Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno–matematički fakultet
Biološki odsjek
Jakob Ćosić
DNA barkodiranje kao metoda u taksonomskoj identifikaciji biljnih i
ţivotinjskih vrsta
Diplomski rad
Zagreb, 2014.
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno–matematički fakultet
Biološki odsjek
Jakob Ćosić
DNA barkodiranje kao metoda u taksonomskoj identifikaciji biljnih i
ţivotinjskih vrsta
Diplomski rad
Zagreb, 2014.
«Ovaj rad, izrađen u Zoologijskom zavodu Biološkog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog
fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom doc. dr. sc. Damjana Franjevića predan je
na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
radi stjecanja zvanja magistar eksperimentalne biologije»
Zahvalio bih doc. dr. sc. Damjanu Franjeviću na iznimnom strpljenju, vođenju i pomoći
tijekom izrade rada, mr. sc. Nives Rajević na ustupljenim početnicama, izv. prof. dr. sc.
Zlatku Liberu na ustupljenom uređaju za usitnjavanje tkiva te prof. dr. sc. Marijanu
Grubešiću i dr.sc. Kristijanu Tomljanoviću sa Šumarskog fakulteta na ustupljenim uzorcima
tkiva divokoza.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek Diplomski rad
DNA BARKODIRANJE KAO METODA U TAKSONOMSKOJ IDENTIFIKACIJI BILJNIH I
ŢIVOTINJSKIH VRSTA
Jakob Ćosić
Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb
DNA barkodiranje je novo predloţena metoda molekularne taksonomije koja korištenjem
kratkih univerzalnih sekvenci koje su dovoljno različite kod svih organizama od interesa
omogućava brzu i preciznu identifikaciju biološkog materijala. U ovom radu sam istraţio
uspješnost DNA barkodiranja kao taksonomske metode za identifikaciju biljnih i ţivotinjskih
vrsta te barkodirao devet autohtonih hrvatskih biljnih vrsta i divokozu Rupicapra rupicapra
L. (Bovidae) te na osnovi dobivenih barkodova rekonstruirao filogenetski odnos populacija
divokoze iz Hrvatske. Na kraju sam se dotakao i problema s kojima se ova metoda
suočava, najčešće u vidu malih razlika među barkodovima raziličitih vrsta, problematičnog
barkodiranja biljaka zbog spore evolucije plastidnog genoma i izolacije biljnih gena i
problema pri određivanju ţivotinjskih vrsta zbog specifičnog načina evolucije ţivotinjskog
mitohondrijskog genoma te prijedloga za njezino poboljšanje.
(50 stranica, 15 slika, 15 tablica, 56 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)
Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjiţnici
Ključne riječi: molekularna taksonomija, matK, rbcL, COI, divokoza
Voditelj: doc.dr.sc. Damjan Franjević
Ocjenitelji: doc. dr. sc. Damjan Franjević, izv. prof. dr. sc. Antun Alegro, izv. prof. dr. sc.
Domagoj Đikić
Zamjena: doc. dr. sc. Petra Korać
Rad prihvaćen: 6. studenog 2014.
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb
Faculty of Science
Division of Biology Graduation Thesis
DNA BARCODING AS A METHOD IN TAXONOMICAL IDENTIFICATION OF PLANT AND
ANIMAL SPECIES
Jakob Ćosić
Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb, Croatia
DNA barcoding is a newly proposed method of molecular taxonomy, which by the usage of
short, universal sequences that are divergent enough in all organisms of interest, allows
fast and precise identification of biological material. In this paper, I examined the fidelity of
DNA barcoding as a taxonomic method for identification of plant and animal species. I also
barcoded nine autochthonous Croatian plant species and chamois Rupicapra rupicapra L.
(Bovidae), and conducted analysis of phylogenetic relations of chamois populations from
Croatia based on collected barcode sequences. In the end, I considered the problems
concerning the method, as well as suggestions for its improvement. Considered problems
are mostly small differences between barcodes of different organisms, problematic
barcoding of plants due to slow evolution of plastid genome and isolation of plant genes
and problematic determination of animals due to specific evolution of animal mitochondrial
genome.
(50 pages, 15 figures, 15 tables, 56 references, original in: croatian)
Thesis deposited in the Central Biological Library
Key words: molecular taxonomy, matK, rbcL, COI, chamois
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Damjan Franjević
Reviewers: Asst. Prof. Dr. Damjan Franjević, Assoc. Prof. Dr. Antun Alegro, Assoc. Prof.
Dr. Domagoj Đikić
Substitution: Asst. Prof. Dr. Petra Korać
Thesis accepted: November 6, 2014.
Sadržaj
1. Uvod ............................................................................................................................... 9
1.1. Biljne vrste obuhvaćene istraţivanjem ................................................................... 14
1.2. Ţivotinjske vrste obuhvaćene istraţivanjem i njihova taksonomska problematika... 16
2. Ciljevi istraţivanja ......................................................................................................... 18
3. Materijali i metode ........................................................................................................ 19
3.1. Materijali ................................................................................................................ 19
3.1.1. Uzorci .............................................................................................................. 19
3.1.2. Kemikalije ........................................................................................................ 20
3.1.3. Početnice......................................................................................................... 21
3.1.4. Pribor ............................................................................................................... 22
3.1.5. Računalni programi ......................................................................................... 22
3.2. Metode ................................................................................................................... 23
3.2.1. Metoda izolacije i umnaţanja biljne DNA ......................................................... 23
3.2.2. Metoda izolacije i umnaţanja ţivotinjske DNA ................................................. 25
3.2.3. Računalne metode .......................................................................................... 27
4. Rezultati ....................................................................................................................... 28
4.1. Sravnjene sekvence ............................................................................................... 28
4.2. Rezultati BLAST analize ........................................................................................ 30
4.3. Rezultati analize filogenije COI sekvenci ................................................................ 34
4.4. Barkodovi uzoraka ................................................................................................. 39
5. Rasprava ...................................................................................................................... 40
6. Zaključak ...................................................................................................................... 43
7. Literatura ...................................................................................................................... 44
7.1. Internetske reference ............................................................................................. 49
8. Popis priloga................................................................................................................. 50
9
1. Uvod
DNA barkodiranje je novo predloţena metoda molekularne taksonomije kojom se
prethodno odabranim sekvencama i standardiziranim postupcima pokušava klasificirati
raznolikost ţivota. Povećanjem broja poznatih ţivućih vrsta postalo je potrebno na
jednostavan način ih razlikovati i klasificirati. Hebert i sur. (2003, 2003a) su predloţili
sistem DNA barkodiranja ţivotinja zasnovan na molekularnoj raznolikosti mitohondrijskog
gena za podjedinicu I citokrom c oksidaze (COI). Ideja molekularne taksonomije se temelji
na razlikama u kratkim genetičkim markerima koji su zajednički svim ţivim bićima, a DNA
barkodiranje se od ostalih takvih prijedloga razlikuje pozivanjem na standardizirane
markere i metode kao i samom količinom podataka (Moritz i Cicero, 2004). Molekularni
pristup određivanju svojti koristi raznolikost DNA sekvenci, koje se moţe promatrati kao
molekularne taksonomske jedinice ugrađene u svaku stanicu. Snaga molekularne
taksonomije prema tome leţi u mogućnosti određivanja vrste iz vrlo male količine tkiva
koja bi bila nedostatna za morfološku determinaciju. Njenom primjenom se zaobilaze i
ostale poteškoće s morfološkim određivanjem vrsta čija su glavna ograničenja: 1)
fenotipska plastičnost i genetička varijabilnost mogu rezultirati netočnom determinacijom;
2) teško određivanje morfološki kriptičnih svojti; 3) morfološki ključevi su upotrebljivi samo
za određeni spol ili ţivotni stadij jedinke i 4) upotreba ključeva zahtjeva visoku razinu
stručnosti što često rezultira krivom determinacijom (Hebert, 2003a).
Metoda zahtjeva postojanje jedinstvenog kodirajućeg ili nekodirajućeg
standardiziranog lokusa u svim organizmima od interesa, dovoljno kratkog za brzo rutinsko
sekvenciranje koji se kod velikog broja različitih svojti moţe umnoţiti jedinstvenim
početnicama i koji ima dovoljno visoku stopu molekularne evolucije za jednostavno i
jedinstveno razlikovanje vrsta. Idealan DNA barkod bi rutinski trebalo moći izolirati
univerzalnim parom početnica, sekvencirati iz bilo kojeg smjera te bi trebao imati
maksimalnu moć diskriminacije među različitim vrstama (CBOL Plant Working Group,
2009). Uz to, da bi DNA barkodiranje bilo uspješno mora proteći dovoljno vremena od
specijacije da bi mutacije i genetički drift fiksirali nove alele u populaciji, odvojene od
ostalih vrsta (Hollingsworth, 2011).
Za barkodiranje ţivotinja se koriste isključivo mitohondrijski geni zbog brze stope
molekularne evolucije mitohondrijskog genoma što omogućava razlikovanje blisko srodnih
ţivotinjskih vrsta iz svih koljena osim Cnidaria (Hebert, 2003). Selekcija osobito jako
10
djeluje na proteinske produkte mitohondrijskog genoma optimizirajući njihove interakcije s
proteinskim produktima jezgrinog genoma koji su puno konzervativniji. Uz to,
mitohondrijski genom ţivotinja je bolji kandidat za analizu od jezgrinog genoma zbog toga
što nema introne, rekombinacije su jako rijetke i nasljeđuje se samo od jednog roditelja.
Robusne početnice također omogućuju rutinsku izolaciju ţeljenih dijelova mitohondrijskog
genoma. Trinaest mitohondrijskih gena koji kodiraju proteine su dobri kandidati za
taksonomske analize i zbog rijetkih insercija i delecija koje najčešće rezultiraju
pomicanjem okvira čitanja (slika 1).
Slika 1: Mitohondrijski genom sisavca. Trinaest gena koji kodiraju proteine su označeni narančasto, dva
gena za ribosomalnu RNA ţuto, a dvadeset i dva gena za transportnu RNA zeleno. Ruţičasto su označene
D-petlja i kontrolna regija (Preuzeto iz Park, 2011).
COI sekvenca je jedini barkod sluţbeno priznat od strane američkog National
Center for Biotechnology Information (NCBI), a kao standard za barkodiranje ţivotinja se
koristi "Folmerova regija", minimalno 500 parova baza (pb) duga sekvenca 5' kraja COI
gena (slika 2).
11
Slika 2: COI gen i fragmenti umnoţeni različitim parovima početnica. Folmerova regija je označena ţuto
(Preuzeto iz McKeon, 2010).
Podjedinica I citokrom c oksidaze je podjedinica kompleksa IV, posljednjeg
kompleksa lanca prijenosa elektrona u oksidacijskoj fosforilaciji koji prenosi elektrone s
citokroma c na molekularni kisik pri čemu nastaje voda. Uspjeh u određivanju vrsta
povezan je s velikom brzinom promjene COI sekvence kod velike većine ţivotinjskih svojti
i ograničenjima u divergenciji mitohondrijske DNA. Iako ne postoji razlog za a priori odabir
određenog gena, gen za podjedinicu I citokrom c oksidaze ima dvije vaţne prednosti: 1)
univerzalne početnice omogućuju izolaciju 5' kraja COI gena iz svih ţivotinjskih koljena
osim Cnidaria i 2) COI pokazuje veći filogenetski signal od drugih mitohondrijskih gena.
Ţivotinjske vrste istog roda često imaju vrlo različite sekvence COI gena, a njegova
evolucija je dovoljno brza ne samo za određivanje srodnih vrsta već i filogeografskih grupa
jedne vrste. Divergencija COI sekvenci među pripadnicima iste vrste je najčešće manja od
2 % pa se zato COI moţe koristiti za vrlo točnu determinaciju (Hebert, 2003). Zbog vrlo
rijetkog pojavljivanja insercija i delecija poravnavanje COI sekvenci je također
jednostavno. Uz to, konvergencija molekularnih osobina i horizontalni prijenos gena
nemaju velik utjecaj na sposobnost determinacije COI sekvencom (Hebert, 2003a).
Sekvenca podjedinice I citokrom c oksidaze koja se koristi kao ţivotinjski barkod
nije prikladna za barkodiranje biljaka zbog puno sporije evolucije biljnog mitohondrijskog
genoma i komplicirane izolacije biljnih mitohondrijskih gena (Kress, 2005). Zbog toga
jedinstveni lokus ne ispunjava zahtjeve za barkodiranje pa se zato koristi kombinacija više
njih. Na temelju procjene lakoće izolacije, kvalitete sekvenci i razine divergencije među
vrstama kao univerzalni biljni barkod predloţena je kombinacija gena za veliku podjedinicu
ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze oksigenaze (rbcL), enzima Calvinovog ciklusa koji
katalizira karboksilaciju ribuloza-1,5-bisfosfata u 3-fosfoglicerat i maturazu K (matK),
12
enzima kodiranog trnK prokariotskim intronom skupine II koji izrezuje introne skupine II iz
primarnog RNA transkripta, uz upotrebu dodatnih sekvenci ako je to potrebno (slika 3)
(Zoschke, 2010; Hausner, 2006).
Slika 3: Plastidni genom vrste Arbutus unedo L. Gen rbcL je označen zeleno, a matK narančasto (Preuzeto
iz Martinez-Alberola, 2013).
rbcL i matK barkodovi su minimalno 500 pb duge sekvence 5' kraja gena. Iako nije
najvarijabilnija regija plastidnog genoma rbcL je najbolje poznati gen, ima veliku
univerzalnost i dobru moć razlučivanja, a univerzalne početnice omogućuju laku izolaciju
dvosmjernih sekvenci iz velike većine kopnenih biljaka te je često dio najboljih kombinacija
lokusa za određivanje vrsta, dok je matK regija plastidnog genoma s jednom od najvećih
stopa molekularne evolucije te pokazuje visoku razinu razlučivosti među
kritosjemenjačama, no još uvijek ne postoje univerzalne početnice za nju (CBOL Plant
Working Group, 2009).
13
Za barkodiranje ostalih ţivih organizama predloţen je gen za 18S ribosomalnu RNA
kod protista, a za gljive mitohondrijski CO1 gen (slika 4) i jezgrine ribosomalne ITS
sekvence (slika 5) (Pawlowski, 2012; Seifert, 2007, 2009).
Slika 4: Mitohondrijski genom kvasca Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen (Preuzeto s
eplantscience.com).
