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Tesis de Maestría
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DIVERSIDAD Y DISTRIBUCIÓN DE LA VARIACIÓN GENÉTICA
DENTRO Y ENTRE POBLACIONES DE ZAMIA LODDIGESII MIQ.
EN LA VERTIENTE DEL GOLFO DE MÉXICO
TESIS QUE PRESENTA FRANCISCO LIMÓN SALVADOR
PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS
Xalapa, Veracruz, México (2012)
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Aprobación final del documento de tesis de grado:
“Diversidad y distribución de la variación genética dentro y entre poblaciones de Zamia loddigesii Miq. en la vertiente del Golfo de México”
Nombre
Firma
Director
Dr. Jorge González Astorga _________________________
Comité Tutorial
Dr. Alejandro Espinosa de los
Monteros Solís _________________________
Dr. Francisco Vergara Silva _________________________
Jurado Dra. Carla Gutierrez Rodríguez _________________________
Dr. Fernando Nicolalde Morejón _________________________
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AGRADECIMIENTOS A Dios El presente estudio fue posible gracias a la beca número 58618, otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología para realizar mis estudios de maestría (2010-2012). A los miembros de mi comité tutorial, Dr. Alejandro Espinosa de los Monteros Solís y Dr. Francisco Vergara Silva, por su gran ayuda durante todo el proceso de la maestría, en sus correcciones y aporte de ideas a mi investigación. A los Doctores que formaron parte de mi jurado, Dra. Carla Gutierrez Rodríguez y Dr. Fernando Nicolalde Morejón por la revisión de mi texto y sus sugerencias para enriquecer el manuscrito. A la M. en C. Janet Nolasco Soto y al Dr. Fernando Nicolalde-Morejón, por toda su ayuda en la colecta en el campo y durante el trabajo de laboratorio. A Martha Osorio por el empeño en la revisión de mi documento y las correcciones al mismo. En especial al Dr. Jorge González-Astorga, quien desde el principio ha dirigido este proyecto de investigación, aportando las formas y los medios para lograr la realización de esta tesis. DEDICATORIA A mi esposa Faby, porque a lo largo de estos años ha estado a mi lado en todas las fases de este proceso, aportando ideas, aguantando mis quejas, desveladas y salidas. Por preocuparse por mí, de muchas formas y demostrarme así su amor en cada momento. A Zamia Sinaí, que aún no te conocemos, pero disfrutamos tu desarrollo todos los días. A mis padres Francisco Limón y Juanita Salvador porque siempre están al pendiente de mi. A Tatnai y a Topito. A mis amigos Ivan, Claus, Gabo, Moi, Nanche y Karina que aunque cada día los veo menos, siempre están ahí cuando más se necesitan. La mente inteligente adquiere sabiduría, y los oídos sabios van en pos de la ciencia.
Proverbios 18:15
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DECLARACIÓN
Excepto cuando es explícitamente indicado en el texto, el trabajo de investigación contenido
en esta tesis fue efectuado por Francisco Limón Salvador como estudiante de la carrera de
Maestro en Ciencias entre Septiembre del 2010 y Agosto del 2012, bajo la supervisión del
Dr. Jorge González Astorga.
Las investigaciones reportadas en esta tesis no han sido utilizadas anteriormente para
obtener otros grados académicos, ni serán utilizadas para tales fines en el futuro.
Candidato: Biól. Francisco Limón Salvador _____________________
Director de tesis:
Dr. Jorge González Astorga _____________________
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ÍNDICE RESUMEN………………………………………………………………………………………………………………….. 09 INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….…………………………………..……. 10 CAPÍTULO 1: MARCO TEÓRICO………………….………………….………………………….…………………. 13 1.1 Zamia loddigesii Miq. ………………….………………….…………………………….……………. 13 1.1.2 Distribución y Hábitat………………….………………….…………………..………. 14
1.1.3 Descripción botánica………………….………………….…………………………….. 15 1.2 Marcadores moleculares………………….………………….……………………………...…….. 15
1.2.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)………………….………………...……. 16 1.3 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN………………….………………….………………………..….…..…. 19 1.4 HIPÓTESIS …….………………….………………….………………….………………….………………….….… 20 1.5 OBJETIVOS……………………….………………….………………….………………….………………….….…. 21 1.5.1 Objetivo general………………….………………….………………….…………………….….…. 21
1.5.2 Objetivos específicos………………….………………….………………….………………...…. 21 CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS………………….………………….………………………..…..... 22 2.1 Fase de Campo………………….………………….………………….………………….……………….………. 22 2.1.1 Colecta de material vegetal………………….………………….……………………..…...... 23 2.2 Fase de Laboratorio………………….………………….………………….………………….………………… 23 2.2.1 Extracción y Purificación de DNA………………….………………….………………..…… 23 2.2.2 Amplificación de fragmentos de DNA mediante primers ISSR…………...…… 23 2.2.3 Visualización de productos amplificados………………….……………………….….... 24 2.2.4 Registro de datos………………….………………….…………………………………………….. 24 2.3 Análisis de datos………………….………………….………………….………………………………………… 25 2.3.1 Especificaciones metodológicas………………….………………….………………………. 25 2.3.2 Caracterización y lectura de los primers ISSR………………….………………………. 26 2.3.3 Composición genética de las poblaciones………………….……………………………. 26 2.3.4 Estructura genética………………….………………….………………………………….………. 27
2.3.5 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)………………….………………………....... 30 2.3.6 Distancias genéticas………………….………………….……………………………………...... 30 2.3.7 Análisis de agrupamiento………………….………………….…………………………………. 31 2.3.7.1 UPGMA………………….………………….………………….……………………....... 31 2.3.7.2 Neighbor-Joining (NJ)………………….………………….……………………..... 31 2.3.7.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)………………….………….. 32
2.3.8 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)…………………….…….….... 32 2.3.9 Prueba de Mantel………………….………………….………………….…………..…………... 33
CAPÍTULO 3: RESULTADOS………………….………………….………………….………………….……..….. 34 3.1 Amplificación de fragmentos de DNA mediante primers ISSR………………..…. 34 3.2 Registro de datos………………….………………….………………….…………………………... 35 3.3 Características y atributos de los primers ISSR………………….………………..…..… 35 3.4 Composición genética de las poblaciones………………….……………………..………. 37
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3.5 Estructura genética………………….………………….………………….………………..…….… 38 3.6 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)………………….……………………..………… 40
3.7 Distancias genéticas………………….………………….………………….…………………….…. 40 3.8 Análisis de agrupamiento………………….………………….………………….……………..… 41 3.8.1 UPGMA………………….………………….………………….………………….…….….. 41 3.8.2 Neighbor-Joining (NJ)………………….………………….………………….….…… 42 3.8.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)………………….……..…..... 43
3.9 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)………………….………………… 44 3.10 Prueba de Mantel………………….………………….………………….……………….……….. 45 CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN………………….………………….………………….………………….…………..…. 46 4.1 Características y atributos de los primers ISSR………………….…………………….... 48 4.2 Composición genética de las poblaciones………………….………………………..….… 51 4.3 Estructura genética………………….………………….……………………………………..……. 53 4.4 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)………………….……………………………… 56 4.5 Distancias genéticas………………….………………….………………….……………….….….. 61 4.6 Análisis de agrupamiento………………….………………….………………….………..……. 61 4.6.1 UPGMA………………….………………….………………….……………………………. 61 4.6.2 Neighbor-Joining (NJ)………………….………………….…………….……………. 62 4.6.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)……………..……………….. 62 4.7 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)………………...…..……………. 62 4.8 Prueba de Mantel………………….………………….………………….………..….…………….. 63
4.9 Implicaciones para la conservación………………….………………………………………… 65 4.10 Conclusiones………………….………………….………………….…………….….………………. 66
LITERATURA CITADA………………….………………….………………….………………….……..…………….. 69
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LISTA DE CUADROS Cuadro 2.1 Diferentes configuraciones usadas en la optimización del modelo……………. 29 Cuadro 3.1 Lista de primers utilizados en el análisis ISSR, temperatura de alineamiento, número de bandas y sus respectivas secuencias…………………………..………. 34 Cuadro 3.2 Concentraciones finales de los reactivos…………………………………………..………. 34 Cuadro 3.3 Condiciones de tiempo y temperatura de cada fase del PCR…………………..… 34 Cuadro 3.4 Características de las bandas dentro de las cinco poblaciones de Zamia loddigesii estudiadas en esta tesis………………………………………………………………… 36 Cuadro 3.5 Resumen de la variación genética en Zamia loddigesii…………………….……….. 37 Cuadro 3.6 Estimador de la diferenciación genética promedio (FST) entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México……………………....………..………………. 38 Cuadro 3.7 Índices para los cuatro modelos de Hickory (Holsinger y Lewis, 2003)…..…. 39 Cuadro 3.8 Resumen de la diversidad genética de Zamia loddigesii, de acuerdo a los análisis bayesianos…………………………………………………………………….............. 40 Cuadro 3.9 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) para las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México……………………………………………….…………………. 40 Cuadro 3.10 Estimadores de Distancia e Identidad genética de Nei entre pares de poblaciones en Zamia loddigesii………………………………………..……………………..…………….. 41 Cuadro 3.11 PCoA basado en distancias genéticas, porcentaje de variación explicado en los primeros tres ejes…………………………………………………………………..………….. 43 Cuadro 3.12 Resumen del Análisis Espacial de Varianza Molecular.……………………………. 44 Cuadro 3.13 Combinaciones usadas en la prueba de Mantel………………………………………. 45 Cuadro 4.1 Número de bandas entre especies de cícadas…………………………………………… 49 Cuadro 4.2 Comparación entre dos marcadores moleculares en las mimas poblaciones de Zamia loddigesii………………………………………………………………….. 53 Cuadro 4.3 Comparación de índices bajo dos enfoques………………………………………………. 55 Cuadro 4.4 Resumen de diferentes estudios usando marcadores moleculares………….. 58
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LISTA DE FIGURAS Figura 1.1 Zamia loddigesii. Tomado de Vovides et al. (1983)…………………………….………… 14 Figura 2.1 Ubicación de las poblaciones colectadas de Zamia loddigesii.…………….……... 22 Figura 2.2 Realce digital sobre las bandas amplificadas en varios primers de ISSR, en varios individuos de Zamia loddigesii………………………………………….…………….. 25 Figura 3.1 Electroforesis del Primer 835 de la población de Zamia loddigesii en Oaxaca, México, indicando su codificación………..……………..…………………………………… 35 Figura 3.2 Distribución de los atributos de las bandas entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México……………………………………………………………..…. 36 Figura 3.3 Distribución de los índices de diversidad en las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México……………………………………………………….……….. 38 Figura 3.4 Dendrograma usando la distancia sin sesgo de Nei (1978)………………………….. 41 Figura 3.5 Dendrograma de Zamia loddigesii, obtenido con el método de Neighbor-Joining……………………………………………………………………………………………….……. 42 Figura 3.6 Distribución en dos dimensiones de los 91 individuos de Zamia loddigesii mediante el análisis de coordenadas principales………………………………. 43 Figura 3.7 Agrupación de las poblaciones de acuerdo al SAMOVA………………………………. 45 Figura 4.1 Tendencia en las publicaciones con ISSR vs Aloenzimas…………………………..…. 48 Figura 4.2 Reconstrucción de escenarios…………………………………………………………………..… 68
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Diversidad y distribución de la variación genética dentro y entre poblaciones de Zamia loddigesii Miq. en la vertiente del Golfo de México RESUMEN
En México se han realizado estudios sobre genética de poblaciones en cícadas, éstos han aportado
información acerca de la diversidad y la estructura genética en los tres géneros que se distribuyen en
nuetsro país (i. e., Zamia, Ceratozamia y Dioon), los cuales han revelado que las cícadas mexicanas
poseen valores relativamente altos de diversidad genética comparadas con cícadas de otras regiones y
especies vegetales con características de vida similares. Estos estudios se han realizado básicamente con
marcadores aloenzimáticos, los cuales a pesar de aportar información muy valiosa, han venido a ser
reemplazados por marcadores moleculares de DNA. En el presente trabajo se usaron once marcadores
ISSR para estudiar la composición genética dentro y entre cinco poblaciones de Zamia loddigesii
abarcando su distribución natural, en la vertiente del Golfo de México. Se obtuvieron 472 bandas, en
algunos casos disminuyó su número gradualemente desde el norte al sur de la distribución de la especie.
