đồ áN cá ngừ đóng hộp

GVHD: TH.S NGUYỄN THẢO MINH- TH.S NGUYỄN CẨM HƯỜNG

BỘCÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

GVHD: Th.S Nguyến Cẩm Hường Th.S Nguyễn Thị Thảo Minh

Sinh viện thực hiện: Phan Thị Hương

MSSV: 2022110365

Lớp: 02DHDB2

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 17 tháng 5 năm 2014


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bài đồ án phân tích thực phẩm này em xin gửi lời cảm ơn chân thành

tới các Cô Nguyễn Cẩm Hường và Cô Nguyễn Thảo Minh đã hướng dẫn cho em trong

suốt thời gian qua, cho em những lời nhận xét để am có thể sửa đổi và bổ sung kịp thời

cho bài đồ án của mình được tốt hơn. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè đã

cho e những lời khuyên bổ ích và giúp đỡ em trong quá trình tìm kiếm tài liệu, các tiêu

chuẩn Việt Nam, CODEX, AOAC …

Trong quá trình làm bài sẽ không tránh khỏi những sai sót mong nhận được sự góp ý

từ Thầy, Cô giáo.

Em xin cảm ơn!


LỜI NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

………………


LỜI MỞ ĐẦU

Cá ngừ đóng hộp được sản xuất đầu tiên vào năm 1903, và nó đã nhanh chóng trở

nên phổ biến với các loại sản phẩm như cá ngừ ngâm dầu, cá ngừ ướp muối…

Sản phẩm đồ hộp cá ngừ rất giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao và rất dễ

chế biến hoặc có thể dùng ăn ngay tùy khẩu vị của từng người. Ngoài ra sản phẩm cá ngừ

đóng hộp rất thuận tiện cho các buổi dã ngoại, picnic…vì nó rất dễ mang theo. Dầu cá

ngừ có chứa hàm lượng Vitamin D rất cao và là nguồn cung cấp acid béo omega-3

khoảng 300 milligramsa.

Có cầu thì sẽ có cung chuyện đó là một quy luật sống của xã hội. Nhu cầu sử dụng

đồ hộp càng cao thì nền công nghiệp sản xuất đồ hộp càng phát triển, yêu cầu của người

sử dụng về vấn đề an toàn cũng theo đó tăng dần. Chính vì vậy, để tiện lợi cho việc kiểm

soát chất lượng của các sản phẩm đồ hộp trên thị trường các tổ chức lớn như hiệp hội các

nhà hóa phân tích chính thống (AOAC), CODEX hay mỗi quốc gia đều đưa ra các chỉ

tiêu và phương pháp kiểm tra chỉ tiêu cho sản phẩm của mình.

Để làm rõ hơn về các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm cá ngừ đóng hộp trong bài

đồ án phân tích thực phẩm này em đã liệt kê ra các chỉ tiêu chất lượng, các phương pháp

kiểm tra chỉ tiêu đó.

Trong bài làm này của em không tránh khỏi những sai sót dù em đã cố gắng làm bài.

Nên em mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ Thầy, Cô để bài làm của em được hoàn

thiện hơn, giúp e có những kinh nghiệm cho bài làm sau của mình.

Cuối cùng, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô hướng dẫn cũng như các

giáo viên trong trường, các bạn và những người thân đã giúp em hoàn thành bài đồ án

này.

Em xin cảm!


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

LỜI MỞ ĐẦU

Trang

I. Tổng quan về sản phẩm cá ngừ đóng hộp ......................................................... 1

1.1. Giới thiệu chung về sản phẩm cá ngừ đóng hộp .............................................. 1

1.1.1. Khái niệm ................................................................................................... 1

1.1.2. Tổng quan về nguyên liệu .......................................................................... 1

1.1.2.1. Nguyên liệu chính ........................................................................... 1

1.1.2.2. Nguyên liệ phụ ................................................................................ 6

1.2. Thị trường tiêu thụ cá ngừ đóng hộp ............................................................... 9

1.2.1. Thế giới ...................................................................................................... 9

1.2.2. Việt Nam .................................................................................................... 12

II. Tiêu chuẩn Việt Nam, Quy chuẩn Việt Nam cho sản phẩm cá ngừ

đóng hộp ..................................................................................................................... 14

2.1. Tiêu chuẩn Việt Nam về sản phẩm cá ngừ đóng hộp ...................................... 14

2.1.1. TCVN 6388:2006 cá ngừ đóng hộp ........................................................... 14

2.1.1.1. Phạm vi áp dụng ............................................................................. 14

2.1.1.2. Mô tả ............................................................................................... 14

2.1.1.2.1. Định nghĩa sản phẩm ...................................................... 14

2.1.1.2.2. Trình bày ......................................................................... 15

2.1.1.3. Thành phần cơ bản và các chỉ tiêu chất lượng ................................ 15

2.1.1.4. Phụ gia sản phẩm ............................................................................. 16

2.1.1.5. Vệ sinh xử lý ................................................................................... 17

2.1.2. Ghi nhãn sản phẩm bao gói sẵn theo TCVN 7087 : 2008 .......................... 18

2.1.2.1. Phạm vi áp dụng ............................................................................. 18

2.1.2.2. Thuật ngữ và định nghĩa .................................................................. 18

2.1.2.2.1. Thông báo ( Claim) .......................................................... 18

2.1.2.2.2. Khách hàng ( Consumer) ................................................. 18

2.1.2.2.3. Bao bì ( Container) ........................................................... 18

2.1.2.2.4. Ngày sản xuất ( Date of manufacture ) ............................ 19

2.1.2.2.5. Ngày đóng gói ( Date of packaging) ................................ 19

2.1.2.2.6. Thời hạn bán ( Sell – by- date) ....................................... 19


2.1.2.2.7. Ngày hết hạn sử dụng....................................................... 19

2.1.2.2.8. Thực phẩm ( Food) .......................................................... 19

2.1.2.2.9. Phụ gia thực phẩm ( Food additive) ................................. 19

2.1.2.2.10. Thành phần ( Ingredient) ............................................... 20

2.1.2.2.11. Nhãn ( Label) .................................................................. 20

2.1.2.1.12. Ghi nhãn ( Labelling) ....................................................... 20

2.1.2.1.13. Lô hàng ( Lot) .................................................................. 20

2.1.2.1.14. Bao gói sẵn ( Prepackaged).............................................. 20

2.1.2.1.15. Chất phụ trợ trong quá trình chế biến .............................. 20

2.1.2.1.16. Thực phẩm dùng cho mục đích sử dụng trực tiếp............ 20

2.1.2.3. Nguyên tắc chung ......................................................................... 21

2.1.2.4. Ghi nhãn bắt buộc đối với thực phẩm bao gói sẵn .......................... 21

2.1.3. TCVN 7266 : 2003 quy phạm thực hành đối với thủy sản đóng hộp ........ 29

2.1.3.1. Định nghĩa ...................................................................................... 29

2.1.3.2. Yêu cầu đối với nguyên liệu ........................................................... 31

2.2. Quy chuẩn kỹ thuật Việt Nam ............................................................................... 32

III. Các phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm cá ngừ đóng hộp theo

TCVN ................................................................................................................... 33

3.1. Lấy mẫu, kiểm tra và phân tích ( theo TCVN 6388:2006) .................................. 33

3.1.1. Lấy mẫu ..................................................................................................... 33

3.1.2. Kiểm tra cảm quan và kiểm tra vật lý ........................................................ 34

3.1.3. Xác định khối lượng tịnh ( theo TCVN 6388: 2006) ................................. 34

3.1.4. Xác định khối lượng đã ráo nước ( theo TCVN 6388 : 2006) .................. 34

3.1.5. Xác định khối lượng ráo nước đã được rửa (đối với hộp có nước sốt) ...... 34

3.1.6. Kiểm tra dạng trình bày .............................................................................. 35

3.1.7. Xác định histamine ................................................................................... 36

3.1.8. Xác định khuyết tật .................................................................................... 36

3.1.9. Tạp chất lạ ................................................................................................. 36

3.1.9.1. Mùi ................................................................................................. 36

3.1.9.2. Cấu trúc .......................................................................................... 36

3.1.9.3. Sự biến màu ..................................................................................... 37

3.1.9.4. Chất không mong muốn .................................................................. 37

3.2. TCVN 8342 : 2010 Phát hiện Salmonella bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi

Polymeraza (PCR) ............................................................................................................... 37

3.2.1. Nguyên tắc ................................................................................................. 37

3.2.2. Thuốc thử, môi trường và vật liệu .............................................................. 37


3.2.3. Cặp mồi ..................................................................................................... 37

3.2.4. Môi trường nuôi cấy .................................................................................. 38

3.2.5. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử ................................................................... 40

3.2.6. Cách tiến hành ............................................................................................ 40

3.2.7. Điện di sản phẩm khuếch đại .................................................................... 41

3.2.8. Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại ........................................... 42

3.2.9. Đọc và diễn giải kết quả ............................................................................. 42

3.2.10. Báo cáo thử nghiệm ................................................................................... 42

3.3. TCVN 8343 : 2010 Thủy sản và sản phẩm thủy sản ( phát hiện acid Boric và

muối Borat) ............................................................................................... 43

3.3.1. Nguyên tắc ................................................................................................ 43

3.3.2. Thuốc thử và vật liệu .................................................................................. 43

3.3.3. Cách tiến hành ............................................................................................ 43

3.3.3.1. Thử sơ bộ ........................................................................................ 43

3.3.3.2. Thử xác nhận ................................................................................... 43

3.3.4. Đọc kết quả ................................................................................................ 44


3.4. TCVN 8344 : 2010 thủy sản và sản phẩm thủy sản ( phát hiện ure) Fish and

fishery products Detection of urea .................................................................... 44

3.4.1. Nguyên tắc .................................................................................................. 44

3.4.2. Thốc thử ..................................................................................................... 44

3.4.3. Cách tiến hành ........................................................................................... 45

3.4.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ........................................................................... 45

3.4.3.2. Tiến hành thử................................................................................... 45

3.4.4. Báo cáo thử nghiệm .................................................................................... 45

3.5. TCVN 8345 : 2010 Thủy sản và sản phẩm thủy sản xác định dư lượng sulfonamit

( phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao) ...................................................... 45

3.5.1. Nguyên tắc ................................................................................................. 45

3.5.2. Thuốc thử ................................................................................................... 46

3.5.3. Cách tiến hành ............................................................................................ 47

3.5.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ........................................................................... 47

3.5.3.2. Chuẩn bị trắng trắng ....................................................................... 47

3.5.3.3. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ng/g .............................. 48

3.5.3.4. Chuẩn bị dung dịch dựng đường chuẩn .......................................... 48

3.5.3.5. Tạo dẫn xuất huỳnh quang ............................................................. 48

3.5.3.6. Tiến hành phân tích trên HPLC ..................................................... 48

3.5.3.7. Tính kết quả ..................................................................................... 49


3.5.3.8. Độ lặp lại ........................................................................................ 49

3.5.3.9. Báo cáo thí nghiệm ......................................................................... 49

3.5.3.10. Báo cáo thí nghiệm ......................................................................... 49

3.6. TCVN 8354: 2010 thủy sản và sản phẩm thủy sản ( xác định hàm lượng Sulfit)

Fish and fishery products Determination of sulfit content 50

3.6.1. Nguyên tắc ................................................................................................. 50

3.6.2. Thuốc thử ................................................................................................... 50

3.6.3. Cách tiến hành ........................................................................................... 51

3.6.4. Tính kết quả ............................................................................................... 52

3.7. TCVN 3701: 2009 thủy sản và sản phẩm thủy sản – xác định hàm lượng

natriclorua ............................................................................................................. 53

3.7.1. Thuốc thử ................................................................................................... 53

3.7.2. Lấy mẫu ..................................................................................................... 54

3.7.3. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................. 54

3.7.7. Cách tiến hành ........................................................................................... 55

3.7.8. Tính kết quả ............................................................................................... 55

3.7.9. Báo cáo thử nghiệm

3.8. TCVN 4822: 2007 Phương pháp phát hiện và định lượng Coliforn bằng kỹ thuật

đếm số có xác suất lớn nhất. ............................................................................... 55

3.8.1. Nguyên tắc .................................................................................................. 55

3.8.1.1. Phát hiện Coliform .......................................................................... 55

3.8.1.2. Bằng kỹ thuật MPN ........................................................................ 56

3.8.2. Môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng ............................................ 56

3.8.2.1. Khái quát ........................................................................................ 56

3.8.2.2. Dịch pha loãng ................................................................................ 57

3.8.2.3. Môi trường tăng sinh chọn lọc: Canh thang tryptoza lauryl sulfat 57

3.8.2.4. Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng (lactose

bile brilliant green broth ................................................................. 58

3.8.3. Cách tiến hành ............................................................................................ 58

3.8.4. Tính và biểu thị kết quả .............................................................................. 60

3.8.5. Độ chụm .................................................................................................... 60


3.9. TCVN 7927: 2008 Thực phẩm- phát hiện và định lượng Staphylococcus Aureus

bằng phương pháp tính số có xác suất lớn nhất. 61

3.9.1. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy 61

3.9.2. Cách tiến hành ........................................................................................... 62

3.9.3. Biểu thị kết quả ........................................................................................... 64


3.9.4. Báo cáo thử nghiệm .................................................................................... 64

IV. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm theo tiêu chuẩn CODEX. 65

V. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm theo AOAC ........................... 65

5.1. AOAC 977.13 Xác định histamin trong hải sản. Phương pháp huỳnh quang ..... 65

5.2. AOAC 996.07 Xác định Putrescine, Cadaverine trong đồ hộp cá ngừ và cá

mahimahi bằng phương pháp sắc ký khí. ............................................................. 71

5.3. AOAC 937.09 Xác định hàm lượng muối (natri clorua) trong thủy sản và sản

phẩm thủy sản ........................................................................................................ 80

5.4. AOAC 977.26 phương pháp xác định clostridium botulinum và độc tố của nó

trong thực phẩm. .................................................................................................... 81

VI. So sánh các phương pháp kiểm tra ....................................................................... 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


Danh mục bảng

Trang

Trang

I. Tổng quan về sản phẩm cá ngừ đóng hộp

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của cá ngừ 2

Bảng 1.2: Một số yêu cầu đối với cá ngừ nguyên liệu 6

Bảng 1.3: chỉ số iod của 1 số loại dầu thực vật 7

Bảng 1.4: một số chỉ tiêu chất lượng của muối thực phẩm 7

Bảng 1.5: các chỉ tiêu của nước dùng trong thực phẩm 9

Bảng 1.6: Một số chỉ tiêu của bột ngọt 9

Bảng 1.7 : Nhập khẩu cá ngừ ở Đức 11

II. Tiêu chuẩn Việt Nam, Quy chuẩn Việt Nam cho sản phẩm cá ngừ đóng

hộp

Bảng 2.1: Các tiêu chuẩn Việt Nam về cá ngừ đóng hộp 14

Bảng 2.2: Các chất phụ gia được phép sử dụng trong sản xuất cá ngừ đóng hộp 17

Bảng 2.3: một số nhóm tên trong ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn 24

Bảng 2.4: Lượng ăn vào hàng tuần có thể chấp nhận được tạm thời 33

Bảng 2.5: giới hạn ô nhiễm kim loại nặng của cá ngừ đóng hộp 33

III. Các phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm cá ngừ đóng hộp

theo TCVN

Bảng 3.1: Chương trình pha động 48

Bảng 3.2– Các số có xác suất lớn nhất (MPN) trên gam phần mẫu thử, sử dụng 3 ống

có các phần mẫu thử tương ứng là 0,1 g, 0,01 g và 0,001 g 64

IV. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm theo tiêu chuẩn CODEX

V. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm theo AOAC


Bảng 977.13A : Kết quả nghiên cứu liên phòng để xác định histamin trong cá ngừ bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 69

Bảng 977.13B: kết quả nghiên cứu liên phòng để xác định histamin trong cá ngừ đóng

hộp và đông lạnh bằng phương pháp phát quang ( phương pháp sửa đổi bằng cách sử

dụng methanol 75% (v / v). 70

Bảng 977.13C thu hồi histamine thêm vào cá ngừ đóng hộp 70

( phương pháp được sửa đổi bằng cách sử dụng methanol 75%). 71

Bảng 996.07A Kết quả xác định putrescine ( µg/g) cá ngừ đóng hộp bằng sắc ký khí 77

Bảng 996.07B Kết quả xác định cadaverine ( µg/g) cá ngừ đóng hộp bằng sắc ký khí 78

Bảng 996.07C thu hồi putrescine đã thêm vào cá ngừ đóng hộp 78

Bảng 996.07D thu hồi cadaverine thêm vào trong cá ngừ 79

Bảng 996.07E chuẩn bị dung dịch chuẩn putrescine- cadaverine 80


CÁ NGỪ ĐÓNG HỘP Page 1

I. Tổng quan về sản phẩm cá ngừ đóng hộp

1.1. Giới thiệu chung về sản phẩm cá ngừ đóng hộp

1.1.1. Khái niệm

Theo tiêu chuẩn Việt Nam ( TCVN 6388-2006) thì sản phẩm cá ngừ đóng hộp được

định nghĩa là:

Cá ngừ đóng hộp (Canned tuna and bonito):

Sản phẩm gồm thịt của bất kỳ loài cá nào được kể tên dưới đây, được đựng trong

hộp ghép mí kín. Sản phẩm phải được xử lý chế biến đủ để đảm bảo vô trùng trong

thương mại.

Thunnus alalunga

Thunnus albacares

Thunnus atlanticus

Thunnus obesus

Thunnus maccoyii

Thunnus thynnus

Thunnus tonggol

Euthynnus affinis

Euthynnus alletteratus

Euthynnus lineatus

Katsuwonus pelamis (từ đồng nghĩa. Euthynnus pelamis)

Sarda chiliensis

Sarda orientalis

Sarda sarda

1.1.2. Tổng quan về nguyên liệu

1.1.2.1. Nguyên liệu chính

Cá ngừ là tên gọi chung chỉ các họ cá có tên khoa học Teleostei, Percida, Scombina,

Scombridae. Phân bố chủ yếu ở vùng biển khơi, các loài này rất lanh lợi va có thể di

chuyển rất xa với tốc độ nhanh. Chúng được xếp đứng đầu chuỗi thức ăn trong các loài

cá.

Thịt cá ngừ có màu đỏ hoặc đỏ sẫm, trong cá ngừ có nhiều huyết chiếm 5-6% trọng

lượng cá tươi. Muốn sản xuất cá ngừ đóng hộp tốt cá cần được làm sạch huyết vì huyết

còn sót lại trong cá sẽ làm cho màu săc và hương vị của cá kém đi và đồng thời ảnh

hưởng tới việc bảo quản, hyết phải được lấy khi cá còn tươi.



Thân nhiệt của loài cá ngừ thường cao hơn các loài cá khác, hầu hết các loài cá có

thân nhiệt cao hơn môi trường sống 1-20C nhưng cá ngừ thì có than nhiệt cao hơn môi

trường . sống tới 100C vì vậy thịt cá ngừ nhanh hỏng hơn các loài cá khác.

Thịt cá ngừ có nhiều nạc, ít chất mỡ, giàu dinh dưỡng cà các muối khoáng nên rất

ngon và không có độc.

Cá ngừ có hàm lượng vitamin nhất là vitamin D, photpho cao, có nhiều acid béo

hông bão hòa (nhất là omega-3, làm giảm tryglycerid trong máu), có tác dụng tốt trong

việc phòng ngừa một số bệnh tim mạch, xương khớp…

Thành phần dinh dưỡng trong 100g thực phẩm ăn được

Năng

lượng

Thành phần chính Muối khoáng Vitamin

Nước protein lipit Tro Canxi Photpho Sắt A B1 B2 PP

Calori G Mg mcg Mg

87 77.5 21 0.3 1,2 44 206 1 5 0.02 0.08 4

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của cá ngừ

Một số loài cá ngừ dùng làm nguyên liệu trong chế biến cá ngừ đóng hộp:

Cá thunnus obesus- cá ngừ mắt to

Tên khoa học: thunnus obesus

Họ: Scombridae

Bộ: Perciformes

Lớp: Actinopterygii



Cá ngừ mắt to sống ở các đại dương trên khắp thế giới trên các vùng biển nhiệt đới,

cận nhiệt đới và ôn đới. Phần lớn chúng sinh sống ở biển Thái Bình Dương, đặc biệt là

vùng bắc bán cầu. Chúng sống cách biệt khỏi các loài cá khác, động vật giáp xác và mực.

Săn lượng đánh bắt hằng năm khoảng 25000 tấn. Thịt cá ngừ mắt to có màu đỏ tươi và

hương vị thơm ngon.

Thunnus albacares- cá ngừ vây vàng

Tên khoa học: Thunnus albacares

Họ: Scombridae

Bộ: Perciformes

Lớp: Actinopteyggi

Cá ngừ vây vàng sống ở các đại dương, cả ở vùng biển nhiệt đới và ôn đới nhưng

không có ở vùng biển Địa Trung Hải. Ngư trường chính của loài cá này kéo dài 250 theo

đường kinh tuyến Bắc.

Thunnus allunga- cá ngừ vây dài



Tên khoa học: Thunnus allunga

Họ: Scombridae

Bộ: Percifprmes

Kích thước tối đa: Chiều dài toàn bộ 140 cm, trọng lượng tối đa được công bố là

60,3 kg.

Cá ngừ chấm

Tên khoa học: Euthynnus affinis

Kích thước: 240-450 mm, chủ yếu là 360mm

Thunnus tonggol – cá ngừ bò



Tên khoa học: Thunnus tonggol

Kích thước 400-700mm

Sarda orientalis - cá ngừ dọc dưa

Tên khoa học: Sarda orientalis

Kích thước khai thác: 450mm-750mm

Katsuwonus pelamis – cá ngừ vằn

Tên khoa học: Katsuwonus pelamis

Kích thước khai thác: 240-700mm, chủ yếu là 480- 560mm



Một số yêu cầu đối với cá ngừ nguyên liệu:

Thân cá Co cứng, để trên bàn tay than cá không bị quằn xuống.

Miệng cá Ngậm cứng

Mang cá Dán chặt xuống hoa khé, không có nhớt

Mắt cá Nhãn cầu lồi và trong

Bụng và hậu môn Bụng không phì, hậu môn thụt vào sâu, màu trắng nhạt

Phản ứng với giấy quỳ Acid

Bảng1.2: Một số yêu cầu đối với cá ngừ nguyên liệu

Ngoài ra, còn một số yêu cầu sau:

Mình cá sạch, không bám nhiều bùn cát, có ít chất nhờn với màu trong tự nhiên,

không bị đục

Cá chìm hẳn trong nước

Nếu mổ cá thì ruột, mật cá phải còn nguyên vẹn, không có mùi tanh hôi.

Đối với cá tươi: hàm lượng NH3 15-25 mg/100g , mỡ cá không có hiện tượng

thủy phân và oxi hóa.

1.1.2.2 Nguyên liệu phụ

a. Dầu thực vật

Trong sản xuất cá hộp người ta thường sử dụng dầu hướng dương, dầu lạc, dầu oliu

ép nguội. Tính chất hóa lý của dầu thực vật phụ thuộc chủ yếu vào tính chất của acid éo

trong thành phần của nó. Dầu thực vật khác mỡ động vật là nó chứa các acid béo không

no như oleic, linoleic, linolenic…hầu hết các acid này tồn tại dưới trạng thái lỏng ở nhiệt

độ phòng nên ở nhiệt độ thường dầu thực vật tồn tại dưới trạng thái lỏng.

Dầu càng chứa nhiều acid béo không no thì càng kém bền với tác dụng của nhiệt khi

chế biến. Hàm lượng acid béo không no trong dầu được xác định bằng phương pháp cho

kết hợp với iod (chỉ số iod). Chỉ số iod của dầu phụ thuộc vào hàm lượng acid béo no và

không no có trong dầu.



Dầu

Chỉ số iod

Hàm lượng acid béo, % khối lượng.

No Không no

Linolenic Oleic Linoleic

Hướng dương 119-144 8-12 35-40 Gần 5

Lạc 101-106 13-24 50-60 13-16

Oliu 78-93 11 81 7

Bảng 1.3: chỉ số iod của 1 số loại dầu thực vật

Yêu cầu của nguyên liệu:

Màu trong, sang không có mùi hôi

Chỉ số acid < 2, chỉ số iod từ 101-106

Tác dụng của dầu trong sản phẩm ngâm dầu:

Chống ăn mòn hộp

Tạo cảm quan: Thịt cá săn, không bị bở.

Là một lớp bảo vệ chống vi sinh và ngăn cản sự hoạt động của enzyme.

b. Muối thực phẩm ( theo tiêu chuẩn TCVN 3974- 2007)

Tên chỉ tiêu Chất lượng

Cảm quan:

Màu sắc Trắng trong

Mùi vị Không mùi, dung dịch muối 5% có vị mặn

thuần khiết, không có vị lạ

Dạng bên ngoài và cỡ hạt Khô ráo tơi đều và trắng sạch.

Hóa học

Hàm lượng NaCl 9 tính theo % chất khô) >95%

Hàm lượng chất không tan ( tính theo %

chất khô)

< 0,25%

Bảng1 4: một số chỉ tiêu chất lượng của muối thực phẩm

c. Nước

Bảng tiêu chuẩn sinh của nước dùng trong công nghiêp thực phẩm của bộ y tế: Tiêu

chuẩn QD1329-2002-BYT



STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Giới hạn tối đa

Chỉ tiêu cảm quan và thành phần vô cơ

1 Màu sắc TCU 15

2 Mùi vị Không có mùi vị lạ

3 Độ đục TCU 2

4 pH 6,6-8,5

5 Độ cứng mg/l 300

6 Tổng chất rắn hòa tan (TDS) mg/l 1000

7 Hàm lượng nhôm mg/l 0,2

8 Hàm lượng amoni tính theo NH4+ mg/l 1,5

9 Hàm lượng Atimon mg/l 0,005

10 Hàm lượng Asen mg/l 0,01

11 Hàm lượng Bari mg/l 0,7

12 Hàm lượng Bo tính chung cho cả

Borat và acid Boric

mg/l 0,3

13 Hàm lượng cadimi mg/l 0,003

14 Hàm lượng clorua mg/l 250

15 Hàm lượng crom mg/l 0,05

16 Hàm lượng đồng mg/l 2

17 Hàm lượng xianua mg/l 0,07

18 Hàm lượng florua mg/l 0,7-1,5

19 Hàm lượng H2S mg/l 0,05

20 Hàm lượng Fe mg/l 0,5

21 Hàm lượng Pb mg/l 0,01

22 Hàm lượng Mn mg/l 0,5

23 Hàm lượng thủy ngân mg/l 0,001

24 Hàm lượng nitrit/ nitrat mg/l 3/50



25 Hàm lượng Na mg/l 200

26 Hàm lượng sunphat mg/l 250

27 Hàm lượng Zn mg/l 3

28 Độ oxy hóa mg/l 2

Bảng 1.5: các chỉ tiêu của nước dùng trong thực phẩm

d. Bột ngọt ( TCVN 1459:2008)

STT Tên tiêu chuẩn Yêu cầu

1 Công thức hóa học C3H8NaO4.H2O

2 Hàm lượng chất chính,

không nhỏ hơn

99%

3 Trạng thái Tinh thể hoặc bột kết tinh

mà trắng, hầu như không

mùi

4 Hao hụt khối lượng khi

sấy ở 98% trong 5h, không

lớn hơn

0,5%

5 Chì không lớn hơn 1 mg/ kg

6 pH ( dung dịch 1/50) 6,7-7,2

Bảng 1.6: Một số chỉ tiêu của bột ngọt

e. Gia vị

Khi sản xuất đồ hộp người ta thường sử dụng các loại gia vị như: tỏi, tiêu, hành, ớt.

mùi thơm của gia vị chủ yếu là do thành phần tinh dầu và glucoside có trong gia vị.

