280 nm, pudiendo
diferenciarse claramente de la señal a 295 nm. Por lo tanto, la fracción II no
contiene dopamina pues esta sería identificada claramente.
A continuación, se realizó un espectro de resonancia nuclear de
protones (1H-NMR) a una alícuota de una fracción de separación que presentó
un espectro UV-visible con los picos a 220 nm, 295 nm y 478 nm de λ tal como
se observó en figura 9 A. La alícuota medida, se obtuvo de una purificación de
aminocromo preparado y purificado íntegramente en óxido de deuterio, tal
como se describe en materiales y métodos. La figura 10 muestra el espectro de 1H-NMR con y señales claras. Las resonancias a 6,41 y 5,57 ppm indicaron
protones de una orto-quinona. La señal a 6,41 ppm con una integración ≅ 1
corresponde al hidrógeno marcado como H-4 el cual muestra un inusual
acoplamiento a largo rango con los protones del grupo marcado H-3 (J4 = 2,57
Hz) probablemente por la perdida de aromaticidad en una orto-quinona (con
respecto al anillo bencénico). La señal a 5,57 ppm con una integración ≅ 1, es
un singulete que corresponde al hidrógeno marcado como H-7. El hidrógeno de
la amina secundaria no existiría porque probablemente se habría cambiado por
deuterio. El anillo pirrolidina tiene dos grupos metileno resonantes, el H-2 (3,81
ppm; J3 = 5,18 Hz) con integración ≅ 2 el cual exhibe un triplete mostrando el
acoplamiento con los hidrógenos H-3 y los hidrógenos del metileno H-3
muestran una señal con una integración ≅ 2 que corresponde a un multiplete
45
con 2 sistemas de acoplamiento diferentes con J3 = 5,19 Hz and J4 = 2.55 Hz,
un acoplamiento vecino con el metileno H-2 y un acoplamiento a largo rango
con el hidrógeno H-4. Por lo tanto, las mediciones con 1H-NMR demostraron
que la fracción de la separación de aminocromo que presenta un espectro de
absorvancia con picos de absorción a 220, 295 y 478 nm de λ, contenía
aminocromo puro.
Debido a la separación lograda entre aminocromo y dopamina a través
de una resina de exclusión por tamaño, sugerimos que la diferencia en la
migración se debió a diferencia en las propiedades polares entre ambas
moléculas. Estas diferencias polares podrían generar esferas de hidratación de
diferentes diámetros que explicarían las distintas migraciones. Para corroborar
que es esta diferencia en las polaridades las que influyeron en la distintas
migraciones, se realizó una separación de dopamina incubada con tirosinasa
por resina Sephadex G-25-80 pero a un pH mas alcalino, pH 7,5. Tal como se
observa en la figura 11, apareció una señal I a los 300 µl de elusión. Esta señal
correspondió a la migración de tirosinasa, lo que se determinó por su propiedad
para oxidar dopamina adicionada a esta fracción. Apareció una señal II de un
pico a 478 nm a los 900 µl de elusión, sin embargo el pico a 280, se obtuvo a
los 1000 µl de elusión. Al realizar una medición por espectroscopia UV-visible,
se observó que correspondió a una mezcla de dopamina y aminocromo. La
señal III que apareció desde los 1000 µl de elusión, correspondió a melanina
por la alta polimerización a este pH.
Con la técnica de purificación de aminocromo por columnas con
Sephadex G-25-80, se logró una máxima concentración de 80 µM. Esta
concentración nos permitió realizar algunos ensayos, sin embargo, para ciertos
experimentos la concentración de trabajo fue de 100 µM. Por lo anterior, fue
imprescindible mejorar la técnica para aumentar la concentración. Debido a la
diferencia entre los comportamientos polares observados entre dopamina y
aminocromo a pH 6,0, propusimos que se podía mejorar la separación
ocupando una columna de intercambio iónico. Se oxidó dopamina con
tirosinasa y se paso este medio de incubación por una columna con resina CM-
Sephadex C-50-120 tal como se describe en materiales y métodos. Como se
46
observa en la figura 12, aparecieron 5 fracciones con sustancias que
absorbieron en el rango de 280 nm de λ. La tirosinasa eluyó rápidamente
(señal I) lo que se comprobó al agregar dopamina a una alícuota del eluido que
dio señal I y luego de 10 min, observar aumento de la absorbancia a 478 nm de
λ (no mostrado). A los 3 ml de elusión apareció una señal con absorción a 280,
478 y 600 nm de λ que correspondió a melanina (señal II). Entre los 5-8 ml de
elución con 25 mM MES pH 6 sin NaCl, se obtuvo una gran señal a 280 y a 478
nm de λ (señal III). Un barrido de absorbancias entre 200-800 nm de λ de los
eluidos que mostraron la señal III, con el espectro característico del
aminocromo puro. Solo después de aumentar la fuerza iónica, agregando a la
fase móvil 300mM NaCl, apareció una señal con solo absorción a 280 nm de λ
(señal V). El eluido que mostró señal V presentó aumento de absorción a 478
nm de λ solo al incubar por 10 min con tirosinasa, lo que nos indicó que
correspondió a dopamina. La señal IV indica el punto donde se comenzó a eluir
con 20 mM MES pH 6 + 300 mM NaCl. Mediante esta técnica, se logró una
máxima concentración de 260 µM de aminocromo puro.
47
Figura 7. Determinación de aparición de aminocromo por oxidación de dopamina a distintos pH y distintos tiempos.
Espectros de absorción entre 380-800 nm de λ luego de incubación de 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa a distintos pH: pH 4,0, curvas negras; pH 5,0, curvas rojas; pH 6,0, curvas azules; pH 7,0, curvas celestes y pH 8,0, curvas violetas. (A) Incubación por 10 min, (B) por 1 hr y (C) por 4 hrs.
Wavelength (nm)350 400 450 500 550 600 650
Abs
orba
nce
(A
U)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7A
Wavelength (nm)350 400 450 500 550 600 650
Ab
sorb
ance
(A
U)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
B
Wavelength (nm)350 400 450 500 550 600 650 700
Abs
orb
anc
e (A
U)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8C
48
Figura 8. Separación de aminocromo por columna de exclusión por tamaño a pH 6,0.
(A) Separación de un incubado de 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa en 25 mM MES pH 6,0 por 10 minutos en una columna con resina sephadex G-25-80. Se determinó aparición de distintas especies por la medición de absorbancia a 280 nm, 478 nm y 600 nm, graficando cada punto a través del programa Sigma Plot. Las señales I, II, III y IV, corresponde a la aparición de distintas especies de la incubación. (B) Tabla que muestra la formación de aminocromo por aumento de absorción a 280 nm y 478 nm pero no a 600 nm, luego de agregar tirosinasa o dopamina a distintas fracciones de la separación mostrada en 7 A.
Abs<280nm> Abs<478nm> Abs<600nm>
Fracción 400-500 µl 0,11972 4,37E-02 3,60E-02 Fracción 400-500 µl + 5mM DA 0,68969 0,519 6,53E-02 Fracción 600-700 µl 3,71E-02 5,36E-02 6,26E-02 Fracción 600-700 µl + 5 mM DA 0,68605 5,68E-02 2,64E-02 Fracción 2200-2300 µl 5,95E-02 8,50E-03 9,63E-03 Fracción 2200-2300 µl + 10 ng/ml tir 0,13522 5,61E-02 8,14E-03 Fracción 1700-1800 µl 4,29E-03 3,49E-03 6,78E-04 Fracción 1700-1800 µl + 10 ng/ml tir 2,32E-02 8,48E-03 3,72E-03
v o lu m e n d e e lu i d o ( x 1 0 0 µ l )
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5
Abs
orba
ncia
- 0 , 1
0 , 0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
0 , 6
2 8 0 n m4 7 8 n m6 0 0 n m
I
I I
I I I I V
A
B
49
Figura 9. Espectros de absorción de eluidos derivados de la oxidación de la dopamina.
(A) Espectro de absorción entre 200-800 nm de λ de la fracción II de la separación de dopamina incubada con tirosinasa, por resina Sephadex G-25. (B) comparación de los espectros de absorbancia de la dopamina (línea azul), de la fracción II (línea verde) y el espectro de dopamina junto a la fracción II (línea rosada).
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
190 290 390 490 590 690
Longitud de onda (nm)
Absorbancia
DA
Amino
DA+amino
L o n g itu d d e o n d a ( n m )
2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0
Abs
orba
ncia
0 ,0
0 ,5
1 ,0
2 2 0
2 9 7
4 7 7
A
B
50
Figura 10. Espectro H-NMR de eluido que contiene aminocromo en D2O.
Espectro H-NMR de una alícuota de la fracción II de la separación de dopamina incubada con tirosinasa, por resina Sephadex G-25 realizada en óxido de deuterio. (A) Región de alto campo donde aparecen los protones aromáticos (protones 4 y 7 de la molécula de aminocromo representada en la figura). (B) Región de bajo campo, donde aparecen los protones alifáticos (protones 2 y 3 de la molécula de aminocromo.
51
Figura 11. Separación de aminocromo por columna de excusión por tamaño a pH 7,5.
Separación de un incubado de 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa en 25 mM tris-HCl pH 7,5 por 5 minutos en una columna con resina sephadex G-25-80. Se determinó aparición de distintas especies por la medición de absorbancia a 280 nm, 478 nm y 600 nm, graficando cada punto a través del programa Sigma Plot. Las señales I, II y III, corresponde a la aparición de distintas especies de la incubación.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0 5 10 15 20Volumen de eluido (x 100 ul)
Abs
orva
ncia
(nm
)
280 nm
478 nm
600 nm
I
II III
52
Figura 12. Separación de aminocromo en columna de intercambio catiónico.
Separación de un incubado de 5 mM de dopamina con 10 ng/ml de tirosinasa en 25mM MES pH 6,0 por 10 minutos en una columna con resina de intercambio catiónico CM-Sephadex C-50-120. Los primeros 14 ml fueron eluidos con 25 mM MES pH 6,0 y los 11 ml restantes con 25mM MES pH 6,0 + 300mM NaCl. La aparición de las distintas especies fue determinada por absorción a 280 nm, 478 nm y 600 nm de λ, graficando cada punto a través del programa Sigma Plot. Las señales I, II, III, IV y V, marcan aparición de diferentes especies.
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
Abs
orba
ncia
-0 ,2
0 ,0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
1 ,0
1 ,22 8 0 n m 4 7 8 n m 6 0 0 n m
T a m p ó n d e e lu c ió n + 3 0 0 m M d e N a C l
v o lu m e n d e e lu id o (m l)
I I I
IV
V
III
53
Objetivo específico 3. Comprobar por estudios in vitro, que el aminocromo
puro es capaz de inducir la agregación de αααα-sinucleína humana
estabilizando la estructura oligomérica e inhibiend o la fibrilación de αααα-
sinucleína .
Inducción de la agregación de αααα-sinucleína durante la oxidación de
dopamina catalizada por tirosinasa
Lansbury y colaboradores (Conway et al. 2001) sugirieron que la
dopamina al oxidarse induce la agregación de α-sinucleína, discutiendo que la
molécula responsable podría ser el aminocromo. Sin embargo, estos resultados
los obtuvieron incubando 180 µM de α-sinucleína con 180 µM de dopamina por
24 hrs. con agitación. Bajo estas condiciones, la α-sinucleína polimeriza hasta
formar fibras, sin necesidad de la presencia de otro compuesto. La dopamina al
oxidarse previno la formación de fibras de α-sinucleína, sin embargo no fueron
muy claros los resultados que sugerirían que la dopamina al oxidarse indujo la
agregación de α-sinucleína. Nosotros intentamos probar que la dopamina al
oxidarse induce la polimerización de α-sinucleína y luego quisimos demostrar
que es el aminocromo la molécula responsable.