Slika 5: Jezgrine ITS1 i ITS2 sekvence gljiva između gena za 18S, 5.8S i 28S ribosomalnu RNA. Zeleno,
crveno i ljubičasto su označene početnice i sekvence koje umnaţaju. Crveno su označene početnice za
umnaţanje ITS regija i 5.8S rRNA gena (Preuzeto s ibwf.de).
14
U svrhu promicanja DNA barkodiranja kao globalnog standarda za identifikaciju
bioloških uzoraka 2004. godine je osnovan Konzorcij za barkodiranje ţivota (Consortium
for the Barcode of Life, CBOL). 2010. je osnovan International Barcode of Life (iBOL)
kojemu je cilj samo barkodiranje i u kojemu sudjeluje više tisuća znanstvenika iz cijeloga
svijeta što ga čini najvećim projektom kojemu je cilj proučavanje molekularne
bioraznolikosti i DNA taksonomije (Ratnasingham i Hebert, 2007). Cilj projekta iBOL je
barkodiranje 5 milijuna uzoraka i 500 tisuća vrsta do 2015. godine. Do sada je uspješno
barkodirano više od 3 milijuna uzoraka koji uključuju više od 150 tisuća vrsta Arthropoda,
25 tisuća vrsta Chordata, 50 tisuća vrsta biljaka i 10 tisuća vrsta iz manjih svojti (BOLD,
2014). Barkodovi uzoraka su pohranjeni u Barcode of Life Database (BOLD) bazi
podataka i Banci Gena (GenBank) pri National Center for Biotechnology Information
(NCBI). Glavne primjene DNA barkodiranja se vide u molekularnoj taksonomiji vrsta i
istraţivanju njihove evolucijske povijesti te u identifikaciji prethodno nepoznatih vrsta i
biološkog materijala, uključujući i fosilne ostatke.
1.1. Biljne vrste obuhvaćene istraživanjem
Biljne vrste uključene u ovo istraţivanje su tipični predstavnici mediteranske i
submediteranske vegetacije koju nalazimo na obalama Sredozemnog mora te manjim
dijelom u drugim krajevima svijeta umjerenog pojasa. U Hrvatskoj biljke mediteranske
vegetacije nalazimo u obalnim i brdskim klimazonalnim pojasevima. U Hrvatskoj obalni
mediteranski pojas obuhvaća veći dio otoka, uski priobalni pojas te juţnu Dalmaciju, a
brdski mediteranski pojas okolne planinske masive. Mediteranske biljke su prilagođene za
ţivot u uvjetima suhog i vrućeg ljeta te blage, kišovite zime i uglavnom su zimzelene, dok
submediteransku vegetaciju predstavljaju listopadne biljke prilagođene na zime sa znatno
niţim temperaturama i većom količinom padalina. Prilagodbe biljaka uključuju koţasto
lišće s voštanim slojem, dlake te jak korijenski sustav. Ekosustavi predstavnika te
vegetacije su uglavnom makije, garizi i kamenjari, dok je šumska vegetacija zbog stoljeća
krčenja rijetka (vusz.hr, 2014).
Sve biljne vrste obuhvaćene ovim istraţivanjem su kritosjemenjače (Angiospermae,
Magnoliophyta), od kojih su Ruscus aculeatus L. (Asparagaceae) – bodljikava veprina i
Smilax aspera L. (Smilacaceae) – crvena tetivika jednosupnice; Arbutus unedo L.
(Ericaceae) – planika, Hedera helix L. (Hederaceae) – bršljan, Oxalis acetosella L.
(Oxalidaceae) – šumski cecelj, Phillyrea media L. (Oleaceae) – srednja komorika, Pistacia
15
lentiscus L. (Anacardiaceae) – tršlja i Quercus ilex L. (Fagaceae) – hrast crnika prave
dvosupnice, a Laurus nobilis L. (Lauraceae) – lovor pripada magnolidnom kompleksu
primitivnih kritosjemenjača (slika 6).
Slika 6: Filogenetski odnosi kritosjemenjača prema The Angiosperm Phylogeny Group (Preuzeto iz The
Angiosperm Phylogeny Group, 2003).
16
1.2. Životinjske vrste obuhvaćene istraživanjem i njihova taksonomska
problematika
Divokoza Rupicapra rupicapra L. je jedan od velikih sisavaca s Alpsko-dinaridskog
područja koji pripada redu parnoprstaša Artiodactyla i porodici šupljoroţaca Bovidae.
Sjeverne Dinaride i Alpe naseljava isključivo alpska podvrsta R. r. rupicapra, dok se u
središnjim i juţnim Dinaridima nalazi balkanska podvrsta R. r. balcanica, koja je morfološki
veća od alpske. Na području Velebita prije 30-ak godina se pojavila manja populacija
divokoza nastala introdukcijom obje podvrste (atos.hr, 2014; hunting-croatia.net, 2014; np-
sjeverni-velebit.hr, 2014). Divokoze ţive na nadmorskim visinama višim od 1000 m, na
granici šumske vegetacije i klekovine, a tijekom zime se spuštaju u niţe predjele. Dnevne
su ţivotinje, hrane se svim vrstama planinskog bilja, a najveće prijetnje su im vuk Canis
lupus L., ris Lynx lynx L. i u Alpskim predjelima, lavine (zasticenevrste.azo.hr., 2014). U
Hrvatskoj najveće populacije se nalaze na području Velebita i Biokova. Tijekom 19.
stoljeća u Hrvatskoj je zbog krivolova gotovo potpuno izumrla. Naporima plemstva krajem
19. stoljeća i lovačkih društava nakon drugog svjetskog rata uspostavljene su stabilne
populacije, koje iako se obnavljaju i dalje pokazuju pad broja jedinki. Danas je divokoza u
Hrvatskoj zaštićena vrsta te se nalazi na Crvenom popisu zaštićenih sisavaca Hrvatske s
regionalnom kategorijom ugroţenosti niskorizična vrsta (IUCN kategorija NT) (Tvrtković i
Grubešić, 2006).
Rod Rupicapra se pojavio u zapadnoj Euroaziji s vrstama R. rupicapra i R.
pyrenaica tijekom kasnog pleistocena (Masini i Lovari, 1988). Dosadašnja rijetka
istraţivanja filogenije ovog roda su pokazala da su jedinke vrste R. rupicapra s područja
Alpa i sjevernih Dinarida grupirane u četiri mitohondrijske filogrupe: središnju, juţnu,
sjevernu i istočnu (Schaschl, 2003; Hammer, 1995) (slika 7). Iako DNA barkodiranje nije
zamišljeno kao metoda molekularne filogenije, DNA barkodovi ţivotinja se mogu pouzdano
upotrijebiti za razlučivanje filogenetskih odnosa unutar različitih populacija iste vrste.
17
Slika 7: Populacije roda Rupicapra u Europi i zapadnoj Aziji. Bojama su predstavljene populacije različitih
podvrsta vrsta R. rupicapra i R. pyrenaica. Podvrste R. r. rupicapra i R. r. balcanica koje nalazimo u
Republici Hrvatskoj predstavljene su crvenom i sivom bojom (Preuzeto iz Pérez, 2011).
18
2. Ciljevi istraživanja
Ciljevi ovoga istraţivanja su bili:
1) Upotrijebiti metodu DNA barkodiranja za identifikaciju nekih autohtonih hrvatskih
biljnih vrsta te pomoću barkodova za populacije divokoza s područja Republike
Hrvatske ustanoviti njihov filogenetski odnos.
2) Dobivene sekvence barkodova unijeti u BOLD baza podataka iBOL-a i u Banku
Gena, što predstavlja prvi unos barkodova vrsta iz Republike Hrvatske u
međunarodnu bazu podataka barkodiranih vrsta.
19
3. Materijali i metode
3.1. Materijali
3.1.1. Uzorci
Istraţivanje sam napravio s 9 hrvatskih autohtonih biljnih vrsta: Arbutus unedo L.
(Ericaceae) – planika, Hedera helix L. (Hederaceae) – bršljan, Laurus nobilis L.
(Lauraceae) – lovor, Oxalis acetosella L. (Oxalidaceae) – šumski cecelj, Phillyrea media L.
(Oleaceae) – srednja komorika, Pistacia lentiscus L. (Anacardiaceae) – tršlja, Quercus ilex
L. (Fagaceae) – hrast crnika, Ruscus aculeatus L. (Asparagaceae) – bodljikava veprina i
Smilax aspera L. (Smilacaceae) – crvena tetivika te 11 uzoraka divokoze Rupicapra sp. L.
(Bovidae). Svi biljni uzorci su prikupljeni na području grada Rovinja (45°05'03"N,
13°37'50"E) tijekom 2013. godine. Ţivotinjski uzorci su prikupljeni na raznim lokalitetima na
području Sjevernog Velebita (44°44'45"N, 14°57'30"E), Biokova (43°23'03"N, 17°04'10"E) i
rijeke Kupe krajem 2013. i početkom 2014. godine (tablica 1). Biljni uzorci su bili
pohranjeni u silikagelu u hladnjaku, a ţivotinjski u 96 % etanolu u hladnjaku.
Tablica 1: Lokacije prikupljanja ţivotinjskih uzoraka i spol jedinki uključenih u analizu.
Uzorak Lokacija Spol
1_Rupicapra S. Velebit Muţjak
2_Rupicapra S. Velebit Muţjak
3_Rupicapra S. Velebit Muţjak
4_Rupicapra S. Velebit Ţenka
5_Rupicapra S. Velebit Muţjak
6_Rupicapra S. Velebit Muţjak
7_Rupicapra S. Velebit Muţjak
8_Rupicapra S. Velebit Ţenka
9_Rupicapra S. Velebit Muţjak
10_Rupicapra Biokovo Muţjak
11_Rupicapra Kupa Muţjak
20
3.1.2. Kemikalije
1. Etidij-bromid (3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinijev bromid) (Sigma-Aldrich)
2. Agaroza (Sigma-Aldrich)
3. 96 % Etanol (Kemika)
4. Izopropanol (propan-2-ol) (Kemika)
5. Pufer TE 1x (10 mM 2-amino-2-hidroskimetilpropan-1,3-diol i 1 mM
etilendiamintetraoctena kiselina)
6. Komercijalni puferi proizvođača Qiagen: AE, AL, ATL, AP1, AP2, AP3/E, AW,
AW1, AW2, EB, PB, PE, QG
7. Proteinaza K (Qiagen)
8. RNaza A (Qiagen)
9. CoralLoad Concentrate, 10x (Qiagen)
10. GelPilot 100bp Plus Ladder (Qiagen)
11. GelPilot DNA Loading Dye 5x (Qiagen)
12. HotStarTaq Plus Master Mix 2x (Qiagen)
13. RNase Free Water (Qiagen)
21
3.1.3. Početnice
U tablici 2 prikazani su slijedovi nukleotida početnica, duljine početnica, udio CpG
mjesta, temperature mekšanja i njihove relativne molekulske mase. Sve sekvence su
prikazane od 5' prema 3' kraju. Proizvođač svih početnica je tvrtka Macrogen iz
Amsterdama.
Tablica 2: Karakteristike početnica korištenih u ovom radu. CpG = postotak CpG mjesta, Tm = temperatura
mekšanja, Mr = relativna molekulska masa.
Početnica Sekvenca Duljina / pb CpG / % Tm / °C Mr
rbcLa-F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC 26 42.31 64.7 7950.2
rbcLa-R ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC 20 45.0 56.4 6087.0
matK-KIM1R CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 27 48.15 68.3 8210.4
matK-KIM3F ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC 25 40.0 62.5 7678.0
LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 25 32.0 59.2 7722.1
HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 26 35.0 62.0 7980.3
22
3.1.4. Pribor
1. BioRad MyCycler termocycler
2. BioRad PowerPac Basic uređaj za elektroforezu
3. BioRad Wide Mini-Sub Cell GT i Mini-Sub Cell kadice za elektroforezu
4. BioRad C1301-230V mikrocentrifuga
5. BioRad transiluminator
6. Qiagen - Retsch TissueLyser MM300 uređaj za usitnjavanje tkiva
7. Qiagen DNeasy Mini spin kolone
8. Qiagen MinElute kolone
9. Eppendorf 5424 mikrocentrifuga
10. Eppendorf Research 10, 200 i 1000 μL mikropipete
11. Eppendorf SAFELOCK mikroepruvete 1.5 mL i 2 mL
12. Eppendorf PCR mikroepruvete 0.5 mL
13. Eppendorf epT.I.P.S. nastavci za mikropipete 10, 200 i 500 μL
14. Mettler Toledo AB54-3 analitička vaga
15. Pechiney Parafilm M
16. Rezač parafilma
17. Shel Lab vodena kupelj
18. Bibby Stuart Vortex Mixer SA7
19. Fotoaparat Olympus Camedia C-4000 Zoom
20. Računalo Intel Pentium (R) Core (TM) i5-3330 3.2GHz s 8 GB RAM-a
3.1.5. Računalni programi
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) verzija 6.0 (Tamura, 2013)
Clustal X2 verzija 2.1 (Larkin, 2007)
BioEdit verzija 7.2.5 (Hall, 1999)
Cam2Com verzija 4.1.1.41. (2007)
23
3.2. Metode
3.2.1. Metoda izolacije i umnažanja biljne DNA
Prije izolacije biljne DNA 25 do 35 mg liofiliziranog biljnog tkiva je usitnjeno u
uređaju za usitnjavanje tkiva. Ukupna biljna stanična DNA je izolirana Qiagen DNeasy
Plant Mini Kit (50) kompletom prema Qiagen DNeasy Plant Handbook protokolu (Qiagen,
2006). Provjera izolacije DNA je napravljena elektroforezom na 1 % agoroznom gelu
pripremljenom u 1x TE puferu na 120 V u trajanju od 15 min. Gel je nakon elektroforeze
natopljen etidij-bromidom te promatran na transiluminatoru i fotografiran aparatom
povezanim s osobnim računalom s programom Cam2Com (slika 8).
Slika 8: Provjera izolacije biljne stanične DNA elektroforezom. LN = L. nobilis, QI = Q. ilex, OA = O.
acetosella, AU = A. unedo, HH = H. helix, PL = P. lentiscus, RA = R. aculeatus, SA = S. aspera, PM = P.
media.
Odabrane sekvence, rbcL i matK, su umnoţene koristeći Qiagen HotStarTaq Plus
Master Mix Kit komplet lančanom reakcijom polimerazom (PCR) u BioRad MyCycler
termocyleru u reakcijama od 25 μL (tablica 3) prema modificiranom Qiagen HotStarTaq
Plus PCR Handbook protokolu (tablica 4)(Qiagen, 2008a).
