Sabrina FrusconiSOD Diagnostica Genetica

AOU Careggi Firenze

frusconis@aou-careggi.toscana.it

DNA fetale su sangue materno

Determinazione non invasiva del sesso genetico fetale

Determinazione non invasiva dell’ RhD fetale

Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

DNA fetale su sangue materno

DNA libero circolante nel plasma materno• DNA libero circolante: DNA materno + DNA fetale

• Origine: apoptosi del citotrofoblasto

• Frammentato (143 bp in media)

• Presente a partire dalla 5a settimana di gravidanza

• La quantità di cffDNA aumenta con l’età gestazionale

• Il DNA di origine fetale è in percentuale variabile : 5-15% del DNA circolante totale (10-20° settimana di gestazione)

Caratteristiche cffDNA Vantaggi

Presente nel plasma materno precocemente (4-5 sett)

(Lo YM et al 1998)

Diagnosi precoce

Rapida clearance dopo il parto(Lo YM et al 1999)

Gravidanza-specifico

Rappresentativo del genoma fetale totale (Lo Y et al 2010)

Analisi di qualsiasi regione genomica fetale

DNA libero circolante nel plasma materno

“Ricerca di DNA fetale circolante nel plasma materno: prospettive per la diagnosi non invasiva di Sindrome di Down (trisomia 21), Sindrome di Edwards (trisomia 18),

Sindrome di Patau (trisomia 13)”

SOD Diagnostica GeneticaAOUC Careggi, Firenze

Dr.ssa F. Torricelli

Centro Unico Diagnosi PrenataleOspedale Palagi, Firenze

Dr. E. Periti

2300 2300 casicasi reclutatireclutati da da SettembreSettembre 20122012

Criteri di arruolamentoEtà > 18 anniGravidanza singolaStoria clinica negativa per malattia oncologica pregressa o in atto

Ospedale Misericordia Dr. E. Colosi

Progetto

Follow-up

- QF-PCR/cariotipo

- alla nascita

Università di Napoli Federico IIMedicina Molecolare e Biotecnologie Mediche

Dr.ssa A. Conti

Determinazione non invasiva del sesso genetico fetale

Determinazione non invasiva dell’ RhDfetale

Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

DNA fetale su sangue materno

AmplificazioneSRY

AmplificazioneDYS14

MASCHIO + +

FEMMINA- -

DNA fetale scarso?

Utilizzo di marcatori indipendenti dal sesso fetale per confermare la presenza di DNA fetale (RASSF1A)

Determinazione precoce e non invasiva del sesso genetico fetale

DYS14(multicopia)

SRY

DYS14 array1) SRY (Yp11.3) 2) DYS14 (Yp11.2)

GENE MULTICOPIA (n copie: 11-78), PER RIDURRE LA POSSIBILITÀ DI FALSI NEGATIVI

RICERCA RICERCA DIDI CONTROLLI INTERNI PER IL DNA FETALECONTROLLI INTERNI PER IL DNA FETALE

v Distinzione del DNA fetale da quello materno sfruttando il diverso pattern di metilazione di specifici geni à GENE RASSF1A

In assenza di un controllo interno specifico per il DNA fetale (indicatore della presenza del DNA fetale) non si può avere la certezza assoluta dell’accuratezza del risultato qualora tutti i marcatori in esame risultino negativi nell’amplificazione.

3,4% falsi negativi1,2% falsi positivi

BMC Research Nores 2012, 5:476

Non-invasive prenatal diagnostic test accuracy for fetal sex using cell-free DNA a review and meta-analysisCaroline F. Wright, Yinghui Wei, Julian PT Higgins and Gurdeep S. Sagoo

Results: Ninety studies, incorporating 9,965 pregnancies and Overall mean sensitivity was 96.6% and mean specificity was 98.9%.These results vary very little with trimester or week of testing, indicating that the performance of the test is reliably high.

