Doktorat Urša Lampreht Tratar - COnnecting REpositoriesElektrogenska terapija z interlevkinom 12 za zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psih. i Izjavljam, da sem avtorica

UNIVERZA V LJUBLJANI MEDICINSKA FAKULTETA

PODIPLOMSKI ŠTUDIJ BIOMEDICINE

Urša LAMPREHT TRATAR

ELEKTROGENSKA TERAPIJA Z INTERLEVKINOM 12 ZA ZDRAVLJENJE

KOŽNIH IN ORALNIH TUMORJEV PRI PSIH

DOKTORSKA DISERTACIJA Podiplomski študij

ELECTROGENE THERAPY WITH INTERLEUKIN 12 FOR THE TREATMENT

OF SKIN AND ORAL TUMORS IN DOGS

DOCTORAL DISSERTATION Postgraduate study

Ljubljana, 2018

Urša Lampreht Tratar (2018). Elektrogenska terapija z interlevkinom 12 za zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psih.

i

Urša Lampreht Tratar, dr. vet. med.

Elektrogenska terapija z interlevkinom 12 za zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psih

Imenovanje mentorja in somentorja na seji senata dne: 10. november 2015

Komisija za oceno in zagovor imenovana na seji senata dne: 18. junij 2018

Datum zagovora: 21. avgust 2018

Mentorica: prof. dr. Maja Čemažar, univ. dipl. biol.

Somentorica: prof. dr. Nataša Tozon, dr. vet. med.

Predsednica komisije: prof. dr. Mateja Erdani Kreft, univ. dipl. biol.

Član: prof. dr. Marko Snoj, dr. med.

Član: prof. dr. Zlatko Pavlica, dr. vet. med.


i

Izjavljam, da sem avtorica doktorskega dela z naslovom Elektrogenska terapija z interlevkinom 12 za

zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psih.

Doktorsko delo sem opravljala na Onkološkem inštitutu Ljubljana in na Kliniki za male živali

Veterinarske fakultete v Ljubljani. Raziskovalno delo je bilo deloma izpeljano na sodelujočem inštitutu

v Rimu, Italija (Laboratory of Genetic and Clinical Pathology, University Campus Bio-Medico of Rome

in National Research Council - Institute of Translational Pharmacology (CNR-IFT)), v okviru financiranja

STSM (short term scientific mission), ki je bilo dodeljeno v okviru COST TD1104 Action-EP4Bio2Med.

Člankov, zajetih v tem delu, ni uporabil za doktorsko disertacijo nihče od preostalih soavtorjev.

Urša Lampreht Tratar, dr. vet. med.

Ljubljana, april 2018


ii

ZAHVALA

Za nastanek doktorske naloge se zahvaljujem predvsem mentorici prof. dr. Maji Čemažar. Hvala za

izjemno vodenje, spodbudo in pomoč pri reševanju problemov. Hvala tudi prof. dr. Gregorju Serši za

spodbujanje širokega pogleda v znanost. Prav tako hvala somentorici prof. dr. Nataši Tozon za vso

podporo in vodenje pri delu z našimi pasjimi pacienti.

Hvala puncam z Oddelka za eksperimentalno onkologijo: Špeli, Moniki, Urški, Katji, Martini, Vesni,

Maši, Tanji, Barbari, Ajdi, Simoni, Lari in Miri za vse jutranje sestanke in debate, tako znanstvene kot

tudi tiste malo manj znanstvene.

Hvala tudi sodelavcem s Klinike za male živali: Nini, brez katere delo v onkotimu ne bi bilo pol tako

zabavno. Ter vsem ostalim, ki ste mi bili v veliko pomoč pri delu in zbiranju mojih neštetih vzorcev.

Hvala tudi sodelavcem iz Rima: Emanueli, Luisi in Mariangeli. Hvala za nove izkušnje in izvrstno

sodelovanje.

Hvala moji priženjeni družini za vso pomoč in hvala vsem prijateljem za iskrene nasvete ter zabavne

vikende.

Iz srca se zahvaljujem mojima staršema in bratu za izjemno podporo ter spodbujanje že od malih nog.

Ne nazadnje se za stalno oporo, dobro voljo in potrpežljivost zahvaljujem Matevžu in najinemu Jaku.

Hvala tudi moji mali kosmati negativni kontroli, Atosu .


iii

KKazalo

ZAHVALA ...................................................................................................................................................ii

SEZNAM OKRAJŠAV ................................................................................................................................. iv

POVZETEK ................................................................................................................................................ vi

ABSTRACT .............................................................................................................................................. viii

UVOD IN PREDSTAVITEV HIPOTEZ ........................................................................................................... 1

Pes kot model za preiskovanje raka .................................................................................................... 1

Rak je bolezen imunskega sistema ...................................................................................................... 3

Elektrokemoterapija za zdravljenje raka ............................................................................................. 7

Genski elektroprenos IL-12.................................................................................................................. 9

Uporaba elektrogenske terapije IL-12 za zdravljenje tumorjev pri psih ........................................... 10

Možnosti izboljšave plazmida ............................................................................................................ 11

Namen dela, hipoteze in zastavljeni potek študije............................................................................ 12

UPORABLJENE METODE ........................................................................................................................ 13

POGLAVJE 1 ........................................................................................................................................... 15

POGLAVJE 2 ........................................................................................................................................... 26

POGLAVJE 3 ........................................................................................................................................... 32

POGLAVJE 4 ........................................................................................................................................... 48

POGLAVJE 5 ........................................................................................................................................... 62

1. Uvod .......................................................................................................................................... 62

2. Materiali in metode ................................................................................................................... 63

3. Rezultati ..................................................................................................................................... 72

4. Razprava .................................................................................................................................... 80

5. Zaključek .................................................................................................................................... 81

PREGLED IN SKLEPNE MISLI ................................................................................................................... 82

Priprava in ovrednotenje plazmidov, ki nosijo zapis za pasji IL-12 ................................................... 82

Klinična študija na spontanih pasjih in oralnih tumorjih pri psih ...................................................... 84

Doprinos k znanosti in vpogled v prihodnje študije .......................................................................... 85

ZAKLJUČKI .............................................................................................................................................. 86

SKUPNI SEZNAM CITIRANE LITERATURE ............................................................................................... 87

ZNANSTVENA DELA, OBJAVLJENA V ČASU NASTAJANJA DOKTORSKE NALOGE ................................... 99


iv

SEZNAM OKRAJŠAV

BCC karcinom ploščatih celic (ang. basal cell carcinoma)

CCL CC kemokin ligand (ang. CC chemokin ligand)

Celice NK celice naravne ubijalke (ang. natural killer cell)

CMV citomegalovirusni promotor (ang. cytomegalovirus promotor)

COL kolagenski promotor (ang. collagen promoter)

CXCL CXC kemokin ligand (ang. CXC kemokin ligand)

Ct vrednost praga (ang. threshold cycle)

CTLA4

limfocitni T ubijalski antigen 4 (ang. cytotoxic T-lymphocyte–

associated antigen 4)

DAMP

z nevarnostjo povezani molekulski vzorci (ang. danger associated

molecular pattern)

ECT elektrokemoterapija (ang. electrochemotherapy)

EP elektroporacija (ang. electroporation)

EGT elektrogenska terapija (ang. electrogene therapy)

EMA Evropska agencija za zdravila (ang. European Medcines Agency)

FDA Zvezni urad za živila in zdravila (ang. Food and drug administration)

GM-CSF

dejavnik stimulacije granulocitne/makrofagne kolonije (ang.

granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)

GET genski elektroprenos (ang. gene electrotransfer)

IFNɣ interferon gama (ang. interferon gamma)

IL interlevkin (ang. interleukin)

LV nizko-napetostni električni pulzi (ang. low voltage pulses)

MEA več-točkovna elektroda (ang. multi-electrode array)

MDSC

celica zaviralka mieloidnega izvora (ang. Myeloid-derived suppressor

cell)

MHC

poglavitni kompleks tkivne skladnosti (ang. major histocompatibility

complex)

mRNA obveščevalna ribonukleinska kislina (ang. messenger ribonucleic

acid)

ORF odprt bralni okvir (ang. open reading frame)


v

ORT titracija operatorja in represorja (ang. operator-repressor titration)

PBS fosfatni pufer (ang. phosphate buffer saline)

PD-(L)1 protein (ligand) programirane celične smrti 1 (ang. programmed cell

death protein (ligand) 1)

ROS reaktivne kisikove spojine (ang. reactive oxygen species)

qRT-PCR

kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (ang.

quantitative real-time polymerase chain reaction)

TGFβ dejavnik tumorske rasti beta (ang. tumor growth factor beta)

TLR Tollu podobni receptorji (ang. Toll-like receptor)

TNFα dejavnik tumorske nekroze alfa (ang. tumor necrosis factor alpha)

VEGF

dejavnik enotelijske žilne rasti (ang. vascular endothelial growth

factor)


vi

POVZETEK Znanstveno izhodišče: Spontani tumorji pri psih predstavljajo odličen model za preizkušanje novih

terapij in za njihov prenos v humano onkologijo. Ena izmed novih terapij, ki se je izkazala za izredno

učinkovito za zdravljenje tumorjev pri psih in ljudeh, je elektrokemoterapija. Elektrokemoterapija je

lokalno zdravljenje, ki ima velik uspeh na lokalnem nivoju, vendar ne na sistemskem. Kot dodatno

terapijo s sistemskim učinkom bi lahko uporabili elektrogensko terapijo z interlevkinom-12 (IL-12), ki

je v nekaterih predkliničnih in kliničnih študijah izboljšala odgovor na zdravljenje. IL-12 je provnetni

citokin, ki prek interferona gama (IFNɣ) poveča delovanje protitumorskega imunskega odziva. V

kliničnih študijah, kjer so uporabili kombinacijo elektrokemoterapije in elektrogenske terapije z IL-12

za zdravljenje spontanih tumorjev pri psih, so dokazali dobro protitumorsko učinkovitost. V teh

študijah so uporabili plazmid, ki je nosil zapis za humani ali mačji IL-12, ki nima popolne homolognosti

s pasjim IL-12. Poleg tega je nosil zapis za gen za odpornost proti ampicilinu, ki ga pristojne organizacije

ne odobravajo. Zato je priprava plazmida, ki bi nosil zapis za pasji IL-12 z ali brez gena za odpornost

proti antibiotiku, ključna za uporabo v nadaljnjih kliničnih študijah na psih.

Metode: V prvem sklopu smo pripravili in ovrednotili plazmide, ki nosijo zapis za pasji IL-12 pod

konstitutivnim ali tkivno specifičnim promotorjem in z ali brez gena za odpornost proti antibiotiku.

Poskuse smo v in vitro pogojih opravili na humanih in pasjih normalnih ter tumorskih celičnih linijah in

spremljali stopnjo izražanja IL-12 na nivoju mRNA ter na proteinskem nivoju po genskem

elektroprenosu. V in vivo pogojih smo na ksenograftih pasjih melanomskih celic na imunsko oslabljenih

miših, poleg protitumorskega učinka, spremljali tudi imunski odziv po genskem prenosu IL-12. Ne

nazadnje smo klinično študijo prijavili pristojnim organom in začeli z vključevanjem pacientov v klinično

študijo, kjer smo s kombinacijo elektrokemoterapije ter elektrogenske terapije zdravili spontane kožne

in oralne tumorje pri psih. V času terapije smo merili velikost tumorjev in jemali vzorce krvi, urina in

blata ter brise z mesta aplikacije plazmida za določanje varnosti in učinkovitosti terapije.

Rezultati: Rezultati so pokazali, da ima novi plazmid, ki nosi zapis za pasji IL-12, podobno ali višjo

zmožnost ekspresije v in vitro pogojih na nivoju mRNA in proteinov kot plazmid, ki nosi zapis za humani

IL-12. V in vivo poskusu na imunsko komprimiranih miših smo ugotovili, da je terapevtska učinkovitost

po elektrogenskem prenosu primerljiva med plazmidoma, ki nosita zapis za pasji ali humani IL-12. V

primeru plazmidov, ki nosijo zapis za pasji IL-12 pod konstitutivnim in tkivno specifičnim promotorjem

in nimajo gena za odpornost proti antibiotiku, smo ugotovili, da odstranitev gena za odpornost proti

antibiotiku ne zmanjša citotoksičnosti ter sposobnosti ekspresije transgena. V in vivo študiji smo

ugotovili, da ima plazmid s konstitutivnim promotorjem višjo ekspresijo IL-12 kot plazmid s tkivno

specifičnim promotorjem. Poleg tega je po genskem elektroprenosu plazmid s konstitutivnim

promotorjem povzročil povišano vrednost IL-12 v serumu, medtem ko je bilo izražanje IL-12 v primeru


vii

tkivno specifičnega promotorja omejeno na tumor. Ne nazadnje je bila v primeru konstitutivnega

promotorja zaznana povišana infiltracija grancim B pozitivnih celic v tumorju in vranici, kar kaže na

sistemski učinek terapije. Po genskem elektroprenosu IL-12 smo opazili tudi povišano infiltracijo M1

makrofagov in dendritičnih celic v tumorju na imunsko nezavrtih miših. V klinično študijo smo vključili

55 psov, 42 s kožnimi tumorji in 13 z oralnimi tumorji. V primeru kožnih tumorjev smo dosegli popoln

odgovor pri 84 % pacientov. Odgovor je bil slabši pri oralnih tumorjih, kjer je delež popolnih odgovorov

znašal 15 %. Pri preiskovanju zbranih vzorcev urina, blata in seruma nismo zaznali prisotnosti

plazmidne DNA. V primeru brisov kože smo pri nekaterih pacientih zaznali prisotnost plazmidne DNA

takoj po aplikaciji (najvišja je bila 100 ng/mL), ki je v štirih tednih padla na ničelno vrednost. Poleg tega

smo v krvi merili deleže imunskih celic po terapiji, kjer smo ugotovili statistično značilen upad celic T

zaviralk ob koncu opazovanega obdobja, glede na delež celic T zaviralk ob terapiji.

Zaključek: Novo pripravljeni plazmid, ki kodira pasji IL-12 in ima gen za odpornost proti kanamicinu,

ima enako učinkovito stopnjo izražanja IL-12 in enak protitumorski učinek kot plazmid, ki nosi zapis za

humani IL-12. Uporaba novega plazmida v kombinaciji z elektrokemoterapijo za zdravljenje spontanih

kožnih in oralnih tumorjev pri psih se je izkazala za varno ter učinkovito. Poleg tega novo pripravljeni

plazmidi, ki nosijo zapis za pasji IL-12 pod tkivno specifičnim ali konstitutivnim promotorjem brez gena

za odpornost proti antibiotikom, predstavljajo učinkovito orodje za nadaljnje klinične študije, ki so

nujno potrebne za uspešno translacijo te terapije v humano medicino.


viii

ABSTRACT Scientific background: Spontaneous tumors in dogs represent an excellent model for testing new

therapies and for their translation into human oncology. One such novel therapy is

electrochemotherapy, which has proved to be effective in treating tumors in dogs and humans.

Electrochemotherapy is a treatment with great success locally, but not systemically. Interleukin 12 (IL-

12) electrogenetherapy has proved highly effective in inducing a systemic effect in preclinical and

clinical studies. IL-12 is an inflammatory cytokine that increases the activity of the antitumor immune

response through interferon γ (IFNɣ). In clinical studies on combined electrochemotherapy and IL-12

electrogenetherapy treatments of spontaneous tumors in dogs, a good antitumor efficacy has been

demonstrated. In these studies, plasmids encoding human or feline IL-12, which do not have a

complete homology to canine IL-12, were used. In addition, these plasmids carried an ampicillin

resistance gene which is disapproved by regulatory agencies. Therefore, the preparation of plasmids

encoding the canine IL-12 with or without an antibiotic resistance gene is essential for use in further

clinical studies on dogs.

Methods: Firstly, plasmids encoding the canine IL-12 under a constitutive or tissue-specific promoter

with or without the gene for antibiotic resistance were prepared and evaluated. The experiments were

carried out in in vitro conditions on human and canine normal and tumor cell lines. The IL-12 expression

on mRNA and protein levels was monitored following gene electrotransfer. In in vivo conditions, the

antitumor effect of IL-12 gene electrotransfer of canine melanoma cell line xenografts on

immunocompromised mice was evaluated. We also observed the induced immune response after the

IL-12 gene electrotransfer. Lastly, we registered a clinical study with the competent authorities and

began to enroll dogs with spontaneous tumors. Dogs were treated with a combination of

electrochemotherapy and IL-12 electrogenetherapy. During the course of the therapy, we measured

the size of the tumors and took blood, swabs, urine, and stool samples to determine the safety and

efficacy of the therapy.

Results: The new plasmid encoding canine IL-12 has a similar or a higher-level IL-12 expression on

mRNA and protein levels in in vitro conditions. In in vivo conditions on immunocompromised mice, the

therapeutic efficacy after IL-12 gene electrotransfer was found to be comparable between plasmids

encoding canine and human IL-12. In the case of plasmids encoding canine IL-12 under constitutive

and tissue-specific promoters without the antibiotic resistance gene, it has been found that the

removal of the antibiotic resistance gene does not reduce the cytotoxicity or the expression level of

the transgene. In in vivo conditions, it was found that the plasmid with the constitutive promoter had


ix

a higher expression of the transgene than the plasmid with a tissue-specific promoter. In addition,

gene electrotransfer of the plasmid with the constitutive promoter caused an increase in serum IL-12,

while in the case of the tissue-specific promoter, IL-12 expression was limited to the tumor. In the case

of the constitutive promoter, an increased infiltration of granzyme B-positive cells was observed in the

tumor and spleen, indicating a systemic effect of the treatment. Also, an increased infiltration of M1

macrophages and dendritic cells in the tumor was observed after the IL-12 gene electrotransfer. Our

clinical study involved 55 dogs, 42 of them with skin tumors and 13 with oral tumors. In the case of

skin tumors, 84 % complete responses were achieved; whereas in oral tumors, only 15 % complete

responses were achieved. When screening for the presence of plasmid DNA, no plasmid DNA was

detected in the stool, urine, or serum samples. Plasmid DNA was present in skin swabs in some

patients. The highest concentration of plasmid DNA (100 ng/mL) was detected immediately after

therapy; but after 4 weeks, no plasmid DNA was detected. Lastly, the percentage of immune cells was

measured after the therapy. We observed a statistically significant decline in the percentage of

regulatory T cells at the end of the observation period compared to the time of the treatment.

Conclusion: The new plasmid encoding canine IL-12 with kanamycin resistance gene has the same or

higher expression level of IL-12 and an antitumor effect comparable to that of the plasmid encoding

human IL-12. The use of a new plasmid in combination with electrochemotherapy for the treatment

of spontaneous skin and oral tumors in dogs has proved to be safe and efficient. Additionally, newly

prepared plasmids encoding canine IL-12 under the constitutive or tissue-specific promoter without

antibiotic resistance genes serves as an effective tool for further clinical studies, which are

indispensable for translating this therapy into human medicine.


1

UVOD IN PREDSTAVITEV HIPOTEZ

PPes kot model za preiskovanje raka

Laboratorijska miš je dober in nepogrešljiv model za preiskovanje raka, predvsem zaradi majhne

velikosti in možnosti razmnoževanja v ujetništvu (De Robertis in sod. 2016). Mišje modele uporabljamo

za preučevanje začetka nastanka raka, razvoja in napredovanja bolezni ter za preučevanja novih terapij

za zdravljenja raka, vključno z gensko terapijo (Bock in sod. 2014). Vendar je zaradi slabše zmožnosti

prenosa novih terapij iz mišjih modelov na ljudi potrebno iskanje novih živalskih modelov, prek katerih

bi se nove terapije lažje prenesle v klinične študije na ljudeh (Kung 2006). Zaradi tega postaja

veterinarska medicina, predvsem pa veterinarska onkologija, pomemben člen v translaciji predkliničnih

raziskav v humane klinične študije. Domače živali, zlasti psi, predstavljajo pomembno raziskovalno

skupino v veterinarski medicini, saj si delijo življenjski prostor z ljudmi in so zato izpostavljeni podobnim

okoljskim dejavnikom tveganja za razvoj določenih bolezni. Poleg tega je življenjska doba psov precej

daljša v primerjavi z laboratorijskimi mišmi. Tako lahko dosežejo visoko starost, ki je povezana s

tveganjem za razvoj bolezni; pri zdravljenih psih pa lahko spremljamo tudi morebitne dolgodobne

stranske učinke (Rowell, McCarthy in Alvarez 2011). Preizkušanje novih terapij je tako mogoče tudi na

spontanih tumorjih, ki imajo drugačne lastnosti kot eksperimentalno povzročeni tumorji. Te lastnosti

so heterogenost med osebki in tumorji, možnosti nastanka ponavljajoče se ali odporne bolezni in

možnost zasevanja na oddaljena mesta, ki sledijo normalnemu poteku bolezni (Casal in Haskins 2006;

Khanna, Lindblad-Toh in Vail 2006). Nekateri spontani tumorji pri psih so zelo podobni humanim,

predvsem v histološki zgradbi (Ranieri in sod. 2013). Ne nazadnje je zaradi omejenih možnosti

zdravljenja ali odklonitve standardnega zdravljenja s strani lastnika nove terapije pogosto lažje

uporabiti, predvsem v primeru manj invazivnih metod. Tako je ocenjevanje učinka novih terapij

hitrejše, kar pripomore tudi k hitrejši translaciji novih terapij v humano medicino (Ranieri in sod. 2013).