24
Tablica 3: Sastav 25 μL PCR reakcija za umnažanje biljnih gena.
Sastojak V / μL
HotStar Taq Plus MasterMix 10
Početnica 1 1
Početnica 2 1
DNA uzorka 1
CoralLoad Concentrate, 10x 2
RNase Free Water 10
Tablica 4: Protokol za umnaţanje biljne DNA metodom PCR. PD = preddenaturacija, D = denaturacija, A =
vezanje početnica, S = sinteza DNA, F = završna faza.
PD D A S F
95°C, 5min 94°C, 30s 53°C, 40s 72°C, 40s 72°C, 10min
35 ciklusa
Za umnaţanje rbcL sekvenci su korištene početnice rbcLa-F i rbcLa-R, a za matK
sekvence početnice matK-KIM1R i matK-KIM3F (Fazekas, 2012). Provjera umnaţanja je
napravljena elektroforezom na 1 % agaroznom gelu pripremljenom u 1x TE puferu na 120
V, u trajanju od 15 min (slika 9).
Slika 9: Elektroforeza produkata PCR reakcija umnaţanja biljnih gena. rbcL pokazuje umnaţanje u području
~600 pb, a matK u području ~800 pb. LN = L. nobilis, QI = Q.ilex, OA = O. acetosella, AU = A. unedo, HH =
H. helix, PL = P. lentiscus, RA = R. aculeatus, SA = S. aspera, PM = P. media, S = GelPilot 100bp Plus
Ladder.
Umnoţena DNA je pročišćena Qiagen MinElute Reaction Cleanup Kit kompletom
prema Qiagen MinElute Handbook protokolu (Qiagen, 2008). Pročišćeni uzorci su zajedno
s početnicama poslani u servis za sekvenciranje Macrogen u Amsterdamu.
25
3.2.2. Metoda izolacije i umnažanja životinjske DNA
Ukupna ţivotinjska stanična DNA je izolirana iz jetre 11 jedinki vrste R. rupicapra.
Za izolaciju je 10 do 15 mg u 96 % etanolu konzerviranog ţivotinjskog tkiva otopljeno u
vodenoj kupelji na 56 °C, 24 h pomoću Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit kompleta
prema Qiagen Blood & Tissue Handbook protokolu. Nakon otapanja ukupna stanična DNA
je izolirana Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit kompletom prema Qiagen Blood & Tissue
Handbook protokolu (Qiagen, 2006a). Provjera izolacije ukupne stanične DNA je
napravljena elektroforezom na 1 % agaroznom gelu pripremljenom u 1x TE puferu na 120
V, u trajanju od 15 min, koji je nakon elektroforeze natopljen etidij-bromidom te fotografiran
na transiluminatoru (slika 10).
Slika 10: Provjera izolacije ţivotinjske stanične DNA elektroforezom. Uzorci su označeni brojevima.
COI sekvenca je umnoţena koristeći Qiagen HotStarTaq Plus Master Mix Kit
komplet PCR reakcijama u 20 μL (tablica 5) u BioRad MyCycler termocyleru prema
modificiranom Qiagen HotStarTaq Plus PCR Handbook protokolu (tablica 6)(Qiagen,
2008a).
26
Tablica 5: Sastav 20 μL PCR reakcija za umnaţanje COI gena.
Sastojak V / μL
HotStar Taq Plus MasterMix 10
Početnica 1 1
Početnica 2 1
DNA uzorka 2
CoralLoad Concentrate, 10x 2
RNase Free Water 4
Tablica 6: Protokol za umnaţanje ţivotinjske DNA metodom PCR. PD = preddenaturacija, D = denaturacija,
A = vezanje početnica, S = sinteza DNA, F = završna faza.
PD D A S F
95°C, 5min 94°C, 40s 48°C, 40s 72°C, 1min 72°C, 10min
35 ciklusa
Provjera umnaţanja je napravljena elektroforezom na 1 % agaroznom gelu
pripremljenom u 1x TE puferu na 120 V, u trajanju od 15 min (slika 11). Za umnaţanje COI
gena korištene su početnice LCO1490 i HCO2198 (Folmer, 1994).
Slika 11: Elektroforeza produkata PCR reakcija umnaţanja ţivotinjskih gena. Uzorci su označeni brojevima.
S = GelPilot 100bp Plus Ladder.
Umnoţena DNA je pročišćena Qiagen MinElute Reaction Cleanup Kit kompletom
prema Qiagen MinElute Handbook protokolu (Qiagen, 2008). Pročišćeni uzorci su zajedno
s početnicama poslani u servis za sekvenciranje Macrogen u Amsterdamu.
27
3.2.3. Računalne metode
Nakon sekvenciranja dobivene sekvence višestruko su sravnjene programom
ClustalX2 i uređene u programu BioEdit. Sravnjivanje je potrebno kako bi se homologne
nukelotide svelo u jednu ravninu te s obzirom da svi potječu od zajedničkog pretka
omogućilo filogenetske analize. Sekvence su uspoređene s referentnim sekvencama u
Banci Gena i jedna s drugom pomoću Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) alata na
internetskoj stranici NCBI-ja. BLAST analiza uspoređuje sličnosti među primarnom
strukturom sekvenci te rezultate daje kao postotak sličnosti. Analizom tih podataka moţe
se utvrditi postojanje homologije među sekvencama. BLAST analiza također moţe
uspoređivati ţeljene sekvence s onima u Banci Gena pa se zato i koristi kao alat za njeno
pretraţivanje. U BLAST analizi korišteni su algoritmi megablast, discontinous megablast i
blastn koji se razlikuju po osjetljivosti na sličnosti među analiziranim sekvencama (Altschul,
1990; ncbi.nlm.nih.gov, 2014). Programom MEGA 6 su napravljena filogenetska stabla
temeljena na COI haplotipovima koristeći metode najveće štedljivosti (Maximum
Parsimony) sa supstitucijskim modelom Subtree Pruning and Regrafting (SPR) i najveće
vjerojatnosti (Maximum Likelihood) s modelom Generalised Time Reversible (GTR) i
metodom SPR. Metoda najveće štedljivosti analizu vrši samo s informativnim, varijabilnim
mjestima u slijedu nukleotida ili aminokiselina te generira velik broj mogućih filogenetskih
stabala. Nakon toga, po principu Ockhamove britve, algoritam odabire stablo za čiju je
topologiju potrebno najmanje evolucijskih koraka. Ukoliko više različitih stabala
zadovoljava princip najveće štedljivosti, algoritam generira konsenzusno stablo koje
predstavlja srednju vrijednosti najštedljivijih stabala. Supstitucijski model SPR nasumično
odabire grane već postojećih stabala te ih premješta kako bi generirao što veći broj novih
stabala.Metoda najveće vjerojatnosti isto tako generira velik broj stabala koja pod
određenim evolucijskim modelom s najvećom vjerojatnosti prikazuju filogenetske odnose
analiziranih markera. Supstitucijski model GTR je neutralan, nezavisan model evolucije
DNA. Model GTR dozvoljava različite frekvencije za sva četiri nukleotida te pretpostavlja
da je evolucija pojedinih nukleotida povratan homogeni Markovljev proces sa simetričnom
supstitucijskom matricom i zato moţe biti povratna u vremenu. Zbog toga za filogenetsku
analizu ovim modelom nije vaţno, niti je moguće odrediti koja je sekvenca ishodišna jer
sve imaju jednaku vjerojatnost za evoluciju jedne iz druge (Tavaré, 1986; Yang, 1994). Broj
poduzorkovanja (bootstrap) u svim analizama je bio 2000. Bootstrap analizom algoritam
generira stabla te ih uspoređuje prema topologiji. Vrijednosti bootstrap analize prikazane
su kao postotak stabala koja su imala jednaku topologiju.
28
4. Rezultati
4.1. Sravnjene sekvence
Nakon sekvenciranja i računalne obrade ukupno je dobiveno 29 sekvenci od kojih je
9 biljnih rbcL sekvenci (tablica 7), 9 biljnih matK sekvenci (tablica 8) i 11 ţivotinjskih COI
sekvenci (tablica 9).
Tablica 7: rbcL sekvence nakon sravnjivanja. A = adenin, T = timin, C = citozin, G = gvanin, CpG = postotak
CpG mjesta, Mr = relativna molekulska masa.
Udio baza / %
Uzorak Duljina / pb A T C G CpG / % Mr
Arbutus unedo 549 28.1 28.4 20.4 23.1 44 169825.4
Hedera helix 549 25.9 28.1 22.8 23.3 46 169547.0
Laurus nobilis 547 25.2 26.3 23.2 25.2 48 169122.7
Oxalis acetosella 549 25.7 29.3 22.0 23.0 45 169548.1
Phillyrea media 549 27.0 28.6 20.8 23.7 44 169816.3
Pistacia lentiscus 549 28.4 27.5 21.5 22.6 44 169678.3
Quercus ilex 548 26.5 28.6 21.9 23.0 45 169295.0
Ruscus aculeatus 547 25.6 28.5 22.9 23.0 46 168870.6
Smilax aspera 549 28.4 27.9 20.6 23.1 44 169828.4
Prosječna duljina umnoţenih rbcL sekvenci je 548 nukleotida.
29
Tablica 8: matK sekvence nakon sravnjivanja. A = adenin, T = timin, C = citozin, G = gvanin, CpG = postotak
CpG mjesta, Mr = relativna molekulska masa.
Udio baza / %
Uzorak Duljina / pb A T C G CpG / % Mr
Arbutus unedo 775 30.1 36.5 17.2 16.3 33 238946.0
Hedera helix 774 29.3 35.5 18.7 16.4 35 238432.5
Laurus nobilis 782 29.0 34.9 19.2 16.9 36 240916.0
Oxalis acetosella 781 28.8 36.6 16.6 17.9 35 241094.3
Phillyrea media 782 29.0 37.1 17.0 16.9 34 240882.2
Pistacia lentiscus 793 28.6 35.8 19.0 16.5 36 244222.2
Quercus ilex 781 29.6 36.1 19.1 15.2 34 240337.8
Ruscus aculeatus 799 30.0 38.2 16.6 15.1 32 246184.8
Smilax aspera 797 31.6 36.6 16.6 15.2 32 245699.5
Prosječna duljina umnoţenih matK sekvenci je 785 nukleotida.
Tablica 9: COI sekvence nakon sravnjivanja. A = adenin, T = timin, C = citozin, G = gvanin, CpG = postotak
CpG mjesta, Mr = relativna molekulska masa.
Udio baza / %
Uzorak Duljina / pb A T C G CpG / % Mr
1_Rupicapra 659 29.4 26.7 27.5 16.4 44 202136.2
2_Rupicapra 659 27.9 28.5 26.3 17.3 44 202316.4
3_Rupicapra 659 29.3 26.3 27.0 17.5 44 202347.7
4_Rupicapra 659 28.7 27.2 26.9 17.3 44 202301.3
5_Rupicapra 659 27.8 29.0 25.8 17.5 43 202377.4
6_Rupicapra 659 26.3 29.3 27.0 17.4 44 202167.2
7_Rupicapra 659 28.1 29.1 25.9 16.8 43 202282.4
8_Rupicapra 659 27.0 30.3 25.5 17.1 43 202312.4
9_Rupicapra 659 25.9 26.4 29.1 18.5 48 202113.9
10_Rupicapra 659 27.2 28.8 26.7 17.3 44 202226.3
11_Rupicapra 659 26.7 27.6 29.1 16.5 46 201833.9
Prosječna duljina umnoţenih COI sekvenci je 659 nukleotida.
30
4.2. Rezultati BLAST analize
BLAST alatom je prvo pretraţena baza podataka Banke Gena. Pretrage su
napravljene korištenjem algoritma megablast, kako bi se pronašle sekvence najsličnije
onima u Banci Gena. U tablici 10 su rezultati BLAST pretrage s identificiranom vrstom,
pristupnim brojem identificirane sekvence i postotkom poklapanja za biljne rbcL sekvence.
U tablici 11 su rezultati iste pretrage za biljne matK sekvence i u tablici 12 rezultati
pretrage za ţivotinjske COI sekvence.
Tablica 10: Rezultati BLAST analize rbcL sekvenci.
Uzorak Poklapanje / % GenBank
pristupni broj
Identificirana vrsta
Arbutus unedo 99 JQ067650.2 Arbutus unedo
Hedera helix 97 L01924.2 Hedera helix
Laurus nobilis 98 HQ619756.1 Laurus nobilis
Oxalis acetosella 95 JN893052.1 Oxalis acetosella
Phillyrea media 98 FJ862064.1 Phillyrea media
Pistacia lentiscus 99 FN599457.1 Pistacia chinensis
Quercus ilex 99 AB125020.1 Quercus ilex
Ruscus aculeatus 97 JN892402.1 Ruscus aculeatus
Smilax aspera 100 JQ711037.1 Smilax aspera
31
Tablica 11: Rezultati BLAST analize matK sekvenci.
Uzorak Poklapanje / % GenBank
pristupni broj
Identificirana vrsta
Arbutus unedo 99 JQ067650.2 Arbutus unedo
Hedera helix 99 JN895670.1 Hedera helix
Laurus nobilis 99 HQ619817.1 Laurus nobilis
Oxalis acetosella 95 JN895689.1 Oxalis acetosella
Phillyrea media 99 HE967458.1 Phillyrea augustinifolia
Pistacia lentiscus 90 KJ510922.1 Pistacia chinensis
Quercus ilex 99 AB125037.1 Quercus ilex
Ruscus aculeatus 99 HM640554.1 Ruscus aculeatus
Smilax aspera 99 KJ719970.1 Smilax aspera
Tablica 12: Rezultati BLAST analize COI sekvenci
Uzorak Preklapanje / % GenBank
pristupni broj Identificirana vrsta
1_Rupicapra 86 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
2_Rupicapra 86 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
3_Rupicapra 87 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
4_Rupicapra 82 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
5_Rupicapra 86 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
6_Rupicapra 87 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
7_Rupicapra 86 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
8_Rupicapra 85 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
9_Rupicapra 97 FJ207539.1 Rupicapra rupicapra
10_Rupicapra 91 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii
11_Rupicapra 99 KF317908.1 Rupicapra rupicapra
Dva uzorka su određena kao divokoza R. rupicapra, dok su ostali najsličniji
sekvenci azijske koze Capricornis milneedwardsii David. Sve sekvence su određene točno
do razine porodice Bovidae.
