Do an Chung Cuoi

61

Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội

MỤC LỤC

MỤC LỤC.................................................................................................................1

LỜI MỞ ĐẦU...........................................................................................................3

PHẦN I. TỔNG QUAN...........................................................................................4

1.1. XYLAN...........................................................................................................4

1.2. PHỨC HỆ ENZYM PHÂN CẮT XYLAN.....................................................5

1.3. KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI XYLANASE................................................7

1.3.1. Khái niệm về xylanase...............................................................................7

1.3.2. Phân loại xylanase....................................................................................8

1.4. CẤU TRÚC CỦA XYLANASE.....................................................................9

1.5. CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA XYLANASE......................................................11

1.6. NGUỒN THU XYLANASE.........................................................................13

1.6.1. Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn.........................................................13

1.6.2. Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc........................................................14

1.7. ỨNG DỤNG CỦA XYLANASE..................................................................17

1.7.1. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi......................................17

1.7.2. Trong sản xuất bánh................................................................................17

1.7.3. Trong sản xuất rượu vang.......................................................................18

1.7.4. Trong sản xuất cồn nhiên liệu.................................................................18

1.7.5. Trong chất hoạt động bề mặt..................................................................18

1.7.6. Trong tẩy trắng giấy và bột giấy.............................................................19

1.8. TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ XYLANASE....................19

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP........................................................21

2.1. VẬT LIỆU.....................................................................................................21

2.1.1. Nguồn phân lập.......................................................................................21

2.1.2. Hóa chất..................................................................................................21

Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-K49

61


2.1.3. Thiết bị....................................................................................................22

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................23

2.2.1. Phương pháp phân lập............................................................................23

2.2.2. Xác định hoạt tính xylanase trên môi trường đặc...................................23

2.2.3. Xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp DNS...............................24

2.2.4. Phương pháp định tên nấm mốc..............................................................25

2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA.................................................................26

2.2.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose...........................................27

2.2.7. Phương pháp khuếch đại một đoạn DNA bằng phản ứng PCR..............28

2.2.8. Phương pháp tinh sạch một đoạn DNA...................................................28

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................30

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH

XYLANASE CAO...............................................................................................31

3.2. ĐỘNG HỌC SINH TỔNG HỢP ENZYM XYLANASE CỦA CHỦNG C1

VÀ B7.................................................................................................................. 34

3.3. ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOI HÌNH THÁI..............................36

3.4. ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ.....................38

3.4.1. Tách chiết DNA tổng số..........................................................................38

3.4.2. Khuếch đại đoạn ITS1-5,8S-ITS2 bằng phản ứng PCR..........................39

3.4.3. Giải trình tự đoạn được khuếch đại và phân tích trình tự.......................41

3.5. THIẾT KẾ ĐOẠN MỒI ĐỂ TÁCH DÒNG GEN MÃ HOÁ XYLANASE.46

3.6. KHUẾCH ĐẠI GEN MÃ HOÁ XYLANSE.................................................47

3.7. GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ĐÃ ĐƯỢC KHUẾCH ĐẠI VÀ KIỂM TRA

ĐỘ TƯƠNG ĐỒNG TRÊN NGÂN HÀNG GEN THẾ GIỚI.............................50

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................................56

TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................57

PHỤ LỤC................................................................................................................62


61


LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay trên trái đất, mỗi năm thực vật sản sinh ra một lượng sinh khối

khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ tấn. Tất cả mọi hoạt động của con người cũng

như các loài động vật đều cần đến thực vật. Chúng là nguồn lương thực để nuôi

sống con người và động vật đồng thời là nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho

các ngành công nghiệp. Để thay đổi tính chất của vật liệu đầu vào cho phù hợp với

sản phẩm mong đợi người ta phải tìm cách thay đổi cấu trúc của thành tế bào thực

vật. Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo khá vững chắc bởi cellulose,

hemicellulose và lignin cho nên để phá hủy một phần hoặc toàn bộ chúng thì người

ta thường sử dụng các hóa chất mạnh như axit mạnh hay kiềm mạnh. Do đó chi phí

để sản xuất các sản phẩm như giấy thường cao và nhất là gây ảnh hưởng nghiêm

trọng đến môi trường sinh thái. Chính vì vậy mà yêu cầu đặt ra là phải thay thế bằng

các phương pháp an toàn hơn đối với môi trường. Và giải pháp cho vấn đề này là

các loại enzym thủy phân các polyme sinh học kể trên.

Một loại enzym hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm là

xylanase. Enzym này có khả năng thủy phân hiệu quả các xylan – là thành phần chủ

yếu của hemicellulose trong thành tế bào thực vật. Xylanase có rất nhiều ứng dụng

trong công nghệ chế biến giấy và bột giấy, công nghệ thực phẩm, công nghiệp sản

xuất thức ăn chăn nuôi, hay ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh hoc (ethanol

sinh học) từ phế thải nông nghiệp.

Tuy được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, nhưng việc sử dụng

xylanase còn hạn chế do hiệu suất sinh tổng hợp của các chủng vi sinh vật tự nhiên

sinh enzym này chưa cao. Thông qua đề tài nghiên cứu "Phân lập, tuyển chọn và

tách dòng gen mã hóa enzym xylanase từ nấm mốc" hy vọng sẽ lựa chọn được gen

mã hóa xylanase có hoạt tính cao, tiếp tục những nghiên cứu để sản xuất được

xylanase có giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu thị trường.


61


PHẦN I. TỔNG QUAN

1.1. XYLAN

Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose được tìm thấy

trong thành tế bào thực vật là polysaccharide cơ bản thứ hai sau cellulose [1]. Thuật

ngữ hemicellulose được dùng để chỉ những polysaccharide thành tế bào thực vật mà

kết hợp chặt chẽ với cellulose và glucan. Trong thực tế, thành tế bào thực vật là một

vật liệu phức tạp trong đó cellulose (35-50%), hemicellulose (20-30%) - một nhóm

cacbonhydrat trong đó dạng xylan là loại chủ yếu - và lignin (20-30%) liên kết chặt

chẽ với nhau.

Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc acetyl,

4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo

bởi các gốc xylopyranose. Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu β-1,4-

glycozit. Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng các gốc

của axit 4-O-methyl-D-glucuronic [2, 3].

Hình 1. Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae [10]


61


Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu của thành tế bào của thực vật sống lâu

năm, từ 15-30% đối với gỗ cứng và 7-10% đối với gỗ mềm.

Với các cây gỗ mềm, các nhóm phụ của xylan chủ yếu là axit 4-O-methyl

glucuronic và arabinose. Chúng liên kết với bộ khung xylan bằng liên kết α-1,3-

glycozit. Hiếm khi thấy các nhóm acetyl trong xylan của gỗ mềm. Tỷ lệ arabinose

so với xylose thường là 0,6 [4].

Hemicellulose trong gỗ cứng có nhóm phụ là axit 4- O-methyl glucuronic,

axit acetic và axit uronic. Bộ khung của xylan gỗ cứng này gồm các gốc β-1,4-D-

xylopyranose, trung bình cứ 10 – 20 gốc xylose thì có một axit 4- O-methyl

glucuronic liên kết với nó theo kiểu α-1,2-glycozit. Xấp xỉ 60-70% các đơn vị

xylose được este hóa với axit acetic ở nhóm hydroxyl của carbon thứ 2 hoặc thứ 3

và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm axit uronic liên kết với

gốc xylose theo kiểu α-1,2-glycozit [2, 4, 5].

1.2. PHỨC HỆ ENZYM PHÂN CẮT XYLAN

Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzym trong

đó endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện

nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan

tạo ra các oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β-1,4-D-xylan

xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer. Các

nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-

glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase.


61


Hình 2. Vị trí tấn công của các enzym vào xylan của cỏ [2]

Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylo-

oligosaccharide bằng cách loại bỏ thành công xylose từ đầu không khử. Có nhiều

công bố về Bacillus sp [6] và một số nấm [7] sinh tổng hợp β-xylosidase nội bào.

Enzym α-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối cùng

không khử α-L-arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan.

Một lượng lớn các vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và các loài vi khuẩn được

công bố là có khả năng sinh tổng hợp α-arabinosidase. Rhodothermus marinus là

loài chịu nhiệt có sinh enzym lớn nhất với hoạt độ 6,6 U/ml [8].

Enzym α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic

giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyl. Sự thủy phân

liên kết α-1,2 bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan. Tương tự

như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase


61


với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh

tổng hợp α-glucuronidase [9].

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết

của các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose

với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose với

axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p-

coumaroyl esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì

thuận lợi cho sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự

phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose. Nếu sử dụng cùng với

xylanase và các enzym phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase

có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [2].

1.3. KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI XYLANASE

1.3.1. Khái niệm về xylanase

Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of

Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 có:

Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase

Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong

xylan.

Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4-

xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4-

xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β-

xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D-

xylanase

Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase [10]


61


1.3.2. Phân loại xylanase

Wong và các cộng sự [11] phân loại xylanase thành hai nhóm dựa vào đặc

tính lý hóa của chúng như là khối lượng phân tử và điểm đẳng điện và trên các đặc

tính xúc tác khác nhau của chúng. Endo-xylanase có khối lượng phân tử cao với giá

trị pI thấp thuộc về glycanase họ 10 (trước đây gọi là họ ‘F’), trong khi đó các

endoxylanse khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được phân loại thành

glycanase họ 11 (trước đây là họ G) [12, 13].

Biely và các cộng sự [14] sau khi mở rộng phạm vi nghiên cứu trên sự khác

biệt trong các đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase kết luận rằng endo-xylanase của

họ 10 khác với các thành viên của họ 11 là khả năng có thể tấn công các liên kết

glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử [15]. Trong khi endo-

xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh, endo-

xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế. Theo đó

các endo-xylanase của họ 10 có nhiều các hoạt động xúc tác, cái mà tương ứng với

β-xylosidase. Các endo-xylanase của họ 10 giải phóng các xylopyranosyl ở đầu tận

cùng gắn với một gốc xylopyranosyl thay thế, nhưng chúng cũng thể hiện hoạt độ

aryl-β-D-xylosidase.

Sau khi kiểm tra một nghiên cứu phân tích tác nhân rộng rãi, Sapag và các

cộng sự [12] đã ứng dụng một phương pháp mới mà không liên quan tới phân tích

trình tự trước đó cho việc phân loại xylanase họ 11, để chia xylanase thành 6 nhóm

chính. Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzym của nấm. Các enzym nhóm I và II

thường là các enzym có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ

Ascomyceta và Basidiomyceta. Các enzym nhóm I có giá trị pI bazo trong khi đó

nhóm II có giá trị pI ở phía axit. Các enzym của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi

các nấm yếm khí. Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba

nhóm là A, B và C. Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ

Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương.


61


Nhóm B và C thì chứa các enzym chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương,

những loài thường sống trong dạ cỏ [12].