Các loại gia vị này sẽ góp phần nâng cao tính chất cảm quan cho sản phẩm, tăng

thêm hương vị và tạo sự hấp dẫn. Ngoài ra motoj số gia vị còn có khả năng kháng khuẩn,

giải độc, có tác dụng kích thích tiêu hóa…

1.2. Thị trường tiêu thụ cá ngừ đóng hộp

1.2.1. Thế giới



Trong mấy năm vừa qua, tiêu thụ cá ngừ hộp giảm, năm 2012 đã giảm khoảng 12%

so với năm trước, nguyên nhân là tình hình kinh tế khó khăn, giá bán lẻ cao, người tiêu

dùng không hài lòng với chất lượng sản phẩm và những rắc rối liên quan đến hàm lượng

thủy ngân trong cá. Việc hai nhãn hiệu nổi tiếng Bumble Bee và Chicken of The Sea tự

nguyện triệu hồi sản phẩm gần đây do sai lỗi trong khâu đóng hộp càng làm mất lòng tin

của người tiêu dùng hơn nữa.

Sự sa sút của thị trường khiến khối lượng nhập khẩu cá ngừ hộp năm 2012 giảm tới

14,3%, tuy giá trị (761,3 triệu USD) tăng 5,8% do giá tăng trên khắp thế giới. Nhập khẩu

cá ngừ hộp thịt trắng ngâm nước muối giảm tới 20,4%, nhập khẩu cá ngừ đóng túi giảm

nhẹ 1,1%. Thái Lan là nhà cung cấp số 1 về cá ngừ hộp cho Mỹ, mặc dù vậy trong những

năm vừa qua cũng đã giảm gần 18%.

Nhu cầu sử dụng cá ngừ đóng hộp đã tăng lên đáng kể trong năm 2014. Tuy bước

sang năm 2014, giá cá ngừ đóng hộp vẫn thấp hơn những năm trước nhưng điều này sẽ

kích thích nhu cầu tiêu thụ tại các thị trường truyền thống. Kể từ quý 4/2013 cho đến đầu

năm 2014, sản lượng khai thác cá ngừ trên thế giới đã tăng đáng kể do các lệnh cấm đánh

bắt cá định kỳ tại các khu vực đã kết thúc. Tuy nhiên, nhu cầu tiêu thụ và giá cả lại có xu

hướng tăng giảm khó lường.

Châu Âu

Do giá tăng nên các nước EU giảm nhập khẩu từ các nguồn cung cấp châu Á truyền

thống như Thái Lan, Philippin,….mà tăng nhập khẩu từ các nước châu Phi do không phải

chịu thuế. Tổng nhập khẩu cá ngừ đồ hộp, cá ngừ chế biến/có bảo quản vào EU đạt

447.579 tấn, trị giá 2,47 tỷ USD, giảm 3,5% về khối lượng nhưng lại tăng tới 14,4% về

giá trị. Đầu năm nay, EU tăng hạn ngạch nhập khẩu thăn cá ngừ hấp chín không phải chịu

thuế lên 22.000 tấn.

Năm ngoái, thị trường EU có mức tăng trưởng khả quan. Nhập khẩu cá ngừ đóng

hộp vào EU từ các nước ngoài EU tăng 11% về khối lượng và gần 27% về mặt giá trị so

với cùng kỳ năm 2012.

Đức

Theo thống kê của Trung tâm Thương mại Quốc tế (ITC), nhập khẩu cá ngừ đóng

hộp của Đức 5 tháng đầu năm 2013 tăng hơn 21% về khối lượng so với cùng kỳ năm

2012. Đức hiện nhập khẩu cá ngừ đóng hộp từ 25 nước trên thế giới, nhiều nhất từ

Ecuador, tiếp đến Philippines, Papua News Guinea và Việt Nam.



Ecuador - nhà cung cấp hàng đầu cá ngừ đóng hộp sang Đức trong giai đoạn này đạt

mức tăng trưởng hơn 120% so với cùng kỳ năm 2012. Dường như sự tăng trưởng sản

lượng đánh bắt cá ngừ hồi cuối năm ngoái và lợi thế về giá nguyên liệu cá ngừ thấp hơn

so với tại Bangkok là điều kiện thuận lợi cho nước này đẩy mạnh xuất khẩu cá ngừ sang

Đức.

NHẬP KHẨU CÁ NGỪ ĐÓNG HỘP CỦA ĐỨC (tấn)

Xuất xứ T1-

5/2012

T1-

5/2013

Tỷ trọng

2013 (%)

Tăng/ giảm

(%)

Ecuador 2.753 6.082 19.79 + 120.92

Philippines 5.914 5.370 17.47 - 9.20

Papua New

Guinea 3.884 3.490 11.36 - 10.14

Việt Nam 2.283 3.287 10.69 + 43.98

Tây Ban Nha 1.294 2.967 9.65 + 129.29

Hà Lan 3.330 2.671 8.69 - 19.79

Các nước khác 5.749 6.868 0.22 + 19.46

Tổng 25.207 30.735 100.00 + 21.93

Bảng 1.7 : Nhập khẩu cá ngừ ở Đức

Trong khi đó, Philippines - nước đứng thứ 2 về xuất khẩu cá ngừ đóng hộp sang

Đức - lại giảm xuất khẩu so với cùng kỳ năm ngoái do nước này không được hưởng ưu

đãi thuế quan như Ecuador. Vì vậy, nước này đang nỗ lực thúc đẩy quá trình đàm phán về

ưu đãi thuế quan mới với EU cho cá ngừ nhập khẩu từ năm 2014.

Thị trường khác

Trung Quốc là thị trường cá ngừ hộp nhỏ nhưng đang tăng mạnh. Năm 2012 Trung

Quốc NK 6.193 tấn (+19,1%), trị giá 30,4 triệu USD (+32,6%), chủ yếu là từ Hàn Quốc.



Thái Lan, nhà xuất khẩu cá ngừ hộp lớn, đang phải trải qua giai đoạn sụt giảm mạnh

trên nhiều thị trường. Năm 2012, xuất khẩu cá ngừ hộp của Thái giảm tới 20,5% về khối

lượng và 1,5% về giá trị so với năm 2011. Các nhà nhập khẩu chính của Thái là Mỹ và

EU đều giảm, trong đó Mỹ giảm mạnh nhất, hơn 30% trong năm 2012.

hình 1: biểu đồ về việc nhập khẩu cá ngừ đóng hộp ở Anh vào năm 2011.

Theo đánh giá của Globefish, năm 2013 nhu cầu cá ngừ hộp của các thị trường

chính là Mỹ và EU có thể như năm 2012. Giá cá ngừ vằn có vẻ sẽ nằm lại ở mức trên

2.000 USD/tấn, nhưng rất nhiều khả năng các nhà chế biến cá ngừ sẽ điều chỉnh giá bán

để bù chi phí sản xuất tăng. Trong vài tháng tới, dự kiến trong các siêu thị lớn ở châu Âu

và Bắc Mỹ sẽ xuất hiện ngày càng nhiều cá ngừ hộp dán nhãn sinh thái, chế biến từ

nguồn nguyên liệu khai thác bằng câu cần không dùng thiết bị dụ cá.

1.2.2. Việt Nam



Thị trường Việt Nam chủ yếu là xuất khẩu cá ngừ nguyên liệu, thăn cá ngừ đông

lạnh sang các nước như Nhật Bản, Mỹ, Đức, các nước châu Âu…

Hình 2: Xuất khẩu cá ngừ tại Việt Nam, 2006-2012.

Việt Nam đứng thứ 3 về Xuất khẩu thăn cá ngừ đông lạnh cho Mỹ và thị trường này

cũng tiêu thụ cá ngừ đồ hộp và chế biến nhiều nhất của Việt Nam. Dự đoán, Mỹ sẽ tiếp

tục tăng nhập khẩu cá ngừ của nước ta. Tuy nhiên, cá ngừ vây vàng cắt miếng và thăn,

nếu xử lý bằng CO nhập vào Mỹ có khả năng sẽ phải chịu thuế

Xuất khẩu cá ngừ đóng hộp của Việt Nam sang Đức tăng trưởng ở mức khá, 43,98%

so với cùng kỳ năm ngoái. Điều này cho thấy mặc dù cùng chịu mức thuế như nhau

nhưng các sản phẩm cá ngừ đóng hộp của Việt Nam đang có lợi thế hơn so với các sản

phẩm cùng loại của Philippines. Đây là cơ hội tốt để các doanh nghiệp Việt Nam tăng

cường khai thác thị trường này.

Tuy nhiên, đáng lưu ý là tốc độ tăng trưởng xuất khẩu cá ngừ đóng hộp của Việt

Nam sang Đức trong năm 2013 ngày càng chậm và thấp hơn so với cùng kỳ năm 2012.

Tăng trưởng nhập khẩu được ghi nhận ở một số thị trường như Mỹ, EU, ASEAN,

Ixraen vv…. Tỷ trọng xuất khẩu cá ngừ hộp tăng khá mạnh (44,4%) so với cùng kỳ 2012.



II. Tiêu chuẩn Việt Nam, Quy chuẩn Việt Nam cho sản phẩm cá ngừ đóng hộp.

2.1. Tiêu chuẩn Việt Nam về sản phẩm cá ngừ đóng hộp.

Số hiệu tiêu chuẩn Tên tiêu chuẩn Chú thích

TCVN 6388 : 2006 CÁ NGỪ ĐÓNG HỘP

Canned tuna and bonito

Tương đương với Codex

stan 70 – 1981, Rev.1 – 1995

TCVN 7087 : 2002 Ghi nhãn thực phẩm bao gói

sẵn

Tương đương với [CODEX

STAN 1 : 1985 (Rev. 1-1991,

Amd. 1999 & 2001

TCVN 7266 : 2003 Quy phạm thực hành đối với

thủy sản đóng hộp

Tương đương với

CAC/RCP 10 - 1976)];

Bảng 2.1: Các tiêu chuẩn Việt Nam về cá ngừ đóng hộp

2.1.1. TCVN 6388:2006 cá ngừ đóng hộp

2.1.1.1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng cho cá ngừ đóng hộp. Tiêu chuẩn này không áp dụng cho

các sản phẩm đặc biệt khi khối lượng cá ít hơn 50 % khối lượng tịnh.

2.1.1.2. Mô tả

2.1.1.2.1. Định nghĩa sản phẩm

Cá ngừ đóng hộp (Canned tuna and bonito):

Sản phẩm gồm thịt của bất kỳ loài cá nào được kể tên dưới đây, được đựng trong

hộp ghép mí kín.

Thunnus alalunga

Thunnus albacares

Thunnus atlanticus

Thunnus obesus

Thunnus maccoyii

Thunnus thynnus

Thunnus tonggol

Euthynnus affinis

Euthynnus alletteratus

Euthynnus lineatus

Katsuwonus pelamis (từ đồng nghĩa. Euthynnus pelamis)



Sarda chiliensis

Sarda orientalis

Sarda sarda

Sản phẩm phải được xử lý chế biến đủ để đảm bảo vô trùng trong thương mại.

2.1.1.2.2. Trình bày

Cho phép sản phẩm được trình bày như sau:

a. Cá khoanh (còn nguyên da hoặc bỏ da) [Solid (skin-on or skinless)]: cá được cắt

ngang thành khúc và được xếp đầy vào hộp sao cho các mặt cắt gần như song song với

hai đáy của hộp. Tỷ lệ các khúc hoặc miếng rời không được lớn hơn 18 % khối lượng ráo

nước.

b. Cá khúc (chunk): phần lớn các miếng cá phải có kích thước mỗi chiều không

nhỏ hơn 1,2 cm và giữ được cấu trúc cơ ban đầu của khúc cá. Tỷ lệ những khúc cá có

kích thước nhỏ hơn 1,2 cm không được vượt quá 30 % khối lượng ráo nước.

c. Cá cắt lát (Flake or flakes): hỗn hợp của các miếng cá có kích thước mỗi chiều

nhỏ hơn 1,2 cm nhưng vẫn còn giữ được cấu trúc cơ ban đầu của thịt cá. Tỷ lệ những

miếng cá có kích thước nhỏ hơn 1,2 cm phải lớn hơn 30 % khối lượng ráo nước.

d. Miếng vụn (Grated or shredded): hỗn hợp của các miếng cá nhỏ đã nấu chín

được làm nhỏ đến kích thước đồng nhất, trong đó các mẩu vụn vẫn tách rời nhau và

không tạo thành bột nhão.

e. Sản phẩm có thể được trình bày theo cách khác sao cho:

Đủ để phân biệt với các dạng trình bày được qui định trong tiêu chuẩn này;

Đáp ứng tấ t cả các yêu cầu khác của tiêu chuẩn này;

Được mô tả đầy đủ trên nhãn để không gây khó hiểu hoặc tránh gây hiểu nhầm

cho người tiêu dùng.

2.1.1.3. Thành phần cơ bản và các chỉ tiêu chất lượng

a. Nguyên liệu

Sản phẩm phải được chế biến từ cá khoẻ mạnh của các loài nêu trong 2.1 và có chất

lượng phù hợp để bán dưới dạng tươi dùng làm thực phẩm.

b. Các thành phần khác

Môi trường đóng hộp và tất cả các thành phần khác được sử dụng phải đạt chất

lượng thực phẩm và phù hợp với các tiêu chuẩn có thể áp dụng được.

c. Sự phân huỷ



Sản phẩm không được chứa hàm lượng histamin lớn hơn 10 mg/100 g tính theo giá

trị trung bình của đơn vị mẫu được thử.

d. Sản phẩm cuối cùng

Sản phẩm thỏa mãn các yêu cầu của tiêu chuẩn này khi các lô hàng được kiểm tra

theo điều 9, đáp ứng các điều khoản của điều 8. Sản phẩm phải được kiểm tra theo các

phương pháp qui định trong điều 7.

2.1.1.4. Phụ gia thực phẩm

Chỉ được phép dùng các phụ gia sau đây:

Phụ gia Mức tối đa trong sản phẩm cuối

cùng

Chất làm dày hoặc tạo đông (chỉ sử dụng trong

môi trường đóng hộp)

GMP

400 Axit alginic

401 Natri alginate

402 Kali alginate

404 Canxi alginate

406 Aga-aga

407 Carrageenan và các muối Na, K và NH4 của

nó (bao gồm furcellaran)

407 a Rong biển Euchema đã chế biến (PES)

410 Gôm đậu carob

412 Gôm gua

413 Gôm tragacan

415 Gôm xanthan

440 Pectin

466 Natri cacboxymetylxenluloza

Chế phẩm amidon GMP

1401 Amidon đã được xử lý bằng axit



1402 Amidon đã được xử lý bằng kiềm

1404 Amidon đã oxi hoá

1410 Monoamidon phosphate

1412 Điamion phosphat este hoá với natri

trimetaphosphat hoặc este hoá với phospho

oxyclorua

1414 Diamidon phosphat đã axetylat hoá

1413 Diamidon phosphat đã phosphat hoá

1420 Amidon axetat este hoá với axetic anhydrite

1421 Amidon axetat este hoá với vinyl axetat

1422 Diamidon adipat đã axetylat hoá

1440 Amidon hydroxypropyl

1442 Amidon hydroxypropyl phosphate

Chất điều chỉnh độ chua GMP

260 Axit axetic

270 Axit lactic (L- , D- và DL-)

330 Axit xitric

450 (i) Dinatri diphosphat 10 g/kg biểu thị theo P2O5 (bao

gồm cả phosphat tự nhiên)

Hương tự nhiên GMP

Dầu hương liệu

Chiết xuất từ gia vị

Hương liệu khói (dung dịch khói tự nhiên và các

chiết xuất của chúng)

Bảng 2.2: Các chất phụ gia được phép sử dụng trong sản xuất cá ngừ đóng hộp

2.1.1.5. Vệ sinh và xử lý

a. Sản phẩm cuối cùng không được có bất kỳ tạp chất lạ nào gây hại đến sức khoẻ

con người.



b. Khi được kiểm tra bằng các phương pháp lấy mẫu và kiểm tra thích hợp theo qui

định, sản phẩm phải:

Không được có các vi sinh vật có thể phát triển trong các điều kiện bảo quản thông

thường;

Không mẫu nào được chứa histamin lớn hơn 20 mg/100 g;

Không được có bất kỳ một chất nào khác kể cả các chất có nguồn gốc từ vi sinh

vật với lượng có thể gây hại đến sức khoẻ, phù hợp với các tiêu chuẩn qui định;

Không được có các khuyết tật ảnh hưởng đến sự nguyên vẹn của hộp mà có thể

tổn hại đến độ kín.

2.1.2. Ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn theo TCVN 7087 : 2008

Tiêu chuẩn này tương đương với CODEX STAN 1 – 2005.

2.1.2.1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn dùng để cung cấp

cho người tiêu dùng hoặc để dùng cho mục đích sử dụng trực tiếp và áp dụng cho các vấn

đề liên quan đến việc giới thiệu chúng.

2.1.2.2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

2.1.2.2.1. Thông báo ( Claim)

Việc ghi nhãn nhằm giới thiệu một thực phẩm có những đặc tính chất lượng liên

quan đến bản chất, nguồn gốc, đặc tính dinh dưỡng, quá trình chế biến, thành phần cấu

tạo hoặc bất kỳ chỉ tiêu chất lượng nào khác của thực phẩm đó.

2.1.2.2.2. Khách hàng ( Consumer)

Người hoặc tổ chức mua hoặc nhận thực phẩm để thỏa mãn nhu cầu của họ.

2.1.2.2.3. Bao bì (Container)

Vật chứa thực phẩm dùng để phân phối ở dạng đơn vị riêng lẻ, bao gồm cả loại bao

phủ kín hoàn toàn hoặc một phần thực phẩm và vật liệu bao bọc bên ngoài. Một bao bì



thực phẩm cung cấp cho khách hàng có thể bao gồm một số đơn vị bao gói hoặc một số

dạng bao gói.

Các thuật ngữ sau đây áp dụng để ghi thời hạn đối với thực phẩm bao gói sẵn:

2.1.2.2.4. Ngày sản xuất ( Date of manufacture )

Ngày mà thực phẩm trở thành sản phẩm như nó đã được mô tả.

2.1.2.2.5. Ngày đóng gói ( Date of packaging)

Ngày mà thực phẩm được cho vào bao bì cuối cùng để bán.

2.1.2.2.6. Thời hạn bán ( Sell – by- date)

Ngày cuối cùng cung cấp dịch vụ bán thực phẩm cho khách hàng, sau đó là thời hạn

bảo quản cho phép còn lại của thực phẩm trong điều kiện bảo quản của khách hàng.

2.1.2.2.7. Ngày hết hạn sử dụng ( Use – by date/ Recommended Last Consumtion

Date. Expiration date)

Ngày kết thúc thời hạn dự tính mà sau đó thực phẩm, dưới các điều kiện bảo quản

xác định, có thể không còn đầy đủ các đặc tính chất lượng vốn có của nó theo mong

muốn thông thường của khách hàng. Sau ngày hết hạn sử dụng, thực phẩm được coi như

không có giá trị mua bán.

2.1.2.2.8. Thực phẩm ( Food).

Tất cả các chất đã hoặc chưa được chế biến nhằm sử dụng cho con người bao gồm

đồ ăn, uống, nhai, ngậm và tất cả các chất được sử dụng để xử lý, chế biến, sản xuất “

thực phẩm”, nhưng không bao gồm mỹ phẩm, thuốc lá và các chất chỉ được dùng như

dược phẩm.

2.1.2.2.9. Phụ gia thực phẩm ( Food additive)

Tất cả các chất mà bản than nó không được tiêu dùng một cách thông thường như

một thực phẩm hoặc như một thành phần đặc trưng của thực phẩm, cho dù nó có hoặc

không có giá trị dinh dưỡng. Những chất này được bổ sung một cách có chủ định vào

thực phẩm vì mục đích công nghệ ( kể cả nhằm cải thiện tích chất cảm quan) trong quá

trình sản xuất, chế biến, xử lý, bao gói, vận chuyển, bảo quản để trực tiếp hoặc gián tiếp



tạo ra kết quả mong muốn cho một thực phẩm hoặc các bán thành phẩm và chúng sẽ trở

thành một thành phần của thực phẩm đó. Thuật ngữ này không bao gồm chất nhiễm bẩn (

Contaminants) hoặc những chất được thêm vào thực phẩm để duy trì hay cải thiện chất

lượng dinh dưỡng của thực phẩm.

2.1.2.2.10. Thành phần ( Ingredient)

Các chất có trong thực phẩm, bao gồm cả phụ gia thực phẩm, được sử dụng trong

quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm và có mặt trong thực phẩm cho dù chúng có thể ở

dạng đã chuyển hóa.

2.1.2.2.11. Nhãn ( Label)

Thẻ, nhãn hiệu, mác, hình ảnh hoặc các hình thức mô tả khác được viết, in, ghi,

khắc nổi, khắc hình một cách trực tiếp hoặc gắn vào bao bì sản phẩm.

2.1.2.2.12. Ghi nhãn ( Labelling)

Bao gồm toàn bộ việc sử dụng các hình thức thể hiện như in, viết, vẽ, tạo hình, kỹ

thuật số, đồ họa để trình bày trên nhãn đi kèm hoặc đính kèm gần thực phẩm để cung cấp

thông tin về thực phẩm đó, kể cả nhằm tăng cường khả năng tiêu thụ và trao đổi thực

phẩm.

2.1.2.2.13. Lô hàng ( Lot)

Một lượng nhất định của hàng hóa đucợ sản xuất trong các điều kiện cơ bản giống

nhau.

2.1.2.2.14. Bao gói sẵn ( Prepackaged)

Việc bao gói hoặc trang trí trước thực phẩm trong một bao bì nhằm sẵn sàng cung

cấp cho khách hàng hoặc dùng cho mục đích sử dụng trực tiếp.

2.1.2.2.15. Chất phụ trợ trong quá trình chế biến ( Processing aid)

Chất hay vật liệu, không bao gồm các dụng cụ hoặc thiết bị, mà bản thân nó không

được tiêu dùng như một thành phần của thực phẩm nhưng được sử dụng một cách có chủ

định trong quá trình xử lý, chế biến nguyên liệu, thực phẩm hay các thành phần thực

phẩm để hoàn thiện một mục đích công nghệ nào đó. Các chất hay các vật liệu này cũng



có thể được tạo ra một cách không có chủ định nhưng không thể tránh được sự tổn dư

hoặc phát sinh của chúng trong thành phần.

2.1.2.2.16. Thực phẩm dùng cho mục đích sử dụng trực tiếp ( Foods for catering

purposes)

Thực phẩm dùng trong các nhà hàng, khách sạn, căng – tin, trường học, bệnh viện,

hay những tổ chức tương tự, những nơi mà thực phẩm được cung cấp cho người tiêu

dùng trực tiếp.

2.1.2.3. Nguyên tắc chung.

a. Không được mô tả, trình bày hoặc ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn một cách sai

lệch, gây hiểu nhầm, lừa dối hoặc theo cách có thể tạo ra nhận thức, ấn tượng

không đúng về đặc tính của sản phẩm trên mọi phương diện.

b. Khi trình bày hoặc mô tả thực phẩm bao gói sẵn, không được dùng những từ ngữ,

hìn ảnh hay các hình thức thể hiện khác để đề cập hay gợi ý trực tiếp về bất cứ một

sản phẩm nào khác, mà sản phẩm có thể gây nhầm lẫn với thực phẩm bao gói sẵn,

hoặc nhằm lừa dối hay làm cho khách hang tin rằng thực phẩm bao gói sẵn có liên

quan đến sản phẩm đó.

2.1.2.4. Ghi nhãn bắt buộc đối với thực phẩm bao gói sẵn

a. Tên của thực phẩm

Trên gọi của thực phẩm bao gói sẵn phải thể hiện đúng bản chất xác thực của nó.

Tên gọi thường phải cụ thể, không trừu tượng.

Trong trường hợp motoj sản phẩm cụ thể có một hay nhiều tên gọi đã được

xác định trong các tiêu chuẩn tương ứng thì phải sử dụng ít nhất một trong

các tên đó cho thực phẩm.

Trong các trường hợp khác, phải sử dụng tên gọi do cơ quan có thẩm quyền

của quốc gia quy định.

Trường hợp tên gọi chưa xác định hoặc chưa được quy định, có thể sử dụng

tên thông dụng kèm theo một thuật ngữ mô tả thích hợp để không gây hiểu

nhầm hoặc lừa dối khách hàng.

Có thể sử dụng “tên tự đặt”, “tên thông dụng” hay “ thương hiệu”, miễn là

phải kèm theo tên gọi như đã quy định trong các điều đã nêu trên đây.

Phải ghi bên cạnh tên gọi của thực phẩm những từ hoặc cụm từ bổ sung cần thiết

nhằm xác định về bản chất thực và tình trạng vật lý của thực phẩm, kể cả môi

trường bao gói, loại, phương pháp và điều kiện xử lý thực phẩm ( như sấy khô, cô

đặc, hoàn nguyên, xông khói…).



b. Liệt kê thành phần

Phải liệt kê các thành phần của thực phẩm trên nhãn trừ khi thực phẩm chỉ có một

thành phần.

Phần tiêu đề thíc hợp có chứa thuật ngữ “ thành phần” phải được ghi phía

dưới hoặc phía trên bảng liệt kê các thành phần có trong thực phẩm.

Tất cả các thành phần phải được liệt kê theo thứ tự giảm dần theo tỉ lệ khối

lượng (m/m) tại thời điểm sản xuất thực phẩm đó.