32
Nakon pretrage Banke Gena, sekvence su uspoređene međusobno jedna s drugom
alatom BLAST s uključenom opcijom poravnavanja dvije ili više sekvenci uz korštenje
algoritama megablast, discontinous megablast i blastn. U tablici 13 su rezultati analize
sličnosti rbcL sekvenci. Rezultati su dani kao postotak razlike među sekvencama te je
izračunata srednja vrijednost divergencije za svaku od sekvenci i prosjek srednjih
vrijednosti. Rezultati iste analize za matK sekvence su u tablici 14, a za COI sekvence u
tablici 15.
Tablica 13: Postotak divergencije među rbcL sekvencama dobiven BLAST analizom. SV = srednja vrijednost.
Uzorak
A.
unedo
H.
helix
L.
nobilis
O.
acetosella
P.
media
P.
lentiscus
Q.
ilex
R.
aculeatus
S.
aspera
Arbutus unedo 0 11 12 11 8 11 11 10 10
Hedera helix 11 0 25 14 11 10 9 17 10
Laurus nobilis 12 25 0 8 11 10 10 16 9
Oxalis acetosella 11 14 8 0 14 13 10 10 12
Phillyrea media 8 11 11 14 0 8 11 10 11
Pistacia lentiscus 10 10 10 13 8 0 9 10 10
Quercus ilex 10 9 10 10 11 9 0 11 9
Ruscus aculeatus 9 17 16 10 10 10 11 0 9
Smilax aspera 16 10 9 12 11 10 9 9 0
SV 10.88 14 12.25 11.63 10.5 10.13 10 11.63 10
Srednji postotak divergencije među svim rbcL sekvencama dobiven BLAST
analizom je 11.22.
33
Tablica 14: Postotak divergencije među matK sekvencama dobiven BLAST analizom. SV = srednja
vrijednost.
Uzorak
A.
unedo
H.
helix
L.
nobilis
O.
acetosella
P.
media
P.
lentiscus
Q.
ilex
R.
aculeatus
S.
aspera
Arbutus unedo 0 16 21 22 14 19 22 25 24
Hedera helix 16 0 19 20 11 18 19 25 24
Laurus nobilis 21 19 0 22 27 20 22 20 20
Oxalis acetosella 22 20 22 0 20 18 19 26 28
Phillyrea media 14 11 27 20 0 16 18 24 23
Pistacia lentiscus 19 18 20 18 16 0 18 25 25
Quercus ilex 22 19 22 19 18 18 0 26 26
Ruscus aculeatus 25 25 20 26 24 25 26 0 16
Smilax aspera 24 24 20 28 23 25 26 16 0
SV 20.4 19 21.4 21.9 19.1 19.9 21.3 23.4 22.9
Srednji postotak divergencije među svim matK sekvencama dobiven BLAST
analizom je 21.
Tablica 15: Postotak divergencije među COI sekvencama dobiven BLAST analizom. Brojevima od 1 do 11 su
označeni uzorci, SV = srednja vrijednost.
Uzorak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 0 8 6 5 8 6 8 9 9 7 20
2 8 0 7 5 1 8 1 2 8 6 16
3 6 7 0 5 8 6 7 8 8 5 15
4 5 5 5 0 6 5 5 5 8 7 20
5 8 1 7 6 0 9 0 3 8 7 16
6 6 8 6 5 9 0 8 7 9 7 19
7 8 1 7 5 0 8 0 2 8 7 16
8 9 2 8 5 3 7 2 0 8 6 17
9 9 8 8 8 8 9 8 8 0 8 17
10 7 6 5 7 7 7 7 6 8 0 20
11 20 16 15 20 16 19 16 17 17 20 0
SV 8.6 6.2 7.4 7.1 6.6 8.4 6.2 6.7 9.1 8 17.6
Srednji postotak divergencije među svim COI sekvencama dobiven BLAST
analizom je 8.4.
34
4.3. Rezultati analize filogenije COI sekvenci
Filogenetski odnosi među COI sekvencama su analizirani programom MEGA 6.
Najprije su izrađena filogenetska stabla metodom najveće štedljivosti (slika 12). Prikazano
stablo je izabrano kao najštedljivije s duljinom 853. Indeks homoplazije za mjesta
informativna za analizu ovom metodom je 0.632153, a indeks retencije je 0.539249.
Kompozitni indeks za sva mjesta je 0.453905, a za informativna mjesta 0.340888. U svim
analizama filogenije kao vanjska grupa za korijen stabla je izabrana sekvenca COI gena
ovce Ovis aries L. (Bovidae), pristupni broj KF977845.1. 659 nukleotida je bilo
informativno za analizu metodom najveće štedljivosti.
35
Slika 12: Filogenetsko stablo COI haplotipova dobiveno metodom maksimalne štedljivosti. Duljine grana su
prikazane kao broj supstitucija kroz cijelu sekvencu. Brojem je prikazan postotak poduzorkovanja koji je
razultirao istom topologijom grana. Crveno = Sjeverni Velebit, plavo = Biokovo, zeleno = Kupa.
36
Slika 13 prikazuje bootstrap konsenzus dendrogram dobiven iz 2000
poduzorkovanja metodom najveće štedljivosti. Stablo je dobiveno koristeći algoritam SPR
s razinom pretrage 2. Početna stabla su napravljena nasumičnim dodavanjem sekvenci
(10 poduzorkovanja).
Slika 13: Bootstrap konsenzus dendrogram COI haplotipova dobiven metodom maksimalne štedljivosti.
Brojem je prikazan postotak poduzorkovanja koji je razultirao istom topologijom grana. Crveno = Sjeverni
Velebit, plavo = Biokovo, zeleno = Kupa.
37
Nakon toga programom MEGA 6 izrađena su filogenetska stabla temeljena na
metodi najveće vjerojatnosti s evolucijskim modelom GTR i heurističkom metodom SPR.
Slika 14 prikazuje stablo dobiveno metodom najveće vjerojatnosti. Prikazano je stablo s
najvećim logaritmom vjerojatnosti -3775.9520. Duljina grana je prikazana kao broj
supstitucija po informativnom mjestu. 659 nukleotida je bilo informativno te je uključeno u
analizu metodom najveće vjerojatnosti.
Slika 14: Filogenetsko stablo COI haplotipova dobiveno metodom maksimalne vjerojatnosti. Brojem je
prikazan postotak poduzorkovanja koji je rezultirao istom topologijom grana. Crveno = Sjeverni Velebit, plavo
= Biokovo, zeleno = Kupa.
38
Na kraju je napravljen i bootstrap konsenzus dendrogram dobiven iz 2000
poduzorkovanja metodom najveće vjerojatnosti s evolucijskim modelom GTR i
heurističkom metodom SPR s razinom pretrage 3 (slika 15).
Slika 15: Bootstrap konsenzus dendrogram COI haplotipova dobiven metodom maksimalne vjerojatnosti.
Brojem je prikazan postotak poduzorkovanja koji je rezultirao istom topologijom grana. Crveno = Sjeverni
Velebit, plavo = Biokovo, zeleno = Kupa.
39
4.4. Barkodovi uzoraka
Obrađene sekvence biljnih i ţivotinjskih uzoraka poslane su u bazu podataka BOLD
i Banku Gena. Iz baze podataka BOLD i Banke Gena preuzeti su identifikacijski brojevi za
svaku sekvencu, a iz baze BOLD preuzeti su i ilustrativni prikazi barkodova. Barkodovi
svih biljnih i ţivotinjskih uzoraka su u prilozima.
40
5. Rasprava
Ovim istraţivanjem pokazao sam da je DNA barkodiranje brza i jednostavna
metoda za identifikaciju biljnih i ţivotinjskih vrsta. Za barkodiranje biljaka sam koristio gene
rbcL i matK koje predlaţe CBOL. Prosječne i stvarne razlike među rbcL i matK
sekvencama su puno veće od 2% te se uzorci identificirani ovom metodom lako mogu
povezati s odgovarajućim vrstama. Također, prosječne razlike među matK sekvencama
(21%) su puno veće nego one među rbcL sekvencama (11.22%), čime sam potvrdio već
prije poznatu činjenicu o većoj selektivnosti matK gena za određivanje vrsta (Kress, 2005;
CBOL Plant Working Group, 2009; Hollingsworth, 2011; Burgess, 2011). Stvarne razlike
među svim biljnim sekvencama su bile puno veće od 2% te se sve analizirane sekvence
mogu pripisati jedinstvenim vrstama, neovisno o analiziranom genu. Taj postotak
uspješnosti u jedinstvenom određivanju vrsta je puno veći od već objavljenih istraţivanja s
puno većim brojem istraţivanih vrsta te se moţe objasniti isključivo vrlo malim brojem
analiziranih uzoraka (Hollingsworth, 2011; Burgess, 2011). BLAST analiza rbcL sekvenci je
točno odredila 8 uzorka (88%) do razine vrste i 9 uzoraka (100%) do razine porodice s
prosječnim poklapanjem od 98%, a analiza matK sekvenci 7 uzoraka (77%) do razine
vrste i 9 uzoraka (78%) do razine porodice s prosječnim poklapanjem od 98%. Rezultati
BLAST određivanja su takvi zbog nepostojanja barkodova za veliku većinu ţivih
organizama pa BLAST analiza novu sekvencu identificira kao najbliţeg srodnika.
Pronalaţenje univerzalnog lokusa za molekularnu taksonomiju biljaka se pokazalo
osobito teškim zbog spore molekularne evolucije plastidnog genoma te nedostatka
univerzalnih početnica za sve biljne organizme. Također su moguće i translokacije dijelova
plastidnog genoma u druge organele što dodatno moţe zakomplicirati analizu (Delwiche i
Palmer, 1996; Wang, 2007; Hazkani-Covo, 2010). Zbog toga drugi autori kao standardne
biljne barkodove predlaţu nekodirajuće regije kao Internal Transcibed Spacer (ITS) regiju
jezgrinog ribosomalnog cistrona 18S-5.8S-26S, ili nekodirajuće plastidne regije trnL-F i
trnH-psbA (Chase, 2007; China Plant BOL Group, 2011; Kress, 2005, 2007).
Hebert i sur. (2003 i 2003a) su objavili da je divergencija COI sekvenci među
različitim vrstama istog roda redovito veća od 2%, a među jedinkama iste vrste manja od
2% te da se COI sekvence vrlo pouzdano mogu koristiti za određivanje vrsta i
filogeografsku analizu kod svih ţivotinjskih koljena osim Cnidaria. Wiemers i Fiedler (2007)
su ustanovili da je prosječna razlika veća od 2% kod barkodiranja ţivotinja zapravo
41
rezultat nedovoljnog broja istraţivanih uzoraka te da velik broj dobro definiranih vrsta ima
vrlo slične ili jednake sekvence COI gena. Zbog toga predlaţu korištenje DNA barkodiranja
kao pomoći pri razlikovanju kriptičnih vrsta. Razlika među mojim sekvencama je puno veća
od 2% te bi se moglo zaključiti da sekvence pripadaju različitim kriptičnim vrstama
divokoza ili različitim mitohondrijskim filogrupama vrste Rupicapra rupicapra čije su
postojanje ustanovili Schaschl i sur. (2003). Problemi s određivanjem i nesrazmjer među
COI sekvencama potencijalno jedne vrste su već otprije poznati te su pripisanim kriptičnim
svojtama (Hebert, 2004). BLAST analiza je sve sekvence točno odredila samo do razine
porodice. Neuspjeh u određivanju vrsta ostalim sekvencama mogu pripisati nepostojanju
barkodova za potencijalno kriptične vrste. Istraţivane vrste ne moraju nuţno biti kriptične
jer je zbog specifičnog načina evolucije mitohondrijskog genoma moguća i mitohondrijska
heteroplazmija kod jedinki iste vrste koja rezultira mitohondrijskom polifilijom te umnaţanje
translociranih mitohondrijskih pseudogena iz jezgre metodom PCR (Ballard, 2004;
Hazkani-Covo, 2010). Ti pseudogeni su često jako udaljeni od ortologne mitohondrijske
sekvence te se već pokazali problematičnima za DNA barkodiranje ţivotinja (Hazkani-
Covo, 2010; Song, 2008; Buhay, 2009). Treba naglasiti i da organizam nije određen samo
redoslijedom baza u svom mitohondrijskom genomu, već i svojim jezgrinim genima,
morfologijom, ekologijom i ostalim biološkim faktorima te se DNA barkodiranje vidi kao
pomoć pri tradicionalnom određivanju vrsta (Moritz i Cicero, 2004). Veličina područja
uzorkovanja također utječe na uspješnosti barkodiranja COI sekvencom, tako što se
povećanjem područja uzorkovanja povećavaju i razlike među sekvencama iste vrste
(Bergstein, 2012). Pošto se za barkodiranje kao standardni barkod uzima konsenzusna
sekvenca, vrlo brza evolucija mitohondrijskog genoma, ali i spora evolucija plastidnog
genoma moţe rezultirati jednakim barkodom među različitim vrstama (Meier, 2006).
Uzorci 9 i 11 prikupljeni na Sjevernom Velebitu i Kupi u većini slučajeva pokazuju
odvajanje od ostalih sekvenci koje podupire i visoka bootstrap vrijednost. Ostale sekvence
pokazuju visoku razinu bliskosti, no njihova srodnosti nije potvrđena bootstrap
vrijednostima. Prema tome, zbog samog odvajanja većine uzoraka na filogenetskim
stablima i niskih bootstrap vrijednosti ne moţe se puno zaključiti o filogenetskim odnosima
među populacijama divokoza, kao ni o potencijalnoj hibridizaciji tih populacija. Sama
razlika među sekvencama 11 i referentnim sekvencama KF317908.1 i FJ207539.1 iz
Banke Gena je do 3% te se moţe zaključiti da sve pripadaju vrsti Rupicapra rupicapra L.
Takav rezultat filogenetske analize upućuje na postojanje mitohondrijske heteroplazmije
unutar populacija divokoza s područja Republike Hrvatske.
42
Sama metoda DNA barkodiranja, uz postojanje popratnog sistema za identifikaciju i
baze sekvenci, bi omogućila brzu, jeftinu, pristupačnu i jednostavnu identifikaciju svih ţivih
organizama na Zemlji te dala nove spoznaje o diverzifikaciji ţivota, kriptičnim vrstama i
pravilima molekularne evolucije (Hebert, 2003a). Iako problemi s metodom postoje,
najčešće u vidu malih razlika u sekvencama jako bliskih vrsta, mitohondrijske i plastidne
heteroplazmije, umnaţanja mitohondrijskih pseudogena kod ţivotinja te nepostojanja
jedinstvenog lokusa za barkodiranje biljaka, sama metoda je vrlo jednostavna te zahtijeva
samo osnovnu laboratorijsku opremu i tehnike, što je čini osobito pogodnom za male
laboratorije i vrlo brzo određivanje velikog broja vrsta i uzoraka.