1.4. CẤU TRÚC CỦA XYLANASE

Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt

các enzym, từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans

có nét đặc trưng của họ 11 [16,17]. Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạo

thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và

tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [12]. Sự khác nhau trong hoạt

động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau

trong cấu trúc bậc ba của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được

sắp xếp từ các mảnh β [18, 19]. Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase

họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh β [20]. Vị trí liên kết

cơ chất của endo-xylanase họ 10 ở khe xúc tác không sâu như với endo-xylanase họ

11. Điều này cùng với tính linh động hình thể lớn hơn của các enzym lớn hơn so với

của những enzym nhỏ hơn có thể giải thích nguyên nhân của tính đặc trưng cơ chất

thấp hơn của endo-xylanse họ 10 [16, 17].


61


Hình 3. Cấu trúc không gian 3 chiều của Xylanase họ 10 từ Bacillus

halodurans [21]

Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β

cái mà làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác. Vũng lõm này

được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón

cái của tay phải. Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân

tử isoleusin [16, 17].

Hình 4. Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [22]


61


Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vònng xylopyranose ở gần vị trí

xúc tác. Meagher và các cộng sự [23] nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei

có thể liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên

kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác. Các vị trí cho các gốc

xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi

tryptophan [19, 24].

1.5. CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA XYLANASE

Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của

xylanase. Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan. Sự thủy phân nhìn

chung có thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric

của các monomer đường khử của cacbonhydrat. Đề xuất này bao gồm một hoặc hai

trạng thái chuyển tiếp hóa học. Sự dịch chuyển glycosyl thường dẫn đến trong sự

thay thế tính ái nhân ở cacbon bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với sự

duy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric. Hầu hết các enzym thủy phân

polysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết đến với sự thủy phân các

cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric của C1. Có sự liên quan của

cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm [2]. Cơ chế dịch

chuyển kép bao gồm các đặc điểm:

Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất.

Một nhóm carboxyl của enzym ở trạng thái hoạt động

Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzym với

cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên kết

này đối lập với đường của cơ chất.

Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên [2].

(hình 5)


61


Hình 5. Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của Bacillus circulans

(1 XNB).

(a) Cấu trúc xylan xoắn là phù hợp với dạng lõm giữa Tyr 65 và Tyr 69. Glu 172 là

tác nhân xúc tác axit/bazo và Glu 78 là ái nhân. (b) Glycone liên kết với Glu 78.

Chất trung gian này được giữ lại trong suốt phản ứng chuyển glycosyl. (c) Nước

chiếm chỗ của nucleophile. (d) Sự tách và khuếch tán của glycone (xylobiose) cho

phép sự di chuyển của enzym tới một vị trí mới trên cơ chất. Xylanase của họ 11

biểu lộ một cơ chế endo và ngẫu nhiên hơn trong quá trình phân cắt. Điều này là

bởi vì aglycone được giải phóng ở bước (b) và glycone ở bước (d) [16, 17].


61


Leggio và các cộng sự [20] đề xuất rằng cơ chế xúc tác của xylanase là:

1. Xylanase nhận biết và liên kết với xylan.

2. Gốc xylosyl ở vị trí -1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía gốc

xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên kết cộng

hóa trị enzym-cơ chất trung gian.

3. Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó cơ

chế thủy phân glycosyl cổ điển tiếp tục diễn ra và sản phẩm được giải phóng

[20].

1.6. NGUỒN THU XYLANASE

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật; nhiều loại vi khuẩn

và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [11,25]. Tuy nhiên, có nhiều

nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp endo-

xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả. Cleemput và các

cộng sự [26] đã tinh chế được một loại endo-xylanase với khối lượng phân tử là 55

kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu. Một số loài động vật thân mềm dưới nước

cũng có khả năng sinh tổng hợp xylanase [27].

1.6.1. Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các quá

trình công nghiệp trong đó có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó. Một số loài

sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp.

Bacillus SSP-34 có khả năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ 506 U/ml trong

môi trường tối ưu. Trước đó thì Ratto và các cộng sự đã công bố Bacillus circulans

tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400 U/ml. Nó hoạt động tối ưu ở pH 7 và 40%

hoạt độ được duy trì ở pH 9,2. Streptomyces cuspidosporus sinh tổng hợp được

xylanase có hoạt độ 49 U/ml trong môi trường xylan. Bacillus sp NCL 87-6-10 tổng


61


hợp được xylanase với hoạt độ 93 U/ml trong môi trường có cảm ứng zeolit và có

hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80. Một chủng khác là Bacillus circulans AB16

tổng hợp xylanase có hoạt độ 19,28 U/ml khi sinh trưởng trên môi trường rơm gạo.

Streptomyces sp QG-11-3 có khả năng sinh enzym xylanase có hoạt độ 96 U/ml.

Các sinh vật khác sinh tổng hợp xylanase được đưa ra ở bảng 1 [28].

1.6.2. Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc

Các enzym xylanase được sinh tổng hợp từ nấm mốc thường có pH tối ưu

thấp hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn. Giá trị pH tối ưu của

xylanase từ nấm mốc thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3 đến 8 và ổn

định ở pH 5 (bảng 2).

Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối ưu

của xylanase từ nấm. Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy, để sử dụng

xylanase từ nấm mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ít

được dùng hơn so với vi khuẩn. Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác,

như công nghiệp sản xuất đồ uống, công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại

là một ưu thế rất lớn của xylanase nấm mốc vì môi trường cho enzym hoạt động là

môi trường axit. Gomes và các cộng sự đã công bố thu được hoạt độ xylanase là

188,1 U/ml với pH tối ưu 4,5 từ Trichoderma viride. Tương tự với T. viride, T.

reesei cũng được biết đến với khả năng sinh tổng hợp xylanase cao với hoạt độ 960

U/ml. Giống như Trichoderma sp, Schizophillum commune cũng là một trong

những loài tổng hợp xylanase cao với hoạt độ xylanase là 1244 U/ml. Nằm trong

nhóm nấm mùn trắng, một loài nấm phá hủy thành tế bào thực vật có tiềm năng là

Phanerochaete chrysosporium sản xuất xylanase có hoạt độ 15-20 U/ml trong môi

trường nuôi cấy. Aspergillus niger có hoạt độ xylanase là 76,6 U/ml sau 5,5 ngày

lên men. Nấm sinh tổng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản xuất

enzym trên môi trường lỏng ở quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được thường


61


thấp hơn thực tế. Điều này là do khi tiến hành lên men trong môi trường lỏng các

sợi nấm kết lại thành các pellet làm cản trở quả trình tiếp xúc với chất dinh dưỡng

và đặc biệt là các ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men làm sinh khối của nấm dễ bị

phá vỡ dẫn đến việc làm giảm lượng enzym thu được [28].

Bảng 1. Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [28]

Vi sinh vật Xylanase (U/ml)

Nấm mốc

Aspergillus awamori VTT-D-75028 12,00

Aspergillus niger KKS 138

Aspergillus niger 250

Fusarium oxysporum VTT-D-80134 3,70

Phanerochate chrysosporium 15-20

Piromyces sp.strain E 2 7,96

Thermomyces lanuginosus 650-780

Trichoderma reesei 960

Vi khuẩn

Bacillus SSP-34 506

Bacillus circulans 400

Bacillus stearothermophilus StrainT6 2,33

Bacillus sp. 120

Bacillus sp. strain NCL 87-6-10 93

Bacillus circulans AB 16 19,28

Streptomyces sp. QG-11-3 96

Thermoactinomyces thalophilus sub group C 42


61


Bảng 2. Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [28]

Vi sinh vật

KLPT

(KDa)Điều kiện tối ưu Độ bền pI Km

(mg/ml)

Vmax

(µmol

/ phút /

pH Nhiệt

độ

pH (giờ) Nhiệt độ

(giờ)

Acrophialophora

nainiana

22 7,0 55 - 60 (1) - 16 - -

Aspergillus awamori 39 5,5-6 55 - - 5,7-6,7 1,0 10000

23 50 - - 3333

26 4,0 45-50 - - 3,3-3,5 0,09 455

34 6 56 56 1091

Aureobasidium pullulans

Y-2311-1

25 4,8 54 4,5 50 9,4 7,6 2650

Cephalosporium sp. 35 7,5- 50 - - 6,3 5,26 118,4

24 7,5- 50 - - 4,4 4,16 145,2

Penicillium

purpurogenum

33 7,0 60 6,0-7,5

(24)

40 (3) 8,6 - -

23 3,5 50 4,5-5,5

(24)

40 (3) 5,9 - -

Vi khuẩn

Bacillus sp. W1

(JCM2888)

21.5 6 65 4,5-10 - 8,5 4,5 -

49.5 7,9 70 4,5-7,0 - 3,7 0,95 -

Streptomyces T-7 20.64

3

4,5-5,5 60 5,0 (144) 37 (264) 7,8 10 7600

Streptomyces sp. No

3137

50 5,5-6,5 60-65 5,5-6,5 55 7,1 9,1 -

25 5,0-6,0 60-65 5,0-6,0 55 10.06 - -

25 5,0-6,0 60-65 5,0-6,0 55 10.26 11.2 -

Thermotoga thermarum 266 b 6 80 - - - 0,36 1,18

35 c 7 90- - - - 0,24 19,5


61


1.7. ỨNG DỤNG CỦA XYLANASE

1.7.1. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Việc sử dụng enzym xylanase cho thức ăn của động vật đã thu hút sự quan

tâm của các nhà khoa học. Sự kết hợp của xylanase với thức ăn của gà con làm

giảm độ nhớt trong ruột, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn. Kết quả là cải thiện đáng kể

trọng lượng của chúng [29]. Theo Feoli và các cộng sự thì việc bổ xung xylanase

vào bột mì gia súc và bột đậu tương với một tỷ lệ nhất định cũng cải thiện được

năng suất và hiệu suất tiêu thụ thức ăn của lợn [30]. Các nghiên cứu khác cũng chỉ

ra rằng việc bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏ

ling lăng, ngũ cốc...) đã làm tăng hiệu quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất

trong chăn nuôi [31].

1.7.2. Trong sản xuất bánh

Các xylanase cũng được cho rằng có thể cải thiện chất lượng của bánh mì với

việc làm tăng thể tích đặc trưng của bánh. Điều này càng được nâng cao khi sử

dụng chung với amylase. Xylanase có tính axit từ Aspergillus oryzae được sử dụng

để sản xuất thực phẩm thương mại truyền thống của Nhật như là sake (một loại

rượu từ gạo) và shoyu koji (từ đậu nành và hạt lúa mì). Người ta chỉ ra rằng hiệu

quả phân giải thành tế bào đậu tương và lúa mì cải thiện giá trị sử dụng các vật liệu

thô và làm giảm lượng bã ép lọc đậu tương. Multifect và Enzeko là tên thương mại

của một số các xylanase thương mại cũ được sử dụng trong công nghệ làm bánh.