Khi công bố một thành phần “ phức hợp” mà bản than nó gồm hai hoặc nhiều

“ thành phần cấu thành” thì cần ghi kèm theo các “ thành phần cấu thành” đó,

đặt trong dấu ngoặc đơn và ở sát ngay với thành phần “ phức hợp” tương ứng,

theo thứ tự giảm dần về thành phần khối lượng. Trường hợp thành phần “phức

hợp” có tên gọi đã được xác định ( trong một tiêu chuẩn tương ứng hay một

văn bản phấp quy khác) nhưng chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ hơn 5% khối lượng thực

phẩm thì không nhất thiết phải ghi nhãn những “ thành phần cấu thành”, trừ

khi chúng là các phụ gia thực phẩm góp phần tạo nên các tính chất công nghệ

của thành phẩm.

Phải công bố các thực phẩm và tành phẩm được coi là “nhạy cảm” sau đây

o Ngũ cốc chứa glutten: Nghĩa là lúa mỳ, lúa mạch đen, lúa mạch, yến

mạch, lúa mỳ Spenta và các dòng lai hay sản phẩm của chúng.

o Loài giáp xác và sản phẩm của nó

o Trứng và sản phẩm trứng

o Các và sản phẩm cá

o Lạc, đậu tương và sản phẩm của chúng

o Sữa và sản phẩm sữa ( bao gồm lactoza)

o Các hạt của cây và sản phẩm của chúng

o Sunphit có hàm lượng từ 10 mg/kg trở lên.

Lượng nước được thêm vào thực phẩm phải được ghi trong bảng thành phần

của thực phẩm đó, ngoại trừ trường hợp nước là một thành phần thực phẩm

như nước muối, siro hoặc canh thịt trong một thực phẩm hỗn hợp và được ghi

rõ trong bảng liệt kê các thành phần. Không nhất thiết phải ghi lượng nước

hoặc các chất dễ bay hơi đã bay hơi trong quá trình chế biến.

Ngoài các điều khoản chung của tiêu chuẩn này, đối với thực phẩm đã bị loại

nước hoặc cô đặc mà sẽ được hoàn nguyên chỉ bằng cách thêm nước, có thể

liệt kê các thành phần của sản phẩm hoàn nguyên theo thứ tự giảm dần về tỉ lệ

khối lượng (m/m) miễn là phải kèm theo những công bố như “ các thành phần

của sản phẩm sau khi được xử lý phù hợp với chỉ dẫn ghi trên nhãn”



Phải công bố sự có mặt của tất cả các chất gây dị ứng có nguồn gốc từ các sản

phẩm được liệt kê ở mục trên được chuyển vào thực phẩm hoặc thành phần của

thực phẩm bằng công ngheẹ sinh học.

Nếu không cung cấp đầy đủ các thông tin về sự có mặt của các chất gây dị ứng

trên nhãn, thực phẩm chứa chất gây dị ứng đó không được lưu hành trên thị

trường.

Trong bảng liệt kê các thành phần, phải sử dụng một tên gọi cụ thể, phù hợp với

các điều khoản đã quy định phần tên gọi của thực phẩm cho mỗi thành phần thực

phẩm, ngoại trừ cá trường hợp sau:

Trừ khi các thành phần nêu trên được liệt kê trong bảng công bố những thực phẩm

và thành phần thực phẩm được coi là “ nhạy cảm” và nếu tên trong nhóm chung

không cung cấp các thông tin cần thiết, có thể sử dụng các nhóm tên sau đây:

Tên nhóm Tên của các loại thuộc nhóm

“ Dầu” cùng với thuật ngữ “thực vật”

hoặc “ động vật”, có thể xác định thêm

bằng thuật ngữ “ hydro hóa” hoặc “ hydro

hóa một phần”. khi thích hợp.

Dầu tinh luyện, trừ dầu oliu

“ Mỡ” kèm theo thuật ngữ “ thực vật”

hoặc “động vật”, khi thích hợp.

Các loại chất béo tinh luyện

“ Tinh bột” Các loại tinh bột, trừ tinh bột biến tính

hóa học.

“Cá” Các loại cá khi chúng là một phần của

thực phẩm khác và việc ghi nhãn và trình

bày của thực phẩm này không chỉ rõ một

loại cá cụ thể nào.

“Thịt gia cầm” Các loại thịt gia cầm khi chúng là một

thành phần của thực phẩm khác và việc

ghi nhãn không chỉ rõ một loại thịt gia

cầm cụ thể

“Phomat” Các loại phomat khi phomat hoặc hỗn

hợp phomat là thành phần của thực phẩm

khác và việc ghi nhãn thực phẩm đó

không nhằm vào một loại phomat cụ thể

nào.



“Gia vị” hoặc “hỗn hợp gia vị”, khi thích

hợp

Các gia vị hoặc chất chiết từ gia vị, được

dùng riêng hoặc kết hợp không vượt quá

2% khối lượng thực phẩm.

“Gia vị thảo mộc” hoặc “hỗn hợp gia vị

thảo mộc”, khi thích hợp

Các gia vị thảo mộc khi dùng riêng hoặc

kết hợp không vượt quá 2% khối lượng

thực phẩm.

“Gôm” Các chế phẩm của gôm được sử dụng

trong sản xuất kẹo cao su

“Đường” Các loại đường sacarozo

“Destroza” hoặc “Glucoza” Đường dextroza khan và đường dextroza

ngậm một phần tử nước.

“Muối casein” Các loại muối casein

“Bơ cacao” Các loại bơ cacao, nén, ép, tách hoặc tinh

chế.

“Quả tẩm đường” Các loại quả tẩm đường khi chúng không

vượt quá 10% khối lượng của thực phẩm

đó

Bảng 2.3: một số nhóm tên trong ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn

Cần ghi tên các chất phụ trợ trong quá trình chế biến và các phụ gia được phối chế

vào thực phẩm ở mức không đáng kể hoặc ít hơn mức yêu cầu để đạt được tính

chất công nghệ trong bẩng liệt kê các thành phần của thực phẩm đó Những phụ gia

thực phẩm và chất phụ trợ trong quá trình chế biến được liệt kê trong trong bảng

công bố những thực phẩm và thành phần thực phẩm đucợ coi là “ nhạy cảm”

không áp dụng điều này.

c. Khối lượng tịnh và khối lượng ráo nước.

Phải công bố khối lượng tịnh trên nhãn theo hệ đơn vị đo lường quốc tế (SI).

Phải công bố hàm lượng tịnh theo phương thức sau:

Theo đơn vị thể tích đối với thực phẩm dạng lỏng.

Theo đơn vị khối lượng đối với thực phẩm dạng rắn.

Theo đơn vị khối lượng hoặc thể tích đối với thực phẩm dạng sệt ( nhớt),

bán lỏng.

Phải công bố khối lượng tịnh và khối lượng ráo nước của thực phẩm được bao gói

trong môi trường chất lỏng kèm theo hệ đơn vị đo lường khối lượng chất khô của

thực phẩm. Môi trường chất lỏng trong trường hợp này có thể là nước, dung dịch

đường hoặc muối, dấm và nước ép rau quả ( trong rau quả đóng hộp) hoặc là hỗn

hợp các loại nói trên.



d. Tên và địa chỉ

Phải công bố chính xác tên và địa chỉ của nhà sản xuất, cơ sở đóng gói, nhà phân

phối, tổ chức xuất, nhập khẩu, các đại lý hoặc nhà cung cấp trên nhã của sản phẩm.

e. Nước sản xuất.

- Phải công bố nước sản xuất của thực phẩm trên nhãn trong trường hợp thiếu thông

tin này có thể gây nhầm lẫn hoặc lừa dối khách hàng.

- Trường hợp thực phẩm được chế biến lại tại một nước thứ hai mà làm thay đổi bản

chất của sản phẩm đó thì nước thứ hai được coi là nước xuất xứ để ghi nhãn.

f. Nhận biết lô hàng.

Trên mỗi lô hàng, phải ghi rõ ký hiệu bằng cách dập nổi hoặc các hình thức thể hiện

bền khác, ở dạng mã hóa hoặc dạng thể hiện đầy đủ, để nhận biết về cơ sở sản xuất và lô

hàng đó.

g. Hướng dẫn về thời hạn ghi nhãn và bảo quản.

- Khi các tiêu chuẩn tương ứng không quy định thì áp dụng việc ghi nhãn thời hạn

như sau:

Phải công bố trên nhãn “ thời hạn sử dụng tố nhất”

Thời hạn được ghi nhãn ít nhất phải bao gồm các thông tin:

Ngày, tháng và năm đối với thực phẩm có thời hạn sử dụng tốt nhất không quá ba

tháng;

Tháng và năm đối với thực phẩm có thời hạn sử dụng tốt nhất trên ba tháng. Nếu

thời hạn bắt đầu từ tháng 12, phải ghi rõ năm đó.

Thời hạn phải được ghi rõ bằng các cụm từ.

“ Sử dụng tốt nhất trước…”, trong trường hợp chỉ rõ ngày (nếu có), tháng, năm.

“ Sử dụng tốt nhất cho đến…” hoặc “ kết thúc thời hạn sử dụng tốt nhất…”, trong

các trường hợp khác.

Phải ghi các cụm từ trong mục trên kèm theo:

Hoặc thời hạn cụ thể; hoặc



Giấy chứng nhận, nơi thời hạn được ấn định

Ngày, tháng, năm phải được ghi theo dãy số không mã hóa. Có thể ghi tháng bằng

các chữ cái như ở một số nước nếu việc này không gây nhầm lẫn co khách hàng.

Mặc dù đã dược quy định trong phần đầu của mục (g) nhưng việc ghi nhã thời hạn

sử dụng tốt nhất không áp dụng cho:

Rau quả tươi, bao gồm cả khoai tây chưa gọt vỏ, bị cắt hoặc được xử lý bằng các

phương pháp tương tự;

Rượu vang, rượu mùi, rượu vang có ga, rượu vang ướp hương, rượu vang ướp hoa

quả và rượu vang quả có ga;

Đồ uống chứa không dưới 10% hàm lượng cồn theo thể tích;

Các loại bánh mì, bánh nướng, bánh ngọt, bánh sản xuất hàng loạt từ bột nhào, mà

bản chất thành phần của chúng đã được xác định trước, thường được tiêu thụ trong vòng

24h sau khi sản xuất;

Dấm ăn

Muối ăn các loại

Đường ở thể rắn

Các sản phẩm mứt kẹo chứa các loại đường có mùi và/ hoặc có màu

Kẹo cao su

- Hướng dẫn sử dụng

Phải công bố trên nhãn hướng dẫn sử dụng đối với các sản phẩm cần hướng dẫn sử

dụng, kể cả cách “ tái tạo” thực phẩm đó trước khi sử dụng, để đảm bảo sử dụng thực

phẩm đúng cách.

Những yêu cầu bắt buộc bổ sung ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn.

- Ghi nhãn định lượng các thành phần.



Nếu việc ghi nhãn thực phẩm hay mô tả thực phẩm nhằm đặc biệt nhấn mạnh vào sự

có mặt của một hoặc nhiều thành phần đặc trưng và/ hoặc có giá trị thì phải công bố trên

nhãn tỉ lệ phần trăm hiện có của các thành phần đó theo khối lượng (m/m) tại thời điểm

sảm xuất.

Một cách tương tự, nếu việc ghi nhãn thực phẩm nhằm đặc biệt nhấn mạnh vào sự

có mặt của một hoặc nhiều thành phần có hàm lượng nhỏ thì phải công bố trên nhãn tỉ lệ

phần trăm của thành phần đó theo khối lượng trong thành phần (m/m) tại thời điểm sản

xuất.

Không nhất thiết phải đặc biệt nhấn mạnh thành phần đặc trưng trong tên gọi của

thực phẩm. Sự đề cập đến một thành phần mà bản than nó được sử dụng với một hàm

lượng nhỏ hoặc chỉ sử dụng làm chất tạo hương cũng không nhất thiết phải được nhấn

mạnh khi ghi nhãn thực phẩm.

- Thực phẩm đã qua chiếu xạ

Khi ghi nhãn thực phẩm đã qua xử lý bằng bức xạ ion, phải công bố rõ rang cụm từ

“ thực phẩm đã qua chiếu xạ” ngay bên cạnh tên của thực phẩm. Khuyến khích việc sử

dụng biểu ượng quốc tế về chiếu xạ thực phẩm ( hình vẽ), nhưng khi sử dụng phải đặt

biểu tượng này gần tên của thực phẩm.

hình 3: Biểu tượng thực phẩm qua chiếu xạ

Khi một thực phẩm đã qua chiếu xạ đucợ sử dụng như một thành phần thực phẩm

khác, thực phẩm đó phải được công bố rõ ràng trong bảng liệt kê các thành phần khi ghi

nhãn.

Khi thực phẩm chỉ có một thành phần và được chế biến từ một nguyên liệu đã qua

chiếu xạ, phải ghi rõ việc xử lý này trên nhãn của thực phẩm.

- Miễn áp dụng ghi nhãn bắt buộc



Ngoài gia vị thảo mộc, đối với các bao gói nhỏ, có diện tích bề mặt lớn nhất nhỏ

hơn 10 cm2, có thể miễn áp dụng quy định các điều: liệt kê thành phần, nhận biết lô hàng

đến mục hướng dẫn sử dụng.

- Ghi nhãn không bắt buộc

Có thể trình bày trên nhãn tất cả các thông tin hay các hình tượng trưng bằng cách

in, viết, vẽ hoặc các hình thức đồ hòa khác nhưng không được mâu thuẫn vơi những quy

định ghi nhãn bắt buộc của tiêu chuẩn này hoặc mâu thuẫn với quy định liên quan đến

việc thông báo đã nêu ở phần trên.

Cho phép sử dụng dấu phân dạng chat lượng trên nhãn, nhưng có dấu hiệu đó phải

dễ hiểu và không gây hiểu nhầm trên mọi phương tiện.

- Trình bày các thông tin ghi nhãn bát buộc.

Khái quát

Nhãn thực phẩm bao gói phải được gắn vào bao bì thực phẩm sao cho không bị

bong, rơi hoặc tách rời khỏi bao bì.

Nhãn phải ở vị trí dễ nhìn thấy, rõ ràng, không nhòe, bền màu, không tẩy xóa được

và dễ đọc đối với khách hàng khi mua sắm hoặc sử dụng trong nhứng điều kiện bình

thường.

Khi bao bì thực phẩm được bao bọc thì mặt bên ngoài của lớp vật liệu bao bọc phải

có những thông tin cần thiết của nhãn hoặc lớp vật liệu bao bọc đó phải cho phép đọc

được các nội dung của nhãn trên bao bì bên trong nó.

Tên gọi và hàm lượng tịnh của thực phẩm phải hiển thị ở nơi dễ thấy trên nhãn và trong

cùng một tầm nhìn.

Ngôn ngữ

Nếu ngôn ngữ của nhãn gốc không được chấp nhận, đối với khách hàng đã định, thì

có thể sử dụng một nhãn phụ chứa các thông tin ghi nhãn bắt buộc bằng ngôn ngữ khách

hàng yêu cầu thay vì phải ghi nhãn lại.

Trường hợp ghi nhãn lại hoặc sử dụng một nhãn phụ thì những thông tin ghi nhãn

bắt buộc phải được cung cấp đầy đủ và phản ánh chính xác như bản gốc.



Chú ý:

Ngoài các quy định trong tiêu chuẩn TCVN 7087 : 2002 còn một số quy định

riêng cho sản phẩm cá ngừ đóng hộp như sau:

a. Tên sản phẩm

Tên sản phẩm ghi trên nhãn phải là "cá ngừ" được ghi trước hoặc ghi sau tên

thường gọi của loài đó phù hợp với qui định mà không gây nhầm lẫn cho người

tiêu dùng.

Tên sản phẩm có thể được mô tả hoặc kèm theo thuật ngữ mô tả màu sắc của sản

phẩm, "trắng" chỉ dùng cho cá Thunnus alalunga, còn thuật ngữ “sáng”, “tối” và

“hỗn hợp” được dùng phù hợp với qui định.

b. Dạng trình bày

Dạng trình bày như trong 2.3 phải được ghi đúng với tên thường gọi.

Tên của môi trường đóng hộp phải là một phần của tên gọi sản phẩm.

2.1.3. TCVN 7266 : 2003 quy phạm thực hành đối với thủy sản đóng hộp.

2.1.3.1. Định nghĩa

Trong quy phạm này sử dụng các thuật ngữ sau đây:

"Bộ phận bài khí" (bleeders): Gồm các lỗ thoát rất nhỏ để hơi nước đi vào thiết bị

thanh trùng trong quá trình gia nhiệt. Sự bài khí làm cho hơi nước tuần hoàn trong thiết bị

thanh trùng và bảo đảm loại bỏ hết không khí lẫn với hơi nước vào trong thiết bị thanh

trùng;

"Sự phồng hộp" (buckle): là hộp sản phẩm sau khi ghép mí và thanh trùng bị phồng

lên do áp suất bên trong được hình thành khi thanh trùng hoặc trong quá trình làm nguội

hoặc do sự hình thành khí bên trong hộp;

"Thủy sản đóng hộp" (canned fish): là cá hoặc động vật giáp xác, nhuyễn thể được

đựng trong các hộp đã được ghép mí kín vỡ được thanh trùng đủ để tiêu diệt hoặc kìm

hãm tòan bộ vi sinh vật mà chúng có thể phát triển ở nhiệt độ bảo quản và làm hỏng sản

phẩm hoặc có thể gây độc cho người ăn.

Trong tiêu chuẩn này cụm từ "thuỷ sản đóng hộp" bao gồm cả động vật giáp xác, nhuyễn

thể đóng hộp,tiêu chuẩn này không bao gồm hàm ý khác;

"Làm lạnh" (chilling): Là quá trình hạ nhiệt độ của cá hoặc động vật giáp xác,

nhuyễn thể đến nhiệt độ tan băng;

"Nước biển sạch" (clean sea water): Là nước biển đáp ứng các tiêu chuẩn về vi sinh

như nước uống được và không chứa các chất không mong nuốn;

"Làm sạch" (cleaning): Là sự loại bỏ các chất bẩn ra khỏi bề mặt;



"Thời gian nâng nhiệt" (come-up time): là thời gian cần thiết để nâng nhiệt độ của

thiết bị thanh trùng đã được xếp hộp vào đến nhiệt độ quy định;

"Nhiễm bẩn" (contamination): Là sự xâm nhập các chất bẩn trực tiếp hay gián tiếp

vào thuỷ sản;

"Khử trùng" (disinfection): Là việc áp dụng các tác nhân vật lý, hoá học hợp vệ

sinh vào quá trình để loại bỏ các vi sinh vật có hại trên bề mặt sản phẩm;

"Cá" (fish): Là các động vật xương sống máu lạnh sống dưới nước, bao gồm cá, cá

mang tấm và cá miệng tròn, trừ động vật có vú sống dưới nước, động vật không xương

sống vỡ loài lưỡng cư;

"Phồng lý " (flipper): Là hộp sản phẩm đã ghép mí và thanh trùng nhìn bề ngòai

bình thường, nhưng nắp hoặc đáy hộp có thể bị phồng lên do tác động cơ học. Chỉ cần ấn

nhẹ sẽ làm cho nắp hoặc đáy hộp trở lại phẳng hoặc bị lõm nhẹ;

"Cá hoặc động vật giáp xác, nhuyễn thể tươi" (fresh fish or shellfish): Là cá hoặc

động vật giáp xác, nhuyễn thể được bắt lên còn tươi không được xử lý bằng chất bảo

quản hoặc chỉ được bảo quản bằng việc làm lạnh;

"Khoảng trống trên hộp" (headspace): Là khoảng trống còn lại trong hộp sản phẩm

cho phép các phần bên trong hộp giãn nở khi gia nhiệt;

"Xử lý nhiệt " (heat process): Là việc xử lý các hộp sản phẩm đã ghép mí ở nhiệt độ

đủ để tiêu diệt hoặc kìm hãm các vi sinh vật có thể phát triển ở nhiệt độ bảo quản sản

phẩm vỡ có thể gây hại cho người dùng. Quá trình thanh trùng thực tế thường được xem

là khoảng thời gian mà sản phẩm cụ thể cần duy trì ở nhiệt độ quy định;

"Thời gian xử lý nhiệt " (heat processing time): Là thời gian để các hộp sản phẩm

đã ghép mí được lưu giữ ở nhiệt độ quy định;

"Hộp kín " (hermetically sealed): Nghĩa là kín khí;

"Hộp hở " (leaker): Là hộp sản phẩm đã ghép mí và xử lý nhiệt có khuyết tật làm

cho nước, khí hoặc vi sinh vật có thể lọt qua;

"Hộp bẹp" (panelled container): Là hộp kim loại đựng sản phẩm đã ghép mí và

thanh trùng, bị bẹp một phần do không đủ cứng để chịu độ chân không bên trong hoặc nó

chịu áp lực bên trong trong suốt thời gian làm nguội;

"Nhà máy hoặc phân xưởng" (plant or establishment): Là một hoặc một dãy nhà

hoặc một phần của chúng được sử dụng để sản xuất hoặc bảo quản sản phẩm;

"Nước uống được" (potable water): Là nước sạch thích hợp để dùng cho con người

vỡ có các chỉ tiêu chất lượng không thấp hơn các mức quy định tương ứng nêu trong ấn

bản "Tiêu chuẩn quốc tế về nước uống" mới nhất của tổ chức y tế thế giới;

"Thiết bị thanh trùng" (retort): Là nồi chịu áp lực được thiết kế để gia nhiệt bằng

hơi nước bão hòa hoặc nước nóng với áp lực khí nén dùng để xử lý nhiệt sản phẩm đã

được đóng hộp, ghép mí kín;



"Hơi nước bão hòa" (saturated steam): là hơi nước sạch mà nhiệt độ hơi nước phụ

thuộc hoàn toàn vào áp suất cuả nó;

"Loài giáp xác, nhuyễn thể" (shellfish): Là các loài động vật không xương sống và

giáp xác bao gồm cả nhuyễn thể chân đầu được dùng làm thực phẩm;

"Tách vỏ" (shelling): Là quá trình lấy thịt ra khỏi vỏ nhuyễn thể, giáp xác bằng tay

hay bằng máy;

"Hộp phồng " (springer): Là hộp bằng kim loại đã ghép mí và thanh trùng có một

đáy bị phồng. Nếu ấn vào đáy thì đáy kia sẽ phồng lên;

"Cháy ngún" (stack- burn): Là chất lượng của hộp sản phẩm bị hỏng do làm nguội

không đủ sau quá trình thanh trùng. Điều này thường xảy ra đối với sản phẩm khi xếp

hộp quá dày hoặc hộp được lấy ra khi còn nóng;

"Phồng" (swell): Là hộp sản phẩm làm bằng kim loại đã ghép mí bị phồng cả hai

đáy hộp do áp suất của khí trong hộp;

"Vật liệu chống ăn mòn thích hợp" (suitable corrosion-resistant material): Là vật

liệu không thấm nước, không lồi lõm, không bị rỉ, không độc hại và không chịu tác động

của nước biển nước đá, dịch nhớt của cá hay bất cứ chất bào mòn nào khác. Bề mặt của

vật liệu chống ăn mòn phải nhẵn và dễ làm sạch bằng các chất tẩy rửa;

"Đuổi khí" (venting): Là quá trình đẩy không khí ra khỏi thiết bị thanh trùng bằng

hơi ở giai đoạn đầu của quá trình gia nhiệt. Một lượng hơi nước đáng kể được đi vào thiết

bị thanh trùng để đuổi không khí đi ra bằng cách mở các van ở phía trên thiết bị thanh

trùng.

2.1.3.2. Yêu cầu đối với nguyên liệu.

a. Yêu cầu chung

Không sử dụng bất kỳ một loại cá, động vật giáp xác, nhuyễn thể hay thành phần

khác đã bị ươn hỏng, hoặc đã bị nhiễm bẩn các chất lạ tới mức làm cho sản phẩm không

theerd ùng làm thực phẩm cho con người.

Nguyên liệu cần phải loại bỏ nếu có chứa các chất có hại. đã bị phân hủy hoặc tạp

chất lạ không thể loại bỏ đến mức có thể chấp nhận được bằng các quy trình phân loại

thông thường.

Cá hoặc động vật giáp xác, nhuyễn thể bị bệnh cần phải loại bỏ hoặc bỏ phần bị

bệnh đi. Chỉ sử dụng những con cá hoặc động vật giáp xác, nhuyễn thể khỏe mạnh và

tươi sống để sản xuất đồ hộp.

Cá hoặc động vật giáp xác, nhuyễn thể tươi sống dùng để chế biến đồ hộp cần được

giữ cẩn thận từ khi đánh bắt cho đến khi chế biến nhiệt giống như khi chúng đucợ bảo

quản để bán ở dạng tươi sống trên thị trường.



Nếu nguyên liệu cá ngừ được cấp đông trong nước muối trên tàu đánh cá cần phải

lưu ý để tránh thịt cá bị ngâm muối quá mặn.

Vì thực tế rất khó loại muối ra khỏi cá nên lượng muối cao trong nguyên liệu được

nhận để làm cá hộp có thể tạo ra vị không phù hợp của thành phẩm. Nếu muối bị ngấm

quá mặn vào, thịt cá có thể bị biến tính mà không thể dùng để chế biến cá hộp được nữa.

Nhà máy cá cần xác định hàm lượng muối khi tiếp nhận cá đã được làm lạnh trong nước

muối.

Khi không thể ướp nước đá cho cá trên tàu ở ngoài khơi, cần nhanh chóng đưa cá về

nhà máy đóng hộp và chế biến càng sớm càng tốt sau khi đưa cá lên bờ.

Cá nhỏ có nhiều thức ăn trong bụng sau khi bắt dưới nước lên không được

đem đóng hộp khi chưa bỏ nội tạng.

Nếu ruột cá đầy thức ăn khi chúng chết, các enzym có mặt sẽ bắt đầu phân giải cơ

thịt cá cũng như thức ăn.

Cá nhỏ nhìn chung được bỏ nội tạng bằng cách lấy nội tạng ra khi bỏ đầu cá.

Phương pháp này sẽ không có kết quả nếu bụng cá đầy thức ăn. Tuy nhiên nếu thức ăn bị

vỡ ra trong cá nó sẽ bị hư hỏng nhanh chóng và thịt cá ở gần ổ bụng sẽ bị phân huỷ. Hình

thức bề ngoài và mùi vị của sản phẩm đóng hộp sẽ bị ảnh hưởng, thường không thể bán

được.

Trong một số trường hợp cá ăn no có thể được giữ sống một thời gian đủ để cho

ruột cá không còn gì nữa trước khi bắt ra khỏi nước.

2.2. Quy chuẩn kỹ thuật Việt Nam.

QCVN 8-2:2011/BYT: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim

loại nặng trong thực phẩm ( National technical regulation on the limits of metals

contamination in food).