43
6. Zaključak
Na osnovu provedenog istraţivanja, prema postotku divergencije među rbcL i matK
sekvencama, većina biljnih uzoraka je identificirana do razine vrste neovisno o korištenom
genu.
Rezultati dobiveni barkodiranjem uzoraka divokoza s područja Republike Hrvatske
ukazuju na postojanje više od jedne vrste divokoza s obzirom na postotak divergencije
među njihovim COI sekvencama.
Dobivene rezultate barkodiranja divokoza potvrđuju i filogenetski odnosi dobiveni
metodom najveće vjerojatnosti i najveće štedljivosti.
44
7. Literatura
Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J., 1990. Basic local alignment
search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
Ballard J.W.O., Whitlock M.C., 2004. The incomplete natural history of mitochondria, Mol.
Ecol. 13(4): 729 – 744, doi:10.1046/j.1365-294X.2003.02063.x
Bergsten J., Bilton D.T., Fujisawa T., Elliott M., Monaghan M.T., Balke M., Hendrich L.,
Geijer J., Herrmann J., Foster G.N., Ribera I., Nilsson A.N., Barraclough T.G., Vogler A.P.,
2012. The Effect of Geographical Scale of Sampling on DNA Barcoding, Syst. Biol. 61(5):
851 – 869, doi:10.1093/sysbio/sys037
Buhay J.E., 2009. "COI–like" Sequences are Becoming Problematic in Molecular
Systematic and DNA Barcoding Studies, J. Crustac. Biol. 29(1): 96 – 110, doi:10.1651/08-
3020.1
Burgess K.S., Fazekas A.J., Kesanakurti P.R., Graham S.W., Husband B.C., Newmaster
S.G., Percy D.M., Hajibabaei M., Barrett S.C.H., 2011. Discriminating plant species in a
local temperate flora using the rbcL + matK DNA barcode, Methods Ecol. Evol. 2: 333 –
340, doi:10.1111/j.2041-210X.2011.00092.x
CBOL Plant Working Group, 2009. A DNA Barcode for land plants, PNAS 106(31): 12794
– 12797, doi:10.1073/pnas.0905845106
Chase M.W., Cowan R.S., Hollingsworth P.M., van den Berg C., Madriñán S., Petersen G.,
Seberg O. i sur., 2007. A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants,
Taxon 56(2): 295 – 299
China Plant BOL Group, Li D.-Z. i sur., 2011. Comparative analysis of a large dataset
indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core
barcode for seed plants, PNAS 108(49): 19641 – 19646
Delwiche C.F., Palmer J.D., 1996. Rampant Horizontal Transfer and Duplication of
Rubisco Genes in Eubacteria and Plastids, Mol. Biol. Evol. 13(6): 873 – 882
45
Fazekas A.J., Kuzmina M.L., Newmaster S.G., Hollingsworth P.M. (2012): DNA Barcoding
Methods for Land Plants. U: Kress W.J., Erickson D.L. (ur.) DNA Barcodes: Methods and
Protocols, Methods Mol. Biol., 858: str. 238, doi:10.1007/978-1-61779-591-6_11, Springer
Science+Business Media, ISBN:978-1-61779-590-9
Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R., 1994. DNA primers for amplification
of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates, Mol.
Mar. Biol. Biotechnol. 3(5): 294 – 299
Hammer S., Nadlinger K., Hartl G.B., 1995. Mitochondrial DNA differentiation in chamois
(genus Rupicapra): implications for taxonomy, conservation and management, Acta
Theriologica Suppl. 3: 145 – 155
Hausner G., Olson R., Simon D., Johnson I., Sanders E.R., Karol K.G., McCourt R.M.,
Zimmerly S., 2006. Origin and Evolution of the Chloroplast trnK (matK) Intron: A Model for
Evolution of Group II Intron RNA Structures, Mol. Biol. Evol., 23(2): 380 – 391,
doi:10.1093/molbev/msj047
Hazkani-Covo E., Zeller R.M., Martin W., 2010. Molecular poltergeists: Mitochondrial DNA
Copies (numts) in Sequenced Nuclear Genomes, PLoS Genet. 6(2): e1000834,
doi:10.1371/journal.pgen.1000834
Hebert P.D.N., Ratnasingham S., deWaard J.R., 2003. Barcoding animal life: cytochrome c
oxidase subunit 1 divergences among closely related species, Proc. R. Soc. Lond. B 270
(suppl. 1): S96 – S99, doi:10.1098/rsbl.2003.0025
Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., 2003a. Biological identifications through DNA
barcodes, Proc. R. Soc. Lond. B 270(1512): 313 – 321, doi:10.1098/rspb.2002.2218
Hebert P.D.N., Penton E.H., Burns J.M., Janzen D.H., Hallwachs W., 2004. Ten species in
one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes
fulgerator, PNAS 101(41): 14812 – 14817, doi:10.1073/pnas.0406166101
Hollingsworth P.M., Graham S.W., Little D.P., 2011. Choosing and Using a Plant DNA
Barcode, PLoS ONE 6(5): e19254, doi:10.1371/journal.pone.0019254
46
Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A., Janzen D.H., 2005. Use of DNA
barcodes to identify flowering plants, PNAS 102(23): 8369 – 8374,
doi:10.1073/pnas.0503123102
Kress W.J., Erickson D.L., 2007. A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The
Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnH-psbA Spacer Region, PLoS ONE
2(6): e508. doi:10.1371/journal.pone.0000508
Martínez-Alberola F., del Campo E.M., Lázaro-Gimeno D., Mezquita-Claramonte S.,
Molins A., i sur., 2013. Balanced Gene Losses, Duplications and Intensive
Rearrangements Led to an Unusual Regularly Sized Genome in Arbutus unedo
Chloroplasts, PLoS ONE 8(11): e79685. doi:10.1371/journal.pone.0079685
Masini F., Lovari S., 1988. Systematics, phylogenetic relationships, and dispersal of the
chamois (Rupicapra spp.), Quartern. Res. 30(3): 339 – 349, doi:10.1016/0033-
5894(88)90009-9
McKeon S.N., Lehr M.A., Wilkerson R.C., Ruiz R.F., Sallum M.A., Lima J.B.P., Povoa
M.M., Conn J.E., 2010. Lineage divergence detected in the malaria vector Anopheles
marajoara (Diptera: Culicidae) in Amazonian Brazil, Malar. J. 9:271, doi:10.1186/1475-
2875-9-271
Meier R., Shiyang K., Vaidya G., Ng P.K.L., 2006. DNA Barcoding and Taxonomy in
Diptera: A Tale of High Intraspecific Variability and Low Identification Success, Syst. Biol.
55(5): 715 – 728, doi:10.1080/10635150600969864
Moritz C., Cicero C., 2004. DNA Barcoding: Promise and Pitfalls, PLoS Biol 2(10): e245,
doi:10.1371/journal.pbio.0020354
Park C.B., Larsson N.G., 2011. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging, J. Cell
Biol. 193(5): 809 – 818, doi:10.1083/jcb.201010024
Pawlowski J., Audic S., Adl S., Bass D., Belbahri L. i sur., 2012. CBOL Protist Working
Group: Barcoding Eukaryotic Richness beyond the Animal, Plant and Fungal Kingdoms,
PLoS Biol 10(11): e1001419, doi:10.1371/journal.pbio.1001419
47
Pérez T., Hammer S.E., Albornoz J., Domínguez A., 2011. Y–chromosome phylogeny in
the evolutionary net of chamois (genus Rupicapra), BMC Evol. Biol. 11(272):
doi:10.1186/1471-2148-11-272
Ratnasingham S., Hebert, P.D.N., 2007. BOLD: The Barcode of Life Data System
(www.barcodinglife.org), Mol. Ecol. Resour. 7: 355 – 364, doi:10.1111/j.1471-
8286.2006.01678.x
Schaschl H., Kaulfus D., Hammer S., Suchentrunk F., 2003. Spatial patterns of
mitochondrial and nuclear gene pools in chamois (Rupicapra r. rupicapra) from the Eastern
Alps, Heredity 91: 125 – 135, doi:10.1038/sj.hdy.6800290
Seifert K.A., Samson R.A., deWaard J.R., Houbraken J., Lévesque C.A., Moncalvo J.M.,
Louis-Seize G., Hebert P.D.N., 2007. Prospects for fungus identification using CO1 DNA
barcodes, with Penicillium as a test case, PNAS 40(9): 3901 – 3906, doi:
10.1073/pnas.0611691104
Seifert K.A., 2009. Progress towards DNA barcoding of fungi, Mol. Ecol. Resour. 9 (suppl.
1): 83 – 89, doi: 10.1111/j.1755-0998.2009.02635.x
Song H., Buhay J.E., Whiting M.F., Crandall K.A., 2008. Many species in one: DNA
barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes
are coamplified, PNAS 105(36): 13486 – 13491, doi:10.1073/pnas.0803076105
The Angiosperm Phylogeny Group, 2003. An update of the Angiosperm Phylogeny Group
classification for the orders and families of flowering plants: APG II, Bot. J. Linn. Soc. 141:
399 – 436
Tavaré S., 1986. Some Probabilistic and Statistical Problems in the Analysis of DNA
Sequences, Lectures Math. Life Sci. 17: 57 – 86
Tvrtković N., Grubešić M., (2006): Divokoza. U: Tvrtković N. (ur.) Crvena knjiga sisavaca
Hrvatske. Zagreb, Ministarstvo kulture, Drţavni zavod za zaštitu prirode, str. 42, ISBN:
953-7169-12-X.
48
Wang D., Wu Y.W., Shih C.C.A., Wu C.S., Wang Y.N., Chaw S.M., 2007. Transfer of
Chloroplast Genomic DNA to Mitochondrial Genome Occured At Least 300 MYA, Mol. Biol.
Evol. 24(9): 2040 – 2048, doi:10.1093/molbev/msm133
Wiemers M., Fiedler K., 2007. Does the DNA barcoding gap exist? – a case study in blue
butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae), Front. Zool. 4(8), doi:10.1186/1742-9994-4-8
Yang Z., 1994. Estimating the Pattern of Nucleotide Substitution, J. Mol. Evol. 39: 105 –
111
Zoschke R., Nakamura M., Liere K., Sugiura M., Börner T., Schmitz-Linneweber C., 2010.
An organellar maturase associates with multiple group II introns, PNAS 107(7): 3245 –
3250, doi: 10.1073/pnas.0909400107
Hall, T., 1999. BioEdit: a user–friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 95/98/NT, Nucleic Acids Symp. Ser. 41: 95 – 98 (program:
http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html, pristupljeno 5. srpnja 2014.)
Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H.,
Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G.,
2007. Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioinformatics 23(21): 2947 – 2948,
doi:10.1093/bioinformatics/btm404, (program: http://www.clustal.org/download/2.1/ ,
pristupljeno 5. srpnja 2014.)
Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski A., Kumar, S., 2013. MEGA 6: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0, Mol. Biol. Evol. 30(12): 2725 – 2729,
doi: 10.1093/molbev/mst197 (program: http://www.megasoftware.net/mega.php ,
pristupljeno 5. srpnja 2014.)
Qiagen®, 2006. DNeasy® Plant Handbook, 24–27
Qiagen®, 2006a. DNeasy® Blood & Tissue Handbook, 28–30
Qiagen®, 2008. MinElute® Handbook, 23–24
Qiagen®, 2008a. HotStarTaq® Plus PCR Handbook, 28–30
49
7.1. Internetske reference
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (pristupljeno 11. rujna 2014.)
http://www.boldsystems.org/index.php/ (pristupljeno 11. rujna 2014.)
http://www.eplantscience.com/index/genetics/maternal_effects_and_cytoplasmic_inheritan
ce/mitochondrial_genetics.php (pristupljeno 11. rujna 2014.)
http://www.ibwf.de/taxon_index.htm
http://atos.hr/hr/hrvatska-lovni-turizam/divokoza.html (pristupljeno 11. rujna 2014.)
http://zasticenevrste.azo.hr/vrsta.aspx?id=260 (pristupljeno 11. rujna 2014.)
http://www.hunting-croatia.net/uvjeti.html (pristupljeno 11. rujna 2014.)
http://www.np-sjeverni-velebit.hr/park/zivapriroda/zivotinje/ (pristupljeno 11. rujna 2014.)
http://www.vusz.hr/Cms_Data/Contents/VSZ/Folders/dokumenti/javanustanovazaupravljan
jezasticenimprirodnimvrijednostima/arhiva/~contents/NDW2SALP92LHTQZ7/2011-3-15-
5947916-2009-12-7-5331263-vegetacijahrvatske.pdf (pristupljeno 11. rujna 2014.)