Pasme, ki so najbolj nagnjene k obolevnosti zaradi raka, so: zlati prinašalec, nemški bokser in nemški

ovčar (Rowell, McCarthy in Alvarez 2011). Med najpogostejše kožne tumorje pri psih sodi kožni


2

mastocitom, med oralnimi tumorji pri psih pa je najpogostejši maligni melanom (Boerkamp in sod.

2014).

Mastocitom

Mastocitom je vrsta raka, kjer pride do neoplastične proliferacije tkivnih bazofilcev (Misdorp 2004). Je

najpogostejši kožni rak pri psih, ki predstavlja 16 do 21 % kožnih tumorjev. Pogosteje zbolijo psi, starejši

od 9 let in kar v 50 % nemški bokserji, nato mopsi, bostonski terierji in angleški braki (Bostock 1986).

Čeprav je mastocitom pri bokserjih najpogostejši, se pri tej pasmi navadno pojavljajo mastocitomi nižje

histološke stopnje malignosti, ki večinoma pomenijo boljšo prognozo. Histološka stopnja malignosti je

najpomembnejši samostojni napovedni dejavnik za mastocitom (Blackwood in sod. 2012). Največkrat

uporabljena je razvrstitev po patohistoloških kriterijih, t. i. klasifikacija po Patnaiku (Patnaik in sod.

1984). Ta razvrstitev razvršča mastocitome v tri histološke stopnje malignosti: dobro diferencirani

mastocitom (histološka stopnja malignosti I), zmerno diferencirani mastocitom (histološka stopnja

malignosti II) in diferencirani mastocitom (histološka stopnja malignosti III). Standardno lokalno

zdravljenje mastocitoma je kirurška odstranitev tumorja. V primeru stopnje malignosti I in II tumor

kirurško odstranimo v celoti z 2 cm varnostnim robom in spodaj ležečo mišično fascijo (Simpson in sod.

2004). Pri mastocitomu stopnje malignosti II, kjer ni prišlo do popolne odstranitve tumorja in so bili

robovi infiltrirani s tumorskimi celicami, se je bolezen ponovila v enem letu pri 7,3 % psov, v dveh letih

pri 22,1 % in treh letih v 33,3 % primerih (Séguin in sod. 2006). V primeru mastocitoma stopnje

malignosti III se tumor izreže v celoti s 3 cm varnostnim robom in globoko mišično fascijo. Ko tumorja

ni možno kirurško odstraniti ali je treba zaradi zasevanja uporabiti sistemsko terapijo, se uporabljata

neoadjuvantna ali adjuvantna radioterapija in kemoterapija (Thamm, Turek in Vail 2006).


3

Maligni melanom

Najpogostejši oralni tumor pri psih je maligni melanom. Pojavlja se v 30 do 40 % vseh oralnih tumorjev

in predvsem pri starejših (srednja starost 12 let) ter manjših pasmah (Bergman 2007). Poleg ustne

votline se maligni melanom pri psih pojavlja na mestih, kot so ustnice, koža in okončnine. Oralni maligni

tumorji pri psih in ljudeh imajo veliko podobnosti na molekularnem nivoju, kot so na primer signalne

poti aktivacije AKT mTOR, spremembe v receptorju tirozin kinaze in povečano delovanje

ciokloksigenaze 2 (COX-2) (Atherton in sod. 2016). Poleg tega imajo podobne fenotipske značilnosti, ki

se kažejo v tem, da so oboji tumorji zelo agresivni in hitro zasevajo, kar vodi v slabo prognozo (Atherton

in sod. 2016). Pasme, ki so nagnjene k razvoju malignega melanoma, so kodri, bauceroni in rotvajlerji.

Pri kodrih je večji delež oralnega malignega melanoma (77 %), pri bauceronu in rotvajlerju pa kožni

melanom (80 %; 69 %). Pri psih ima UV žarčenje minimalno vlogo pri razvoju malignega melanoma, saj

večinoma zbolijo psi s temno dlako (Gillard in sod. 2014). Kot standardna terapija se uporablja kirurgija,

pri kateri velikokrat pride do resekcije dela ali celotne čeljusti. Ker ta vrsta tumorja velikokrat zaseva

(74 %) je enoletno preživetje po kirurški eksciziji 21 % (Nishiya in sod. 2016).

RRak je bolezen imunskega sistema

Povezava med imunskim sistemom in napredovanjem raka je ena izmed glavnih tem v preiskovanju

raka zadnjih nekaj let. Imunsko urejanje imenujemo dogajanje, ki določa odgovor imunskega sistema

na rast in razmnoževanje tumorskih celic (Vinay in sod. 2015).

Sestavljen je iz treh faz (Kalbasi in sod. 2013):

a) ubijanja tumorskih celic,

b) ravnovesja in

c) pobega tumorskih celic.


4

Slika 1: Faze imunskega urejanja zajemajo pobeg tumorskih celic, ravnovesje in ubijanje tumorskih celic

s strani imunskega sistema. Shema je povzeta po Kalbasi in sod. 2013.

a) Ubijanje tumorskih celic

V tej fazi sodelujejo tako celice prirojenega kot celice pridobljenega imunskega odziva. Glavno vlogo

pri ubijanju tumorskih celic imajo naravne celice ubijalke, makrofagi in celice T ubijalke. Za to fazo so

značilni:

visoka antigenska variabilnost;

povišano izražanje molekul poglavitnega kompleksa tkivne skladnosti (MHC) razreda I;

povečano delovanje antigen predstavitvenih celic;

povečano izražanje kostimulatornih molekul.

b) Ravnovesje

Druga faza v imunskem urejanju raka je faza ravnovesja. V tej fazi pride do progresije rasti tumorskih

celic, ki so se uspešno izognile imunskemu sistemu.


5

c) Pobeg tumorskih celic

Tumorske celice lahko pobegnejo imunskemu odzivu na tri načine:

Izguba antigenosti

Tumorske celice se lahko izognejo prepoznavi imunskega sistema tako, da »izgubijo« antigensko

prepoznavnost, ki je v večini primerov posledica mutacij. Antigenska prepoznavnost je ključna za

delovanje imunskega sistema, ki celic, ki jih ne prepozna kot tuje, ne ubije (Beatty in Gladney 2015).

Izguba imunogenosti

Tumorske celice, ki jih imunski sistem prepozna (izražajo antigene, prepoznavne s strani imunskega

sistema), lahko ubežijo uničenju imunskega sistema z izražanjem imunosupresivnih molekul. Ena izmed

takšnih molekul je ligand programirane celične smrti 1 (PD-L1), ki deluje imunosupresivno na imunske

celice s citotoksičnim delovanjem, kot so celice T ubijalke (Juneja in sod. 2017).

Imunosupresivno okolje

Tumorske celice lahko tudi ubežijo tako, da »ustvarijo« imunosupresivno mikrookolje, ki deluje v

njihovo korist. V tem mikrookolju se nahajajo številni imunosupresivni dejavniki, kot so

imunosupresivne molekule in imunosupresivne imunske celice. Najbolj preiskovani imunosupresivni

molekuli sta PD-L1 in limfocitni T ubijalski antigen 4 (CTLA-4), ki sta inhibitorja imunskih kontrolnih točk

ter delujeta zaviralno na delovanje citotoksičnih imunskih celic. Med imunosupresivne celice štejemo

celice T zaviralke, M2 makrofage in nezrele mieloidne celice, delujejo protivnetno, spodbujajo rast žil

in proliferacijo celic ter tako prispevajo k rasti in zasevanju rakastih celic (Devaud in sod. 2013).


6

Slika 2: Tumorske celice se lahko izognejo imunskemu sistemu tako, da izgubijo prepoznavnost ali pa

delujejo supresivno na delovanje celic imunskega sistema. Povzeto po Beatty in sod. 2014.

Zaradi različnih mehanizmov pobega tumorskih celic imunskemu sistemu so nove terapije raka

usmerjene v izboljšanje imunskega sistema, ki povečajo protitumorsko delovanje imunskih celic ali

blokirajo imunosupresivne signale, ki jih oddajajo tumorske celice (Finn 2012; Gonzalez-Gugel, Saxena,

in Bhardwaj 2016). Glavne tarče preiskovanja so antigen predstavitvene celice in citotoksične celice.

Antigen predstavitvene celice

Med antigen predstavitvene celice štejemo specializirane celice, kot so dendritične celice, in

nespecializirane, kot so makrofagi. Makrofagi imajo posebej pomembno vlogo v imunoterapiji raka, saj

lahko igrajo dvojno vlogo: lahko zavirajo (M1) ali spodbujajo (M2) rast tumorskih celic (Kim, Kim in Bae

2016). M1 makrofage aktivirajo vnetni citokini, med njimi tudi dejavnik tumorske nekroze α (TNF in


7

IFN . Na svoji površini izražajo MHC II molekule in proizvajajo IL-12, IL-23, reaktivne kisikove spojine

(ROS), vnetne citokine (IL-1β, TNF, IL-6) in protitumorske kemokine (CXCL-9 and CXCL-10). Glavno

protitumorsko delovanje predstavlja predstavitev tumorskih antigenov prek MHC II-receptorja in

izločanje molekul, ki privablja Th1 celice, ki delujejo citotoksično na tumorske celice. M2 makrofage

spodbujajo IL-4, IL-13, IL-21 in IL-33, sami pa izločajo IL-10 ter kemokine CCL-17, CCL-22 in CCL-24, ki

privabljajo celice T zaviralke in Th2 celice, ki pripomorejo k rasti tumorskih celic. M2 makrofagi slabo

predstavljajo antigene, preprečujejo vnetje in stimulirajo ožiljenost ter obnavljanje tkiva (Achyut in

Arbab 2016; Yang in Zhang 2017).

Citotoksične celice

Citotoksične celice, med katere štejemo celice T ubijalke in naravne celice ubijalke (celice NK), so

najbolj pomembne celice v boju proti raku, saj neposredno uničujejo tumorske celice. Citotoksično

delovanje poteka prek dveh encimov: perforina in grancima B. Encim perforin ustvari pore v tarčni

celici, prek katerih nato grancim B vstopi v tumorsko celico in povzroči apoptozo celice (Chávez-Galán

in sod. 2015).

EElektrokemoterapija za zdravljenje raka

Elektrokemoterapija je lokalna terapija za zdravljenje tumorjev različnih vrst, katere dostavna metoda

je elektroporacija (Yarmush in sod. 2014). S pomočjo električnih pulzov povzročimo večjo propustnost

celične membrane in tako omogočimo prehajanje citostatikov prek celične membrane (Mir in sod.

1991; G. Sersa, Cemazar in Miklavcic 1995). Tako lahko citostatiki, kot sta bleomicin in cisplatin, ki sama

po sebi ne prehajata celične membrane, vstopita v celico in povzročita njen propad. Zaradi povečane

citotoksičnosti blemicina in cisplatina na mestu aplikacije električnih pulzov lahko apliciramo manjše

doze teh zdravil, kar pomeni manj ali nič sistemskih učinkov na zdravo tkivo (G. Sersa in sod. 2008).


8

Slika 3: Shematični prikaz delovanja elektrokemoterapije

Druga pomembna lastnost elektrokemoterapije je protižilni učinek, ki povzroči zmanjšan pretok krvi v

tumorju (ishemijo) in posledično zadržanje citostatikov v tkivu. Poleg tega povzroči tudi uničenje

endotelijskih celic in s tem žil, kar pomeni sekundarno uničenje tumorskih celic (Bellard in sod. 2012;

Markelc, Sersa in Cemazar 2013; Sersa in sod. 1999). Tretji mehanizem elektrokemoterapije je

aktivacija imunskega sistema s sproženjem vnetja na mestu aplikacije električnih pulzov. Aktivacija

imunskega sistema je poglavitna za popolno uničenje tumorskih celic (Sersa in sod. 2015).

Elektrokemoterapija se pogosto uporablja za zdravljenje kožnih zasevkov malignega melanoma,

ploščatoceličnega (SCC) in bazalnoceličnega (BCC) karcinoma področja glave in vratu (Bertino in sod.

2016) ter za zdravljenje jetrnih zasevkov kolorektalnega karcinoma (Edhemovic in sod. 2014).

Klinične študije v veterinarski onkologiji naše raziskovalne skupine so pokazale dober uspeh pri

zdravljenju kožnih in podkožnih tumorjev z elektrokemoterapijo. Pri konjih je bil dosežen 100 %

objektivni odgovor pri zdravljenju sarkoidov (Tozon, Sersa in Čemažar 2016). Pri mačkah je bil uspeh

zdravljenja SCC v 70 %, od tega je bil dosežen popoln odgovor pri 50 % (Tozon in sod. 2014). Najbolj

pogosto zdravljeni tumorji pri psih so bili mastocitomi in perianalni tumorji, kjer smo v obeh primerih

tumorjev dosegli popoln odgovor v 70 % (Tozon, Sersa in Čemažar 2016; Tozon in sod. 2005). Poleg

tega je v primeru mastocitomov elektrokemoterapija enako učinkovita kot standardno zdravljenje –


9

kirurgija (Kodre in sod. 2009), kar pomeni, da je odlična zamenjava v primeru, kjer bi uporaba

kirurškega zdravljenja pomenila amputacijo dela okončine ali čeljusti. Elektrokemoterapija je

učinkovito lokalno zdravljenje, vendar nima učinka na oddaljene tumorje ali zasevke. V tem primeru je

potrebno sistemsko zdravljenje, kjer se je IL-12 z dostavnim sistemom, elektroporacijo, izkazal za

učinkovito zdravljenje raka tako na lokalni kot tudi na sistemski ravni (Sersa in sod. 2015).

GGenski elektroprenos IL-12

Tako kot pri elektrokemoterapiji je tudi pri genskem elektroprenosu dostavni sistem elektroporacija,

vendar je v temu primeru terapevtska molekula plazmidna DNA (Cemazar, Jarm in Sersa 2010). Po

genskem elektroprenosu začne celica proizvajati transgen, katerega zapis nosi plazmidna DNA. V

uporabi so različni transgeni, od imuno spodbujajočih (IL-12, IL-2, IL-15, dejavnik stimulacije

granulocitne/makrofagne kolonije (GM-CSF)), transgenov, ki ciljajo ožiljenost (dejavnik enotelijske

žilne rasti (VEGF), anti-endoglin, endostatin) do DNA vakcin (HIV, virus ptičje gripe, humani papiloma

virus) (Ferraro in sod. 2011; Gothelf in Gehl 2012; Yarmush in sod. 2014). Eden izmed zelo preiskovanih

citokinov v uporabi z genskim elektroprenosom je IL-12. IL-12 je topen citokin in deluje protitumorsko,

tako da sproži nastajanje IFN , ki spodbudi infiltracijo imunskih celic s citotoksično aktivnostjo, kot so

celice T ubijalke in celice NK (Del Vecchio in sod. 2007). IL-12 deluje tudi protižilno prek aktivacije IFN ,

ki aktivira z interferonom inducibilen protein-10 (IP10) in monokin Mig. Poleg tega IL-12 poveča

imunski odziv celic CD4 + Th1, kar aktivira specifični odgovor B celic (Trinchieri 2003). Genski

elektroprenos IL-12 se je izkazal za učinkovit in varen pri zdravljenju eksperimentalno povzročenih

tumorjev pri miših (Hanna in sod. 2001; Kishida in sod. 2003). Rezultati teh študij so pokazali sistemsko

in lokalno povišanje IL-12 in posledično tudi IFN (Lucas in sod. 2002). Ne glede na način aplikacije

(intratumoralno, intramuskularno in peritumoralno) je terapija genskega elektroprenosa IL-12

povzročila zaostanek rasti tumorja in celo popolno izginotje tumorja, ki je bil najvišji (celo do 90 %) v

primeru intratumoralne aplikacije (Pavlin in sod. 2009; Sedlar in sod. 2013). Poleg tega so bile v

tumorjih odkrite povišane infiltracije limfocitov T, celic NK in dendritičnih celic, kot tudi zmanjšanje


10

količine krvnih žil, kar kaže na protižilni učinek IL-12 terapije. Dodatno so bile merjene tudi količine

cirkulirajočih limfocitov, kjer so ugotovili porast spominskih celic T ubijalk pri miših, ki so bile odporne

na ponovno rast tumorjev (Li, Zhang in Xia 2002; Shirley in sod. 2015).

UUporaba elektrogenske terapije IL-12 za zdravljenje tumorjev pri psih

Uporabo genskega elektroprenosa IL-12 v veterinarskih kliničnih študijah z namenom zdravljenja

tumorjev imenujemo elektrogenska terapija (Pavlin in sod. 2011). Terapijo so uporabili kot samostojno

zdravljenje eksperimentalno transplantiranih spolno prenosljivih tumorjev in so pokazali izjemno

protitumorsko učinkovitost s statistično značilnim zaostankom rasti tumorja in dolgotrajno popolno

regresijo tumorja. Poleg tega je imela elektrogenska terapija z IL-12 tudi sistemski učinek na oddaljene

nezdravljene tumorje (Chuang in sod. 2009). Naša raziskovalna skupina je uporabila elektrogensko

terapijo za zdravljenje različnih spontanih tumorjev pri psih. Intramuskularna aplikacija se je izkazala

za varno in učinkovito terapijo šestih vključenih psov v študijo. Pri vseh psih smo opazili podaljšanje

preživetja, prav tako smo pri štirih od šestih psov v serumu zaznali povišanje IL-12 in IFN (Cemazar in

sod. 2011). Poleg intramuskularne aplikacije pa je bila opravljena tudi študija, kjer je bilo vključenih

osem psov s skupno enajstimi spontanimi mastocitomi, pri katerih smo intratumoralno aplicirali

plazmidno DNA in dovedli električne pulze. Opazili smo zmanjšanje velikosti tumorjev v razponu od 15

do 83 % (mediana 50 %) ter sistemsko povišanje IL-12 in IFN (Pavlin in sod. 2011). Dodatno so v klinični

študiji Cicchelero in sod., po intratumoralni aplikaciji IL-12, poleg učinka na zaostanek rasti tumorja,

opazili tudi povišanje imunskih celic v periferni krvi in zmanjšano prekrvavljenost tumorjev (Cicchelero

in sod. 2016). Ne nazadnje pa je bila opravljena tudi klinična študija faze I na ljudeh, kjer so dokazali,

da ima študija, poleg tega, da je učinkovita in varna, tudi protitumorski učinek na oddaljene tumorje

(Daud in sod. 2008).

Elektrogensko terapijo pa so uporabljali tudi v kombinaciji z elektrokemoterapijo na spontanih

tumorjih s slabo prognozo. Pri zdravljenju šestih psov z različnimi spontanimi tumorji so ugotovili dober

odziv psov na terapijo, in sicer pri treh od šestih je prišlo do popolnega odziva, pri ostalih treh pa do


11

delnega odziva na zdravljenje (Reed in sod. 2010). Poleg tega je bila terapija uporabljena tudi pri dveh

psih s papilarnim in kostnim tumorjem. Pri obeh pacientih so ugotovili popolno izginotje tumorja

(Cutrera in sod. 2008). Pred kratkim pa je bila objavljena tudi študija, kjer so s to terapijo zdravili 13

psov z različnimi malignimi obolenji. Uporabili so plazmid, ki kodira pasji IL-12. Zabeležili so objektivni

odgovor v polovici primerov (Cutrera in sod. 2015b). Ne nazadnje smo tudi na našem inštitutu uporabili

kombinacijo elektrogenske terapije z elektrokemoterapijo za zdravljenje mastocitomov pri psih.

Uporabili smo plazmid, ki nosi zapis za humani IL-12. Pri 18 psih smo dosegli popoln odgovor v 72 %.