Theo quy chuẩn Việt Nam 8-2:2011/ BYT quy định:



TT Kim loại nặng PTWI (mg/kg thể trọng) Ghi chú

1 Arsen (As) 0,015 Tính theo Arsen vô cơ

2 Cadimi (Cd) 0,007

3 Chì (pb) 0,025

4 Thủy ngân (Hg) 0,005

5 Methyl thủy ngân (MeHg) 0,0016

6 Thiếc (Sn) 14

Bảng 2.4: Lượng ăn vào hàng tuần có thể chấp nhận được tạm thời

STT Tên thực phẩm ML

(mg/kg hoặc mg/l)

Giới hạn ô nhiễm cadmi (Cd)

1 Cá cơm, cá ngừ, cá vền hai sọc, cá

chình, cá đối mục, cá song Nhật Bản,

cá Luvar, cá mòi, cá trích.

0,1

Giới hạn ô nhiễm chì (Pb)

1 Cơ thịt cá 0,3

Giới hạn ô nhiễm thủy ngân (Hg)

1 Cá vây chân, cá ngừ, cá chình, cá

sơn, cá bơn buồm, cá phèn, cá nhông

lớn, cá tuyết nhỏ, cá nhám góc, cá

đuối, cá vây đỏ, cá cờ lá, cá hố, cá

bao kiếm, cá vền biển, cá mập, cá thu

rắn, cá tầm, cá kiếm

1

Giới hạn ô nhiễm methyl thủy ngân (MeHg)

1 Cá ăn thịt ( cá ngừ, cá mập, cá măng

và các loại cá khác)

1,0

Giới hạn ô nhiễm thiếc (Sn) trong thực phẩm

1 Các thực phẩm đóng hộp khác 250

Bảng 2.5: giới hạn ô nhiễm kim loại nặng của cá ngừ đóng hộp

III. Các phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm cá ngừ đóng hộp

theo TCVN

3.1. Lấy mẫu, kiểm tra và phân tích ( theo TCVN 6388:2006)

3.1.1. Lấy mẫu



Việc lấy mẫu các lô hàng để kiểm tra sản phẩm cuối cùng như qui định trong 3.3

phải phù hợp với

Phương án lấy mẫu thực phẩm bao gói sẵn của Uỷ ban tiêu chuẩn thực phẩm

Codex (AQL-6,5) (CODEX STAN 233-1969).

Việc lấy mẫu các lô hàng để kiểm tra khối lượng tịnh và khối lượng ráo nước phải

tiến hành theo phương án lấy mẫu thích hợp đáp ứng các chuẩn cứ qui định.

3.1.2. Kiểm tra cảm quan và kiểm tra vật lý

Mẫu được lấy để kiểm tra cảm quan và kiểm tra vật lý phải được thực hiện bởi

người được đào tạo về kiểm tra và tiến hành theo 3.1.3 (xác định khối lượng tịnh) đến

3.1.5 (Xác định khối lượng ráo nước đã được rửa (đối với hộp có nước sốt)) của Phụ lục

A và Các hướng dẫn về đánh giá cảm quan cá và động vật có vỏ trong phòng thử nghiệm

(CAC/GL 31 – 1999).

3.1.3. Xác định khối lượng tịnh ( theo TCVN 6388: 2006)

Khối lượng tịnh của tất cả các đơn vị mẫu phải được xác định theo trình tự sau:

Cân hộp chưa mở.

Mở hộp và lấy sản phẩm ra.

Cân hộp rỗng, (kể cả nắp) sau khi đã lấy hết chất lỏng và thịt cá.

Khối lượng tịnh là hiệu số của khối lượng hộp chưa mở và khối lượng của hộp rỗng.

3.1.4. Xác định khối lượng đã ráo nước ( theo TCVN 6388 : 2006)

Khối lượng đã ráo nước của tất cả các đơn vị mẫu phải được xác định theo trình tự sau:

Duy trì hộp ở nhiệt độ từ 200C đến 300C ít nhất là 12 giờ trước khi kiểm tra.

Mở và nghiêng hộp để đổ lượng chứa lên rây tròn đã biết trước khối lượng, rây

có mắt lưới vuông kích thước 2,8 mm x 2,8 mm.

Nghiêng rây một góc khoảng từ 170 đến 200, để cho cá ráo nước (khô) trong 2

phút, tính từ khi đổ sản phẩm lên rây.

Cân rây có đựng cá đã ráo nước.

Khối lượng của cá đã ráo nước thu được bằng cách lấy khối lượng của rây đựng

cá đã ráo nước trừ đi khối lượng của rây.

3.1.5. Xác định khối lượng ráo nước đã được rửa (đối với hộp có nước sốt) ( theo TCVN

6388: 2006)

Duy trì hộp ở nhiệt độ từ 200C đến 300C ít nhất là 12 giờ trước khi xác định.

Mở, nghiêng hộp và dùng nước ấm (khoảng 400C) đựng trong chai rửa (thí dụ

bằng chất dẻo) để rửa phần nước sốt bám dính và rửa toàn bộ cá đựng trên rây

tròn đã biết trước khối lượng.



Rửa cá trên rây bằng nước ấm cho đến khi sạch hết nước sốt; nếu cần, tách riêng

các thành phần (gia vị, rau, quả) bằng kẹp panh. Nghiêng rây một góc khoảng từ

170 đến 200, để cho cá ráo nước trong 2 phút, tính từ khi kết thúc công đoạn rửa.

Làm khô nước bám ở đáy rây bằng giấy thấm. Cân rây có đựng cá đã được rửa

và ráo nước.

Khối lượng của cá đã được rửa và ráo nước thu được bằng cách lấy khối lượng

của rây có đựng cá đã được rửa và ráo nước trừ đi khối lượng của râ

3.1.6. Kiểm tra dạng trình bày

Việc trình bày tất cả các đơn vị mẫu được kiểm tra theo trình tự sau:

Mở hộp và tách nước sốt chứa trong hộp theo 3.1.4 ( cách xác định khối lượng

đã ráo nước).

Lấy cá ra và cho vào một cái rây đã cân bì có cỡ lỗ 1,2 cm gắn với một nồi hứng.

Dùng dao tách cẩn thận các miếng cá mà không làm vỡ miếng cá. Đảm bảo các

miếng cá nhỏ hơn được chuyển lên phía trên mắt lưới rây để chúng lọt được qua

lưới xuống nồi hứng.

Tách phần thu được trong nồi ra thành các phần riêng biệt gồm những lát cá

mỏng, miếng vụn và bột nhão rồi cân riêng từng phần để xác định khối lượng

của mỗi phần.

Nếu ghi là “cá khúc" thì cân rây cùng với cá còn lại trên đó và ghi khối lượng.

Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng của rây để xác định khối lượng của cá

khúc và cá khoanh.

Nếu ghi là “cá khoanh" thì bỏ tất cả các miếng nhỏ (các khúc) ra khỏi rây rồi cân

lại. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng của rây để xác định khối lượng của “cá

khoanh".

Tính toán

Biểu thị khối lượng của phần cá cắt lát, miếng vụn (vụn nát và bột nhão) theo phần

trăm của tổng khối lượng cá đã ráo nước.

% cá cắt lát =

Khối lượng cá cắt lát

x 100 Tổng khối lượng cá ráo

nước

Tính khối lượng của phần cá khúc và cá khoanh còn lại trên rây theo phần trăm

của tổng khối lượng cá đã ráo nước.



% cá khúc và cá khoanh =

Khối lượng cá khúc và cá

khoanh

x100 Tổng khối lượng cá ráo nước

Tính khối lượng của cá khoanh còn lại trên rây theo phần trăm của tổng khối

lượng cá đã ráo nước.

% cá khoanh =

Khối lượng cá khoanh

x 100 Tổng khối lượng cá ráo

nước

3.1.7. Xác định histamin

Xem AOAC 977.13, Xác định histamin trong hải sản. Phương pháp huỳnh quang.

Với lượng cho phép hàm lượng histamin trong sản phẩm không được chứa hàm

lượng histamin lớn hơn 10 mg/100 g tính theo giá trị trung bình của đơn vị mẫu được thử.

Không được có bất kì mẫu thử nào có hàm lượng histamine lớn hơn 20 mg/100g.

3.1.8. Xác định khuyết tật

Đơn vị mẫu bị coi là khuyết tật nếu có một trong các đặc điểm sau:

3.1.8.1. Tạp chất lạ

Sự có mặt của bất kỳ chất nào có trong đơn vị mẫu mà không có nguồn gốc từ cá,

không gây hại cho sức khoẻ con người, và dễ dàng phát hiện được mà không cần phải

khuyếch đại hoặc ở mức xác định được bằng bất kỳ phương pháp nào, kể cả phương pháp

khuyếch đại và cho thấy không phù hợp với thực hành sản xuất tốt và thực hành vệ sinh

tốt.

3.1.8.2. Mùi

Đơn vị mẫu bị ảnh hưởng do có mùi hoặc hương khó chịu và dễ nhận thấy chứng tỏ

sự giảm chất lượng hoặc ôi dầu.

3.1.8.3. Cấu trúc

Thịt quá nhão không đặc trưng cho các loài được giới thiệu; hoặc b) thịt quá cứng

không đặc trưng cho các loài được giới thiệu; hoặc

Thịt bị rỗ tổ ong lớn hơn 5 % khối lượng ráo nước.



3.1.8.4. Sự biến màu

Đơn vị mẫu bị ảnh hưởng bởi sự biến màu rõ do có sự phân huỷ hoặc ôi dầu hoặc do

bị sunphua hoá nhiều hơn 5 % khối lượng tịnh.

3.1.8.5. Chất không mong muốn

Đơn vị mẫu bị ảnh hưởng bởi các tinh thể "struvit " có chiều dài lớn hơn 5 mm

3.2. TCVN 8342 : 2010 Thủy sản và sản phẩm thủy sản (phát hiện Salmonella bằng

kỹ thuật phản ứng chuỗi Polymeraza (PCR)) Fish and fishery products

Detection of Salmonella using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique

3.2.1. Nguyên tắc

Phương pháp này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích (một đoạn trong gen invA)

có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản

phẩm khuếch đại trên gel agaroza, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng

đèn cực tím (UV) ở bước sóng 302 nm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di

sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã

định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch

đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.

Chú thích: Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion)

giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của

tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI-1 (Salmonella

pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S.

bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I. InvA là một bản gen luôn có mặt

trong hệ thống gen inv.

3.2.2. Thuốc thử, môi trường và vật liệu

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước được sử dụng là nước cất hoặc

nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.2.3. Cặp mồi

Gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai

trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của

hai mồi như sau:

invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3';

invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3'.



Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE.

Đệm TE có thành phần như sau: 10 mM Tris-HCl (pH = 8) và 1 mM EDTA.

3.2.4. Môi trường nuôi cấy

Khuyến khích sử dụng môi trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho

phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có

thành phần phù hợp như dưới đây.

Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản

xuất. Trong trường hợp sử dụng các vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành

phần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh và sinh học phân tử.

Dung dịch đệm pepton

a. Thành phần

Pepton (C5H10O5) 10,0 g

Natri clorua (NaCl) 5,0 g

Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) 3,6 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,5 g

Nước 1 000 ml

b. Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần trong nước, đun tan, phân phối vào trong các bình chứa phù

hợp. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 min, pH sau khi khử trùng là 7,0 0,2 ở

25 0C.

Hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR 1,1x

a. Thành phần

Taq polymeraza 0,025 U/l (1,25 U/50 l)

Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25 0C) 75 mM

Amoni sulfat [(NH4)2SO4] 20 nM

Tween 20 0,01 % (thể tích)

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200 M (mỗi loại)

Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM



b. Chuẩn bị

Tất cả các thành phần trên được pha chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt độ

4 0C trong 1 tháng. Có thể bảo quản ở nhiệt độ – 20 0C trong 1 năm. Không nên rã đông

và tái đông dung dịch đã pha chế nhiều lần.

Thang ADN

Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp. Có

thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo trong

phương pháp này.

Agaroza

Agaroza sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ

hơn 1 000 bp.

Đệm điện di TAE 1x

a. Thành phần

Tris 4,84 g

Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0 2 ml

Axit axetic băng 1,14 ml

Nước vừa đủ 1 000 ml

b. Chuẩn bị

Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha loãng với

nước thành dung dịch 1x.

Đệm tải mẫu 6x

a. Thành phần

Glyxerol 30 %

Xanh bromphenon 0,25 %

Tris 200 mM

Na2EDTA 20 mM

b. Chuẩn bị

Các thành phần trên được pha trong nước, bảo quản ở nhiệt độ 4 0C.



Thuốc nhuộm AND, dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml.

CẢNH BÁO – Thuốc nhuộm etyl bromua là một chất độc có thể gây ung thư cho

người và động vật. Do đó, khi sử dụng hoá chất này phải có găng tay và kính bảo hộ.

Dung dịch sau khi sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ.

CẢNH BÁO – Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ.

Bộ chụp ảnh trên đèn UV.

Ống Eppendorf, 0,2; 0,5 và 1,5 ml, loại chuyên dùng cho PCR.

3.2.5. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không

bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy

mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có

tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thoả thuận về vấn đề này.

3.2.6. Cách tiến hành

Phần mẫu thử

Cân chính xác 25 g mẫu thử (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi

cho vào bình nón hoặc bao PE vô trùng.

Tăng sinh

Giai đoạn tăng sinh được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên

tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu

lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm.

Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0 0C 1,0 0C trong khoảng 18 h 2 h.

Xử lý mẫu giải phóng ADN

Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau

khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN. Cách xử lý như sau:

a) Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể tích 1,5

ml, ly tâm với tốc độ 10 000 r/min trong 5 min rồi loại bỏ phần nước. Rửa sinh khối với

nước rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước.

b) Pha loãng huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước. Đun sôi cách thuỷ trong

10 min. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 r/min trong 5 min để lắng các



mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn ADN để tiến hành

phản ứng khuếch đại.

Khuếch đại

Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt

bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.

CẢNH BÁO:

Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc

tăng sinh hay chuẩn bị mẫu.

Phòng thử nghiệm phải được bố trí tách khỏi khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch

đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây

kết quả dương tính giả.

Chuẩn bị ống khuếch đại

Hút 45 l hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR dung tích

0,2 ml hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 l mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 l mẫu

khuôn ADN. Tổng dung tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.

Đối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella

chuẩn đã biết.

Đối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước.

Chương trình khuếch đại

Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại

như sau:

Duy trì nhiệt độ 95 0C trong 5 min để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong

mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95 0C/60 s; 54 0C/45 s và 72 0C/60 s. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72 0C trong 10 min, sau đó

giữ ổn định ở nhiệt độ 20 0C cho đến khi điện di.

3.2.7. Điện di sản phẩm khuếch đại

Chuẩn bị gel điện di agaroza 1 %

Gel agaroza 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay

điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 mm đến 4

mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.

Chuẩn bị dịch điện di



Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 l đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều.

Điện di

Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng

dương. Nạp 10 l dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agaroza. Tiến hành điện di trong

60 min ở hiệu điện thế 100 V.

3.2.8. Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại

Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu

Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 l

nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di.

Nhuộm gel

Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 min. Rửa gel bằng nước

trong khoảng 3 min đến 5 min để loại bỏ phần etyl bromua dư.

Quan sát, chụp hình

Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát

các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả.

3.2.9. Đọc và diễn giải kết quả

Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có sản

phẩm khuếch đại ADN với kích thước 520 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm

này.

Mẫu được kết luận là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp

trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại, hay sản

phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp.


Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều

được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

kết quả thử nghiệm thu được.



3.3. TCVN 8343 : 2010 Thủy sản và sản phẩm thủy sản ( phát hiện acid Boric và

muối Borat) Fish and fishery products Detection of boric acid and borates


Mẫu sản phẩm thủy sản được chiết thử sơ bộ bằng dung dịch nước hoặc thử xác

nhận bằng than hoá trước khi chiết. Axit boric và muối borat có trong dịch chiết đã được

axít hoá tác dụng với curcumin trên giấy nghệ tạo thành phức màu cam đỏ. Trong môi

trường hơi amoniac (NH3) màu cam đỏ chuyển thành màu xanh lục và trở lại màu đỏ bởi

hơi axit clohydric (HCl).

3.3.2. Thuốc thử và vật liệu

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng

nước cất đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

Dung dịch axit clohydric (HCl), đậm đặc.

Dung dịch amoni hydroxit (NH4OH), đậm đặc.

Nước vôi hoặc sữa vôi.

Giấy nghệ, chuẩn bị như sau:

Hòa tan 0,5 g curcumin (hoặc 1,5 g đến 2,0 g bột nghệ) trong 100 ml etanol 80 %

trong bình nón 250 ml (4.2). Lắc mạnh bình trong 5 min rồi lọc lấy dịch trong. Nhúng tờ

giấy lọc (4.7) vào dung dịch vừa lọc rồi để khô. Sau 1 h, cắt giấy nghệ thành những mảnh

có kích thước 6 cm x 1 cm. Bảo quản giấy nghệ nơi tối.


3.3.3.1. Thử sơ bộ

Dùng đũa thuỷ tinh khuấy trộn đều 25 g mẫu đã xay với 10 ml nước trong bình nón

125 ml rồi đậy miệng bình bằng mặt kính đồng hồ.

Đun từ từ bình nón trên bếp điện cho đến khi dung dịch sôi. Chú ý phải lắc đều khi

đun. Làm nguội mẫu rồi lọc dịch trong bằng giấy lọc.

Axit hóa dịch lọc bằng dung dịch HCl đến khi pH = 5 rồi rót dịch vào trong ống

nghiệm 15 ml.

Nhúng một đầu giấy nghệ vào trong ống nghiệm chứa dịch mẫu cho ngập khoảng

1/2 chiều dài tờ giấy. Lấy giấy ra rồi để khô tự nhiên. Quan sát màu của giấy thử, tiến

hành đọc kết quả theo 3.3.6.

3.3.3.2. Thử xác nhận



Tiến hành thử khẳng định đối với các mẫu cho kết quả dương tính trong phép thử sơ bộ

theo qui trình sau:

Kiềm hoá 25 g mẫu với nước vôi hoặc sữa vôi trong chén sứ.

Đun từ từ mẫu trong chén sứ trên bếp điện cho bay hơi đến khô.

Đặt chén sứ vào trong lò nung ở nhiệt độ 3500C trong 4 h cho đến khi các chất hữu

cơ cháy thành than hoàn toàn. Sau đó, để nguội rồi hoà tan cặn với 4 ml nước và

thêm từng giọt dung dịch HCl cho đến khi dung dịch có tính axit rõ rệt (pH = 5).

Lọc dung dịch vào ống nghiệm.

Nhúng một đầu giấy nghệ vào trong ống nghiệm chứa dịch mẫu cho ngập khoảng

1/2 chiều dài tờ giấy. Lấy giấy ra rồi để khô tự nhiên. Quan sát màu của giấy thử,

tiến hành đọc kết quả theo 3.3.6.

3.3.4. Đọc kết quả

Nếu có borat trong mẫu thì giấy nghệ chuyển sang màu cam đỏ đặc trưng. Đặt giấy

nghệ lên miệng ống nghiệm chứa dung dịch amoni hydroxit . Giấy nghệ phải chuyển

sang màu xanh lục và trở lại màu đỏ khi đặt giấy trên ống nghiệm chứa axit clohydric



Mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

Phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

Mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi

là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

Kết quả thử nghiệm thu được.

3.4. TCVN 8344 : 2010 thủy sản và sản phẩm thủy sản ( phát hiện ure) Fish and

fishery products Detection of urea


Mẫu sản phẩm được chiết với dung dịch nước. Urê có trong dịch chiết phản

ứng với thuốc thử p-dimetylaminobenzaldehyt tạo phức màu vàng chanh đặc trưng.

3.4.2. Thuốc thử


nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

Dung dịch p-dimetylaminobenzaldehyt (DMAB)



Hòa tan 8,00 g p-dimetylaminobenzaldehyt trong 500 ml etanol 95 % rồi thêm 50

ml axit clohyđric đậm đặc 12 M. Bảo quản dung dịch tránh ánh sáng. Dung dịch sử dụng

được trong vòng 1 tháng. Pha loãng dung dịch 10 lần trước khi sử dụng và chỉ sử dụng

trong ngày.


3.4.3.1. Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hoá khoảng 200 g mẫu sản phẩm thủy sản bằng máy nghiền.

Cân 25 g mẫu đã xay nghiền, chính xác đến 0,1 mg, đưa vào bình nón dung tích 50

ml. Thêm 25 ml nước cất rồi khuấy trộn đều bằng đũa thuỷ tinh. Sau đó, đậy miệng bình

bằng mặt kính đồng hồ.

Đun từ từ bình nón trên bếp điện cho đến sôi. Chú ý lắc đều bình nón khi đun. Làm

nguội mẫu rồi dùng giấy lọc Whatman để lọc lấy dịch trong.

3.4.3.2. Tiến hành thử

Nhỏ 5 giọt đến 6 giọt dịch mẫu vào trong ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch thuốc

thử urê. Đun nóng dung dịch trong 1 min.

Quan sát màu dung dịch. Kết luận mẫu có urê nếu màu dung dịch trong ống nghiệm

chuyển sang màu vàng chanh đậm. Nồng độ của urê trong mẫu càng cao thì màu vàng của

dung dịch càng đậm.









3.5. TCVN 8345 : 2010 Thủy sản và sản phẩm thủy sản xác định dư lượng sulfonamit

( phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao) Fish and fishery products

Determination of sulfonamide residues Method using high-performanc

liquid chromatography




Các chất nhóm sulfonamit có trong mẫu sản phẩm thủy sản được chiết tách bằng

hỗn hợp axetonitril và diclometan. Dịch chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch

fluorescamin để tạo dẫn xuất huỳnh quang. Hàm lượng các dẫn xuất được xác định trên

hệ thống HPLC với detector huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.



nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho HPLC.

Diclometan (CH2Cl2), loại dùng cho HPLC.

Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4).

Dung dịch axetonitril/H3PO4, pH = 6,0

Cho 80 ml axetonitril và 20 ml H3PO4 0,02 M vào cốc 250 ml. Dung dịch này được

để nguội tới nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxit 1 M hoặc dung dịch natri

hydroxit 0,1 M để chỉnh pH = 6,0 0,1.

Dung dịch đệm xitrat 0,5 M, pH = 3,0

Hòa tan 10,5 g axit xitric với 100 ml nước, chỉnh pH = 3,0 0,1 bằng dung dịch

natri hydroxit 10 M, dung dịch natri hydroxit 1 M và dung dịch natri hydroxit 0,1 M.

Dung dịch đệm cho sự tạo dẫn xuất

Trộn theo thể tích gồm 6 phần axetonitril/H3PO4 (3.4) với 4 phần dung dịch đệm

xitrat 0,5 M ở trên

Dung dịch fluorescamin, 10 mg/ml

Hòa tan 50 mg tác nhân tạo dẫn xuất fluorescamin (Fluram) trong 5 ml axeton (loại

dùng cho HPLC).

Các chất thuộc nhóm sulfanilamit

Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit, 1 mg/ml

Hòa tan 10 mg chuẩn nội sulfanilamit trong 10 ml metanol (loại dùng cho HPLC).

Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit, 50 g/ml

Hút 1 ml sulfanilamit 1 mg/ml (3.8.1) vào bình định mức 20 ml (4.4) rồi định mức

tới vạch bằng metanol.

Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit, 5 g/ml

Pha loãng 1 ml sulfanilamit 50 g/ml (3.8.2) với nước để có 10 ml.



Các dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc các sulfonamit, 100 g/ml

Cân lần lượt 10,0 mg từng loại các chất chuẩn nhóm sulfonamit. Sau đó, hòa tan rồi

định mức đến vạch 100 ml bằng metanol.

Dung dịch chuẩn các sulfonamit trung gian, 1 000 ng/ml

Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc các sulfonamit 100 g/ml (3.9.1) vào các

bình định mức 100 ml. Sau đó, định mức đến vạch bằng metanol.

Các dung dịch chuẩn sulfonamit để dựng các đường chuẩn, 0.0; 1.0; 2.0; 4.0; 6.0;

8.0 và 10.0 ng/ml.

Hút lần lượt 0; 0.5; 1.0; 2.0; 3.0; 4.0 và 5.0 ng/ml dung dịch các sulfonamit 1 000

ng/ml vào bình định mức 500 ml. Sau đó, định mức tới vạch bằng metanol.

Pha động

Dung dịch H3PO4, 0,02 M

Hòa tan 2,3 g axit phosphoric (H3PO4) 85 % (loại dùng cho HPLC) với nước rồi định

mức thành 1 000 ml.

Hỗn hợp dung dịch metanol và axetonitril, tỷ lệ1:1

Hòa tan 500 ml metanol trong 500 ml axetonitril (3.1).


3.5.3.1. Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền ít nhất 200 g mẫu bằng máy nghiền. Cân 5,0 g mẫu đã được nghiền, w,

chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly tâm thủy tinh 25 ml.

Thêm 10 ml axetonitril và 2,5 ml diclometan vào ống ly tâm thủy tinh 25 ml có

chứa 5,0 g mẫu thử. Sau đó, lắc ống trong 10 min trên máy lắc. Tiếp theo ly tâm trong 10

min ở tốc độ 6 000 r/min.

Dùng pipet Pasteur hút lớp trên vào bình định mức 25 ml. Thực hiện lại bước chiết

theo rồi gom tất cả phần dịch chiết vào bình định mức 25 ml, thêm axetonitril đến vạch.

Hút chính xác 10 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm thủy tinh 15 ml để bay hơi tới

cặn khô bằng dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 0C trên bể điều nhiệt.

3.5.3.2. Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu sản phẩm thủy sản đã được xác định không có các chất nhóm

sulfonamit. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng như chuẩn bị đối với mẫu thử theo.



3.5.3.3. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ng/g

Thêm chính xác 500 l dung dịch các chuẩn sulfonamit trung gian 1 000 ng/ml vào

5 g mẫu trắng. Tiến hành chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi 100 ng/g như chuẩn bị đối với

mẫu thử theo.

3.5.3.4. Chuẩn bị dung dịch dựng đường chuẩn

Hút chính xác 10 ml lần lượt các dung dịch chuẩn sulfonamit để dựng các đường

chuẩn vào ống nghiệm thủy tinh 15 ml. Sau đó, cho dung dịch bay hơi tới cặn khô dưới

dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 0C trên bể điều nhiệt . Tiếp tục thực hiện bước tạo dẫn xuất

huỳnh quang theo.

3.5.3.5. Tạo dẫn xuất huỳnh quang

Thêm vào các ống nghiệm chứa mẫu đã chuẩn bị tại 3.5.5.1, 3.5.5.2 và 3.5.5.3 các

dung dịch gồm: 1 ml dung dịch đệm tạo dẫn xuất, 20 l dung dịch chuẩn nội sulfanilamit

5 g/ml và 0,2 ml dung dịch fluorescamin 10 mg/ml. Sau đó, để cho phản ứng khoảng 30

min đến 50 min ở nhiệt độ phòng, rồi lọc qua giấy lọc 0,45 m. Lấy 10 l dung dịch này

tiêm vào hệ thống HPLC.