Se planteó un modelo de estudio in vitro, donde no haya polimerización
espontánea de α-sinucleína sola y que solo la incubación con dopamina al
oxidarse induce la agregación de α-sinucleína. Para lograr estas condiciones,
se incubó α-sinucleína en bajas concentraciones en presencia ó ausencia de
dopamina y un catalizador que induce la oxidación de ésta. La figura 13 A nos
muestra el resultado de un Western blot para anticuerpo específico anti-α-
sinucleína. Para este Western blot se cargaron alícuotas que contuvieron 500
ng de α-sinucleína por bolsillo, de las 4 condiciones descritas a continuación:
(1) 5 µM de α-sinucleína sola, incubada a 37ºC, a pH 7,5 por 4 hrs sin
agitación. Solo se observó una banda única de aproximadamente 18 kDa
correspondiente al monómero de α-sinucleína; (2) 5 µM de α-sinucleína con
100 µM de dopamina incubada a 37ºC, a pH 7,5 por 4 hrs sin agitación. No se
observó diferencias con la incubación de α-sinucleína sola; (3) 5 µM de α-
54
sinucleína con 100 µM de dopamina y 10 ng/ml de tirosinasa incubada a 37 ºC,
a pH 7,5 por 4 hrs sin agitación. En esta condición se observó una disminución
significativa de la banda correspondiente al monómero de α-sinucleína, lo que
se cuantificó en el gráfico 13 B. También se pudo apreciar, sólo en esta
condición, la aparición de una señal α-sinucleína positiva de alto peso
molecular (que no fue capaz de entrar en el gel separador de un SDS-PAGE al
12%); (4) 5 µM de α-sinucleína con 10 ng/ml de tirosinasa incubada a 37ºC, a
pH 7,5 por 4 hrs. sin agitación. La tirosinasa por si sola no fue capaz de inducir
la disminución de α-sinucleína monomérica, mostrando una señal igual a lo
observado con α-sinucleína sola. El gráfico de la figura 13 B, corresponde a la
cuantificación de la banda monomérica de tres Western blot diferentes de las
condiciones descritas para la figura 13 A. Este gráfico comprueba que solo la
incubación de α-sinucleína con dopamina y tirosinasa induce la desaparición
del monómero de α-sinucleína. Al no ver claramente la aparición de bandas
correspondientes a polímeros de α-sinucleína, se aumentó la concentración de
α-sinucleína en la reacción a 10 µM y la carga de α-sinucleína en el gel SDS-
PAGE a 2 µg por bolsillo. La figura 13 C corresponde a un Western blot para α-
sinucleína donde se comparó la incubación de: (1) 10 µM de α-sinucleína sola
a 37ºC, pH 7,5 por 4 hrs sin agitación y (2) 10 µM de α-sinucleína con 100 µM
de dopamina y 10 ng/ml de tirosinasa a 37 ºC, pH 7,5 por 4 hrs sin agitación. Al
igual que en la figura 13 A, la α-sinucleína sola mostró una única banda
correspondiente al monómero de α-sinucleína. Sin embargo, la presencia de
dopamina y tirosinasa, indujo la aparición de un bandeo α-sinucleína positivo
de entre 40-200 kDa que correspondieron a polímeros de α-sinucleína. El
gráfico 13 D muestra la cuantificación de la señal α-sinucleína positiva entre
40-200 kDa observada en la figura 13 C, de tres experimentos diferentes. Este
gráfico confirma la aparición de polímeros de α-sinucleína por dopamina
cuando se incuba junto a tirosinasa.
55
Figura 13. Determinación de αααα-sinucleína en presencia de por dopamina y tirosinasa
(A) Western blot incubado con anticuerpo anti-α-sinucleína en que se cargaron alícuotas de incubación de: (1) α-sinucleína sola; (2) α-sinucleína y dopamina; (3) α-sinucleína, dopamina y tirosinasa; y (4) α-sinucleína y tirosinasa. La banda de ≅18 kDa corresponde a monómeros de α-sinucleína, y la señal sobre los 200 kDa, correspondería a polímeros de α-sinucleína de alto peso molecular que no alcanzaron a entrar al gel separador (línea fragmentada indica límite entre gel concentrador y gel separador). (B) Gráfico que representa la cuantificación de las bandas monoméricas de α-sinucleína para cada condición mostrada en la figura 13 A. Cada barra representa los pixeles totales cuantificados de 3 geles diferentes con el programa Scion Image. **= p< 0,01. ANOVA, Test Tukey. (C) Western blot incubado con anticuerpo anti-α/β-sinucleína de alícuotas de la incubación de: (1) α-sinucleína sola y (2) α-sinucleína, dopamina y tirosinasa. La banda de ≅ 18 kDa corresponde a monómeros de α-sinucleína, y la señal entre 42-202 kDa, corresponden a agregados de α-sinucleína correspondientes a trímeros hasta polímeros de sobre 10 unidades. (D) Gráfico que representa la cuantificación de la señal entre 42-202 kDa de la figura 13 C. Cada banda representa los pixeles totales cuantificados tres experimentos diferentes con el programa Scion Image. *** = p< 0,005. Test Student.
pixe
les
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
1 2 3 4
**
1 2 3 4
Límite gel separador y gel concentrador
A B
C
1 2
D
Pix
eles
0
5000
10000
15000
20000
1 2
*** kDa 202 71
30,6
17,8
41,8
17,8
30,6
71
41,8
202
kDa
56
agregación de αααα-sinucleína Inducida por aminocromo
Luego de haber confirmado que la dopamina al oxidarse con tirosinasa
indujo de agregación de α-sinucleína, quisimos comprobar si el aminocromo
puede inducir la agregación de α-sinucleína. Para esto, se incubó 10 µM de α-
sinucleína en presencia y ausencia de 10 µM de aminocromo puro en 25 mM
Tris-HCl pH 7,5 por 4 hrs a 37ºC sin agitación, luego se determinó la
agregación de α-sinucleína por la técnica de Western blot, incubado con
anticuerpo anti-α-sinucleína. El Western blot de la figura 14 corresponde a la
incubación de (1) α-sinucleína sola y (2) α-sinucleína junto a aminocromo. En
este Western blot se observó que al incubar α-sinucleína sola, sólo apareció
una banda monomérica de α-sinucleína. En comparación, en presencia de
aminocromo apareció un bandeo que corresponde a estructuras de 40-200
kDa, que son específicos para α-sinucleína. Este bandeo es similar al que
apareció en la incubación de α-sinucleína con dopamina y tirosinasa. También
se puede observar, que apareció una señal en el área correspondiente al gel
concentrador, que podría corresponder a estructuras poliméricas de alto peso
molecular que no son capaces de entrar al gel separador.
Debido a que Conway et al. (2001) describe que la dopamina al oxidarse
indujo protofibras de α-sinucleína, se quiso observar la morfología de los
agregados inducidos por aminocromo por microscopía electrónica. Para lo
anterior, se aumentó la concentración de α-sinucleína en la incubación a 30
µM, que fue una concentración que definimos como adecuada para visualizar
estructuras en el microscopio electrónico. Se incubó 30 µM de α-sinucleína en
presencia y ausencia de 10 µM de aminocromo purificado, en 25 mM de tris-
HCl pH 7,5 por 5 días a 37 ºC sin agitación. Se incubaron grillas con membrana
de Formvar con gotas de la incubación de α-sinucleína sola ó α-sinucleína con
aminocromo y se observó cada incubación por microscopía electrónica con la
técnica de tinción negativa. La figura 15 muestra fotografías representativas de
las dos condiciones en estudio, tomadas con aumento de 30000 x. La figura 15
A, muestra una fotografía de la incubación de α-sinucleína sola y la figura 15 B
57
corresponde a una ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro
de la figura 15 A. Tal como nos muestran estas fotografías, la incubación de α-
sinucleína sola no indujo la aparición de estructuras que pudieran ser vistos por
microscopía electrónica con la técnica de tinción negativa. Las pocas
estructuras que se observaron (flechas punteadas figura 15 A) son estructuras
amorfas, electronicamente densas que también aparecieron en controles
negativos (sin α-sinucleína). La figura 15 C, muestra una fotografía de la
incubación de α-sinucleína con aminocromo y la figura 15 D corresponde a una
ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 15 C. El
análisis de las grillas incubadas con el medio de incubación de α-sinucleína con
aminocromo, evidenció dos tipos de estructuras diferentes. Un tipo de
estructura son cuerpos amorfos o globulares, electrónicamente densos y de
distinto tamaño que varían entre 250 nm de diámetro hasta 3 µm de largo
(flechas gruesas blancas). Estas estructuras también aparecieron en un medio
de incubación de dopamina con tirosinasa sin α-sinucleína y pensamos que
puede corresponder a melanina, pero no se trabajó en su identificación. Un
segundo tipo de estructuras, son globulares y no son electrónicamente densas,
por lo que solo se pudieron ver por tinción negativa, es decir, solo se aprecia el
borde negro de las estructuras que da la tinción con acetato de uranilo. Por la
amplificación de la figura 15 C, podemos observar la forma globular de estas
estructuras de entre 15-25 nm de diámetro (flechas negras en figura 15 D)
similares a estructuras descritas como oligómeros de α-sinucleína (Lee y Lee,
2002; Conway et al., 2000a).
Como se ha descrito que la oxidación de dopamina inhibe la formación
de fibras de α-sinucleína (Conway et al., 2001), quisimos determinar si el
aminocromo es capaz de inhibir la formación de fibras de α-sinucleína. Se
incubó 100 µM de α-sinucleína en 20 mM MES pH 6,5; 100 mM NaCl por 4
días a 37 ºC con agitación constante a 200 rpm (Rasia et al., 2005), lo que
induce la formación de fibras de α-sinucleína y se observó el efecto que
produjo la incorporación de 100 µM de aminocromo sobre: (i) la formación de
fibras tipo amiloide, determinado por fluorescencia de TioT; (ii) cambio de
58
estructura secundaria de la α-sinucleína, determinado por dicroísmo circular;
(iii) la formación de fibras y cuerpos fibrilares, determinados visualmente por
microscopía electrónica.
La figura 16 nos muestra la cinética de la formación de fibras tipo
amiloides de α-sinucleína incubada en dos condiciones diferentes, determinada
por aumento en la fluorescencia de TioT. La curva con puntos negros muestra
la cinética de fibrilación de α-sinucleína sola y la curva con puntos blancos
muestra la cinética de fibrilación de α-sinucleína incubada con aminocromo. La
incubación de α-sinucleína sola bajo las condiciones experimentales descritas,
indujo la aparición y aumento de fibras en una cinética muy rápida, con un
tiempo medio de 25,6 ± 1,3 hrs y un máximo en la cantidad de fibras tipo
amiloide antes de 2 días. En comparación, al incubar α-sinucleína con
aminocromo la velocidad de fibrilación disminuyó, mostrando un tiempo medio
de fibrilación de 37 ± 4,3 hrs, alcanzando el máximo de fibrilación casi a las 80
hrs. de incubación.
Se determinó el cambio de estructura secundaria de la α-sinucleína a
través de la técnica de dicroísmo circular. En la figura 17 se muestran los
espectros representativos de un experimento hecho por triplicado para cada
condición. Se tomaron alícuotas a distintos tiempos de incubación (24, 48 y 72
hrs) de los medios de incubación de 100 µM de α-sinucleína en presencia o
ausencia 100 µM de aminocromo. La figura 17 A, nos muestra los espectros
obtenidos del medio de incubación de α-sinucleína sola. El espectro negro nos
mostró que con 24 hrs de agitación de 100 µM de α-sinucleína sola a 37 ºC no
se produjo un cambio aparente en la estructura secundaria de la proteína,
manteniéndose ésta en estructura de ovillo al azar (observado por la gran señal
negativa de absorvancia a los 200 nm de longitud de onda), tal como esta
descrita para los monómeros de α-sinucleína (Conway et al., 2000a). El
espectro rojo, nos mostró que 48 hrs de agitación de 100 µM de α-sinucleína
sola a 37 ºC es suficiente para inducir un cambio conformacional de la proteína
a sábana-β, tal como se aprecia por el cambio del mínimo de elipticidad desde
200 a 220 y por la forma del espectro observado (Conway et al., 2000b). El
59
espectro verde, es el espectro de la α-sinucleína sola incubada por 72 hrs y
nos indicó que luego del cambio conformacional a 48 hrs, las estructura
sábana-β se mantiene estable por sobre 72 hrs La figura 17 B, nos muestra los
espectros obtenidos del medio de incubación de 100 µM de α-sinucleína con
100 µM de aminocromo puro. El espectro negro, nos indicó que luego de 24 hrs
de incubación aún no hay cambio conformacional de la α-sinucleína, tal como
se observó cuando se incubó sola. El espectro rojo, nos mostró que hay cierta
aparición de estructura sábana-β, pero es menor a la observada en la
incubación de α-sinucleína sola a las 48 hrs Esto se demostró por el grado de
torsión de la luz a 220 nm de λ, donde en la incubación de α-sinucleína sola es
de aproximadamente –3,5 miligrados y en la incubación de α-sinucleína con
aminocromo es de aproximadamente -2,5 miligrados. A diferencia del espectro
de α-sinucleína sola, el espectro de la incubación de α-sinucleína con
aminocromo no es típico de estructura sábana-β ya que el mínimo de torsión no
fue a 220 nm, sino cerca de los 205 nm de λ. Sin embargo, se observó una
disminución bastante marcada de la estructura ovillo al azar, pero sin que toda
esta estructura haya adquirido estructura sabana-β y menos hélice-α. El
espectro verde, nos indicó que la incubación de α-sinucleína con aminocromo
por 72 hrs indujo una mayor transformación a sábana-β que a las 48 hrs,
corroborando los datos anteriores de la capacidad del aminocromo para
disminuir la velocidad de fibrilación de α-sinucleína, pero ya no se observa
estructura ovillo al azar, sin embargo, el espectro tampoco mostró una forma
típica para sábana-β, hélice-α u ovillo al azar.