Novozyme đưa ra một số các enzym xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzym

khác, để cải thiện bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ. Một số các

enzym xylanase thương mại như Celluclast BG, Fungamyl Super AX, Fungamyl

Super MA and the Pentopan® [31].


61


1.7.3. Trong sản xuất rượu vang

α-L-arabinofuranosidase và β-D-glucopyranosidase được sử dụng trong quá

trình sản xuất thực phẩm cho các chất thơm, rượu vang và nước hoa quả. Vi sinh

vật bám trên quả nho với mật độ vừa phải sẽ làm tăng các chất hóa học phức tạp và

tăng chất lượng cảm quan của rượu vang. Điều này do các vi sinh vật này sinh

xylanase, enzym này được cho rằng có khả năng giúp đỡ sự phá hủy thành tế bào

của nho và vì thế làm tăng lượng monoterpenyldiglycoside, chất mà tạo mùi thơm.

Hiện nay, chưa có một enzym thương mại nào có tiềm năng để sử dụng trong sản

xuất rượu vang và nó vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển. [31]

1.7.4. Trong sản xuất cồn nhiên liệu

Sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn năng lượng hóa thạch đang cần sự thay thế

từng bước một với các nguồn thay thế, nguồn này phải thân thiện với môi trường và

phải góp phần bảo vệ trái đất thoát khỏi sự khủng hoảng. Để thu được bioethanol

cần biến đổi nguyên liệu từ thực vật qua các bước như: tiền xử lý bằng hóa chất, sau

đó thủy phân lignocellulose biopolymer thành các đường khử (sử dụng enzym hoặc

hóa chất), rồi lên men các đường khử thành rượu, và cuối cùng là chưng cất và tinh

chế bioethanol [32]. Tuy nhiên, tiền xử lý và sử dụng hóa chất để thủy phân làm giá

thành sản xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi trường. Do đó mà các nhà

nghiên cứu đang cố gắng sử dụng công nghệ enzym để thực hiện quá trình này, việc

nghiên cứu tạo ra các loại enzym có hoạt lực cao, và phối hợp sử dụng các enzym

như xylanase, cellulase, laccase đang được đẩy mạnh nghiên cứu.

1.7.5. Trong chất hoạt động bề mặt

Alkyl glycoside là một trong những chất quan trọng nhất của các chất hoạt

động bề mặt. Về phương diện thương mại, chúng được sản xuất từ các đường đơn

như là glucose và một rượu béo. Nhưng sự glycosyl hóa sử dụng polysaccharide thì

dễ dàng thực hiện hơn trong sản xuất công nghiệp, bởi vì sự thủy phân của


61


polysaccharide và các bước tiếp theo có thể được bỏ qua. Xylanase từ

Aureobasidium pullulans được sử dụng cho sự glycosyl hóa của xylan, 1-octanol

and 2-ethyl hexanol thành octyl-β-D-xylobioside, xyloside and 2-ethylhexyl-β-D-

xylobioside tương ứng [31].

1.7.6. Trong tẩy trắng giấy và bột giấy

Sự tiến bộ trong ứng dụng của công nghệ sinh học tới công nghệ sản xuất

giấy và bột giấy đã có những phát triển có ý nghĩa qua những năm gần đây. Một

trong những ứng dụng thành công nhất là việc sử dụng endo-1,4-β-D-xylanase cho

bước tiền xử lý quá trình tẩy trắng bằng Clo và Clo dioxit. Dựa trên nghiên cứu của

một lượng lớn các phòng thí nghiệm và nhà máy, nó đang được thiết lập để tiền xử

lý cho bột giấy kraft với xylanase đã nâng cao một cách có ý nghĩa khả năng tẩy

trắng của bột giấy bằng cách sử dụng các tác nhân tẩy trắng bằng Clo tiếp theo. Lợi

ích có ý nghĩa nhất của việc tẩy trắng tìm thấy từ việc tiền xử lý bằng xylanase là

làm nó sáng hơn, giảm lượng hóa chất tẩy trắng cần thiết mà vẫn cho độ sáng cao,

và giảm lượng hợp chất Clo hữu cơ trong nước thải tẩy trắng. Hiệu quả của tiền xử

lý bằng xylanase dựa trên các tác nhân tẩy trắng có chứa oxy được nghiên cứu với

một bột giấy kraft gỗ mềm. Bột giấy được tiền xử lý với một dung dịch chứa

xylanase 12%. Xử lý enzym cũng làm loại bỏ một lượng nhỏ của lignin làm giảm

giá trị kappa của bột giấy đi 3%. Sự tăng tính nhớt có thể là do các phân tử

polysaccharide khối lượng phân tử cao được làm giàu, diễn ra khi xylan được loại

bỏ [33].

1.8. TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ XYLANASE

Mặc dù tính chịu nhiệt có thể tốt cho quá trình sản xuất của các enzym bền

nhiệt, nhưng nó thường không có tính thực tế bởi năng suất thấp và quá trình lên

men có nhiệt độ cao cần các trang thiết bị đặc biệt. Kỹ thuật gen đã tạo ra được các

sản phẩm mang tính thương mại nhờ việc chuyển gen vào các cơ thể chủ thích hợp


61


để sản xuất. Sự biểu hiện của các protein ngoại lai vào trong hệ thông prokaryote

được sử dụng một cách rộng rãi nhất bởi khả năng biểu hiện ở mức cao, cả trong

những nghiên cứu cơ bản và trong sản xuất thương mại. Thêm vào đó, tốc độ sinh

trưởng nhanh và sự dễ dàng trong việc nuôi cấy của E. coli khiến nó rất được quan

tâm và trở thành loài được sử dụng để biến nạp gen chủ yếu dùng để sản xuất các

sản phẩm chuyển gen hiện nay. Ngoài E. coli nấm men cũng được sử dụng khá

nhiều để biểu hiện gen.

Một loạt các nghiên cứu gần đây đã tách dòng và biểu hiện xylanase trong

các vật chủ vi khuẩn và nấm men khác nhau. Một số ví dụ, xylanase được tách dòng

vào trong E. coli bao gồm A. oryzae (Kimura cs., 2002), A. pullulans var.

melanigenum (Ohta cs., 2001), Bacillus lyticus (Srivastava and Mukherjee,

2001), Clostridium thermocellum (Fernandes cs., 1999) and Caldocellum

saccharolyticum (Lüthi cs., 1990). Một số xylanase từ A. pullulans var.

melanigenum (Tanaka cs., 2004), T. lanuginosus IOC-4145 (Damaso cs., 2003) và

A. niger (Berrin cs., 2000) được biểu hiện trong Pichia pastoris [31].


61


PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Nguồn phân lập

Mẫu dùng để phân lập nấm mốc là mẫu mốc tương của thị trấn Bần, tỉnh

Hưng Yên, mẫu nước thải nhà máy giấy tại Quảng Ninh và mẫu gỗ mục tại Thanh

Trì, Hà Nội.

Bảng 3. Nguồn phân lập nấm mốc

Mẫu Thời gian lấy Số lần lấy Địa điểm

Gỗ mục 25-08-2008

12-11-2008

2 Xã Vạn Phúc,

Thanh Trì, Hà Nội

Đất tại hồ xử lý

nước thải nhà máy

giấy

14-12-2007

09-03-2008

2 Nhà máy giấy

Quảng Ninh

Mốc tương 10-04-2008

23-05-2008

16-06-2008

3 Thị trấn Bần,

Hưng Yên

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất dùng trong phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc và cảm ứng

sinh xylanase:, Birchwood xylan của Fuka, Các hóa chất axit 3,5-

dinitrosalisilic, saccharose , NaNO3, KCl, Fe2SO4, MgSO4, KH2PO4, cao nấm


61


men, saccharose, aga, axit 3,5-dinitrosalisilic, CH3COOHNa,… từ Trung

Quốc

Hóa chất dùng để tách chiết DNA tổng số, điện di DNA,...của hãng sigma,

Merk: Tris base, Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), CTAB, NaCl, β-

mercaptoethanol, Sodium dodecyl sulphate (SDS), Natri axetat, etanol 100%,

etanol 70%, Clorofoc:isoamyalcohol (24:1), agarose, ethydium bromide

(EtBr),...

Hóa chất dùng trong khi thực hiện phản ứng PCR gồm: 4 loại

deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP), MgCl2 và Taq polymerase

(Fermentas), primer được tổng hợp từ công ty Sigma

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị sử dụng thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh và kỹ thuật di truyền và

phòng thí nghiệm công nghệ cao thuộc Viện công nghệ Sinh học-công nghệ thực

phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội, bao gồm:

Các loại cân điện tử

Nồi khử trùng (Nhật bản)

Tủ cấy vô trùng

Máy khuấy trộn Vontex (Rotolab, OSI)

Micropipet các loại (Biohit)

Máy đo pH (Mettler Toledo)

Máy ổn nhiệt

Máy li tâm (Eppendorf, CHLB Đức)

Máy li tâm lạnh (Avanti TM 30 Centifuge Beckman)

Hệ thống điện di (Bio-Rad)

Bộ điện di DNA (Advance Tech, Nhật bản)

Máy soi chụp ảnh gel.


61


Máy PCR Biorad, USA.

Tủ lạnh sâu -20oC, -85oC (Sanyo, Nhật bản)

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp phân lập

Để tiến hành phân lập các chủng nấm mốc, sử dụng môi trường Czapek với

thành phần:

NaNO3 : 3 g KH2PO4 : 1 g

MgSO47H2O : 0,5 g KCl : 0,5 g

FeSO4 : 0,01 g Saccharose : 30 g

Cao nấm men : 5 g Aga : 20 g

Nước : 1000 ml,

thanh trùng ở điều kiện nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phút.

Các mẫu phân lập được nghiền bằng cối vô trùng sau đó hòa tan bằng nước

cất thanh trùng. Pha loãng rồi hút khoảng 100 µl dịch, trang đều trên mặt thạch.

Nuôi ở 30oC trong thời gian 48 giờ. Sau đó chuyển các chủng nấm mốc có khuẩn

lạc riêng rẽ vào các ông nghiệm thạch nghiêng của môi trường Czapek.

2.2.2. Xác định hoạt tính xylanase trên môi trường đặc

Chủng nấm mốc được cấy chấm điểm trên môi trường Czapek trong đó

saccharose được thay thế bằng xylan với hàm lượng 2 g/l. Nuôi ở 30oC trong 3 ngày

sau đó sử dụng lugol và congo đỏ để xác định đường kính thủy phân của enzym

xylanase. Các chủng nấm mốc được lựa chọn dựa vào tỷ lệ giữa đường kính phân

hủy cơ chất và đường kính khuẩn lạc.


61


2.2.3. Xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp DNS

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với

thuốc thử axit dinitro salicylic. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với

nồng độ đường khử. Biết được mật độ quang của dung dịch đường khử nghiên cứu,

dựa vào đồ thị chuẩn xylose với thuốc thử này suy ra hàm lượng đường khử của

dịch nghiên cứu.