50
8. Popis priloga
I Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
II Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
III Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
IV Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
V Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
VI Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
VII Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
VIII Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
IX Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
X Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
XI Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
XII Arbutus unedo – planika rbcL barkod
XIII Arbutus unedo – planika matK barkod
XIV Hedera helix – bršljan rbcL barkod
XV Hedera helix – bršljan matK barkod
XVI Laurus nobilis – lovor rbcL barkod
XVII Laurus nobilis – lovor matK barkod
XVIII Oxalis acetosella – šumski cecelj rbcL barkod
XIX Oxalis acetosella – šumski cecelj matK barkod
XX Phillyrea media – srednja komorika rbcL barkod
XXI Phillyrea media – srednja komorika matK barkod
XXII Pistacia lentiscus – tršlja rbcL barkod
XXIII Pistacia lentiscus – tršlja matK barkod
XXIV Quercus ilex – hrast crnika rbcL barkod
XXV Quercus ilex – hrast crnika matK barkod
XXVI Ruscus aculeatus – bodljikava veprina rbcL barkod
XXVII Ruscus aculeatus – bodljikava veprina matK barkod
XXVIII Smilax aspera – crvena tetivika rbcL barkod
XXIX Smilax aspera – crvena tetivika matK barkod
I
I Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
Rupicapra rupicapra - divokoza (fotografija: Z. Marasović)
BOLD pristupni broj: FOC001-14
GenBank pristupni broj: KM527375
Nukleotidna sekvenca:
ACTTTACCTTTAGCATTTTGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACCGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCTGAGACAACCAAATCTACTACGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCTGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAACATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCATTTGGGGGAACCATAACAAATACTGGCGGATTA
CCGGTTCTCCCACTTTCCGGAATAACGGCTGGGAATACCAAACCCCTTACAAAACCAAAATCAAAAACACCCTCCTTGAACCCACCAGG
AGAAGGGAACCCAATCTTAAACCCAACCCCAATTTT
Sekvenca aminokiselina:
TLPLAFCTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLWDNQIYYVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFCNWLVPLMIGGLDMTFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFGGTMTNTGGL
PVLPLSGMTAGNTKPLTKPKSKTPSLNPPGEGNPILNPTPIX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
II
II Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC002-14
GenBank pristupni broj: KM527374
Nukleotidna sekvenca:
ACTCAACCTTTAGGATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCATTTGTGTGATCCATACGAATCACTGCTGTATTA
CTGCTTCTCTCACTTCCCGTATTAGCGGCTGGTATTACAATACCACTAACAGACCGAAATCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCAGG
AGGAGGGGACCCTATCCTATATCAACACCTATTTTT
Sekvenca aminokiselina:
TQPLGFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFVWSMRITAVL
LLLSLPVLAAGITMPLTDRNLNTTFFDPAGGGDPILYQHLFX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
III
III Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC003-14
GenBank pristupni broj: KM527373
Nukleotidna sekvenca:
ACTTTATCTTTAGTATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCAATTGGGGGAACCCTTCCAAACCCTGGTGGAATA
ACGGTTCCCCCAATTCCCGGAATAACGGGTGGGATTAACATTCCCCTAAACGAACCAAATCCAAATACAACCTCCTTGAACCCACCGGA
AGAAGGGAACCCAATCCAAAATCCACACCCAATTTT
Sekvenca aminokiselina:
TLSLVFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPIGGTLPNPGGM
TVPPIPGMTGGINIPLNEPNPNTTSLNPPEEGNPIQNPHPIX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
IV
IV Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC004-14
GenBank pristupni broj: KM527372
Nukleotidna sekvenca:
ACTTCAACTTTAGTATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
AAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCATTTGGGGGAACCATACCAATCACTGGTGGATTA
CTGGTTCCCTCCCTTTCCGGATTAACGGGTGGGATTACCATACCCCTAACAGAACGAAATCCAAATACACCCTCCTTGAACCCACAAGA
AGAAGGGAACCTAATCTATATCCCACCCCCAATTTT
Sekvenca aminokiselina:
TSTLVFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIEGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFGGTMPITGGL
LVPSLSGLTGGITMPLTERNPNTPSLNPQEEGNLIYIPPPIX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
,
V
V Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC005-14
GenBank pristupni broj: KM527371
Nukleotidna sekvenca:
ACTTTATCTTTAGGATTTGGGTACTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCATTTGTGTGATCCATACGAATCACTGCTGTATTA
CTGCTTCTCTCACTTCCCGTATTAGCGGCTGGTATTACAATACCACTAACAGACCGAAATCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCAGG
AGGAGGGGACCCTATCCTATATCAACACCTATTTTT
Sekvenca aminokiselina:
TLSLGFGYWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFVWSMRITAVL
LLLSLPVLAAGITMPLTDRNLNTTFFDPAGGGDPILYQHLFX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
VI
VI Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC006-14
GenBank pristupni broj: KM527370
Nukleotidna sekvenca:
ACATTACCTTTAGGATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCCTTTGGGGGATCCCTAACAAACCTTGCCGGATTT
CCGGCTCCCTCCCTTTCCGGAATATCGGCGGGAATTACAAAACTCCTAACTTATCTAAACCTTAAAACAACCTATTTTTCCCTCCTCTG
GGGAGGGGGCCCTTTTCCTTTTCCACCTTTATTTTT
Sekvenca aminokiselina:
TLPLGFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFGGSLTNLAGF
PAPSLSGMSAGITKLLTYLNLKTTYFSLLWGGGPFPFPPLFX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
VII
VII Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC007-14
GenBank pristupni broj: KM527369
Nukleotidna sekvenca:
ACTTTAACTTTATTATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCATTTGTGTGATCCATACGAATCACTGCTGTATTA
CTGCTTCTCTCACTTCCCGTATTAGCGGCTGGTATTACAATACCACTAACAGACCAAAATCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCAGG
AGGAGGGGACCCTATCCTATATCAACACCTATTTTT
Sekvenca aminokiselina:
TLTLLFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFVWSMRITAVL
LLLSLPVLAAGITMPLTDQNLNTTFFDPAGGGDPILYQHLFX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
VIII
VIII Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC008-14
GenBank pristupni broj: KM527368
Nukleotidna sekvenca:
ACTTTATCTTTAGTATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCGACCCCCCCCATTTGTGTGATCCATACGAATCACTGCTGTATTA
CTGTTTCTCTCATTTCCCGTATTATCGGCTGGTATTACAATACCTCTAACTGACCTAAATCTAAATACGACCTTCTTTGACCCTTCATG
AGGAGGGGACCCTATCGTAGATCAACACCTATTTTT
Sekvenca aminokiselina:
TLSLVFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYRPPPFVWSMRITAVL
LFLSFPVLSAGITMPLTDLNLNTTFFDPSWGGDPIVDQHLFX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
IX
IX Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC010-14
GenBank pristupni broj: KM527367
Nukleotidna sekvenca:
ACATTACATTTGAGTCTTGGTTGCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGAGGGAATCTCCTCACACTTAGGCATTTTATCCTGACACCTGGAAAGTGTTGGGATAACTTTAGAAGGAACAAGTTACT
ACAGCAATTCTTTATATATAACCCCCCAAAAGGCTCCGTTGCTGGCTCCCTCCATATGCTCCGCCCCCCAGAAGCATCACAGCATTCCA
CCCTCAATCCCTATGTGGCTAAACCCCACGGACTATAAAGATACCAAGCGTTCCCAACCTGGAAAACCCCTCTCGTTCTCTCCTGTTCC
GACCCTGCCGCTTACCTGATACCTGTCCGCCTTTTT
Sekvenca aminokiselina:
TLHLSLGCWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHEGISSHLGILSWHLESVGMTLEGTSYYSNSLYMTPQKAPLLAPSMCSAPQKHHSIP
PSIPMWLNPTDYKDTKRSQPGKPLSFSPVPTLPLTWYLSAFX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
X
X Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC012-14
GenBank pristupni broj: KM527366
Nukleotidna sekvenca:
ACCCTTAAACTCCAATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC
CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG
GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC
CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA
TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA
TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCCTTTGGGGGGACCCTACCAATCCTTGTGGAATTA
CGGCTTCCCTACTTTCCCGGAATAACGGCTGGGATTTCCATACCCCTAAAAAACCAAAATCTAAATTCAACCTTTTTTGACCCACCGGG
AGGAGGGAACCCATTCCCTTTTTCATCCCTAATCTG
Sekvenca aminokiselina:
TLKLQFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL
PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFGGTLPILVEL
RLPYFPGMTAGISMPLKNQNLNSTFFDPPGGGNPFPFSSLIX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
XI
XI Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod
BOLD pristupni broj: FOC013-14
GenBank pristupni broj: KM527365
Nukleotidna sekvenca:
ACTTTTAACGTCCTATTTGGCGCCTGAGCCGGCATAGTAGGGACCGCCCTAAGCTTACTGATTCGCGCTGAACTAGGCCAACCCGGAAC
TCTACTCGGAGACGATCAAATCTACAACGTAATTGTAACCGCACATGCATTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATCATAATCG
GAGGTTTTGGCAACTGACTAGTTCCTCTAATAATTGGAGCCCCTGACATAGCATTTCCTCGGATAAATAACATAAGCTTCTGACTCCTT
CCCCCTTCTTTCCTGCTACTCCTAGCATCTTCTATAATCGAAGCCGGAGCAGGAACAGGTTGAACCGTGTATCCCCCTCTAGCAGGTAA
CCTGGCCCATGCAGGAGCTTCAGTAGACCTAACCATTTTCTCCTTACACCTAGCAGGTGTCTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTA
TCACGACTATCATTAATATAAAACCCCCCGCAATATCACAATACCAAACTCCCCTATTCGTATGATCTGTATTAATTACTGCCGTACTA
CTCCTCCTCTCACTCCCTGTATTAGCAGCCGGCATTACAATGCTACTGACTGACCGAAACCTAAACACAACCTTCTTCGACCCAGCAGG
AGGAGGGGATCCCATCTTATATCAACACCTGTTCTG
Sekvenca aminokiselina:
TFNVLFGAWAGMVGTALSLLIRAELGQPGTLLGDDQIYNVIVTAHAFVMIFFMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGAPDMAFPRMNNMSFWLL
PPSFLLLLASSMIEAGAGTGWTVYPPLAGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKPPAMSQYQTPLFVWSVLITAVL
LLLSLPVLAAGITMLLTDRNLNTTFFDPAGGGDPILYQHLFX
Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.
XII
XII Arbutus unedo – planika rbcL barkod
Arbutus unedo L. – planika.
BOLD pristupni broj: ATG010-14
GenBank pristupni broj: KM527347
Nukleotidna sekvenca:
GGTAAGGCTTGGGGCTGGTGTTAAGAATTACAAATTGACTTATTATACTCCTAAATATGAAACAAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT
TCCGAGTAACTCCTCAACCAGGAGTTCCACCTGAAGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCAGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
TGGACCGATGGACTTACTAGCCTTGATCGTTACAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGC
TTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCCGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAG
CCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAAGATCTACGAATCCCTGTTTCGTATGTTAAAACTTTCCAAGGGCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAA
AGAGATAAATTGAACAAATATGGTCGTCCCCTGTTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTATGGGCGAAC
ACTTTATGAGTGTCTGCCCGGGGGAG
Sekvenca aminokiselina:
VRLGAGVKNYKLTYYTPKYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVAGEENQYIA
YVAYPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPVSYVKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRT
LY
Ilustrativni rbcL barkod vrste A. unedo.
XIII
XIII Arbutus unedo – planika matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG001-14
GenBank pristupni broj: KM527356
Nukleotidna sekvenca:
GGGTAAAAGATGTCTCTTCTTTTGCTTTATTACGATTTTTTTTCCACGCGTATCGTAATTGGAATAGTCTTATGACTCAAAAGAAATCG
AGTTTTTCTTTTTCAAAAACAAATAAAAGATTATTCTTGTTCCTATATAATTTTCATGTATGTGAATATGAATCTATCTTCCTTTTTCT
CCGCAACCAATCTTCTCATTTACGTTCAATATCTTCTGAAACCTTTCTTGAACGAATATATTTCTATAGAAAAATAGAACTAGAAGTCT
TTACTAAGGATTTTAAGGCTATTCTATGGGTGTTCAAAGATCCTTTCCTGCATTATGTTAGGTATCAAGGAAAATCCACTTTGGCTTCA
AAAGGGACGTCTCTTTTAATGAATAAATGGAAATATTACCTTGTCAAGTTCTGGCAATGTTATTTTTACATGTGGTCTCAACCAAGAAG
GATCCATATAAACCAATTATCCAACGATTCCCTCGACTTTCTGGGCTATCTTTCAAGTGTGCGATTAAACCCTTTAATGGTACGGAGTC
AAATGCTAGAAAATTCTTTTCTAATAGGGAATGCTTTTAAGAAGTTCGATACCCTAGTGCCAATTATTCCAATGATTGGATCATTGTCT
AAAGCGAAATTTTGTAACGTCTTAGGACATCCCATGAGTAAGTCAGTCTGGGCTGATTTATCAGATTCTGATATTATTGACCGATTCGG
GCGTATATATAGAAATCTTTCTCATTATCATAGCGGATCCTTAAATAAAATGAGTTTGTATCGAGTAAAGTATATACTTCGA
Sekvenca aminokiselina:
VKDVSSFALLRFFFHAYRNWNSLMTQKKSSFSFSKTNKRLFLFLYNFHVCEYESIFLFLRNQSSHLRSISSETFLERIYFYRKIELEVF
TKDFKAILWVFKDPFLHYVRYQGKSTLASKGTSLLMNKWKYYLVKFWQCYFYMWSQPRRIHINQLSNDSLDFLGYLSSVRLNPLMVRSQ
MLENSFLIGNAFKKFDTLVPIIPMIGSLSKAKFCNVLGHPMSKSVWADLSDSDIIDRFGRIYRNLSHYHSGSLNKMSLYRVKYILR
Ilustrativni matK barkod vrste A. unedo.
XIV
XIV Hedera helix – bršljan rbcL barkod
Hedera helix L. – bršljan.
BOLD pristupni broj: ATG018-14
GenBank pristupni broj: KM527348
Nukleotidna sekvenca:
TGTTGGGATCACAGCTGGTGTTAAAGATTACAGATTGACTTATTATACTCCTGACTATCAAACCAAAGATACTGACATCTTGGCAGCAT
TCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCACCTGAAGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
TGGACCGATGGACTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGGCGATGCTACGGAATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAGTCAATTTATTGC
TTATGTAGCTTACCCATTAGACCTTTTTGAAGAAGGGTCTGTTACTCACATGTTTACCTCCATTGTAGGTAAAGGGTTTGGGGTCCAAC
CGCCCCCAGCGTTTTCCCTGGAACAAGATAAAATTCCTGTTGCTTGTGCCCCGGTTTTCCAAGGGGGAACTCCAGGGATCCAAGTTAAT
CGAGATAAGCTGCCCAAATGTCAGTATCTTTGGTTCAGAGTCACGAGTATAATAAATCTGTTAATCTTTAACACCAGCTTTGAATCCCA
CACTTCGTTATTCTCTGTGTGGGGGGG
Sekvenca aminokiselina:
VGITAGVKDYRLTYYTPDYQTKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYGIEPVAGEESQFIA
YVAYPLDLFEEGSVTHMFTSIVGKGFGVQPPPAFSLEQDKIPVACAPVFQGGTPGIQVNRDKLPKCQYLWFRVTSIINLLIFNTSFESH
TSLFSVWGX
Ilustrativni rbcL barkod vrste H. helix.