3.5.3.6. Tiến hành phân tích trên HPLC

a. Điều kiện phân tích

Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo C18;

Chương trình pha động: theo qui định trong Bảng 1;

Thời gian Dung dịch H3PO4 0,02 M

(3.10.1)

Hỗn hợp dung dịch metanol

và axetonitril (3.10.2)

Bắt đầu 60 40

20 min 60 40

25 min 50 50

39 min 50 50

40 min 45 55

50 min 45 55

51 min 60 40

58 min 60 40

Bảng 3.1: Chương trình pha động



Tốc độ dòng: 0,6 ml/min;

Thể tích tiêm: 10 l;

Bước sóng kích thích: = 405 nm;

Bước sóng phát xạ: = 495 nm.

b. Ổn định cột sắc ký trong 30 min tại chế độ làm việc.

c. Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang. Dựng đường chuẩn

giữa tỷ số diện tích pic các chuẩn sulfonamit/diện tích pic chuẩn nội sulfanilamit

và nồng độ theo quan hệ tuyến tính.

d. Tiêm các dịch mẫu trắng, dịch mẫu xác định độ thu hồi và dịch mẫu thử đã tạo dẫn

xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC, mỗi mẫu 2 lần. Xác định tỉ số diện tích pic

sulfonamit/sulfanilamit.

3.5.3.7. Tính kết quả

Hàm lượng sulfonamit trong mẫu thử, M, được tính bằng microgam trên kilogam

(g/kg) theo công thức sau:

W

VCM *

Trong đó

C là nồng độ của từng chất thuộc nhóm sulfonamit thu được, tính bằng nanogam

trên mililit (ng/ml);

V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

W là khối lượng mẫu thử (5,0 g).

3.5.3.8. Độ lặp lại

Độ lệch chuẩn lặp lại, CVs, tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một

dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

3.5.3.9. Báo cáo thử nghiệm






là tự Chọn và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;




3.6. TCVN 8354: 2010 thủy sản và sản phẩm thủy sản ( xác định hàm lượng Sulfit)

Fish and fishery products Determination of sulfit content


Mẫu thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản được axit hoá bằng axit sulfuric (H2SO4) và

chưng cất trong thiết bị Kjeldahl bán vi lượng. Hơi SO2 tạo thành được cho phản ứng với

axit 2,2’-dinitro-5,5’-dithiobenzoic (DTNB) trong cốc nhận để hình thành phức axit 5-

mercapto-2-nitrobenzoic có màu vàng chanh đậm. Cường độ màu của phức axit được đọc

trên máy quang phổ tại bước sóng 412 nm. Hàm lượng sulfit, tính theo nồng độ của SO2

trong mẫu được tính toán theo cường độ màu của phức axit theo phương pháp ngoại

chuẩn.



nước cất đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

a. Khí nitơ (N2).

b. Dung dịch axit sulfuric, 10 N

Cho từ từ 272 ml axit sulfuric (H2SO4) đậm đặc vào 700 ml nước và định mức đến

1000 ml.

Dung dịch đã pha có thể sử dụng trong vòng 1 năm.

c. Dung dịch đệm phosphat, pH = 8

Hòa tan 3,65 g dikali hydrophosphat ngậm ba phân tử nước (K2HPO4.3H2O, khối

lượng phân tử 228,23 g/mol) và 0,25 g kali hydrophosphat (KH2PO4) với 900 ml nước.

Chỉnh pH = 8,0 bằng dung dịch axit clohydric (HCl) 0,1 M hoặc dung dịch natri hydroxit

(NaOH) 0,1 M. Định mức đến 1 000 ml.

Dung dịch đã pha có thể sử dụng trong vòng 1 tháng.

d. Dung dịch hồ tinh bột

Trộn 1 g hồ tinh bột với 100 ml nước rồi đun sôi và làm nguội.

Dung dịch đã pha có thể sử dụng trong vòng 1 tuần.

e. Dung dịch chuẩn gốc iot, 0,05 M

Sử dụng ống chuẩn iot (Iodine titrisol) N/10, pha trong 1 000 ml.


f. Dung dịch chuẩn iot, 0,005 M



Pha loãng 10 lần dung dịch (3.5).

Dung dịch đã pha loãng có thể sử dụng trong vòng 1 tháng.

g. Dung dịch thuốc thử axit 2,2'-dinitro-5,5'-dithiobenzoic (DTNB)

Hòa tan 1 g DTNB (C14H8N2O8S2) trong 100 ml etanol 96 % (thể tích) và định mức

đến 1 000 ml với dung dịch đệm (3.3).


h. Dung dịch gốc disulfit, 0,05 M

Hòa tan 2,376 3 g natri disulfit (Na2S2O5, khối lượng phân tử 190,10 g/mol) và

0,009 3 g EDTA (dinatri etylendiamin tetraaxetat ngậm hai phân tử nước, công thức phân

tử C10H14N2Na2O8.2H2O, khối lượng phân tử 372,24 g/mol) trong nước và định mức đến

250 ml.

Dung dịch đã pha có thể sử dụng trong vòng 1 tháng. Định phân lại nồng độ trước

khi sử dụng.

i. Dung dịch disulfit, 0,000 5 M, tương đương 0,064 mg SO2/ml

Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch gốc disulfit (3.8), thêm 0,037 g EDTA, hòa tan rồi định

mức đến 1 000 ml.

Dung dịch đã pha có thể sử dụng trong vòng 1 tháng. Định phân lại nồng độ trước

khi sử dụng.


a. Chuẩn bị mẫu

- Chuẩn bị mẫu thử

Đồng nhất mẫu thử bằng máy nghiền. Cân 2 mẫu, mỗi mẫu 5,00g, chính xác đến 0,1

mg vào cốc có mỏ 100 ml. Trộn đều mẫu đã cân với 15 ml nước.

b. Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu được xác định trước không chứa sulfit. Chuẩn bị mẫu trắng giống

như đối với chuẩn bị mẫu thử.

c. Dựng đường chuẩn

Cho vào 2 bình nón dung tích 250 ml, mỗi bình 5 ml dung dịch chuẩn iot. Chuẩn độ

với dung dịch chuẩn disulfit đến màu vàng nhạt. Thêm dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục

chuẩn độ cho đến khi dung dịch đổi màu.



Dùng pipet lấy lần lượt 0; 1; 2; 3; 4 và 5 ml dung dịch disulfit đã được chuẩn độ nêu

trên vào trong các bình định mức 50 ml có chứa 25 ml dung dịch thuốc thử. Sau đó, pha

loãng đến vạch với dung dịch đệm phosphat rồi để yên trong 10 min.

Xác định lần lượt độ hấp thụ của các dung dịch thu được bằng máy quang phổ đã

được hiệu chỉnh bằng nước ở bước sóng 412 nm (độ hấp thụ là 0 đối với nước).

Dựng đường chuẩn theo các giá trị của độ hấp thụ và nồng độ sulfit của dãy chuẩn

biểu thị bằng miligam trên mililit (mg/ml). Hàm lượng SO2 trong dịch mẫu được tính

theo đường hồi qui tuyến tính của đồ thị thu được sau khi hiệu chỉnh với giá trị độ hấp

thụ của mẫu trắng.

d. Tiến hành thử

Chuyển mẫu trắng và các mẫu thử đã chuẩn bị theo lần lượt vào các bình chưng cất.

Tráng rửa các cốc đựng mẫu với 10 ml nước rồi cho hết vào bình chưng cất. Lắp đặt bình

vào bộ chưng cất Kjeldahl.

Đặt bình nón thu hồi chứa 50 ml DTNB ở đầu ra của ống ngưng tụ. Nối các đường

dẫn khí nitơ và nước làm nguội vào thiết bị chưng cất.

Cho vào bình chưng cất 20 ml axit sulfuric 10N qua chiếc phễu gắn ở phía trên bộ

chưng cất và nhanh chóng đóng kín hệ thống lại. Tiến hành chưng cất trong vòng 4 min,

sau đó lấy bình hứng ra khỏi bộ chưng cất. Rửa bình ngưng và ống nối với dung dịch

đệm phosphat, chuyển dịch rửa vào bình thu hồi.

Chuyển toàn bộ dịch cất vào bình định mức dung tích 50 ml rồi rửa bình thu hồi với

dung dịch đệm phosphat. Chuyển dịch rửa vào bình định mức rồi định mức với dung dịch

đệm phosphat.

Đọc giá trị độ hấp thụ sau 10 min ở bước sóng 412 nm và dùng nước là dung dịch so

sánh. Nếu giá trị độ hấp thụ lớn hơn 1,5, phải pha loãng dung dịch với hỗn hợp theo tỉ lệ

1:1 (thể tích) của dung dịch đệm phosphat và dung dịch thuốc thử rồi tiến hành đọc lại.

3.6.4. Tính kết quả

a. Tính nồng độ dung dịch gốc disulfit

Nồng độ dung dịch gốc disulfit, C, biểu thị bằng miligam SO2 trên mililit (mg/ml),

được tính theo công thức sau:

V

VCC

06,64** 00

trong đó:



Co : là nồng độ của dung dịch iot, tính bằng mol trên lít (mol/l);

Vo : là thể tích dung dịch iot được sử dụng, tính bằng mililit (ml);

V : là thể tích dung dịch gốc disulfit dùng cho chuẩn độ, tính bằng mililit (ml);

64,06 là khối lượng mol của SO2, tính bằng gam trên mol (g/mol).

b. Tính hàm lượng SO2 trong mẫu

Hàm lượng SO2 trong mẫu, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính

theo công thức sau:

m

fVCX

** 11

trong đó:

C1 : là nồng độ SO2 trong dung dịch mẫu, tính được từ đường chuẩn theo, tính

bằng miligam trên mililit (mg/ml);

V1: là thể tích của dịch cất, tính bằng mililit (ml);

f : là hệ số pha loãng dung dịch đo độ hấp thụ, f = 1 nếu không pha loãng;

m: là khối lượng mẫu cân, tính bằng gam (g).

Kết quả được tính theo giá trị trung bình của 2 lần thử song song.

c. Báo cáo thử nghiệm








3.7. TCVN 3701: 2009 thủy sản và sản phẩm thủy sản – xác định hàm lượng

natriclorua (Fish and fishery products - Determination of sodium chloride content)


Chỉ được sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, nước sử dụng phải là nước cất

hoặc đã loại ion không chứa nhóm halogen.

a. Dung dịch chuẩn bạc nitrat (AgNO3), 0,1M



Hòa tan một lượng bạc nitrat (AgNO3) lớn hơn lượng lý thuyết (169,87g) bằng nước

trong bình định mức 1 000 ml và pha loãng đến vạch. Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị

trong lọ thủy tinh, tránh ánh sáng.

Xác định nồng độ dung dịch AgNO3 lớn hơn lượng lý thuyết (169,87 g) bằng nước


trong lọ thủy tinh tránh ánh sáng.

Xác định nồng độ dung dịch AgNO3 bằng dung dịch natri clorua (NaCl) 0,1 M

(5,844 g NaCl khan trong 1 000 ml nước).

b. Dung dịch chuẩn amoni thioxyanat (NH4SCN), 0,1 M

Hòa tan 7,612 g NH4SCN bằng nước trong bình định mức dung tích 1 000 ml .

Thêm nước đến vạch và trộn.

Xác định nồng độ dung dịch làm việc bằng cách lấy chính xác từ 40 ml đến 50 ml

dung dịch chuẩn AgNO3 0,1 M, thêm 2 ml dung dịch chỉ thị sắt (III) và 5 ml dung dịch

HNO3, chuẩn độ bằng dung dịch NH4SCN 0,1 M cho đến khi dung dịch xuất hiện màu

xanh xám sau khi lắc mạnh.

c. Dung dịch chỉ thị sắt (III), sắt (III) amoni sulfat [FeNH4(SO4)2 12 H2O)] bão hòa.

d. Dung dịch axit nitric (HNO3), tỷ lệ 1 + 1.

3.7.2. Lấy mẫu

Tiến hành lấy mẫu theo TCVN 5276:1990.

3.7.3. Chuẩn bị mẫu

Cân khoảng 50 g mẫu thử, chính xác đến 0,001 g, cho vào bình đựng của máy

nghiền tốc độ cao và thêm 450 g nước. Đậy nắp, bật máy nghiền ở tốc độ thấp bằng cách

dùng biến áp biến đổi để phân tán sơ bộ sau đó nghiền kỹ với tốc độ cao (thường 1 min

đến 2 min là đủ). Dùng pipet đã tháo bỏ đầu tip để chuyển khoảng 50 g hỗn hợp sau khi

nghiền (tương đương 5 g mẫu thử). Trộn kỹ huyền phù của mẫu thử ngay trước khi dùng

pipet để lấy phần mẫu thử để phân tích, sao cho phần chất rắn được phân tán đều.

Đối với nước mắm, mẫu thử được pha loãng 20 lần.


Cho khoảng 100 g dung dịch đã chuẩn bị chính xác đến 0,001 g, vào cốc có mỏ 250

ml. Thêm dung dịch AgNO3 0,1 M với một lượng lớn hơn đủ để tạo kết tủa tất cả ion Cl-



thành AgCl, sau đó thêm 20 ml dung dịch HNO3. Đun sôi nhẹ trên bếp điện hoặc bếp

cách cát sao cho tất cả các chất rắn hòa tan hết ngoại trừ AgCl (thường mất khoảng 15

min). Làm nguội, thêm 50 ml nước và 5 ml dung dịch chỉ thị và chuẩn độ bằng dung dịch

chuẩn NH4SCN 0,1 M cho đến khi dung dịch có màu nâu sáng ổn định.

3.7.5. Tính kết quả

Hàm lượng natri clorua, X1, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính theo

công thức:

m

kVVX

100**)000585*( 21

1

Trong đó:

V1 là thể tích dung dịch AgNO3 0,1 M đã thêm vào tính bằng mililit (ml);

V2 là thể tích dung dịch NH4SCN 0,1 M đã dùng để chuẩn độ, tính bằng mililit

(ml);

0,00585 là lượng natri clorua tương ứng với 1 ml dung dịch AgNO3 0,1 M, tính

bằng gam (g);

m là khối lượng dung dịch mẫu thử đã chuẩn bị được lấy để chuẩn độ, tính bằng

gam (g);

k là hệ số pha loãng khi chuẩn bị mẫu thử (đối với mẫu nguyên liệu, bán thành

phẩm và sản phẩm thủy sản, k = 10; đối với mẫu nước mắm, k = 20);

100 là hệ số quy đổi ra %.

Biểu thị kết quả đến hai chữ số thập phân.


Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

Mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;


Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

Tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem

là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả

3.8. TCVN 4882 : 2007 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương

pháp phát hiện và định lượng Coliform bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất.


3.8.1.1. Phát hiện coliform



Cấy phần mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc và ủ 24 h

hoặc 48 h ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận).

Khi ống thu được cho thấy có màu đục và/hoặc sinh khí thì cấy tiếp vào ống đựng

môi trường khẳng định và ủ ở 30 oC hoặc 37 oC trong 24 h hoặc 48 h (theo thỏa thuận).

Sau khi kiểm tra ống thu được mà cho thấy đục và hình thành khí thì khẳng định sự

có mặt của coliform

3.8.1.2. Bằng kỹ thuật MPN

Cấy vào bộ ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ kép

một lượng mẫu thử xác định nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng hoặc với một lượng

huyền phù ban đầu xác định nếu các sản phẩm ở dạng khác.

Cấy vào bộ ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ đơn

một lượng mẫu thử xác định nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng hoặc với một lượng

huyền phù ban đầu xác định nếu các sản phẩm ở dạng khác. Sau đó, trong cùng điều kiện,

cấy các ống tiếp theo chứa môi trường với các dịch pha loãng thập phân của phần mẫu

thử hoặc của huyền phù ban đầu.

Ủ ấm ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) các ống chứa môi trường tăng sinh chọn

lọc nồng độ kép trong 24 h và các ống chứa môi trường nồng độ đơn 24 h hoặc 48 h và

sau đó kiểm tra sự sinh khí hoặc sự mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí trong các

ống này.

Từ các ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép và các ống chứa môi

trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn có sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc sinh khí,

các dịch cấy để cấy vào một loạt các ống chứa môi trường khẳng định.

Ủ ấm các ống trong 4.2.4 ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h hoặc 48

h, và sau đó kiểm tra các loạt ống này về sự sinh khí.

Tính số có xác suất lớn nhất của coliform có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam mẫu

(tức là số MPN) từ số ống có sinh khí trong loạt ống thử mới. Dùng bảng để xác định số

có xác suất lớn nhất.

3.8.2. Môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng

3.8.2.1. Khái quát

Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 về cách chuẩn bị,

pha chế và tính năng thử nghiệm của môi trường.



3.8.2.2. Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc

tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm nghiệm.

3.8.2.3. Môi trường tăng sinh chọn lọc: Canh thang tryptoza lauryl sulfat

a. Thành phần

a) Môi trường nồng độ

kép

b) Môi trường nồng độ

đơn

Dịch thủy phân protein sữa và

protein động vật bằng enzym

40 g 20 g

Lactoza (C12H22O11.H2O) 10 g 5 g

Dikali hydro phosphat

(K2HPO4)

5,5 g 2,75 g

Kali dihydro phosphat

(KH2PO4)

5,5 g 2,75 g

Natri clorua 10 g 5 g

Natri lauryl sulfat 0,2 g 0,1 g

Nước 1 000 ml 1 000 ml

b. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần khác nhau hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng

cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.

Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x 160

mm chứa ống Durham đối với môi trường nồng độ đơn, và vào các ống nghiệm có kích

thước 20 mm x 200 mm (không chứa các ống Durham )đối với môi trường nồng độ kép.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 oC. Các ống Durham không

được chứa các bọt khí sau khi khử trùng.

c. Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính

năng đối với canh thang tryptoza lauryl sulfat theo ISO/TS 11133-2 : 2003, Bảng B.1.



3.8.2.4. Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng (lactose bile brilliant

green broth)

a. Thành phần

Dịch thủy phân casein bằng

enzyme

10 g

Lactoza (C12H22O11.H2O) 10 g

Mật bò khô 20 g

Lục sang 0,0133 g

Nước 1 000 ml

b. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun

nóng nhẹ, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.

Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x 160

mm có ống Durham

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 oC. Các ống Durham không được chứa

bọt khí sau khi khử trùng.

c. Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính

năng đối với canh thang mật lactoza lục sáng theo Bảng B.1 của ISO/TS 11133-2 : 2003.


Phương pháp phát hiện

a. Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu

chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm liên quan.

b. Cấy và ủ

Tùy thuộc vào giới hạn phát hiện yêu cầu, mà lấy x ml mẫu thử dạng lỏng hoặc x ml

huyền phù ban đầu nếu mẫu thử ở dạng khác, chuyển vào ống nghiệm chứa 10 ml môi



trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép khi 1 ml < x < 10 ml, hoặc vào ống nghiệm chứa

10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn khi x ≤ 1 ml.

Để ống môi trường nồng độ kép trong tủ ấm ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận)

trong 24 h ± 2 h.

Để ống môi trường nồng độ đơn trong tủ ấm ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận)

trong 24 h ± 2 h hoặc nếu ở giai đoạn này mà không thấy có sinh khí hoặc mờ đục làm

cản trở việc phát hiện sinh khí thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

c. Phép thử khẳng định

Dùng vòng que cấy lấy cấy dịch thu được cấy vào ống môi trường thử khẳng định.

Đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, nếu không

sinh khí ở giai đoạn này thì ủ trong 48 h ± 2 h.

Tiến hành theo cùng một trình tự như trong đối với các ống đã được ủ ấm trong có

biểu hiện sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí, khi quan sát thấy một

trong các biểu hiện đó (tức là sau 24 h ± 2 h hoặc sau 48 h ± 2 h).

d. Diễn giải kết quả

Ống nghiệm thu được cho thấy sinh khí sau 24 h ± 2 h và 48 h ± 2 h được coi là

dương tính.

Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc

tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm liên quan.

Chuẩn bị một số độ pha loãng đủ để đảm bảo rằng các ống tương ứng với độ pha

loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.

e. Cấy và ủ

Thông thường lấy một tổ hợp ba ống đối với mỗi độ pha loãng. Tuy nhiên, đối với

một số sản phẩm và/hoặc các kết quả yêu cầu có độ chính xác lớn hơn, mà có thể cần

thiết phải cấy một loạt nhiều hơn ba ống (ví dụ: năm ống). Đối với các trường hợp này,

để tính MPN xem các bảng liên quan trong TCVN 6404 (ISO 7218).

Lấy ba ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép. Dùng pipet vô trùng (6.6)

chuyển 10 ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 10 ml huyền phù ban đầu, nếu là các sản

phẩm ở dạng khác vào từng ống trên.



Lấy ba ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn. Dùng pipet vô trùng chuyển

1 ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu, nếu là các sản phẩm ở dạng

khác vào từng ống nghiệm nói trên.

Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo. Sử dụng mỗi pipet vô trùng cho mỗi độ pha

loãng. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

Để ống môi trường nồng độ kép trong tủ ấm ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong

24 h ± 2 h.

Để ống môi trường nồng độ đơn trong tủ ấm ở 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong

24 h ± 2 h, hoặc nếu ở giai đoạn này mà không thấy sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở

việc phát hiện sinh khí thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

f. Phép thử khẳng định

Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy thu được vào ống môi trường thử khẳng định. Đặt vào tủ

ấm ở nhiệt độ 30 oC hoặc 37 oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, nếu không sinh khí ở

giai đoạn này thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

Tiến hành theo cùng một trình tự đối với các ống đã được ủ ấm có biểu hiện sinh khí

hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí, khi quan sát lần thứ nhất (tức là sau 24 h

± 2 h hoặc sau 48 h ± 2 h).

g. Diễn giải kết quả

Đối với mỗi độ pha loãng, đếm tổng số các ống quan sát thấy có sinh khí (các ống dương

tính) sau 24 h ± 2 h và sau 48 h ± 2 h (nếu có).

3.8.4. Tính và biểu thị kết quả

Theo các kết quả diễn giải chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt coliform trong phần

mẫu thử x g hoặc x ml của sản phẩm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng. Xem

[TCVN 6404 (ISO 7218)].

3.8.5. Độ chụm

Với kỹ thuật MPN có thể cho kết quả với dao động lớn, do đó hết sức thận trọng khi

sử dụng kết quả thu được bằng phương pháp này.

Giới hạn tin cậy được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218).





mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

mục đích của phép thử và nhiệt độ ủ đã sử dụng;

tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi

tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

các kết quả thử nghiệm thu được.

3.9. TCVN 7927: 2008 Thực phẩm- phát hiện và định lượng Staphylococcus Aureus

bằng phương pháp tính số có xác suất lớn nhất.

Foodstuffs – Detection and enumeration of staphylococcus aureus by most

probable number (MPN) method

3.9.1. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy

Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng phải là

nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

a. Canh thang trypticaza (tryptic) đậu tương chứa 10 % natri clorua (NaCl) và 1%

natri pyruvat

Cho 95 g NaCl vào 1000 ml dung dịch của 17,0 g trypticaza hoặc tryptoza (sản

phẩm thủy phân tuyến tụy của casein), 3,0 g phyton (sản phẩm thủy phân papain của bột

đậu tương), 5/0 g NaCl, 2,5 g K2HPO4, 2,5 g dextroza (trypticaza khan hoặc canh thang

trypxin đậu tương là thích hợp) và 10 g natri pyruvat. Chỉnh pH đến 7,3. Đung nóng nhẹ,

nếu cần. Phân phối các lượng 10 ml vào các ống nghiệm kích thước 16 mm × 150mm.

Hấp áp lực 15 min ở 121 oC. Độ pH cuối cùng phải là 7,3 ± 0,2. Dung dịch này có thể

bảo quản được đến 1 tháng ở nhiệt độ 4 oC ± 1 oC.

b. Dung dịch muối sinh lý

Hòa tan 8,5 g NaCl trong 1000 ml nước. Hấp áp lực 15 min ở 121 oC và để nguội

đến nhiệt độ phòng.

c. Môi trường Baird-Parker (thạch trứng tellurit glyxin pyruvat)

- Môi trường cơ bản

Hòa tan 10,0 g trypton, 5,0 g dịch chiết thịt bò, 1,0 g dịch chết nấm men, 10,0 g

natri pyruvat, 12,0 g glyxin, 5,0 g LiCl.H2O và 20,0 g thạc trong 950 ml H2O. Đun nóng

đến sôi, thỉnh thoảng khuấy để hòa tan hết các thành phần. Phân phối các lượng 95 ml

vào các chai có nắp vặn. Hấp áp lực 15 min ở 121 oC. Độ pH cuối cùng phảo là 7,0 ± 0,2

ở 25 oC. Dung dịch này có thể bảo quản được đến 1 tháng ở nhiệt độ 4 oC ± 1 oC.

- Môi trường tăng sinh



Ngâm các quả trứng tươi khoảng 1 min trong dung dịch HgCl2 bão hòa đã pha loãng

(1 + 1000). Làm vỡ các quả trứng một cách vô trùng, tách riêng lòng trắng và lòng đỏ.

Trộn lòng đỏ với dung dịch muối sinh lý theo tỷ lệ (3 + 7, tính theo thể tích), dùng bộ

trộn tốc độ cao để trộn trong khoảng 5 s. Cho vào 50 ml nhũ tương lòng đỏ trứng 10 ml

dung dịch kali tellurit 1 % đã lọc để khử trùng (khối lượng trên thể tích). Trộn đều và bảo

quản ở nhiệt độ 4 oC ± 1 oC.

- Môi trường hoàn chỉnh

Cho 5 ml môi trường tăng sinh vào 95 ml môi trường cơ bản đã được làm ấm đến

nhiệt độ từ 45 oC đến 50 oC. Trộn kỹ, tránh tạo bọt và rót các lượng từ 15 ml đến 18 ml

vào các đĩa petri vô trùng có kích thước 100 mm × 15 mm. Bảo quản các đĩa này ở nhiệt

độ phòng (25 oC) đến 5 ngày trước khi sử dụng. Môi trường này phải mờ đục đều; không

sử dụng các đĩa không mờ đục. Làm khô các đĩa trước khi sử dụng theo một trong các

phương pháp sau đây:

Mở nắp đĩa, úp bề mặt thạch xuống, đặt vào tủ thông gió hoặc tủ ấm 30 min ở 50 oC;

Đậy nắp đĩa và đặt vào tủ không khí cưỡng bức hoặc tủ ấm trong 2 h ở 50 oC;

Đậy nắp đĩa và đặt vào tủ ấm 4 h ở 35 oC, hoặc

Đậy nắp đĩa và để trên bàn của phòng thử nghiệm từ 16 h đến 18 h ở nhiệt độ

phòng.