A nivel de especie, el porcentaje de polimorfismo fue del 97.28%, el número de alelos fue 1.97 y el índice
de Shannon fue 0.38. Siguiendo aproximaciones convencionales y métodos bayesianos, se detectó una
estructura poblacional de entre 40 y 56% (FST, GST, θ y ɸST), el flujo génico estimado fue de 0.36. Los
análisis de agrupamiento diferenciaron escasamente a las poblaciones y la prueba de Mantel no fue
significativa. Comparaciones con un estudio previo con aloenzimas, muestra valores superiores y un
grado mayor de diferenciación entre poblaciones a lo reportado. Finalmente se propone un escenario
histórico basado en la información obtenida y se proponen planes de conservación para preservar la
diversidad genética de esta especie amenazada.
Palabras clave: Cícadas, Diversidad y Estructura Genética, ISSR, México, Zamia loddigesii
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INTRODUCCIÓN
El orden Cycadales es un grupo de plantas con semilla que está dentro de las gimnospermas, es
un linaje monofilético que surgió hace ca. 300 millones de años, entre el Carbonífero y el
Pérmico temprano (Jones, 1993; Norstog y Nicholls, 1997). Aunque es importante señalar que
las cícadas contemporáneas (ca. 331 especies, Stevenson et al., 2012) se originaron de procesos
de especiación ocurridos a finales del Mioceno – Plioceno (i.e., ca. 12 millones de años)
(Nagalingum et al., 2011), en este sentido su caracterización como ‘fósiles vivientes’ queda en
entredicho (Vergara-Silva et al., 2012).
Con respecto a su conservación, son junto con las cactáceas y las orquídeas, entre otras,
uno de los grupos de plantas más amenazados del planeta, ya que el 62% de sus especies
válidas, se encuentran amenazadas de extinción (Hoffman et al., 2010; Da Silva et al., 2012). En
México se encuentra la mitad de todas las especies de cícadas del continente y ocupa el
segundo lugar en diversidad a nivel mundial, con alrededor de 53 especies, seguido de Australia
(ca. 80 especies) (Nicolalde-Morejón et al., 2011; Stevenson et al., 2012). Nuestro país, además
de ser muy diverso en este grupo, posee un gran porcentaje de endemismos (ca. 90%), por lo
que es considerado un importante centro de diversidad del Neotrópico (Vergara-Silva et al.,
2012).
El género Zamia tiene ca. 71 especies (Stevenson et al., 2012), habita únicamente en el
continente americano, desde Georgia y Florida en Estados Unidos hasta Bolivia y el suroeste de
Brasil (Norstog y Nicholls, 1997; Stevenson, 2001; Nicolalde-Morejón et al., 2009). México
cuenta con 15 especies de este género (Nicolalde-Morejón et al., 2009).
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Zamia loddigesii Miq. es una especie endémica a México, con una amplia distribución,
presente en los estados de Tamaulipas, Hidalgo, Veracruz, Puebla, Oaxaca, Chiapas y Tabasco.
La especie se ha adaptado a diversos tipos de hábitat desde ambientes conservados (Bosque
Mesófilo de Montaña) hasta pastizales y lugares ampliamente perturbados, por lo que sus
poblaciones se han visto afectadas y reducidas en tamaño (Nicolalde-Morejón et al., 2009). De
acuerdo con la Lista Roja de Especies Amenazadas (Chemnick y Gregory, 2010a), Zamia
loddigesii está en la categoría NT (casi amenazada), por lo que a nivel nacional se ha establecido
legalmente su protección, así como a nivel internacional. Sin embargo, a pesar de ello, es muy
colectada por su uso como planta de ornato, destinada principalmente a mercados nacionales e
internacionales de coleccionistas.
Con el surgimiento de técnicas moleculares de DNA, una serie de marcadores han
surgido y se han aplicado en la caracterización de la variabilidad genética en especies de
plantas. En particular, los marcadores ISSR (‘Inter Simple Sequence Repeats’ por sus siglas en
inglés) han destacado por ser útiles en la identificación de variación genética entre y dentro de
poblaciones, por lo que han sido aplicados en estudios de genética de poblaciones (Hartl y Clark,
1997), lo cual permite conocer la diversidad y la estructura genética de las especies, así como
estimar las tasas de entrecruzamiento, la endogamia, el flujo génico, la selección natural y la
deriva génica (Lewontin, 1974) y a partir de esta información, inferir cómo los procesos
evolutivos han modulado la dinámica de los genes al seno de las poblaciones.
Debido a que Zamia loddigesii es una especie endémica con tamaños poblacionales
relativamente bajos y a los factores de riesgo a los que está sometida son extremos, es
importante disponer de información detallada de su diversidad, variación genética y estructura
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genética, ya que de esta manera se puede obtener información valiosa para proponer
programas de conservación y manejo sustentable (Yu et al., 2011).
Por lo que los objetivos del presente estudio son: a) evaluar la diversidad genética en las
poblaciones de Zamia loddigesii a lo largo de su distribución natural, utilizando como
herramienta marcadores ISSR; b) conocer la distribución de la variación genética dentro y entre
las poblaciones; c) estimar la correlación entre la diferenciación genética y la distancia
geográfica entre poblaciones; d) calcular el flujo génico entre poblaciones; e) con base en los
resultados obtenidos, diagnosticar los factores que están determinando la forma en cómo se
distribuye la variación dentro y entre las poblaciones de la especie; finalmente f) proponer
medidas de protección apropiadas a la especie, en base en los resultados obtenidos en esta
tesis.
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CAPÍTULO 1: MARCO TEÓRICO
Dentro del orden Cycadales, la Familia Zamiaceae está compuesta por ocho géneros (Chigua
D.W. Stev., Dioon Lindl., Encephalartos Lehm., Lepidozamia Regel, Macrozamia Miq.,
Ceratozamia Brongn, Microcycas A. DC. y Zamia L.) cuya distribución se da en las regiones
tropicales y subtropicales del planeta, i. e., África, Australia, América y Las Antillas (Stevenson,
1992).
Zamia es uno de los géneros más diversos desde diferentes contextos, es el segundo
género más numeroso con 71 especies, después de Cycas (107) (Stevenson et al., 2012), se
distribuye a lo largo de toda la región tropical y subtropical del continente americano (Nicolalde-
Morejón et al., 2011).
De igual manera, Zamia es uno de los géneros más complejos debido a su diversidad en
patrones de variación morfológica, ecológica, citológica y genética (Vovides et al., 1983; Vovides
y Olivares 1996; Marchant, 1968; Moretti y Sabato, 1984; Moretti, 1990a b; Moretti et al., 1991;
Norstog y Nicholls, 1997; Nicolalde-Morejón, 2009; Nicolalde-Morejón et al., 2009; González-
Astorga et al., 2006; Limón-Salvador, 2009).
1.1 Zamia loddigesii Miq.
Recibe su nombre en honor a Joachim Conrad Loddiges (1738-1826), proveedor de plantas
exóticas con sede en Londres, destacado monografista y sistematizador de las cícadas del siglo
XVIII, que mantenía una estrecha comunicación con Friedrich Anton Wilhelm Miquel (Haynes,
2009) quien la describió en 1843 (Aiton, 1789) (ver Figura 1.1). Coloquialmente se le conoce con
los nombres de Teocinte, Teocintle, Teosinte, Camotillo, Cocalito, Palmiche, Palmilla, Cihua,
Chacuhua (Bonta y Osborne, 2007) y Tzompollo (Contreras-Medina et al., 2003).
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Zamia loddigesii es una de las especies más colectadas dentro del género, junto con
Zamia furfuracea (Chemnick y Gregory, 2010b) es apreciada por coleccionistas por su facilidad
de manejo, crecimiento lento, así como a su resistencia a variaciones de temperatura y plagas.
1.1.2 Distribución y Hábitat
Es endémica a México, se distribuye en los
estados de Tamaulipas, Hidalgo, Veracruz,
Tabasco, parte de Oaxaca y con sólo una
localidad conocida en Chiapas (Nicolalde-
Morejón et al., 2009).
Al ser de amplia distribución, los
tipos de vegetación donde crece son
variados, incluyen bosque tropical lluvioso,
bosque tropical deciduo y sub-decíduo
(sensu Rzedowski, 1978), asimismo en
hábitats de sucesión secundaria como
pastizales y cultivares (Nicolalde-Morejón
et al., 2009) y conservados como el bosque
mesófilo de montaña (Contreras-Medina et al., 2003).
Comparte su distribución con otras seis especies (i. e., Zamia cremnophila, Z. katzeriana,
Z. lacandona, Z. purpurea, Z. polymorpha y Z. spartea) y se encuentra en altitudes que van
desde el nivel del mar hasta los 1000 m s.n.m. (Nicolalde-Morejón, 2009).
Figura 1.1 Zamia loddigesii. Tomado de Vovides et al., (1983)
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1.1.3 Descripción botánica
Es una planta con un tallo hipógeo, de ramificación dicotómica con la edad, de 10-45cm
longitud, 8-15cm de diámetro, catáfilas cartáceas, persistentes, de base triangular, de 8.4-3.7cm
a la base, amarillento tomentoso. Hojas 2-3 (4) ascendiendo a separarse, de 45-96 x 30-41cm,
verde claro cuando emergen, verde a verde oscuro cuando maduras, peciolo de 15-25cm
longitud, verde en hojas jóvenes, subterete, armado con espinas de hasta 4mm de longitud,
raquis subterete de hasta 57cm de longitud, foliolos 12-23 pares, sésiles, coriáceos, linear-
lanceolados, de opuestos a subopuestos, base atenuada, márgenes serrulados (Nicolalde-
Morejón et al., 2009). Su número cromosómico diploide es 18 (Norstog, 1980; Moretti, 1990b).
Aunque todas las cícadas se encuentran protegidas por convenios internacionales y
nacionales (INE-SEMARNAP, 2000; Donaldson, 2003; IUNC, 2012; UNEP-WCMC, 2012), en la
práctica existe poco o nulo cuidado en el manejo y protección de Zamia loddigesii, por lo que
sus poblaciones son muy vulnerables a cambios de uso de suelo, extracciones ilegales y
reducción de su hábitat (Vázquez-Torres et al., 1999; González-Astorga et al., 2006; Osborne y
Vovides, 2007; Chemnick y Gregory, 2010a).