XV
XV Hedera helix – bršljan matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG009-14
GenBank pristupni broj: KM527357
Nukleotidna sekvenca:
GGGTTAAAGATGCTTCTTCTTTGCATTTATTACGATTCTTTCTCCACGAGTATTGTAATTGGAATACTCCAAATAAAGCCGGTTCTTCT
TTTTCAAAAAGAAATCAAAGACTATTCTTCTTCCTATATAATTCTCATCTATGTGAATACGAATCCATCTTCATCTTTCTCCGTAACCA
ATCTTCTCATTTACGCTCAACATCTTCTGGAACCCTTCTTGAACGAATATATTTCTATGGAAAAATAAAATATCTTGTAAAAGTCTTTG
TTAAGGCTTTTCAAGTCAATCTATTGTTGTTGAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTAGGTATCAAGGAAAATCAATTCTCGCTTCAAAA
GGGACGCCCTTTTTGATGAAAAAATGGACATATTACTTTGTTAATTTATGGCAATGTCATTTTTACCTGTGGTCTCAACCGGGAAGGAT
CTGTATAAACCAATTATACAATCATTCCCTCGACCTTCTGGGCTATCTATCAAGTGCGCGGCTAAACCCTTCAATGGTACGCGGTCAAA
TGCTAGAAAATTCATTTCTAATTGATAATGCTATTAATAAGTTCGATACTATTGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCATTGGCTAAA
GCGAAATTTTGTAACGTATTGGGGCATCCTATTAGTAAGGCGGTTTGGACCGATTTATCAGATTCTGATATTATTGACCGATTTGGGGC
GTATATGCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGTGGATCCTCACAAAAAAAAGAGTTTGTATCG
Sekvenca aminokiselina:
VKDASSLHLLRFFLHEYCNWNTPNKAGSSFSKRNQRLFFFLYNSHLCEYESIFIFLRNQSSHLRSTSSGTLLERIYFYGKIKYLVKVFV
KAFQVNLLLLKDPFMHYVRYQGKSILASKGTPFLMKKWTYYFVNLWQCHFYLWSQPGRICINQLYNHSLDLLGYLSSARLNPSMVRGQM
LENSFLIDNAINKFDTIVPIIPLIGSLAKAKFCNVLGHPISKAVWTDLSDSDIIDRFGAYMQKSFSLSQWILTKKRVCIX
Ilustrativni matK barkod vrste H. helix.
XVI
XVI Laurus nobilis – lovor rbcL barkod
Laurus nobilis L. – lovor.
BOLD pristupni broj: ATG017-14
GenBank pristupni broj: KM527349
Nukleotidna sekvenca:
GCTGGGTGTAAAAGATACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAAGTACTGATATTTTGGCAGCATTTCGAGTAACTCC
TCAACCCGGAGTTCCACCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGAC
TTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAGGAAAGTCAATTTATTGCCTATGTAGCTTAC
CCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGGTCTGTTACGAACATGTTTACTTCTATTGTGGGTAAAGGGTTTGGGGTCCATCGGGCCCCACAGTT
GTCCCTGGACCAATTGAAAAATCCGCCGCCGGAACCCCCGGTTCCTCGGGGGGGACTCCGGGGTTTCCAAGATGAATCCAATAAGGTGG
CCAAATATCAAGACCTTTGGTTTCGAGTCCCGGATAAAATCAATTTGGTAACCTTTACAACAACTTTTGGTCCCACACTTGGTGAATCT
CCGCGTGGGGGAG
Sekvenca aminokiselina:
AGCKRYKLTYYTPDYETKSTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVAGEESQFIAYVAY
PLDLFEEGSVTNMFTSIVGKGFGVHRAPQLSLDQLKNPPPEPPVPRGGLRGFQDESNKVAKYQDLWFRVPDKINLVTFTTTFGPTLGES
PRGGX
Ilustrativni rbcL barkod vrste L. nobilis.
XVII
XVII Laurus nobilis – lovor matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG008-14
GenBank pristupni broj: KM527358
Nukleotidna sekvenca:
GGATTACAGATACTCTTTCGTTGCATTTATTGCGATTTTCTCTCTACGAGTATTGGAATTCAAATAGTCTCATTACTCCAAAAAATTCC
ATTTCCCTTTTTTCAAAAGAGAATCAAAGATTCTTCTTGTTCCTCTCTAATTCTCATGTATATGAATGTGAATTCATATTCATTTTTCT
CCGTAAACAACCCTTTCATTTACGATCAAAATCTTTTGGATCCTTTCTTGAACGAACACATTTCTATGCAAAAATAGAATATCTTGTAG
TAGTGCTTTGTAACGATTTTCAGAAAACCCTATGGTTGTTCAAAGACCCTTTTATGCATTATGTCAGATATCAAGGAAAATCGATTCTG
GCTTCAAGGGGGGCTCGTCTTCTGATAAAGAAATGGAAATCTCACCTTGTCAACTTTTGGCAATGTCATTTTGACTTGTGGTCTCAACC
GGCCAGGATCCATATAAAGCAATTATATAATCATCCCTTCTATTTTCTAGGCTATCTTTCAAGTGTACGACTAAACTCTTCGGTGATAA
GGAGTCAAATGCTAGAGAATTCGTTTCGAATAGATACTGCTATTAAGAAATTCGAGACCGTAGTCCCAATTATTCCTCTGATTGGATCA
TTGGCTAAAGCAAAATTTTGTAATGTATCAGGGCATCCCATTAGTAAGCCGTTTCGGGCTGATTTGTCAGATTCTGAGATTCTCAATCG
ATTTGGGGCGGATATGCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGTGGATCCTCAAAAAAACAGAGTTTGTATCGTATAAAGTATATACTTCGA
Sekvenca aminokiselina:
ITDTLSLHLLRFSLYEYWNSNSLITPKNSISLFSKENQRFFLFLSNSHVYECEFIFIFLRKQPFHLRSKSFGSFLERTHFYAKIEYLVV
VLCNDFQKTLWLFKDPFMHYVRYQGKSILASRGARLLIKKWKSHLVNFWQCHFDLWSQPARIHIKQLYNHPFYFLGYLSSVRLNSSVIR
SQMLENSFRIDTAIKKFETVVPIIPLIGSLAKAKFCNVSGHPISKPFRADLSDSEILNRFGADMQKSFSLSQWILKKTEFVSYKVYTSX
Ilustrativni matK barkod vrste L. nobilis.
XVIII
XVIII Oxalis acetosella – šumski cecelj rbcL barkod
Oxalis acetosella L. – šumski cecelj.
BOLD pristupni broj: ATG012-14
GenBank pristupni broj: KM527350
Nukleotidna sekvenca:
GTTCGAATCCAGGCCGGTGTTACAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT
CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCCCCTGAGGAAGCCGGGGCAGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGT
GGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGTCAATTTATTGCT
TATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTGTTTGGGTTCCAGGC
GCTCCGGGCTCTACCTCTAGAGGATTTGCGAATCCCTACTGCTTATGTTCAAACTTTTCAAGGGGGGAATCACGGGATCCAAGTTTACA
CAGATAGATTGAACAATTACGGCCGCCCCCGATTGGGATGCACGATTAAAACAAATCTGTTTATAACCCTTAACAACTATGGTGAATCC
GACTATTGCTGTAGTCTCTGTTGTG
Sekvenca aminokiselina:
VRIQAGVTDYKLTYYTPDYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVAGEESQFIA
YVAYPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFQALRALPLEDLRIPTAYVQTFQGGNHGIQVYTDRLNNYGRPRLGCTIKTNLFITLNNYGES
DYCCSLCCX
Ilustrativni rbcL barkod vrste O. acetosella.
XIX
XIX Oxalis acetosella – šumski cecelj matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG003-14
GenBank pristupni broj: KM527359
Nukleotidna sekvenca:
GAGGCGAAGATGCCTCTTCTTTGCATTTAGTACGGCTCTTTCTCTACGAGTATTATAAGTGGAATAGTCTTATTAATTCAAAGAACTCT
AGTTCCATTTTTTGGAAGAGTAATCCAAGATTGTTCTTGTTCTTATATAATTCTCATGTATATGAATACGAATCCATTCTTCTTTTTCT
CTCTAACCAATCTTCTCATTTACGATCAACATCTTCTCGGATTTTTTTTGAGCGAATCTATTTTTATGGAAAAATAGAGTATCTTGCAA
AAATCTTTGCGAATGATTTCAGGGGTATCCTGTGGTTATTGAAAGATCCTTTCATGCATTATGTTCGATACCAAGGAAAATCCGTTTTG
GCTTCAAAAGATACGCGTCTTCTGATAAATAAATGGAAATTTTATCTTGTTAATTTATGTCAATGTCATTATTATGCGTGGTCTCAACC
GGAAAGGGTCTCTATAAACCGATTATTCAAGCATTCTCTCAACTTTTTGGGATATTTTTCAAGTGTGCGACTAAATCCTTCAGTGGTAC
GGAGTCAAATGTTGGAACAGTCGTTTATAATAGATAATGTTATGAAGAAACTCGATACGATAATTCCGATTATTCCTTTGATTGGATCA
TTGGCAAAATCGAAATTTTGTAACACATCGGGCTATCCCATTAGTAAGCCGACTTGGGCGGATTCGTCGGATTCTGATATTATGGACCG
ATTTGTGCGTATATACAGTAATCTTTCTCATTATTATAGGGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTATATCGAATAAATTATATACTTCGC
Sekvenca aminokiselina:
GEDASSLHLVRLFLYEYYKWNSLINSKNSSSIFWKSNPRLFLFLYNSHVYEYESILLFLSNQSSHLRSTSSRIFFERIYFYGKIEYLAK
IFANDFRGILWLLKDPFMHYVRYQGKSVLASKDTRLLINKWKFYLVNLCQCHYYAWSQPERVSINRLFKHSLNFLGYFSSVRLNPSVVR
SQMLEQSFIIDNVMKKLDTIIPIIPLIGSLAKSKFCNTSGYPISKPTWADSSDSDIMDRFVRIYSNLSHYYRGSSKKKSLYRINYILR
Ilustrativni matK barkod vrste O. acetosella.
XX
XX Phillyrea media – srednja komorika rbcL barkod
Phillyrea media L. – srednja komorika.
BOLD pristupni broj: ATG014-14
GenBank pristupni broj: KM527351
Nukleotidna sekvenca:
TGTTGCGATTCAAGCGGGTGTTAAGAGGAACAAATTGACTTATTATACTCCTGAATACGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT
TCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGCACATGGACAACTGTG
TGGACCGATGGACTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGGCGATGCTACCATATTGAGCCTGTTCCTGGAGAAGCAGATCAATATATCTG
TTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTGACTTCCATTGTAGGTAATGTATTTGGGTTCAAAG
CCCTGCGTGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAGTCCCTACTGCTTATATTAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGGGATCCAAGTTGAG
AGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTGTTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTATGGTAGAGC
AGTTTATGAATGTCTTCCCGGTGGTG
Sekvenca aminokiselina:
FGIKPGVKDYKLTYYTPDYITKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYNIEPVAGEENQYIC
YVAYPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPTAYTKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRA
VYECLRGGX
Ilustrativni rbcL barkod vrste P. media.
XXI
XXI Phillyrea media – srednja komorika matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG005-14
GenBank pristupni broj: KM527360
Nukleotidna sekvenca:
GGGTAAAAGATGCCTCTTCTTTGCATTTATTACGATTCTTTCTTCACGAGTATTGTAATTGGAATAGTCTTATTACTCCAAAGAAAGCC
AGTTCTTCTTTTTCAAAAAGGAATCAAAGATTATTCTTCTTCTTATATAATTCTCATGTATGTGAATACGAATCTATTTTCGTCTTTCT
ACGTAACCAATCTTCTCATTTACGATCAATATCTTCTGGAGCTCTTCTTGAACGAATATATTTCTATGGAAAAATAGAACGTCTTGTAG
ACGTCTTTGTTAAGGATTTTCAGACCAATCTATGCTTGTTCAAGGATCCTTTCATGAATTATGTTAGGTATCAAGGAAAATCAATTCTG
GCTTCAAAAGGGACGCCTCTTTTGATGAATAAATGGAAATATTACCTTGTAACTTTTTGGCAATGTTATTTTTCGCTGTGGTTTCATCC
AAGAAGGATTTATCTAAACCAATTATCTAATCATTCCCTTGAATTTGTGGGCTATCTTTCAAGTGTGCGACTAAACGCTTCAGTGGTAC
GGAGTCAAATTCTAGAAAATTCATTTCTAATCAATAATGCTATTAAGAAGTTCGATACTCTTGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCA
TTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAACGTACTAGGGTATCCCATTAGTAAGCCGGTTCGGGCTGATTTATCAGATTCTGATATTATTGATCG
ATTTTGGGCGTATATGCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGCGGATCTTCAAAAAAAAAGAGTTTGTATCGAATAAAGTATATACTTCGA
Sekvenca aminokiselina:
VKDASSLHLLRFFLHEYCNWNSLITPKKASSSFSKRNQRLFFFLYNSHVCEYESIFVFLRNQSSHLRSISSGALLERIYFYGKIERLVD
VFVKDFQTNLCLFKDPFMNYVRYQGKSILASKGTPLLMNKWKYYLVTFWQCYFSLWFHPRRIYLNQLSNHSLEFVGYLSSVRLNASVVR
SQILENSFLINNAIKKFDTLVPIIPLIGSLAKAKFCNVLGYPISKPVRADLSDSDIIDRFWAYMQKSFSLSQRIFKKKEFVSNKVYTSX
Ilustrativni matK barkod vrste P. media.
XXII
XXII Pistacia lentiscus – tršlja rbcL barkod
Pistacia lentiscus L. – tršlja.
BOLD pristupni broj: ATG013-14
GenBank pristupni broj: KM527352
Nukleotidna sekvenca:
GTTTGGGATCAAGCCGGGCGTTAAAGACTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATATAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT
TCCGAGTCACTCCTCAACCTGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCGGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
TGGACCGATGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACAACATTGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATATG
TTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAG
CCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAGGATCTACGAATCCCTACCGCGTATACAAAAACTTTCCAAGGACCACCACATGGGATCCAAGTTGAG
AGAGATAAATTGAACAAGTATGGACGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTAGGTTTATCCGCTAAGAACTACGGTAGAGC
TGTTTATGAATGTCTACGCGGTGGAC
Sekvenca aminokiselina:
VAIQAGVKRNKLTYYTPEYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVPGEADQYIC
YVAYPLDLFEEGSVTNMLTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRVPTAYIKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRA
VYECLPGGX
Ilustrativni rbcL barkod vrste P. lentiscus.