Từ hàm lượng đường khử ta suy ra được hoạt độ của endo-β-1,4-xylanase

với cơ chất là xylan 0,5% pha trong đệm citrate pH=4,5. Phản ứng enzym được tiến

hành ở 50oC trong 15 phút.

“Một đơn vị hoạt độ của enzym xylanase được định nghĩa là lượng enzym có khả

năng thủy phân xylan tạo 1 µmol xylose trong thời gian 1 phút ở điều kiện 50oC”.

y = 0.0036x + 0.1942

R2 = 0.9977

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 100 200 300 400 500 600

Nồng độ đường xylose (micromol/ml)

OD

540

nm

Hình 6. Đường chuẩn xylose theo phản ứng DNS


61


Công thức tính hoạt độ enzym xylanase:

H = (U/ml)

Trong đó H: hoạt độ enzym xylanase, U/ml

ODtn: giá trị OD của mẫu thí nghiệm đo ở bước sóng 540nm

ODkc: giá trị OD của mẫu kiểm chứng đo ở bước sóng 540nm

0,0036: hệ số của đường chuẩn

15: thời gian phản ứng, phút

0,1: lượng dịch enzym tham gia phản ứng, ml

f: hệ số pha loãng dịch enzym

2.2.4. Phương pháp định tên nấm mốc

Định tên theo phương pháp xác định hình thái:

Nuôi nấm mốc trên môi trường Czapek, quan sát màu sắc bào tử, đặc điểm

khuẩn lạc bằng mắt thường và quan sát hệ sợi, bào tử dưới kính hiển vi quang học

Định tên theo phương pháp sinh học phân tử:

Khuếch đại đoạn DNA chứa vùng ITS1 – 5,8S – ITS2. Trong đó ITS1 là

đoạn DNA nằm giữa vùng gen mã hoá protein 18S và 5,8S của ribosom, 5,8 S là

đoạn gen mã hoá protein 5,8S còn ITS2 là đoạn DNA nằm giữa vùng gen mã hoá

protein 5,8S và 28S của ribosom. ITS1 và ITS2 là đoạn rất biến đổi đối với các loài

khác nhau nên có thể dựa vào trình tự của nó mà xác định được loài nấm mốc


61


2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA

Nguyên tắc:

Tách chiết được DNA cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ liên kết của các

protein với DNA. Và khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzym phân hủy

DNA.

Các bước tiến hành:

Nấm mốc nuôi thu sinh khối trên môi trường lỏng 48 giờ

Cân 0,2-0,3 gam sinh khối nấm mốc. Bổ sung 1ml đệm lysis (100mM

Tris-HCl pH 8, 10mM EDTA, 2% SDS, 1% β-mecaptoethanol, 100µg

protease K)

Ủ ở 65oC trong 1 giờ.

Thêm NaCl 5M để đạt nồng độ NaCl là 0,7M. Thêm CTAB 10% với

thể tích bằng 1/10 dịch

Ủ ở 65oC trong 30 phút.

Cho hỗn hợp Clorofom:Isoamyl alcohol (24:1) vào dịch với tỷ lệ 1:1

Ly tâm ở 13000 rpm/10 phút

Thu dịch nổi

Cho isopropanol vào với tỷ lệ 1:1

Ly tâm ở 13000 rpm/30 phút

Rửa bằng ethanol 70%. Ly tâm ở 13000rpm/ 10 phút

Làm khô

Hòa tan trong 50µl TE (10mM Tris, 1mM EDTA)


61


2.2.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tắc:

Việc phân ly dựa trên độ lớn và hình thái các chất, trong điện trường, do tích

điện âm nên các phân tử DNA dịch chuyển về phía anode (cực dương) với tốc độ tỉ

lệ nghịch với khối lượng phân tử. Vì vậy, Các đoạn DNA càng lớn thì dịch chuyển

càng chậm sau một khoảng thời gian di chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân

tử có kích thước (trọng lượng) khác nhau sẽ tách xa vị trí bắt đầu di chuyển những

khoảng khác nhau. Do đó, chúng được tách nhau ra. Ta có thể phát hiện được chúng

nhờ kỹ thuật nhuộm EtBr.

Qui trình (cho gel agarose 1%)

Cân 1g agarose cho vào 100 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan

hoàn toàn. Để nguội 45-50oC rồi đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị

sẵn. Sau 20-30 phút, khi gel đã trùng hợp hoàn toàn thì chuyển khay

chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện

di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 1-2 mm

Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn với đệm mẫu 6X và tra vào các giếng

trên gel

Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối

với bộ nguồn với chế độ chạy 100V và 90mA

Nhuộm gel: Bản gel sau khi chạy điện di xong được nhuộm trong dung

dịch EtBr 0,5 g/ml trong 5-10 phút, rửa lại bằng nước trước khi soi gel

Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, DNA sẽ được phát sáng nhờ

liên kết với EtBr


61


2.2.7. Phương pháp khuếch đại một đoạn DNA bằng phản ứng PCR

Nguyên tắc:

Taq polymerase là một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt được dùng để

tổng hợp các đoạn DNA trong môi trường có 4 loại dNTPs (dATP, dCTP, dGTP,

dTTP) và 2 primer trên khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa

biết trình tự.

Tiến hành:

Thành phần của phản ứng PCR chuẩn với thể tích phản ứng 100 µl là:

DNA khuôn (105 – 106 phân tử)

50 pmol mỗi mồi

200 µmol mỗi dNTP

2U Taq polymerase

1,5 mM MgCl2

50mM KCl, 10mM Tris HCl (pH 8.4)

Nước đề ion

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chuẩn:

Biến tính ở chu kỳ đầu ở 94oC trong 5 phút. Các chu kỳ sau biến tính

trong 1 phút

Bắt cặp mồi ở nhiệt độ khoảng 50oC – 60oC trong 30 giây

Kéo dài ở 72oC trong 1,5 phút

Thực hiện 25 – 40 chu kỳ. Chu kỳ cuối thực hiện ở 72oC trong 5 phút. Kết thúc

phản ứng hạ nhiệt độ xuống 4oC.

2.2.8. Phương pháp tinh sạch một đoạn DNA

Cho vào ống eppendoff 1,5mL 50µL sản phẩm phản ứng PCR:

- 5µL CH3COONa 3M, pH 4,6

- 100 µL ethanol 95%


61


Vortex hỗn hợp rồi đặt ở -20oC trong 30 phút để kết tủa sản phẩm

PCR.

Ly tâm mẫu ở tốc độ 13.000 rpm trong 20 phút

Loại bỏ dịch nổi

Rửa với ethanol 70%

Làm khô

Hòa tan lại trong 50µL nước.

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nhằm tách dòng được gen mã hoá enzym xylanase có hoạt tính cao, quá trình

nghiên cứu thực hiện qua các bước theo sơ đồ hình 7.


61


Hình 7. Sơ đồ quy trình thí nghiệm

Nấm mốc là vi sinh vật nhân chuẩn nên trong bộ gen có chứa các intron. Vì

vậy, trong các nghiên cứu thường tiến hành tách dòng gen bằng việc tách chiết

RNA và khuếch đại gen mong muốn bằng phản ứng RT-PCR. Đối với gen mã hoá

enzym xylanase cũng như vậy, trong gen này có chứa một intron ở giữa. Tuy nhiên


Phân lập, tuyển chọn chủng

Phân lập, tuyển chọn chủng

Định tênĐịnh tên

Xác định động học STH xylanase

Xác định động học STH xylanase

Tách chiết DNA, RNATách chiết DNA, RNA

Thiết kế mồiThiết kế mồi

Giải trình tựGiải trình tự

Dùng PCR, RT-PCR để KĐ gen xylanase

Dùng PCR, RT-PCR để KĐ gen xylanase

61


trong nghiên cứu này, tôi muốn đi theo một hướng tiếp cận khác để tách dòng gen

mã hoá enzym xylanase từ nấm mốc. Đó là tách dòng từ chính genom của nấm mốc

bằng phản ứng PCR. Vì việc tách dòng gen từ genom bằng phản ứng PCR là một

phương pháp tiết kiệm chi phí về hoá chất và đơn giản hơn so với việc tách dòng từ

RNA. Với định hướng biểu hiện trong chủng nấm mốc mà tiến hành tách dòng nên

việc có intron trong gen không phải là trở ngại. Hơn nữa với một intron trong gen,

nếu muốn ta dễ dàng loại bỏ bằng phản ứng PCR.

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT

TÍNH XYLANASE CAO

Có 3 nguồn để phân lập nấm mốc đó là gỗ mục, đất tại hồ xử lý nước thải

nhà máy giấy, và mốc tương. Ở đây tôi chọn nguồn mốc tương để phân lập xuất

phát từ thực tế rằng bất kỳ thành tế bào của tế bào thực vật nào cũng có chứa xylan

(hemicellulose), do đó mốc tương muốn sinh trưởng thì cần phải có enzym xylanase

để phân huỷ thành tế bào thực vật.

Từ 7 mẫu đã phân lập được 28 chủng nấm mốc trên môi trường Czapek đặc

với cách tiến hành đã trình bày ở phần phương pháp phân lập. 28 chủng này được

chọn lọc trên môi trường Czapek đặc trong đó saccharose được thay thế bằng xylan

với hàm lượng 2 gam/lít. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.

Bảng 4. Đặc tính của các chủng nấm mốc đã được phân lập

Chủng Nguồn phân lập Mầu sắc bào tử Tỷ lệ D/d


61


B1 Mốc tương Bần Màu xanh lá cây 1,21

B2 Mốc tương Bần Màu xám 1,20

B3 Mốc tương Bần Màu xám đen 1,11

B4 Mốc tương Bần Màu xám xanh 1,14

B5 Mốc tương Bần Màu vàng xanh 1,24

B6 Mốc tương Bần Màu vàng xanh 1,38

B7 Mốc tương Bần Mầu đen 1,44

B8 Mốc tương Bần Mầu trắng 1,43

B9 Mốc tương Bần Mầu vàng 1,41

M1 Gỗ mục Màu xanh 1,26

M2 Gỗ mục Màu xám 1,20

M3 Gỗ mục Màu nâu 1,05

C1 Gỗ mục Màu đen 1,54

C2 Gỗ mục Màu trắng 1,16

C3 Gỗ mục Màu vàng xanh 1,20

C4 Gỗ mục Màu xám xanh 1,05

C5 Gỗ mục Màu vàng xám 1,33

C6 Mẫu gỗ mục Màu xanh đậm 1,17


61


C7 Mẫu gỗ mục Màu xanh nhạt 1,11

N1 Nước thải Màu vàng 1,39

N2 Nước thải Màu xanh nhạt 1,28

N3 Nước thải Màu xám 1,12

N4 Nước thải Màu vàng xám 1,25

N5 Nước thải Màu sẫm 1,41

N6 Nước thải Màu vàng xanh 1,05

N7 Nước thải Màu đen 1,12

N8 Nước thải Màu nâu 1,06

N9 Nước thải Màu xanh đậm 1,15

Trong đó D: đường kính thủy phân (mm)

d: đường kính khuẩn lạc (mm)


61


Hình 8. Hình ảnh vòng thủy phân của chủng C1 và B7

Từ kết quả trên, chọn 2 chủng có tỷ lệ D/d cao nhất là B7 và C1 có bào tử

màu đen với tỉ lệ D/d tương ứng cao nhất là 1,44 và 1,54. Tỷ lệ D/d thể hiện khả

năng sinh enzym xylanase của các chủng nấm mốc. Tỷ lệ D/d càng cao có thể phần

nào chứng tỏ chủng nấm mốc có khả năng sinh xylanase với hoạt tính cao. Kết quả

tuyển chọn này khá lý thú vì chủng có tỷ lệ D/d cao thứ hai đó là chủng B7, một

chủng có nguồn gốc từ mốc tương Bần – đây là nguồn phân lập rất mới mẻ mà ít

người nghĩ rằng lại có thể thu được một chủng nấm mốc có khả năng sinh enzym

xylanase cao. Việc chọn lựa 2 chủng này ngoài lý do tỷ lệ D/d cao còn vì cả 2

chủng này đều có bào tử mầu đen, rất có thể thuộc loài Aspergillus niger. Bởi vì các

nghiên cứu trên thế giời đã chỉ ra rằng Aspergillus niger là loài có khả năng sinh

tổng hợp xylanase có hoạt tính khá tốt [34].