- Canh thang tim-não (BHI)

Hòa tan dịch chiết từ khoảng 200 g não bê và 250 tim bò, 10,0 g pepton proteoza

hoặc Gelysat, 5,0 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4.12H2O và 2,0 g glucoza trong 1000 ml nước,

đun nóng nhẹ, nếu cần. Phân phối các lượng 5 ml vào các ống nghiệm có kích thước 16

mm x 150 mm và hấp áp lực 15 min ở 121 oC. Độ pH cuối cùng phải là 7,4 ± 0,2.

- Huyết tương coagulaza khô (thỏ) với EDTA

Hoàn nguyên theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Nếu không sẵn có, thì hoàn nguyên

huyết tương coagulaza khô (thỏ) và thêm Na2H2EDTA để có được nồng độ cuối cùng là

0,1 % trong huyết tương đã hoàn nguyên.

d. Dịch pha loãng phosphat đệm Butterfield

- Dung dịch gốc

Hòa tan 34,0 g KH2PO4 trong 500 ml nước, dùng khoảng 175 ml dung dịch NaOH 1

M để chỉnh pH đến 7,2 và pha loãng đến 1000 ml. Bảo quản trong tủ lạnh.

- Dịch pha loãng

Pha loãng 1,25 ml dung dịch gốc đến 1000 ml bằng nước. Dùng dung dịch này để

chuẩn bị các dung dịch trắng, phân phối các lượng đủ, có tính đến hao hụt trong khi hấp

áp lực. Hấp áp lực 15 min ở 121 oC.


a. Chuẩn bị mẫu thử



Cân một cách vô trùng khoảng 50 g mẫu thử chưa rã đông cho vào bình trộn vô

trùng. Thêm 450 ml pha loãng đệm phosphat và đồng hóa trong 2 min ở tốc độ cao (từ 16

000 r/min đến 18 000 r/min). Sử dụng dịch pha loãng 1:10 này để chuẩn bị các dãy dịch

pha loãng từ 10-2 đến 10-6 bằng cách chuyển 10 ml pha loãng 1:10 vào 90 ml dịch pha

loãng trắng, lắc mạnh để trộn kỹ và tiếp tục cho đến khi thu được dịch pha loãng 10-6.

b. Kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất

Cấy vào 3 ống đựng canh thang trypticaza đậu tương với NaCl 10 % và natri

pyruvat 1 % ở mỗi độ pha loãng với các lượng 1 ml của dịch pha loãng thập phân. Cần có

đủ độ pha loãng từ phần mẫu thử để có được điểm kết thúc âm tính. Ủ ấm trong 48 h ở 35 oC.

Sử dụng vòng cấy 3 mm, chuyển 1 vòng cấy từ mỗi ống phát triển dương tính sang

các đĩa đựng môi trường Baird-Parker khô. Trộn các ống trên máy trộn Vortex trước khi

ria cấy nếu chỉ thấy mọc ở trên đáy hoặc bên thành ống. Ria cấy sao cho thu được các

khuẩn lạc mọc tách biệt. Ủ 48 h ở 35 oC đến 37 oC.

c. Khẳng định

Đối với mỗi ống cho thấy có sự phát triển, lấy 1 hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc nghi

ngờ là S. aureus. Dùng kim cấy vô trùng chuyển các khuẩn lạc sang các ống chứa 0,2 ml

canh thang BHI và các mặt nghiêng của thạch chứa môi trường duy trì thích hợp bất kỳ,

ví dụ như thạch trypticaza đậu tương thạch đếm đĩa chuẩn, v.v… Giữ lại các chủng cấy

trên ống thạch ở nhiệt độ phòng để dự phòng, hoặc lặp lại phép thử trong trường hợp các

kết quả thu được có nghi ngờ.

Cho 0,5 ml huyết tương coagulaza có EDTA hoàn nguyên vào dịch cấy BHI và trộn

kỹ. Ủ ấm ở nhiệt độ từ 35 oC đến 37 oC và cứ sau 6 h kiểm tra sự kết đông. Bất kỳ sự kết

đông nào cũng được coi là phản ứng dương tính. Các cục kết đông nhỏ hoặc thưa có thể

quan sát được bằng cách gõ nhẹ ống sao cho phần chất lỏng của hỗn hợp phản ứng chạm

tới miệng ống, các cục đông sẽ lộ ra phía trên bề mặt chất lỏng. Các chủng dương tính

coagulaza được coi là S. aureus. Các phép kiểm chứng âm tính và dương tính phải được

thực hiện đồng thời với các chủng cấy của khả năng phản ứng coagulaza chưa biết. Kiểm

tra lại các kết quả thử nghiệm coagulaza nghi ngờ trên các chủng cấy BHI đã được ủ ấm

ở 35 oC đến 37 oC từ 18 h đến 48 h.

d. Diễn giải kết quả

Các khuẩn lạc của S. aureus điển hình tròn, trơn nhẵn, lồi, ướt, có đường kính từ 2

mm đến 3 mm trên các đĩa mọc thưa, có màu đen xám đến đen nhánh, thường có viền

sáng màu (không trắng), có quầng đục bao quanh (kết tủa) và thường có vùng trong phía

ngoài; các khuẩn lạc dính khi tiếp xúc với kim cấy. Đôi khi có thể gặp phải các chủng

không phân giải lipit có vẻ bề ngoài tương tự, ngoại trừ không có quầng đục bao quanh

và các vùng sang. Các khuẩn lạc được phân lập từ các loại thực phẩm khô hoặc đông lạnh

đã được bảo quản trong khoảng thời gian dài thường ít đen hơn các khuẩn lạc điển hình

và có thể có dạng bên ngoài thô nhám và cấu trúc khô.



3.9.3. Biểu thị kết quả

Tính số có xác suất lớn nhất (MPN) của S. aureus trên gam sản phẩm từ Bảng 1.

Bảng 3.2– Các số có xác suất lớn nhất (MPN) trên gam phần mẫu thử, sử dụng 3 ống

có các phần mẫu thử tương ứng là 0,1 g, 0,01 g và 0,001 g

Các ống dương tính Các ống dương tính Các ống dương tính Các ống dương tính

0,1 0,01 0,001 MPN 0,1 0,01 0,001 MPN 0,1 0,01 0,001 MPN 0,1 0,01 0,001 MPN

0 0 0 <3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23

0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39

0 0 2a 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64

0 0 3a 9 1 0 3a 15 2 0 3a 26 3 0 3a 95

0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43

0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75

0 1 2a 9,2 1 1 2a 15 2 1 2 27 3 1 2 120

0 1 3a 12 1 1 3a 19 2 1 3a 34 3 1 3 160

0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93

0 2 1a 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150

0 2 2a 12 1 2 2a 20 2 2 2 35 3 2 2 210

0 2 3a 16 1 2 3a 24 2 2 3a 42 3 2 3 290

0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240

0 3 1a 13 1 3 1a 20 2 3 1 36 3 3 1 460

0 3 2a 16 1 3 2a 24 2 3 2a 44 3 3 2 1100

0 3 3a 19 1 3 3a 29 2 3 3a 53 3 3 3 >1100

a Các kết quả không chắc chắn cao như thế muốn nói rằng có mặt các yếu tố làm ảnh hưởng đến độ thu

hồi hoặc nhận dạng đối với các dịch pha loãng thấp hơn. Do đó, giá trị MPN có thể thấp hơn nhiều so với

nồng độ thực.



Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;



Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất

thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;



Các kết quả thử nghiệm thu được.

IV. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm theo tiêu chuẩn CODEX.

Tiêu chuẩn Việt Nam 6388 : 2006 hoàn toàn tương đương với Codex stan 70 –

1981, Rev.1 – 1995 những phương pháp kiểm tra của TCVN 6388 : 2006 là giống với

Codex 70 -1981, Rev.1- 1995.

Hay tiêu chuẩn kiểm tra sản phẩm cá ngừ đóng hộp của Việt Nam và CODEX giống

nhau ở các phương pháp kiểm tra sau:

Lấy mẫu, kiểm tra và phân tích

Kiểm tra cảm quan và kiểm tra vật lý

Xác định khối lượng tịnh

Xác định khối lượng đã ráo nước

Xác định khối lượng ráo nước đã được rửa (đối với hộp có nước sốt)

Kiểm tra dạng trình bày

Xác định histamine

Xác định khuyết tật

Tạp chất lạ

Mùi

Cấu trúc

Sự biến màu

Chất không mong muốn

Cách xác định hàm lượng Histamine

Cách bao gói sản phẩm

V. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu của sản phẩm theo AOAC

5.1. AOAC 977.13 Xác định histamin trong hải sản. Phương pháp huỳnh quang .

AOAC phương pháp chính thức 977.13: Histamin trong thủy sản.

Chú ý: Xem phụ lục B, quy định an toàn phòng thí nghiệm cho “ xử lý an toàn cho

hóa chất có tính kiềm” – Natri hydroxit ( NaOH); “ xử lý an toàn các hóa chất có tính

acid” – acid phosphoric ( H3PO4) và acid clo hydric (HCl); và “ xử lý an toàn các hóa

chất có mối nguy hiểm đặc biệt”- methanol. Xử lý các chất thải dung môi một cách thích

hợp theo các quy định về môi trường thông dụng.

Xem bảng 977.13A và 977.13B cho các kết quả nghiên cứu và hỗ trợ cho việc chấp

nhận phương pháp phân tích này. Xem bảng 977.13C cho việc khôi phục lại dữ liệu.



A. Nguyên tắc

Mẫu được tách chiết bằng methanol 75% (v/v). Dịch chiết được làm sạch trên cột

trao đổi ion, sau đó được tạo dẫn xuất huỳnh quang với O- phthalaldehyt (OPT). Hàm

lượng dẫn xuất histamine được xác định bằng hệ thống HPLC với detecter huỳnh quang

theo phương pháp ngoại chuẩn.

B. Thiết bị

Rửa sạch tất cả các dụng cụ thủy tinh và nhựa bằng HCl – H2O theo tỉ lệ (1 + 3)

trước khi sử dụng.

- Cột thủy tinh 200 x 7 mm ống polypropylene trang bị stopcocks nhựa loại nhỏ và

có khóa teflon dài 45cm. Tỷ lệ kiểm soát dòng chảy lớn hơn 3ml/ phút bằng cách

điều chỉnh chiều cao của cột tương ứng với ổ cắm ống. Ngoài ra, ta còn có thể sử

dụng van 2 chiều trên ống.

- Hệ thống HPLC huỳnh quang: Thiết bị này được trang bị để hoạt đông với áp lực

trung bình của đèn Hg với bước sóng kích thích ở 350nm bước sóng phát xạ

- Repipets : 1ml và 5ml

C. Hóa chất

- Nhựa trao đổi ion: Bio-Rad AG 1x8, kích thước hạt 50 mesh đến 100 mesh (Bio-

Rad Laboratories, 1414 Harbour, Nam Richmond, CA 94804, Hoa Kỳ) hoặc

DOWEX 1x8, kích thước hạt 50 mesh đến 100 mesh. Nhựa trao đổi ion được đổ

vào trong dung dịch NaOH 2M với tỉ lệ tương ứng 15ml NaOH 2M/ 1g nhựa. Tiến

hành khuấy đều dung dịch, để yên ít nhất trong 30 phút rồi gạn bỏ phần dung dịch.

Lặ lại thao tác trên vơi tỉ lệ tương ứng. Cuối cùng rửa nhựa với nước. Sau đó, đổ

nhựa lên giấy lọc rồi rửa nhiều lần với nước cho đến khi hết NaOH. Nhựa bảo

quản được trong 1 tuần trong nước. Nhồi nhựa trao đổi ion đã được chuẩn bị vào

cột thủy tinh đến chiều cao khoảng 8 cm và giữ cho cột không bị khô. Trước khi

sử dụng phải rửa cột thủy tinh với 10 ml nước.

- Acid phosphoric ( H3PO4): 3, 57N.

Pha loãng 121,8 ml acid phosphoric ( H3PO4, đậm đặc 85%) với nước để có 1000ml.

Nếu nồng độ acid phosphoric là 1,19 M thì khối lượng acid phosphoric cần thiết

được tính là:

Acid = 4343

%*

493.17

POHPOH CN



Dùng 5ml acid phosphoric vừa pha được chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 1M với

chỉ thị Phenolphtalein để điều chỉnh nồng độ cần thiết.

- O- Phthaldialdehyde (OPT)

Hòa tan 100 mg o- Phthal aldeyt (OPT, 99% được bảo quản lạnh) trong 100ml

methanol. Dung dịch OPT bền trong 1 tuần khi được bảo quản lạnh trong chai tối màu.

- Các dung dịch chuẩn histamine.

Dung dịch chuẩn gốc histamin 1 mg/ ml

Cân chính xác 169,1 mg histamine, hòa tan lượng histamine này với HCl 0,1 M rồi

định mức đến 100ml.

Dung dịch chuẩn trung gian histamine, 10 mg/l

Dùng pipet hút 1ml dung dịch chuẩn gốc histamine trộn đều với dung dịch acid HCl

0,1M rồi định mức đến 100ml. Dung dịch chuẩn trung gian histamine bền trong một tuần

khi bảo quản lạnh.

Các dung dịch chuẩn làm việc histamine.

Dùng pipet hút 1,2 và 3ml dung dịch chuẩn histamine 10 mg/l trong dung dịch acid

HCl 0,1M sau đó định mức đến 100 ml để được các dung dịch chuẩn 0.5, 1 và 1,5 g/ 5 l.

Mỗi khi phân tích cần tiến hành pha các dung dịch chuẩn làm việc mới.

- Methanol 75% (v/v)

Hút 75 ml MeOH (đựng trong bình thủy tinh) cho vào bình định mức 100ml hoặc

cho vào ống đong. Pha loãng với nước, trong khi thêm nước phải lắc đều dung dịch.

D. Dung dịch xác định đường chuẩn.

Hút chính xác 5 ml các dung dịch chuẩn làm việc đã pha ở trên vào các bình thủy

tinh hoặc bình tam giác 50 ml riêng biệt. Hút 10 ml HCl 0,1 M cho vào mỗi bình và lắc

đều hỗn hợp trong bình. Dùng pipet hút 3 ml dung dịch NaOH 1M cho vào hỗn hợp. Sau

khoảng 5 phút, thêm 1 ml dung dịch OPT vào mỗi bình và lắc nhanh hốn hợp cho đều.

Sau chính xác 4 phút, dùng pipet thêm 3 ml dung dịch H3PO4 3, 57 N vào mỗi bình và

tiến hành trộn ngay lập tức. Điều quan trọng cần chú ý là sau mỗi lần thêm vào các chất

cần trộn đều trong một thời gian để phản ứng xảy ra.



Chuẩn bị mẫu trắng bằng cách thay thế 5ml dịch chiết mẫu trắng đã được làm sạch

cho vào bình định mức 50 ml. Sau đó, lần lượt tiến hành các bước như đối với dung dịch

xác định đường chuẩn. Trong vòng 1,5 h bước sóng của đèn huỳnh quang đạt cực đại khi

khi bước sóng kích thích từ 350 nm và bước sóng phát xạ là 444 nm.

E. Xác định

Tiến hành chiết xuất mẫu cùng với methanol 75% ( v/v) giống như trong AOAC

957.07 C. Thêm 4-5 ml nước vào cột để loại bỏ rửa cột. Dùng pipet để hút 1 ml dung

dịch chiết vào cột và cho thêm 4-5 ml nước. Ngay lập tức, thu dịch chảy ra vào bình định

mức 50 ml đã chứa dung dịch acid HCl 1 M. Khi lớp dung dịch cách mặt trên lớp nhựa

một khoảng 2 mm phải cho tiếp nước vào cột cho đến khi thu được khoảng 35 ml dịch

giải hấp. Khóa cột rồi tiến hành định mức phần dịch giải hấp thu được bằng nước sau đó

đóng nút, lắc đều. Bảo quản dịch giải hấp thu trong môi trường lạnh.

Dùng pipet hút 5 ml dịch giải hấp vào bình định mức 50 ml, đồng thời hút 10 ml

HCl 0,1 M thêm vào bình. Tiếp thục tiến hành các bước như trong mục D, “ cho thêm 3

ml dung dịch NaOH 1 M vào hỗn hợp trong bình định mức…”

Nếu mẫu cá ngừ đem đi thử có hàm lượng histamin lớn hơn 15 mg/ 100 g. Dùng

pipet hút chính xác 1 ml OPT và 10 ml mẫu vào cốc sau đó tiến hành trộn đều hỗn hợp.

Đọc chỉ số trên đèn huỳnh quang. Khi cần thiết, có thể tiến hành pha loãng phần hỗn hợp

với OPT để thu được kết quả chính xác. Để định lượng đạt được độ tin cậy cao mỗi dịch

thử ta nên thực hiện 2 lần sau đó lấy giá trị trung bình 2 lần thử.

F. Tính toán

Kết quả hàm lượng histamine có trong mẫu thử với số µg histamine trong 5 ml dịch

thử phải là đường thẳng đi qua gốc tọa độ có độ dốc là:

m = 3

25,1

cb

a III

mg Histamine/ 100 g cá = 10*F*Is*m

1

µ g Histamine/ g cá = )(100

min)(*10

cág

histamg

Trong đó:



Ia nồng độ histamine có trong dịch chiết mẫu

Ib nồng độ mẫu chuẩn làm việc 1.5; 1; 0.5

Ic µ histamine chuẩn

F là hệ số pha loãng sẽ bằng tổng số ml dung dịch rửa giải và số ml HCl 0,1 M

chia cho số ml dung dịch rửa giải. F=1 là dung dịch rửa giải không bị pha loãng.

Nếu đường chuẩn không phải là đường hồi quy tuyến tính thì ta sử dụng đường cong tiêu

chuẩn trực tiếp cho việc định lượng. Đọc tất cả các giá trị từ đường cong gần nhất 0.05 µ

g histamine / 5 ml dung dịch mẫu thử.

mg histamine / 100 g cá = 10*F*W

µ g histamine / g cá = 10* ( mg histamine / 100 g cá)

trong đó:

W = µ g histamine / 5 ml dung dịch mẫu thử được xác định từ đường cong tiêu

chuẩn.

Bảng 977.13A : Kết quả nghiên cứu liên phòng để xác định histamin trong cá ngừ bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Mẫu thử nghiệm1 Histamine

Mg /100g

Lượng trung

bình Histamine

Mg/ 100g

Sr RSDr

%

SR RSDR

Cá ngừ vằn được

chấp nhận để đóng

gói trong nước

1 1.4 0.643 46.9 1.009 73.6

Cá ngừ vằn với 25

mg mẫu thử

histamine / 100 g cá

26 25.8 0.950 3.7 1.383 5.4

Cá ngừ vây vàng

đóng gói trong nước

30 31.6 2.053 6.5 3.473 11.0

Cá ngừ vây vàng cắt

khúc đóng gói trong

nước

20 19.8 0.941 4.7 1.729 8.7

Cá ngừ vằn cắt khúc

ngâm trong dầu

120 125.6 6.432 5.1 8.807 7.0



Cá ngừ vây vàng cắt

khúc ngâm trong

dầu

200 198.8 4.801 2.4 10.6555 5.4

Thành phần trung

bình

Bảng 977.13B: kết quả nghiên cứu liên phòng để xác định histamin trong cá ngừ

đóng hộp và đông lạnh bằng phương pháp phát quang ( phương pháp sửa đổi bằng cách

sử dụng methanol 75% (v / v).

Mẫu thử Có ý

nghĩa là

µg/g

sr, µ g/ g sR, µ g/ g RSDr, % RSDR, % rb Rc

1 9.896 0.884 0.915 9.01 9.32 2.475 2.562

2 13.0 1.710 1.710 13.17 13.17 4.788 4.788

3 5.627 1.205 1.295 21.42 23.03 3.374 3.626

4 7.831 1.084 1.084 13.84 13.84 3.035 3.035

5 20.28 1.140 2.077 5.62 10.24 3.192 5.816

6 58.02 2.111 5.466 3.64 9.42 5.911 15.305

7 158.4 6.575 14.050 4.15 8.87 18.410 39.340

Dựa vào kết quả nhận được từ 16 phòng thí nghiệm

r = 2.8 * sr, R = 2.8 * sR

Bảng 977.13C thu hồi histamine thêm vào cá ngừ đóng hộp ( phương pháp được sửa

đổi bằng cách sử dụng methanol 75%).

Phòng thí

nghiệm

Chất nền g/ µg Tìm thấy g/ µg Thu hồi g/ µg Phục hồi %

A 10.00 69.00

66.00

59.00

56.00

111.65

111.67

B 9.85 63.30

62.20

53.45

52.35

106.58

104.39

C 9.65 67.00

72.40

57.35

62.35

114.36

125.12

D 8.95 55.00

58.10

46.05

49.15

91.82

98.01

E 9.95 58.40

55.10

48.90

45.60

97.51

90.93

F 9.65 58.10 48.45 96.61



Thêm 50,15 µ g histamine / g

Dữ liệu từ phòng thí nghiệm I, L, M và loại trừ vì kết quả chất nền và các giá trị

ngoại lai.

5.2. AOAC 996.07 Xác định Putrescine, Cadaverine trong đồ hộp cá ngừ và cá

mahimahi bằng phương pháp sắc ký khí.

Giới hạn phát hiện là 0,3 g putrescine / g cá ngừ đóng hộp, và 0,5 µ g

cadaverine/ g cá ngừ đóng hộp và cá mahimahi.

Xem bảng 996.07A và B là các kết quả của quá trình nghiên cứu để chứng nhận cho

phương pháp này. Bảng 996.07C và D là các số liệu thu được.

Chú ý: Xem phụ lục B, chú ý an toàn. Chất Anhydride Pentafluoropropionic là chất

gây bỏng nặng, cần chú ý tránh để tiếp xúc với da và mắt. Phải đeo gang tay baorveej và

sử dụng tủ hút khi sử dụng hóa chất này.

A. Nguyên tắc

Putrescine và cadaverine được trích chiết từ mẫu với methanol 75% và sau đó được

chuyển đổi thành các dẫn suất của flo. Hỗn hợp các chất được tinh chế bằng cách cho đi

51.80 42.15 84.05

G 11.55 61.40

57.80

49.85

46.25

99.40

92.22

H 9.20 54.10

54.10

44.90

44.90

89.53

89.53

J 9.30 55.60

55.10

46.30

46.30

92.32

93.32

K 10.25 53.00

53.00

42.75

42.75

85.24

85.24

N 10.10 54.30

54.30

42.20

42.20

88.14

88.14

O 10.00 59.00

59.00

49.00

49.00

97.71

97.71

P 10.70 53,30

53.30

42.60

42.60

84.95

98.89

Rec Avg, % 96.41



qua ống chiết pha rắn ( SPE) và các dẫn xuất được định lượng bằng đầu dò điện tử của

thiết bị săc ký khí ( GC) sau khi đã được tách ra trên OV- 225 cột.

B. thiết bị

- sắc ký khí : Với 63 đầu dò điện tử.

Điều kiện hoạt động nhiệt độ tối thích 210 0C, nhiệt độ phát hiện 3200C. Cột sắc ký

170-1800C. Tốc độ dòng 25 ml/ phút. Khi cần thiết có thể dùng để phát hiện điểm thanh

lọc khí ( ví dụ 40 ml/ phút).

- cột sắc ký GC: cột thủy tinh đường kính 1800 x 2 mm cùng với 3% OV – 225

(50% cyanopropylphenyl 50% methyl) kích thước khí đốt trên 100-120 và Chrom

Q hoặc sử dụng cột mao quản tương đương. Ở nhiệt độ phòng giữ khoảng 2 giờ,

nếu nhiệt độ tăng dần lên ( 60C/ phút) cho đến khi đạt 2400C thì giữ khoảng 16

giờ. Thời gian lưu của các dẫn xuất pentafluoropropionic putrescine, cadaverine và

hexanediamine tương ứng là 7 phút, 9 phút và 12 phút.

- ống chiết pha rắn ( SPE) 3ml.

Ống chiết pha rắn SPE làm bằng nhôm (SupelClean LC). Kiểm tra hoạt động của

từng ống SPE bằng cách sau: Cho vào ống SPE hơn 2 ml dung môi khí ete toluene và sau

đó thêm vào ống 50 µl thuốc nhuộm Sudan sau đó thêm 1-2 giọt dung môi khí ete toluene

để loại bỏ thuốc nhuộm đã bỏ vào trước đó, dung môi vượt qua cột 3 ml. Nếu thuốc

nhuộm vẫn tồn tại trong 4mm đầu của ống SPE ống SPE hoạt động tốt cho việc thực hiện

tích li và chiết xuất mẫu phân tích.

- Cân phân tích

- Thiết bị quay làm nay hơi: nhiệt độ duy trì ở 50 ± 50C.

- Làm ướt bằng nước nóng ở nhiệt độ 50 ± 50C và 60 ± 50C

- Bình thủy tinh kín có dung tích 100 ml và 1l, Hình tròn có đáy phẳng 24/ 40 bình

dung tích 100ml, xi lanh lớn, bình thủy tinh kín 100-500 ml.

- Máy xay sinh tố: dùng để chuẩn bị mẫu thử

- Pipets : loại 1,2,3,5,10 và 25 ml.

- micropipets : loại 50, 250 và 500 µl.

- giấy lọc gấp nếp

- ống tiêm: loại 1 ml sai số trong khoảng 0,01 ml.

C. hóa chất.

- Pentafluoropropionic (PFP) anhydride: Được bảo quản lạnh hoặc sử dụng của

hàng bảo quản bằng độ ẩm từ Pierce Chemical Co, PO Box 117, Rockford, IL

61.105-0.117, Mỹ)



- Ethyl acetate: Bảo quản trong chai thủy tinh. Thích hợp cho việc sử dụng máy

GC.

- Toluene : Bảo quản trong chai thủy tinh. Thích hợp cho việc sử dụng máy GC.

- Acid clohydric ( 83,3 ml HCL đậm đặc pha với nước) để đạt nồng đôh 1M, 0,1M

( pha loãng 100 ml HCl 1N trong 1l nước).

- Hexan : thích hợp cho máy sắc ký khí

- Ethyl acetate toluene – dung môi: 30% Ethyl acetate trong toluene.

Hút 150 ml ethyl acetate vào ống đong, thêm vào đó 350 ml toluen, sau đó trộn đều.

- Methanol : 75% (v/ v)

Hút 750 ml MeOH trong bình thủy tinh co vào bình định mức 1000 ml. Định mức

tới vạch bằng nước và lắc đều hỗn hợp.

- Các dung dịch chuẩn Hexanediamine

Dung dịch chuẩn gốc Hexanediamine

Hòa tan 163 mg Hexanediamine dihydrochloride trong bình định mức 100 ml bằng

dung dịch HCl 0,1 M. Sau đó tiến hành định mức tới vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M.