Prav tako smo pri 78 % pacientov opazili povišane serumske vrednosti IL-12 in IFNgama v serumu

(Cemazar in sod. 2016). V vzorcih tumorjev po terapiji smo opazili povišano infiltracijo imunskih celic,

limfocitov T in makrofagov ter zmanjšano proliferacijo tumorskih celic in zmanjšano število žil

(Salvadori in sod. 2017).

MMožnosti izboljšave plazmida

V večini omenjenih raziskavah je bila uporabljena plazmidna DNA, z zapisom za humani ali mačji IL-12.

Homolognost med pasjim in humanim ali mačjim je 86 % in 82 % (Buttner in sod. 1998). Čeprav je

homolognost med citokini visoka, pa vedno obstaja možnost, da heterogen IL-12 izzove alergijsko

reakcijo in je učinkovitost manjša. Poleg tega so imeli uporabljeni plazmidi gen za odpornost proti

ampicilinu. Ampicilin je pogosto uporabljen širokospektralni antibiotik v veterinarski in humani

medicini (Solensky 2003), zato uporabo ampicilina kot selektivnega markerja varnostna priporočila

EMA in FDA odsvetujejo oziroma prepovedujejo (EMA 2011; Hubbard 1996). Nadalje so imeli

uporabljeni plazmidi konstitutivne virusne promotorje, ki se uporabljajo zelo pogosto, saj omogočajo

zelo visoko stopnjo izražanja, vendar jih ni mogoče nadzorovati in niso tkivno specifični. Poleg tega so

nagnjeni k metilaciji v sesalskih celicah in posledično inaktivaciji in vitro ter in vivo. Za bolj ciljano

izražanje transgena v tarčnih celicah se uporabljajo tkivno specifični evkariontski promotorji, ki

omogočajo usmerjeno transkripcijo in s tem preprečujejo izražanje transgena v neustreznih tkivih

(Kamensek in sod. 2011; Papadakis in sod. 2004).


12

NNamen dela, hipoteze in zastavljeni potek študije

Namen doktorske naloge je bila priprava in ovrednotenje plazmidne DNA z zapisom za pasji IL-12 za

zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev psov z uporabo genskega elektroprenosa, v kombinaciji s

kirurško odstranitvijo ali elektrokemoterapijo.

Zastavili smo si tri delovne hipoteze:

Hipoteze

1 Priprava plazmida s tkivno specifičnim in konstitutivnim promotorjem ter zapisom za pasji IL-12 z

ali brez gena za odpornost proti antibiotiku bo uspešna.

2 Novo pripravljeni plazmid bo bolje ali enako učinkovit v razmerah in vitro in in vivo kot doslej

uporabljeni plazmid z zapisom za humani IL-12.

3 Elektrogenska terapija s plazmidom, ki nosi zapis za pasji IL-12, je sama ali v kombinaciji s kirurško

odstranitvijo ali elektrokemoterapijo varna in ima protitumorski učinek na kožne in oralne

tumorje psov.


13

UPORABLJENE METODE V oklepaju je označeno poglavje, v katerem je metoda navedena:

In vitro metode:

Standardne molekularne metode za pripravo plazmidne DNA (1–4)

ORT tehnologija za pripravo ORT plazmidov (3, 4)

Izolacija in ovrednotenje plazmidne DNA (1–5)

Gojenje celic in vitro (1–3)

Genski elektroprenos in vitro na izbranih celičnih linijah (1–3)

In vivo metode:

Nastanitev in oskrba živali (2–4)

Anestezija miši (2–4)

Priprava celične suspenzije za nasaditev podkožnih tumorjev (2–4)

Nasaditev podkožnih tumorjev (2–4)

Injiciranje plazmidne DNA v tumor miši (2–4)

Aplikacija električnih pulzov in vivo z uporabo ploščate elektrode (2–4)

Genski elektroprenos in vivo (2–4)

Merjenje velikosti tumorjev (2–4)

Izračunavanje zaostanka v rasti in izris rastnih krivulj (2–4)

Odvzem krvi mišim (3, 4)

Odvzem mišje vranice in tumorjev (3, 4)

Citološke in histološke metode:

Priprava vzorcev tumorjev za histološko analizo (fiksiranje v cinkovem fiksativu, vklapljanje v

parafin, rezanje rezin, barvanje s hematoksilininom in eozinom) (3, 4)

Imunohistološko barvanje rezin tumorjev in vranice (3, 4)

Spremljanje fluorescence celic z uporabo fluorescentni mikroskopa (1–3)

Pretočna citometrija (1, 2, 3, 5)

Imunokemijski test ELISA in ELISpot (1–5)


14

Metode v klinični študiji:

Priprava in prijava dokumentov (protokol, ocena tveganja GSO) klinične študije pristojnim

organom (5)

Izvajanje elektrokemoterapije in elektrogenske terapije na spontanih tumorjih pri psih (5)

Jemanje biopsij tumorjev, vzorcev krvi, urin, brisa, blata (5)

Spremljanje tumorjev na tedenskih pregledih z merjenjem in slikanjem (5)

Ostale metode:

Izolacija mRNA in kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (1, 2, 3, 5)

Statistične metode (1–5)


15

POGLAVJE 1

Poglavje 1: Genski elektroprenos pasjega interlevkina 12 v pasje melanomske celične linije

Gene Electrotransfer of Canine Interleukin 12 into Canine Melanoma Cell Lines

Urša Lampreht1, Urška Kamenšek1, Monika Štimac1, Gregor Serša1, Nataša Tozon2, Maša Bošnjak1, Andreja Brožič3, Geraldo Gileno de Sa´ Oliveira4, Takayuki Nakagawa5, Kohei Saeki5, Maja Čemažar1, 6

1 Department of Experimental Oncology, Institute of Oncology Ljubljana, Zaloška 2, 1000 Ljubljana,

Slovenia

2 University of Ljubljana, Veterinary Faculty, Small Animal Clinic, Cesta v Mestni log 47, Ljubljana,

Slovenia

3 Department of Cytopathology, Institute of Oncology Ljubljana, Zaloška 2, 1000 Ljubljana, Slovenia

4 Laboratory of Pathology and Bio-Intervention, Goncalo Moniz Research Center, Oswaldo cruz

Foundation and National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases (INCT-DT), Rua

Waldemar Falcão, No. 121, Candeal, Salvador, Brazil

5 Laboratory of Veterinary Surgery, Graduate School of Agricultural and Life sciences, The University of

Tokyo, 1-1-1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan

6 University of Primorska, Faculty of Health Sciences, Polje 42, Izola, Slovenia

The Journal of Membrane Biology 248 (5): 909–917, doi: 10.1007/s00232-015-9800-2. 2015


16

POVZETEK

Genska terapija (GET) s plazmidom, ki nosi zapis za interlevkin 12 (IL-12), se je izkazala za učinkovito terapijo pri zdravljenju tumorjev v kliničnih študijah humanih in veterinarskih pacientov. Klinične študije v veterini so do zdaj uporabljale plazmide, ki so nosili zapis za humani ali mačji IL-12, ter gen za odpornost proti ampicilinu, kar pristojne agencije odsvetujejo. Namen študije je priprava plazmida, ki nosi zapis za pasji IL-12 in gen za odpornost proti kanamicinu. Validacijo novega plazmida smo opravili na celičnih linijah pasjega malignega melanoma, ki do zdaj še niso bile uporabljene v GET študijah, ter na celičnih linijah humanega malignega melanoma. Celične linije pasjega in humanega malignega melanoma so bile transfecirane s plazmidom, ki nosi zapis za zeleni flourescirajoči protein pri različnih parametrih električnih pulzov, z namenom določitve uspešnosti transfekcije in preživetja celic. Izražanje IL-12 po GET s plazmidom, ki nosi zapis za pasji IL-12, smo določili s pomočjo qRT-PCR na nivoju mRNA in ELISpot na nivoju proteinov. Rezultati so pokazali, da ima novi plazmid, ki nosi zapis za pasji IL-12, podobno ali višjo zmožnost ekspresije kot plazmid, ki nosi zapis za humani IL-12. Tako predstavlja obetajoč terapevtski plazmid za nadaljnje klinične študije z gensko terapijo IL-12 za zdravljenje spontanih tumorjev pri psih. Poleg tega zadovoljuje tudi kriterije pristojnih agencij (FDA in EMA).


17


18


19


20


21


22


23


24


25


26

POGLAVJE 2

Poglavje 2: Ovrednotenje plazmida, ki nosi zapis za pasji interlevkin 12 v in vitro ter in vivo pogojih

In vitro and in vivo evaluation of a plasmid encoding canine interleukin 12

U. Lampreht1, U. Kamensek1, M. Stimac1, M. Bosnjak1, S. Kranjc1, G. Sersa1, M. Cemazar1, 2

1 Institute of Oncology Ljubljana, Department of experimental oncology, Ljubljana, Slovenia 2 University of Primorska, Faculty of Health Sciences, Izola, Slovenia

1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies (WC 2015): Portorož, Slovenia, September 6–10, 2015, IFMBE proceedings 53: 441–444.


27

POVZETEK

Klinične študije na spontanih tumorjih pri psih z uporabo elektrogenskega prenosa plazmida, ki nosi zapis za humani interlevkin 12 (IL-12), so pokazale dobre uspehe. Vendar je uporaba plazmida, ki nosi zapis za pasji IL-12, nujna za prihodnje klinične študije. Zato je bil namen te študije oceniti učinkovitost plazmida, ki nosi zapis za pasji IL-12 v in vitro ter in vivo pogojih ter primerjati njegovo aktivnost s plazmidom, ki nosi zapis za humani IL-12. Naši rezultati so pokazali, da je po in vitro genskem elektroprenosu učinkovitost ekspresije plazmida, ki nosi zapis za pasji IL-12, primerljiva s plazmidom, ki nosi zapis za humani IL-12. V in vivo poskusu na imunsko zavrtih miših smo ugotovili, da je terapevtska učinkovitost po elektrogenskem prenosu primerljiva med plazmidoma, ki nosita zapis za pasji ali humani IL-12. Poleg tega je bil učinek terapije na zaostanek rasti tumorja enak po prvi in drugi terapiji, kar kaže na to, da je elektrogenska terapija s plazmidom, ki nosi zapis za pasji IL-12, ponovljiva. Tako naša študija predpostavlja, da je plazmid, ki nosi zapis za pasji IL-12, primeren plazmid za uporabo v nadaljnjih kliničnih študijah na psih.


28


29


30


31


32

POGLAVJE 3

Poglavje 3: Protitumorski učinek plazmidov, ki nosijo zapis za pasji IL-12 in so brez gena za antibiotično rezistenco na pasjem melanomskem modelu

Antitumor effect of antibiotic-resistance gene-free plasmids encoding interleukin-12 in canine

melanoma model

Ursa Lampreht Tratar1, Spela Kos1, Urska Kamensek1, Maja Ota2, Natasa Tozon3, Gregor Sersa1, 4, Maja Cemazar1, 5

1 Institute of Oncology Ljubljana, Department of Experimental Oncology, Zaloška 2, 1000 Ljubljana, Slovenia

2 Institute of Oncology Ljubljana, Department of Pathology, Zaloška 2, 1000 Ljubljana, Slovenia

3 Clinic for Surgery and Small Animals, University of Ljubljana, Veterinary Faculty, Cesta v Mestni log 47, 1000 Ljubljana, Slovenia

4 University of Ljubljana, Faculty of Health Sciences, Zdravstvena pot 5, 1000 Ljubljana, Slovenia

5 University of Primorska, Faculty of Health Sciences, Polje 42, Izola, Slovenia

Cancer Gene Therapy 2018: 1–10, doi: 10.1038/s41417-018-0014-5. 2018


33

POVZETEK

Genski elektroprenos interlevkina 12 (IL-12) se je izkazal za učinkovit in varen način zdravljenja tumorjev v veterinarskih kliničnih študijah. Vendar so uporabljeni plazmidi večinoma nosili zapis za humani ali mačji IL-12 in gen za odpornost proti antibiotiku. Zato je bil namen tega raziskovalnega dela narediti plazmid brez gena za odpornost proti antibiotiku, ki nosi zapis za pasji IL-12 in je pod dvema različnima promotorjema: konstitutivnim in tkivno specifičnim. Rezultati, dobljeni pri poskusih v in vitro pogojih na različnih celičnih linijah, so pokazali, da imajo novo narejeni plazmidi primerljivo citotoksičnosti in ekspresijo v primerjavi s plazmidi, ki imajo gen za odpornost proti antibiotiku. Dodatno so in vivo študije pokazale statistično značilen zaostanek rasti tumorja CMeC-1 v primerjavi s kontrolnimi skupinami po intratumoralnem genskem elektroprenosu. Poleg višje ekspresije, dobljene v primeru plazmidov s konstitutivnim promotorjem, je bila glavna razlika med obema plazmidoma distribucija ekspresije transgena. Po genskem elektroprenosu je plazmid s konstitutivnim promotorjem pokazal povišano vrednost v serumu, medtem ko je bilo izražanje IL-12 v primeru tkivno specifičnega promotorja omejeno na tumor. Poleg tega je bila v primeru konstitutivnega promotorja zaznana povišana infiltracija grancim B-pozitivnih celic v tumorju in vranici, kar kaže na sistemski učinek terapije. Tako lahko z uporabo različnih promotorjev vplivamo na vrsto terapije: lokalno ali sistemsko. Rezultati te študije so pokazali, da plazmidi, ki nosijo zapis za pasji IL-12 pod konstitutivnim ali tkivno specifičnim promotorjem brez gena za odpornost proti antibiotiku, predstavljajo uporabno orodje za tarčno dostavo genov, ki bi lahko bilo uporabljeno za zdravljenje lastniških psov.


34


35


36


37


38


39


40


41


42


43


44


45


46


47


48

POGLAVJE 4

Poglavje 4: Genski elektroprenos plazmida za IL-12 rekrutira M1 makrofage in antigen predstavitvene celice in povzroči popolno regresijo agresivnih mišjih tumorjev melanoma

B16F10

Gene Electrotransfer of Plasmid-Encoding IL-12 Recruits the M1 Macrophages and Antigen-

Presenting Cells Inducing the Eradication of Aggressive B16F10 Murine Melanoma

Ursa Lampreht Tratar1, Luisa Loiacono2, 3, Maja Cemazar1, 4, Urska Kamensek1, Vito Michele Fazio2, 3, Gregor Sersa1, Emanuela Signori2, 5

1 Department of Experimental Oncology, Institute of Oncology Ljubljana, Zaloska 2, Ljubljana, Slovenia

2 Laboratory of Genetic and Clinical Pathology, University Campus Bio-Medico of Rome, via Álvaro

del Portillo 21, 00128 Rome, Italy

3 Laboratory of Oncology, IRCCS “Casa Sollievo della Sofferenza”, viale dei Cappuccini, 71013 San

Giovanni Rotondo (Fg), Italy

4 Faculty of Health Sciences, University of Primorska, Polje 42, Izola, Slovenia

5 National Research Council - Institute of Translational Pharmacology (CNR-IFT), Via Fosso del Cavaliere 100, Rome, Italy

Mediators of Inflammation 2017: 1–11, doi: 10.1155/2017/5285890. 2017


49

POVZETEK

Imunoterapija je trenutno eden izmed najbolj obetavnih pristopov za zdravljenje raka. Genski prenos plazmidov z zapisom za interlevkin 12 (IL-12) vodi v produkcijo IL-12, ki povzroči polarizacijo imunskih celic v smer protitumorskega odziva. Pri tem imajo pomembno vlogo makrofagi. Cilj študije je bil ovrednotiti genski elektroprenos plazmida z zapisom za interlevkin 12 brez gena za antibiotično rezistenco na agresivnem mišjem tumorskem modelu melanoma, B16F10. Elektroprenos IL-12 je povzročil popolno in dolgotrajno regresijo tumorjev. Terapija je povzročila povišane serumske koncentracije IL-12 in interferona γ (mIFNγ). Histološko barvanje tumorjev s hematoksilin eozinom (HE) je pokazalo obsežno infiltracijo imunskih celic, ki je trajala od 4. do 14. dneva. Tudi imunohistokemično barvanje F4/80, MHCII in CD11c je bilo bolj pozitivno v terapevtski skupini. Infiltracija imunskih celic v tumor in visoka gostota F4/80, MHCII in CD11c pozitivnih celic nakazujejo na polarizacijo makrofagov in prisotnost antigen predstavitvenih celic, kar prispeva k protitumorski učinkovitosti terapije z IL-12.


50


51


52


53


54


55


56


57


58


59


60


61


62

POGLAVJE 5

Poglavje 5: Protitumorski učinek elektrokemoterapije v kombinaciji z elektrogensko terapijo z IL-12 pri zdravljenju spontanih kožnih in oralnih tumorjev pri psih

11. Uvod

Rak je pogosta bolezen psov starejših od 10 let, saj kar polovica starejših psov zboli za to boleznijo in

četrtina izmed njih zaradi nje sčasoma pogine (Adams in sod. 2010; Dobson 2013; Vail in MacEwen

2000). Najbolj pogosti solidni tumorji pri psih so mastocitom v koži in maligni melanom v gobcu

(Withrow in Vail 2007). Psi zbolijo za podobnimi vrstami rakov kot ljudje (Khanna, Lindblad-Toh in Vail

2006) in imajo tudi podobne značilnosti glede etiologije, klinične patologije ter odziva na zdravljenje

(Ranieri in sod. 2013; Rowell, McCarthy in Alvarez 2011). Zaradi teh lastnosti in dejstva, da je

preskušanje novih terapij v veterinarski onkologiji lažje zaradi manj opredeljenih standardnih

postopkov, predstavljajo psi odličen model za translacijske študije in prenos novih terapij v humano

onkologijo.

Elektrokemoterapija je lokalno zdravljenje tumorjev, pri katerem pride do vnosa citostatikov v

tumorske celice s pomočjo električnih pulzov (Cemazar in sod. 2008). V veterinarski onkologiji se je

elektrokemoterapija izkazala za izredno uspešno in varno lokalno zdravljenje tumorjev pri konjih

(Tamzali in sod. 2012), mačkah (Tozon in sod. 2014) in psih (Tozon in sod. 2016), kjer je uspeh primerljiv

s standardno kirurško terapijo (Kodre in sod. 2009). Elektrokemoterapija je izredno učinkovito lokalno

zdravljenje, vendar je brez sistemskih učinkov. Da bi dosegli sistemski učinek, se je genska terapija z IL-

12 izkazala za zelo učinkovito terapijo. Elektrogenska terapija uporablja metodo prenosa, prav tako kot

elektrokemoterapija, elektroporacijo. S pomočjo elektroporacije vnesemo v tarčne celice plazmidno

DNA, ki nosi zapis za IL-12, ki se nato začne izražati v tarčni celici (Cemazar, Jarm in Sersa 2010).

Elektrogenska terapija z IL-12 je že bila uporabljena tako v predkliničnih raziskavah (Pavlin in sod. 2009;

Tevz in sod. 2009) kot tudi v kliničnih študijah na psih (Pavlin in sod. 2011) in ljudeh (Daud in sod. 2008).

IL-12 je topni citokin, ki ima provnetno vlogo in dober protitumorski učinek prek IFNγ in TNFα, ki temelji

na protižilnem učinku (Salvadori in sod. 2017) ter na povečevanju delovanja antigen predstavitvenih

celic in celic T ubijalk (Colombo in Trinchieri 2002). Poleg tega IL-12 deluje na zmanjšanje

imunosupresivnih celic, kot so celice T zaviralke in MDSC, ki jih povezujejo s slabo prognozo (Lasek,

Zagożdżon in Jakobisiak 2014; Steding in sod. 2011). Elektrogenska terapija z IL-12 je pokazala, da ima

delen učinek na zaostanek v rasti spontanih tumorjev pri psih in da poviša količino serumskega IL-12

ter IFNγ (Cemazar in sod. 2011; Chuang in sod. 2009; Pavlin in sod. 2011). Zaradi omejenega učinka

elektrogenske terapije je bil predlagan model kombinacije elektrokemoterapije z elektrogensko


63

terapijo za zdravljenje raka (Sersa in sod. 2015). Kombinacijo teh terapij so objavile tri raziskovalne

skupine, kjer so zdravili različne spontane tumorje pri psih (Cemazar in sod. 2016; Cutrera in sod.

2015a; Reed in sod. 2010). V vseh omenjenih študijah so uporabili plazmid, ki nosi zapis za humani ali

mačji IL-12. Humani in mačji IL-12 sta pasjemu homologna le v 86 in 82 %, zaradi česar lahko pride do

neželenih alergijskih reakcij (Buttner in sod. 1998). Poleg tega so plazmidi v omenjenih študijah

večinoma nosili gen za ampicilinsko rezistenco. Zaradi pogoste uporabe ampicilina v kliniki (Solensky

2003) je uporaba plazmida z genom za ampicilinsko rezistenco v kliničnih študijah za agenciji EMA in

FDA nesprejemljiva. Dopuščajo pa uporabo plazmidov z genom za kanamicinsko rezistenco (EMA 2011;

Hubbard 1996).