3.2. ĐỘNG HỌC SINH TỔNG HỢP ENZYM XYLANASE CỦA

CHỦNG C1 VÀ B7

Tiến hành nuôi hai chủng C1 và B7 trong môi trường Czapek, thay thế

đường saccharose bằng xylan 0,2% ở 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau các


C1 B7

61


khoảng thời gian 1, 2, 3, 4 và 5 ngày, thu mẫu và xác định hoạt độ. Kết quả thể hiện

ở hình 9.

0

100

200

300

400

500

600

0 1 2 3 4 5 6Thời gian (ngày)

Ho

ạt

độ

xy

lan

as

e (

U/m

l)

Chủng B7

Chủng C1

Hình 9. Động học sinh tổng hợp xylanase từ chủng C1 và B7

Kết quả động học sinh tổng hợp xylanase của hai chủng C1 và B7 (hình 9)

cho thấy hai chủng có khả năng sinh enzym xylanase khá cao. So với các chủng

nấm mốc đã được nghiên cứu trên thế giới thì hoạt độ thu được ở mức trên trung

bình. Đa số các chủng nấm mốc có hoạt độ vào khoảng 300 U/ml. Chỉ có một số ít

các chủng có hoạt độ cao khoảng 1000U/ml. Tuy nhiên 2 chủng nấm mốc chọn

được có hoạt tính rất tốt bởi chúng sinh tổng hợp xylanase đạt 520,24 U/ml (chủng

C1) và 323,96 U/ml (chủng B7) khi chưa được tối ưu điều kiện sinh enzym. Hoạt

độ thu được có thể sẽ cao hơn nữa nếu chúng ta tiếp tục nghiên cứu để tối ưu điều

kiện sinh tổng hợp enzym của chủng.


520,24 U/ml

323,96 U/ml

61


Thường thì với nấm mốc hoạt độ cao nhất của enzym được thu nhận sau 3

ngày. Tuy nhiên, với xylanase là một ngoại lệ, người ta thường thu được hoạt độ

xylanase cao nhất từ nấm mốc sau 2 ngày nuôi cấy [35].

Việc xác định động học sinh tổng hợp xylanase không chỉ giúp đánh giá sơ

bộ khả năng sinh xylanase của chủng nấm mốc nghiên cứu mà nó còn là dữ liệu

quan trọng để xác định thời gian thu sinh khối trong trường hợp muốn tách chiết

RNA để tách dòng gen mã hoá xylanase.

3.3. ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOI HÌNH THÁI

Hai chủng nấm mốc được nuôi trên môi trường Czapek đặc để quan sát đặc

điểm hình thái dưới mắt thường và dưới kính hiển vi. Để quan sát màu sắc và hình

thái khuẩn lạc ta tiến hành cấy chấm điểm trên môi trường rắn, nuôi ở 25oC để tiến

hành quan sát. Còn để quan sát dưới kính hiển vi, ta lấy bào tử của 2 chủng C1 và

B7 hoà vào trong nước cất thanh trùng rồi lấy dịch trang đều trên mặt môi trường

đặc. Sau đó đặt các vòng bằng sợi kim loại nhỏ lên trên. Sau khoảng 2 ngày nuôi ở

30oC khi hệ sợi nấm đã phát triển bao phủ lên vòng kim loại và tạo bào tử, lấy vòng

kim loại ra, đặt dưới kính hiển vi quang học để quan sát đặc điểm, kích thước hệ sợi

nấm và bào tử. Hình 10 và 11 là hình dạng của chủng C1 và B7 khi soi dưới kính

hiển vi.


61


Hình 10. Hình ảnh bào tử của chủng C1 dưới kính hiển vi quang học có độ phóng

đại 400 lần

Hình 11. Hình ảnh bào tử của chủng B7 dưới kính hiển vi quang học có độ phóng

đại 400 lần.


61


Cả 2 chủng đều có đặc điểm:

Khuẩn lạc trên môi trường Czapek có đường kính 4,5 -5,5 cm sau 7

ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25ºC.

Khuẩn lạc xốp nhẹ, mặt trước có màu đen nâu, mặt trái không màu

đến màu vàng nhạt.

Cuống sinh bào tử trần có kích thước120-1010µm x 4,0µm, nhẵn.

Bọng cầu hoặc gần cầu có d = 30-50µm.

Chổi 2 tầng, cuống thể bình 12-15µm x 6-7,5µm, thể bình 5-12µm x

3-3,7µm.

Bào tử cầu hoặc gần cầu, gai, ráp, d = 5-6 µm.

Trên đây là những đặc điểm quan trọng để có thể xác định một cách sơ bộ:

hai chủng C1 và B7 thuộc loài Aspergillus niger. Việc định tên bằng phương pháp

soi hình thái này có độ chính xác không cao do phải phụ thuộc vào trình độ và kỹ

năng của người quan sát. Tuy nhiên, việc định tên sơ bộ lại rất cần thiết để biết một

cách sơ bộ về chủng mà ta đang nghiên cứu. Và việc định tên bằng phương pháp

sinh học phân tử là cần thiết để biết chính xác tên loài của chủng sẽ tiến hành

nghiên cứu.

3.4. ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

3.4.1. Tách chiết DNA tổng số

Nuôi nấm mốc trong môi trường Czapek lỏng. Sau 48 giờ, thu sinh khối và

tách chiết DNA tổng số, tiến hành điện di trên gel agarose. Kết quả thể hiện ở hình

12:


61


Hình 12. Điện di đồ của DNA tổng số của C1 và B7

Kết quả điện di cho thấy đã tách chiết thành công DNA tổng số từ hai chủng

nấm mốc C1 và B7.

3.4.2. Khuếch đại đoạn ITS1-5,8S-ITS2 bằng phản ứng PCR

Đoạn ITS1 – 5,8S – ITS2 được khuếch đại bằng cặp mồi mà nhiều nghiên

cứu tiến hành để định tên loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus là:

ITS 1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3';

ITS 4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-3'.

Thực hiện phản ứng PCR với các thành phần phản ứng thể hiện ở bảng 5.


B7 C1

61


Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại đoạn ITS1 – 5,8S – ITS2

Hóa chất Thể tích cho 1 phản ứng 50 μl

Nước đề ion 36,2 µl

10X PCR buffer 5 µl

5mM dNTP 1 µl

Primer I (10µM) 1,5 µl

Primer II (10µM) 1,5 µl

Taq DNA Polymerase (5u/µl) 0,3 µl

25mM MgCl2 3 µl

DNA khuôn 100ng/µl 1,5 µl

Và chu trình nhiệt của phản ứng thực hiện theo bảng 6.

Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho khuếch đại đoạn ITS1-5,8S-ITS2

Nhiệt độ (oC) Thời gian

Nhiệt độ biến tính đầu 94 4 phút

Nhiệt độ biến tính ở mỗi chu kỳ 95 30 giây

Nhiệt độ bắt cặp mồi 50 30 giây

Nhiệt độ kéo dài 72 60 giây

Nhiệt độ kéo dài ở chu kỳ cuối 72 8 phút


61


Phản ứng PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ. Kết thúc phản ứng hạ nhiệt

độ xuống 4oC. Lấy 7 µl sản phẩm điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thể hiện ở

điện di đồ hình 13:

Hình 13. Điện di đồ sản phẩm của phản ứng PCR của chủng C1 và B7

Đoạn DNA mà cặp mồi ITS1 và ITS4 khuếch đại có chứa vùng ITS1-5,8S-

ITS2 của nấm mốc Aspergillus có độ dài khoảng 620 bp, trên bảng điện di thấy rằng

đoạn được nhân lên có kích thước nhỏ hơn 700 bp và lớn hơn 600 bp. Do đó có thể

nhận định rằng đoạn DNA chứa vùng ITS1-5,8S-ITS4 đã được khuếch đại. Muốn

biết chính xác hơn cần tiến hành giải trình tự của sản phẩm của phản ứng PCR này.

3.4.3. Giải trình tự đoạn được khuếch đại và phân tích trình tự

Sản phẩm của phản ứng PCR được tinh sạch theo phần phương pháp tinh

sạch DNA và tiến hành giải trình tự tại viện Công nghệ Sinh học Việt Nam. Kết quả

giải trình tự:


600bp

B7C1

700bp

61


Của chủng B7:

ggatcattaccgagtGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTA

TTGTACCCTGTTGCTccTGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGG

GGCGCCTCTtCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGA

ACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAA

AACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGT

CTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTC

CGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGT

CCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCG

TCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGG

CCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGG

ATCAGGTagggATACCCGCTGAA

Kết quả giải trình tự sản phẩm phản ứng PCR từ chủng B7 ta biết trình tự

một đoạn dài 553 bp. Ta nhận thấy trình tự xác định được ngắn hơn sản phẩm của

phản ứng PCR khi tiến hành điện di trên gel agarose để xác định kích thước. Điều

này là do khi giải trình tự đoạn đầu và đoạn cuối có nhiễu khiến không thể xác định

được trình tự hai đầu của sản phẩm PCR.

Trong 553 bp của đoạn DNA được giải trình tự ở trên thì đoạn trình tự có ký

hiệu bằng chữ màu đỏ là đoạn ITS1(dài 186 bp), đoạn tiếp theo có ký hiệu bằng chữ

màu xanh là đoạn 5,8S (dài 156 bp) và đoạn có ký hiệu bằng chữ màu tím là đoạn

ITS2(dài 169 bp). Kiểm tra độ tương đồng trên ngân hàng gen thế giới bằng chương

trình Blast của cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy độ tương đồng của cả 3 đoạn ITS1 –

5,8 S – ITS2 so với các chủng thuộc loài Aspergillus niger là 99,2%. Hình 14 là kết

quả so sánh độ tương đồng của đoạn DNA tách được từ chủng B7 với đoạn DNA

ITS1-5,8S-ITS2 của chủng Aspergillus niger W04-151.