Por lo anterior es de suma importancia conocer la distribución de la variación genética
dentro y entre las poblaciones de Zamia loddigesii para poder entender y explicar patrones
evolutivos así como para plantear con ello acciones de conservación (Vovides et al., 2002).
1.2 Marcadores moleculares
El advenimiento de técnicas moleculares mostró claramente sus ventajas sobre los marcadores
morfobioquímicos en el análisis de la diversidad genética de las poblaciones. Debido a que los
marcadores moleculares son estables e independientes del entorno (temporal y espacialmente),
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han venido a reemplazar a los caracteres fenotípicos para detectar variación genética, no solo
entre poblaciones, sino también entre individuos dentro de poblaciones (Azofeifa-Delgado,
2006). Además, permiten seleccionar regiones concretas del DNA, para ello el número de
polimorfismos detectables es teóricamente ilimitado y permiten analizar tanto la información
que se expresa fenotípicamente como la que no es expresada (Jiménez y Collada, 2000).
Bajo este principio, se han desarrollado muchas técnicas moleculares, el primer
marcador que se aplicó a plantas fueron los Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
(Beckman y Soller, 1983) y desde entonces el desarrollo de marcadores basados en PCR
aplicados a plantas ha crecido, entre ellos están los Random Amplification of Polymorphic DNA
(RAPD) (Williams et al., 1990); los Microsatélites (SSR) (Ali et al., 1986), los Amplified Fragment
Length Polymorphism (AFLP) (Vos et al., 1995) y los Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)
(Zietkiewicz et al., 1994), principalmente.
Cada uno de estos marcadores moleculares tiene ventajas y desventajas para un estudio
determinado, así la selección de la mejor técnica a utilizarse depende de los objetivos
planteados, del material que se analizará y del tipo de datos y resultados esperados.
1.2.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)
Los ISSR (Inter Secuencias Simples Repetidas) son un tipo de marcadores genéticos, que
permiten obtener la variación en regiones de DNA entre los microsatélites que se encuentran
dispersas en todo el genoma, particularmente en el núcleo (Zietkiewicz et al., 1994). Los
microsatélites son secuencias de DNA pequeñas (generalmente de 16 a 25 pares de bases) e
hipervariables, se expresan como disimilitudes en las poblaciones y se caracterizan por ser
repeticiones de mono, di, o trinucleótidos (Wolfe et al., 1998). Los ISSR son marcadores
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dominantes que se encuentran entre regiones de microsatelites, los “primers” diseñados para
obtener estos marcadores son los propios microsatélites (secuencias simples repetidas de di o
trinucleótidos) anclados a la terminación 3’ o 5’ del microsatélite con uno a tres nucleótidos
(Zietkiewicz et al., 1994; Grupta et al., 1994; Wolfe y Liston, 1998). El principio de los ISSR es que
los sitios complementarios del “primer” están dispersos en todo el genoma, así, hay altas
probabilidades de que el primer se una a dos sitios localizados en hebras opuestas de DNA
dentro de una distancia amplificable (Zietkiewicz et al., 1994; Culley y Wolfe, 2001). El primer es
complementario a una región microsatélite blanco y el nucleótido extra permite que ocurra la
amplificación, siempre y cuando el “primer” se pegue a la terminación del microsatélite con un
primer del nucleótido disponible en la secuencia flanqueadora. Los nucleótidos extras juegan el
papel de anclas y aseguran que la amplificación inicie siempre del extremo 3’ o 5’ del
microsatélite. Así, el primer localiza dos regiones microsatélite separadas por una secuencia
genómica amplificable del DNA blanco, por lo que la reacción de PCR generará una banda de
tamaño particular (i.e., su peso molecular en pares de bases) para ese locus, representando la
secuencia de DNA que se encuentra entre los microsatélites, i.e. el ISSR (Bornet y Branchard,
2001).
Con frecuencia estas amplificaciones de un solo primer propicia altos niveles de bandas
polimórficas (Wolfe y Liston, 1998; Culley y Wolfe, 2001), para ello las bandas obtenidas son
analizadas como marcadores dominantes, lo cual significa que cada banda corresponde a un
locus (Wolfe, 2005). Así, la presencia de la banda representa el genotipo dominante (tanto
homócigo, como heterócigo), mientras que su ausencia representa el genotipo homócigo
recesivo. Esto es válido si se asume que solamente existen dos alelos por locus.
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Los ISSR son usados en estudios de variabilidad genética en poblaciones naturales
debido a que no se requiere información previa del genoma, su implementación tiene bajo
costo y los procedimientos de laboratorio son fácilmente transferibles a cualquier especie, así
como su alta reproducibilidad, debido principalmente a las altas temperaturas de alineación de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Zietkiewicz et al., 1994; Wolfe et al., 1998; Wang,
2010). Además, para diseñar los primers no es necesario tener la información a priori de
secuencias del genoma de las poblaciones bajo estudio (Godwin et al., 1997), por lo que se ha
utilizado ampliamente en investigaciones de variación genética entre grupos de individuos
filogenéticamente cercanos (Bornet y Branchard, 2001), así como en la identificación de
variedades dentro de especies (Nagaoka y Ogihara, 1997; Wolfe et al., 1998).
Las investigaciones que abordan el estudio de la diversidad y la estructura genética en
cícadas utilizando marcadores enzimáticos han mostrado que aunque son, en general especies
con distribución restringida, su diversidad genética en promedio es mayor a lo esperado en
otras especies con las mismas características biológicas (Hamrick y Godt, 1996; Dioon edule:
González-Astorga et al., 2003; Dioon angustifolium: González-Astorga et al., 2005; Zamia
loddigesii: González-Astorga et al., 2006; Dioon sonorense, D. tomasellii y D. holmgrenii:
González-Astorga et al., 2008; Dioon caputoi y D. merolae: Cabrera-Toledo et al., 2010).
Respecto a marcadores moleculares de DNA, existen pocos estudios realizados en
cícadas, los que se han realizado han sido en cícadas del continente asiático y recientemente en
África; sin embargo, hasta el momento no existen trabajos publicados que aborden el estudio
de la diversidad y estructura genética que utilicen marcadores moleculares de DNA en especies
de cícadas en México, por lo que el presente trabajo también proveerá información novedosa a
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nivel de DNA para el género de Zamia y los resultados, discusión y conclusiones surgidas de esta
investigación incrementarán nuestro conocimiento sobre la biología evolutiva de la cícadas.
1.3 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN
Zamia loddigesii, es una de las especies de más amplia distribución en México, pero también es
una especie que se han reducido sus poblaciones naturales, lo cual ha influido en una
disminución de su diversidad genética y un incremento en la diferenciación genética entre las
poblaciones remanentes, generándose un fuerte aislamiento genético entre sus poblaciones
(González-Astorga et al., 2006); con base en lo anterior, en este trabajo de tesis, nos
preguntamos: ¿cuál será la manera en qué los marcadores de DNA ISSR detectarán este efecto?,
esto con relación a lo detectado con otro tipo de marcador molecular como lo son las
isoenzimas, esto a nivel de la diversidad y la estructura genética de las poblaciones remanentes
de Zamia loddigesii en estado natural.
De igual forma se ha probado que usando isoenzimas Zamia loddigesii posee valores
relativamente altos de diversidad genética, otros estudios utilizando marcadores de DNA, han
revelado mayores niveles de polimorfismo que los registrados con marcadores de isoenzimas,
entonces la pregunta es si, ¿obtendremos índices de diversidad superiores a los ya reportados
para la misma especie?
20
1.4 HIPÓTESIS
Se espera que los niveles de diversidad genética en Zamia loddigesii detectados con ISSR
sean superiores a los reportados con isoenzimas (González-Astorga et al., 2006), debido
a que los marcadores de DNA tienden a ser más neutros que las enzimas, ya que estas
últimas están más expuestas a la acción de la selección natural.
Se espera que la estructura genética en las poblaciones de Zamia loddigesii evaluada con
ISSR sea mayor que lo reportado con isoenzimas, como se ha detectado en Cycas
guizhouensis (Xiao et al., 2004), debido a que con los marcadores moleculares de DNA se
está evaluando variación genética que ha estado expuesta durante mayor tiempo al
efecto de la mutación, a la reordenación del genoma, a la fluctuación aleatoria de las
frecuencias alélicas (i.e., deriva génica), principalmente, en tanto que los marcadores
isoenzimáticos son más conservados, ya que debido a su alto efecto funcional, puede
“purgar” las mutaciones que cambien el efecto funcional de la enzima respecto al
sustrato. Por lo anterior, cabría esperar que la diferenciación genética (FST o GST) sea
mayor evaluada con ISSR que con isoenzimas.
21
1.5 OBJETIVOS
1.5.1 Objetivo general
Evaluar la diversidad y distribución de la variación genética dentro y entre poblaciones de Zamia
loddigesii a lo largo de su rango de distribución natural utilizando para ello marcadores ISSR.
1.5.2 Objetivos específicos
Obtener el porcentaje de loci polimórficos (P), el número promedio de alelos por locus
(A), la diversidad genética de Nei (HE) y el índice de diversidad de Shannon (I).
Evaluar la distribución de la variación genética entre y dentro de las poblaciones,
utilizando los estimadores: FST o GST y análisis molecular de varianza (AMOVA).
Calcular las distancias genéticas entre las poblaciones.
Determinar el flujo génico entre las poblaciones.
Estimar la correlación entre la diferenciación genética y la distancia geográfica entre las
poblaciones.
Realizar análisis de agrupamiento para determinar las relaciones entre las poblaciones
estudiadas.
Analizar la correlación entre la distribución genética y la espacial, mediante un SAMOVA
Diagnosticar los factores que influyen en la estructura genética de la especie.
Proveer medidas de protección apropiadas a la especie, en base a su información
genética.
22
CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Fase de Campo
Para el desarrollo de esta tesis, se muestrearon cinco poblaciones de Zamia loddigesii: una en el
estado de Tamaulipas, dos en Veracruz, otra más en Oaxaca y la última en Tabasco, en todo este
rango incluye toda la distribución geográfica de la especie, las ubicaciones se señalan en la
Figura 2.1, las colectas se hicieron entre las altitudes de los 85 y los 250 m s.n.m.
Figura 2.1 Localización de las poblaciones colectadas de Zamia loddigesii.
23
2.1.1 Colecta de material vegetal
Se tomaron entre tres y cinco foliolos de cada individuo, estas muestras fueron etiquetadas
individualmente y guardadas en nitrógeno líquido para evitar la degradación del DNA.
Finalmente las almacenamos, para su posterior análisis, en un ultracongelador a -70°C.
2.2 Fase de Laboratorio
La parte experimental se realizó en el Laboratorio de Genética de Poblaciones, del Instituto de
Ecología (INECOL) A. C. campus Xalapa, Veracruz, durante los meses de Febrero a Julio del 2011.
2.2.1 Extracción y Purificación de DNA
Con la ayuda de un mortero maceramos individualmente con nitrógeno líquido todas las
muestras hasta pulverizarlas. Se siguió el protocolo de extracción DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,
2006) que, a diferencia del método CTAB ofrece la ventaja de no requerir de una extracción con
Fenoles o Cloroformo, además de ser más rápido (Haymes et al., 2004). Al terminar, se tomaron
3ul de DNA y 2.5ul de Ficol de cada individuo y fueron colocados en geles de Agarosa al 1%,
éstos se corrieron por 40 minutos a 150V x 50mA, para comprobar la calidad de las
purificaciones. Finalmente todas las muestras las almacenamos en tubos etiquetados a una
temperatura de -20°C en un congelador Fagor.