Zato je bil namen te klinične študije uporabiti plazmid, ki nosi zapis za pasji IL-12 in ima gen za

odpornost proti kanamicinu, za zdravljenje spontanih kožnih in oralnih tumorjev pri psih.

22. Materiali in metode

2.1. Farmacevtski proizvodi (citostatiki in plazmidi)

Za izvajanje elektrokemoterapije smo uporabili dva citostatika: bleomicin in cisplatin. Bleomicin

(Blenoxane, Bristol-Myers, NY, ZDA) smo raztopili v fiziološki raztopini s koncentracijo 3 mg/mL,

cisplatin (Cisplatin Kabi, Fresenius Kabi Oncology, Hampshire, Velika Britanija) pa je že raztopljen v

koncentraciji 1 mg/ml. Doza za intravenozno uporabo bleomicina je bila 0,3 mg/kg telesne teže, v

primeru intratumoralne uporabe pa je bila doza odvisna do velikosti tumorja. Pri manjših tumorjih (do

1 cm3) je bila količina cisplatina ali bleomicina 1 mg/cm3, pri tumorjih večjih od 1 cm3 pa 0,5 do 1

mg/cm3. Uporabljeni plazmid v klinični študiji je bil pCMVcaIL12 velikosti 4547 bp, ki nosi zapis za pasji

IL-12. Plazmid smo pripravili s kloniranjem gena za pasji IL-12 iz plazmida pcDNA3.1zeo+sccaIL12 (darilo

Geralda Gilena de Sa Oliveira) (Dos Santos et al. 2004), v komercialno dostopni ekspresijski vektor s

CMV promotorjem pVAX (Invitrogen, CA, ZDA). Podrobna priprava plazmida, pa tudi ovrednotenje v in

vitro ter in vivo pogijih, je predstavljeno v poglavjih 1, 2 in 3. Izolacija in priprava plazmida sta bili

izvedeni s pomočjo Qiagen Endo-Free kompleta (Qiagen, Hilden, Germany), v skladu z navodili

proizvajalca. Plazmid je bil pripravljen sterilno, v koncentraciji 1 mg/ml, v vodi brez endotoksinov

(Qiagen).

2.2. Živali, vključene v klinično študijo

Med junijom 2015 in februarjem 2018 smo v klinično študijo vključili 55 psov: 42 psov s kožnimi tumorji

(38 z mastocitomom, 3 s plazmocitomom in 1 z epiteliotropnim limfomom) in 13 psov z oralnimi

tumorji (9 z oralnim malignim melanomom, 3 s fibrosarkomom in 1 s SCC (ploščatoceličnim

karcinomom)). Pri 10 pacientih s kožnim tumorjem je bilo prisotnih več tumorjev. Vključeni psi so bili


64

različnih pasem (večinoma mešanih, sledili so nemški bokserji in psi tipa bull), spolov (38 samic, 14

samcev) in starosti (5 do 15 let) (Tabela 1). V tabelo so pacienti uvrščeni sprva glede na tip tumorja,

nato glede na vrsto zdravljenja, prejšnja zdravljenja, starost, klinični stadij bolezni in velikost tumorja.

Vključitveni kriteriji so bili, da imajo živali citološko ali histološko potrjene tumorje, da je pričakovana

življenjska doba daljša od 3 mesecev, da mora lastnik živali razumeti postopke zdravljenja in morebitne

stranske pojave ter podpisati obveščeni pristanek. Živali, vključene v študijo, so bile tiste, pri katerih so

lastniki zavrnili standardno zdravljenje, zaradi cene zdravljenja, dostopnosti zdravljenja ali invazivnost

zdravljenja (ki bi zajemalo amputacije delov okončin ali čeljusti). Klinično študijo je odobrila Etična

komisija pri Ministrstvu za kmetijstvo, gozdarstvo in hrano Republike Slovenije (številka dovoljenja:

323-451/2004-9).

Tabela 1: Seznam pacientov, vključenih v klinično študijo

ŠT.

PACIENTA PASMA STAROST

(LETA)/

SPOL

VRSTA

TUMORJA LOKACIJA

TUMORJA PREJŠNJA

ZDRAVLJENJA KLINIČNI

STADIJ VELIKOST

TUMORJA

(CM3)

PH

OCENA ŠT.

TUMORJEV VRSTA

ZDRAVLJENJA

KOŽN

I TUM

ORJ

I

1 X 3/F MCT Desno koleno / 1 3,22 I (K) 1 ECT

(CDDP) +

EGT 2 X 5/F MCT Brada levo / 1 0,85 II 1 ECT

(CDDP) +

EGT 3 AST 5/M MCT Leva nadlaht / 1 2,04 I (K) 1 ECT

(CDDP) +

EGT 4 AST 6/F MCT Območje

dlančnic leve

noge

/ 1 2,1 II (PK) 1 ECT (bleo)

+ EGT

5 VT 6/F MCT Desni bok / 1 1,15 NZ 1 ECT

(CDDP) +

EGT 6 NB 6/M MCT Levo stegno / 1 2,5 II (PK

) ECT

(CDDP) +

EGT 7 B 6/F MCT Desno

zapestje / 1 6,28 II (PK

) 1 ECT

(CDDP) +

EGT 8 X 6/F MCT Konica in baza

levega ušesa / 3 1; 0,8 NZ 2 ECT

(CDDP) +

EGT 9 AM 7/F MCT Desni bok / 1 0,05 II 1 ECT

(CDDP) +

EGT


65

10 FB 7/M MCT Dorzalna

stran nosnic / 1 1,07 I/II 1 ECT

(CDDP) +

EGT 11 BP 7/F MCT Levo stegno / 1 1,63 II (PK

) 1 ECT (bleo)

+ EGT 12 NLT 7/F MCT Prsni koš, levi

bok / 3 0,26;

0,26 II 2 ECT

(CDDP) +

EGT 13 X 7/F MCT Vrat / 3 0,97 II (PK

) 1 ECT (bleo)

+ EGT 14 NB 7/M MCT Leva rama

(2x), leva

preskapularna

bezgavka

/ 3 3,14;

0,52;

41,21

III (K) 3 ECT

(CDDP) +

EGT

15 X 8/F MCT Desno koleno / 1 0,52 NZ 1 ECT (bleo)

+ EGT

KOŽN

I TUM

ORJ

I

16 X 8/M MCT Levo zapestje / 1 5,89 II (PK

) 1 ECT (bleo)

+ EGT 17 BP 8/M MCT Območje

desnih

dlančnic

/ 1 15,36 II (PK

) 1 ECT

(CDDP) +

EGT 18 X 8/F MCT Levi gleženj / 1 22,4 NZ 1 ECT

(CDDP) +

EGT 19 M 9/F MCT Desni gleženj / 1 0,82 I 1 ECT

(CDDP) +

EGT 20 X 9/F MCT Sprednja

desna noga / 2 0,38 NZ 1 ECT (bleo)

+ EGT 21 AST 9/F MCT Levo stegno

lateralno, leva

lopatica

/ 4 0,53;

0,03 II (PK

) 2 ECT (bleo)

+ EGT

22 NB 1/F MCT Območje med

prsti leve

noge, leva

poplitealna

bezkavka

KO (NR) 3 0; 0,52 II (K) 2 EGT

23 NB 4/M MCT Desna

spodnja veka ECT 1 0,004 NZ 1 ECT (bleo)

+ EGT 24 BT 5/F MCT Levi komolec KO (NR) 1 0 II 1 ECT (bleo)

+ EGT 25 NB 6/F MCT Desna

spodnja

ustnica, desna

sprednja noga

KO (NR) 3 0;

0,024 II 2 ECT + EGT

26 Hrt 7/F MCT Leva zadnja

noga KO (NR) 1 0 II (K) 1 ECT (bleo)

+ EGT


66

27 NB 7/F MCT Čelo KO (NR) 1 0 II 1 EGT KO

ŽNI T

UMO

RJI

28 GDP 7/F MCT Desni bok

ventralno,

desni bok

dorzalno

KO (NR) 1 0,9; 1,7 III 2 ECT

(CDDP) +

EGT

29 MT 7/F MCT Območje L1

mamarnega

kompleksa

KO (NR) 2 0 III 1 EGT

30 D 8/F MCT Leva lopatica 0b + KT 4 280,8 1 EGT 31 M 9/M MCT Območje med

prsti desne

zadnje noge

KO (NR) 3 1,31 II 1 ECT (bleo)

+ EGT

32 X 10/F MCT Prsni koš ECT 1 0,4 II (PK) 1 ECT (bleo)

+ EGT 33 ŠO 11/F MCT Desna stran

vratu, desni

bok

KO (NR) 3 0; 0 II 2 ECT (bleo)

+ EGT

34 BT 13/F MCT Medialna

stran desnega

stegna,

dimeljsko

območje

desnega

stegna

KO (NR) 4 14,65;

0,52 III (K) 2 ECT (bleo)

+ EGT

35 JRT 6/F MCT Desno

zapestje / 1 3,5 NZ 1 Krg + ECT

(bleo) +

EGT 36 M 8/F MCT Desna

lopatica (3x),

levi gleženj

/ 4 0,019;

0,019;

0,002;

0,11

II 4 Krg + EGT

37 FB 10/F MCT Leva sprednja

noga, vrat / 3 12,56;

0,52 II (PK) 2 Krg + ECT

(bleo) +

EGT 38 ZP 11/M MCT Desna zadnja

noga / 4 0,98 NZ 1 Krg + EGT

39 VT 5/F P Desna

sprednja noga / 1 0,37 1 ECT (bleo)

+ EGT 40 KŠ 5/F P Območje med

prsti sprednje

desne noge

KO (NR) 2 5,52;

1,14 2 ECT (bleo)

+ EGT

41 MH 9/F P Dorzalno od

levega očesa KO (NR) 2 12,1 1 ECT (bleo)

+ EGT 42 M 8/F EL Smrček / 1 0,11 1 Krg + EGT

43 SP 9/M OMM Zgornja leva

ustnica / 2 8,35 1 CRT + ECT

(bleo) +

EGT


67

ORA

LNI T

UMO

RJI

44 ZP 10/M OMM Desna

mandibula / 3 40,1 1 CRT + ECT

(bleo) +

EGT 45 IPT 13/M OMM Desna


(bleo) +

EGT 46 KŠ 14/F OMM Spodnja

desna ustnica / 2 3,14 1 CRT + ECT

(bleo) +

EGT 47 NLT 15/F OMM Leva


(bleo) +

EGT 48 IS 9/M OMM Desna

mandibula KO (NR) 2 14,13 1 ECT (bleo)

+ EGT 49 CKS 10/F OMM Desni ustni

kot, desna

amndibularna

bezgavka

KO (NR) 3 1,31;

0,89 2 ECT (bleo)

+ EGT

50 Pu 11/F OMM Pod jezikom KO (NR) 1 0,79 1 ECT (bleo)

+ EGT 51 Kr 12/F OMM Zgornja desna

ustnica KO (NR) 1 0 1 ECT + EGT

52 Po 3/M FiB Desna

mandibular / 3 18,84 II/III 1 ECT + EGT

53 RG 8/F FiB Maksila / 3 9,16 NZ 1 Krg + ECT +

EGT 54 VT 6/M FiB Obe

mandibule KO (NR) 2 27,8 III 1 Krg + EGT

55 AST 14/F SCC Spodnja

desna ustnica / 2 9,8 NZ 1 Krg + ECT +

EGT Pasme: X (mešanec), AST (ameriški stafordširski terrier), VT (zahodnovišavski beli terier), NB (nemški bokser), B (angleški brak), AM (aljaški

malamute), FB (francoski buldog), BP (bernski planšar), NLT (nemški lovski terier), M (mops), GDP (gladkodlaki prinašalec), MT (maltežan), D

(doberman), ŠO (šetlandski ovčar), BT (bostonski terier), JRT (Jack russel terier), ZP (zlati prinašalec), KŠ (koker španjel), SP (šarpej), IS (irski

seter), CKS (cavalir king Charles španjel), IPT (irski pšenični terier), Pu (pudelj), Kr (krvosledec); Po (pointer), RG (rodezijski grebenar), MH

(angleški mali hrt), MCT (mastocitom), P (plazmocitom), OMM (oralni maligni melanoma), FiB (fibrosarkom), EL (epiteliotropni limfom), SCC

(ploščatocelični karcinom ), K (koža), PK (podkožje), ECT (elektrokemoterapija), EGT (elektrogenska terapija), NZ (ni znano), Krg (kirurgija), Ob

+ KT (obsevanje in kemoterapija), KO (NR) (kirurška odstranitev z nečistimi robovi), CRT (citoreduktivna terapija), PH (patohistološka), bleo

(bleomicin), CDDP (cisplatin).

Pred zdravljenjem smo opravili klinični pregled, rentgensko slikanje prsnega koša, ultrazvočno

preverjanje abdomna in preiskavo krvi. Preiskava krvi je zajemala popolno krvno sliko ter biokemijske

in koagulacijske preiskave. Preiskave so bile opravljene s hematološkimi in kemičnimi sredstvi (Advia

120, Siemens, Munich, Germany; RX-Daytona, Randox, Crumlin, UK). Odvzeli smo tankoigelno biopsijo

tumorjev ali/in biopte tumorjev za citološko ali patohistološko določanje vrste in histološkega gradusa

tumorja glede na posodobljene smernice kriterijev WHO (Withrow and Vail 2007). Tumorje smo


68

izmerili v treh pravokotnih projekcijah (a, b, c) in izračunali prostornino tumorja glede na enačbo: V =

a x b x c x π/6.

2.3 Protokol zdravljenja

Elektrokemoterapija in elektrogenska terapija sta potekali pod splošno anestezijo. Anestezija je

potekala s premedikacijo z intravenozno apliakcijo midozolama (Midazolam Torrex, Torrex Pharma

GesmbH, Dunaj, Avstrija; 0,2 mg/kg). Psa smo v splošno anestezijo uvedli s propofolom (Diprivan,

Zeneca, Grangemouth, Združeno kraljestvo; 3 - 6 mg/kg) in vzdrževali z izofluranom (Isoflurin,

Vetpharma Animal Health, Barcelona, Španija), mešanim S 100 % kisikom. Med anestezijo so živali

prejemale infuzijo Hartmanove tekočine (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Nemčija), v hitrosti 5

ml/kg/h. V primeru oralnih tumorjev smo izvedli rentegensko slikanje in potrebno čiščenje zob. Poleg

tega smo pri oralnih tumorjih tudi kirurško odstranili tumor brez varnostnih robov, z namenom

zmanjšanja bremena tumorja. V primeru elektrokemoterapije smo uporabili intravenozno aplikacijo

bleomicina ali intratumoralno aplikacijo bleomicina ali cisplatina. V primeru oralnih tumorjev smo

zaradi težje manipulacije tumorjev in s tem aplikacije citostatikov izvajali intravenozno aplikacijo

bleomicina. V primeru kožnih tumorjev pa je bilo zdravilo izbora intratumoralna aplikacija cisplatina. V

primeru slabšega odziva smo pri pacientih ponovili terapijo, takrat z intratumoralno aplikacijo

bleomicina. Električne pulze smo dovedli 10 minut po intravenozni apliakciji bleomicina in takoj po

intratumoralni aplikaciji bleomicina ali cisplatina. V obeh primerih smo uporabili osem električnih

pulzov (100 μs, 1300 V/cm, 5 kHz), ki smo jih generirali z elektrogeneratorjem Cliniporator™ (IGEA s.

r. l., Carpi, Italija). Uporabili smo ploščate elektrode, z razdaljo 6 mm med elektrodami. Električne pulze

smo najprej dovedli na rob tumorja z namenom zmanjšanja krvnega pretoka v tumorju in nato

nadaljevali v koncentričnih krogih do središča tumorja. Po elektrokemoterapiji smo začeli z drugim

delom terapije – elekrogensko terapijo. Plazmid pCMVcaIL-12 smo aplicirali peritumoralno v

submukozo na dve mesti. Doza plazmidne DNA je bila 2 mg. Po aplikaciji plazmidne DNA smo na mesto

injiciranja dovedli električne pulze (24 pulzov, 60 V, 150 ms, 4 Hz) z večtočkovno elektrodo (multi-array

electrode; MEA, Iskra Medical, Podnart, Slovenia). MEA elektroda ima krožno razporeditev sedem

elektrodnih konic na razdalji 3,5 mm med vsako konico. Glede na obseg posega in tumorja so pacienti

prejeli intravenozno aplikacijo analgetika karprofen (Rimadyl, Pfizer, NY, ZDA; 4 mg/kg). Ko so si

pacienti popolnoma opomogli od anestezije so bili odpuščeni v domačo oskrbo. Pacienti z oralnimi

tumorji so prejeli oralni gel na osnovi klorheksidina (Stomodine gel, ICF, Milano, Italija).

2.4. Spremljanje učinka terapije

Pacienti so prihajali na kontrolne preglede 1 teden, 2 tedna, 4 tedne, 2 meseca, 3 mesece, 6 mesecev

in 1 leto po terapiji. Nato smo kontrolne preglede opravljali letno do konca opazovalnega časa (25.


69

februar 2018). Ob vsakem pregledu smo izmerili velikost tumorja in tumor slikali. Poleg tega smo pred

zdravljenjem in ob vsakem kontrolnem pregledu vzeli vzorce polne krvi in seruma za spremljanje krvne

slike pacienta ter za določanje različnih imunskih celičnih populacij v polni krvi in za določanje vsebnosti

IL-12 ter IFNγ v serumu. Ne nazadnje smo pred terapijo, 1 teden, 2 tedna in 1 mesec po terapiji zbrali

tudi vzorce seruma, urina, blata in brise kože na mestu aplikacije plazmida za določanje prisotnosti

plazmidne DNA. Lokalni odziv terapije smo ocenjevali z merjenjem velikosti tumorja 4 tedne po terapiji

in ob koncu opazovalnega časa kot popolni odgovor (complete response; CR), delni odgovor (partial

response; PR), stabilna bolezen (stable disease; SD) in progres bolezni (progressive disease; PD), kot je

opisano v kriterijah RECIST-a: »Response evaluation criteria in solid tumors«(Eisenhauer in sod. 2009).

Možne stranske učinke smo določali glede na lestvico toksičnosti, povzeto po »Veterinary Cooperative

Oncology Group (VCOG-CTCAE)« (Veterinary Co-operative Oncology 2004).

2.5. Določanje prisotnosti DNA v odvzetih vzorcih

Možne ostanke plazmidne DNA smo določevali v vzorcih seruma, urina, blata in brisov kože z mesta

aplikacije DNA. V primeru brisov kože smo vatenke, s katerimi smo jemali vzorce, dali čez noč v 1 mL

vode brez endotoksinov (Qiagen), ki smo jo nato uporabili kot vzorec za merjenje prisotnosti DNA. V

primeru blata smo DNA izolirali s SmartHelix™ First DNAid kit (IFB, Slovenia), po navodilih

proizvajalca. Prisotnost DNA v odvzetih vzorcih smo določali z uporabo kvantitativne verižne reakcije s

polimerazo v realnem času (qRT-PCR). Uporabili smo reakcijsko mešanico Taqman Gene Expression

Master Mix (2×) (Applied Biosystems, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) ter

reagente iz kompleta Taqman Gene Expression Assay (Applied Biosystems). Komplet, poleg dveh

začetnih oligonukleotidov, vsebuje še tretji oligonukleotid – sondo. Sonde so bile specifične za

hipoksantin-gvanin-fosforibozil-transferazo (HPRT; Mm00446968_m1) in posebno narejen zapis za

sondo, ki je označeval del plazmida pCMVcaIL-12 (AAGCTTGGTACCCCGCCACC). Temperaturni program

za qPCR je bil: aktivacija Uracil-DNA glikozilaze (50 °C, 2 min), temperaturna aktivacija DNA-polimeraze

(95 °C, 10 min), 45 ciklov denaturacije (95 °C, 15 s) in podvojevanja (60 °C, 1 min). Za vsak vzorec smo

določili pragovni cikel (cikel, v katerem krivulja preseže vrednost praga) (t. i. vrednost Ct). Podatke smo

analizirali po metodi relativne kvantifikacije ( Ct), s katero smo določili razmerje med številom kopij

oz. količino analiziranega gena v vzorcu (plazmid PCMVcaIL-12) in referenčnim genom (HPRT) ter ga

normalizirali glede na količino analiziranega gena (pCMVcaIL-12) v kontrolni skupini (kontrolna

skupina) (Livak in Schmittgen 2001).