La figura 18 muestra fotografías representativas de alícuotas de los
mismos medios de incubación de α-sinucleína sola y α-sinucleína con
aminocromo incubados por 48 hrs, usados para determinación de estructura
secundaria con dicroismo circular y de fibrilación con TioT. En la figura 18 A
vemos una fotografía tomada con aumento de 33000 x de un medio de
incubación de α-sinucleína sola. La figura 18 B corresponde a la ampliación de
el área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 18 A. Bajo las
condiciones descritas, la incubación de α-sinucleína sola generó gran cantidad
60
de fibras de 10-15 nm de ancho no electrónicamente densas, por lo que solo se
observaró por la delimitación de las estructuras con la tinción de acetato de
uranilo (flechas negras en figura 18 B). Estas fibras aparecieron asociadas
entre sí en una forma muy densa y no ordenada que generó estructuras
amorfas de entre 0,5-15 µm de longitud (flecha blanca en figura 18 A). Las
fibras observadas son muy similares a las fibras descritas para α-sinucleína
(Conway et Al., 2000b; Spillantini et al., 1998). Esta incubación de α-sinucleína
sola no generó otro tipo de estructura. La figura 18 C muestra una fotografía
representativa tomada con aumento de 33000 x del medio de incubación de α-
sinucleína con aminocromo. La figura 18 D corresponde a una ampliación de
una fotografía de la incubación de α-sinucleína con aminocromo. La incubación
de α-sinucleína con aminocromo disminuyó notoriamente la cantidad de fibras,
lo que se aprecia en la disminución del tamaño y de la cantidad de las
estructuras compuestas de fibras agrupadas (flechas gruesas y blancas de la
figura 18 C). Las estructuras fibrilares mas grandes no superaron los 0,4 µm de
diámetro. Además de la disminución en la cantidad de fibras, se observó la
aparición de pequeñas estructuras globulares, que no eran electrónicamente
densas y por lo tanto solo observadas con tinción negativa. Estas estructuras
se encontraron distribuidas por toda la grilla de observación microscópica de
manera homogénea, en todas las grillas observadas para esta condición. La
figura 18 D muestra la ampliación de estas estructuras globulares. Estas
corresponden a estructuras globulares de entre 15-25 nm (flechas negras de
figura 18 D), similares a lo observado en la incubación por 5 días sin agitación
(figura 15 C y D) y a las descritas previamente (Conway et al., 2000a; Lee y
Lee, 2002).
Las observaciones por microscopía electrónica recién descritas fueron
realizadas luego de incubación por 48 hrs, por lo que nos quedó la duda si las
pequeñas estructuras globulares son una estructura alternativa a la fibra ó son
precursoras de estas. Como previamente se observó, la agregación de α-
sinucleína inducida por aminocromo comenzó con la formación de polímeros de
bajo peso molecular (40-200 kDa) y luego de 48 hrs se obtuvo estructuras
globulares de 15-25 nm de diámetro. Por lo tanto, se supuso que si estas
61
estructuras globulares son el precursor de las fibras, entonces tendríamos una
agregación secuencial que comienza con la aparición de polímeros de 40-200
kDa, luego continua con la aparición de estructuras globulares de 15-25 µm de
diámetro con características de pre-fibra y finaliza en la formación de fibras. De
esta forma, mientras aparecen estructuras de gran tamaño, las estructuras de
bajo peso molecular deberían ir disminuyendo gradualmente. Por lo tanto,
realizamos western blot para detectar α-sinucleína a tiempos distintos de
incubación de α-sinucleína con aminocromo. A mayor tiempo de incubación los
agregados de bajo peso molecular deberían disminuir y los polímeros de alto
peso molecular aumentar. La figura 19 nos muestra el resultado de Western
blots para la incubación por 48 y 102 hrs de (1) 100 µM de α-sinucleína sola ó
(2) 100 µM de α-sinucleína junto a 100 µM de aminocromo en 20 mM MES pH
6,5; 100 mM NaCl a 37 ºC con agitación constante a 200 rpm. La incubación de
α-sinucleína sola por 48 hrs que se muestra en la figura 19 A, no mostró
aparición de polímeros α-sinucleína positivos de 40-200 kDa., aunque si se
observaron estructuras de alto peso molecular que no entraron al gel
separador. La incubación de α-sinucleína sola por 102 hrs que se observa en la
figura 19 B, tampoco mostró polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa.
Además, los polímeros de alto peso molecular desaparecieron. Al incubar α-
sinucleína con aminocromo por 48 hrs, apareció una señal difusa
correspondiendo a polímeros de α-sinucleína de entre 40 hasta sobre los 190
kDa, señal que es mucho mas fuerte alrededor de los 190 kDa. También
apareció una señal que corresponde a polímeros de alto peso molecular (flecha
negra continua) similar a lo ocurrido con α-sinucleína sola, pero además
pudimos ver un precipitado en el bolsillo de carga reconocido con anticuerpo
anti α/β-sinucleína (flecha blanca y gruesa). Al incubar α-sinucleína con
aminocromo por 102 hrs, se mantuvo la presencia de polímeros α-sinucleína
positivos de entre 40 hasta sobre los 190 kDa, de los polímeros de alto peso
molecular presentes en el gel concentrador (flecha negra continua) y de la
marca del precipitado α-sinucleína positivo sobre el bolsillo, pero fuera del gel
(flecha blanca y gruesa). Las figuras 19 B y 19 D, corresponden a gráficos que
62
muestran la cuantificación de la marca de entre 40-200 kDa para α-sinucleína
en presencia o ausencia de aminocromo de tres experimentos distintos cada
gráfico. El gráfico de la figura 19 B, corresponde a la cuantificación de la
incubación por 48 hrs y la figura 19 D la incubación por 102 hrs Estos gráficos
claramente comprueban que incluso luego de la incubación por 102 hrs de α-
sinucleína con aminocromo, hay un marcado aumento de los polímeros de 40-
200 kDa en comparación con lo observado en la incubación de α-sinucleína
sola.
63
Figura 14. Agregación de αααα-sinucleína inducida por aminocromo purificado.
(A) Western blot incubado con anticuerpo anti-α/β-sinucleína de los incubados de: (1) α-sinucleína sola y (2) α-sinucleína y aminocromo. La línea fragmentada indica el límite entre el gel separador y el gel concentrador. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de los pixeles totales de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos diferentes, de las condiciones mostradas en la figura 14A. ** = p< 0,01. Test Student.
30,6
71
17,8
kDa
202
41,8
1 2
A
6,9
Pix
eles
0
10000
20000
30000
40000
1 2
B **
Límite entre gel separador y concentrador
64
Figura 15. Determinación por microscopía electrónica de estructuras globulares inducidas por aminocromo.
(A) fotografía representativa con aumento de 30000 x de la incubación por 5 días sin agitación de α-sinucleína sola. Flechas negras indican estructuras amorfas que también se observaron en controles sin α-sinucleína. (B) Ampliación del cuadro negro dentro de la figura 15 A. Barra = 0,25 µm. (C) fotografía representativa con aumento de 30000 x de la incubación por 5 días sin agitación de α-sinucleína con aminocromo. Flechas blancas indican estructuras electrónicamente densas de diferentes tamaños que también fueron observados en la incubación de dopamina y tirosinasa sin α-sinucleína. (D) Ampliación del cuadro negro dentro de la figura 15 C. Las flechas negras indican estructuras globulares de 15-25 nm de diámetro, observadas solo con tinción negativa. Barras inferiores = 0,25 µm.
B A
C D
65
Figura 16. Determinación de la cinética de fibrilación de αααα-sinucleína en presencia y ausencia de aminocromo.
Aumento en la fluorescencia de tioflavina T a 480 nm de longitud de onda que representa la formación de fibras tipo amiloide, a medida que aumenta el tiempo de incubación de α-sinucleína en dos condiciones diferentes. La curva con puntos negros muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína sola y la curva roja muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína junto a aminocromo. Cada curva fue realizada incluyendo los datos de tres incubaciones separadas para cada condición.
Tiempo (Horas)
0 20 40 60 80 100 120
Un
idad
es a
rbitr
aria
s de
fluo
resc
enci
a de
Tio
T
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
alfa-Sinucleina alfa-Sinucleina + Aminocromo
66
Figura 17. Determinación de la estructura secundaria de αααα-sinucleína en presencia y ausencia de aminocromo.
Cada gráfico muestra los espectros obtenidos por dicroísmo circular de la α-sinucleína incubada por 24, 48 y 72 hrs en presencia o ausencia de aminocromo. (A) Espectros de dicroísmo circular de α-sinucleína sola incubada por 24 hrs (curva negra), 48 hrs (curva roja) y 72 hrs (curva verde). (B) Espectros de dicroísmo circular de α-sinucleína incubada con aminocromo por 24 hrs (curva negra), 48 hrs (curva roja) y 72 hrs (curva verde).
alfa-sinucleina sola
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad (
mgr
ados
)
-8
-6
-4
-2
0
2
24Hrs48 Hrs72 Hrs
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
elip
ticid
ad (
mgr
ados
)
-8
-6
-4
-2
0
2
24 Hrs48 Hrs72 Hrs
A B
67
A
Figura 18. Inhibición de fibrilación e inducción de oligómeros de αααα-sinucleína por aminocromo.
(A) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de α-sinucleína sola luego de 48 hrs de incubación con agitación. La flecha blanca indica la gran estructura oscura, compuesta de fibras agregadas en forma densa. (B) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 18 A Las flechas negras induzcan algunas fibras individuales de las que esta formada la estructura de la figura 18 A. (C) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de α-sinucleína con aminocromo, luego de 48 hrs de incubación con agitación. Las flechas blancas indican estructuras similares a las observadas en la incubación de α-sinucleína sola, pero de mucho menor tamaño. (D) Ampliación de una fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de α-sinucleína con aminocromo luego de 48 hrs de incubación con agitación. Las flechas negras indican pequeñas estructuras globulares de entre 15-25 nm de diámetro y que no se observaron en la incubación de α-sinucleína sola. Las barras inferiores representan 0,57 µmetros.
B
C D
68
Figura 19. Determinación de la agregación αααα-sinucleína a polímeros de bajo peso molecular por aminocromo.
(A) Western blot incubado con anticuerpos específicos para α/β-sinucleína de la incubación por 48 hrs con agitación constante de α-sinucleína en ausencia y presencia de aminocromo. La flecha y línea discontinua marcan el límite entre el gel concentrador y separador. La flecha continua indica presencia de estructuras α-sinucleína positivas, de alto peso molecular que no pudieron entrar al gel separador. La flecha blanca indica un precipitado α/β-sinucleína positivo en el bolsillo de carga. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos diferentes, de las condiciones mostradas en la figura 16 A. (C) Western blot incubado con anticuerpos específicos para α/β-sinucleína de la incubación por 102 hrs con agitación constante de α-sinucleína en presencia o ausencia de aminocromo. La flecha y línea discontinua marcan el límite entre el gel concentrador y separador. La flecha continua indica presencia de estructuras α-sinucleína de alto peso molecular que no entraron en el gel separador. La flecha blanca indica un precipitado α/β-sinucleína positivo en el bolsillo de carga. (D) Gráfico que muestra la cuantificación de los pixeles totales de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos diferentes, de las condiciones mostradas en la figura 16 C. La medición de los pixeles totales fue realizado con el programa Scion Image. * = p< 0,05; ** = p< 0,01. Test Student.
1 2
60
40
25
15
85
120
190
kDa
1 2
Gel separador
Límite gel concentrador
A B
1 2
60
15
85
25
40
120
190
kDa
Gel separador
Límite gel concentrador
C
1 2
D
**
*
69
Objetivo 4. Comprobar por estudios in vitro, que la reducción de
aminocromo con un electrón aumenta la capacidad del aminocromo de
inducir la agregación de αααα-sinucleína.
Efecto de la reducción de aminocromo con un electró n en la agregación
de αααα-sinucleína
El cuarto objetivo de esta tesis fue determinar si la reducción de
aminocromo con un electrón, lo que conlleva a la aparición del radical
leucoaminocromo-o-semiquinona (Baez et al., 1995; Segura-Aguilar et al.,
1998), aumenta la capacidad del aminocromo de inducir la agregación de α-
sinucleína. Para reducir el aminocromo con un electrón, se usó la enzima
NADH citocromo C reductasa en presencia de NADH. Hasta el momento, la
reducción de aminocromo con un electrón solo se ha realizado incubando
dopamina con un catalizador de la oxidación junto a una flavoenzima reductasa
y NADH o NADPH, por lo tanto, nosotros aplicamos este modelo al ensayo de
agregación de α-sinucleína. Se incubó 10 µM de α-sinucleína, 100 µM de
dopamina, 10 ng/ml de tirosinasa en presencia o ausencia de 250 µM NADH y
50 µg/ml de citocromo C reductasa en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 por 4 hrs a 37 ºC
sin agitación. En la figura 20 pudimos observar la aparición agregados de α-
sinucleína de entre 40-200 KD inducidos por dopamina al oxidarse con
tirosinasa (carril 2), sin embargo, contrario a lo que se pensaba la presencia de
citocromo C reductasa previno la agregación de α-sinucleína (carril 3). El carril
5 muestra el efecto que ejerció la incubación de 25 ng/ml de SOD y 25 ng/ml de
catalasa junto a α-sinucleína, dopamina, tirosinasa, NADH y citocromo C
reductasa. Se observó la misma disminución en la agregación de α-sinucleína
(comparar carriles 3 y 5). Es interesante observar que la presencia de SOD y
catalasa aumentó la agregación de α-sinucleína que indujo la dopamina al
oxidarse (comparar carriles 2 y 4), pero la incubación de α-sinucleína con SOD
y catalasa en ausencia de dopamina y tirosinasa no indujo agregación
(comparar carriles 4 y 8).