2.2.2 Amplificación de fragmentos de DNA mediante primers ISSR
Para la amplificación de fragmentos de DNA fueron probados 100 primers ISSR procedentes de
la serie No. 9 de la Unidad de Servicios de Proteínas y Ácidos Nucleicos de la Universidad de
Columbia Británica, Vancouver, Canadá. Los resultados dudosos o poco visibles fueron repetidos
y realizamos todos los ensayos con un control negativo que contenía todos los reactivos de la
PCR excepto la solución de DNA, para comprobar la ausencia de contaminación en los reactivos.
24
Todas las reacciones de PCR las hicimos en un termociclador Biometra T-personal (Whatman
Biometra, Goettingen, Alemania).
También realizamos ensayos para determinar las concentraciones óptimas de Cloruro de
Magnesio, Buffer, DNTPs, Taq Polimerasa, Templado de DNA y de los Primers. El número de
ciclos y las temperaturas de alineamiento para cada primer fueron optimizados en una
termocicladora de gradientes “MasterCycler Gradient” (Eppendorf International).
2.2.3 Visualización de productos amplificados
Separamos los productos obtenidos del PCR por medio de electroforesis en geles de agarosa al
1%, utilizando TBE 0.5X como buffer de corrida con un pH de 8.4.
En cada población se colocó también 3μl de una escalera o ladder (Quiagentm) de peso
molecular conocido para calcular el tamaño en pares de bases de los diferentes loci
amplificados. Las muestras fueron corridas a 150V y 50mA por una hora y se les agregó bromuro
de etidio para ser visualizados con luz UV. Al terminar la corrida electroforética cada gel fue
visualizado y registrado con una cámara digital Canon Power Shot A650 IS con filtro UV.
2.2.4 Registro de datos
De la colección de fotografías agrupamos todas las poblaciones por primer de ISSR, usando los
pesos moleculares como referencias; fueron registradas las bandas amplificadas para cada
individuo y cada primer; adicionalmente se realizó un tratamiento digital a las fotografías con el
fin de discriminar mejor las bandas (Figura 2.2), el cual consistió en un contraste (emboss) en el
que cada pixel de la imagen, se sustituye, ya sea por un resalte o una sombra, dependiendo de
la luz u obscuridad de los límites de la imagen original, generando un relieve entre las bandas,
del fondo obscuro o de los barridos del corrimiento del gel.
25
Figura 2.2 Realce digital sobre las bandas amplificadas en varios primers de ISSR, en varios individuos de Zamia loddigesii.
A la presencia de una banda se asignó el valor “1”, mientras que las ausencias se
registraron con “0” (Wolfe, 2005). Las bandas poco definidas o de difícil interpretación no
fueron consideradas en el registro de datos. Se construyó una matriz binaria con todos los datos
y ésta fue utilizada para todos los diferentes paquetes de análisis, realizando algunos ajustes de
formato cuando fuera necesario.
2.3 Análisis de datos
Los ISSR son marcadores moleculares dominantes, esto es, que no se pueden distinguir
directamente individuos heterocigotos, de homocigotos dominantes (González y Aguirre, 2007),
lo que genera una dificultad para calcular las frecuencias alélicas a partir de estos resultados.
Asimismo, la ausencia de una banda puede interpretarse como pérdida del locus a través de
inserción o deleción del sitio, una mutación o de rearreglos cromosómicos (Wolfe y Liston,
1998; González y Aguirre, 2007).
2.3.1 Especificaciones metodológicas
Los análisis estadísticos se realizaron asumiendo que las poblaciones se encuentran en
26
Equilibrio Hardy-Weinberg (EHW), esto se debe a la naturaleza de los marcadores y la
imposibilidad de distinguir homocigotos recesivos, esta asunción debe ser hecha para la
mayoría de programas en genética de poblaciones que analizan datos de marcadores
dominantes y generalmente utilizan la corrección de Lynch y Milligan (1994) para reducir el
sesgo.
2.3.2 Caracterización y lectura de los primers ISSR
A partir de la matriz binaria se obtuvo el número de bandas por individuo, el número de bandas
polimórficas, el número de bandas fijas (dentro de la población y a nivel especie) y el número de
bandas privadas, esto es el número de bandas que son únicas a una sola población, utilizando el
programa FAMD v1.25 (Schlüter y Harris, 2006). Además se obtuvo el número de bandas para
toda la población y el número de bandas comunes (con una frecuencia mayor o igual a 5%) con
el programa GenAlEx v6.41 (Peakall y Smouse, 2006).
2.3.3 Composición genética de las poblaciones
Dentro de una especie se encuentran tanto diferencias genéticas entre poblaciones, como entre
los individuos dentro de poblaciones. Estas diferencias pueden surgir como resultado de la
acción de procesos aleatorios, que aunado al flujo génico puede generar una nueva población,
proceso que Wright (1978) nombró ‘efecto del fundador’, en estas poblaciones que en general
tienen tamaños efectivos relativamente inferiores a la población o poblaciones originales es
probable que se fijen o se pierdan alelos debido al efecto del azar, proceso que se le conoce
como deriva (Templeton, 1991). También, las diferencias entre poblaciones pueden surgir de
manera sistemática, especialmente si el entorno en varios lugares expone a los individuos a
diferentes óptimos para su supervivencia y reproducción, estas divergencias son especialmente
27
fuertes y rápidas, cuando existe poco flujo génico entre las poblaciones, por ejemplo en plantas
debido a la dispersión limitada de semillas o polen o por barreras fisiográficas; así con el
transcurrir de las generaciones, esas diferencias entre, eventualmente se acumularán y
resultarán en el desarrollo de una nueva especie (Templeton, 2006).
La diversidad genética evaluada en esta tesis se basó en estimadores que incorporan la
variación de alelos dentro de las poblaciones así como la divergencia de las poblaciones. Para
ello se calculó: el número observado de alelos (Na) y el número efectivo de Alelos (Ne), donde
este último se refiere a los alelos con capacidad de pasar a la siguiente generación (Kimura y
Crow, 1964). El índice de diversidad genética de Nei (HE) (Nei, 1973), esto es la heterocigosidad
esperada para la diversidad dentro de las poblaciones (HS) y a nivel de especie (HT); el número
de loci polimórficos (NLP) y el índice de información de Shannon (I), éste índice no asume que
haya equilibrio en Hardy-Weinberg (Lewontin, 1972), los análisis fueron realizados con el
programa Popgene versión 1.31 (Yeh et al., 1999). Se estimó también, el Porcentaje de Loci
Polimórficos (PLP), con respecto al número promedio de loci examinados, éste análisis se
calculó usando el programa TFPGA versión 1.3 (Miller, 1997).
2.3.4 Estructura genética
El perfil genético del total de las poblaciones típicamente varía de un lugar a otro a través del
rango de la especie, esto podemos verlo reflejado en el grado de diferenciación entre las
poblaciones, el cual puede ser calculado siguiendo uno o varios estadísticos. Los dos métodos
más usados para marcadores moleculares de tipo dominante son el índice de fijación de Wright
(FST) (Wright 1969, 1978) y el coeficiente de variación genética de Nei (Gst) (Nei, 1973) estos
índices son funciones de como la heterocigosidad es particionada dentro y entre poblaciones.
28
El índice de fijación (FST), mide el efecto de las divisiones de una población en la
heterocigocidad de las subpoblaciones debido a la deriva génica. Este coeficiente es el más útil y
el más utilizado para determinar las divergencias genéticas entre las subpoblaciones. El índice
FST es siempre positivo. Tiene un valor cercano a 0 cuando no hay subdivisión (i. e., con
apareamientos al azar) por lo que no existen divergencias genéticas entre las poblaciones; y
tiene un valor cercano a 1 cuando existe subdivisión extrema (aislamiento completo), de
manera que valores de FST menores a 0.05 indican una diferenciación genética insignificante,
mientras que valores mayores a 0.25 muestran una diferenciación genética significativa entre
las poblaciones.
Para estimar el grado de diferenciación genética entre las poblaciones (FST de Wright), se
utilizó el método de Weir y Cockerham (1984) donde el índice θ (theta) corresponde al
coeficiente FST. Con los datos de las cinco poblaciones estudiadas, se utilizó el programa TFPGA
versión 1.3 (Miller, 1997) para estimar el valor de θ; para esto se realizó un análisis ‘Jackknife’
(i.e., réplicas de eliminación secuencial de loci) a todos los datos para obtener estimados de
varianza, así como un ‘Bootstrap’ sobre todos los loci para obtener uno intervalos de confianza
al 95% y 99%.
La medida de diferenciación genética a través de los loci (GST), es un índice que ha sido
usado ampliamente para describir la estructura genética de las poblaciones, con especial
enfoque en los efectos de la deriva génica y migración, que son fuerzas evolutivas que reflejan
las características demográficas que se encuentran bajo selección neutral y se espera que
afecten a todos los loci de la misma forma (Ryman y Leimar, 2009). Tiene además la propiedad
de ser utilizado para uno o varios loci, no necesita de un número especifico de poblaciones y el
29
estadístico es relativamente responsable de cambios en las frecuencias alélicas en el tiempo
(Falk et al., 2001), éste análisis fue realizado con el programa Popgene, de Yeh et al., (1999)
versión 1.31. A partir del resultado, se calculó también el flujo génico (Nm) como: Nm = ¼ (1/GST
- 1).
Debido a la naturaleza dominante de los ISSR se utilizó el método de análisis propuesto
por Holsinger et al., (2002) implementado en el programa Hickory version 1.1, el cual no asume
que las poblaciones están en equilibrio Hardy-Weinberg (Holsinger y Wallace, 2004), y estima
análogos bayesianos de FST y FIS, designados como θ-II (Theta II) y f, respectivamente (Holsinger
y Wallace, 2004). Este programa permite la estimación de cuatro diferentes modelos; el primero
es un modelo completo en el que θ-II y f son estimados simultáneamente. Después utiliza dos
modelos alternativos que asumen que no hay endogamia dentro de las poblaciones (f = 0) y que
no hay estructura entre las poblaciones (θ-II = 0). Finalmente, el cuarto modelo permite que la
estimación de f varíe conforme avanza el modelo. Al mismo tiempo se calcula la heterocigosidad
local y total (HS y HT, respectivamente) con lo que se obtiene la GST sobre la misma matriz de
datos.
El programa corre los cuatro modelos probando diferente número de iteraciones (ver
Cuadro 2.1), y del modelo seleccionado se realizaron al menos diez repeticiones para comparar
los resultados, los valores fueron muy similares
Cuadro 2.1 Diferentes configuraciones usadas en la optimización del modelo.
nBurnin nSample thin
Test1 20000 10000 10
Test2 50000 50000 50
Test3 50000 100000 50
Test4 50000 250000 50
Test5 100000 1000000 50
30
Posteriormente, los modelos probados fueron comparados usando el criterio de
información de la Desviación (DIC) que combina una medición de ajuste del modelo (Dbar) con
uno de complejidad del modelo (pD, número efectivo de parámetros). Lo modelos con menor
valor de DIC son los elegidos, pero es requerida una diferencia de más de seis unidades para que
el modelo esté estadísticamente soportado (Holsinger et al., 2002).