70

2.6. Določanje vsebnosti citokinov v serumu

Vsebnosti IL-12 in IFNγ v serumu smo določali z encimsko imunskim testom ELISA proizvajalca R&D

(Canine IL-12/IL-23 p40 DuoSet ELISA; Canine IFN-gamma Quantikine ELISA, R&D Systems, Inc.,

Minneapolis, MN, ZDA). Metoda ELISA temelji na vezavi preiskovanega antigena na protitelo, ki je

predhodno vezano na ploščo. Po vezavi antigena na ploščo smo dodali detekcijska protitelesa,

specifična za antigen, na katera se nato vežejo z encimom označena protitelesa. Po spiranju plošče smo

dodali substrat, ki ob prisotnosti encima razvije barvo (iz modre v rumeno). Spremembo obarvanosti

smo zaznali kot spremembo absorbance, ki smo jo izmerili pri valovnih dolžinah 450 in 540 nm s

čitalcem mikroplošč Tecan Infinite 200. Nato smo koncentracijo IL-12 in IFNγ določili iz naklona premice

standardne krivulje ter izrazili kot pg/mL.

2.7. Izolacija perifernih mononuklearnih krvnih celic (PBMC) in določanje podvrst limfocitov s pretočnim citometrom

V vzorcih, polne krvi, smo določali prisotnost različnih podpopulacij limfocitov. Periferne

mononuklearne krvne celice (PBMC) smo izolirali s Ficolom (Ficoll-PaqueTM Plus, GE Healthcare Bio-

Sciences AB, Švedska) in Septmate centrifugirkam (STEMCELL Technologies Inc, Kanada). Dva mililitra

krvi v epruvetah EDTA smo zmešali z raztopino PBS. Nato smo razredčeno kri previdno dali v

sentrifugirke Septmate, v katere smo predhodno dali 4 mL Ficolla (GE Healthcare Bio-Sciences AB).

Vzorce smo centrifugirali 15 minut na 2000 obratov/minuto. Zgornji sloj, ki vsebuje PBMC, smo prenesli

v novo centrifugirko in dodali enako količino raztopine PBS. Vzorce smo centrifugirali 5 minut na 1200

obratov/minuto. Sedimentu, ki je vseboval PBMC, smo dodali 1 mL seruma (Serum-free freezing media,

Biological Industries, Beit HaEmek, Israel) in ga shranili v krioviale na - 80 °C. Za merjenje na pretočnem

citometru smo kroviale, ki so vsebovale PBMC, odtajali na 37 °C. Vsebino kriovial smo zmešali z 1 mL

hladnega RPMI-medija (Gipko, Life Technologies, CA, ZDA) in centrifugirali 5 minut na 3000

obratov/minuto. Sediment smo zmešali z 12 mL RPMI-medija in vzorec inkubirali v petrijevki 2 uri na

37 °C. Po dveh urah smo vsebino, ki je vsebovala PBMC, centrifugirali 5 minut na 1500 obratov/minuto.

Sediment smo uporabili za merjenje na pretočnem citometru.

Za določitev podvrste limfocitov v vzorcih smo celično suspenzijo razdelili v tri epruvete. Prvo epruveto

smo uporabili za določitev levkocitov (CD45+), drugo za določitev deleža limfocitov T (CD3+) in tretjo

za določitev deleža celic T pomagalk (CD4+), celic T ubijalk (CD8+) in celic T zaviralk

(CD4+CD25+Foxp3+). Celice smo označili s primerno količino površinskih protiteles (5 ali 10 μl).

Uporabili smo protitelesa za CD3 FITC (klon CA17.2A12), CD21 PE (klon CA2.1D6) podjetja Bio-Rad (CA,

ZDA) in CD45 eFluor® 450 (klon YKIX716.13), CD4 PE-Cy7 (klon YKIX302.9), CD8a eFluor 450 (klon

YCATE55.9) ter CD25 (klon P4A10) podjetja eBioscience (MA, ZDA). Po 20-minutni inkubaciji s


71

površinskimi protitelesi v temnem prostoru smo celice dvakrat sprali z raztopino PBS in centrifugirali 5

minut na 1500 obratov/minuto. Supernatant smo odlili in celicam dodali 300 μl fiksacijske raztopine

(Cell fix, BD Biosciences, CA, ZDA). Celice smo označili s FOXp3 APC (klon FJK-16s, eBioscience) za

določitev znotrajceličnega pasjega Foxp3. Sprva smo celicam za 90 minut dodali 1 ml fiksacijskega in

permebilizacijskega pufra (Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set Kit, eBioscience). Nato smo

celice sprali s permebilizacijskim pufrom in jim dodali 5 μl Foxp3 protitelesa. Celice smo inkubirali v

temi za 45 minut in jih nato sprali v 2 ml permebilizacijskega pufra ter centrifugirali 5 minut na 1500

obratih/minuto. Nato smo celice ponovno sprali zraztopino PBS in centrifugirali 5 minut na 1500

obratih/minuto. Nato smo celicam dodali 200 μl razstopine PBS. Vzorce smo izmerili z 10-barvnim

pretočnim citometrom FACSCanto (BD Biosciences). Izmerjene podatke smo analizirali z uporabo

programa BD FACSDiva (v.8.0.1, BD Biosciences). Podvrste limfocitov smo določevali pri 16 pacientih

(6 mastocitomov, 8 oralnih malignih melanomov in 2 plazmacitoma), v treh časovnih točkah (ob

terapiji, 4 tedne po terapiji in ob koncu opazovalnega časa).

2.8. Statistična obdelava podatkov

Za vsako preučevano skupino smo preverili, če so podatki normalno porazdeljeni (test Shapiro-Wilk),

nato pa izračunali aritmetično sredino in standardno napako. Skupine smo med seboj primerjali z

enosmerno analizo variance (One-Way ANOVA). Če so bile razlike med skupinami statistično značilno

različne, smo razlike med posameznimi skupinami primerjali s Holm-Sidakovim testom. Vrednosti p <

0,05 smo obravnavali kot statistično značilne. Za statistično obdelavo podatkov smo uporabljali

program SigmaPlot 12 (Systat Software Inc., London, Anglija). Pri izračunu srednjega časa opazovanega

obdobja smo izračunali srednjo vrednost – mediano.


72

33. Rezultati

V sklopu doktorske naloge smo klinično študijo prijavili pristojnim organom. Prijavili smo klinično

študijo na spontanih oralnih in kožnih tumorjih pri psih, ki smo jih zdravili z gensko terapijo, v

kombinaciji s kirurgijo ali elektrokemoterapijo. V klinični študiji smo uporabili plazmid, ki nosi zapis za

pasji IL-12 in ima gen za kanamicinsko rezistenco.

3.1. Protitumorski učinek in varnost terapije

Protitumorski učinek terapije smo določali z merjenjem velikosti tumorjev. Rezultati klinične študije so

pokazali izjemno uspešnost terapije v primeru kožnih tumorjev. V 84 % pacientov je prišlo do

popolnega izginotja tumorja (Slika 1).

Slika 1: Odgovor na zdravljenje 11-letne psičke, pasme zahodnovišavski beli terier, s plazmacitomom

na sprednji desni tački, 1. kliničnega stadija (A). Slike prikazujejo stanje ob terapiji (0,37 cm3, B), 1

mesec po terapiji, kjer smo zabeležili popoln odgovor (C), in dva meseca (D) ter eno leto (E) po terapiji,

kjer nismo opazili ponovne rasti tumorja.

Srednji preživitveni čas je bil 10,5 meseca (1–40). V klinični študiji smo imeli 13 psov, ki so imeli večje

število tumorjev, vendar smo zaradi etičnih razlogov zdravili vse tumorje, razen v primeru 3 pacientov.

V teh primerih smo zdravili samo tumor, na nezdravljenih oddaljenih tumorjih pa smo zabeležili

sistemski učinek (Tabela 2). Pri dveh pacientih smo spremljali lokalno bezgavko, ki je bila pozitivna na


73

prisotnost tumorskih celic, kar smo ugotovili s tankoigelno biopsijo (TIAB). V obeh primerih je prišlo do

zmanjšanja bezgavke brez prisotnosti tumorskih celic (TIAB). Pri tretjem pacientu smo zdravili le tumor

na levem boku in opazovali rast tumorja na prsnem košu. Po 4 tednih je pri zdravljenem tumorju prišlo

do popolnega izginotja tumorja, pri nezdravljenem pa do zmanjšanja velikosti iz 0,25 cm3 na 0,019 cm3

(Slika 2).

Tabela 2: Seznam pacientov, pri katerih smo opazili učinek na oddaljene nezdravljene kožne tumorje

Številka pacienta Velikost

zdravljenega

tumorja (lokacija)

Vrsta terapije Velikost

nezdravljenega

tumorja (lokacija)

Velikost

zdravljenega

tumorja 4 tedne

po terapiji

Velikost

nezdravljenega

tumorja 4 tedne

po terapiji

12 0,26 cm3 (levi bok) ECT + EGT 0,26 cm3 (prsni koš) 0 cm3 0,019 cm3

14 3,14 cm3 (dorzalno

od preksapularne

bezgavke)

ECT + EGT 41,2 cm3

(preksapularna

bezgavka)

0 cm3 18,8 cm3

22 1 cm3 (med prsti

leve noge)

Kirurška

odstranitev + EGT

0,52 cm3 (poplitealna

bezgavka)

0 cm3 0,06 cm3

Slika 2: Odgovor na zdravljenje 8-letne psičke, pasme nemški lovski terier, z mastocitomomoma na

desnem boku (A; 0,26 cm3) in prsnem košu (B; 0,26 cm3). Zdravljen je bil le prvi tumor (Slika 1B), kjer

smo 4 tedne po zdravljenju opazili popoln odgovor (Slika 1C), drugi tumor (Slika 1E) pa se je kljub temu,

da ga nismo lokalno zdravili, zmanjšal iz 0,26 cm3 na 0,019 cm3 (Slika 1F). Po 4 tednih smo na drugem

tumorju opravili elektrokemoterapijo in elektrogensko terapijo zaradi etičnih razlogov, in po 4 tednih

smo tudi pri drugem tumorju opazili popoln odgovor. Vse do konca opazovanega obdobja pri

nobenemu od teh dveh tumorjev nismo opazili ponovnega izrasta (Slika 1D, 1G).


74

Pri 5 pacientih od skupno 42 s kožnimi tumorji je prišlo do progresa bolezni (Tabela 3). V primeru

oralnih tumorjev je delež popolnih odgovorov znašal 15 %, delež delnih odgovorov je bil 8 % in delež

progresivne bolezni 77 % (Slika 3). Srednji preživitveni čas je bil 5 mesecev (2–22). V klinično študijo so

bili vključeni pacienti z izredno heterogenimi lastnostmi, ki jih nismo uspeli povezati s končnim

odgovorom na zdravljenje in zato pacientov nismo razdelili v posebne skupine, kot npr. glede na

starost, klinični stadij ali velikost tumorja. Poleg učinkovitosti smo preverjali tudi varnost terapije.

Zaznali nismo nobenih znakov toksičnosti terapije, ki smo jih opazovali po klasičnih kriterijih klinične

toksičnosti VCOG-CTCAE. Monitoring razgradnje plazmida na koži pacientov smo izvedli na odvzetih

brisih, vzorcih blata, urina in krvi z metodo qRT-PCR. V vzorcih krvi, blata in urina ni bilo zaznati

prisotnosti plazmida. Plazmidna DNA je bila prisotna v nekaterih brisih kože - maksimalna vrednost je

bila izmerjena takoj po terapiji (100 ng/mL), vendar je v roku 4 tednov padla na ničelno vrednost.

Tabela 3: Seznam pacientov, pri katerih je prišlo do progresa bolezni

ŠT.

PACIENTA

VRSTA

TUMORJA

PASMA STAROST

PSA

VRSTA

TERAPIJE

ŠTEVILO

TERAPIJ

KLINIČNI

STADIJ

BOLEZNI

VELIKOST

TUMORJA

(CM3) OB

TERAPIJI

VELIKOST

TUMORJA

(CM3) OB

EVTANAZIJI

VZROK

EVTANAZIJE

ČAS

PREŽIVETJA

(MESECI)

KOŽN

I TUM

ORJ

I

5 MCT VT 6 ECT +

EGT

2 1 1,15 20,4 Povečanje

tumorske

mase

5

18 MCT X 8 ECT +

EGT

1 1 22,4 4,6 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

7

30 MCT D 8 EGT 1 4 280,8 125,6 Evtanazija na

željo lastnika

1

31 MCT M 9 ECT +

EGT

1 3 1,31 0 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

(letargija)

2

41 P MH 9 ECT +

EGT

1 2 12,1 12,1 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

(nevrološki

znaki)

1

43 OMM SP 9 CRT +

ECT +

EGT

2 2 8,35 0,52 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

(pljučni

zasevki)

3


75

Legenda:

Pasme: X (mešanec), AST (ameriški stafordširski terrier), VT (zahodnovišavski beli terier), NB (nemški bokser), B (angleški brak), AM (aljaški

malamute), FB (francoski buldog), BP (bernski planšar), NLT (nemški lovski terier), M (mops), GDP (gladkodlaki prinašalec), MT (maltežan), D

(doberman), ŠO (šetlandski ovčar), BT (bostonski terier), JRT (Jack Russel terier), ZP (zlati prinašalec), KŠ (koker španjel), SP (šarpej), IS (irski

seter), CKS (cavalir king Charles španjel), IPT (irski pšenični terier), Pu (pudelj), Kr (krvosledec); Po (pointer), RG (rodezijski grebenar), MH

(angleški mali hrt), MCT (mastocitom), P (plazmocitom), OMM (oralni maligni melanoma), FiB (fibrosarkom), EL (epiteliotropni limfom), SCC

(ploščatocelični karcinom), K (koža), PK (podkožje), ECT (elektrokemoterapija), EGT (elektrogenska terapija), NZ (ni znano), Krg (kirurgija), Ob

44 OMM ZP 10 CRT +

ECT +

EGT

2 3 40,1 14,13 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

(nevrološki

znaki)

5 O

RALN

I TUM

ORJ

I

45 OMM IPT 13 CRT +

ECT +

EGT

4 3 15,7 0 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

(pljučni

zasevki)

9

47 OMM NLT 15 ECT +

EGT

5 2 12,56 3,14 Evtanazija na

željo lastnika

5

48 OMM IS 9 CRT +

ECT +

EGT

3 2 14,13 4,19 Evtanazija na

željo lastnika

3

49 OMM CKS 10 ECT +

EGT

1 3 1,31;

0,89

0 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

(bruhanje,

driska)

12

50 OMM Pu 11 ECT +

EGT

2 1 0,79 9,4 Povečanje

tumorske

mase

2

51 OMM Kr 12 Krg +

EGT

3 1 0 0 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

(pljučni

zasevki)

22

53 FiB RG 8 Krg +

ECT +

EGT

3 4 9,16 NZ Oteženo

dihanje zaradi

širjenja

tumorske

mase v nosno

votlino

3

54 FiB VT 6 Krg +

EGT

2 5 27,8 4,1 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

5

55 SCC AST 14 Krg +

ECT +

EGT

2 2 9,8 0 Sistemsko

poslabšanje

stanja živali

3


76

+ KT (obsevanje in kemoterapija), KO (NR) (kirurška odstranitev z nečistimi robovi), CRT (citoreduktivna terapija), PH (patohistološka), NZ (ni

znano).

Slika 3: Odgovor na zdravljenje 13-letnega psa, pasme irski mehkodlaki pšenični terier, z oralnim

malignim melanomom 3. kliničnega stadija (15,7 cm3; A). Pacient je imel številne pljučne zasevke 7

mesecev po terapiji in je bil evtanaziran 10 mesecev po prihodu na kliniko zaradi težav, nepovezanih s

tumorjem. Slike in rentgenski posnetki, ki so prikazani, so bili opravljeni ob prvem zdravljenju (teden

0; B, C), ob drugem zdravljenju (teden 2; D, E), ob četrtem zdravljenju (teden 8; F, G) in 9 mesecev po

prvem zdravljenju (H, I). Na rentgenskih posnetkih je s puščico označena osteoliza mandubile (C in E),

kjer je v času zdravljenja prišlo do regeneracije kostnine (G in I).

3.2. Merjenje sistemskega imunskega odgovora

V okviru klinične študije smo psom odvzeli serum pred terapijo in ob kontrolnih pregledih za določanje

vsebnosti serumskih proteinov IL-12 in IFNγ. Koncentracije IL-12 in IFNγ smo izmerili le pri 22 od 55

pacientov, ker v času merjenja nismo opazili povezave med odgovorom tumorja in serumske količine

IL-12 ali IFNγ (Tabela). Povišanje IL-12 ali IFNγ smo v tabeli označili z oznako O (odziven), kjer ni prišlo

do povišanja pa z NO (neodziven). Do povišanja IL-12 je prišlo pri 10 pacientih, do povišanja IFNγ pa pri

12 pacientih (Tabela 4).

Tabela 4 : Vrednosti serumske količine IL-12 in IFNγ ter odgovor na terapijo pri 22 pacientih

Št. pacienta

IL-12 (pg/mL) IFNγ (pg/mL) Odgovor na terapijo ob

koncu opazovanega

obdobja

Ob terapiji 1 teden po terapiji

4 tedne po terapiji

O/NO Ob terapiji

1 teden po terapiji

4 tedne po terapiji

O/NO

KOŽN

I TUM

ORJ

I

1 532.3 795.1 671.3 O 0 0 0 NO CR 2 117.7 376.4 319.4 O 349.1 349.1 0 NO CR

3 220.9 235.4 219.6 O 0 0 0 NO CR 7 199.6 351.7 366.8 O 0 249.6 208.7 O CR 9 154.2 164.5 189.3 NO 0 0 0 NO CR

12 174.1 298.0 421.7 O 863.8 325.7 1671.4 NO CR 14 1378.2 1034.9 1034.9 NO 0 0 0 NO CR

15 287.3 357.5 364.4 O 0 85.9 0 O CR

16 427.7 337.6 187.6 NO 0 863.8 50.7 O CR


77

19 315.0 275.5 265.3 NO 0 220.4 249.6 O CR 22 1866.4 1875.3 1728.1 NO 0 243.8 202.8 O CR 27 426.1 467.1 513.8 O 208.7 916.6 144.7 O CR 38 277.7 399.5 370.6 O 0 39.0 0 O CR

39 611.7 493.3 519.7 NO 273.0 1127.2 559.7 O CR 40 662.9 562.0 377.9 NO 0 0 0 NO CR

ORA

LNI

TUM

ORJI

45 876.3 876.3 909.9 NO 0 50.2 0 O PD 47 407.1 497.7 410.0 O 0 0 0 NO PD 48 122.1 187.8 184.9 O 220.4 138.5 249.6 NO PD 50 506.5 430.5 382.3 NO 0 98.6 0 O PD 51 1819.1 1525.3 1401.1 NO 0 0 0 NO PD 52 561.7 536.1 438.4 NO 0 770.3 0 O CR 54 726.0 726.0 778.6 NO 0 875.6 261.3 O PD

Legenda: O (odziven), NO (neodziven), CR (popoln odgovor), PR (delni odgovor), PD (progresivna bolezen).

Poleg sistemske količine serumskih proteinov smo merili tudi različne podvrste limfocitov s pretočnim

citometrom. Vrednosti med posamezniki so se zelo razlikovale že v začetnem vzorcu (ob terapiji), tako

da danih vrednosti nismo normalizirali, saj nismo opazili nobene korelacije z odgovorom tumorjev.

Glede na potek terapije nismo opazili nobenih razlik v primeru celic T ubijalk (CD8+) in celic T pomagalk

(CD4+) (Tabela 5). Razliko smo opazili v primeru celic T zaviralk (Foxp3+). Pri vseh merjenih 16 pacientih

(Slika 4) smo zaznali zmanjšanje celic T zaviralk ob koncu opazovalnega časa glede na čas, ko je bila

opravljena terapija. V primeru plazmacitoma je bila mediana deleža celic T zaviralk ob terapiji 0,7 %, 4

tedne po terapiji 0,55 % in ob koncu opazovalnega časa 0,25 %. Razlike niso bile statistično značilne. V

primeru oralnega malignega melanoma je bila mediana deleža celic T zaviralk ob terapiji 1,2 %, 4 tedne

po terapiji 1,0 % in ob koncu opazovalnega časa 0,3 %. Zmanjšanje celic T zaviralk ob koncu

opazovanega obdobja je bilo statistično značilno nižje kot ob terapiji. Prav tako kot v primeru oralnega

melanoma je tudi v primeru mastocitoma prišlo do statistično značilnega zmanjšanja deleža celic

zaviralk ob koncu opazovanega obdobja glede na čas terapije. V času terapije je bil delež celic T zaviralk

1,5 %, 4 tedne po terapiji 1,4 % in ob koncu opazovanega obdobja 0,35 %. Čeprav smo pri vseh merjenih

pacientih zaznali zmanjšanje celic T zaviralk, nismo opazili povezave s potekom zdravljenja, saj je tudi

v primeru zmanjšanja celic T zaviralk pri nekaterih pacientih prišlo do progresa bolezni (Tabela 5).