70
El siguiente paso fue determinar si la reducción del aminocromo con un
electrón inhibe la agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo, al igual
que lo observado en la incubación de dopamina y tirosinasa. Se incubó 10 µM
de α-sinucleína, 10 µM aminocromo en presencia o ausencia de 250 µM NADH
y 50 µg/ml de citocromo C reductasa en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 por 4 hrs a 37
ºC sin agitación. Los resultados de cada incubación se muestran en la figura
21. Al igual que lo ocurrido en la incubación de α-sinucleína con dopamina y
tirosinasa, la citocromo C reductasa inhibió la agregación de α-sinucleína
inducida por aminocromo puro (carriles 2 y 3). Luego, 25 ng/ml de SOD y 25
ng/ml de catalasa no fueron capaces de revertir el efecto de la citocromo C
reductasa sobre la agregación de α-sinucleína (carril 5 al compararlo con carril
3), confirmando lo observado con dopamina y tirosinasa en la figura 20.
Finalmente, también se observó que la adición de SOD y catalasa al medio con
α-sinucleína y aminocromo, aumentó significativamente la agregación de α-
sinucleína.
A continuación se quiso determinar el efecto que tiene la citocromo C
reductasa sobre la inhibición en la formación de fibras de α-sinucleína inducida
por aminocromo por aminocromo. Para esto, se incubó 100 µM de α-sinucleína
y 100 µM de Aminocromo en presencia o ausencia de 500 µM de NADH y 10
µg/ml de citocromo C reductasa en 20 mM MES pH 6; 100 µM NaCl por 4 días
a 37 ºC con agitación a 200 rpm. La figura 22, nos muestra el aumento en la
fluorescencia de TioT medido a 480 nm de λ versus tiempo de incubación en
horas. Tal como se vio anteriormente, el aminocromo aumenta el tiempo medio
de fibrilación de la α-sinucleína sola de 25,3 ± 1,6 hrs a 37 ± 4,3 hrs La
citocromo C reductasa no logra revertir este efecto del aminocromo, con un
tiempo medio de 33 ± 4,4 hrs y una cinética muy parecida a la observada para
α-sinucleína con aminocromo.
La figura 23 A, B y C muestran el cambió de estructura secundaria
determinada por la técnica de dicroísmo circular a distintos tiempos: (A) 24 hrs;
(B) 48 hrs y (C) 72 hrs. Las condiciones evaluadas a estos tres tiempos fueron:
(i) espectro negro, 100 µM de α-sinucleína sola; (ii) Espectro rojo, 100 µM de α-
71
sinucleína con 100 µM de aminocromo y (iii) Espectro verde,100 µM α-
sinucleína, 100 µM de aminocromo, 500 µM NADH y 10 µg/ml de citocromo C
reductasa. Todas las condiciones incubadas en 20 mM MES pH 6,5; 100 mM
NaCl a 37ºC con agitación constante a 200 rpm. A las 24 hrs ninguna condición
mostró un cambio de estructura secundaria, manteniéndose las tres con
configuración de ovillo al azar. Tal como se observa en la figura 23 B, a las 48
hrs la incubación de α-sinucleína sola mostró un completo cambio
conformacional de ovillo al azar a sábana-β lo que disminuyó en presencia de
aminocromo, sin embargo, la reducción de aminocromo con un electrón por la
citocromo C reductasa inhibió casi completamente el cambio de estructura
secundaria de la α-sinucleína de ovillo al azar a sábana-β, observándose un
espectro similar a lo observado a las 24 hrs. Como se observa en la figura 23
C, luego de 72 hrs de incubación se observó que: (i) La α-sinucleína sola
mostró un espectro típico de estructura sábana-β; (ii) la incubación de α-
sinucleína en presencia de aminocromo dio un espectro que indica que no hay
transformación preferentemente a sabana-β, aunque se observa desaparición
total de estructura ovillo al azar. (iii) la presencia de citocromo C reductasa y
NADH junto a α-sinucleína y aminocromo previno en parte la desaparición de
estructura de ovillo al azar y provocó una disminución en la estructura sábana-
β. Para poder observar los cambios de estructura secundaria que ocurrieron
con el tiempo en la incubación de α-sinucleína, aminocromo, citocromo C
reductasa y NADH, se compuso la figura 23 D. Esta figura muestra los
espectros a 24 (línea negra), 48 (línea roja) y 72 hrs (línea verde),
observándose que con el tiempo fue disminuyendo en parte la estructura ovillo
al azar, y hubo un aumento discreto de estructura sábana-β.
Los mismos medios de incubación analizados por dicroismo circular y
fluorescencia con TioT fueron analizados por microscopía electrónica usando la
técnica de tinción negativa. La figura 24 A corresponde a una fotografía
representativa del medio de incubación de α-sinucleína con aminocromo,
tomada con aumento de 33000 x. Como ya se vio anteriormente, la incubación
de α-sinucleína con aminocromo generó algunas estructuras compuestas
72
exclusivamente por fibras. Estas estructuras fueron similares a las observadas
en la incubación de α-sinucleína sola, pero de mucho menor tamaño (0,5-1,5
µm de diámetro) y menos densas (flechas blancas gruesas en figura 24 A).
También aparecieron estructuras globulares de 15-25 nm de diámetro solo
observadas por contraste con tinción negativa, tal como se observa en la figura
24 A indicada con las flechas negras y en la figura 24 B, que es una ampliación
del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 24 A. La figura 24 C,
muestra una fotografía representativa del medio de incubación de α-sinucleína
y aminocromo en presencia de citocromo C reductasa y NADH, tomada con
aumento de 33000 x. En esta incubación, aparecieron estructuras compuestas
solo de fibras, similares a las observadas con α-sinucleína y aminocromo, pero
de mayor tamaño (1,5-3 µm de diámetro) (flecha blanca y gruesa en figura 24
C). También se observó la presencia de las estructuras globulares de 15-25 nm
solo observadas con tinción negativa, similares a las observadas en la
incubación de α-sinucleína con aminocromo pero en menor cantidad,
(estructuras indicadas por flechas negras en figura 24 C y en 24 D que es una
ampliación de área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 24 C).
73
Figura 20. Efecto de la citocromo C reductasa sobre la agregación de αααα-sinucleína inducida por la dopamina al oxidarse con tirosinasa.
(A) Western blot incubado con anticuerpo anti α/β-sinucleína para la incubación por 4 hrs sin agitación de las siguientes condiciones: (1) α-sinucleína sola; (2) α-sinucleína + dopamina + tirosinasa; (3) α-sinucleína + dopamina + tirosinasa + citocromo C reductasa + NADH; (4) α-sinucleína + dopamina + tirosinasa + SOD + catalasa; (5) α-sinucleína + dopamina + tirosinasa + citocromo C reductasa + NADH + SOD + catalasa; (6) α-sinucleína + dopamina; (7) α-sinucleína + tirosinasa; (8) α-sinucleína + citocromo C reductasa + NADH; (9) α-sinucleína + SOD + catalasa. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de las bandas entre 42-202 kDa de tres experimentos diferentes, de las condiciones mostradas en la figura 20 A con el programa Scion Image. ** p< 0,01 al comparar con carril 1; ++ p<0,01 . ANOVA, Test Tukey.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
6,9
71
30,8
17,8
41,8
133 202
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
1 2 3 4 5 6 7 8 9
pixele
s
**
**
B
++
++
74
Figura 21. Efecto del citocromo C reductasa sobre la agregación de αααα-sinucleína inducida por aminocromo.
(A) Western blot incubado con anticuerpo anti-α/β-sinucleína para incubaciones por 4 horas sin agitación de las siguientes condiciones: (1) α-sinucleína sola. (2) α-sinucleína + aminocromo. (3) α-sinucleína + aminocromo + NADH + citocromo C reductasa. (4) α-sinucleína +aminocromo + SOD + catalasa. (5) α-sinucleína + aminocromo + NADH + citocromo C reductasa + SOD + catalasa. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos distintos de las diferentes condiciones mostradas en la figura 21 A. La cuantificación de pixeles totales fue realizado con el programa Scion Image. ** p < 0,01 al comparar con carril 1; ++ p< 0,01. ANOVA, Test de Tukey.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
1 2 3 4 5p
ixele
s
++
++
++
17,8
202
71
41,8
133
30,8
6,9
kDa
1 2 3 4 5
A B
**
**
*
*
75
T ie m p o (H rs .)
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
Uni
dade
s ar
bitr
aria
s de
fluo
resc
enci
a
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0 s in u c le in a s o las in u c le in a + a m in o c ro m os in u c le in a + a m in o c ro m o + re d u c ta s a
22.-Efecto de la citocromo C reductasa sobre los cambios en la velocidad de fibrilación de αααα-sinucleína que ejerce el aminocromo, medidos por fluorescencia de tioflavina T.
Aumento en la fluorescencia de TioT a 480 nm de longitud de onda que representa la formación de fibras tipo amiloide, a medida que aumenta el tiempo de incubación de α-sinucleína en tres condiciones diferentes. Los círculos negros muestran la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína sola. Los círculos blancos muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína con aminocromo. Los triángulos negros muestran la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y citocromo C reductasa. Cada curva se realizo considerando la cinética de tres experimentos diferentes.
76
Figura 23. Efecto de la citocromo C reductasa en los cambios conformacionales de la αααα-sinucleína inducidos por el aminocromo.
(A) Espectros de dicroísmo circular tomados a 24 hrs. (B) Espectros de dicroísmo circular tomados a 48 hrs. (C) Espectros de dicroísmo circular tomados a 72 hrs. Las condiciones determinadas en los espectros de dicroísmo circular fueron: α-sinucleína sola (espectro negro); α-sinucleína con aminocromo (espectro rojo); α-sinucleína y aminocromo en presencia de NADH y citocromo C reductasa (espectro verde). (D) Espectros de α-sinucleína incubada con aminocromo, NADH y citocromo C reductasa a 24 hrs (espectro negro), 48 hrs (espectro rojo), 72 hrs (espectro verde).
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad (
mgr
ados
)
-8
-6
-4
-2
0
2
α−sinucleina solaα-sinucleina + aminocromoα-sinucleina+aminocromo+cit C red.
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad (
mgr
ados
)
-6
-4
-2
0
2
α-sinucleinaα-sinucleina+aminocromoα-sinucleina+aminocromo+cit C red
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad (
mgr
ados
)
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
α−sinucleinaa-sinucleina+aminocromoα-sinucleina+aminocromo+ cit C red
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad (
mgr
ados
)
-8
-6
-4
-2
0
2
24 Hrs48 Hrs72 Hrs
A
D C
B
77
Figura 24. Determinación de la disminución de los oligómeros de αααα-sinucleína por la reducción de aminocromo con un electrón.
(A) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de 48 hrs con agitación de α-sinucleína con aminocromo. Las flechas negras indican las estructuras oligoméricas de α-sinucleína que son ampliadas en la figura 24 B. (B) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 24 A. Las flechas negras indican las estructuras globulares de 15-25 µm de diámetro observadas solo por tinción negativa que también se señalan en la figura 24 A. (C) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación por 48 hrs con agitación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y citocromo C reductasa. La flecha blanca indica una estructura fibrilar similar a lo observado en la incubación de α-sinucleína sola y α-sinucleína con aminocromo, pero de mayor tamaño que las observadas con α-sinucleína y aminocromo y menor que las observadas con α-sinucleína sola. Las flechas negras indican estructuras globulares de α-sinucleína que son ampliadas en 24 D. (D) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 24 A. Las flechas negras indican pequeñas estructuras globulares de entre 15-25 nm de diámetro que también se señalan en la figura 24 C. Las barras al inferior de cada figura corresponden a 0,59 µmetros.
A
C
B
D
78
Objetivo 5. Demostrar por estudios in vitro, que la DT-diaforasa disminuye
la agregación de αααα-sinucleína inducida por la reducción de aminocromo
con un electrón.
Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de αααα-sinucleína inducida
por aminocromo
El último objetivo de la tesis fue demostrar que la DT-diaforasa inhibe in
vitro la agregación de α-sinucleína a oligómeros, que debía ser inducida por
aminocromo al reducirse con un electrón. Sin embargo, nuestros resultados
indicaron que la reducción de aminocromo con un electrón previene esta
agregación y demostramos que el aminocromo sin reducirse, es capaz de
inducir esta agregación. Por lo tanto, quisimos determinar si la DT-diaforasa es
capaz de inhibir la agregación inducida por aminocromo solo in vitro.
La DT-diaforasa reduce al aminocromo con dos electrones, sin embargo,
no hay datos previos sobre la reducción de aminocromo puro por esta enzima.
Se determinó los parámetros cinéticos de la DT-diaforasa sobre el aminocromo
puro. Para esto, se determinó la cinética de desaparición de aminocromo por la
DT-diaforasa. La desaparición de aminocromo fue determinado a 37 ºC y pH
7,5 por la disminución de la absorción a 478 nm de λ en una reacción que fue
completamente inhibida por dicumarol. Bajo estas condiciones, se determinó
que la Km fue de 95 µM y la actividad de 49 µmoles de aminocromo/min/mg de
DT-diaforasa.
Se determinó el efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de α-
sinucleína inducida por aminocromo. Para esto, se incubó 10 µM α-sinucleína
con 10 µM aminocromo en presencia y ausencia de 250 µM NADH y 2,5 µg/ml
DT-diaforasa, todo incubado en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 a 37 ºC por 4 hrs y sin
agitación. Además, se determinó el efecto de SOD y catalasa sobre esta
incubación, ya que se ha descrito que estas enzimas potencian la acción
protectora de la DT-diaforasa. La figura 25 corresponde a un Western blot
incubado con anticuerpo anti α/β-sinucleína y muestra en el carril 2, cómo el
aminocromo indujo la agregación de α-sinucleína a estructuras de 40-200 kDa.