61


gb|EU821304.1| Aspergillus niger strain W04-151 internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequenceLength=515

Score = 908 bits (1006), Expect = 0.0 Identities = 508/511 (99%), Gaps = 0/511 (0%) Strand=Plus/Plus

Query 1 CCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTCCT 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 1 CCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCG 60

Query 61 GCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCgggggggCGCCTCTTCCCCCCGGGCCCGTGCCCGC 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||Sbjct 61 GCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGC 120

Query 121 CGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATC 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 121 CGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATC 180

Query 181 AGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 181 AGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT 240

Query 241 GCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGC 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 241 GCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGC 300

Query 301 GCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGC 360 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 301 GCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGC 360

Query 361 TTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCA 420 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 361 TTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCA 420

Query 421 CCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGC 480 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 421 CCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGC 480

Query 481 CTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGG 511 |||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 481 CTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGG 511

Hình 14. So sánh độ tương đồng giữa đoạn ITS1-5,8S-ITS2 của chủng B7 với chủng Aspergillus niger W04-151 (Query: trình tự ITS1-5,8S-ITS2 của chủng B7; Sbjct: trình

tự: ITS1-5,8S-ITS2 của chủng Aspergillus niger W04-15)

Với đoạn ITS2 và 5,8S thì độ tương đồng là 100%, không có sự khác biệt ở

bất kỳ một nucleotide nào so với đoạn trình tự tương ứng của các chủng thuộc loài


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=213866869&dopt=GenBank&RID=2GDHPMYX01R&log$=nuclalign&blast_rank=4

61


Aspergillus niger trên ngân hàng gen thế giới. Còn đoạn trình tự ITS1 thi có 3

nucleotide khác so với đoạn trình tự tương ứng của các chủng thuộc loài Aspergillus

niger (độ tương đồng là 98,4%). Điều này chứng tỏ chủng B7 thuộc loài Aspergillus

niger.

Của chủng C1:

atcattaccgagtGCGGGTCctttgggcccaacctcccatccgtgtctattgtaccctgtt

gcttcggcgggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctctgccccccgggcccg

tgcccgccggagaccccaacccgaacactgtctgaaagcgtccagtctgagttgattgaa

tgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcag

cgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcac

attgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcc

cggcttgtgtgttcggtcgccgtccccctctccgggtggacgggcccgaaaggcagcggc

ggcaccgcgtccgatcctcgagcgtaaggggctttgtcacatgctctgtaggattggccgg

cgcctgccgacgttttccaaccattctttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccg

ctgaacttaa






gb|EU821304.1| Aspergillus niger strain W04-151 internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequenceLength=515



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=213866869&dopt=GenBank&RID=2GEAKVXV014&log$=nuclalign&blast_rank=4

61


Query 1 CCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCG 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1 CCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCG 60

Query 61 GCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCgggggggCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGC 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 61 GCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGC 120

Query 121 CGGAGACCCCAACCCGAACACTGTCTGAAAGCGTCCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATC 180 ||||||||||||| |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||Sbjct 121 CGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATC 180

Query 181 AGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 181 AGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT 240

Query 241 GCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGC 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 241 GCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGC 300

Query 301 GCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGC 360 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 301 GCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGC 360

Query 361 TTGTGTGTTCGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGTGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCA 420 ||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||Sbjct 361 TTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCA 420

Query 421 CCGCGTCCGATCCTCGAGCGTAAGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGC 480 |||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 421 CCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGC 480

Query 481 CTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGG 511 |||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 481 CTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGG 511

Hình 15. So sánh độ tương đồng giữa đoạn ITS1-5,8S-ITS2 của chủng C1 với

chủng Aspergillus niger W04-151 (Query: trình tự ITS1-5,8S-ITS2 của chủng C1;

Sbjct: trình tự: ITS1-5,8S-ITS2 của chủng Aspergillus niger W04-15)

Trong 541 bp của đoạn DNA được giải trình tự ở trên thì đoạn trình tự có ký

hiệu bằng chữ màu đỏ là đoạn ITS1(dài 186 bp), đoạn tiếp theo có ký hiệu bằng chữ

màu xanh là đoạn 5,8S (dài 156 bp) và đoạn có ký hiệu bằng chữ màu tím là đoạn

ITS2 (dài 169 bp). Kiểm tra độ tương đồng trên ngân hàng gen thế giới bằng

chương trình Blast của cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy độ tương đồng của cả 3 đoạn


61


ITS1 – 5,8 S – ITS2 so với các chủng thuộc loài Aspergillus niger là 99%. Hình 15

là kết quả so sánh độ tương đồng của đoạn DNA tách được từ chủng C1 với đoạn

DNA ITS1-5,8S-ITS2 của chủng Aspergillus niger W04-151. Với đoạn ITS1 độ

tương đồng là 98,9% (có 2 nucleotide khác so với các chủng thuộc loài Aspergillus

niger). Với 5,8S thì độ tương đồng là 100%, không có sự khác biệt ở bất kỳ một

nucleotide nào so với đoạn trình tự tương ứng của các chủng thuộc loài Aspergillus

niger trên ngân hàng gen thế giới. Còn đoạn trình tự ITS2 thì có 3 nucleotide khác

so với đoạn trình tự tương ứng của các chủng thuộc loài Aspergillus niger (độ tương

đồng là 98,2%). Điều này chứng tỏ chủng C1 thuộc loài Aspergillus niger.

3.5. THIẾT KẾ ĐOẠN MỒI ĐỂ TÁCH DÒNG GEN MÃ HOÁ

XYLANASE

Xylanase của nấm mốc là một isozyme, trong đó enzym có khối lượng phân

tử khoảng 21kDa đến 24kDa là loại phổ biến và có hoạt tính cao. Vì vậy tôi định

hướng sẽ tách dòng gen mã hoá xylanase loại có khối lượng khoảng 21 kDa đến 24

kDa. Để thiết kế mồi cho đoạn gen mã hoá xylanase này đầu tiên cần lấy các trình

tự gen mã hoá xylanse trên ngân hàng gen thế giới. Vì đã định tên được 2 chủng

nấm mốc dùng để tiến hành tách dòng thuộc loài Aspergillus niger cho nên tôi đã

tìm các trình tự gen của các chủng nấm mốc Aspergillus niger để tiến hành phân

tích độ tương đồng của đoạn gen mã hoá xylanase.

Sau khi tiến hành phân tích độ tương đồng nhận thấy: với gen mã hóa enzym

xylanase có một trở ngại đó là: vùng trong gen thì rất bảo thủ, nhưng vùng bên

ngoài gen lại rất biến đổi. Hơn nữa khi thiết kế mồi cần phải chú ý thoả mãn các

điều kiện như:

Độ dài của mồi nên trong khoảng 18 – 22 bp. Nếu ngắn quá thì tính đặc

hiệu sẽ giảm, còn nếu dài quá thì mồi khó bắt cặp.


61


Nhiệt độ biến tính của mồi tốt nhất trong khoảng từ 52oC – 58oC, nó ảnh

hưởng tới nhiệt độ bắt cặp của mồi. Nếu nhiệt độ biến tính cao sẽ làm

nhiệt độ bắt cặp mồi cao, điều này làm giảm khả năng gắn mồi, làm giảm

lượng sản phẩm của phản ứng PCR. Còn nếu nhiệt độ biến tính của mồi

thấp sẽ làm nhiệt độ bắt cặp mồi thấp là nguyên nhân gây lỗi.

Trong mồi tốt nhất nên chứa 50 – 60% (G+C) để làm liên kết giữa mồi

với khuôn tốt và đảm bảo về nhiệt độ bắt cặp.

Đầu 3’ của mồi nên có G hoặc C hoặc CG hay GC để làm tăng khả năng

liên kết đặc hiệu ở đầu 3’

Mồi phải không tự tạo vòng, tự bắt cặp và bắt cặp bổ sung với nhau

Không có đoạn trình tự lặp của 2 nucleotide như: ATATATAT,… vì như

vậy sẽ gây bắt cặp nhầm

Nhiệt độ bắt cặp của 2 mồi tốt nhất không nên chênh nhau quá 3oC

Với các điều kiện đặt ra như trên tôi đã thiết kế được cặp mồi để khuếch đại

toàn bộ đoạn gen mã hoá xylanase:

Primer 1: 5’-ATGCTCACGACGAACCTTCTC-3’

Primer 2: 5'-TCACTGAACAGTGATGGAGGAAG-3'

3.6. KHUẾCH ĐẠI GEN MÃ HOÁ XYLANSE

Thực hiện tối ưu các thành phần nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA khuôn

cho phản ứng phản ứng PCR ở điều kiện:

Với nồng độ MgCl2: 1mM; 1,5mM; 2mM; 2,5mM; 3mM

Hàm lượng DNA khuôn: 1ng; 10ng; 100ng; 500ng; 1000ng

Kết quả phản ứng PCR thực hiện thành công ở điều kiện nồng độ MgCl2: 2mM và

DNA khuôn: 100ng. Thành phẩn của phản ứng PCR thể hiện ở bảng 7:


61


Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hoá xylanase

Hóa chất Thể tích cho 1 phản ứng 25 μl

Nước PCR 16,3 µl

10X PCR buffer 2,5 µl

5mM dNTP mix 1 µl

Primer I (10µM) 1 µl

Primer II (10µM) 1 µl

Taq DNA Polymerase (5u/µl) 0,2 µl

25mM MgCl2 2 µl

DNA khuôn 100ng/µl 1 µl

Tối ưu chu trình nhiệt của phản ứng PCR ở các nhiệt độ 49oC, 50oC, 51oC kết

quả cho thấy ở 51oC sản phẩm tạo ra rất ít còn ở nhiệt độ 49oC thì sản phẩm điện di

chứng tỏ không đặc hiệu. Phản ứng được thực hiện trong 30 chu kỳ. Chu trình nhiệt

của phản ứng thể hiện ở bảng 8.

Bảng 8. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen mã hoá xylanase

Nhiệt độ (độ C) Thời gian

Nhiệt độ biến tính đầu 94 4 phút

Nhiệt độ biến tính ở mỗi chu kỳ 95 30 giây


61


Nhiệt độ bắt cặp mồi 50 45 giây

Nhiệt độ kéo dài 72 45 giây

Nhiệt độ kéo dài ở chu kỳ cuối 72 8 phút

Sau phản ứng PCR, sản phẩm được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thể hiện ở

hình 16:

Hình 16. Điện di đồ sản phẩm của phản ứng PCR

Đoạn gen mã hóa enzym xylanase có kích thước khoảng 746 bp, mà trên điện

di đồ cho thấy sản phẩm của phản ứng PCR có kích thước lớn hơn 700bp và nhỏ

hơn 800 bp. Chính vì vậy có thể nhận định rằng đoạn gen mã hóa enzym xylanase

đã được khuếch đại. Muốn biết chính xác hơn cần tiến hành giải trình tự của sản

phẩm của phản ứng PCR này.