Tabela 5: Deleži limfocitov T in podtipov limfocitov (celic T pomagalk, T ubijalk in T zaviralk)

ŠT.

PACIENTA

ČAS

ODVZEMA

% LIMFOCITOV

T (CD45+CD3+)

% CELIC T

POMAGALK

(CD3+CD4+)

% CELIC T

UBIJALK

(CD3+CD8+)

% CELIC T ZAVIRALK

(CD3+CD4+FOXP3+)

ODGOVOR

NA

TERAPIJO

KOŽN

I TUM

ORJ

I

2 T 37.6 65.7 14.0 1.4 CR

4 tedne po

T

62.4 63.9 15.8 1.3

KOO 52.1 56.5 22.6 0.4

7 T 61.1 22.1 54.9 1.3 CR

4 tedne po

T

51.8 30.4 44.0 0.8

KOO 59.4 29.6 39.3 0.4


78

9 T 68.9 45.1 24.3 0.8 CR

4 tedne po

T

78.8 35.2 33.1 0.3

KOO 83.3 45.3 25.7 0.3

12 T 86.1 43.9 43.5 2.7 CR

4 tedne po

T

73.8 51.3 31.0 2.0

KOO 72.1 55.7 27.8 0.3

19 T 42.5 61.4 16.0 1.6 CR

4 tedne po

T

78.2 47.6 23.8 1.5

KOŽN

I TUM

ORJ

I

KOO 58.1 52.0 27.3 0.9

29 T 59.3 41.2 28.4 4.0 CR

4 tedne po

T

89 44.8 17.6 1.8

KOO 66.7 55.9 12.7 0.3

39 T 46.4 48.7 24.0 0.7 CR

4 tedne po

T

62.0 40.0 32.0 0.4

KOO 61.9 40.9 37.0 0.2

40 T 83.0 27.7 23.9 0.7 CR

4 tedne po

T

66.0 38.8 30.2 0.7

KOO 59.3 35.7 24.0 0.3

ORA

LNI T

UMO

RJI

43 T 51.6 36.2 18.2 0.4 PD

4 tedne po

T

70.1 43.9 27.9 0.5

KOO 72.6 42.9 16.5 0.3

44 T 78.6 50.2 17.7 1.1 PD

4 tedne po

T

76.4 46.5 31.1 1.2

KOO 77.4 59.9 16.6 0.3

45 T 89.8 54.1 45.2 2.4 PD

4 tedne po

T

81.4 48.6 40.4 1.9

KOO 81.2 59.0 25.9 0.3

46 T 86.3 36.8 34.1 2.9 CR

4 tedne po

T

81.4 45.4 26.2 0.8

KOO 77.1 43.5 24.9 0.5

47 T 45.2 36.7 46.3 4.4 PD


79

4 tedne po

T

36.7 26.2 23.0 2.8

KOO 68.3 34.1 40.8 0.6

49 T 40.5 39.7 22.8 1.1 PD

4 tedne po

T

86.0 40.2 39.3 2.2

KOO 70.2 35.4 42.0 0.8

50 T 63.0 71.8 11.7 1.3 PD

4 tedne po

T

60.1 63.0 17.2 0.5

KOO 54.7 54.5 8.4 0.3

51 T 79.5 35.3 11.8 1.1 PD

4 tedne po

T

77.7 45.0 16.3 0.7

KOO 88.0 39.3 12.2 0.2

Legenda: T (terapija), KOO (konec opazovanega obdobja).

Slika 4: Prikaz deležev celic T zaviralk glede na čas terapije. V primeru mastocitoma in oralnega

malignega melanoma je ob koncu opazovalnega časa delež celic T zaviralk statistično značilno nižji kot

ob času terapije (*p < 0,05)


80

44. Razprava

Objavljenih je bilo že več študij, kjer so dokazali dober uspeh elektrogenske terapije z IL-12, same ali v

kombinaciji z drugimi zdravljenji pri številnih tipih tumorjev (Cemazar in sod. 2016; Cicchelero in sod.

2016; Cutrera in sod. 2015a; Pavlin in sod. 2011). V omenjenih kliničnih študijah so uporabili plazmid,

ki nosi zapis za humani ali mačji IL-12 in ima gen za odpornost proti ampicilinu. V okviru doktorske

naloge smo pripravili novi plazmid, ki nosi zapis za pasji IL-12 in gen za odpornost proti kanamicinu. Ta

plazmid smo uporabili v klinični študiji, kjer smo s kombinacijo elektrokemoterapije in genske terapije

z IL-12 zdravili spontane kožne in oralne tumorje pri psih. Rezultati klinične študije so pokazali izjemno

uspešnost terapije v primeru kožnih tumorjev, kjer smo dosegli 84 % popolnih odgovorov. V prejšnji

klinični študiji, ki je potekala prav tako na kožnih tumorjih s plazmidom, ki nosi zapis za humani IL-12,

smo dosegli popoln odgovor v 72 % (Cemazar in sod. 2016). Večjo uspešnost novejše študije bi lahko

pripisali večji specifičnosti plazmidne DNA, zaradi transgena za pasji IL-12. Slabšo uspešnost smo imeli

pri oralnih tumorjih, kjer smo dosegli srednji preživetveni čas, primerljiv s tistim po kirurški odstranitvi;

5 do 17 mesecev (Withrow in Vail 2007), vendar je v primeru obsežne kirurške operacije, ki večinoma

zajema odstranitev dela ali cele čeljusti, kakovost življenja vprašljiva. V naši klinični študiji smo opazili

tudi protitumorski učinek na oddaljene nezdravljene tumorje, kar nakazuje na uspešen imunsko

posredovani učinek genske terapije z IL-12 (Sersa in sod. 2015). Z namenom spremljanja sistemskega

imunskega odziva po zdravljenju z gensko terapijo smo merili vsebnost IL-12 in IFNγ v serumu. Tako v

naši klinični študiji, kot tudi v predhodni (Cemazar in sod. 2016), smo pokazali, da med zvišanjem

sistemskega IL-12 in IFNγ in odgovorom na terapijo ni medsebojne odvisnosti ter tako ne moremo

sistemske vsebnosti teh citokinov uporabljati kot napovedni dejavnik terapije. Poleg citokinov smo v

krvi merili tudi prisotnost imunskih celic in spremembe v količini po genski terapiji z IL-12. Razlike smo

opazili v primeru celic T zaviralk. Vloga celic T zaviralk pri raku temelji na zaviranju celic T ubijalk, ki

imajo poglavitno vlogo v uničenju tumorskih celic (Chaudhary in Elkord 2016). Povezava med povišano

vrednostjo celic T ubijalk v periferni krvi in napredovanjem raka je bila potrjena tudi pri psih, kjer so

preiskovali več vrst raka, kot so karcinomi, sarkomi, limfomi in mastocitomi (O’Neill in sod. 2009). V

naši študiji smo ugotovili, da se po terapiji vsebnost celic T zaviralk zmanjša pri vseh preiskovanih

pacientih. V primeru mastocitoma in oralnega malignega melanoma je ta razlika statistično značilna.

Ta rezultat sovpada z rezultati, ki so jih pridobile druge raziskovalne skupine, kjer so opazili zmanjšanje

celic T zaviralk po terapiji z IL-12 (Zhao, Zhao in Perlman 2012). Zmanjšanje celic T zaviralk smo opazili

tako pri pacientih, kjer je prišlo do zmanjšanja velikosti tumorja, kot tudi pri pacientih, kjer je prišlo do

napredovanja bolezni, zato količina celic T zaviralk v krvi ne more služiti kot napovedni dejavnik. Vendar

pa terapija z IL-12 deluje zaviralno na prisotnost celic T zaviralk v periferni krvi, kar smo dokazali v tej


81

klinični študiji. Eden izmed razlogov, zakaj je prišlo do progresa bolezni kljub zmanjšanju celic T zaviralk,

je, da so tumorske celice ubrale drugo pot imunosupresije.

55. Zaključek

Rezultati klinične študije so prikazali odličen uspeh terapije s plazmidom, ki nosi zapis za pasji IL-12, na

kožnih in oralnih tumorjih pri psih, kar odpira vrata za nadaljnje študije ter prenos metode v humano

kliniko. Poleg tega izboljšave plazmidov, prikazane v tem doktoratu, predstavljajo možnost za bolj

nadzorovane in varne terapije v nadaljnjih kliničnih študijah na psih.


82

PREGLED IN SKLEPNE MISLI

PPriprava in ovrednotenje plazmidov, ki nosijo zapis za pasji IL-12

Elektrokemoterapija se že uporablja kot standardna terapija za lokalno zdravljenje tumorjev pri psih,

mačkah in konjih (Kodre in sod. 2009; Tamzali in sod. 2012; Tozon in sod. 2014). Za zdravljenje

oddaljenih zasevkov je treba doseči učinek na sistemskem nivoju, ki ga lahko dosežemo v kombinaciji

z uporabo genske terapije z IL-12 (Sersa in sod. 2015). Elektrogenska terapija s plazmidom, ki nosi zapis

za humani ali mačji IL-12, v kombinaciji z elektrokemoterapijo, se je izkazala kot varna ter učinkovita

terapija za zdravljenje pasjih tumorjev (Cemazar in sod. 2016; Cutrera in sod. 2008; Reed in sod. 2010).

Za bolj specifično terapijo je potrebna priprava plazmidov, ki nosijo zapis za pasji IL-12 v izogib

alergičnih reakcij zaradi nepopolne homologije IL-12 ter priprava plazmidov, brez gena za antibiotično

rezistenco za bolj varne terapije.

V prvem sklopu doktorske naloge smo se osredotočili na pripravo novih plazmidov in ovrednotenje teh

v in vitro ter in vivo pogojih. Poleg tega smo opazovali vpliv genske terapije z novimi plazmidi na imunski

odziv na modelih pasjega in mišjega melanoma na miših.

Zaradi boljše vrstne specifičnosti plazmida smo pripravili novi plazmid s pasjim IL-12 (pCMVcaIL12),

pridobljenim iz plazmida pcDNA 3.1.ZeosccaIL12 (Dos Santos in sod. 2004). Plazmid ima gen za

kanamicinsko rezistenco, ki je bolj sprejemljiv za agenciji EMA in FDA (EMA 2011; Hubbard 1996), kot

doslej uporabljeni gen za ampicilin. Nadalje smo novi plazmid pCMVcaIL12 in doslej uporabljeni

plazmid v naših kliničnih študijah na psih s humanim IL-12 pORFhIL-12 primerjali v in vitro pogojih.

Rezultati so pokazali, da med plazmidoma ni statistično značilnih razlik v preživetju celic in na nivoju

izražanja mRNA 2. dan po genskem elektroprenosu po dveh melanomskih celičnih linijah (humane

SkMel-28 in pasje CMeC-1). Nasprotno je na ravni proteinov test ELISpot pokazal statistično značilno

višjo količino IL-12 v primeru plazmida pCMVcaIL12 na obeh celičnih linijah. V in vivo pogojih so

rezultati pokazali enak terapevtski učinek na zaostanek rasti tumorja in ponovljivo terapijo po genskem

elektroprenosu obeh plazmidov (Lampreht Tratar in sod. 2016). Tako smo prikazali, da je novi plazmid

enako učinkovit in primeren za nadaljnjo uporabo v kliniki (Lampreht et al. 2015). Plazmid, ki nosi zapis

za pasji IL-12 z genom za kanamicinsko rezistenco, smo v nadaljevanju uporabili v klinični študiji, ki je

opisana v drugem sklopu.

Ena izmed glavnih ovir za uveljavljanje genske terapije v veterinarski in humani kliniki je uporaba

plazmidov z genom za antibiotično rezistenco (Vandermeulen in sod. 2011). Za to, da bi gensko terapijo

naredili bolj varno, je treba pripraviti plazmide brez gena za antibiotično rezistenco. S tem bi zmanjšali

tveganje za horizontalen genski prenos na okoljske in komenzalne bakterije ter tveganje za nastanek


83

alergijskih reakcij na ostanke antibiotika, uporabljenega v proizvodnji plazmidne DNA. V doktorski

nalogi smo pripravili plazmida s konstitutivnim in tkivno specifičnim promotorjem, brez gena za

antibiotično rezistenco. Rezultati so pokazali, da odstranitev gena za antibiotično rezistenco ne vpliva

na citotoksičnost in na višino izražanja IL-12 mRNA po genskem elektroprenosu na pasjih celičnih

linijah, kar sovpada z rezultati, pridobljenimi na mišjih celičnih linijah (Kamensek in sod. 2017).

Poleg vrstne specifičnosti, glede na uporabljen transgen, lahko pripravimo plazmide, ki so tkivno

specifični. Uporaba tkivno specifičnega promotorja se je izkazala za varen in nadzorovan način izražanja

transgena v tarčnih tkivih v primerjavi s konstitutivnimi promotorji (Kos in sod. 2015), ki so sicer

močnejši in imajo višje izražanje transgena po genskem elektroprenosu (Kamensek in sod. 2017). Tako

uporaba različnih promotorjev predstavlja pomembno orodje v nadzoru genskega prenosa, ker lahko

zagotovi specifično izražanje gena v tarčnih tkivih in nadzoruje razporeditev transgena (Kos in sod.

2015; Tesic in sod. 2015). V doktorski nalogi smo pripravili plazmida s konstitutivnim in tkivno

specifičnim promotorjem brez gena za antibiotično rezistenco. Rezultati so pokazali, da imata oba

plazmida, z različnimi promotorji, enako dober lokalni protitumorski učinek na pasjem melanomu.

Nadalje smo v doktorski nalogi preučevali imunski odziv po genskem elektroprenosu plazmidov, ki

nosijo zapis za pasji IL-12. Znano je že, da genski elektroprenos IL-12 povzroči infiltracijo različnih

imunskih celic, kot so makrofagi, dendritične celice in limfociti T v mišice (Chiarella in sod. 2008; Tevz

in sod. 2009). Poleg tega povzroči genski elektroprenos IL-12 močno infiltracijo imunskih celic v

tumorsko tkivo, kot so CD4+ in CD8+ limfociti T (Kishida in sod. 2003). V doktorski nalogi smo preučevali

imunski odziv po genskem elektroprenosu plazmidov brez gena za anibiotično rezistenco, ki nosijo

zapis za mišji IL-12 na tumorskih modelih mišjega melanoma, ter plazmidov, ki nosijo zapis za pasji IL-

12 na tumorskih modelih pasjega melanoma na imunsko oslabljenih miših. Rezultati na mišjem

melanomu so pokazali močan sistemski in lokalni imunski odziv od 1. do 4. dne po terapiji. Poleg tega

so rezultati pokazali polarizacijo makrofagov v korist protitumorskega Th1 odziva in povečano

koncentracijo specializiranih antigen predstavitvenih celic (Lampreht Tratar in sod. 2017). V primeru

tumorjev pasjega melanoma so rezultati pokazali povišano koncentracijo infiltracije imunskih celic

(grancim B pozitivnih celic) 2. dan po terapiji, ki so v primeru imunsko oslabljenih miši, ki nimajo celic

T ubijalk, celice NK. Poleg tega smo primerjali vpliv različnega promotorja na imunski odziv. Rezultati

so pokazali, da smo v primeru konstitutivnega promotorja uspeli doseči tako lokalni kot sistemski

učinek, kar se je pokazalo z visoko infiltracijo celic NK v tumorskem tkivu ter v vranici in s povišano

vsebnostjo IL-12 v serumu miši. V primeru tkivno specifičnega pa smo zaznali le visoko infiltracijo celic

NK v tumorskem tkivu, brez visokega pozitivnega obarvanja v vranici ter zaznavne vsebnosti IL-12 v krvi

miši (Lampreht Tratar in sod. 2018). Ne nazadnje smo v tej študiji dokazali tudi statistično značilno

zmanjšano število žil v tumorju po genskem elektroprenosu, kar se ujema z rezultati iz prejšnje klinične


84

študije na psih, kjer smo zdravili pse z elektrogensko terapijo s plazmidom, ki nosi zapis za humani IL-

12. V tej študiji smo ugotovili statistično značilno zmanjšanje tumorskih žil 1 mesec in 3 mesece po

terapiji (Salvadori in sod. 2017).

Prvi sklop doktorske naloge smo zaključili z uspešno pripravo in ovrednotenjem treh novih plazmidov.

Plazmid iz prvega dela prvega sklopa s konstitutivnim promotorjem in genom za antibiotično rezistenco

(pCMVcaIL12) smo zaradi omejenega časa doktorske naloge uporabili v drugem sklopu, v klinični

študiji, ki je potekala vzporedno s prvim sklopom.

KKlinična študija na spontanih pasjih in oralnih tumorjih pri psih

Zdravljenje spontanih tumorjev pri psih z gensko terapijo IL-12, samo ali v kombinaciji s kirurgijo ali

elektrokremoterapijo, kaže dobre rezultate pri številnih tipih tumorjev, kot so mastocitom (Pavlin in

sod. 2011; Čemažar in sod. 2016), oralni melanom (Cutrera in sod. 2015a) in oralni fibrosarkom

(Cicchelero in sod. 2016). V vseh omenjenih študijah so uporabili plazmid, ki nosi zapis za humani ali

mačji IL-12. Humani in mačji IL-12 sta pasjemu homologna le v 86 in 82 %, kar lahko privede do

neželenih alergijskih reakcij in manjše učinkovitosti delovanja na imunski sistem (Buttner in sod. 1998).

Poleg tega so plazmidi v omenjenih študijah večinoma nosili gen za ampicilinsko rezistenco. Zaradi

pogoste uporabe ampicilina v kliniki (Solensky 2003) je uporaba plazmida z genom za ampicilinsko

rezistenco v kliničnih študijah za agenciji EMA in FDA nesprejemljiva. Dopuščajo pa uporabo plazmidov

z genom za kanamicinsko rezistenco (EMA 2011; Hubbard 1996).

V sklopu doktorske naloge smo klinično študijo prijavili pristojnim organom. Prijavili smo klinično

študijo na spontanih oralnih in kožnih tumorjih pri psih, ki smo jih zdravili z gensko terapijo, v

kombinaciji s kirurgijo ali elektrokemoterapijo. V klinični študiji smo uporabili plazmid, ki nosi zapis za

pasji IL-12 in ima gen za kanamicinsko rezistenco. Rezultati klinične študije so pokazali izjemno

uspešnost terapije v primeru kožnih tumorjev, ki je pokazala 84 % popolnih odgovorov. Srednji

preživetveni čas je 10,5 meseca (1–40). Trinajst pacientov je imelo več kot 1 tumor, vendar smo pri

večini zaradi etičnih razlogov zdravili vse novotvorbe. V 3 primerih pa smo zdravili samo 1 tumor in

ugotovili, da ima terapija sistemski učinek na oddaljene nezdravljene tumorje. V primeru oralnih

tumorjev je delež popolnih odgovorov znašal 15 %, delež progresivne bolezni pa 77 %. Srednji

preživetveni čas je 5 mesecev (2–22).