Dung dịch chuẩn Hexanediamine 20 µg/ ml

Dùng piptet hút 2 ml dung dịch Hexanediamine chuẩn đã pha ở trên vào bình định

mức 100 ml sau đó định mức tới vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M và lắc đều hỗn hợp

trong bình định mức.

Dung dịch chuẩn làm việc Hexanediamine 5 µg/ ml.

Dùng pipet hút 25 ml dung dịch chuẩn Hexanediamine 20 µ g/ ml cho vào bình định

mức 100 ml và tiến hành định mức tới vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M.

- Dung dịch chuẩn Putrescine-cadaverine

Hòa tan 91,4 mg Putrescine dihydrochloride và 171, 3 mg cadaverine

dihydrochloride vào bình định mức với HCl 0,1 M. Sau đó tiến hành định mức tới vạch

bằng dung dịch HCl 0,1 M rồi lắc đều hỗn hợp.

- Dung dịch chuẩn làm việc Putrescine-cadaverine

Dung dịch chuẩn làm việc 10 µg Cadaverine / ml và 5 µg Putrescine / ml.



Dùng pipet hút 1 ml dung dịch chuẩn Putrescine-cadaverine đã pha ở trên cho vào

bình định mức 100 ml và định mức tới vạch bằng di=ung dịch HCl 0,1 M, lắc đều hỗn

hợp.

Dung dịch chuẩn làm việc 1 µg Cadaverine/ ml và 0,5 µg/ ml Putrescine.

Dùng pipet hút 10 ml dung dịch chuẩn làm việc 10 µg Cadaverine / ml và 5 µg

Putrescine / ml cho vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch bằng dung

dịch HCl 0,1 M.

- Dung môi ete - toluene: Tỉ lệ theo thể tích là 4 + 1. Dùng để kiểm tra hoạt động

của ống SPE.

- Thuốc nhuộm Sudan: Được dùng để kiểm tra hoạt động của ống SPE.

Hòa tan 0,01 g thuốc nhuộm ( 97%) trong 8 ml dung môi ete – tluene.

D. Chuẩn bị dung dịch chuẩn Putrescine-cadaverine để hiệu chuẩn.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn putrescine-cadaverine để hiệu chuẩn ( I-IV)

( xem Bảng 996.07E ) như sau:

Hút 1 ml dung dịch chuẩn làm việc hexanediamine (Dung dịch chuẩn làm việc

Hexanediamine 5 µg/ ml) và 1 ml dung dịch chuẩn làm việc putrescine-cadaverine

( xem bảng 996.07E) vào 2 bình 100 ml riêng biệt có hình tròn hoặc có đáy bằng

24/40 bình. Thêm vào đó 0,5 ml dung dịch HCl 1 M và tiến hành bốc hơi đến khô

trên thiết bị bay hơi quay với nhiệt độ 50 – 600C ( chú ý: Bảo quản dung dịch sau

khi bay hơi ở nhiệt độ lạnh và trong điều kiện chân không). Tiến hành rửa sạch

mỗi bình bằng 1 – 2 ml nước và tiến hành bốc hơi đến khô một lần nữa để loại bỏ

hết HCl còn sót lại trong bình.

Sau khi tiến hành bốc hơi đến khô mỗi bình cho thêm vào 1 ml dung dịch ethyl

acetate và 300 µl Pentafluoropropionic (PFP) anhydride. Đóng kín bình bằng nút

rồi trộn các dung dịch dung và đun cách thủy ở nhiệt độ 500 trong 30 phút ( chú ý:

Vì tăng nhiệt độ nên một số chất như Pentafluoropropionic (PFP) sẽ làm tăng áp

suất trong bình, vì vậy nút chai phải đảm bảo chắc chắn).

Cần lắc đều hỗn hợp ít nhất là một lần trong thời gian phản ứng. Sau khi phản ứng

thì kết quả trong hỗn hợp sẽ rỗ ràng. Trong vòng 2 giờ sau khi lấy các bình ra khỏi

nước ấm ta cần ta sử dụng ống SPE để làm sạch hỗn hợp.

Thêm 2 ml toluene, dung dịch chuẩn putrescine-cadaverine và để hỗn hợp phản

ứng trong ống SPE. Thêm 2 ml hexane vào ống SPE và để cho dung dịch chảy qua

ống bằng lực hấp dẫn. Loại bỏ hexane. Thêm 150 µl hỗn hợp Pentafluoropropionic

(PFP) – toluene L và dung dịch chuẩn putrescine-cadaverine vào đầu ống SPE.



Khi hỗn hợp được thêm vào ta bắt đầu thu lượng chất đó. Thêm 3 hoặc 4 giọt dung

môi ethyl acetate toluene 30 %. Sauk hi hỗn hợp đã ngấm vào mẫu, thêm 2 ml

dung môi ethyl acetate toluene 30 %. Bổ sung thêm 6 ml dung môi ethyl acetate

toluene 30 % ( tổng cộng 8 ml) và tiến hành thu lại toàn bộ các chất đi ra sau quá

trình. Các chất này sẽ sử dụng được 1 tuần khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh và trong

bóng tối.

E. Phân lập chất phân tích.

Mẫu được tríc ly với methanol 75% như sau: Chuyển 10 g mẫu từ máy xay ra bát

sau đó thêm vào 60 ml methanol 75 %. Pha trộn hỗn hợp 2 phút với tốc độ cao. Cho hỗn

hợp vào bình định mức 100 ml có nắp đậy. Rửa bát và máy trộn với dung dịch methanol

75 % và thêm nước để tráng bình. Đặt bình đun cách thủy ở nhiệt độ 600C trong 15 phút.

Lấy ra và làm nguội đến nhiệt độ phòng và định mức tới vạch với methanol 75 %. Trộn

hỗn hợp bằng cách đảo ngược và lọc hỗn hợp qua giấy lọc. Dung dịch trích ly này sử

dụng được ít nhất là 4 tháng trong điều kiện bảo quản lạnh.

Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch đã được trích ly ở trên cho vào bình định mức 100

ml, thêm vào đó 1 ml dung dịch chuẩn làm việc ethyl acetate toluene 5 µg/ ml, thêm 0,5

ml HCl 0,5 M. Bốc hơi đến khô dung dịch bằng thiết bị bay hơi quay với nhiệt độ 50 –

600C ( chú ý: Chiết suất phải được bốc hơi đến khô). Sau khi tất cả các dung môi đều đã

bay hơi hết, thêm 2 – 3 ml nước, trộn đều và tiến hành bay hơi lần 2 ( điều này sẽ làm

loại bỏ tất cả HCl và làm cho dung dịch chiết được khô). Lượng chiết suất khô này sử

dụng được trong 3 ngày (trước khi phản ứng với anhydride PFP).

Thêm vào lượng chiết xuất khô 1 ml ethyl acetate và 300 µl PFP anhydride . Đóng

kín bình bằng nút rồi trộn các dung dịch dung và đun cách thủy ở nhiệt độ 500 trong 30

phút ( chú ý: Vì tăng nhiệt độ nên một số chất như Pentafluoropropionic (PFP) sẽ làm

tăng áp suất trong bình, vì vậy nút chai phải đảm bảo chắc chắn). Trong vòng 2 giờ sau

khi lấy các bình ra khỏi nước ấm ta cần ta sử dụng ống SPE để làm sạch hỗn hợp.

Tiến hành các bước tiếp theo như phần D. Bắt đầu từ thêm 2 ml tolune…

F. Xác định bằng sắc ký khí

Điều chỉnh hệ thống GC cho phù hợp với chất phân tích. Cho tiêm 1 µl dung dịch chuẩn

putrescine-cadaverine để hiệu chuẩn IV. . Đối với các sản phẩm có chứa hàm lượng chất

phân tích thấp (ví dụ, 0-5 µg cadaverine / g), dung dịch chuẩn putrescine-cadaverine hiệu

chuẩn III (5 µg / g) là phù hợp.



Tiêm 1-2 µl dẫn xuất thu được từ bước E vào hệ thống GC ( lưu ý: việc hiệu chuẩn máy

GC bằng dung dịch chuẩn putrescine-cadaverine chỉ cần thực hiện một lần ở đầu quá

trình phân tích, trừ khi máy bị tắt trong quá trình phân tích).

G. Tính toán

Thực hiện tính toán như các bước sau đây:

Tính tỷ lệ phản ứng của cadaverine ( RS c ) trong mỗi dung dịch chuẩn putrescine-

cadaverine như sau:

h

cc

PS

PSRS

Trong đó:

PSc : là chiều cao của đỉnh PFP cadaverine trong dung dịch chuẩn putrescine-

cadaverine

PSh: là chiều cao của đỉnh PFP hexanediamine trong dung dịch chuẩn putrescine-

cadaverine

Kết quả RSc với µg cadaverine (Wc)

Tính tỷ lệ phản ứng của putrescine ( RS p ) trong mỗdundung dịch chuẩn

putrescine-cadaverine hiệu chuẩn như trên, sử dụng chiều cao đỉnh của PFP-

putrescine ( PS p ).

Kết quả RS p với µg putrescine dẫn xuất ( W p )

Tính tỉ lệ phản ứng của cadaverine trong mẫu đem đi thử nghiệm( RTc ) như sau:

h

c

cPT

PTRT

Trong đó:

PTc chiều cao đỉnh của PFP-cadaverine trong thử nghiệm



PTh chiều cao đỉnh của PFP- hexanediamine trong thử nghiệm.

Tính hàm lượng putrescine trong mẫu đem đi thử nghiệm tương tự như trên

PT h là chiều cao đỉnh cao đỉnh của PFP- - hexanediamine trong thử nghiệm.

PT p là chiều cao đỉnh của PFP- putrescine trong thử nghiệm

Xác định kết quả cadaverine (W c ) và putrescine ( Wp) trong mẫu từ đồ thị được

xay dựng từ các số liệu dung dịch hiệu chuẩn.

Tính toán lượng cadaverine trong mẫu như sau:

µg cadaverine/ g = l

c

W

FW 10**

Trong đó:

F là hệ số pha loãng nếu có

Wl khối lượng của mẫu đêm đi thử nghiệm (g)

Tính toán hàm lượng putrescine trong mẫu đem đi kiểm tra tương tự như trên:

Thay giá trị Wc bằng W p . Lấy đơn vị báo cáo kết quả là µg/ g.

Bảng 996.07A Kết quả xác định putrescine ( µg/ g) cá ngừ đóng hộp bằng sắc ký khí.

Mẫu thử Số có

nghĩa

( µg/ g)

sr

( µg/ g)

sR

( µg/ g)

RSDr

%

RSDR

%

rb Rc

1 0,323 0,053 0,064 16,49 19,75 0,148 0,179

2 0,184 0,028 0,080 15,49 43,6 0,078 0,224

3 0,524 0,089 0,141 17,09 26,86 0,249 0,395

4 0,778 0,058 0,072 7,51 9,23 0,162 0,202

5 2,606 0,196 0,209 7,51 8,03 0,549 0,585

6 4,545 0,234 0,399 5,17 8,77 0,655 1,117

Bảng trên được thiết lập dựa vào kết nhận được từ 14 phòng thí nghiệm.

rb = 2,8 * sr

Rc = 2,8 * sR



Bảng 996.07B Kết quả xác định cadaverine ( µg/ g) cá ngừ đóng hộp bằng sắc ký khí.

Mẫu thử Số có nghĩa

( µg/ g)

sr

( µg/

g)

sR

( µg/ g)

RSDr

%

RSDR

%

rb Rc

Cá ngừ đóng hộp 0,564 0,056 0,104 9,91 18,40 0,157 0,291

Cá ngừ đóng hộp 1,064 0,082 0,104 7,71 9,80 0,230 0,291

Cá ngừ đóng hộp 1,118 0,099 0,117 8,88 10,49 0,277 0,328

Cá ngừ đóng hộp 2,573 0,076 0,111 2,98 4,55 0,213 0,311

Cá ngừ đóng hộp 9,120 0,515 0,648 5,65 7,1 1,442 1,814

Cá ngừ đóng hộp –

có đầu nhọn

5,171 0,779 0,914 15,06 17,68 2,181 2,559

Mahimahi 8,390 0,418 1,239 4,45 14,77 1,170 3,496

Bảng trên được thiết lập dựa vào kết nhận được từ 14 phòng thí nghiệm.

rb = 2,8 * sr

Rc = 2,8 * sR

Bảng 996.07C thu hồi putrescine đã thêm vào cá ngừ đóng hộp

Phòng thí

nghiệm

Nền µg/ g Tìm thấy µg/ g Thu hồi µg/ g Phục hồi %

A 0,35 4,60

4,80

4,25

4,45

86,38

90,45

B 0,31 5,35

4,82

5,04

4,51

102,44

91,67

C 0,35 4,78

4,65

4,43

4,30

90,04

87,40

D 0,32 4,88

4,83

4,56

4,51

92,68

91,76

E 0,33 4,83

4,51

4,50

4,18

91,46

84,96



F 0,42 4,00

4,15

3,58

3,73

72,76

75,81

G 0,24 4,66

4,74

4,42

4,50

89,84

91,46

H 0,31 4,71

4,59

4,40

4,28

89,43

86,99

I 0,26 4,57

3,74

4,31

3,48

87,60

70,73

K 0,40 4,61

4,42

4,21

4,02

85.57

81,71

AVG.rec % 87,05

Chấp nhận 4,92 µg putrescine/ g tuna

Bảng 996.07D thu hồi cadaverine thêm vào trong cá ngừ.

Phòng thí

nghiệm

Nền µg/ g Tìm thấy µg/

g

Thu hồi µg/ g Phục hồi %

A 0,53 5,10

5,40

4,57

4,87

91,95

97,99

B 0,54 5,33

5,48

4,79

4,94

96,38

99,40

C 0,46 5,35

5,33

4,89

4,87

98,39

97,99

D 0,57 5,40

5,30

4,83

4,73

97,18

95,17

E 0,50 5,33

4,58

4,83

4,08

97,18

82,09

F 0,58 5,38

5,32

4,80

4,74

96,58

95,37

G 0,59 5,43

5,50

4,84

4,91

97,38

98,79



H 0,72 5,38

5,66

4,66

4,94

93,76

99,40

I 0,60 5,52

4,41

4,92

3,81

98,99

76,66

J 0,71 6,13

6,27

5,42

5,56

109,05

111,87

Avg.rec % 96,58

Chấp nhận 4,97 µg cadaverine/ cá ngừ

Bảng 996.07E chuẩn bị dung dịch chuẩn putrescine- cadaverine

Dung dịch chuẩn

putrescine-

cadaverine

Dung dịch chuẩn

làm việc chuẩn

putrescine-

cadaverine

Khố lượng Lượng

cadaverine tương

đương trong mẫu

µg/g

Lượng

putrescine

tương đương

trong mẫu

µg/g

I B 0,5 0,5 0,25

II B 1,0 1 0,5

III B 0,5 5 2,5

IV A 1,0 10 5

Thêm vào 1 ml dung dịch chuẩn làm việc hexanediamine

5.3. AOAC 937.09 Xác định hàm lượng muối (natri clorua) trong thủy sản và sản

phẩm thủy sản.

A. Hóa chất

a. Dung dịch chuẩn bạc nitrat (AgNO3), 0,1M

Hòa tan một lượng bạc nitrat (AgNO3) lớn hơn lượng lý thuyết (169,87g) bằng nước


trong lọ thủy tinh, tránh ánh sáng.

Xác định nồng độ dung dịch AgNO3 lớn hơn lượng lý thuyết (169,87 g) bằng nước


trong lọ thủy tinh tránh ánh sáng.

Chuẩn hóa nồng độ dung dịch AgNO3 bằng dung dịch natri clorua (NaCl) 0,1 M

(5,844 g NaCl khan trong 1 000 ml nước).

b. Dung dịch chuẩn amoni thioxyanat (NH4SCN), 0,1 M



Hòa tan 7,612 g NH4SCN bằng nước trong bình định mức dung tích 1 000 ml. Thêm

nước đến vạch và trộn.

Xác định nồng độ dung dịch làm việc bằng cách lấy chính xác từ 40 ml đến 50 ml

dung dịch chuẩn AgNO3 0,1 M, thêm 2 ml dung dịch chỉ thị sắt (III) và 5 ml dung dịch

HNO3, chuẩn độ bằng dung dịch NH4SCN 0,1 M cho đến khi dung dịch xuất hiện màu

xanh xám sau khi lắc mạnh.

Chuẩn hóa dung dịch NH4SCN 0,1 bằng dung dịch AgNO3 để xác định nồng độ

NH4SCN 0,1.

c. Dung dịch chỉ thị sắt (III), sắt (III) amoni sulfat [FeNH4(SO4)2 12 H2O)] bão hòa.

B. Xác định

a. Các loại thịt động vật có vỏ

Cân 10g thịt, chất lỏng hoặc hỗn hợp thịt và chất lỏng vào Erlenmeyer hoặc cốc

thủy tinh 250 ml.

b. Các loài cá khác

Sử dụng mẫu với kích thước phụ hợp hoặc tùy thuộc vào dung dịch NaCl có trong

mẫu.

Thêm dung dịch AgNO3 0,1 M với một lượng lớn hơn đủ để tạo kết tủa tất cả ion Cl-

thành AgCl, sau đó thêm 20 ml dung dịch HNO3. Đun sôi nhẹ trên bếp điện hoặc bếp

cách cát sao cho tất cả các chất rắn hòa tan hết ngoại trừ AgCl (thường mất khoảng 15

phút). Làm nguội, thêm 50 ml nước và 5 ml dung dịch chỉ thị và chuẩn độ bằng dung

dịch chuẩn NH4SCN 0,1 M cho đến khi dung dịch có màu nâu sáng ổn định.

5.4. AOAC 977.26 phương pháp xác định clostridium botulinum và độc tố của nó

trong thực phẩm.

A. Nguyên tắc

Tiêm vào con chuột một lượng độc tố botulinum được chiết xuất từ thực phẩm với

liều lượng gây chết tối thiểu ( MLD. Con chuột sẽ bị chết trong 48 h sau khi xuất hiện các

triệu chứng của việc ngộ độc độc tố botulinum. Một loại thuốc kháng độc thích hợp sẽ

bảo vệ cho con chuột khỏi các triệu chứng nhiễm độc trong khi các loại thuốc kháng độc

khác không có tác dụng cho nên người ta sẽ xác định được loại huyết thanh có tác dụng

chống lại độc tố botulinum. Bào tử bị nghi ngờ trong thực phẩm sẽ được nuôi cấy và phát

triển trong môi trường thích hợp và sản sinh ra độc tố, độc tố này sẽ được phát hiện.



B. Thiết bị

Opener: xem 972.44 C (a)

Bình kị khí: bình GasPark được sản xuất ở Hoa Kỳ, số 219.511) hoặc thay thế bởi

Case- nito

Đĩa petri: đường kính 100 mm, các đĩa được làm khô trong 24 h ở nhiệt độ 350C

trước khi thực hiện cấy mẫu.

Máy li tâm: tốc độ cao

Xi-lanh: 1 ml hoặc 3 ml

C. Hóa chất và mẫu.

Nấu nước dùng thịt:

Xay 500g gan bò tươi với 800 ml nước. Cho nhiệt BP và đung nhỏ lửa trong 1 giờ.

Làm nguội và điều chỉnh pH =7 và đung sôi trong vòng 10 phút. Lọc qua vải ép, lấy

lượng chất lỏng. Để nước dùng thu được vào trong môi trường gồm 10 g peptone, 1g

K2HPO4 và 1 g tinh bột hòa tan. DDiieuf chỉnh pH = 7 và pha loãng thành 1 l với nước.

Lọc qua giấy khô ( có thể bảo quản nước dùng ở nhiệt độ lạnh để sử dụng cho các phép

thử sau). Lấy ống nghiệm có chỉ số 18 hoặc 20 x 150 mm, cho nước dùng vào trong ống

nghiệm với chiều cao 1-2 cm và 10- 12 ml chất lỏng. Hấp ở 20 phút ở nhiệt độ 1200C.

Chiết xuất Trypticase- peptone glucose- men ( TPGY) hoặc nước dùng với

trypsin ( TPGYT)

Hòa tan 50 g Trypticase, 5g Bacto- peptone, 20 g nấm men, 4 g dextrose và 1 g natri

thioglycollate trông 1 l nước và phân chia vào 20 ống nghiệm mỗi ống 15 ml. Hấp 10

phút đối với ống hoặc 15 phút đối với chai trong 1210C. Kiểm tra pH cuối cùng nên đạt 7

± 0,1. Bảo quản trong tủ lạnh để tiếp tục sử dụng và sẽ bỏ đi khi không sử dụng trong

vòng 2 tuần.

Chuẩn bị trypsin bằng cách hòa tan 1,5 g trypsin ( Difco 1: 250, số 0152) trong 100

ml nước. Khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc 0, 45 µm hoặc bổ lọc tương đương và

bảo quản trong tủ lạnh.

Thạch gan bê- long đỏ trứng hoặc thạch lòng đỏ trứng kỵ khí.

Thạch gan bê lòng đỏ trứng: Rửa sạch 2-3 quả trứng và để ráo. Ngâm trứng trong

dung dịch HgCl2 0,1 % trong 1 h. Lấy trứng ra khỏi dung dịch HgCl2 và ngâm

trứng vào cồn 70% trong 30 phút. Loại vỏ trứng trong điều kiện vô trùng và loại

bỏ lòng trắng. Cho lượng lòng đỏ thu được vào bình chứa vô trùng và thêm vào đó

dung dịch NaCl 0, 85% ( w/v), trộn đều. Cho 500 ml thạch bê vô trùng thêm 40 ml



lòng đỏ trứng pha với dung dịch NaCl, trộn đều và đổ đĩa. Để đĩa khô trong 24h ở

nhiệt độ 350C. Loại bỏ các đĩa bị nhiễm bẩn và lưu trữ các đĩa vô trùng ở điều kiện

lạnh.

Thạch lòng đỏ trứng kỵ khí: Hòa tan 5 g nấm men, 5 g tryptone, 20 g proteode

peptone, 5g NaCl và 20 g agar trong 1 l nước. Điều chỉnh pH =7 và phân chia môi

trường trên vào 2 bình 1l. Cho vào nồi hấp 1210 trong 20 phút. Lấy 500 ml đi làm

tan thạch ở 45-500C và thêm vào đó 40 ml lòng đỏ trứng ngâm nước muối. tương

tự như bước trên và đem đi đổ đĩa và bảo quản như đối với Thạch gan bê lòng đỏ

trứng.

Gel- đệm phosphate

Ph = 6,2. Hòa tan 2 g gelatin và 4 g Na2HPO4 trong 1 l nước ấm. Phân chia vào các

bình 100 ml và đem hấp ở 1210C trong 20 phút.

Chuẩn bị thuốc kháng độc Clostridium btulinum.

Các loại từ A đến F hoặc loại đa năng A-F có sẵn trên thị trường.

D. Chuẩn bị thử nghiệm

- Kiểm tra sơ bộ:

Giữ mẫu thử trong tủ lạnh, các loại đồ hộp khi chưa mở trừ khi bị phồng lên và có nguy

cơ bị bung nắp cần phải được làm lạnh.

- Các loại thực phẩm rắn.

Có ít hoặc không có chất lỏng trong thực phẩm. Thêm lượng đệm gel – phosphate và xay

với máy vô trùng. Hoặc có thể cắt nhỏ mẫu ra bằng kẹp vô trùng và làm giàu mẫu bằng

nước dùng làm giàu.

- Các loại thực phẩm lỏng

Cấy nước làm giàu trực tiếp vào bằng pipet vô trùng

- Các loại thực phẩm đóng hộp

Khử trùng bằng dung dịch cồn iod và mở hộp như trong 972.44 D. Khi hộp đã bị

phồng lên có thể mở theo đường dọc hộp, nếu hộp có nguy cơ nổ cần tiến hành một cách

thận trọng.

- Kiểm tra phần dự trữ.



Sau khi cấy mẫu, hấp vô trùng và loại bỏ các phần lọ vô trùng để tiến hành làm

thêm thử nghiệm khi cần thiết.

E. Phát hiện C. Bolutinum.

- Làm giàu: Hòa tan dung dịch có sẵn trước khi tiêm mẫu 10- 15 phút và làm nguội

một cách nhanh chóng. Cấy 2 ống nước dùng thịt với 1 g rắn hoặc 1-2 ml chất

lỏng thực phẩm với 15 ml nước dùng. Cấy từ từ bên dưới bề mặt nước dùng, ủ ở

350C. Tương tự như vậy cấy 2 ống TPGY và ủ ở 260C.

- Kiểm tra: Sau 5 ngày, kiểm tra các ống nghiệm có đục, sinh khí và các hạt thịt bị

tiêu hóa, xuất hiện mùi hôi. Kiểm tra bằng kính hiển vi bằng cách nhuộm Gram.

Quan sát hình thái học của các vi sinh vật và lưu ý sự tồn tại của các tế bào C.

botutinum điển hình.

- Các bước tiếp theo: Thông thường sau 5 ngày ủ thì các hoạt động sống sẽ cao nhất

và sản sinh ra nhiều chất độc nhất. Giữ lại các ống nghiệm bảo quản ở nhiệt độ

lạnh nếu không có sự phát triển sau 5 ngày, ủ thêm 10 ngày để phát hiện mầm

bệnh có thể chậm phát triển của bào tử C. botulinum trước khi hấp bỏ.

F. Phân ly các ống nghiệm

Nếu có sự hình thành các bào tử C. Botulinum thì việc phân lập sẽ tiến ra dễ dàng.

- Tiền xử lý: Lấy 1- 2ml dung dịch trong ống nghiệm phát hiện C. Botulinum vào

ống vô trùng nắp vặn. Trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 1h.

- Cấy dung dịch: Cấy vòng lặp trên một trong 2 môi trường thạch gan-bê lòng đỏ

trứng hoặc thạch lòng đỏ trứng kỵ khí để phân lập. Ủ trong 48 h ở 350C trong điều

kiện kỵ khí.