ACCURATO DOPO LA 7a SETTIMANA DI GRAVIDANZA

La determinazione precoce non invasiva del sesso genetico fetale si è rivelata una metodica con una sensibilità del 99.8%

Gravidanze a rischio per malattie genetiche X-linked

Utilità clinica: evitare il ricorso alla diagnosi prenatale invasiva in caso di fetofemmina

Gravidanze a rischio per disordini della differenziazione sessuale

Utilità clinica: trattamenti farmacologici precoci

Sebbene il test sia molto accurato, sarà comunque necessario confermare il sessofetale mediante ecografia nel secondo trimestre.

La coppia dovrà inoltre essere informata sulla possibilità di dover ripetere ilprelievo in caso di risultato dubbio o di cffDNA non sufficiente.

Il DNA fetale circolante

Determinazione non invasiva del sesso genetico fetale

Determinazione non invasiva dell’ RhDfetale

Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

DNA fetale su sangue materno

Gli antigeni del sistema Rh sono codificati da due geni

RHCE che codifica per gli antigeni C, c , E, e

RHD che codifica per l’antigene D

L’antigene D è il più immunogeno

in grado di provocare una reazione immunitaria agendo come antigene

Determinazione non invasiva del fattore RH fetale

Rh+

Rh-

PrimaPrima gravidanzagravidanza

§ Parto§ Aborto§ Gravidanza ectopica§ Indagini invasive di

diagnosi prenatale§ Traumi addominali

Passaggio di sangue fetale nel circolo materno Formazione di anticorpi (IgM) anti-RhDMadre Rh- e feto Rh+

Anticorpi anti-RhD

Rh-

Rh+

Alloimmunizzazione materno-fetale

GravidanzeGravidanze successivesuccessive

Passaggio transplacentare di anticorpi (IgG) anti-Rh(D) da madre a fetoDistruzione dei globuli rossi fetali

Anemia fetale

Idrope

Morte intrauterina

Anemia

Ittero

Danno neurologico

Malattia emolitica fetale e Malattia emolitica fetale e neonataleneonatale

Determinazione non invasiva del fattore RH fetaleSe una donna RhD negativo è immunizzata con anticorpi anti-D la determinazione prenatale del fattore RhD fetale può stabilire se il

feto sia a rischio di MEN

Immunoprofilassi anti-D prenatale a tutte le donne Rh negative non sensibilizzate (III

trimestre di gravidanza) + immunoprofilassi post-partum

§ Riduzione dell’incidenza di alloimmunizzazione anti-D allo 0.2-0.3% nelle donne Rh negative

40% delle donne Rh negative ricevono un’immunoprofilassi non necessaria

ü Rischio di trasmissione di infezioni virali (agenti virali noti o sconosciuti)

ü Rischio di reazioni allergiche o di tipo anafilattico

ü Spreco di dosi preziose di farmaco

ü Costi aggiuntivi

Immunoprofilassi anti-D post-partum

Riduzione dell’incidenza di alloimmunizazione anti-D dal 16% al 1-2% nelle donne Rh negative

Determinazione non invasiva del fattore RH fetalenelle donne Rh negativo

SRYamplificato

SRY nessun segnale di

amplificazione

RHDamplificato

FETO RH+♂

FETO RH+♀

RHD nessun segnale di

amplificazione

FETO RH -♂

FETO RH -♀

Determinazione non invasiva del fattore RH fetale

DNA fetale scarso?

Utilità clinica

Limitare il ricorso all’immunoprofilassi

Ridurre l’utilizzo di immunoglobuline anti-D

Somministrare immunoglobuline anti-D dopo eventi sensibilizzanti solo se il

feto risulta RhD +

Possibilità di offrire un’immunoprofilassi prenatale solo nel caso in cui il feto

risulti RhD +

Selezionare le gravidanze che necessitano di uno stretto monitoraggio

Determinazione non invasiva dell’Rh fetale

Introduzione

Determinazione non invasiva del sesso genetico fetale

Determinazione non invasiva dell’ RhDfetale

Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

DNA fetale su sangue materno

“Ricerca di DNA fetale circolante nel plasma materno: prospettive per la diagnosi non invasiva di Sindrome di Down (trisomia 21), Sindrome di Edwards (trisomia 18),