Uporaba elektrokemoterapije za lokalno zdravljenje tumorjev pri psih se je že izkazala kot varna in

učinkovita terapija, primerljiva s standardno kirurško terapijo (Kodre in sod. 2009). Prav tako je

kombinirana terapija elektrokemoterapije z gensko terapijo s plazmidom za humani IL-12 pokazala

odličen terapevtski učinek na mastocitomih, kjer smo dosegli 72 % popolni odgovor pri 18 pacientih


85

(Cemazar in sod. 2016). V trenutni klinični študiji je odstotek popolne ozdravitve kožnih tumorjev višji,

kar bi lahko pripisali večji specifičnosti pasjega IL-12 plazmidne DNA. V primeru oralnih tumorjev smo

dosegli srednji preživetveni čas, primerljiv s tistim po kirurški odstranitvi; 5–17 mesecev (Withrow in

Vail 2007), vendar je v primeru obsežne kirurške operacije, ki večinoma zajema odstranitev dela ali cele

čeljusti, kakovost življenja vprašljiva. Poleg tega v klinični študiji nismo opazili povezave med

serumskimi vsebnostmi IL-12 in IFNɣ ter končnim odgovorom, kot smo to opazili tudi v primeru

genskega elektroprenosa IL-12 pri miših (Lampreht Tratar in sod. 2017, 2018; Tevz in sod. 2009). Ne

nazadnje smo v klinični študiji tudi ugotovili, da se količina celic T zaviralk zmanjša po elektrogenski

terapiji z IL-12, ki je bila v primeru mastocitoma in oralnega malignega melanoma tudi statistično

značilno nižja glede na čas ob terapiji. Čeprav je rezultat sovpadal z ostalimi študijami, kjer so opazili

visok delež celic T zaviralk pri psih s tumorji (O’Neill in sod. 2009), ki padejo po terapiji z IL-12 (Zhao,

Zhao in Perlman 2012), nismo opazili povezave med padcem celic T zaviralk in boljšim odgovorom na

zdravljenje, saj je tudi v primeru napredovanja bolezni padel delež celic. Tako lahko trdimo, da vsebnost

IL-12 ali IFNɣ ter količina celic T zaviralk v krvi ne morejo biti napovedni dejavnik. Kljub temu smo v naši

študiji dokazali, da terapija z IL-12 zmanjša delež celic T zaviralk v periferni krvi, ki jih povezujejo s slabo

prognozo.

Rezultati klinične študije so prikazali odličen uspeh terapije s plazmidom, ki nosi zapis za pasji IL-12, na

kožnih in oralnih tumorjih pri psih, kar odpira vrata za nadaljnje študije ter prenos metode v humano

kliniko. Poleg tega izboljšave plazmidov, prikazane v tem doktoratu, predstavljajo možnost za bolj

nadzorovane in varne terapije v nadaljnjih kliničnih študijah na psih.

DDoprinos k znanosti in vpogled v prihodnje študije

S pripravo novega plazmida in ovrednotenjem njegovega učinka v in vitro in in vivo pogojih ter z

uporabo novega plazmida v klinični študiji za zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psih smo potrdili

vse tri hipoteze, predstavljene v uvodnem delu. Novost doktorske naloge so plazmidi, ki nosijo zapis

za pasji IL-12. Dokazali smo, da so ti plazmidi sposobni povišati infiltracijo imunskih celic v inducirane

tumorje in vranico na imunsko oslabljenih miših. Poleg tega se je zdravljenje spontanih tumorjev pri

psih z novim plazmidom, ki nosi zapis za pasji IL-12 in ima gen za odpornost proti kanamicinu, izkazalo

za bolj učinkovito kot s plazmidom, ki nosi zapis za humani IL-12 in gen za odpornost proti ampicilinu,

ki smo ga uporabili v prejšnji klinični študiji. Poleg tega smo razvili tudi druga dva plazmida, ki nosita

zapis za pasji IL-12, ki sta pod konstitutivnim ali tkivno specifičnim promotorjem ter brez gena za

odpornost proti antibiotiku. Z uporabo teh dveh plazmidov v nadaljnjih kliničnih študijah lahko

dosežemo bolj nadzorovano delovanje, predvsem pa varnejšo uporabo genske terapije zaradi

odsotnosti gena za odpornost proti antibiotikom. Ne nazadnje je v nadaljnjih kliničnih študijah ključno


86

iskanje novih biomarkerjev in napovednih dejavnikov, s katerimi bi lahko spremljali potek zdravljenja

in določali pogostost ter število ponovitev terapij.

ZAKLJUČKI Najpomembnejše sklepe doktorskega dela lahko strnemo v naslednje:

Novi plazmid, ki nosi zapis za pasji IL-12 pod konstitutivnim promotorjem in ima gen za

odpornost proti kanamicinu, ima podobno ali višjo zmožnost izražanja IL-12 v in vitro pogojih

ter primerljivo terapevtsko učinkovitost v in vivo pogojih kot plazmid, ki nosi zapis za humani

IL-12.

Odstranitev gena za odpornost proti antibiotiku ne vpliva na citotoksičnost plazmida v in vitro

pogojih niti na terapevtsko učinkovitost v in vivo pogojih.

Po genskem elektroprenosu plazmida, ki nosi zapis za IL-12, povzročimo povišano infiltracijo

citotoksičnih imunskih celic in antigen predstavitvenih celic v tumorje.

Z izbiro različnih promotorjev: konstitutivnega ali tkivno specifičnega, lahko vplivamo na to, ali

je terapija lokalna ali sistemska.

Elektrogenska terapija s plazmidom, ki nosi zapis za pasji IL-12 in ima gen za odpornost proti

kanamicinu, je varna in učinkovita za zdravljenje spontanih kožnih ter oralnih tumorjev pri psih.


87

SKUPNI SEZNAM CITIRANE LITERATURE

Achyut B.R. and Arbab A.S. (2016). Myeloid cell signatures in tumor microenvironment

predicts therapeutic response in cancer. OncoTargets Ther 9: 1047–1055.

Adams, V. J., Evans, K. M., Sampson, J., and Wood, J. L. N. (2010). Methods and mortality

results of a health survey of purebred dogs in the UK. J. Small Anim. Pract. 51, 512–524.

Atkins, MB, Robertson, MJ, Gordon, M, Lotze, MT, DeCoste, M, DuBois, JS, Ritz, J, Sandler,

AB, Edington, HD, Garzone, PD, Mier, JW, Canning, CM, Battiato, L, Tahara, H, Sherman,

ML (1997). Phase I evaluation of intravenous recombinant human interleukin 12 in patients

with advanced malignancies. Clin Cancer Res 3:409-17

Bloquel, C, Fabre, E, Bureau, MF, Scherman, D (2004). Plasmid DNA electrotransfer for

intracellular and secreted proteins expression: new methodological developments and

applications. J Gene Med 6 Suppl 1:S11-23,

Bosnjak, M, Lorente, BC, Pogacar, Z, Makovsek, V, Cemazar, M (2014). Different incubation

times of cells after gene electrotransfer in fetal bovine serum affect cell viability, but not

transfection efficiency. J Membr Biol 247:421-8,

Bosnjak M, Prosen L, Dolinsek T et al. (2013). Biological properties of melanoma and

endothelial cells after plasmid AMEP gene electrotransfer depend on integrin quantity on cells.

J Membr Biol. 246(11): 803-819,

Buttner, M., Belke-Louis, G., Rziha, H. J., McInnes, C., and Kaaden, O. R. (1998). Detection,

cDNA cloning and sequencing of canine interleukin 12. Cytokine 10, 241–248.

Cemazar, M., Ambrozic Avgustin, J., Pavlin, D., Sersa, G., Poli, A., Krhac Levacic, A., et al.

(2016). Efficacy and safety of electrochemotherapy combined with peritumoral IL-12 gene

electrotransfer of canine mast cell tumours. Vet Comp Oncol.

Cemazar, M., Jarm, T., and Sersa, G. (2010). Cancer electrogene therapy with interleukin-12.

Curr Gene Ther 10, 300–311. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20560875

[Accessed October 11, 2016].

Cemazar, M., Sersa, G., Pavlin, D., and Tozon, N. (2011). Intramuscular IL-12 Electrogene

Therapy for Treatment of Spontaneous Canine Tumors. Targets Gene Ther.


88

Cemazar, M., Tamzali, Y., Sersa, G., Tozon, N., Mir, L. M., Miklavcic, D., et al. (2008).

Electrochemotherapy in veterinary oncology. J Vet Intern Med 22, 826–831.

Cemazar, M, Jarm, T, Miklavcic, D, Lebar, AM, Ihan, A, Kopitar, NA, Sersa, G (1998). Effect

of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-

cell lines in vitro. Electro- and Magnetobiology 17:263-272,

Cemazar, M, Wilson, I, Dachs, GU, Tozer, GM, Sersa, G (2004). Direct visualization of

electroporation-assisted in vivo gene delivery to tumors using intravital microscopy - spatial

and time dependent distribution. BMC Cancer 4:81,

Cemazar, M., Todorovic, V., Scancar, J. et al. (2015). Adjuvant TNF-alpha therapy to

electrochemotherapy with intravenous cisplatin in murine sarcoma exerts synergistic antitumor

effectiveness, Radiology and Oncology 49: 32–40.

Chaudhary, B., and Elkord, E. (2016). Regulatory T Cells in the Tumor Microenvironment and

Cancer Progression: Role and Therapeutic Targeting. Vaccines 4, 28.

Chávez-Galán, L., Olleros, M.L., Vesin, D. et al. (2015). Much More than M1 and M2

Macrophages, There are also CD169(+) and TCR(+) Macrophages, Frontiers in Immunology

6: 263,

Chiarella, P., Fazio, V.M., Signori, E. (2013). Electroporation in DNA vaccination protocols

against cancer, Current Drug Metabolism 14: 291–299.

Chiarella, P., Massi, E., De Robertis, M., Sibilio, A., Parrella, P., Fazio, V. M., et al. (2008).

Electroporation of skeletal muscle induces danger signal release and antigen-presenting cell

recruitment independently of DNA vaccine administration. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 1645–

57.

Chuang, T.-F., Lee, S.-C., Liao, K.-W., Hsiao, Y.-W., Lo, C.-H., Chiang, B.-L., et al. (2009).

Electroporation-mediated IL-12 gene therapy in a transplantable canine cancer model. Int. J.

Cancer 125, 698–707.

Cicchelero, L., Denies, S., Haers, H., Vanderperren, K., Stock, E., Van Brantegem, L., et al.

(2016). Intratumoural interleukin 12 gene therapy stimulates the immune system and decreases

angiogenesis in dogs with spontaneous cancer. Vet. Comp. Oncol.

Colombo, M. P., and Trinchieri, G. (2002). Interleukin-12 in anti-tumor immunity and

immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155–68.


89

Cutrera, J., King, G., Jones, P., Kicenuik, K., Gumpel, E., Xia, X., et al. (2015). Safe and

effective treatment of spontaneous neoplasms with interleukin 12 electro-chemo-gene therapy.

J. Cell. Mol. Med. 19, 664–675.

Cutrera, J., Torrero, M. N., Shiomitsu, K., Mauldin, N., and Li, S. (2008). Intratumoral

bleomycin and IL-12 electrochemogenetherapy for treating head and neck tumors in dogs.

Methods Mol Biol 423, 319–325.

Daud, A. I., DeConti, R. C., Andrews, S., Urbas, P., Riker, A. I., Sondak, V. K., et al. (2008).

Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J.

Clin. Oncol. 26, 5896–5903.

De Robertis, M., Arigoni, M., Loiacono, L. et al., (2015), Novel insights into Notum and

glypicans regulation in colorectal cancer, Oncotarget 6: 41237-57.

Dean DA, Stivers C, Linkhart TA, Strong DD. (2006). Sequences from the Human Type 1 alpha

2 Procollagen Promoter Mediate Osteoblast-Specific Plasmid Nuclear Import. Mol

Ther;13:S413--S413.

Dean, DA (2013). Cell-specific targeting strategies for electroporation-mediated gene delivery

in cells and animals. J Membr Biol 246:737-44

Delteil, C, Teissie, J, Rols, MP (2000). Effect of serum on in vitro electrically mediated gene

delivery and expression in mammalian cells. Biochim Biophys Acta 1467:362-8

Devaud, C., John, L.B., Westwood J.A. et al. (2013), Immune modulation of the tumor

microenvironment for enhancing cancer immunotherapy, Oncoimmunology 2: e25961.

Del Vecchio M, Bajetta E, Canova S, Lotze MT, Wesa A, Parmiani G, et al. (2007), Interleukin-

12: biological properties and clinical application. Clin Cancer Res 13(16):4677–85.

Dobson, J. M. (2013). Breed-Predispositions to Cancer in Pedigree Dogs. ISRN Vet. Sci. 2013,

1–23.

Dolinsek T, Prosen L, Cemazar M, Potocnik T, Sersa G. (2016), Electrochemotherapy with

bleomycin is effective in BRAF mutated melanoma cells and interacts with BRAF inhibitors.

Radiol Oncol 50(3):274–9.


90

Dolinsek T, Markelc B, Sersa G, Coer A, Stimac M, Lavrencak J, et al. (2013), Multiple

delivery of siRNA against endoglin into murine mammary adenocarcinoma prevents

angiogenesis and delays tumor growth. PLoS One 8(3):e58723.

Dos Santos, L. R., Barrouin-Melo, S. M., Chang, Y. F., Olsen, J., McDonough, S. P., Quimby,

F., et al. (2004). Recombinant single-chain canine interleukin 12 induces interferon gamma

mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells of dogs with visceral leishmaniasis.

Vet. Immunol. Immunopathol. 98, 43–48.

Eisenhauer, E. A., Therasse, P., Bogaerts, J., Schwartz, L. H., Sargent, D., Ford, R., et al.

(2009). New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version

1.1). Eur J Cancer 45, 228–247.

European Medicines Agency (EMA), Reflection paper on design modifications of gene

therapymedicinal products during development, 2011.

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/02/WC5

00122743.pdf

Ferraro B, Morrow MP, Hutnick NA, Shin TH, Lucke CE, Weiner DB. (2011), Clinical

applications of DNA vaccines: current progress. Clin Infect Dis 53(3):296–302.

Ferreira, E, Potier, E, Logeart-Avramoglou, D, Salomskaite-Davalgiene, S, Mir, LM, Petite, H

(2008). Optimization of a gene electrotransfer method for mesenchymal stem cell transfection.

Gene Ther 15:537-44

Finn, O.J. (2012), Immuno-oncology: understanding the function and dysfunction of the

immune system in cancer, Annals of Oncology 23 (8): viii6–viii9.

Forde, P.F., Hall, L.J., de Kruijf M. et al. (2015), Non-viral immune electrogene therapy induces

potent antitumour responses and has a curative effect in murine colon adenocarcinoma and

melanoma cancer models, Gene Therapy 22: 29–39.

Gillard, M, Cadieu, E, De Brito, C, Abadie, J, Vergier, B, Devauchelle, P, Degorce, F, Dreano,

S, Primot, A, Dorso, L, Lagadic, M, Galibert, F, Hedan, B, Galibert, MD, Andre, C (2014).

Naturally occurring melanomas in dogs as models for non-UV pathways of human melanomas.

Pigment Cell Melanoma Res 27:90-102

Gonzales – Gugel, E., Saxena, M., Bhardwaj, N. (2016), Modulation of innate immunity in the

tumor microenvironment, Cancer Immunol Immunother 65: 1261–1268.


91

Gothelf A, Gehl J. (2012), What you always needed to know about electroporation based DNA

vaccines. Hum Vaccin Immunother 8(11):1694–702.

Grohmann U, Bianchi R, Ayroldi E, Belladonna ML, Surace D, Fioretti MC, et al. (1997), A

tumor-associated and self antigen peptide presented by dendritic cells may induce T cell anergy

in vivo, but IL-12 can prevent or revert the anergic state. J Immunol 158(8):3593–602.

Guo, H, Hao, R, Wei, Y, Sun, D, Sun, S, Zhang, Z (2012). Optimization of electrotransfection

conditions of mammalian cells with different biological features. J Membr Biol 245:789-95

Hong Z-F, Zhao W-X, Yin Z-Y, Xie C-R, Xu Y-P, Chi X-Q, et al. (2016), Natural killer cells

inhibit pulmonary metastasis of hepatocellular carcinoma in nude mice. Oncol Lett 11(3):2019–

26.

Hubbard, W. K. (1996). Points to consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventive Infectious

Disease Indications (Docket No 96-N-0400), Food and Drug Administration (FDA), Federal

Register.

Inoue K, Ohashi E, Kadosawa T et al. (2004) Establishment and characterization of four canine

melanoma cell lines. J Vet Med Sci 66 (11): 1437-1440

Jia S-F, Duan X, Worth LL, Guan H, Kleinerman ES. (2006), Intratumor murine interleukin-

12 gene therapy suppressed the growth of local and distant Ewing’s sarcoma. Cancer Gene Ther

13(10) : 948–57.

Kamensek, U., Tesic, N., Sersa, G., Kos, S., and Cemazar, M. (2017). Tailor-made fibroblast-

specific and antibiotic-free interleukin 12 plasmid for gene electrotransfer-mediated cancer

immunotherapy. Plasmid 89: 9–15.

Khanna, C., Lindblad-Toh, K., and Vail, D. (2006). The dog as a cancer model. Nat. Biotechnol.

24, 1065.

Kim, J., Bae, J.S. (2016), Tumor-Associated Macrophages and Neutrophils in Tumor

Microenvironment, Mediators of Inflammation: 11.

Kishida, T., Asada, H., Itokawa, Y., Yasutomi, K., Shin-Ya, M., Gojo, S., et al. (2003).

Electrochemo-gene therapy of cancer: intratumoral delivery of interleukin-12 gene and

bleomycin synergistically induced therapeutic immunity and suppressed subcutaneous and

metastatic melanomas in mice. Mol Ther 8, 738–745. Available at:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14599806.


92

Kodre, V., Cemazar, M., Pecar, J., Sersa, G., Cor, A., and Tozon, N. (2009).

Electrochemotherapy compared to surgery for treatment of canine mast cell tumours. In Vivo

(Brooklyn). 23, 55–62. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19368125.

Kos, S., Tesic, N., Kamensek, U., Blagus, T., Cemazar, M., Kranjc, S., et al. (2015). Improved

Specificity of Gene Electrotransfer to Skin Using pDNA Under the Control of Collagen Tissue-

Specific Promoter. J Membr Biol 248, 919–928.

Kos S, Blagus T, Cemazar M, Lampreht Tratar U, Stimac M, Prosen L, et al. (2016),

Electrotransfer parameters as a tool for controlled and targeted gene expression in skin. Mol

Ther - Nucleic Acids 5(8):e356.

Kung, AL (2007). Practices and pitfalls of mouse cancer models in drug discovery. Advances

in Cancer Research 96:191-212

Lampreht, U., Kamensek, U., Stimac, M., Bosnjak, M., Kranjc, S., Sersa, G., et al. (2016). In

vitro and in vivo evaluation of a plasmid encoding canine interleukin 12. in IFMBE

Proceedings, 441–444.

Lampreht, U., Kamensek, U., Stimac, M., Sersa, G., Tozon, N., Bosnjak, M., et al. (2015). Gene

Electrotransfer of Canine Interleukin 12 into Canine Melanoma Cell Lines. J Membr Biol 248:

909–917.

Lampreht Tratar, U., Loiacono, L., Cemazar, M., Kamensek, U., Fazio, V. M., Sersa, G., et al.

(2017). Gene Electrotransfer of Plasmid-Encoding IL-12 Recruits the M1 Macrophages and

Antigen-Presenting Cells Inducing the Eradication of Aggressive B16F10 Murine Melanoma.

Mediators Inflamm. 2017.

Lasek, W., Zagożdżon, R., and Jakobisiak, M. (2014). Interleukin 12: still a promising

candidate for tumor immunotherapy? Cancer Immunol. Immunother. 63: 419–35.

Li, S., Zhang, X., Xia, X. (2002), Regression of tumor growth and induction of long-term

antitumor memory by interleukin 12 electro-gene therapy, Journal of the National Cancer

Institute 94: 762–768.

Liew, A, Andre, FM, Lesueur, LL, De Menorval, MA, O'Brien, T, Mir, LM (2013). Robust,

efficient, and practical electrogene transfer method for human mesenchymal stem cells using

square electric pulses. Hum Gene Ther Methods 24:289-97


93

Livak, K. J., and Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of Relative Gene Expression Data Using

Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods 25, 402–408.

Lucas, M., Heller, L.C., Coppola, D. et al., (2002), IL-12 Plasmid Delivery by in Vivo

Electroporation for the Successful Treatment of Established Subcutaneous B16.F10 Melanoma,

Molecular Therapy 5: 668–675.

Lucas, M.L., Heller, R. (2003), IL-12 gene therapy using an electrically mediated nonviral

approach reduces metastatic growth of melanoma, DNA and Cell Biology 22 (12): 755-763.

Mali, B, Jarm, T, Snoj, M, Sersa, G, Miklavcic, D (2013). Antitumor effectiveness of

electrochemotherapy: a systematic review and meta-analysis. Eur J Surg Oncol 39:4-16

Meyerrose TE, Herrbrich P, Hess DA et al. (2003). Immune-deficient mouse models for

analysis of human stem cells. Biotechniques 35(6):1262-72

Nakamura S, Watanabe S, Ohtsuka M, Maehara T, Ishihara M, Yokomine T, et al. (2008), Cre-

loxP system as a versatile tool for conferring increased levels of tissue-specific gene expression

from a weak promoter. Mol Reprod Dev 75(6):1085–93.