XXIII
XXIII Pistacia lentiscus – tršlja matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG004-14
GenBank pristupni broj: KM527361
Nukleotidna sekvenca:
GAGGTAAAGATGCCTCTTCTTTACATTTATTACGGTTCTTTCTACACGAGTATTTTAATTTGAATTGGAATAGTCTTAGTAATCCAAAG
AAATCTATTTCCTTTTTTTCAAAAAGTAATTCAAGATTATTCTTGTTCCTATATAATTCTCATGTATGTGAATATGAATCCATCTTCTT
TTTTCTCCGTAACCAATCTTCTCATTTACGATCAACATCTTCTGGAGTCCTTCTTGAGCGAATATATTTCTATCGAAAAGTAGAACATC
TTGTCGAAGTCTTGGCTAATGATTTTGATTTTCAGGACATCTTATGCTTGTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTAAATATCAAGGA
AAATCCATTCTGTCTTCAAAGGATACGCCTCTTCTGATGAATAAATGGAAATATTACCTTGTCAATTTATGGCAATCGCATTTTCACAT
GTGGTCTCAACCGGGAAGGGTTCATATAAAGCACTTCTACAAGCATTCTATCAACTTTCTGGGCTATCTTTCCAGTGTGCAACTAAATC
CTTTGTTGGTACGGAGTCAAATGCTAGAAAATTCATTTATCATAGATAAGGCTATGAAGAAGTTCGATACAACCGTTCCAATTATTCCT
CTGATTGGATCATTGACTAAGGCACGGTTTTGTAACACCTTAGGGCATCCCATTAGTAAGCCGACCCGGGCTGATTCCTCCGATTTTGA
TATTATTGACCGATTTGTGCGTATATGCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGCGGGTCCTCAAAAAAAAAGAGTTTGTATCGAATAAAAT
ATATACTTCGG
Sekvenca aminokiselina:
GKDASSLHLLRFFLHEYFNLNWNSLSNPKKSISFFSKSNSRLFLFLYNSHVCEYESIFFFLRNQSSHLRSTSSGVLLERIYFYRKVEHL
VEVLANDFDFQDILCLFKDPFMHYVKYQGKSILSSKDTPLLMNKWKYYLVNLWQSHFHMWSQPGRVHIKHFYKHSINFLGYLSSVQLNP
LLVRSQMLENSFIIDKAMKKFDTTVPIIPLIGSLTKARFCNTLGHPISKPTRADSSDFDIIDRFVRICRNLSHYHSGSSKKKSLYRIKY
ILR
Ilustrativni matK barkod vrste P. lentiscus.
XXIV
XXIV Quercus ilex – hrast crnika rbcL barkod
Quercus ilex L. – hrast crnika.
BOLD pristupni broj: ATG011-14
GenBank pristupni broj: KM527353
Nukleotidna sekvenca:
ATCAAGCTGGGTGTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATCAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCCTTCCGAGTA
ACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCCGAGGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCCACTGGGACATGGACAACTGTGTGGACTGA
CGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCGGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATTTATTGCTTATGTAG
CTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGATTCAAGGCCCTGCGC
GCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATTCTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGGGATAA
ATTAAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTAGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATG
AATGTCTCCGCGGTGGAT
Sekvenca aminokiselina:
QAGCKDYKLTYYTPDYQTKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVAGEENQFIAYVA
YPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPTSYSKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRAVYE
CLRGGX
Ilustrativni rbcL barkod vrste Q. ilex.
XXV
XXV Quercus ilex – hrast crnika matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG002-14
GenBank pristupni broj: KM527362
Nukleotidna sekvenca:
GGGGTGAAGATGCTTCTTATTTGCATTTATTGCGGTTCTTTCTTCATGAGTATTCTAATTGTAACAGTCTTATTATTACAAATAAATCT
CTTTCCATTTTTTCAAAAAGTAATCCGAGATTCTTTTTATTCCTATATAATTCTTATATATGTGAATACGAATCCATCTTCCTTTTTCT
CCGTAACCAATCTTCTCATTTACGATTAACATCTTCTGGAATCCTTTTTGAACGACTCTGTTTATATAGAAAAATAGAACATTTTGCCG
AAGTCTTTGCTAATGATTTTACGGGCATCCCATGCTTTCTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCAATTCTG
GCTTCCAAAGACACACCTCTTCTAATGAATAAATGTAAATCTTACCTTGTCAATTTATGGCAATGTCATTTTGATGTATGGTCTCACGC
GGCAAGTATCCGTACAAACCAATTATCCAAGCATTCCCTCGATTTTTTGAGTTACTTGTCAAGTGTTCGACGAAATCCTGCAGTGGTGC
GGAATCAAATGCTAGAAAATTCATTTCTACTAAATAATGCTCCCAATAAACTCGATACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCA
TTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAACGCAGTTGGGCATCCAATTAGTAAGCTGACTCGGGCCGATTTATCGGATTTTGAGATTATCAATCG
ATTTTTGCATATATGCAGAAATCTTTCTCATTATTACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGAATATGTATCGAATAAAATATATACTTCGG
Sekvenca aminokiselina:
GEDASYLHLLRFFLHEYSNCNSLIITNKSLSIFSKSNPRFFLFLYNSYICEYESIFLFLRNQSSHLRLTSSGILFERLCLYRKIEHFAE VFANDFTGIPCFLKDPFMHYVRYQGKSILASKDTPLLMNKCKSYLVNLWQCHFDVWSHAASIRTNQLSKHSLDFLSYLSSVRRNPAVVR
NQMLENSFLLNNAPNKLDTIVPIIPLIGSLAKAKFCNAVGHPISKLTRADLSDFEIINRFLHICRNLSHYYSGSSKKKNMYRIKYILR
Ilustrativni matK barkod vrste Q. ilex.
XXVI
XXVI Ruscus aculeatus – bodljikava veprina rbcL barkod
Ruscus aculeatus L. – bodljikava veprina.
BOLD pristupni broj: ATG015-14
GenBank pristupni broj: KM527354
Nukleotidna sekvenca:
GTTGCGATCACAGCTGGGTGTAAAGATTACAGATTGACTTATTATACTCCTGATTACGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT
CCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCCGCTGAAGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCCTCTACTGGTACATGGACAACTGTGT
GGATGGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGGCCGTTGTTGGGGAAGAAAATCAATATATTTGT
TATGTAGCTTATCCTTTATACCTTTTTGAAAAAAGGTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAAAGAATTTGGATTCCAACA
CCCCCCACAGTTTTCCCTGGGGCATCTGAGGAATCCGCCCCCGTATCCCCCGCTTCTTCGGCGGGGACTCCGGGGTGTTCAAGTTGAAA
CGGATAAGCTGCCCAAAAATTGGGATCTTTGGTTTGGAATCACGAGTATAATAAATCTGTTATCCTTAACACCACCTTACATCCCACAC
TTCGTTAGTCTCTGCGTGTGGGGGC
Sekvenca aminokiselina:
VAITAGCKDYRLTYYTPDYETKDTDILAAFRVTPQPGVPAEEAGAAVAAESSTGTWTTVWMDGLTSLDRYKGRCYHIEAVVGEENQYIC
YVAYPLYLFEKRSVTNMFTSIVGKEFGFQHPPQFSLGHLRNPPPYPPLLRRGLRGVQVETDKLPKNWDLWFGITSIINLLSLTPPYIPH
FVSLCVWGX
Ilustrativni rbcL barkod vrste R. aculeatus.
XXVII
XXVII Ruscus aculeatus – bodljikava veprina matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG006-14
GenBank pristupni broj: KM527363
Nukleotidna sekvenca:
GGATTAAAGGTTTCCCTTTTTTACATTTATTGCGGTTCTTTCTTCACGAATATCATAATTTGAATAGTCTTCTCATTACTCAGAAGAAA
TCGATTTACGTTTTTTCAAAAGAAAATAAAAGAGTATTTCGGTTCCTATACAATTTTTATGTATTTGAATGGGAATTTTTATTCGTTTT
TATTCGTAAACAATCCTCTTATTTACGATTAACATCTTCTGGAACCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGAAAAAATAGAACATCTTA
AAATAGAACATTTTGTAGTAGTATGTCGTAACTTTTTTCAGAGAACCCTATGGTTCTGCAAAGATCCTTTCATGCATTATGTTCGATAT
CAAGGAAAAGCAATTCTTGCTTCAAAGGGGACTCATCTTCTGATGAAGAAATGGAAATATCTTTTTTTCAATTTCTGGCAATATTATTT
TCATGTTTGGTCGCAACCGTACAGGATCCATATAAACCAATTATCAAACTATTCTTTTTATTTTCTGGGTTATCTTTCAAGTCTCCTAC
TCCATTTTTCGGCGGTAAGGAATCAAATGTTAAAGAATTCATTTCTAATAGATACCATTACTAAGAAATTTGATACCATAGTCCCAGTT
ATTTTTCTTATTGGATCTTTGGCTAAAGCGAAATTTTGTACTGTATCGGGCCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCGATTTATCGGA
TTCTGATATTCTTGATCGATTCGGTCGGATATGTAAAAATCTTTCTCATTATCATAGTGGATCCTCAAAAAAACAGAGTTTGTATCGAA
TAAAGTATATACTTCGA
Sekvenca aminokiselina:
IKGFPFLHLLRFFLHEYHNLNSLLITQKKSIYVFSKENKRVFRFLYNFYVFEWEFLFVFIRKQSSYLRLTSSGTFLERTHFYEKIEHLK
IEHFVVVCRNFFQRTLWFCKDPFMHYVRYQGKAILASKGTHLLMKKWKYLFFNFWQYYFHVWSQPYRIHINQLSNYSFYFLGYLSSLLL
HFSAVRNQMLKNSFLIDTITKKFDTIVPVIFLIGSLAKAKFCTVSGHPISKPIWTDLSDSDILDRFGRICKNLSHYHSGSSKKQSLYRI
KYILR
Ilustrativni matK barkod vrste R. aculeatus.
XXVIII
XXVIII Smilax aspera – crvena tetivika rbcL barkod
Smilax aspera L. – crvena tetivika.
BOLD pristupni broj: ATG016-14
GenBank pristupni broj: KM527355
Nukleotidna sekvenca:
GTTGGGATTACAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT
TCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCTGAAGAGGCAGGGGCAGCGGTAGCCGCAGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG
TGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATAGAGAGCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGC
TTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGCTCGGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGTTTCAAAG
CCCTACGAGCTCTACGTCTAGAGGATTTGCGAATTCCTACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCACCCCATGGCATCCAAGTTGAA
AGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACCATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAGAACTACGGTAGAGC
GGTTTATGAATGTCTGCGCGGGAGGG
Sekvenca aminokiselina:
LGLQAGVKDYKLTYYTPDYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIESVVGEENQYIA
YVAYPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPTSYSKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRA
VYECLRGRX
Ilustrativni rbcL barkod vrste S. aspera.
XXIX
XXIX Smilax aspera – crvena tetivika matK barkod
BOLD pristupni broj: ATG007-14
GenBank pristupni broj: KM527364
Nukleotidna sekvenca:
AGATTCAAGATGTTCCCTCTTTTACTTTATTGCGACTCTTTCTTCATAAATATCATAATTTGAATAGATTTATTACTCAGAATAAATCT
ATTTACGTTTTTTCAAAAGAAAATACAAGACTATTTCGCTTCCTGTATAATTCTTATGTAGCTGAATGTGAATTTTTATTAGTTTTTCT
TCGTAAACAATCCTATTATTTACGATCAACATCTTCTGGAACCTTTCTTGAACGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAACATATTCATA
TTATAGTAGTAGGGTGTCATAATTATTTTCAGAAGACCCTATGGCCCGTCAAGGGTCCTTTCATGCATTATGTTAGATATCAGGGAAAA
GCGATTCTAGCTTCAAGGGGGACCCATCTTCTGATGAAAAAATGGAGATATTACCTTGTTAATTTCTGGCAATATTATTTTAGCTTTTG
GTCTCAACCGTACAGGATCCATATAAACCAATTATCAAACTATTCCTTCTATTTTCTGGGGTATCTTTCAAGTGTACTAATAAATACTT
CAGCAATAAAGAATCAAATGCTAGAGAACTCATTTCTAATAGATACTGTTATTAATATTAACAAATTTGATACCATAGTCCCAATTATT
CCTCTTATTGGATCATTGTCTAAAGCGAAATTTTGTACTGCCTCAGGGCATCCTATTAGTAAGCCGATGTGGGCTGATTTATCAGATTC
TGATATTATTGATCGATTTGGTCGGATATGTGGAAATCTTTCTCATTATAAAAAGGGGATCTTCAAAAAAACAAAGTTTGTATCGAATA
AAGTATATACTTA
Sekvenca aminokiselina:
IQDVPSFTLLRLFLHKYHNLNRFITQNKSIYVFSKENTRLFRFLYNSYVAECEFLLVFLRKQSYYLRSTSSGTFLERTHFYGKIEHIHI
IVVGCHNYFQKTLWPVKGPFMHYVRYQGKAILASRGTHLLMKKWRYYLVNFWQYYFSFWSQPYRIHINQLSNYSFYFLGYLSSVLINTS
AIKNQMLENSFLIDTVININKFDTIVPIIPLIGSLSKAKFCTASGHPISKPMWADLSDSDIIDRFGRICGNLSHYKKGIFKKTKFVSNK
VYTX
Ilustrativni matK barkod vrste S. aspera.
Životopis
Osobni podaci:
Ime i prezime: Jakob Ćosić
Datum i mjesto rođenja: 17. siječnja 1989., Zagreb
Adresa: Vodička ulica 2, 10040 Zagreb
Mobitel: 091 5301 385
E-mail: [email protected]
Obrazovanje:
2011. – danas, Prirodoslovno – matematički fakultet, diplomski studij
eksperimentalne biologije, modul botanika
2008. – 2011., Prirodoslovno – matematički fakultet, Sveučilište u Zagrebu,
sveučilišni prvostupnik biologije
2003. – 2007., Prirodoslovna škola Vladimira Preloga, Zagreb, kemijski tehničar
Znanja i vještine:
Napredno poznavanje rada na računalu
Engleski jezik, napredno poznavanje u govoru, osnovno u pismu
Njemački jezik, osnovno poznavanje u govoru i pismu
Napredno poznavanje rada u laboratoriju
Vozačka dozvola B kategorije
Izrada herbara
Bavljenje planinarenjem
Ostalo:
Rad u ugostiteljstvu
Rad u skladištu
Pomoćni poslovi u tvornici tekstila
Sakupljanje geoloških uzoraka