79
El carril 1 corresponde a la incubación de α-sinucleína sola. En el carril 3, se
observa como la DT-diaforasa inhibió completamente la aparición de polímeros
de α-sinucleína de 40-200 kDa inducidos por aminocromo. La figura 25 B,
corresponde a la cuantificación de los polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa
en cada condición mostrada en el Western blot de la figura 25 A, de tres
experimentos hechos por separado. En esta figura se demuestra que la
inhibición de la formación de los polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa, por
la presencia de DT-diaforasa, es muy significativa. En este ensayo no se vio un
aporte de las enzimas SOD y catalasa sobre la inhibición de los polímeros de
40-200 kDa de α-sinucleína (carril 4).
Se quiso ver el efecto de la DT-diaforasa sobre la disminución de la
fibrilación de α-sinucleína que induce el aminocromo. Para esto se incubó 100
µM de α-sinucleína y 100 µM de aminocromo en presencia o ausencia de 500
µM de NADH y 100 ng/ml de DT-diaforasa. La incubación en 20 mM MES pH
6,5; 100 µM NaCl, por 4 días a 37ºC con agitación a 200 rpm. La figura 26
muestra la cinética de fibrilación de α-sinucleína bajo las siguientes
condiciones: (i) círculos negros, cinética de fibrilación de la incubación de α-
sinucleína sola; (ii) círculos blancos, cinética de fibrilación de la incubación de
α-sinucleína con aminocromo; (iii) triángulos invertidos negros, cinética de
fibrilación de la incubación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y DT-diaforasa.
La formación de fibras fue determinada por aumento de la fluorescencia de
TioT a 480 nm de λ. Tal como se analizó anteriormente, el aminocromo
aumentó el tiempo medio de fibrilación de α-sinucleína de 25,3 ± 1,3 hrs hasta
37 ± 4,3 hrs La reducción de aminocromo por DT-diaforasa inhibió
completamente la formación de fibras de α-sinucleína, observándose que no
hubo aumento de fluorescencia de TioT, es decir, no hubo formación de fibras
tipo amiloides. Para comprobar este efecto, se midió el cambio de
conformación a través de la técnica de dicroísmo circular. La figura 27 muestra
el cambió de estructura secundaria a distintos tiempos: figura 27 A, 24 hrs; 24
B, 48 hrs; y 24 C, 72 hrs para la incubación de: (i) espectro negro, 100 µM de
α-sinucleína sola; (ii) espectro rojo, 100 µM de α-sinucleína con 100 µM de
80
aminocromo y (iii) espectro verde,100 µM α-sinucleína, 100 µM de
aminocromo, 500 µM NADH y 100 ng/ml de citocromo C reductasa. Cada
condición incubada en 20 mM MES pH 6,5; 100 mM NaCl a 37 ºC con agitación
constante a 200 rpm. Al igual que lo observado anteriormente, 24 hrs de
incubación con agitación no fueron suficientes para generar cambio de
estructura secundaria de la α-sinucleína desde ovillo al azar, en ninguna
condición. 48 hrs de incubación de α-sinucleína sola fueron suficientes para
inducir el cambio de estructura desde ovillo al azar hasta sábana-β, en cambio
en la incubación de α-sinucleína con aminocromo la desaparición de la
estructura ovillo al azar y la aparición de estructura sábana-β es mucho menor
que con α-sinucleína sola. La presencia de DT-diaforasa en la incubación por
48 hrs inhibió completamente cambio de estructura secundaria, manteniéndose
toda la α-sinucleína con conformación de ovillo al azar. Luego de 72 hrs de
incubación, la incubación de α-sinucleína sola mostró un espectro típico de
estructura preferentemente sábana-β y La incubación de α-sinucleína y
aminocromo mostró un espectro que indicó la desaparición de proteína con
estructura de ovillo al azar, aunque no un cambio completo a estructura
sábana-β. La incubación de α-sinucleína junto a aminocromo, NADH, y DT-
diaforasa por 72 hrs aún no muestran ningún cambio en la estructura
secundaria, manteniéndose en forma de ovillo al azar. Para observar esto con
mejor detalle se compuso la figura 27 D, donde se incluyeron los espectros
generados por dicroismo circular de la α-sinucleína en presencia de
aminocromo, NADH y DT-diaforasa por 24 hrs (línea negra), por 48 hrs (línea
roja) y 72 hrs (línea verde). Al comparar los tres espectros, vemos que no hay
diferencias entre ellos con un espectro típico de ovillo al azar, es decir, la α-
sinucleína en forma monomérica.
Finalmente, se quiso observar el efecto de la DT-diaforasa y NADH en
las estructuras poliméricas que se inducen por incubación de α-sinucleína junto
a aminocromo. Se tomó una alícuota de las incubaciones por 48 hrs de α-
sinucleína con aminocromo y α-sinucleína, aminocromo, NADH y DT-diaforasa,
usadas para el estudio por dicroismo circular y TioT. Con estas se incubó una
81
grilla con una membrana de Formvar, que luego se tiño con acetato de uranilo.
Finalmente estas grillas fueron observadas por microscopía electrónica. La
observación de estas grillas nos evidenció que la presencia de DT-diaforasa y
NADH en la incubación de α-sinucleína y aminocromo inhibió completamente la
aparición de estructuras fibrilares y casi completamente la aparición de las
estructuras globulares 15-25 µm de diámetro no electrónicamente densas. La
figura 28 muestra fotografías representativas que confirman este hecho. En la
figura 28 A, se muestra una fotografía tomada con un aumento de 33000 x,
donde se observan las estructuras globulares de 15-25 µm de diámetro no
electrónicamente densas (flechas negras), las cuales están distribuidas
homogéneamente y en las grillas observadas para la incubación de α-
sinucleína y aminocromo. La figura 28 B es una ampliación de la figura 28 A,
donde se aprecian con más claridad estas estructuras, donde se indican con
flechas las mismas estructuras señaladas en la figura 28 A. La figura 28 C es
una fotografía de una membrana de Formvar incubada con una alícuota de la
incubación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y DT-diaforasa. En esta, se
observa una membrana bastante limpia, sin estructuras fibrilares ni globulares
lo que se confirma al ampliar la fotografía en la figura 28 D y observar que las
marcas observadas en la figura 28 C y marcadas con flechas punteadas, solo
corresponden a estructuras amorfas no relacionadas a estructuras observadas
previamente para polímeros de α-sinucleína.
82
B
Figura 25. Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de αααα-sinucleína inducida por aminocromo.
(A) Western blot incubado con anticuerpo anti-α/β-sinucleína para incubaciones por 4 horas sin agitación de: (1) α-sinucleína sola; (2) α-sinucleína + aminocromo; (3) α-sinucleína + aminocromo + NADH + DT-diaforasa; (4) sinucleína + NADH + DT-diaforasa + SOD + catalasa; (5) α-sinucleína + SOD + catalasa. (B) Gráfico que muestra la cuantificación de las bandas entre 42-202 kDa de 3 experimentos distintos de las distintas condiciones mostradas en la figura 25 A. La cuantificación de pixeles totales fue realizado con el programa Scion Image. (** = p< 0,01. ANOVA; Test Tukey-Kramer)
6,9
17,8
31,3
40,4
71
202
kDa
1 2 3 4 5
A
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
1 2 3 4 5
Pix
eles
**
83
Figura 26. Efecto de la DT-diaforasa sobre los cambios en la velocidad de fibrilación de αααα-sinucleína que ejerce el aminocromo, medidos por fluorescencia de tioflavina T.
Aumento en la fluorescencia de TioT a 480 nm de longitud de onda que representa la formación de fibras tipo amiloide, a medida que aumenta el tiempo de incubación de α-sinucleína en tres condiciones diferentes. La curva negra muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína sola. La curva roja muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína junto aminocromo. La curva verde muestra la cinética de formación de fibras por incubación de α-sinucleína con aminocromo, en presencia de NADH y DT-diaforasa. Cada curva se realizo considerando la cinética de tres experimentos diferentes.
Tiempo (Hrs)
0 20 40 60 80 100 120
Uni
dade
s A
rbitr
aria
s de
fluo
resc
enci
a
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180α−sinucleina solaα−sinucleina + aminocromoα−sinucleina + aminocromo + DT-diaforasasa
84
Figura 27. Efecto de la DT-diaforasa en los cambios conformacionales de la αααα-sinucleína inducidos por el aminocromo.
(A) Espectros de dicroismo circular tomados a 24 hrs. (B) Espectros de dicroismo circular tomados a 48 hrs. (C) Espectros de dicroismo circular tomados a 72 hrs. Las condiciones determinadas en los espectros (A)-(C) de dicroísmo circular fueron: α-sinucleína sola (espectro negro); α-sinucleína con aminocromo (espectro rojo); α-sinucleína y aminocromo en presencia de NADH y DT-diaforasa (espectro verde). (D) Espectros de α-sinucleína incubada con aminocromo, NADH y DT-diaforasa a 24 horas (espectro negro), 48 horas (espectro rojo), 72 horas (espectro verde).
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad
(mgr
ados
)
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
α-sinucleina sola
α-sinucleina+aminocromo
α-sinucleina+aminocromo+DT-diaforasa
A
Long itud de ond a (nm )
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad (
mgr
ados
)
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
α -s inuc le ina
α -s inuc le ina + am inocrom o
α -s inuc le ina+am inocrom o+D T -d ia forasa
B
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad (
mgr
ado
s)
-8
-6
-4
-2
0
2
α-sinucleina sola
α-sinucleina + aminocromo
α-sinucleina+aminocromo+DT-diaforasa
C
Longitud de onda (nm)
190 200 210 220 230 240 250 260 270
Elip
ticid
ad (
mgr
ados
)
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
24 hrs
48 hrs
72 hrs
D
85
Figura 28. Determinación de oligómeros de αααα-sinucleína en la incubación de αααα-sinucleína con aminocromo al reducirse por la DT-diaforasa.
(A) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación de 48 hrs con agitación de α-sinucleína con aminocromo. Las flechas negras indican las estructuras oligoméricas de α-sinucleína que son ampliadas en la figura 28 B. (B) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 28 A. Las flechas negras indican las estructuras globulares de 15-25 µm de diámetro observadas solo por tinción negativa también indicadas en la figura 28 A. (C) Fotografía tomada en un microscopio electrónico con aumento de 33000 x del medio de incubación por 48 horas con agitación de α-sinucleína, aminocromo, NADH y DT-diaforasa. Las flechas negras indican marcas electrónicamente densas y pequeñas que son ampliadas en 28 D. D) Ampliación del área delimitada por el cuadro negro dentro de la figura 28C. Las flechas negras indican marcas electrónicamente densas, amorfas y que no corresponden a ningún tipo de estructura descrita anteriormente para α-sinucleína. Las barras inferiores corresponden a 0,59 µmetros.
D C
A B
86
DISCUSIÓN
Expresión y purificación de αααα-sinucleína recombinante humana
El primer objetivo de esta tesis fue la obtención de α-sinucleína humana
recombinante, en forma monomérica y pura. Sin embargo, muchos son los
factores que pueden inducir la agregación de esta proteína y la concentración
es uno de ellos (Hashimoto et al., 1998). En este respecto, se definió un
protocolo de expresión y purificación de α-sinucleína recombinante que siguió
ciertas consideraciones para evitar la agregación de esta proteína, tanto dentro
de la bacteria como al momento de extraerla: (i) Se uso la bacteria de expresión
BL21(DE3)pLys S, la cual es una bacteria que mantuvo una expresión baja de
α-sinucleína; (ii) se comenzó con una baja inducción de la expresión con sólo
0,5 mM IPTG por 3 hrs a 30 ºC (Sambrook, Fritsch y Maniatis, ed. 1989; Manual
técnico pET system); (iii) Al ser una proteína que en forma monomérica y libre
en el citoplasma tiene conformación de ovillo al azar, no requiere de un mayor
cuidado al momento de su extracción, sin embargo, la presencia de detergentes
o solventes orgánicos es otro factor que induce la agregación de α-sinucleína
(Munishkina et al., 2003; Necula et al., 2003), así que se probó la extracción de
proteínas por sonicación y por la técnica de descongelado/congelado en
nitrógeno líquido.
Se probó la inducción de la expresión de α-sinucleína con distintas
concentraciones de IPTG, observando que bajo concentraciones de 0,5 mM de
IPTG disminuyó mucho la expresión de la α-sinucleína. Por otro lado,
concentraciones mayores a 0,5 mM de IPTG no mostraron diferencias en los
niveles de expresión de la proteína, probablemente debido al plasmidio pLysS
que mantiene una baja expresión de la proteína de interés. En relación a la
purificación de la α-sinucleína, se probó la lisis bacteriana por sonicación y
congelado/descongelado. Entre estas técnicas no se observó ninguna
diferencia en la cantidad de α-sinucleína obtenida, sin embargo, la técnica de
sonicación nos generó una gran contaminación con oligonucleótidos que
disminuyó notoriamente con la técnica de congelado/descongelado.