2.3.5 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)
El grado de diferenciación dentro entre poblaciones puede ser evaluado mediante el AMOVA,
este es utilizado para determinar la varianza total existente entre individuos dentro de
poblaciones y entre las poblaciones, y puede ser realizado a partir de una matriz de distancias
genéticas (Excoffier et al., 1992). Para ello, el estimador ФST del AMOVA es análogo del
estadístico FST. El AMOVA, se hizo en el programa Arlequin version 3.1 (Excoffier y Schneider,
2005) usando 10,000 permutaciones y los intervalos de confianza fueron obtenidos con un
bootstrap de 10 mil iteraciones.
2.3.6 Distancias genéticas
El cálculo de distancias o identidades genéticas es muy útil para tener una idea general de que
tan similares (o diferentes) son las poblaciones; las matrices de identidades y distancias
genéticas entre poblaciones fueron construidas con el método original de Nei (1972) para
medidas de distancia e identidades que considera a los cambios en las frecuencias alélicas
derivados tanto de mutaciones como de efectos de deriva genética. Asimismo se utilizó el
estimador no sesgado de Nei (1978), ambas frecuencias fueron estimadas con el método de
expansión de Taylor de Lynch y Milligan (1994), recomendado para marcadores dominantes y
que considera que las poblaciones están en equilibrio de Hardy-Weinberg, esto, utilizando el
31
software TFPGA versión 1.3.
También se construyó una matriz utilizando el coeficiente de Dice (1945), debido a que éste
excluye de su análisis la ausencia de bandas y además no se asume el equilibrio Hardy-Weinberg
(Meyer et al., 2004; Dalirsefat et al., 2009).
2.3.7 Análisis de agrupamiento
A partir de las distancias genéticas, se construyeron dos árboles para conocer la estructura de
agrupamiento de los datos, los cuales dieron lugar a representaciones visuales de las relaciones
genéticas existentes entre los individuos analizados (Hollingsworth y Ennos, 2004). Para ello
seguimos dos aproximaciones, estas fueron: el método no ponderado de apareamiento de
grupos a través de la media aritmética (UPGMA) y el análisis del vecino más cercano o Neighbor-
Joining.
2.3.7.1 UPGMA
El UPGMA (‘Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean’ por sus siglas en ingés),
agrupa a los individuos en forma aglomerada y jerárquica con base los promedios de similitud,
como resultado de ello se obtiene un dendrograma, mediante el cual se puede observar la
formación de grupos a distintos valores de similitud. El UPGMA se elaboró basado en las
distancias genéticas de Nei (1978), utilizando el software TFPGA versión 1.3, este programa
permite realizar un bootstrap a los datos y arroja “índices de consistencia” que permiten inferir
la fuerza relativa de los nodos producidos, calculados para cada nodo generado por el set de
datos originales (Miller, 2007).
2.3.7.2 Neighbor-Joining
El análisis de Neighbor-Joining o del vecino más cercano permite determinar a los individuos
32
que se encuentran más y menos relacionados entre sí dependiendo de sus similitudes. La
cercanía de dos individuos y el hecho de que se formen de una misma rama indican el grado de
similitud entre ellos. Para este análisis, utilizamos el método Neighbor-Joining (Saitou y Nei,
1987) implementado en el software MEGA v5.0.1. El cual produce un árbol sin raíz, porque no
requiere asumir una tasa de evolución constante, que a diferencia del UPGMA produce árboles
enraizados y requiere presuponer una tasa constante de evolución, es decir, se asume un árbol
en el que las distancias desde la raíz a cada extremo de las ramas son iguales.
2.3.7.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)
Además se realizó un Análisis de Coordenadas Principales (PCoA), que permite conocer el
patrón de agrupamiento de todos los individuos en el espacio. El PCoA utiliza directamente la
información de los datos reunidos en la matriz de similitud genética, para extraer información
relevante y así generar nuevas variables denominadas como componentes principales. Este
análisis se llevó a cabo en FAMD (‘Fingerprint Analysis with Missing Data’ por sus siglas en
inglés) versión 1.23 beta, utilizando como medida de distancia el coeficiente de Dice. También
se construyó en GenAlex (Genetic Analysis in Excel) versión 6.2, ya que dicho software, permite
observar en los primeros tres ejes, el porcentaje de variación que es explicada por cada uno.
2.3.8 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)
Se realizó un Análisis Espacial de la Varianza Molecular (SAMOVA) (Dupanloup et al., 2002),
usando el programa SAMOVA versión 1.0. Este análisis, maximiza la proporción de varianza
genética total debida a diferencias entre grupos de poblaciones y minimiza la varianza dentro de
estos, llegando a definir grupos e identificando la presencia de barreras genéticas entre estos
grupos, permitiendo inferir posibles barreras genéticas que expliquen el aislamiento entre
33
grupos de poblaciones. El SAMOVA utiliza al AMOVA y datos de información geográfica, e
involucra la definición de grupos de poblaciones sin la necesidad de una delimitación a priori,
maximizando la diferenciación entre poblaciones (Excoffier et al., 1992). La significancia de la
varianza de componentes de ФCT (entre grupos), ФSC (entre poblaciones dentro de grupos) y ФST
(dentro de poblaciones) fue probada usando 10,000 permutaciones para cada nivel jerárquico.
Las pruebas se realizaron con dos (k = 2), tres (k = 3) y cuatro (k = 4) grupos.
2.3.9 Prueba de Mantel
Para conocer si hay una relación significativa entre la distancia geográfica y las distancias
genéticas de las poblaciones, se llevó a cabo la prueba de Mantel (1967). La prueba de Mantel
es una regresión en donde las variables son matrices de distancia que resumen la disimilaridad
entre grupos. Se busca, por tanto, evaluar si la asociación (positiva o negativa) es más robusta
de lo que se esperaría por azar (Reynolds y Houle, 2002). Este análisis fue llevado a cabo en el
programa TFPGA versión 1.3. Las distancias geográficas se compararon con las siguientes
variables: Distancias genéticas de Nei 1972, 1978; ФST del AMOVA e índices de Shannon.
34
CAPÍTULO 3: RESULTADOS
3.1 Amplificación de fragmentos de DNA mediante primers ISSR
De los 100 primers de la serie 9 de la UBC, 51 amplificaron con más de cuatro bandas y de ellos
se utilizaron los once que mostraron el mayor número de bandas, lo cual se consideró un
mínimo de diez bandas (Cuadro 3.1). Las concentraciones óptimas para cada uno de los
reactivos utilizados en los ensayos se muestran en el cuadro 3.2; el número de ciclos y
temperaturas de alineamiento con mejores resultados se muestran en el cuadro 3.3.
Cuadro 3.1 Lista de primers utilizados en el análisis ISSR, temperatura de alineamiento, número de bandas y sus respectivas secuencias
Primer ISSR
Secuencia 5`a 3` T° Alineamiento
(°C ) # Bandas
Intervalo de Peso Molecular
UBC 846 CACACACACACACACART 52 23 350-1600
UBC 881 GGGTG GGGTG GGGTG 52 22 300-1550
UBC 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 52 21 220-1400
UBC 840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 52 18 250-1000
UBC 848 CACACACACACACACARG 52 18 300-1700
UBC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 52 17 300-1200
UBC 886 VDVCTCTCTCTCTCTCT 48 16 350-1200
UBC 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 52 15 500-1600
UBC 873 GACAGACAGACAGAC A 52 15 500-1200
UBC 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 52 14 380-1400
UBC 836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 52 10 300-970
R = A, G; Y = C, T; V = A, C o G; D = A, G o T Cuadro 3.2 Concentraciones finales de los reactivos
Reactivo Cantidad
Buffer 4μl
MgCl 2.5μl
Formamida (2%) 0.4μl
DNTP 0.4μl
Primer 2μl
Taq Polimerasa 0.2μl
Templado DNA 1μl
H20 9.5μl
Volumen Total 20μl
Cuadro 3.3 Condiciones de tiempo y temperatura de cada fase del PCR
Fase Temperatura Tiempo
Denaturación inicial 94 5 Min
44 Ciclos
Denaturación 94 30 Seg
Alineamiento 52 45 Seg
Extensión 72 2 Min
Extensión Final 72 7 Min
*48°C para primer 886
35
3.2 Registro de datos
Cada uno de los geles se almacenó en una serie de fotografías, registrando el nombre de la
población, el número de individuo más un control negativo, la escalera, el primer utilizado, la
temperatura de alineamiento, voltaje y miliamperaje, duración y fecha de la corrida
electroforética, así como el número de PCR registrado en la bitácora (Figura 3.1)
Figura 3.1 Electroforesis del Primer 835 de la población de Zamia loddigesii en Oaxaca, México, indicando su codificación.
3.3 Características y atributos de los primers de ISSR
De los once primers, en las cinco poblaciones estudiadas (91 individuos), registramos un total de
472 bandas diferentes, la población de Monte Oscuro en Veracruz presenta el mayor número de
bandas totales. El mayor número de bandas por individuo, número de bandas fijas, bandas
localmente comunes y el menor número de bandas únicas, se encontraron en la población de
Aldama en Tamaulipas. En general, los valores más bajos se encuentran en la población de
Tabasco, ya que es la que tiene menor número de bandas totales, bandas por Individuo, bandas
36
fijas y bandas localmente comunes (Cuadro 3.4), incluso sus valores están debajo del promedio
de las cinco poblaciones que fueron analizadas.
Cuadro 3.4 Características de las bandas dentro de las cinco poblaciones de Zamia loddigesii estudiadas en esta tesis
Existe además un patrón latitudinal cualitativo, donde tres grupos de datos (i.e., bandas por
Individuo, bandas locales y bandas fijas) decrecen de norte a sur a lo largo de la distribución de
la especie (Figura 3.2).
Figura 3.2 Distribución
de los atributos de las
bandas entre las cinco
poblaciones de Zamia
loddigesii en México
Población N #Bandas Bandas por Individuo
# Band. localmente comunes
# Bandas Únicas
#Bandas fijas
Aldama 20 95 60.65 18 6 25
Misantla 20 96 60.55 14 18 21
Monte Oscuro 20 101 57.35 14 13 19
Oaxaca 15 94 57.2 10 14 19
Tabasco 16 86 55.25 10 13 17
Total 91 472 58.38 66 64 5* N = Número de individuos muestreados # Bandas = Número de bandas Diferentes en la población BPI = Bandas por individuo # Bandas Localmente Comunes = Encontradas en 50% o menos en la población # Bandas Únicas = Número de bandas únicas a la población # Bandas fijas en el grupo de datos (Población) [*Para todo el conjunto de datos]
37
3.4 Composición genética de las poblaciones
Un resumen de la variación genética en las cinco poblaciones estudiadas se presenta en el
cuadro 3.5, donde se observa que la población más al norte (Aldama, Tamaulipas) presenta los
valores más bajos para el número efectivo de alelos, el índice de Shannon y la diversidad
genética de Nei. De forma opuesta, los valores más altos los presenta la población de Oaxaca.
A nivel especie, Zamia loddigessi, presenta altos valores de polimorfismo (97.28%), así
como la mayoría de los indicadores de diversidad genética.