Sindrome di Patau (trisomia 13)”SOD Diagnostica Genetica

AOUC Careggi, FirenzeDr.ssa F. Torricelli

Centro Unico Diagnosi PrenataleOspedale Palagi, Firenze

Dr. E. Periti

2300 2300 casicasi reclutatireclutati da da SettembreSettembre 20122012

Ospedale Misericordia Dr. E. Colosi

Progetto

Università di Napoli Federico IIMedicina Molecolare e Biotecnologie Mediche

Dr.ssa A. Conti

La Regione Toscana ha recentemente finanziato il progetto “Ottimizzazione e validazione di un test di screening per la diagnosi

prenatale non invasiva delle aneuploidie cromosomiche”

Delibera n. 932 del 11/11/2013

Aspetti tecniciCVS o LA DNA fetale libero circolante

NGS e test prenatali non invasivi

E’ quindi necessaria una

metodica in grado di evidenziare variazioni molto piccole di DNA

Le nuove tecnologie di sequenziamento consentono di ottenere grandi quantità di dati di sequenza in un singolo esperimento

NGS e test prenatali non invasivi

Questo approccio consente di identificare le aneuploidie più frequenti sequenziando, mappando e contando le molecole di

DNA per evidenziare «variazioni nel numero di copie» di uno specifico cromosoma, a partire da DNA totale circolante nel plasma

materno

Isolamento da plasmadel DNA totale circolante▲ cff DNA

Maternal DNA

NGS e test prenatali non invasivi

• Counting: Per ogni cromosoma vengono contate le reads che mappano sul quel cromosoma (count)

• Normalizzazione: I valori di count ottenuti per ciascun cromosoma vengono normalizzati per contenuto in GC e dimensioni della libreria ( n° di reads ottenute per ciascun campione)

• Analisi statistica: calcolo dello Z-score

• Z-score tra -3 and +3 : euploide• Z score >3 : trisomia• Z score <-3: monosomia

• Allineamento : le molecole di DNA sequenziate (reads) vengono allineate al genoma di riferimento

Z-score(chr21) SD ref dataset chr21

=# medio di reads chr21 – # medio di reads ref dataset chr21

NGS e test prenatali non invasivi

Zscore = 3 Paneuploidia= 0.999

Il valore predittivo positivo dipende dalla Sensibilità e dallaSpecificità del test: in particolare, esso aumenta con l'aumentare diquesti due parametri.

NIPT: PPV e NPV

PPV = (Sensibilità x prevalenza)

((Sensibilità x prevalenza)+(1-specificità)x(1-prevalenza))

Specificità x (1-prevalenza)

((1-sensibilità) x prevalenza + specificitàx(1-prevalenza))NPV =

É però importante sottolineare che ilvalore predittivo positivo dipendeanche da un fattore indipendente daltest: la prevalenza della malattianella popolazione sottoposta a

screening.

PPV e

NPV

E’ un test di screening e non un test diagnostico e non può sostituire il test combinato

Non valuta la presenza/assenza di una condizione genetica, ma fornisce una valutazione del RISCHIO per le aneuploidie oggetto dell’indagine

E’ sempre necessario confermare un risultato positivo/alto rischio con DP invasiva

Deve essere offerta in un contesto di una consulenza pre e post-test

Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

OBIETTIVO COMUNE

RIDURRE IL RICORSO ALLE TECNICHE INVASIVESELEZIONANDO PIU’ ACCURATAMENTE LE DONNE A

RISCHIO

Conclusioni

RECLUTAMENTO PAZIENTI E FOLLOW UP

Centro Unico Diagnosi Prenatale Ospedale PalagiDr E. Periti

Ospedale Misericordia Grosseto Dr E. Colosi

Università di Napoli Federico IIDipartimento di Medicina Molecolare

e Biotecnologie MedicheDr.ssa A. Conti

SOD DIAGNOSTICA GENETICA Dr.ssa F. Torricelli

WET LABSabrina Frusconi

Francesca GerundinoClaudia GiachiniFrancesca Marin

Giuseppina MarsegliaElisabetta PeloChiara Pescucci

Fiammetta SberniniDRY LAB

Matteo BenelliElisa Contini