B7

700 bp

800 bp

C1

61


3.7. GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ĐÃ ĐƯỢC KHUẾCH ĐẠI VÀ

KIỂM TRA ĐỘ TƯƠNG ĐỒNG TRÊN NGÂN HÀNG GEN THẾ GIỚI

Phản ứng PCR được tiến hành tinh sạch sau đó gửi đến viện Công nghệ Sinh

học Việt Nam để giải trình tự

Đoạn gen được giải khuếch đại từ chủng B7 có trình tự:

CTGCTGCGCCGCTAGGCTGCTCTGGGTGTTCCCCACGACTCTGTCGCC

CAGCGTTCGGATGCCTTGCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCGAGC

TCGACCGGCGAGAACAACGGCTTCTACTACTCCTTCTGGACCGACGGC

GGGGGCGACGTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTACACTGT

TGAGTGGTCCAACGTGGGCAACTTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACC

CCGGAAGTGCGCAGTAAGTTAATCATCCTCACACTATCTCTTTAAAGGA

TCCAATAAAACGATTACTCACATCATCTCCAGGGACATCACCTACAGGG

GCACCTTCACCCCTAGCGGCAACGGCTATCTCTCCGTCTATGGCTGGA

CCACTGACCCCCTGATCGAGTACTACATCGTCGAGTCCTACGGCGACT

ACGACCCCGGCAGTGGAGGCACATACAAGGGCACCGTCACCTCGGAC

GGATCCGTTTACGATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCTGCTTCCA

TTCAGGGAACCGCTACCTTCACTCAATACTGGTCCGTCCGCCAGAACA

AGAGAGTTGGCGGAACTGTTACCACCTCCAACCACTTCAATGCTTGGG

CTAAGCTGAGAATGAACCTGGGTACTCACAACTACCAGATCGTGGCTA

CCGAGGGCTACAAG







61


Kiểm tra độ tương đồng trên ngân hàng gen thế giới bằng chương trình Blast

của cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy độ tương đồng của đoạn gen được giải trình tự lên

đến 98% so với đoạn gen mã hóa enzym xylanase của các chủng nấm mốc

Aspergillus niger đã được công bố trên thế giới. Hình 17 là kết quả so sánh độ

tương đồng của đoạn DNA tách được từ chủng B7 với đoạn gen mã hoá enzym

xylanase của loài Aspergillus niger được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI với mã

số EU423881.1.

gb|EU423881.1| Aspergillus niger xylanase B (xynB) gene, complete cdsLength=746

Score = 1175 bits (1302), Expect = 0.0 Identities = 670/681 (98%), Gaps = 1/681 (0%)


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=168481218&dopt=GenBank&RID=2GNMN6DG016&log$=nuclalign&blast_rank=3

61


Strand=Plus/Plus

Query 7 CGCCGCTA-GGCTGCTCTGGGTGTTCCCCACGACTCTGTCGCCCAGCGTTCGGATGCCTT 65 ||| |||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 33 CGCGGCTAAGGCTGCTCTGGCTGTTCCCCACGACTCTGTCGCCCAGCGTTCGGATGCCTT 92

Query 66 GCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCGAGCTCGACCGGCGAGAACAACGGCTTCTACTA 125 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 93 GCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCGAGCTCGACCGGCGAGAACAACGGCTTCTACTA 152

Query 126 CTCCTTCTGGACCGACGGCGGGGGCGACGTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTA 185 ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 153 CTCCTTCTGGACCGACGGCGGTGGCGACGTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTA 212

Query 186 CACTGTTGAGTGGTCCAACGTGGGCAACTTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGAAG 245 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 213 CACTGTTGAGTGGTCCAACGTGGGCAACTTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGAAG 272

Query 246 TGCGCAGTAAGTTAATCATCCTCACACTATCTCTTTAAAGGATCCAATAAAACGATTACT 305 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 273 TGCGCAGTAAGTTAATCATCCTCACACTATCTCTTTAAAGGATCCAATAAAACGATTACT 332

Query 306 CACATCATCTCCAGGGACATCACCTACAGGGGCACCTTCACCCCTAGCGGCAACGGCTAT 365 ||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 333 CACATCATCTCCAGGGACATCACCTACAGCGGCACCTTCACCCCTAGCGGCAACGGCTAT 392

Query 366 CTCTCCGTCTATGGCTGGACCACTGACCCCCTGATCGAGTACTACATCGTCGAGTCCTAC 425 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 393 CTCTCCGTCTATGGCTGGACCACTGACCCCCTGATCGAGTACTACATCGTCGAGTCCTAC 452

Query 426 GGCGACTACGACCCCGGCAGTGGAGGCACATACAAGGGCACCGTCACCTCGGACGGATCC 485 |||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 453 GGCGTCTACAACCCCGGCAGTGGAGGCACATACAAGGGCACCGTCACCTCGGACGGATCC 512

Query 486 GTTTACGATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCTGCTTCCATTCAGGGAACCGCTACC 545 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 513 GTTTACGATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCTGCTTCCATTCAGGGAACCGCTACC 572

Query 546 TTCACTCAATACTGGTCCGTCCGCCAGAACAAGAGAGTTGGCGGAACTGTTACCACCTCC 605 |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 573 TTCACTCAGTACTGGTCCGTCCGCCAGAACAAGAGAGTTGGCGGAACTGTTACCACCTCC 632

Query 606 AACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCTGAGAATGAACCTGGGTACTCACAACTACCAGATC 665 ||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 633 AACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCTGGGAATGAACCTGGGTACTCACAACTACCAGATC 692

Query 666 GTGGCTACCGAGGGCTACAAG 686 |||||||||||||| ||| ||Sbjct 693 GTGGCTACCGAGGGGTACCAG 713

Hình 17. So sánh trình tự gen mã hoá enzym xylanse của chủng B7 với đoạn gen mã

hoá enzym xylanse được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI với mã số EU423881.1

(Query: trỉnh tự của đoạn gen được tách từ chủng B7; Sbjct: trình tự của đoạn gen mã hoá xylanase được

công bố)

Đoạn gen được giải khuếch đại từ chủng C1:


61


CTTGCTGGCGCCGCTCAGCTGCTCTGGGTGTTCGGCACGACTCTGTCGCC

CAGCGTTCGGATGCCTTGCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCGAGCTC

GACCGGCGAGAACAACGGCTTCTACTACTCCTTCTGGACCGACGGCGGG

GGCGACGTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTACACTGTTGAGT

GGACCAACGTGGGCAACTTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGAAG

TGCGCAGTAAGTTAATCATCCTCACACTATCTCTTTAAAGGATCCAATAAA

ACGATTACTCACATCATCTCCAGGGACATCACCTACAGCGGCACCTTCAC

CCCTAGCGGCAACGGATATCTCTCCGTCTATGGCTGGACCACTGACCCCC

TGATCGAGTACTACATCGTCAAGTCCTACGGCGACTACGACCCCGGCAGT

GGAGGCACATACAAGGGCACCGTCACCTCGGACGGATCCGTTTACGATAT

CTACACGGCTACCCGTACCAATGCTGCTTCCATTCAGGGAACCGCTACCT

TCACTCAATACTGGTCCGTCCGCCAGAACAAGAGAGTTGGCGGAACTGTT

ACCACCTCCAACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCTGAGAATGAACCTGGG

TACTCACAACTACCAGATCGTGGCTACCGAGGGC






Kiểm tra độ tương đồng trên ngân hàng gen thế giới bằng chương trình Blast

của cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy độ tương đồng của đoạn gen được giải trình tự lên

đến 97% so với đoạn gen mã hóa enzym xylanase của các chủng nấm mốc

Aspergillus niger đã được công bố trên thế giới. Hình 18 là kết quả so sánh độ

tương đồng của đoạn DNA tách được từ chủng C1 với đoạn gen mã hoá enzym

xylanase của loài Aspergillus niger được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI với mã

số EU423881.1.

gb|EU423881.1| Aspergillus niger xylanase B (xynB) gene, complete cdsLength=746


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=168481218&dopt=GenBank&RID=2GNSJY8S01S&log$=nuclalign&blast_rank=3

61



Query 6 TGGCGCCGCTCAG-CTGCTCTGGGTGTTCGGCACGACTCTGTCGCCCAGCGTTCGGATGC 64 || ||| ||| || ||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 30 TGCCGCGGCTAAGGCTGCTCTGGCTGTTCCCCACGACTCTGTCGCCCAGCGTTCGGATGC 89

Query 65 CTTGCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCGAGCTCGACCGGCGAGAACAACGGCTTCTA 124 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 90 CTTGCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCGAGCTCGACCGGCGAGAACAACGGCTTCTA 149

Query 125 CTACTCCTTCTGGACCGACGGCGGGGGCGACGTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGC 184 |||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 150 CTACTCCTTCTGGACCGACGGCGGTGGCGACGTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGC 209

Query 185 CTACACTGTTGAGTGGACCAACGTGGGCAACTTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGG 244 |||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 210 CTACACTGTTGAGTGGTCCAACGTGGGCAACTTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGG 269

Query 245 AAGTGCGCAGTAAGTTAATCATCCTCACACTATCTCTTTAAAGGATCCAATAAAACGATT 304 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 270 AAGTGCGCAGTAAGTTAATCATCCTCACACTATCTCTTTAAAGGATCCAATAAAACGATT 329

Query 305 ACTCACATCATCTCCAGGGACATCACCTACAGCGGCACCTTCACCCCTAGCGGCAACGGA 364 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 330 ACTCACATCATCTCCAGGGACATCACCTACAGCGGCACCTTCACCCCTAGCGGCAACGGC 389

Query 365 TATCTCTCCGTCTATGGCTGGACCACTGACCCCCTGATCGAGTACTACATCGTCAAGTCC 424 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||Sbjct 390 TATCTCTCCGTCTATGGCTGGACCACTGACCCCCTGATCGAGTACTACATCGTCGAGTCC 449

Query 425 TACGGCGACTACGACCCCGGCAGTGGAGGCACATACAAGGGCACCGTCACCTCGGACGGA 484 ||||||| |||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 450 TACGGCGTCTACAACCCCGGCAGTGGAGGCACATACAAGGGCACCGTCACCTCGGACGGA 509

Query 485 TCCGTTTACGATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCTGCTTCCATTCAGGGAACCGCT 544 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 510 TCCGTTTACGATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCTGCTTCCATTCAGGGAACCGCT 569

Query 545 ACCTTCACTCAATACTGGTCCGTCCGCCAGAACAAGAGAGTTGGCGGAACTGTTACCACC 604 ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 570 ACCTTCACTCAGTACTGGTCCGTCCGCCAGAACAAGAGAGTTGGCGGAACTGTTACCACC 629

Query 605 TCCAACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCTGAGAATGAACCTGGGTACTCACAACTACCAG 664 |||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 630 TCCAACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCTGGGAATGAACCTGGGTACTCACAACTACCAG 689

Query 665 ATCGTGGCTACCGAGGG 681 |||||||||||||||||Sbjct 690 ATCGTGGCTACCGAGGG 706

Hình 18. So sánh trình tự gen mã hoá enzym xylanse của chủng C1 với đoạn gen mã hoá enzym xylanse được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI với mã số

EU423881.1 (Query: trỉnh tự của đoạn gen được tách từ chủng C1; Sbjct: trình tự của đoạn gen mã hoá xylanase được công bố)

Từ kết quả phân tích trình tự tương đồng ở trên, khẳng định rằng đã khuếch

đại thành công được đoạn gen mã hóa enzym xylanase từ 2 chủng B7 và C1.