VI. So sánh các phương pháp kiểm tra

Tên chỉ tiêu Phương pháp kiểm

tra chỉ tiêu của

Việt Nam

Phương pháp kiểm


CODEX

Phương pháp kiểm


AOAC

Lấy mẫu, kiểm tra và

phân tích

Các chỉ tiêu kiểm tra này đều tuân theo

TCVN 6388: 2006, tiêu chuẩn này tương

đương với codex stan 70 – 1981, REV.1-

1995. Vì vậy các chỉ tiêu kiểm tra ở Việt

Nam và CODEX về sản phẩm cá ngừ

đóng hộp là giống nhau

Kiểm tra cảm quan và

kiểm tra vật lý

Xác định khối lượng

tịnh


đã ráo nước




ráo nước đã được rửa

(đối với hộp có nước

sốt)

Kiểm tra dạng trình

bày

Xác định khuyết tật

Xác định histamine

TCVN 8352 : 2010

AOAC 977.13

Salmonella TCVN 8342:2010

Acid boric và muối

borat

TCVN 8343:2010

Ure TCVN 8344: 2010

Dư lượng sulfonamit TCVN 8345 : 2010

Hàm lượng Sulfit TCVN 8354: 2010

Hàm lượng

natriclorua

TCVN 3701: 2009 AOAC 937.09

Xác định Putrescine,

Cadaverine

AOAC 996.07

TCVN 8352 : 2010

AOAC 977.13

Giống nhau Nhìn chung cả 2 cách xác định hàm lượng Histamine của Việt Nam

và AOAC là hoàn toàn giống nhau.

Khác nhau Sử dụng dung dịch o- Phthal

aldeyt (OPT) được pha loãng với

100ml methanol với hàm lượng o-

Phthal aldeyt là 100 mg.

Sử dụng dung dịch o- Phthal

aldeyt (OPT) được pha loãng

với 100ml methanol với hàm

lượng o- Phthal aldeyt là 0,1

mg.

TCVN 3701 : 2009 AOAC 937.09

Giống nhau 2 phương pháp kiểm tra hàm lượng natri clorua của 2 tiêu chuẩn này

là hoàn toàn giống nhau.



Kết luận

Cá ngừ đóng hộp là một trong những loại thực phẩm được sử dụng phổ biến trong

cuộc sống hiện nay vì vậy việc kiểm sát chất lượng của loại thực phẩm này là rất quan

trọng nó có ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe của con người.

Giữa một chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm thì có thể có một hoặc nhiều phương

pháp kiểm tra, mỗi phương pháp kiểm tra sẽ có ưu nhược điểm riêng và giới hạn phát

hiện khác nhau. Nên chúng ta cần lựa chọn phương pháp kiểm tra phù hợp với tiêu chuẩn

chất lượng của sản phẩm để việc kiểm tra được nhanh chóng, thuận tiện và đạt kết quả

chính xác nhất.


SVTH: Phan Thị Hương

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1] Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Lệ Hà, Nguyên lý sản xuất đồ hộp thực phẩm, Nhà xuất

bản Khoa học Kỹ thuật, 2009.

[2] Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản-tập 1-

Nguyên liệu chế biến thủy sản, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, 1990

[3] Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản-tập 2-

Ướp muối, chế biến nước mắm, chê biến khô, thức ăn chín, Nhà xuất bản Nông Nghiệp,

1990

[4] Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT: "Qui định danh mục các chất phụ gia được phép

sử dụng trong thực phẩm".

[5] QCVN 02-04:2009/BNNPTNT._ Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về cơ sở sản xuất đồ

hộp thuỷ sản. Điều kiện đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

Website:

http://www.tbtvn.org/Lists/Ti%20liu/Attachments/509/845tdc2002.pdf

http://chicuctdcbinhthuan.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=3031&

Itemid=395

http://www.codexalimentarius.org/input/download/.../CXS_234e_2013.pdf

http://translate.google.com.vn/translate?hl=vi&sl=en&u=http://www.codexalimentarius.o

rg/input/download/report/366/al93_18e.pdf&prev=/search%3Fq%3DCODEX%2Bstanda

rd%2Bfresh%2Bfrozen%2Bsquid%2Beat%26espv%3D2

http://www.eoma.aoac.org/methods/search.asp?string=b

http://chicuctdcbinhthuan.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=3034&

Itemid=395

http://www.clfish.com/inc/haccpv/haccpv/PHU%20LUC%20KIEM%20SOAT%20DU%

20LUONG%20CHAT%20DOC.htm

http://portal.tcvn.vn/default.asp

http://www.tbtvn.org/Lists/Ti%20liu/Attachments/509/845tdc2002.pdf

http://chicuctdcbinhthuan.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=3031&Itemid=395


http://www.codexalimentarius.org/input/download/.../CXS_234e_2013.pdf

http://translate.google.com.vn/translate?hl=vi&sl=en&u=http://www.codexalimentarius.org/input/download/report/366/al93_18e.pdf&prev=/search%3Fq%3DCODEX%2Bstandard%2Bfresh%2Bfrozen%2Bsquid%2Beat%26espv%3D2



http://www.eoma.aoac.org/methods/search.asp?string=b



http://www.clfish.com/inc/haccpv/haccpv/PHU%20LUC%20KIEM%20SOAT%20DU%20LUONG%20CHAT%20DOC.htm

http://www.clfish.com/inc/haccpv/haccpv/PHU%20LUC%20KIEM%20SOAT%20DU%20LUONG%20CHAT%20DOC.htm

http://portal.tcvn.vn/default.asp



BẢNG TIÊU CHUẨN

TCVN 6507-3:2005 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Chuẩn bị

mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân

để kiểm tra vi sinh vật. Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị

các mẫu thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản.

QCVN 02-

04:2009/BNNPTNT

QCVN 02-04:2009/BNNPTNT._ Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia

về cơ sở sản xuất đồ hộp thuỷ sản. Điều kiện đảm bảo vệ sinh an

toàn thực phẩm.

TCVN 6846 :

2001 hay ISO 7251:

1993

Xác định E. Coli

TCVN 4991-89

(ISO 7937 : 1985).

Xác định Clostridium perfringens

TCVN 4882 : 2007

(ISO 4831 : 2006).

Xác định coliform,



PHỤ LỤC 1

AOAC Official Method 937.09

Salt (Chlorine as Sodium Chloride) in Seafood

Volumetric Method

First Action 1937

Final Action

A. Reagents

(a) Silver nitrate standard solution.—0.1M. Prepare as in 941.18A (see A.1.11) and

standardize against 0.1M NaCl containing 5.844 g of pure dry NaCl/L.

(b) Ammonium thiocyanate standard solution.—0.1M. Prepare as in 941.18D(b)

(see A.1.11) and standardize against 0.1M AgNO3.

(c) Ferric indicator.—Saturated solution of FeNH4(SO4)2·12H2O.

B. Determination

(a) Shellfish meats.—Weigh 10 g meats, liquid, or mixed meats and liquid, into 250 mL

Erlenmeyer or beaker.

(b) Other fish products.—Use suitable size test sample, depending on NaCl content.

Add known volume 0.1M AgNO3 solution, more than enough to precipitate all Cl as

AgCl, and then add 20 mL HNO3. Boil gently on hot plate or sand bath until all solids

except AgCl dissolve (usually 15 min). Cool, add 50 mL H2O and 5 mL indicator, and

titrate with 0.1N NH4SCN solution until solution becomes permanent light brown.

Subtract mL 0.1M H4SCN used from mL 0.1M AgNO3 added and calculate difference as

NaCl. With 10 g test sample each mL 0.1N AgNO3 = 0.058% NaCl.



References:

JAOAC 20, 410(1937); 23, 589(1940).

CAS-7647-14-5 (sodium chloride)

© 2000 AOAC INTERNATIONAL

PHỤ LỤC 2


Putrescine in Canned Tuna

and Cadaverine in Canned Tuna and Mahimahi

Gas Chromatographic Method

First Action 1996

(Applicable to determination of 0.3 g putrescine/g in canned tuna, and 0.5 g

cadaverine/g in canned tuna and mahimahi.)

See Tables 996.07A and B for the results of the interlaboratory studies supporting the

acceptance of this method. See Tables 996.07C and D for recovery data.

Caution: See Appendix B, safety notes. Pentafluoropropionic anhydride causes severe

burns. Avoid contact with skin and eyes. Wear gloves and use effective fume removal

device.

A. Principle

Putrescine and cadaverine are extracted from test portion with 75% methanol and then

converted to fluorinated derivatives. Reaction mixture is purified by passing through a

solid-phase extraction (SPE) column and derivatives are quantitated by electron capture

gas chromatography (GC) after separation on OV-225 column.

B. Apparatus

(a) Gas chromatograph.—With 63Ni pulsed electron capture detector. Operating

conditions: injection port, 210°C; detector, 320°C; GC column, 170–180°C; N flow,

25 mL/min; electrometer range, 10–10 (full scale). Detector makeup purge gas as needed

(e.g., 40 mL/min).



(b) GC column.—1800 2 mm id, glass column, packed with 3% OV-225 (50%

cyanopropylphenyl 50% methyl) on 100–120 mesh Gas-Chrom Q, or equivalent capillary

column. Condition 2 h with gas flow at room temperature, increase temperature gradually

(ca 6°C/min) to 240°C, and hold 16 h. Retention times of pentafluoropropionic

derivatives of putrescine, cadaverine, and hexanediamine should be 7, 9, and 12 min,

respectively.

(c) SPE tubes.—3 mL, SupelClean LC-Alumina-N SPE tubes (available from Supelco,

Inc., Supelco Park, Bellefonte, PA 16823-0048, USA, or equivalent). Check activity of

each lot of SPE tubes as follows: Pass 2 mL petroleum ether–toluene solvent, C(k),

through SPE tube and then add to tube 50 L Sudan I dye solution, C(l). Add a few

drops of petroleum ether-toluene solvent, C(k), to remove dye from top frit. Pass 3 mL

solvent through column. If band of dye stays in the top 4 mm of SPE tube, the batch is

satisfactory for purification of calibration standard and analyte derivatives.

(d) Analytical balance.

(e) Rotary evaporator.—Maintaining 50 ± 5°C.

(f) Water bath.—Maintaining 50 ± 5°C and 60 ± 5°C.

(g) Glassware.—Volumetric flasks, 100 mL (glass-stoppered) and 1 L; round or flat

bottom 24/40 flasks, 100 mL; graduated cylinders, 100 and 500 mL (glass-stoppered).

(h) Blender.—For test sample preparation.

(i) Pipets.—Accurately delivering 1, 2, 3, 5, 10, and 25 mL.

(j) Micropipets.—Accurately delivering 50, 150, and 500 L.

(k) Folded filter paper.

(l) Glass syringe.—1.0 mL, calibrated in 0.01 mL.

C. Reagents

(a) Pentafluoropropionic (PFP) anhydride.—Store refrigerated and protected from

moisture (available from Pierce Chemical Co., PO Box 117, Rockford, IL 61105-0117,

USA).



(b) Ethyl acetate.—Distilled in glass. Suitable for GC.

(c) Toluene.—Distilled in glass. Suitable for GC.

(d) Hexane.—Suitable for GC.

(e) Hydrochloric acid.—1M (83.3 mL HCl diluted to 1 L with water); 0.1M (dilute 100

mL 1N HCl to 1 L with water).

(f) Ethyl acetate–toluene solvent.—30% Ethyl acetate in toluene. Transfer 150 mL ethyl

acetate to stoppered graduated cylinder, add 350 mL toluene, and mix.

(g) Methanol.—75% (v/v). Place 750 mL MeOH (distilled in glass) into 1 L volumetric

flask. Dilute to volume with H2O while swirling.

(h) Hexanediamine internal standard solutions.—(1) Hexanediamine standard stock

solution.—Dissolve 163.0 mg hexanediamine dihydrochloride in 0.1M HCl in 100 mL

volumetric flask and dilute to volume with 0.1M HCl. (2) 20 g/mL.—Pipet 2 mL

hexanediamine standard stock solution, (1), into 100 mL volumetric flask and dilute to

volume with 0.1M HCl. (3) Hexanediamine internal standard working solution.—5

g/mL. Pipet 25 mL 20 g/mL hexanediamine standard solution into 100 mL volumetric

flask and dilute to volume with 0.1M HCl.

(i) Putrescine–cadaverine standard stock solution.—Dissolve 91.4 mg putrescine

dihydrochloride and 171.3 mg cadaverine dihydrochloride in 0.1M HCl in 100 mL

volumetric flask and dilute to volume with 0.1M HCl.

Table 996.07A: Interlaboratory study results for determination of putrescine ( g/g)

in canned tuna by gas chromatographya

(j) Putrescine–cadaverine standard working solutions.—(1) Solution A.—10 g

cadaverine/mL and 5 g putrescine/mL as free base. Pipet 1 mL putrescine-cadaverine

standard stock solution, (i), into 100 mL volumetric flask and dilute to volume with 0.1M

HCl. (2) Solution B.— 1 g cadaverine/mL and 0.5 g putrescine/mL as free base. Pipet

10 mL solution A into 100 mL volumetric flask and dilute to volume with 0.1M HCl.

(k) Petroleum ether–toluene solvent.—4 + 1 (v/v). For checking activity of SPE tubes.



(l) Sudan I dye solution.—For checking activity of SPE tubes. Dissolve 0.01 g Sudan I

dye (97%) in 8 mL petroleum ether-toluene solvent, (k).

D. Preparation of Putrescine–Cadaverine Calibration Standard Solutions

Prepare putrescine-cadaverine calibration standard solutions I–IV (see Table 996.07E) as

follows: Pipet 1 mL aliquots of hexanediamine internal standard working

solution, C(h)(3), and indicated volumes of putrescine-cadaverine standard working

solutions (see Table 996.07E) into separate 100 mL round- or flat-bottom 24/40 flasks.

Add ca 0.5 mL 1M HCl into each flask and evaporate to dryness on rotary evaporator at

ca 50–60°C. (Note: Provide adequate chilling and vacuum to obtain evaporation.) Rinse

each flask with 1–2 mL H2O and evaporate to dryness again to remove last trace of HCl.

Table 996.07B: Interlaboratory study results for determination of cadaverine ( g/g)

in canned tuna and mahimahi by gas chromatographya

Table 996.07C: Recovery of putrescine added to canned tunaa

Table 996.07D: Recovery of cadaverine added to canned tunaa

To dried residue, add 1 mL ethyl acetate, C(b), and 300 L PFP anhydride, C(a), using

glass syringe. Close flask with stopper, mix, and heat 30 min at 50°C in water bath.

(Note: Because of pressure increase as PFP reaction is heated, stoppers should be secured

with restraining clip.)

Swirl solution at least once during reaction. After reaction, the resulting reaction mixture

should remain clear. Within 2 h after removal from water bath, proceed to next step to

purify reaction mixture using SPE tube.

Add 2 mL toluene, C(c), to putrescine–cadaverine calibration standard-PFP reaction

mixture. Add 2 mL hexane, C(d), to each SPE tube and let flow through by gravity.

Discard hexane. Add 150 L putrescine-cadaverine calibration standard-PFP-toluene

reaction mixture to top of SPE tube. Start collecting effluent when mixture is added. Add

3 or 4 drops 30% ethyl acetate-toluene solvent, C(f), to tube. After mixture passes into

frit, add 2 mL 30% ethyl acetate-toluene solvent. Add additional 6 mL 30% ethyl acetate-

toluene solvent (total of 8 mL) and collect entire effluent. Effluent is stable at least 1

week stored in refrigerator in the dark.



E. Isolation of Analyte

Extract product with 75% methanol as follows: Transfer 10.00 g product to blender bowl

and add ca 60 mL 75% methanol, C(g). Blend ca 2 min at high speed. Transfer to 100

mL glass-stoppered volumetric flask, rinsing lid and blender jar with 75% methanol and

adding rinsings to flask. Place flask in 60°C water bath and maintain 15 min. Cool to

room temperature and dilute to volume with 75% methanol. Mix by inverting and filter

through folded filter paper. Methanol extracts are stable at least 4 months in refrigerator.

Pipet 10 mL methanol extract into 100 mL round- or flat-bottom flask, add 1 mL

hexanediamine internal standard working solution, C(h)(3), and ca 0.5 mL 1M HCl.

Evaporate to dryness on rotary evaporator at ca 50–60°C. (Note: Extracts must be

evaporated to dryness. Provide adequate chilling and vacuum to obtain evaporation.)

After all solvent is evaporated, add 2–3 mL H2O, swirl, and evaporate again. (Note: This

will eliminate the last trace of HCl and ensure that extract is dry.) Dried residues of

methanol extracts (before reaction with PFP anhydride) are stable at least 3 days.

To dried residue, add 1 mL ethyl acetate and 300 L PFP anhydride using glass syringe.

Close flask with stopper, mix, and heat 30 min at 50°C in water bath. (Note: Because of

pressure increase as PFP reaction is heated, stoppers should be secured with restraining

clip.)

Swirl solution at least once during reaction. After reaction, the resulting analyte reaction

mixture will turn yellow with most fishery products. (Note: Clear reaction mixture

indicates presence of H2O in residue of methanol extract. In such case, repeat evaporation

step and then proceed with analysis.) Within 2 h after removal from water bath, proceed

to next step to purify reaction mixture using SPE tube.

Proceed as in D, beginning "Add 2 mL toluene...," using analyte-PFP reaction mixture

instead of putrescine-cadaverine calibration standard-PFP reaction mixture.

F. GC Determination

Adjust GC system to give full scale recorder response for injection of 1 L derivatized

putrescine-cadaverine calibration standard solution IV from D. For products containing

lower levels of analytes (e.g., 0–5 g cadaverine/g), set derivatized putrescine-cadaverine

calibration standard solution III (5 g/g) full scale.



Inject 1–2 L effluent from E onto GC system. (Note: Full calibration of GC system with

duplicate injections of each of putrescine-cadaverine calibration standard solutions is

required only at the beginning of analysis unless instrument is shut down between

analyses. When analyzing test portions on succeeding days, rerun derivatized putrescine-

cadaverine calibration standard solutions II and III through GC system to ensure that

calibration of instrument is stable.)

G. Calculations

Perform following calculations:

(1) Calculate response ratio of cadaverine (RSc) in each putrescine-cadaverine calibration

standard solution as follows:

RSc =

where PSc = peak height of PFP cadaverine in putrescine-cadaverine calibration standard

solution and PSh = peak height of PFP hexanediamine in putrescine-cadaverine

calibration standard solution.

Plot RSc vs g cadaverine derivatized (Wc).

(2) Calculate response ratio of putrescine (RSp) in each putrescine-cadaverine calibration

standard solution as above, using peak height of PFP-putrescine (PSp).

Plot RSp vs g putrescine derivatized (Wp).

(3) Calculate response ratio of cadaverine in test portion (RTc) as follows:

Table 996.07E: Preparation of putrescine-cadaverine calibration standard solutions

RTc =

where PTc = peak height of PFP-cadaverine in test and PTh = peak height of PFP-

hexanediamine in test.

(4) Calculate response ratio of putrescine in test (PTh) as above, using peak height of

putrescine in test (PTp).



(5) Determine Wc and Wp for tests from calibration graph.

(6) Calculate amount of cadaverine in test portion as follows:

g C4adaverine/g =

where F = attenuation (or dilution) factor, if required, and Wt = weight of test portion, g.

(7) Calculate amount of putrescine in test portion as above, using Wp value. Report all

results to 0.1 g/g.

If values obtained for putrescine and cadaverine in test portion are higher than those

obtained for the most concentrated putrescine-cadaverine calibration standard solution,

quantitate putrescine and cadaverine levels in test portion by analyzing smaller aliquot of

75% methanol extract (e.g., 1 mL), and multiply by appropriate factor to calculate values

in g/g. Smaller volume of test solution may be injected or instrument attenuation may

be adjusted to estimate putrescine and cadaverine content.

Reference:

J. AOAC Int. 80, 591(1997).

Revised: March 1999




PHỤ LỤC 3


Histamine in Seafood

Fluorometric Method

First Action 1977

Final Action 1987

Caution: See Appendix B, Laboratory Safety for "Safe Handling of Alkalies"—sodium

hydroxide; "Safe Handling of Acids"—phosphoric and hydrochloric acids; and "Safe

Handling of Special Chemical Hazards"—methanol. Dispose of waste solvents in an

appropriate manner compatible with applicable environmental rules and regulations.

See Tables 977.13A and B for the results of the interlaboratory study supporting the

acceptance of the method, and Table 977.13C for recovery data.

A. Principle

Sample is extracted with 75% (v/v) methanol. Extract is passed through ion exchange

column. o–Phthaldialdehyde solution is added to eluate to form fluorescent histamine

derivatives. Fluorescent intensity of derivatives is measured using fluorometer and

histamine is quantified using external standards.

B. Apparatus

Rinse all plastic and glass containers with HCl (1 + 3) and H2O before use.



(a) Chromatographic tube.—200 7 id mm polypropylene tube fitted with small plastic

stopcocks and ca 45 cm Teflon tubing. Control flow rate at >3 mL/min by adjusting

height of column relative to tubing outlet. Alternatively, use 2-way valve in place of

tubing.

(b) Photofluorometer.—Equipped with medium pressure Hg lamp with excitation at 350

nm and measuring emission at 444 nm.

(c) Repipets.—1 and 5 mL.

C. Reagents

(a) Ion-exchange resin.—Bio-Rad AG 1-X8, 50–100 mesh (Bio-Rad Laboratories, 1414

Harbour, South Richmond, CA 94804, USA) or Dowex 1-X8, 50–100 mesh. Convert to -

OH form by adding ca 15 mL 2M NaOH/g resin to beaker. Swirl mixture and let stand

<30min. Decant liquid and repeat with additional base. Thoroughly wash resin with H2O,

slurry into fluted paper and wash again with H2O. Prepare resin fresh weekly and store

under H2O. Place glass wool plug in base of tube, B(a), and slurry in enough resin to

form 8 cm bed. Maintain H2O level above top of resin bed at all times. Do not regenerate

resin in packed column; rather, use batch regeneration in beaker when necessary. Wash

column with ca 10 mL H2O before applying each extract.

(b) Phosphoric acid.—3.57N. Dilute 121.8 mL 85% H3PO4 to 1 L. For other

concentration H3PO4, volume required for 1 L1.19M acid = 17493/(density

H3PO4 percent H3PO4). Standardize 5.00 mL by titration with 1.00M NaOH to

phenolphthalein end point, and adjust concentration if necessary.

(c) o-Phthaldialdehyde (OPT) solution.—0.1% (w/v). Dissolve 100 mg OPT in 100 mL

distilled-in-glass methanol. Store in amber bottle in refrigerator. Prepare fresh weekly.

(d) Histamine standard solutions.—Store in refrigerator. (1) Stock solution.—1 mg/mL

as free base. Accurately weigh ca 169.1 mg histamine 2HCl (98%) into 100 mL

volumetric flask, and dissolve and dilute to volume with 0.1M HCl. Prepare fresh

weekly. (2) Intermediate solution.—10 g/mL. Pipet 1 mL stock solution into 100 mL

volumetric flask, and dilute to volume with 0.1M HCl. Prepare fresh weekly. (3) Working

solutions.—0.5, 1.0, and 1.5 g/5 mL. Pipet 1, 2, and 3 mL intermediate solution into

separate 100 mL volumetric flasks, and dilute each to volume with 0.1M HCl. Prepare

fresh daily.



(e) Methanol.—75% (v/v). Place 75 mL MeOH (distilled in glass) into 100 mL

volumetric flask or stoppered graduated cylinder. Dilute to volume with H2O. Swirl flask

while adding H2O.

D. Preparation of Standard Curve

Pipet duplicate 5 mL aliquots of each working standard solution into separate 50 mL

glass or polypropylene Erlenmeyers. Pipet in 10 mL 0.1M HCl to each flask and mix.

Pipet in 3 mL 1M NaOH and mix. Within 5 min, pipet in 1 mL OPT solution and mix

immediately. After exactly 4 min, pipet in 3 mL 3.57NH3PO4 and mix immediately. It is

important to mix thoroughly after each addition and at least once during OPT reaction.

(Run 6– 10 OPT reactions simultaneously by adding reagents to Erlenmeyers in set

order.) Prepare blank by substituting 5 mL 0.1M HCl for histamine solution. Within 1.5

h, record fluorescence intensity (I) of working standard solutions with H2O in reference

cell, using excitation wavelength of 350 nm and emission wavelength of 444 nm.

Plot I (corrected for blank) against g histamine/5 mL aliquot.

E. Determination

Extract prepared sample with 75% (v/v) methanol as in 957.07C (see 35.1.31), paragraph

1. Pass 4–5 mL H2O through column, B(a), and discard eluate. Pipet 1 mL extract onto

column and add 4–5 mL H2O. Immediately initiate column flow into 50 mL volumetric

flask containing 5.00 mL 1.00M HCl. When liquid level is ca 2 mm above resin, add ca 5

mL H2O and let elute. Follow with H2O in larger portions until ca 35 mL has eluted. Stop

column flow, dilute to volume with H2O, stopper, and mix. Refrigerate eluate.

Table 977.13A: Interlaboratory study results for determination of histamine in tuna

by fluorometric method (based on collaborative study results of the original

method)

Pipet 5 mL eluate into 50 mL Erlenmeyer, and pipet in 10 mL 0.1M HCl. Proceed as

in D, beginning "Pipet in 3 mL 1M NaOH . . .''.

If test sample contains >15 mg histamine/100 g fish, pipet 1 mL sample–OPT mixture

into 10 mL beaker containing exactly 2 mL blank–OPT mixture, and mix thoroughly.

Read fluorescence of new solution. Dilute and mix aliquots with blank–OPT mixture as

needed to obtain measurable reading. This approximation indicates proper dilution of

eluate required prior to second OPT reaction needed for reliable quantitation of test

sample. Alternatively, use sensitivity range control of fluorometer (if instrument has one)



to estimate dilution. Use these approximations to prepare appropriate dilution of aliquot

of eluate with 0.1NHCl, and proceed as in D, beginning "Pipet in 3 mL 1M NaOH . . .".

F. Calculations

Plot of I (measured by meter deflection or recorder response and corrected for blank)

against g histamine/5 mL test solution should be straight line passing through origin

with slope = m = [(Ia /1.5) + Ib + 2Ic ]/3.

mg Histamine/100 g fish = (10)(F)(1/m)(Is)

g Histamine/g fish = 10 (mg histamine/100 g fish)

where Is, Ia, Ib, and Ic = fluorescence from test sample, 1.5, 1.0, and 0.5 g histamine

standards, respectively; and F = dilution factor = (mL eluate + mL 0.1M HCl)/mL

eluate. F = 1 for undiluted eluate.

If calibration plot is not linear, use standard curve directly for quantitation. Each

subdivision on abscissa should be 0.1 g histamine/5 mLtest solution. Read all values

from curve to nearest 0.05 g histamine/5 mL test solution.

mg Histamine/100 g fish = (10)(F)(W)

g Histamine/g fish = 10 (mg histamine/100 g fish)

where W = g histamine/5 mL test solution as determined from standard curve.

Reference:

JAOAC 60, 1125, 1131(1977).

CAS-51-45-6 (histamine)

Revised: March 1999

Table 977.13B: Interlaboratory study results for determination of histamine in

canned tuna and frozen mahimahi by fluorometric method (generated for modified

method using 75% (v/v) methanol)a

Table 977.13C: Recovery of histamine added to canned tuna (generated for

modified method using 75% methanol)a




Documents

đồ áN cá ngừ đóng hộp