Cuadro 3.5 Resumen de la variación genética en Z. loddigesii Población Na Ne HE I NLP PP
Aldama 1.3804 1.2190 0.1286 0.1934 70 38.04
Misantla 1.4076 1.2538 0.1490 0.2215 75 40.76
Monte Oscuro
1.4457 1.2392 0.1435 0.2181 82 44.57
Oaxaca 1.4076 1.2593 0.1499 0.2224 75 40.76
Tabasco 1.3750 1.2463 0.1402 0.2063 69 37.50
Promedio 1.40326 1.24346 0.1423 0.2121 74.2 40.326
Especie (DE)
1.9728 (0.163)
1.3843 (0.3246)
0.2408* (0.0256)
0.3813 (0.2104)
179 97.28
Na = Número observado de alelos; Ne = Número efectivo de alelos; HE = Diversidad genética de Nei *HT; I = Índice de Shannon; NLP = Numero de loci polimórficos; PP = Porcentaje de loci polimórficos
En la figura 3.3 se esquematiza la distribución de los diferentes estimadores de la
diversidad genética en las poblaciones de Zamia loddigesii. Las líneas más cercanas al centro
indican bajos valores, mientras que los más alejados del centro, muestran los valores más altos
y a la población a la que pertenecen.
La población de Aldama en Tamaulipas, muestra valores relativamente bajos de
diversidad genética, mientras que los estimadores más altos ocurren en las poblaciones de
Misantla en Veracruz, la de Oaxaca y la de Monte Oscuro en el centro de Veracruz,
principalmente.
38
Figura 3.3 Distribución de los índices de diversidad en las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México.
3.5 Estructura genética
Con base en los dos métodos más utilizados para evaluar la estructura genética de las
poblaciones, tenemos que el coeficiente de endogamia de Wright (FST), fue de 0.444 0.023, lo
cual indica que el 44.47% de la diversidad genética de la especie, está distribuida entre las
poblaciones. Los resultados obtenidos con las poblaciones, se muestran en el cuadro 3.6, junto
con sus intervalos de confianza.
Cuadro 3.6 Estimador de la diferenciación genética promedio (FST) entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México. Se muestra la desviación estándar (DE) del estimador, así como los intervalos de confianza al 95 y al 99%
FST 95% IC. 99% IC
0.4447 (DE) 0.023
Superior: 0.489 Inferior: 0.3978
Superior: 0.5027 Inferior: 0.384
39
El estimador de la diferenciación genética a través de todos los loci fue GST = 0.409, a
partir del mismo estimador, se calculó el flujo génico como Nm = 0.361, lo cual indica un flujo
génico muy limitado entre las poblaciones.
Para el cálculo de FST, a partir de métodos bayesianos, de las diferentes combinaciones la
configuración del ‘test2’ fue seleccionado, ya que se observó después de las pruebas, que
aunque se aumentaran el número de iteraciones, los valores ya no variaban. En el Cuadro 3.7 se
muestran los resultados para los cuatro modelos, el modelo completo (full) es el que muestra el
valor más bajo de (DIC) que es el índice de criterio de desviación, el cual combina una medida
del ajuste del modelo (Dbar), con una medida de la complejidad del modelo (pD), donde pD =
Dbar - Dhat. Los valores más bajos, son los recomendados de acuerdo a Holsinger y Wallace
(2004).
Cuadro 3.7 Índices para los cuatro modelos de Hickory (Holsinger y Lewis, 2003)
Modelo Dbar Dhat pD DIC
Full 1676.14 1321.57 354.57 2030.71
f = 0 1677.01 1286.7 390.313 2067.33
Θ = 0 8721.46 8556.18 165.28 8886.74
Free model 1766.34 1329.68 436.656 2202.99
DIC es el índice de criterio de desviación
Los valores de -II (análogos al FST (Weir y Cockerham, 1984)), y GST-B (Análogo
Bayesiano al GST de Nei (1973)), se encuentran entre 0.56 y 0.45, respectivamente (Cuadro 3.8).
Esto indica que la mayor proporción de variación genética se atribuye a la diferencia entre las
poblaciones.
Para estas pruebas bayesianas, los estimadores: HS y HT en el cuadro 3.8 son similares a
los estadísticos de Nei (1973), mientras que la f es el equivalente a la endogamia local (FIS)
resultó ser de 0.778, lo cual refleja muy altos niveles de endogamia local en las poblaciones de
40
Zamia loddigesii.
Cuadro 3.8 Resumen de la diversidad genética de Zamia loddigesii, de acuerdo a los análisis bayesianos
f θ -II HS[1] hS[2] hS[3] hS[4] hS[5] HS HT GST-B
0.778 (0.25)
0.560 (.51)
0.139 (0.13)
0.164 (0.15)
0.157 (0.14)
0.168 (0.15)
0.148 (0.13)
0.155 (0.15)
0.284 (0.26)
0.452 (0.39)
3.6 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)
A fin de detectar la estructura genética de las poblaciones, se realizó un AMOVA usando los 184
loci detectados para las cinco poblaciones de Zamia loddigesii. Los resultados del AMOVA se
resumen en el cuadro 3.9, donde se indica que el mayor porcentaje de variación genética (i.e.,
52.23%) es debido a las diferencias entre las poblaciones, en tanto que el 47.77% de la varianza
genética total restante se debe a la variación promedio dentro de las poblaciones entre
individuos.
Cuadro 3.9 AMOVA para las poblaciones de Zamia loddigesii en México Fuente de variación Suma de
Cuadrados Cuadrados
Medios Varianza de los componentes
Porcentaje de variación
Entre poblaciones 1162.336 290.584 15.25647 52.23
Dentro de Poblaciones 1200.192 13.956 13.95572 47.77
Total 2362.527 29.21218 100.00
ФST = 0.52226 valor de P < 0.00001
3.7 Distancias genéticas
En el cuadro 3.10 se muestran los datos para distancias e identidad genética entre las diferentes
poblaciones comparadas (1. Aldama, 2. Misantla, 3. Monte Oscuro, 4. Oaxaca y 5. Tabasco) con
el estimador genético de Nei (1972) y el estimador sin sesgo de Nei (1978).
41
Cuadro 3.10 Estimadores de Distancia e Identidad genética de Nei entre pares de poblaciones en Zamia loddigesii
Poblaciones Comparadas
Distanciaa Identidada Distanciab Identidadb
1 vs. 2 0.1626 0.8499 0.1584 0.8535
1 vs. 3 0.1526 0.8585 0.1485 0.8620
1 vs. 4 0.1939 0.8238 0.1888 0.8280
1 vs. 5 0.1357 0.8731 0.1311 0.8772
2 vs. 3 0.1504 0.8603 0.1460 0.8641
2 vs. 4 0.1542 0.8571 0.1487 0.8618
2 vs. 5 0.1773 0.8375 0.1723 0.8418
3 vs. 4 0.1307 0.8775 0.1253 0.8822
3 vs. 5 0.1289 0.8790 0.1240 0.8834
4 vs. 5 0.1300 0.8781 0.1240 0.8833
1.Aldama 2.Misantla 3.Monte Oscuro 4.Oaxaca 5.Tabasco aNei 1972 bNei 1978
3.8 Análisis de agrupamiento
3.8.1 UPGMA
Siguiendo el método de UPGMA, utilizamos las distancias genéticas de Nei (1978), usando
10,000 permutaciones, con este método las poblaciones de Monte Oscuro (Veracruz) y Tabasco
resultaron ser más próximas, seguidas de Oaxaca (Figura 3.4).
Figura 3.4 Dendrograma usando la distancia sin sesgo de Nei (1978).
42
3.8.2 Neighbor-Joining La Figura 3.5 muestra el dendrograma obtenido del análisis de Neighbor-Joining, usando para
ello 10,000 réplicas con el programa MEGA versión 5.0, las distancias fueron calculadas
siguiendo el método de distancia-p. Además de la agrupación de las poblaciones, así como la
distribución de los individuos dentro de las mismas, este dendrograma nos permite visualizar si
hay individuos mezclados en poblaciones a las que no pertenecen. En este sentido, se observa
que ningún individuo está fuera de la población a la que corresponde y, de acuerdo con este
análisis, las poblaciones más próximas entre sí fueron Monte Oscuro y Oaxaca, seguidas por la
de Tabasco.
Figura 3.5 Dendrograma de Zamia loddigesii, obtenido con el método de Neighbor-Joining.
43
3.8.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)
En la figura 3.6 se muestran los resultados obtenidos con GenAlEx. Espacialmente las cinco
poblaciones de Zamia loddigesii aquí estudiadas se separan claramente, sin embargo para evitar
confusiones (sobre todo en las poblaciones de Oaxaca, Tabasco y Monte Oscuro en Veracruz),
se unieron con una línea del mismo color todos los integrantes de cada población.
Figura 3.6 Distribución en dos dimensiones de los 91 individuos de Zamia loddigesii mediante el análisis de coordenadas principales
En el cuadro 3.11 se muestra el porcentaje de variación que explica cada coordenada, el
primer componente explica el 31.67% de la variación total, en tanto que el segundo explica el
24.94% y el tercero el 17.92%. Dentro de cada una de las cinco agrupaciones (poblaciones) se
observa que la distancia a la que se encuentran separados los individuos de las poblaciones de
Oaxaca y Tabasco es relativamente más estrecha que las poblaciones de Misantla y Monte
Oscuro, ambas en Veracruz.
Cuadro 3.11 PCoA basado en distancias genéticas, porcentaje de variación explicado en los primeros tres ejes
Eje 1 2 3
% 31.67 24.94 17.92
% Acumulado 31.67 56.61 74.53
44
3.9 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)
Se analizaron tres escenarios, los cuales se compararon para conocer la agrupación de las
poblaciones incluyendo los datos genéticos y el espacio geográfico. Similar al UPGMA y otros
árboles (no publicados), cuando se consideran dos grupos (K = 2), la población de Misantla en
Veracruz resulta separarse de las demás (Cuadro 3.12); de igual manera cuando se contemplan
tres y cuatro grupos (K = 3 y K = 4, respectivamente) presentan un comportamiento similar al
observado en los dendrogramas, sin embargo ninguna de las tres formas de agrupación de éste
análisis fue significativo.
Cuadro 3.12 Resumen del Análisis Espacial de Varianza Molecular. Entre paréntesis se muestran las poblaciones que se agrupan de acuerdo al número de conjuntos seleccionados
Fuente de Variación G.L. Varianza de
componentes Porcentaje
de Variación Índice de Fijación
Valor de P
K= 2 Grupos: (Aldama, Monte Oscuro, Oaxaca, Tabasco) (Misantla)
ФCT Entre grupos 1 2.87893 9.33 0.09331 0.194 ± 0.013 ФSC Entre poblaciones dentro de grupos
3 14.01765 45.43 0.50111 0.00 ± 0.0
ФST Dentro de poblaciones 86 13.95572 45.23 0.54766 0.00 ± 0.0
K = 3 Grupos: (Monte Oscuro, Oaxaca, Tabasco) (Aldama) (Misantla)
ФCT Entre grupos 2 3.14775 10.48 0.10481 0.112 ± 0.000 ФSC Entre poblaciones dentro de grupos
2 12.92904 43.05 0.48091 0.00 ± 0.0
ФST Dentro de poblaciones 86 13.95572 46.47 0.53531 0.00 ± 0.0
K = 4 Grupos: (Misantla) (Monte Oscuro, Tabasco) (Aldama) (Oaxaca)
ФCT Entre grupos 3 3.12082 10.57 0.10574 0.100 ± 0.008 ФSC Entre poblaciones dentro de grupos
1 12.43827 42.14 0.47125 0.00 ± 0.0
ФST Dentro de poblaciones 86 13.95572 47.28 0.52716 0.00 ± 0.0
45
Figura 3.7 Agrupación de las poblaciones de acuerdo al SAMOVA.