61


PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận

Từ 7 mẫu đã phân lập được 28 chủng nấm mốc. Tuyển chọn được 2 chủng là

C1 và B7 có bào tử màu đen với hoạt tính xylanase cao.


61


Định tên bằng phương pháp hình thái và phương pháp sinh học phân tử đã

xác định được chúng thuộc loài Aspergillus niger. Đã nghiên cứu động học

sinh tổng hợp xylanase của 2 chủng C1 và B7 (hoạt độ cao nhất tương ứng

của hai chủng là 520,24 và 323,96 U/ml).

Đã thiết kế được cặp mồi để khuếch đại gen xylanase, tách chiết DNA tổng

số, tối ưu được điều kiện phản ứng PCR và khuếch đại đoạn gen mã hoá

enzym xylanase từ 2 chủng C1 và B7.

Giải trình tự đoạn gen đã được khuếch đại và kiểm tra độ tương đồng trên

ngân hàng gen thế giới. Kết quả đã khẳng định tách thành công gen mã hoá

enzym xylanase từ hai chủng C1 và B7.

Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo:

Biểu hiện gen mã hoá enzym xylanase ở tế bào vật chủ eukaryote.

Tối ưu hoá điều kiện sinh tổng hợp enzym xylalnase từ biến chủng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Biely, P., Microbial xylanolytic systems, Trends in Biotechnol. 3, 286- 289,

1985.

2. Puls, J., Chemistry and biochemistry of hemicelluloses: Relationship

between hemicellulose structure and enzyms required for hydrolysis, Macromol.


61


Symp. 120, 183-196, 1997.

3. Bissoon, S., Christov, L. and Singh, S., Bleach boosting effects of

purified xylanase from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp, Process

Biochem. 37, 567-572, 2002.

4. Dervilly, G., Thibault, J. -F. and Saulnier, L., Experimental evidence for

a semi-flexibile conformation for arabinoxylans, Carbohydrate Res. 330, 365-372,

2001.

5. Teleman, A., Tenkanen, M., Jacobs A. and Dahlman, O.,

Characterization of O-acetyl-(4-O-methylglucurono) xylan isolated from birch and

beech, Carbohydrate Research. 337, 373-377, 2002.

6. La-Grange, D. C., Claeyssens, M., Pretorius, I. S., van-Zyl, W. H.,

Coexpression of the Bacillus pumilus beta-xylosidase (xynB) gene with the

Trichoderma reesei beta-xylanase-2 (xyn2) gene in the yeast Saccharomyces

cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54, 195-200, 2000.

7. Poutanen, K. Characterisation of xylanolytic enzyms for potential

applications. Ph.D. Thesis, Technical Research Centre of Finland, Publications,

47, Espoo, 1988.

8. Gomes, J., Gomes, I., Terler, K., Gubala, N., Ditzelmuller, G. and Steiner,

W., Optimisation of culture medium and conditions for α – L - arabinofuranosidase

production by the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus,

Enzym Microb. Technol. 27, 414-422, 2000.

9. Hazlewood, G. P. and Gilbert, H. J., Molecular biology of

hemicellulases, in Hemicelluloses and Hemicellulases, Coughlan, M. P. and

Hazlewood, G. P. Eds., Portland Press, London, 103-126, 1993.

10. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzym/EC3/2/1/8.html


http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/8.html

61


11. Wong, K.K.Y., Tan, L. U. L. and Saddler, J. N., Multiplicity of

β-1,4-xylanase in microorganisms: Functions and applications, Microbiol. Rev. 52,

305-317, 1988.

12. Sapag, A., Wouters, J., Lambert, C., Ioannes, P., Eyzaguirre, J. and

Depiereux, E., The endoxylanases from family 11: computer analysis of protein

sequences reveals important structural and phylogenetic relationships, J.

Biotechnol. 109-131, 2002.

13. Kuno, A., Kaneko, S., Ohtsuki, H., Ito, S., Fujimoto Z., Mizuno, H.,

Hasegawa T., Taira K., Kusakabe, I. And Hayashi, K., Novel sugar-binding

specificity of the type XIII xylan-binding domain of a family F/10 xylanase from

Streptomyces olivaceoviridis E-86, FEBS Letts. 482, 231-236, 2000.

14. Biely, P., Markovik, O., and Mislovicova, D., Sensitive detection of endo-

1,4-β-glucanases and endo-1,4-β-xylanases in gels, Anal. Biochem. 144, 147-151,

1985.

15. Biely, P., Vrsanska, M., Tenkanen, M. and Kluepfel, D. Endo-β-xylanases

families: differences in catalytic properties, J. Biotechnol. 57, 151-166, 1997.

16. Jeffries T W. Biochemistry and genetics of microbial xylanases. Curr. Opin.

Biotechnol. 7, 337-342, 1996.

17.htt p ://calvin. b i o tech. w isc.e d u/ j e ff r ies/x y lanase _r evie w /

In d ex o f / j e ff r ies/x y lanase _r evie w

18. Torronen, A., Harkki, A., Rouvinen, J., Three dimensional structure of

endo-1,4-β-xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in

active state, EMBO J. B. 3, 2493-2501, 1994.

19. Wakarchuk, W. W. Campbell, R.L. Sung, W.L., Davoodi, J. and Yaguchi,

M., Mutational and crystallographic analyses of the active site residues of the


http://calvin.biotech.wisc.edu/jeffries/xylanase_review/Indexof/jeffries/xylanase_revie

http://calvin.biotech.wisc.edu/jeffries/xylanase_review/Indexof/jeffries/xylanase_revie

61


Bacillus circulans xylanase, Prot. Sci. 3, 467-475, 1994.

20. Leggio, L. L. Jenkins, J., HarrisG.W. and Pickersgill, R. W., X-ray

cystallographic study of xylopentose binding to Pseudomonas fluorescens

xylanase A, Proteins: Struct. Function and Genetics, 41, 362-374, 2000.

21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=64642

22. http:// www.vtt.fi/liitetiedostot/muut/20%20O'Donohue.pdf

23. Meagher, MM, Tao, B.Y., Chow, J. M., and Reilly, P.J., Kinetcs and

subsite mapping of β-D-xylobiose and D-xylose producing Aspergillus

endoxylanase, Carbohydr. Res. 173, 273-283, 1988.

24. Bray, M. R. and Clarke, A. J., Identification of an essential tyrosyl residue in

the binding site of Schizophyllum commune xylanase-A, Biochemistry, 34, 2006-

2014, 1995.

25. Kulkarni N., Shendye A. and Rao, M., Molecular and biotechnological

aspects of xylanases, FEMS Microbiol. Rev. 23, 411-456, 1999.

26. Cleemput, G., Hessing, M., van Oort, M., Deconynck, M. and Delcour, J.

A., Purification and characterization of β-D-xylosidase and an endo-xylanase

from wheat flour, Plant-Physiol. 113, 377-386, 1997.

27. Lebeda, A., Luhová, L., Sedlá, M. and Jan, D., The role of enzyms in plant-

fungal pathogens interactions, Zeitschrift fur Pflanzenkrankheiten und

Pflanzenschutz, 108,89-95,2001.

28. Subramaniyan, S. and Prema, P. Biotechnology of Microbial Xylanases:

Enzymology, Molecular Biology and Application. Critical Reviews in

Biotechnology, Kerala, India, 1030-1045, 2003.

29. Ricarda M. Engberg, Mette S. Hedemann, and Bent B. Jensen, The


http://www.vtt.fi/liitetiedostot/muut/20%20O'Donohue.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=64642

61


influence of anaerobically stored high moisture wheat and xylanase on broiler

performance and microbial composition and activity in the digestive tract of broiler

chickens, Danish Institute of Agricultural Sciences, Research Centre Foulum,

Denmark (http://www-afac.slu.se/Workshop%20Norge/Foredrag%20Ricarda%20

Engberg %20hel%20hvete.pdf)

30. C. Feoli, J. D. Hancock, C. R. Monge, C. L. Jones, and C. W. Starkey,

Effects of xylanase and wheat middings in diets for finishing pigs, 124-127, Swine

Day 2006.

31. Dawn Elizabeth Stephens, Protein engineering or a fungal xylanase,

Department of Biotechnology, Faculty of Applied Sciences, Durban University of

Technology, Durban, South Africa. February 2007.

32. Tamba-Berehoiu Radiana, Jurcoane Stefana, Popa N.C, Bagiu Liliana,

Rosu Ana, Testing of the efficiency of some enzymatic mixture, concerning the

conversion of several lignocellulosic biomass’ sourses, to reducing sugars, Lucrări

ştiinŃifice Zootehnie şi Biotehnologii, vol. 41(1), Timişoara, 155-161, 2008.

33. J. Ragauskas, Kathleen M. Poll, Effect of Xylanase Pretreatment

Procedures for Nonchlorine Bleaching, Institute of Paper Science and Technology,

Atlanta, GA 30318, 1993.

34. Suprabha G. Nair, Sindhu. R, Shankar Shashidhar, Fungal xylanase

production under solid state and submerged fermentation conditions, African

Journal of Microbiology Research Vol.(2), 082-086, April, 2008.

35. Ayesha Khan, Ikram-ul-Haq, Waseem Ahmad Butt, Sikander, Isolation

and Screening of Aspergillus niger isolates for Xylanase biosynthesis,

Biotechnology, Vol 2, No 3, 185-190, 2003


http://www-afac.slu.se/Workshop%20Norge/Foredrag%20Ricarda%20

61


PHỤ LỤC

Bảng A: Hoạt độ xylanase của chủng B7

Thời gian

(ngày)

Hoạt độ xylanase

(U/ml)


61


1 245,58

2 323,96

3 303,6

4 270,27

5 251,35

Bảng B: Hoạt độ xylanase của chủng C1

Thời gian

(ngày)

Hoạt độ xylanase

(U/ml)

1 320,45

2 520,24

3 486,58

4 400,86

5 390,47


Documents

Do an Chung Cuoi