87
Tal como se observa en la figura 4, el protocolo (figura 3) no logró una
purificación adecuada de la α-sinucleína. Por esto, se modificó este protocolo
adicionándole una etapa de hervido del extracto total de la bacteria, tal como se
observa en el esquema de la figura 5. Luego del hervido del extracto bacteriano,
se eliminó la mayor parte de la proteína contaminante, pero como se observa
en la tabla de la figura 6 B, aún hay presencia de oligonucleótidos. Estos fueron
determinados por absorción a 260 nm, observando la razón 260/280 nm de λ.
Solo después de pasar la muestra a través de la resina de intercambio aniónico
DEAE-Sephadex A-50-120, se observó una razón menor a 1 (0,78), es decir,
disminución de la absorción a 260 nm lo que indicó disminución en la presencia
de oligonucleótidos. La pureza de la α-sinucleína fue demostrada por geles
SDS-PAGE teñidos con azul de coomasie y por tinción de plata. La muestra
también fue reconocida por anticuerpo anti-α-sinucleína.
Hay varias técnicas descritas para purificación de α-sinucleína donde no
se hierven las muestras, pero se requiere un equipo HPLC y columnas
especiales de intercambio iónico. En cambio, nuestra técnica no requirió el uso
de equipo cromatográfico y tiene ventajas por su simpleza. Este protocolo de
purificación, logró una concentración de α-sinucleína de 60-80 µM, sin embargo
se puede aumentar la concentración con modificaciones en el protocolo
descrito. Se probaron varias modificaciones al protocolo definido, siguiendo
sugerencias del Dr. Claudio Fernández (IBR, Rosario, Argentina). Se aumentó
el tiempo de incubación con IPTG a 16 hrs a 37 ºC, aumentando el rendimiento
del método sin observar presencia de polímeros de α-sinucleína en los
extractos celulares. El laboratorio del Dr. Claudio Fernández usa bacterias de
alta expresión sin observar polimerización de α-sinucleína. Por lo anterior, es
recomendable, para aumentar la expresión de la α-sinucleína, el uso de
bacterias sin plasmidios que reduzcan expresión, como la BL21(DE3).
Finalmente, se puede aumentar la concentración complementando la
purificación con una diálisis, tal como se describe en Hoyer et al. (2002).
88
Síntesis y purificación de aminocromo.
A la fecha ya han aparecido 5 trabajos que demuestran que un derivado
de la oxidación de la dopamina induce agregación de α-sinucleína,
estabilizando la estructura oligomérica y desestabilizando la estructura fibrilar
(Conway et al., 2001; Li et al, 2004; Cappai et al., 2005; Norris et al., 2005;
Follmer et al., 2007). En casi todos estos trabajos se asume que este derivado
de la oxidación de la dopamina es el aminocromo, debido a que el aminocromo
es el último metabolito de la cascada de reacciones que sufre la oxidación de la
dopamina. Los ensayos que muestra Norris et al. (2005) se realizaron en un
medio rico en aminocromo, determinado cromatográficamente, pero sin eliminar
los excedentes de dopamina ni del agente oxidante que el usó.
Para comprobar que el aminocromo induce la agregación de α-sinucleína
y determinar el efecto de la reducción del aminocromo con uno o dos electrones
sobre la esta agregación, fue clave la obtención de aminocromo puro. A la fecha
no existen protocolos descritos para la obtención de aminocromo puro, debido a
su inestabilidad, rápida polimerización a melanina (Solano et al., 2000), y a lo
difícil que resulta separar el aminocromo de la dopamina y de otros derivados
de la oxidación de la dopamina y catalizadores de la oxidación de la dopamina.
En esta tesis pudimos establecer un método sencillo y rápido para obtener
aminocromo puro y estable.
El primer paso fue estabilizar el aminocromo, es decir, evitar que
polimerizara a melanina. Para lo anterior, se probó la oxidación de dopamina
catalizada por tirosinasa a distintos pH, y se observó que entre pH 5,0 y pH 7,0
hubo una aparición de aminocromo con solo 10 min de incubación de dopamina
con tirosinasa a temperatura ambiente, sin embargo, a pH 7,0 este aminocromo
polimerizó a melanina luego de 1 hr de incubación a 4 ºC. En cambio a pH 6,0
se mantuvo sin polimerizar al menos por 4 hrs a 4 ºC. Estos estudios fueron
hechos con aminocromo en presencia de tirosinasa, dopamina no oxidada y
posiblemente otros derivados de la oxidación de la dopamina que no se
determinaron. Sin embargo, luego de haber purificado aminocromo se
determinó su estabilidad por sobre 6 hrs a 4 ºC y por sobre 3 hrs a 25 ºC lo que
sugirió que la incubación de aminocromo puro es mas estable que en presencia
89
de dopamina, tirosinasa y otros posibles metabolitos de la oxidación de la
dopamina.
Luego de oxidar aminocromo con tirosinasa a pH 6,0, se quiso separar el
aminocromo. Por la diferencia de los tamaños entre aminocromo, tirosinasa y
melanina, se intento la separación a través de resina de exclusión por tamaño
Sephadex G-25-80. Tal como se pensó, se logró una buena separación entre
estas especies, pero mas aún, se logró una marcada separación entre el
aminocromo y la dopamina, los cuales tienen pesos moleculares similares. Esta
separación se confirmó por espectroscopia UV-visible. Tal como se observa en
la figura 9 B, los espectros de aminocromo y dopamina son muy diferentes y se
puede determinar claramente la presencia de dopamina en una solución de
aminocromo, así el espectro mostrado en la figura 9 A nos evidenció la
obtención de un eluido con aminocromo en ausencia de dopamina. En esta
tesis pudimos determinar entonces el espectro de absorción de aminocromo
puro, el cual consta de tres picos: a 220nm, a 295nm y 478 nm de λ, lo que
recientemente fue confirmado por otro autor (Bisaglia et al., 2007). La
purificación de aminocromo se comprobó por 1H-NMR, técnica que nos
demostró que se pudo separar el aminocromo de dopamina, tirosinasa,
melanina y cualquier otro derivado de la oxidación de dopamina.
La separación lograda entre aminocromo y dopamina por resina de
exclusión por tamaño fue completamente inesperada. La diferencia en los
pesos moleculares de estas moléculas es de 3 gr/mol, esto es, la dopamina
tiene 3 átomos de hidrógeno más que el aminocromo. Esta diferencia en masa
no puede explicar la diferencia en la migración a través de la resina. Una
explicación de este hecho, es que a pH 6,0 el aminocromo y la dopamina
tengan diferencias en sus propiedades iónicas y que el aminocromo adquiera
una esfera de hidratación que aumente su tamaño, incluso por sobre el tamaño
de pigmento de melanina. Esto, debido a que tal como se observa en la figura 8
A, el aminocromo migró antes que el pigmento de melanina. El hecho de que a
pH 7,5 cambie la migración de la dopamina por una resina de exclusión por
tamaño, nos confirma el hecho de que las propiedades iónicas de estas
moléculas están afectando su migración y por lo tanto su tamaño.
90
Debido a las diferentes propiedades polares entre el aminocromo y
dopamina, se supuso que una resina de intercambio iónico podría mejorar la
separación entre estas moléculas a pH 6,0. Esto se confirmó al realizar la
separación en una resina de intercambio catiónico CM-Sephadex C-50-120. De
hecho, el aminocromo sufrió cierto retardo al pasar por esta resina indicando la
existencia de una interacción muy débil, pero la dopamina quedó
completamente retenida en la columna y no migró hasta que se aumentó la
fuerza iónica de la fase móvil con la adición de 300 mM de NaCl.
La purificación de aminocromo con una columna de 23 x 0,7 cm llena de
resina Sephadex G-25-80, nos permitió la obtención de hasta 1 ml de
aminocromo de 80 µM, en una separación que tomó cerca de 2 hrs. La
purificación de aminocromo en columnas con 5 ml de resina CM-Sephadex C-
50-120, logró mas de 3 ml de aminocromo de 250 µM de concentración en no
mas de 30 min. La concentración siempre fue determinada
espectroscópicamente usando el valor de 3058 M-1 cm-1 como coeficiente de
extinción molar a 478 nm de λ (Segura-Aguilar et al., 1989).
Inducción de agregación de αααα-sinucleína por aminocromo.
En el año 2001, Lansbury y colaboradores (Conway et al., 2001)
publicaron que la dopamina, al oxidarse induce la agregación de α-sinucleína
en estructuras protofibrilares y de esta manera previene la estructura fibrilar. A
pesar de tratarse solo de estudios in vitro, esta publicación despertó un gran
interés científico ya que se relacionó la oxidación de dopamina con la formación
de protofibras de α-sinucleína. Varios autores han corroborado lo observado por
Lansbury y colaboradores y han sugerido que es el aminocromo el responsable
(Li et al., 2004; Cappai et al., 2005; Norris et al., 2005; Follmer et al., 2007;
Bisaglia et al., 2007). Sin embargo, aún nadie ha logrado demostrar que fue el
aminocromo el responsable, ya que estos experimentos se realizaron con
dopamina sola ó dopamina en presencia de un oxidante. Para terminar con esa
incertidumbre, nosotros quisimos comprobar por estudios in vitro, que el
aminocromo es capaz de inducir agregación de una manera similar a lo
observado con dopamina al oxidarse. Como control positivo, se indujo
91
agregación de α-sinucleína con dopamina en presencia de tirosinasa como
catalizador de la oxidación de dopamina y se determinó agregación por Western
blot. Se observó que en presencia de dopamina y tirosinasa, hubo desaparición
del monómero de α-sinucleína y aparición de polímeros α-sinucleína positivos.
Solo 4 hrs de incubación a 37 ºC y sin agitación fueron suficientes para inducir
agregación de α-sinucleína, de manera muy similar a lo visto por Cappai et al.
(2005) aunque ellos incubaron con agitación. También pudimos observar la
aparición de una señal de alto peso molecular, reconocida específicamente con
anticuerpo anti-α-sinucleína. Esta señal apareció sobre el límite entre el gel
separador y el concentrador, indicando un polímero de α-sinucleína que fue
capaz de entrar en el gel concentrador al 5 %, pero no fue capaz de entrar al
gel separador al 10 %. Previamente se han descrito estructuras poliméricas de
α-sinucleína llamadas oligómeros de α-sinucleína, las cuales están compuestos
por 25 unidades de α-sinucleína (≅ 450 kDa) (Norris et al., 2005). Posiblemente,
estas señales en el gel concentrador puedan indicar la presencia de este tipo de
estructuras.
Una vez determinadas las condiciones experimentales para ver
agregación de α-sinucleína inducida por dopamina al oxidarse, realizamos el
experimento con aminocromo purificado. Tal como se observó en la figura 11, el
aminocromo purificado indujo la agregación de α-sinucleína a polímeros de
entre 40-200 kDa, al igual que lo observado con dopamina y tirosinasa y tal
como lo describió Cappai et al. (2005). A diferencia de lo observado a la fecha,
la agregación de α-sinucleína a las 4 hrs solo requirió de 10 µM de aminocromo
(una concentración 10-20 veces menor) y en una incubación sin agitación. Lo
anterior demuestra la gran capacidad del aminocromo para inducir agregación
de α-sinucleína. Para poder identificar el tipo de estructura poliméricas de α-
sinucleína que induce la incubación con aminocromo, se incubó α-sinucleína
con aminocromo por 5 días a 37 ºC sin agitación y se realizaron observaciones
con microscopio electrónico. El aminocromo indujo la aparición de 2 tipos de
estructuras, la primera electrónicamente densa, amorfa, de 50-100 nm o en
cuerpos de sobre 1 µm de diámetro. Estas estructuras nunca se han descrito
92
para polímeros de α-sinucleína, principalmente porque los polímeros de α-
sinucleína no forma estructuras electrónicamente densas, por lo que solo
pueden ser apreciadas por tinción negativa. Estas estructuras también fueron
observadas por nosotros al incubar por 5 días 100 µM de dopamina con 10
ng/ml de tirosinasa sin α-sinucleína. Lo anterior nos dio evidencia de que estas
estructuras no corresponden a polímeros de α-sinucleína, sino posiblemente a
melanina. Un segundo tipo de estructuras correspondió a estructuras
globulares, que solo se observaron por contraste con tinción negativa y de 15-
25 nm de diámetro. Estas estructuras fueron muy similares a los oligómeros de
α-sinucleína descritos por Lee y Lee (2002) y los oligómeros estabilizados de α-
sinucleína inducidos por dopamina, descritos por Norris (Norris et al., 2005). Por
otro lado, estas estructuras fueron de un tamaño menor que lo descrito
recientemente por Follmer et al. (2007). Sin embargo, los oligómeros que
observó Follmer aparecieron luego de la incubación de 50 µM de α-sinucleína
con 50 µM de dopamina por 2-3 días con agitación. Además, los oligómeros
observados por Follmer se desarmaron en presencia de alta presión a
oligómeros de un tamaño similar a lo que nosotros observamos. Tal como
demostró Lee y Lee (2002), estos oligómeros pequeños son de rápida aparición
y no son dependientes de aminocromo, ya que se han visto en cultivos
celulares incubados con rotenona y en incubaciones de α-sinucleína mutante
A30P, aunque estos últimos de un tamaño algo menor (Conway et al., 2000a).