Niu G, Chen X. (2010), Vascular endothelial growth factor as an anti-angiogenic target for

cancer therapy. Curr Drug Targets 11(8):1000–17.

O’Neill, K., Guth, A., Biller, B., Elmslie, R., and Dow, S. (2009). Changes in regulatory T cells

in dogs with cancer and associations with tumor type. J. Vet. Intern. Med. 23, 875–881.

Pavlin, D., Cemazar, M., Cor, A., Sersa, G., Pogacnik, A., and Tozon, N. (2011). Electrogene

therapy with interleukin-12 in canine mast cell tumors. Radiol Oncol 45, 31–39.

Pavlin, D., Cemazar, M., Kamensek, U., Tozon, N., Pogacnik, A., and Sersa, G. (2009). Local

and systemic antitumor effect of intratumoral and peritumoral IL-12 electrogene therapy on

murine sarcoma. Cancer Biol Ther 8, 2114–2122.

Prayle, A, Watson, A, Fortnum, H, Smyth, A (2010). Side effects of aminoglycosides on the

kidney, ear and balance in cystic fibrosis. Thorax 65:654-8

Rakhmilevich AL, Janssen K, Hao Z, Sondel PM, Yang NS. (2000), Interleukin-12 gene

therapy of a weakly immunogenic mouse mammary carcinoma results in reduction of

spontaneous lung metastases via a T-cell-independent mechanism. Cancer Gene Ther:

7(6):826–38.


94

Ranieri, G., Gadaleta, C. D., Patruno, R., Zizzo, N., Daidone, M. G., Hansson, M. G., et al.

(2013). A model of study for human cancer: Spontaneous occurring tumors in dogs. Biological

features and translation for new anticancer therapies. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 88, 187–197.

Reed, S. D., Fulmer, A., Buckholz, J., Zhang, B., Cutrera, J., Shiomitsu, K., et al. (2010).

Bleomycin/interleukin-12 electrochemogene therapy for treating naturally occurring

spontaneous neoplasms in dogs. Cancer Gene Ther 17, 457–464.

Rols, MP, Teissie, J (1998). Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules:

Control by pulse duration. Biophysical Journal 75:1415-1423

Rowell, J. L., McCarthy, D. O., and Alvarez, C. E. (2011). Dog models of naturally occurring

cancer. Trends Mol. Med. 17, 380–388.

Salvadori, C., Svara, T., Rocchigiani, G., Millanta, F., Pavlin, D., Cemazar, M., et al. (2017).

Effects of electrochemotherapy with cisplatin and peritumoral IL-12 gene electrotransfer on

canine mast cell tumors: A histopathologic and immunohistochemical study. Radiol. Oncol. 51,

286–294.

Scarpati, G.D., Fusciello, C., Sabbatino, F. et al., (2013), Multidisciplinary Approach to Patient

with Malignant Melanoma, Anticancer Agents in Medicinal Chemistry 13 (6): 887–900.

Schwanhausser B, Busse D, Li N et al. (2011) Global quantification of mammalian gene

expression control. Nature 473 (7347): 337-342

Scelsi, D, Mevio, N, Bertino, G, Occhini, A, Brazzelli, V, Morbini, P, Benazzo, M (2013).

Electrochemotherapy as a new therapeutic strategy in advanced Merkel cell carcinoma of head

and neck region. Radiology and Oncology 47:366-369

Sedlar, A., Kranjc, S., Dolinsek, T. et al. (2013), Radiosensitizing effect of intratumoral

interleukin-12 gene electrotransfer in murine sarcoma, BMC Cancer 13: 38.

Sedlar, A., Dolinsek, T., Markelc, B. et al., (2012), Potentiation of electrochemotherapy by

intramuscular IL-12 gene electrotransfer in murine sarcoma and carcinoma with different

immunogenicity, Radiology and Oncology 46: 302–311.

Selleck, W.A., Canfield, S.E., Hassen, W.A. et al. (2003), IFN-gamma sensitization of prostate

cancer cells to Fas-mediated death: a gene therapy approach, Molecular Therapy 7: 185–192.


95

Sersa, G., Teissie, J., Cemazar, M., Signori, E., Kamensek, U., Marshall, G., et al. (2015).

Electrochemotherapy of tumors as in situ vaccination boosted by immunogene electrotransfer.

Cancer Immunol Immunother 64, 1315–1327.

Shebl, FM, Pinto, LA, Garcia-Pineres, A, Lempicki, R, Williams, M, Harro, C, Hildesheim, A

(2010). Comparison of mRNA and protein measures of cytokines following vaccination with

human papillomavirus-16 L1 virus-like particles. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 19:978-

81

Shi X, Liu J, Xiang Z, Mitsuhashi M, Wu RS, Ma X. (2004), Gene expression analysis in

Interleukin-12-induced suppression of mouse mammary carcinoma. Int J cancer 110(4):570–8.

Shirley, S.A., Lundberg, C.G., Li, F. et al., (2015), Controlled gene delivery can enhance

therapeutic outcome for cancer immune therapy for melanoma, Current Gene Therapy 15: 32–

43.

Soave, D.F., Miguel, D.P., Dias Tome F. et al., (2016), The Fate of the Tumor in the Hands of

Microenvironment: Role of TAMs and mTOR Pathway, Mediators of Inflammation 7.

Solensky, R. (2003). Hypersensitivity reactions to beta-lactam antibiotics. Clin. Rev. Allergy

Immunol. 24, 201–220.

Somatic, H., and Therapy, G. (2006). Guidance for industry: patient-reported outcome

measures: use in medical product development to support labeling claims: draft guidance.

Health Qual. Life Outcomes 4, 79.

Spanggaard, I, Snoj, M, Cavalcanti, A, Bouquet, C, Sersa, G, Robert, C, Cemazar, M, Dam, E,

Vasseur, B, Attali, P, Mir, LM, Gehl, J (2013). Gene electrotransfer of plasmid antiangiogenic

metargidin peptide (AMEP) in disseminated melanoma: safety and efficacy results of a phase I

first-in-man study. Hum Gene Ther Clin Dev 24:99-107

Steding, C. E., Wu, S. tse, Zhang, Y., Jeng, M. H., Elzey, B. D., and Kao, C. (2011). The role

of interleukin-12 on modulating myeloid-derived suppressor cells, increasing overall survival

and reducing metastasis. Immunology 133, 221–238.

Stimac M, Dolinsek T, Lampreht U, Cemazar M, Sersa G. (2015) Gene Electrotransfer of

Plasmid with Tissue Specific Promoter Encoding shRNA against Endoglin Exerts Antitumor

Efficacy against Murine TS/A Tumors by Vascular Targeted Effects. PLoS One

10(4):e0124913.


96

Strasly M, Cavallo F, Geuna M, Mitola S, Colombo MP, Forni G, et al. (2001), IL-12 inhibition

of endothelial cell functions and angiogenesis depends on lymphocyte-endothelial cell cross-

talk. J Immunol 166(6):3890–9.

Tamzali, Y., Borde, L., Rols, M. P., Golzio, M., Lyazrhi, F., and Teissie, J. (2012). Successful

treatment of equine sarcoids with cisplatin electrochemotherapy: a retrospective study of 48

cases. Equine Vet J 44, 214–220.

Tesic, N., Kamensek, U., Sersa, G., Kranjc, S., Stimac, M., Lampreht, U., et al. (2015).

Endoglin (CD105) Silencing Mediated by shRNA Under the Control of Endothelin-1 Promoter

for Targeted Gene Therapy of Melanoma. Mol Ther Nucleic Acids 4, e239.

Tesic, N, Cemazar, M (2013). In vitro targeted gene electrotransfer to endothelial cells with

plasmid DNA containing human endothelin-1 promoter. J Membr Biol 246:783-91

Tevz, G., Kranjc, S., Cemazar, M., Kamensek, U., Coer, A., Krzan, M., et al. (2009). Controlled

systemic release of interleukin-12 after gene electrotransfer to muscle for cancer gene therapy

alone or in combination with ionizing radiation in murine sarcomas. J. Gene Med. 11, 1125–

1137.

Tomayko MM, Reynolds CP (1989) Determination of Subcutaneous Tumor Size in Athymic

(Nude) Mice. Cancer Chemother Pharmacol 24: 148-154

Topham NJ, Hewitt EW. (2009), Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?

Immunology 128(1):7–15

Tozon, N., Lampreht Tratar, U., Znidar, K., Sersa, G., Teissie, J., and Cemazar, M. (2016).

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats.

J. Vis. Exp., 1–7.

Tozon, N., Pavlin, D., Sersa, G., Dolinsek, T., and Cemazar, M. (2014). Electrochemotherapy

with intravenous bleomycin injection: an observational study in superficial squamous cell

carcinoma in cats. J Feline Med Surg 16, 291–299.

Trinchieri G. (2003) Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive

immunity. Nat Rev Immunol 3(2): 133-46

Tugues S, Burkhard SH, Ohs I, Vrohlings M, Nussbaum K, Vom Berg J, et al. (2015) New

insights into IL-12-mediated tumor suppression. Cell Death Differ 22(2):237–46.


97

Vail, D. M., and MacEwen, E. G. (2000). Spontaneously occurring tumors of companion

animals as models for human cancer. Cancer Invest. 18, 781–792.

Vandermeulen, G., Marie, C., Scherman, D., and Préat, V. (2011). New generation of plasmid

backbones devoid of antibiotic resistance marker for gene therapy trials. Mol. Ther. 19, 1942–

9.

Vandermeulen G, Richiardi H, Escriou V, Ni J, Fournier P, Schirrmacher V, et al. (2009), Skin-

specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine 27(32):4272–7.

Veterinary Co-operative Oncology, G. (2004). Veterinary Co-operative Oncology Group -

Common Terminology Criteria for Adverse Events (VCOG-CTCAE) following chemotherapy

or biological antineoplastic therapy in dogs and cats v1.0. Vet. Comp. Oncol. 2, 195–213.

Vinay, D.S., Ryan, E.P., Pawelec G. et al. (2015), Immune evasion in cancer: Mechanistic basis

and therapeutic strategies, Seminars in Cancer Biology 35: S185–S198.

Vogel C, Marcotte EM (2012) Insights into the regulation of protein abundance from proteomic

and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet 13(4): 227-232

Wang, J., Saffold, S., Cao, X. et al. (1998), Eliciting T cell immunity against poorly

immunogenic tumors by immunization with dendritic cell-tumor fusion vaccines, The Journal

of Immunology 61: 5516–5524.

Withrow, S. J., and Vail, D. M. (2007). Small Animal Clinical Oncology. Available at:

papers2://publication/uuid/AE1C1B27-C1B1-46EE-BF4C-990B9E9ED18C.

Wang, S., Ma, N., Zhao, W. et al. (2016), Inflammation-Related DNA Damage and Cancer

Stem Cell Markers in Nasopharyngeal Carcinoma, Mediators of inflammation, vol. 2016, pp.

10.

Williams, S.G., Cranenburgh, R.M., Weiss, A.M. et al. (1998), Repressor titration: a novel

system for selection and stable maintenance of recombinant plasmids, Nucleic Acids Research

26: 2120–2124.

Yamashita, Y.I., Shimada, M., Hasegawa, H. et al., (2001), Electroporation-mediated

interleukin-12 gene therapy for hepatocellular carcinoma in the mice model, Cancer Research

61: 1005–1012.


98

Yarmush ML, Golberg A, Sersa G, Kotnik T, Miklavcic D. (2014), Electroporation-based

technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng

16:295–320.

Zhao, J., Zhao, J., and Perlman, S. (2012). Differential Effects of IL-12 on Tregs and Non-Treg

T Cells: Roles of IFN-γ, IL-2 and IL-2R. PLoS One 7.

Zhou, W, Xiong, Z, Liu, Y, Yao, C, Li, C (2012). Low voltage irreversible electroporation

induced apoptosis in HeLa cells. J Cancer Res Ther 8:80-5


99

ZNANSTVENA DELA, OBJAVLJENA V ČASU NASTAJANJA DOKTORSKE NALOGE

1. LAMPREHT TRATAR, Urša, KAMENŠEK, Urška, SAVARIN, Monika, SERŠA, Gregor, TOZON,

Nataša, BOŠNJAK, Maša, BROŽIČ, Andreja, OLIVEIRA, Geraldo Gileno de Sá, NAKAGAWA,

Takayuki, SAEKI, Kohei, ČEMAŽAR, Maja. Gene electrotransfer of canine interleukin 12 into

canine melanoma cell lines. The journal of membrane biology, ISSN 0022-2631, 2015, vol.

248, iss. 5, str. 909-917, doi: 10.1007/s00232-015-9800-2.

2. LAMPREHT TRATAR, Urša, KAMENŠEK, Urška, SAVARIN, Monika, BOŠNJAK, Maša, KRANJC,

Simona, SERŠA, Gregor, ČEMAŽAR, Maja. In vitro and in vivo evaluation of a plasmid

encoding canine interleukin 12. V: JARM, Tomaž (ur.), KRAMAR, Peter (ur.). 1st World

Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food &

Environmental Technologies (WC 2015) : Portorož, Slovenia, September 6-10, 2015, (IFMBE

proceedings, ISSN 1680-0737, vol. 53). Singapore: Springer. cop. 2016, str. 441-444.

doi:10.1007/978-981-287-817-5_96.

3. LAMPREHT TRATAR, Urša, KOS, Špela, KAMENŠEK, Urška, OTA, Maja, TOZON, Nataša, SERŠA,

Gregor, ČEMAŽAR, Maja. Antitumor effect of antibiotic resistance gene-free plasmids

encoding interleukin-12 in canine melanoma model. Cancer gene therapy, ISSN 0929-1903.

[Print ed.], 2018, vol. , no. , str. [1-10], doi: 10.1038/s41417-018-0014-5.

4. LAMPREHT TRATAR, Urša, LOIACONO, Luisa, ČEMAŽAR, Maja, KAMENŠEK, Urška, FAZIO, Vito

Michele, SERŠA, Gregor, SIGNORI, Emanuella. Gene electrotransfer of plasmid-encoding IL-12

recruits the M1 macrophages and antigen-presenting cells inducing the eradication of

aggressive B16F10 murine melanoma. Mediators of inflammation, ISSN 0962-9351, May

2017, vol. 2017, str. [1-11]. https://www.hindawi.com/journals/mi/2017/5285890/, doi:

10.1155/2017/5285890.

5. SALVADORI, Claudia, ŠVARA, Tanja, ROCCHIGIANI, Guido, MILLANTA, Francesca, PAVLIN,

Darja, ČEMAŽAR, Maja, LAMPREHT TRATAR, Urša, SERŠA, Gregor, TOZON, Nataša, POLI,

Alessandro. Effects of electrochemotherapy with cisplatin and peritumoral IL-12 gene

electrotransfer on canine mast cell tumors : a histopathologic and immunohistochemical

study. Radiology and oncology, ISSN 1318-2099. [Print ed.], 2017, vol. 50, no. 3, str. 286-294,

doi: 10.1515/raon-2017-0035.

6. ČEMAŽAR, Maja, AMBROŽIČ, Jerneja, PAVLIN, Darja, SERŠA, Gregor, POLI, Alessandro, KRHAČ

LEVAČIĆ, Ana, TEŠIĆ, Nataša, LAMPREHT TRATAR, Urša, RAK, Mitja, TOZON, Nataša. Efficacy

and safety of electrochemotherapy combined with peritumoral IL-12 gene electrotransfer of


100

canine mast cell tumours. Veterinary and comparative oncology, ISSN 1476-5810, Jun. 2017,

vol. 15, iss. 2, str. 641-654, doi: 10.1111/vco.12208.

7. TOZON, Nataša, LAMPREHT TRATAR, Urša, ŽNIDAR, Katarina, SERŠA, Gregor, TEISSIE, Justin,

ČEMAŽAR, Maja. Operating procedures of the electrochemotherapy for treatment of tumor

in dogs and cats. Journal of visualized experiments, ISSN 1940-087X, Oct. 2016, iss. 116, doi:

10.3791/54760.

8. ČEMAŽAR, Maja, TODOROVIĆ, Vesna, ŠČANČAR, Janez, LAMPREHT TRATAR, Urša, SAVARIN,

Monika, KAMENŠEK, Urška, KRANJC, Simona, CÖR, Andrej, SERŠA, Gregor. Adjuvant TNF-a

therapy to electrochemotherapy with intravenous cisplatin in murine sarcoma exerts

synergistic antitumor effectiveness. Radiology and oncology, ISSN 1318-2099. [Print ed.],

Mar. 2015, vol. 49, no. 1, str. 32-40, III, ilustr., doi: 10.1515/raon-2015-0005.

9. TEŠIĆ, Nataša, KAMENŠEK, Urška, SERŠA, Gregor, KRANJC, Simona, SAVARIN, Monika,

LAMPREHT TRATAR, Urša, PRÉAT, Véronique, VANDERMEULEN, Gaëlle, BUTINAR, Miha,

TURK, Boris, ČEMAŽAR, Maja. Endoglin (CD105) silencing mediated by shRNA under the

control of Endothelin-1 promoter for targeted gene therapy of Melanoma. Molecular

therapy, Nucleic acids, ISSN 2162-2531, May 2015, no. 4, ilustr. doi: 10.1038/mtna.2015.12.

10. JESENKO, Tanja, MARKELC, Boštjan, BOŠNJAK, Maša, BLAGUS, Tanja, PROSEN, Lara, KRANJC,

Simona, SAVARIN, Monika, LAMPREHT TRATAR, Urša, SERŠA, Gregor, ČEMAŽAR, Maja.

Endoglin silencing has significant antitumor effect on murine mammary adenocarcinoma

mediated by vascular targeted effect. Current gene therapy, ISSN 1566-5232, vol. 15, no. 3,

str. 228-244.

11. SAVARIN, Monika, JESENKO, Tanja, LAMPREHT TRATAR, Urša, ČEMAŽAR, Maja, SERŠA,

Gregor. Gene electrotransfer of plasmid with tissue specific promoter encoding shRNA

against endoglin exerts antitumor efficacy against murine TS/A tumors by vascular targeted

effects. PloS one, ISSN 1932-6203, 2015, vol. 10, no. 4. doi: 10.1371/journal.pone.0124913.

12. KOS, Špela, BLAGUS, Tanja, ČEMAŽAR, Maja, LAMPREHT TRATAR, Urša, SAVARIN, Monika,

PROSEN, Lara, JESENKO, Tanja, KAMENŠEK, Urška, KRANJC, Simona, STEINSTRAESSER, Lars,

VANDERMEULEN, Gaëlle, PRÉAT, Véronique, SERŠA, Gregor. Electrotransfer parameters as a

tool for controlled and targeted gene expression in skin. Molecular therapy, Nucleic acids,

ISSN 2162-2531, 2016, vol. 5, no. 8, doi: 10.1038/mtna.2016.65.

13. PROSEN, Lara, HUDOKLIN, Samo, ČEMAŽAR, Maja, SAVARIN, Monika, LAMPREHT TRATAR,

Urša, OTA, Maja, ŠČANČAR, Janez, ROMIH, Rok, SERŠA, Gregor. Magnetic field contributes to

the cellular uptake for effective therapy with magnetofection using plasmid DNA encoding

against Mcam in B16F10 melanoma in vivo. Nanomedicine, ISSN 1743-5889, 2016, vol. 11,

no. 6, str. 627-641, ilustr., doi: 10.2217/nnm.16.4.


101

14. MITROVIĆ, Ana, SOSIČ, Izidor, KOS, Špela, LAMPREHT TRATAR, Urša, BREZNIK, Barbara,

KRANJC, Simona, MIRKOVIĆ, Bojana, GOBEC, Stanislav, LAH TURNŠEK, Tamara, ČEMAŽAR,

Maja, SERŠA, Gregor, KOS, Janko. Addition of 2-(ethylamino)acetonitrile group to nitroxoline

results in significantly improved anti-tumor activity in vitro and in vivo. Oncotarget, ISSN

1949-2553, 2017, vol. 8, no. 35, str. 59136-59147, ilustr., doi: 10.18632/oncotarget.19296.

15. KAMENŠEK, Urška, ČEMAŽAR, Maja, LAMPREHT TRATAR, Urša, URŠIČ, Katja, SERŠA, Gregor.

Antitumor in situ vaccination effect of TNF[alfa] and IL-12 plasmid DNA electrotransfer in a

murine melanoma model. Cancer immunology and immunotherapy, ISSN 0340-7004, 2018,

vol. , no. , str. [1-7], doi: 10.1007/s00262-018-2133-0.

Documents

Doktorat Urša Lampreht Tratar - COnnecting REpositoriesElektrogenska terapija z interlevkinom 12 za zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psih. i Izjavljam, da sem avtorica