3.10 Prueba de Mantel
Con la finalidad de conocer la relación existente entre la composición genética y la localización
geográfica correspondiente a cada población se aplicó una prueba de Mantel, la cual compara
matrices pareadas. De todas las comparaciones realizadas (Cuadro 3.13), los resultados de la
prueba de Mantel indican que la variabilidad o distancia genética observada es independiente
de la distancia geográfica de las poblaciones de Zamia loddigesii, es decir no existe una relación
significativa entre ambas matrices.
Cuadro 3.13 Combinaciones usadas en la prueba de Mantel
Combinación Correlación (r) Probabilidad superior (p)
Probabilidad inferior (p)
Distancia geográfica vs Fst-1 0.4201 0.1640 0.8480
Distancia geográfica vs Distancia Genética Nei
-.0540 0.4960 0.5110
Distancia geográfica vs Fst-1 quitando Aldama-Tabasco
0.7410 0.0070 1.0000
Distancia geográfica vs PhiPt (AMOVA)
0.3306 0.2210 0.7850
Distancia geográfica vs Shannon -.1113 0.6080 0.4000
46
CAPITULO 4: DISCUSIÓN
En esta tesis se estudió la diversidad y la estructura genética en cinco poblaciones de Zamia
loddigesii en todo su ámbito de distribución, pare ello se utilizaron once primers de ISSR, que
fueron seleccionados de 100 primers, el criterio que se utilizó para escoger los primers fue que
como mínimo presentaran diez bandas, este criterio se utilizó a partir de la revisión de más de
un centenar de publicaciones científicas que abordan el estudio de la genética de poblaciones
en plantas desde 1996 a la fecha, para ello las primeras tres publicaciones que se registraron en
una búsqueda en el ISI Web de Thomson Reurtes fueron: Tsumura et al., (1996), Esselman et al.,
(1999) y Ge y Sun (1999); en tanto que durante el 2011 se publicaron mas de una veintena de
artículos, en los que en su mayoría utilizan al menos diez primers de ISSR y con diez bandas
como mínimo. Lo anterior es evidencia de que los datos y resultados de esta tesis son
consistentes con lo reportado en otros estudios con plantas. En el caso del orden Cycadales el
primer estudio donde se utilizan los ISSR como marcadores de diversidad y estructura genética
es en 12 poblaciones de Cycas guizhouensis K. M. Land y R. F. Zou en el sur de China, donde
utilizaron 11 primers de ISSR (Xiao et al., 2004), lo cual coincide con el mismo número de
marcadores que usé en esta tesis.
Los estudios con marcadores moleculares a nivel del DNA suelen, en general, detectar
mayor diversidad genética que con proteínas enzimaticas, esto puede ser explicado primero,
por la naturaleza conservativa de las secuencias codificantes en los genes muestreados por
isoenzimas, en contraste con las secuencias no codificantes por RAPD e ISSR (Fahima et al.,
1999; Aboel-Atta, 2009), por lo que las isoenzimas podrían subestimar la diversidad genética
(Culley y Wolfe, 2001). Segundo, en el caso de los microsatélites que son secuencias repetitivas
47
cortas en tándem, con una longitud de apenas unos pares de bases, son muy abundantes a lo
largo del genoma; en este contexto Condit y Hubell (1991) estiman que hay 5 x 103 a 3 x 105
microsatélites en cada organismo. Así los microsatélites están dispersos a través de todo el
genoma y son altamente polimórficos debido al deslizamiento del DNA (Hamada y Kakunaga,
1982). Por lo tanto, usar un marcador ISSR compuesto de una secuencia microsatélite, anclada
por dos a cuatro nucleótidos y con frecuencia degenerando en las terminaciones 3’ or 5’
(Zietkiewicz et al., 1994), podría detectar muchas más bandas polimórficas por primer que los
marcadores RAPD (Quian y Hong, 2001), adicionalmente este tipo de marcadores (dominantes),
son neutrales, de manera que no se ven afectados por la acción de la selección natural (Nagaoka
y Ogihara, 1997).
En esta tesis, trabajando con cinco poblaciones de Zamia loddigesii usando marcadores
ISSR fue posible detectar suficiente variación genética entre poblaciones y entre individuos
dentro de las poblaciones. En este contexto, se ha reportado que los ISSR pueden ser más
informativos y tener un mejor desempeño que los RAPD (Ge y Sun, 1999; Korbin et al., 2002;
Galván et al., 2003; Wu et al., 2004; Souframanien y Gopalakrishna, 2004; Vijayan et al., 2004).
Los ISSR son superiores a los RAPD, principalmente en términos de bandas polimórficas
detectadas por primer y por ser mas reproducibles (Culley y Wolfe, 2001; Quian y Hong, 2001).
Finalmente, cuando comparamos la información genética obtenida a partir de
marcadores de isoenzimas, una desventaja que caracteriza a los ISSR es su naturaleza
dominante, que resulta en un menor contenido de información, esto al no poder detectar los
heterocigotos. Sin embargo, como afirma Ge y Sun (1999), esta desventaja es compensada por
el alto número de loci polimórficos que se obtienen y por la capacidad de muestrear un mayor
48
número de regiones del genoma.
Es importante mencionar que existe un renovado interés en la evaluación de la
diversidad, tanto en ecología como en genética de poblaciones (Jost, 2007; Ricotta y
Burrascano, 2008; Ryman y Leimar, 2009; Gregorius, 2010; Meirmans y Hedrick, 2011; Whitlock,
2011), así como el aumento en el número de publicaciones en revistas indizadas (Figura 4.1)
utilizando ISSR como marcadores para conocer la diversidad de las especies, a la vez que van en
desuso los métodos enzimáticos (a pesar la información que ellos aportan), desde 1995 a la
fecha.
Figura 4.1 Tendencia en las publicaciones con ISSR vs Aloenzimas
4.1 Características y atributos de los primers de ISSR
Los resultados obtenidos, concuerdan con otros estudios en cícadas donde se emplean
marcadores moleculares ISSR. Para ello, de los once primers utilizados en la presente tesis,
cinco han sido reportados en otros estudios con cícadas: los primers 835, 836 y 840 también son
reportados por Xiao et al., (2004), Xiao y Gong (2006), Jianguang et al., (2005) y Xiao et al.,
(2005), el primer 841 por Xiao y Gong (2006), Jianguang et al., (2005) y Xiao et al., (2005), así
como el primer 842 (Xiao et al., 2004; Xiao y Gong, 2006; Xiao et al., 2005).
En las dos cícadas asiáticas, Cycas guizhouensis y Cycas debaoensis Y. C. Zhong y C. J.
Chen, que reportan el número de bandas obtenido por cada primer, se puede observar que en
49
todos los casos las especies asiáticas presentan un menor número de bandas por primer,
comparadas con Zamia loddigesii (Cuadro 4.1).
Cuadro 4.1 Número de bandas entre especies de cícadas
Primer ISSR
Zamia loddigesii
Cycas guizhouensis
Cycas debaoensis
UBC 835 14 11 8
UBC 836 10 7 8
UBC 840 18 8 7
UBC 842 17 7 -
Cycas guizhouensis: (Xiao et al., 2004); Cycas debaoensis: (Xie et al., 2005)
Aunque no se incluyeron en el análisis, durante las pruebas preeliminares con los 100
primers, los primers 808 y 810 mostraron variación de bandas como lo reportan Xiao et al.,
2004; Xiao et al., 2005; Jianguang et al., 2005; Xiao y Gong, 2006 (datos no publicados), pero en
el presente estudio, no se incluyeron por mostrar pocas bandas (cinco y seis, respectivamente).
La temperatura de alineamiento para la mayoría de los primers fue de 52°C, excepto
para el primer 886 que fue de 48°C, estos son resultados similares a los reportados por Xiao y
Gong (2006). Con la presente información podemos indicar que los primers utilizados podrían
aplicarse a posteriores estudios con cícadas de otros géneros, así como en especies tanto de
América como del resto del mundo.
El promedio de individuos muestreados en las poblaciones de Zamia loddigesii fue de
18.2. Respecto a esto Nybom (2004) reporta en un meta análisis, con marcadores moleculares
en 307 especies estudiadas, principalmente dominantes (RAPD, AFLP, ISSR), que el número
medio de plantas por población varía entre 14.5 y 18.5, resultado que indica que en esta tesis se
tiene un muestreo consistente.
En Zamia loddigesii, se detectaron un total de 472 bandas diferentes y un promedio de
94.4 bandas en cada población, aunque existe poca información sobre el numero de bandas
50
necesarias para los análisis, Staub et al., (2000) en su estudio indica que casi no existen cambios
con respecto a los coeficientes de variación genética más allá de 80 bandas, en Zamia loddigesii
este número fue mayor que 80 en todas las poblaciones.
Como se muestra en las figuras 3.2 y 3.3, la distribución de las bandas entre las
poblaciones no es homogénea, por el contario, los diferentes valores tienden hacia una u otra
población de acuerdo a diversos factores; sin embargo, es importante señalar que el número de
bandas únicas es muy similar entre las poblaciones del sureste, lo mismo sucede con el número
de bandas locales, lo que hace que la especie, dentro de estas poblaciones sea genéticamente
muy similar, debido a que comparten un número alto de alelos.
Con respecto al número de alelos (bandas) por individuo y al número de bandas locales,
se observa una disminución de norte a sur, a lo largo de la distribución de la especie. Esta
disminución en el número de bandas podría implicar que el origen de la distribución de la
especie sea probablemente la población de Aldama (i. e., más norteña) ya que posee más
bandas siendo esta característica un atributo ancestral. En este contexto, Gonzalez-Astorga et
al., (2006) encontraron un resultado similar para las mismas poblaciones de Zamia loddigesii
usando aloenzimas, detectándose una disminución de la frecuencia de un alelo (i.e., Malato
deshidrogenesa, MDH), desde el norte al sur de la distribución de la especie.
Slatkin (1985) señala que el número de alelos privados es un estimador indirecto del
flujo génico, y cuanto más bajo sea éste, más alelos de este tipo surgen, y son fijados por
eventos de mutación en una población. Las frecuencias encontradas en los alelos privados de Z.
loddigesii (entre 6.3 y 18.7% de la población total), indican que probablemente las poblaciones
estudiadas presentan ciertas limitaciones de flujo génico entre ellas (i.e. aislamiento). Lo que se
51
explica por la gran distancia geográfica entre la población de Aldama y las otras cuatro. Todas
las poblaciones presentaron en mayor o menor grado un número de alelos fijos, lo que sugiere
la existencia de grandes diferencias genéticas entre estas. Además, la presencia de estos alelos,
parece distintivo de especies antiguas y relictas (Reátegui-Zirena et al., 2009), algo que es
caraterístico en las cícadas.