Otro aspecto interesante de estos oligómeros es su gran estabilidad, lo que
sugiere que son polímeros unidos por enlace covalente tal como sugiere
Follmer et al. (2007). Las estructuras que fueron inducidas por aminocromo
encajan con todos estos antecedentes, ya que son estructuras globulares de
15-25 µm de diámetro vistos por tinción negativa. Los polímeros de 40-200 kDa
que posiblemente son los precursores de los oligómeros, demostraron ser muy
estables ya que no desaparecen en condiciones desnaturantes de un SDS-
PAGE. Como se ha sugerido ampliamente, estos oligómeros pueden agregarse
entre sí con uniones débiles para formar estructuras mayores de distintas
formas (anillos, glóbulos o fibras gruesas y cortas) que fueron descritas como
93
protofibras (Conway et al., 2000a; Conway et al., 2000b; Cole et al., 2005; Lee
and Lee, 2002; Ding et al., 2002; Follmer et al., 2007).
Se ha descrito que dopamina al oxidarse no solo induce la agregación de
α-sinucleína en oligómeros, sino que inhibe la formación de fibras (Conway et
al., 2001). Incluso se ha descrito que la dopamina al oxidarse es capaz de
desarmar las fibras apareciendo oligómeros de α-sinucleína (Lee y Lee, 2002).
Para demostrar que esto es cierto para el aminocromo, se incubó 100 µM de α-
sinucleína incubada a pH 6,5 y 100 mM de NaCl, por hasta 5 días con agitación
constante a 37 ºC, en presencia y ausencia de aminocromo purificado. Luego a
esta incubación realizamos los ensayos de: (i) fluorescencia de Tioflavina T,
que determina estructura fibrilar tipo amiloide; (ii) dicroísmo circular, que
determina estructura sabana-β características de fibras de α-sinucleína; (iii)
microscopía electrónica, para observar la forma de las estructuras poliméricas
generadas. Todos estos ensayos nos confirmaron que el aminocromo inhibió la
formación de fibras y que la agregación a oligómeros estabilizados no conlleva
el cambio de conformación a sabana-β, aunque si hay una desaparición de la
conformación de estructura de ovillo al azar, mecanismo ya observado
previamente (Li et al., 2004; Cappai et al., 2005; Norris et al., 2005). Sin
embargo, pudimos observar que a las 72 hrs de incubación de 100 µM de α-
sinucleína con 100 µM de aminocromo, hay aparición de estructura fibrilar con
un tiempo medio de fibrilación de casi 40 hrs, aunque es escasa. Esto a
diferencia de resultados previos donde incluso luego de 6 días de incubación de
14 µM de α-sinucleína con 200 µM de dopamina aún no aparecieron fibras
(Cappai et al., 2005) ó la observación de que la incubación de 50 µM de α-
sinucleína con 50 µM de dopamina indujo la generación de fibras solo luego de
18 días de incubación (Follmer et al., 2007). En este último caso, hay que tener
presente que bajo sus condiciones de trabajo, ellos solo logran la fibrilación de
α-sinucleína luego de 6-7 días de incubación de α-sinucleína incubada sola. En
comparación, nosotros observamos la fibrilación a las 30 hrs de incubación de
α-sinucleína sola, con un tiempo medio de fibrilación de 25,6 ±1,3 hrs.
Probablemente al considerar estas diferencias experimentales, podríamos decir
94
que nuestros resultados fueron consecuentes con los de Follmer et al. En el
caso del grupo de Cappai, ellos no observaron presencia de fibras en la
incubación de α-sinucleína con dopamina. Sin embargo, este grupo incubó α-
sinucleína con dopamina 14 veces mas concentrada que en nuestras
condiciones, donde se incubó α-sinucleína con aminocromo en una relación
1:1. Otro aspecto que hay que destacar, es que en nuestro caso se uso
aminocromo puro, el cual comienza a polimerizar a melanina luego de 2 hrs a
pH 7,5, en cambio la dopamina genera aminocromo mientras se oxida y por lo
tanto, por un lapso de tiempo mucho mayor. En conclusión, el grupo de Cappai
mantuvo una mayor presencia de aminocromo que en nuestro caso. En nuestro
caso la α-sinucleína fue expuesta al aminocromo puro al comienzo de la
incubación, lo que fue suficiente para desencadenar un mecanismo de
nucleación que generó los oligómeros observados. Después de algunas horas,
la α-sinucleína que no interactuó con aminocromo pudo polimerizar a fibras.
Interesantemente, los oligómeros de α-sinucleína observados por
incubación de 100 µM de α-sinucleína con 100 µM de aminocromo por 5 días
con agitación, fueron iguales a los observados por incubación de 30 µM de α-
sinucleína con solo 10 µM de aminocromo por 5 días sin agitación. Esto
significa que la formación de estas estructuras es muy eficiente y solo basta una
baja concentración de aminocromo para formarse. Cuando se compara la
formación de estas estructuras globulares con la fibrilación de α-sinucleína, es
evidente la diferencia en la eficiencia con que se forman ambas estructuras.
Para formar fibras no basta la sola presencia de α-sinucleína, sino que hay que
agitar por 2 días a 37ºC, por otro lado, las estructuras globulares necesitan una
concentración mucho menor de α-sinucleína y no se necesita forzar el sistema
para que estas se formen. Otro aspecto interesante para estas estructuras es
su estabilidad, ni siquiera las condiciones extremas de alta concentración de α-
sinucleína con agitación constante a 200 rpm pudieron impedir su formación.
Esto confirmó lo sugerido previamente (Li et al., 2004; Cappai et al., 2005;
Norris et al., 2005; Follmer et al., 2007), de que la incubación de aminocromo
95
con α-sinucleína indujo la agregación de la α-sinucleína en estructuras estables
que no forman fibras.
La observación microscópica de oligómeros en la figura 18 se realizó a
las 48 horas de incubación, sin embargo, el máximo en cantidad de fibras tipo
amiloide detectada por fluorescencia de la incubación de α-sinucleína con
aminocromo ocurrió sobre las 70 hrs. Existe la posibilidad de que estos
oligómeros fueran estructuras precursoras de las fibras y no estructuras
alternativas a ellas. Para responder a esta pregunta se determinó la diferencia
en la polimerización de α-sinucleína al incubarla sola o en presencia de 100 µM
de aminocromo por 48 y 102 hrs a 37º C con agitación constante de 200 rpm.
La diferencia de polimerización se observa claramente en los Western blot de la
figura 19. Se observó que la incubación de α-sinucleína sola por 48 hrs., no
mostró la aparición de señales entre 40-200 kDa, a pesar de que en estas
condiciones se haya observado gran cantidad de fibras por microscopía. Por
otro lado, la incubación de α-sinucleína con aminocromo por 48 hrs, que indujo
la formación de oligómeros, mostró en el gel la aparición de estructuras de entre
40-200 kDa α-sinucleína positivos. Esto demostró que la aparición de estas
estructuras de 40-200 kDa, son precursores de oligómeros y no de fibras.
Luego de 102 hrs de incubación de α-sinucleína con aminocromo, aún aparece
una gran señal entre 40-200 kDa, lo que nos confirma que el aminocromo
induce la formación de agregados de α-sinucleína alternativos y no precursores
de las fibras.
En conclusión, nuestros resultados sugieren que en condiciones in vitro,
el aminocromo es capaz de inducir la agregación de α-sinucleína incluso a
bajas concentraciones de ambos. Tal como se describió previamente, una
molécula derivada de la oxidación de la dopamina se une a la α-sinucleína
entre los aminoácidos 123-129, lo que conlleva a la polimerización (Norris et al.,
2005). Por lo tanto, sugerimos que este es el mecanismo del aminocromo. La
primera etapa de esta agregación genera la formación polímeros de bajo
número de monómeros de α-sinucleína como dímeros, trímeros, tetrámeros,
etc. (polímeros de 40-200 kDa). Luego por unión covalente, la formación de
96
polímeros de unas 25 unidades de α-sinucleína con una forma globular de entre
15-25 nm de diámetro, denominadas oligómeros de α-sinucleína (Norris et al.,
2005). Estos oligómeros, no pueden unirse para formar fibras de α-sinucleína.
La unión de estos oligómeros entre si por fuerzas intermoleculares, generarían
estructuras de distintas formas, conocidas como protofibras
Efecto de la reducción de aminocromo con un electró n sobre la
agregación de αααα-sinucleína.
Un mecanismo que puede explicar la toxicidad de la oxidación de la
dopamina, es la reducción de aminocromo con un electrón lo cual genera una
semiquinona muy reactiva llamada leucoaminocromo-o-semiquinona. Por tal
motivo, se esperaba que la reducción de aminocromo con un electrón
aumentaría la agregación de α-sinucleína a oligómeros, en comparación a lo
observado en la incubación de α-sinucleína con aminocromo solo.
Sorprendentemente, los resultados mostraron lo contrario, se observó que la
citocromo C reductasa junto a NADH disminuyó el proceso de agregación de α-
sinucleína inducido por aminocromo. Por estudios de Western blot, observamos
que la citocromo C reductasa y NADH inhibió la agregación de α-sinucleína a
polímeros de 40-200 kDa que se indujo por aminocromo puro. Además,
pudimos observar por microscopía electrónica que la presencia de citocromo C
reductasa y NADH indujo una disminución en los oligómeros de α-sinucleína en
comparación con la incubación de α-sinucleína con solo aminocromo puro.
Finalmente, se pudo apreciar por dicroísmo circular una disminución en la
desaparición de estructura de ovillo al azar, es decir, disminuyó la desaparición
del monómero de α-sinucleína por la presencia de citocromo C reductasa y
NADH. En relación a la disminución de la fibrilación de α-sinucleína inducido por
aminocromo, no se obtuvieron resultados muy claros. Por un lado, la cinética de
fibrilación para la incubación de α-sinucleína y aminocromo en presencia o
ausencia de citocromo C reductasa y NADH fue similar, con un tiempo medio de
fibrilación de 37 ± 4,3 hrs y 33 ± 4,4 hrs respectivamente. Sin embargo, por
dicroismo circular se observó una menor formación de estructura sábana-β, lo
97
que significa una menor presencia de fibras, aunque esto no pudo ser
corroborado por microscopía electrónica.
Previamente fue descrito que las enzimas superoxido dismutasa (SOD) y
catalasa aumentan la autooxidación del leucoaminocromo-o-semiquinona hasta
aminocromo (Baez et al., 1995), estimulando aún mas la generación del ciclo
rédox del leucoaminocromo-o-semiquinona, lo que aumentaría la presencia de
radicales libres. Se quiso saber si el aumento en la posibilidad de desarrollo de
este ciclo rédox afectaría la agregación de α-sinucleína. Los resultados
observados en las figuras 20 y 21 muestran que la presencia de la SOD y
catalasa en el medio de incubación de α-sinucleína con aminocromo o
dopamina junto a tirosinasa además de citocromo C reductasa, no provocó
ningún cambio apreciable en relación con la ausencia de SOD y catalasa. Esto
demuestra que el ciclo rédox del leucoaminocromo-o-semiquinona, y por lo
tanto, el aumento en las especies reactivas del oxígeno que se generan en este
ciclo rédox, no afectó a la agregación de la α-sinucleína a polímeros de 40-200
kDa. Como se vio anteriormente, la generación de polímeros de 40-200 kDa
sería un mecanismo de la generación de oligómeros estables de α-sinucleína y
no de fibras, lo que nos sugiere que las especies reactivas del oxígeno
derivadas del ciclo rédox del leucoaminocromo-o-semiquinona no inducen la
agregación a oligómeros de α-sinucleína, aunque se ha descrito que las
especies reactivas del oxígeno inducen la fibrilación de ésta (Hashimoto et al.,
1999).
Por otro lado, la incubación α-sinucleína y aminocromo puro en
presencia de SOD y catalasa indujo una mayor agregación de α-sinucleína a
polímeros de 40-200 kDa que en ausencia de estas enzimas. En la incubación
de α-sinucleína con dopamina y tirosinasa se observó una tendencia a este
aumento, aunque no fue significativo. Una explicación a este hecho, es que tal
como se observó anteriormente la aparición de polímeros de 40-200 kDa es un
evento relacionado con la formación de oligómeros de α-sinucleína y no de
fibras. Como la SOD y catalasa son enzimas que disminuyen la presencia
EROs, se sugiere que la presencia de SOD y catalasa en la incubación de α-
98
sinucleína con aminocromo y posiblemente de α-sinucleína con dopamina y
tirosinasa, disminuye la presencia de EROs presentes en esta incubación.
Estas EROs derivadas de la oxidación de la dopamina o de una reacción entre
aminocromo y oxígeno del medio, causarían una agregación de α-sinucleína a
fibras (Hashimoto et al., 1999), lo que no genera polímeros de 40-200 kDa de α-
sinucleína observados por Western blot. Por lo tanto, la presencia de SOD y
catalasa inhiben la formación de fibras por EROs y dejan en el medio más α-
sinucleína monomérica disponible para su agregación a oligómeros estables de
α-sinucleína, lo que se observa en la aparición temprana (solo 4 horas de
incubación) de polímeros de 40-200 kDa de α-sinucleína.
En conclusión, la presencia de citocromo C reductasa y NADH que
induce la reducción de aminocromo con un electrón, disminuye la agregación de
α-sinucleína a oligómeros estables de α-sinucleína. Esto se explica por la
disminución del aminocromo del medio de incubación, sugiriendo que es el
aminocromo la molécula que interacciona con la α-sinucleína en incubaciones
in vitro. Esto le da al aminocromo un posible papel tóxico y de esta manera, la
toxicidad de la oxidación de la dopamina en el citoplasma no solo estaría dado
por la reducción del aminocromo con un electrón, sino que también a la
presencia de aminocromo. Claramente este es un ensayo in vitro, y faltan
estudios in vivo para evidenciar lo anterior. Recientemente apareció un trabajo
respaldando el planteamiento del papel tóxico del aminocromo, indicando que el
aminocromo es una molécula capaz de inhibir el complejo proteosomal de un
lisado de reticulocito de conejo (Zafar et al., 2006).
Efecto de la DT-diaforasa sobre la agregación de αααα-sinucleína inducida por
aminocromo
El último objetivo de esta tesis fue demostrar que la DT-diaforasa inhibe
la agregación de α-sinucleína inducida por el aminocromo al reducirse con un
electrón en ensayos in vitro. Sin embargo, nuestros resultados demostraron que
la reducción de aminocromo con un electrón disminuye la agregación de α-
sinucleína a oligómeros y que es el aminocromo el que induce esta agregación.
99
La DT-diaforasa es la única enzima capaz de reducir aminocromo con dos
electrones logrando así disminuir la cantidad de aminocromo del medio pero sin
la formación de radicales como el leucoaminocromo-o-semiquinona.
La incubación de DT-diaforasa y NADH junto a α-sinucleína y
aminocromo, por 4 hrs sin agitación, inhibió completamente la agregación de α-
sinucleína a polímeros de 40-200 kDa. En los estudios realizados con
incubación de varios días con agitación, la DT-diaforasa inhibió casi
completamente la aparición de oligómeros de α-sinucleína lo que se observó
por microscopía electrónica e inhibió completamente el cambio de estructura de
ovillo al azar por hasta 72 hrs, lo que se observó por dicroísmo circular. La
inhibición por la DT-diaforasa de la agregación de α-sinucleína a oligómeros,
que es inducida por aminocromo, fue de acuerdo a lo esperado por el hecho de
que la DT-diaforasa disminuye la cantidad de aminocromo del medio. Esta
disminución fue muy rápida, dando una actividad reductora de aminocromo de
49 µmoles de aminocromo/min/mg de DT-diaforasa. Cuando se realizó un
ensayo de unión de aminocromo a α-sinucleína, se obtuvo una velocidad de
unión de 0,56 nmoles de aminocromo/min/mg α-sinucleína. Lo anterior explica
el porque la DT-diaforasa inhibe la agregación de α-sinucleína inducida por
aminocromo. Por antecedentes previos (Norris et al., 2005), pensamos que la
agregación de α-sinucleína inducida por aminocromo dependería de la unión
del aminocromo a la proteína. Como la velocidad de unión α-sinucleína-
aminocromo es muchas veces menor que la velocidad de reducción del
aminocromo por DT-diaforasa, no ocurriría agregación de α-sinucleína a
polímeros de 40-200 kDa ni a oligómeros estables porque no habría unión de α-
sinucleína con aminocromo.
La presencia de DT-diaforasa y NADH en la incubación de α-sinucleína y
aminocromo bajo las condiciones usadas en este estudio, también inhibió
completamente la fibrilación de α-sinucleína. Esto fue observado por los
estudios de fluorescencia de TioT, dicroismo circular y microscopía electrónica.
Como el aminocromo inhibió la fibrilación de α-sinucleína, se esperaba que la
DT-diaforasa mostrara fibrilación de α-sinucleína similar a lo observado con α-
100
sinucleína sola. Una explicación a este fenómeno es que la fibrilación de α-
sinucleína en las condiciones in vitro usadas por nosotros depende de la
presencia de oxígeno o EROs en el medio de incubación. Esta explicación es
muy coherente ya que tal como describió Hashimoto et al. (1999), la presencia
de especies reactivas del oxígeno inducen la fibrilación de α-sinucleína. La DT-
daforasa reduce el aminocromo, pero en presencia de oxígeno hay una re-
oxidación hasta aminocromo. De esta forma, la DT-diaforasa genera un ciclo
rédox que disminuye los niveles de oxígeno del medio (Segura-Aguilar and
Lind, 1989). Los ensayos de fibrilación se realizaron en frascos sellados
herméticamente para evitar infección bacteriana, por lo tanto, no hubo re-
oxigenación posibilitando la disminución de la concentración de oxígeno y
EROs en el medio de incubación, lo que pudo impedir la fibrilación de α-
sinucleína.
Otra explicación puede ser que por la alta sensibilidad de este ensayo de
fibrilación de α-sinucleína, un cambio en la cantidad de proteínas totales del
medio podría afectar la cinética de fibrilación. En los ensayos con DT-diaforasa,
agregamos 5 µg/ml de DT-diaforasa, sin embargo, los ensayos con citocromo C
reductasa incluyeron 10 µg/ml de citocromo C reductasa. Como los ensayos de
α-sinucleína, aminocromo y citocromo C reductasa no mostraron una inhibición
en la fibrilación de α-sinucleína mayor a lo observado con α-sinucleína y
aminocromo solo, descartamos que la inhibición en la fibrilación observada por
DT-diaforasa se deba a la presencia de la proteína DT-diaforasa.
Proyecciones
La agregación de α-sinucleína ha demostrado ser un evento patológico,
gatillado por una serie de factores genéticos, oxidantes y metales entre otros. El
primer evento para la toxicidad de los agregados de α-sinucleína, parece ser la
polimerización a oligómeros de α-sinucleína (revisado en Fink, 2006) Estos
oligómeros parecen ser los precursores de las protofibras, estructuras que han
demostrado ser altamente tóxicas para las neuronas induciendo daño
mitocondrial, fragmentación de membranas de organelos (Gosavi et al., 2001) y
101
depolarización neuronal (Furukawa et al., 2006). Un mecanismo protector de las
neuronas frente a proteínas mal ensambladas es el agresomal. Este
mecanismo consiste en el reclutamiento de las proteínas mal ensambladas ó
agregadas, atracción de estas proteínas al espacio perinuclear lo que se lleva a
cabo por microtúbulos y acumulación de estas en estructuras llamadas
agresomas. Estos agresomas son grandes cuerpos compuestos de fibras de
proteínas, que incluyen proteínas del citoesqueleto y del sistema ubiquitin-
proteosomal y se ubican en el perímetro nuclear de las neuronas (Olanow et al.,
2004; Tanaka et al., 2004). Se ha demostrado que la formación de agregados
fibrilares en células depende de los microtúbulos (Lee y Lee, 2002), por lo tanto,
los cuerpos de Lewy podrían ser agresomas.
En esta tesis demostramos que in vitro el aminocromo es capaz de
inducir la agregación de α-sinucleína en estas estructuras oligoméricas. Esta
oligomerización demostró ser espontánea a pH 7,5 y 37 ºC, necesitando bajas
concentraciones de α-sinucleína y aminocromo. La α-sinucleína es una proteína
que se encuentra concentrada en los terminales sinápticos, unida a membrana
de vesículas e incluso interaccionando con los transportadores de dopamina
(DAT) (Lee et al., 2001; Wersinger y sidhu, 2005). Estos transportadores
permiten la recaptación de dopamina del espacio sináptico pudiendo también
transportar aminocromo (Paris et al., 2005). El hecho de que α-sinucleína y
aminocromo estén co-localizados, aumenta la posibilidad de interacción y
agregación de α-sinucleína. Esta interacción es posible y no es necesaria la
reducción con un electrón para que esta agregación ocurra. Todos los
mecanismos tóxicos que son atribuidos a las protofibras, se han descrito para
protofibras hechas de α-sinucleína sola y no inducidos por la dopamina al
oxidarse. Sin embargo, recientemente apareció un estudio que demuestran que
la toxicidad de α-sinucleína mutante A53T, depende de la presencia de
dopamina (Zhao et al., 2007). También se observó que en células SH-SY5Y
que sobreexpresaban α-sinucleína mutante A53T, la dopamina disminuyó la
formación de grandes estructuras α-sinucleína positivas tipo cuerpos de Lewy,
pero indujo la aparición de polímeros de α-sinucleína de 40-200 kDa. En estos
102
estudios, sin embargo, no se observó un aumento de la neurodegeneración por
dopamina (Mazzulli et al., 2006).
Además de la posible toxicidad de las protofibras de α-sinucleína-
aminocromo, se ha demostrado que la presencia de α-sinucleína es esencial en
varios mecanismos en las células dopaminérgicas. Se ha demostrado que la α-
sinucleína puede regular la tirosina hidroxilasa (TH), disminuyendo la síntesis
de dopamina (Perez et al., 2002; Peng et al., 2005; kaushik et al., 2007).
Además, la α-sinucleína disminuye la presencia de DAT en la membrana
sináptica, induciendo la internalización de DAT y de esta forma disminuyendo la
recaptación de dopamina (Adamczyk et al., 2006). Se demostró que al bloquear
la internalización de DAT inducida por α-sinucleína, aumentó la recaptación de
dopamina induciéndose estrés oxidativo y muerte celular (Wersinger y sidhu,
2005). De esta manera, la disminución de α-sinucleína que podría ocurrir por la
agregación inducida por aminocromo, induciría el aumento de la dopamina
citoplasmática con la consecuente oxidación a aminocromo. Se ha observado
que la α-sinucleína activa a la proteína fosfatasa 2A (Peng et al., 2005), la cual
se ha sugerido como inhibidora de apoptosis en un modelo de Alzheimer (Hsu
et al., 2007). La α-sinucleína también tiene un papel como regulador en la
expresión varios genes (Miller et al., 2007). Uno de ellos es DJ-1 (Colapinto et
al., 2006), cuya proteína ha demostrado ser antioxidante (Taira et al., 2004) y
protectora frente a sustancias agresoras neuronales como 6 OHDA y MPTP
(Paterna et al., 2007; Inden et al., 2006). También se ha relacionado DJ-1 con el
aumento en la expresión de proteínas reguladas por elementos de respuesta
antioxidante (ARE), donde una de estas proteínas es la DT-diaforasa cuya
expresión disminuyó marcadamente al inhibir la expresión de DJ-1 (Clements et
al., 2006). Por lo tanto, la disminución de α-sinucleína podría afectar el nivel de
la expresión de varios genes, varios de ellos relacionados con el sistema
antioxidante celular. De esta manera, pequeños cambios en la concentración de
α-sinucleína pueden inducir efectos tóxicos por aumento de dopamina
citoplasmática, disminución del sistema antioxidante e incluso apoptosis. La
disminución de α-sinucleína podría entonces iniciar un ciclo toxico que induciría
103
el aumento de la dopamina y luego el aumento del aminocromo, una
disminución de la concentración de DT-diaforasa y otras moléculas protectoras
como glutatión reducido gatillando la muerte celular.
En esta tesis se demostró por estudios in vitro, que la DT-diaforasa
puede inhibir la formación de oligómeros de α-sinucleína inducidos por
aminocromo. Nuestros estudios proveen las bases para la determinación de la
DT-diaforasa como parte del mecanismo protector neuronal frente a la toxicidad
de la oxidación de la dopamina. De hecho la DT-diaforasa es una enzima
citoplasmática inducible, con ARE en sus promotores al igual que varias otras
enzimas antioxidantes y protectoras celulares, como SOD, glutatión S-
transferasa y Nrf-2. Lo que sugiere a la DT-diaforasa como una enzima
protectora frente a eventos oxidantes en la célula. Nuestros estudios, presentan
las primeras evidencias de que la DT-diaforasa ejerce un papel vital en la
protección contra formación de oligómeros estables de α-sinucleína y
protofibras inducidas por aminocromo.
104
CONCLUSIONES
• La cromatografía de intercambio iónico separa aminocromo de
dopamina, agentes oxidantes y otros derivados de la oxidación de la
dopamina.
• El aminocromo purificado se mantiene en forma estable por mas de 4
hrs. a 4 ºC en MES pH 6,0.
• En condiciones in vitro, el aminocromo induce la agregación de α-
sinucleína a oligómeros de α-sinucleína.
• Previo a la formación de oligómeros de α-sinucleína aparecen polímeros
de bajo peso molecular compuesto por tres a mas de trece unidades
monoméricas de α-sinucleína.
• En condiciones in vitro, el aminocromo disminuye la fibrilación de α-
sinucleína.
• La fibrilación de α-sinucleína ocurre por un mecanismo diferente que la
formación de oligómeros de α-sinucleína, por ejemplo, no requiere la
aparición previa de polímeros de entre tres hasta mas de trece unidades
de α-sinucleína como sucede con la oligomerización.
• La reducción de aminocromo con un electrón disminuye la
oligomerización de α-sinucleína, pero sin inhibir la fibrilación.
• La DT-diaforasa inhibe la oligomerización de α-sinucleína inducida por
aminocromo y la fibrilación de α-sinucleína en ensayos in vitro.
105
Leukoaminocromo -o- semiquinona
MECANISMO PROPUESTO
Figura 29. Mecanismo propuesto para la inducción de la oligome rización
de αααα-sinucleína por aminocromo y la inhibición de esta por la DT-
diaforasa.
Dopamina-o-Quinona aminocromo
NAD(P)+ NAD(P)H O2 DT-diaforasa
αααα-sinucleína
Dopamina
Oligómeros
O2-.
EROs
NADH/NADPH
NAD+/ NADP+
Flavoenzimas reductasas
Fibras
Neuromelanina
Oxidación
106
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