4.2 Composición genética de las poblaciones
Una de las aproximaciones para la estimación de la diversidad genética, usando marcadores
dominantes, es integrar los análisis incluyendo información obtenida con datos de marcadores
codominantes y así evitar asumir equilibrio Hardy-Weinberg (Narzary et al., 2010). En el
presente estudio, se hicieron pruebas con los datos de isoenzimas publicados por González-
Astorga et al., (2006), integrando el coeficiente de endogamia (endogamia local: FIS) para los
datos de ISSR, sin embargo las diferencias obtenidas fueron mínimas (datos no publicados) y se
optó por no considerar este enfoque para permitir la comparación con otros estudios. Ge y Sun
(1999) reportan haber encontrado también muy poca diferencia cuando integraron datos de
aloenzimas a ISSR.
La variación genética dentro de las poblaciones es el reflejo de diversos procesos
evolutivos, los cuales pueden ser interpretados a partir de la información obtenida de los
diferentes estimadores de diversidad genética. A nivel de poblaciones presentan altos números
de alelos; además, existe una gran similitud en el número de alelos, las heterocigosis, el índice
de Shannon y el porcentaje de loci polimórficos, entre las poblaciones de Misantla en Veracruz y
Oaxaca.
52
El polimorfismo en las poblaciones de Aldama y Tabasco, es el más bajo en la especie
(38% y 37.5%, respectivamente), son valores incluso más bajos que el promedio de las demás y
coincide que ambas poblaciones son las que se encuentran en los extremos de la distribución de
la especie, lo cual puede indicar el aislamiento que han tenido, mientras que la población con
los valores más altos se encuentra en el centro de su distribución (Monte Oscuro, 44%).
Wright (1946) demostró que especies con niveles de endogamia significativa pueden
resultar de la pérdida o fijación de ciertos alelos dentro de una población, dando como
resultando una baja diversidad genética, esto es particularmente visible en la población de
Aldama, que presenta el mayor número de bandas fijas y el menor número de bandas únicas
dentro del análisis.
A nivel de especie, el porcentaje de loci polimórficos es relativamente alto (97.28%),
estos loci son los de mayor importancia en aspectos de la biología de la restauración, debido a
que estos loci polimórficos pueden o no estar adecuadamente representados dependiendo del
diseño y ejecución de un programa de restauración y conservación de las especies (Falk et al.,
2001).
La diversidad genética resulta también ser mucho más alta a nivel de especie (HT 0.240)
que a nivel de poblaciones (HS = 0.142), resultados similares se obtuvieron con ISSR en Magnolia
officinalis (Yu et al., 2011) y Emmenopterys henryi (Li y Jin, 2008), árboles que al igual que las
cícadas, son especies primitivas, de larga vida y amenazadas en la actualidad por reducción de
su hábitat natural. Esta abundante variación en las poblaciones y a nivel de la especie, es
atribuida como una característica heredada de sus ancestros, lo cual explica la alta diversidad
genética a nivel de especie (Ge y Sun, 1999; Li y Jin, 2008; Yu et al., 2011).
53
De acuerdo a nuestra hipótesis que contrasta los niveles de diversidad con aloenzimas e
ISSR, cuando comparamos nuestros resultados, se observa que a nivel de especie, con similar
número de individuos por población analizados, el porcentaje de polimorfismo y el número de
alelos por locus son más altos con ISSR que con aloenzimas, resultados que se muestran
similares a los reportados en otros estudios (i.e., Buso et al., 1998; Ge y Sun, 1999; Ayers et al.,
1999; Xiao et al., 2004; Aboel-Atta, 2009; Jonavičienė et al., 2009). Sin embargo, entre las
poblaciones sucede lo contrario, esto puede deberse a que el haber muestreado 15 loci
aloenzimáticos, la representación del genoma haya sido muy limitada y por lo tanto los
resultados exhiban una información restringida. Aunque también es importante considerar que
los marcadores aloenzimáticos pueden ser afectados por la selección natural, para ello los loci
elegidos podrían estar adaptados en cuanto a su dinámica enzimática. Mientras que los
marcadores ISSR al ser neutrales y no verse afectados por la acción de la selección natural,
incluyen información de genes no codificantes y la diversidad de la especie podría ser menor
que lo detectado por las aloenzimas.
Cuadro 4.2 Comparación entre dos marcadores moleculares en las mimas poblaciones de Zamia loddigesii.
Aloenzimas* ISSR Población N PP Na HE N PP Na HE
Aldama 20.8 66.6 1.93 0.291 20 38.04 1.38 0.128
Misantla 20 40.76 1.40 0.149
Monte Oscuro
19.5 73.3 1.73 0.233 20 44.57 1.44 0.143
Oaxaca 21.5 60.0 1.80 0.273 15 40.76 1.40 0.149 Tabasco 19.2 66.6 1.73 0.268 16 37.50 1.37 0.140
Especie 20.25 66.6 1.80 0.266 97.28 1.97 0.240
*González-Astorga et al. (2006).
4.3 Estructura genética
La estructura genética de la población puede ser resultado de muchos factores, incluyendo el
efecto de la deriva génica, el sistema de cruzamiento, el flujo génico, la selección natural y la
54
historia ecológica de la especie, lo cual implica cambios en la distribución de los poblaciones y
de los individuos al seno de las mismas, por efecto de la fragmentación del hábitat, lo cual da
como resultado el aislamiento geográfico entre poblaciones (Ellstrand y Ellam, 1993).
De acuerdo al análisis con el estimador theta (FST) de TFPGA, nuestros resultados indican,
un grado de diferenciación del 44.4% entre las poblaciones. Este resultado sugiere que existe
una mayor estructuración genética en las poblaciones de Zamia loddigesii usando ISSR, que
respecto a lo que se había reportado para esas mismas poblaciones con aloenzimas (cf. FST =
0.179; González-Astorga, et al., 2006).
El estadístico GST es típicamente usado para describir la cantidad promedio de
diferenciación observada sobre múltiples loci (Ryman y Leimar, 2009), en nuestro estudio este
valor es de 0.4092. Aunque GST suele ser usado como un análogo al FST, los resultados obtenidos
no fueron exactamente los mismos, esto puede deberse a que el valor de GST es afectado por las
diferencias en las tasas de mutación en los distintos loci evaluados (Ryman y Leimar, 2009).
También, la discordancia entre FST y GST se puede deber a que los estimadores de diversidad por
población sean muy variables (Nei, 1973), cosa que no es el caso de los resultados de esta tesis
(ver Cuadro 3.5) ya que las diferencia entre FST y la GST es de solo el 3%.
Los resultados que se obtienen con los métodos convencionales a partir de los
estadísticos de Wright, son similares a los obtenidos siguiendo la aproximación de modelos
bayesianos (Holsinger et al., 2002); siendo estos últimos ligeramente más consistentes ya que
no se requiere asumir el equilibrio Hardy-Weinberg en las poblaciones.
Los resultados obtenidos a partir de diferentes enfoques, nos permiten tener una mayor
verosimilitud, ya que ante la imposibilidad de calcular el índice de endogamia (FIS) con
55
marcadores dominantes y asumir a las poblaciones en equilibrio Hardy-Weinberg como en los
enfoques tradicionales, permite comparar los resultados y observar las diferencias y similitudes
(Cuadro 4.3). Además, considerando que el abordaje que se plantea con los modelos
bayesianos involucra el no tener que definir si las poblaciones están o no en equilibrio, sino que
conforme las iteraciones avanzan, éste valor es estimado.
Cuadro 4.3 Comparación de índices bajo dos enfoques Índice PopGene Hickory
Θ 0.525 0.560
[HS] Aldama 0.1286 0.139
[HS]Misantla 0.1490 0.164
[HS]Monte Oscuro 0.1435 0.157
[HS]Oaxaca 0.1499 0.168
[HS]Tabasco 0.1402 0.148
HT 0.2408 0.284
GST-B 0.4092 0.452
Hubo sin embargo un detalle en la estimación de FIS que se observó al comparar los
resultados obtenidos de aloenzimas (cf. González-Astorga et al., 2006) y los estimados con el
programa Hickory, esto es, que el valor estimado de este último es de f = 0.778, mientras que
con datos de marcadores codominantes el estimado de la endogamia local es de FIS = 0.041,
esto aparentemente surge no como un problema de sentido biológico, sino como un aspecto de
la forma como se analizan los datos y se estiman los estadísticos (Holsinger y Lewis, 2003),
donde se advierte que los marcadores dominantes pueden no ser muy apropiados para estimar
ƒ (FIS), al menos bajo un marco bayesiano, lo cual se explica a partir de que los tamaños de
muestra de las poblaciones son bajos; sin embargo otros estudios con poblaciones naturales y
con simulaciones (Levsen et al., 2008) indican que es un problema que va más allá del tamaño
de las poblaciones y se recomienda no confiar demasiado en estos valores si los resultados son
muy contrastantes.
56
4.4 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)
En Zamia loddigesii, la mayor riqueza en diversidad genética está distribuida entre sus
poblaciones (52.2%), más que dentro de ellas (47.7%). Se ha planteado que el nivel de
heterogeneidad genética entre poblaciones es mayor en especies con poblaciones
geográficamente disjuntas, que especies con distribuciones continuas (Hamrick y Godt, 1996). El
rango de distribución de Z. loddigesii ha sido gradualmente limitado a pequeñas áreas aisladas y
eventualmente se ha dividido en pequeñas poblaciones tipo islas. Así, la diferenciación genética
probablemente haya ocurrido después de que estas barreras hayan surgido.
En general, muchos estudios suelen considerar en el análisis de diferenciación, a los
estadísticos FST, GST y ФST como equivalentes, aunque nuestros resultados muestran que los
índices no son idénticos, sí podemos afirmar que en todos los casos, el grado de estructuración
entre las poblaciones de Z. loddigesii es relativamente alto, de un 40.9% al 56%.
A partir del valor de GST se estimó el flujo génico (Nm), que se refiere al movimiento de
individuos entre las poblaciones, donde Nm = 0.361, lo cual nos indica que menos de un
individuo está migrando por generación. Ellstrand y Ellam (1993) sostienen que una tasa de
migración de 0.5 es considerado suficiente para superar los efectos de la deriva génica, por lo
que podemos deducir que la deriva génica está moldeando la estructura al interior de las
poblaciones. Esto se corrobora con los estimados de tamaño efectivo detectados con
marcadores dominantes en las mismas poblaciones, donde se encontró que este tamaño
efectivo varía de 9 a 57 individuos por población con una media de Ne = 20 15 (cf. González-
Astorga et al., 2006), lo cual es sintomático de que las poblaciones remanentes son
relativamente pequeñas, y siguiendo a Octavio-Aguilar et al., (2009) esto representa
57
aproximadamente la cuarta parte de la población de tamaño demográfico NT el cual variaría de
entre ca. 40 a 200 plantas por población.
De acuerdo a Hamrick y Godt (1996) y Hamrick et al., (1991), la distribución de la
variación genética está fuertemente relacionada con caracteres de historia de vida,
particularmente con los sistemas reproductivos y la dispersión, para ello el flujo génico también
puede ser obstruido por barreras físicas, que impidan a un migrante atravesarlas, así como
también pueden impedir el paso de un polinizador o dispersor (Levin, 1981; Slatkin, 1987). Al
respecto, el nivel de flujo génico vía polen depende de la capacidad migratoria del polinizador.
La evidencia nos indica que muchas cícadas tienen asociaciones simbióticas con insectos
específicos, la mayoría escarabajos y gorgojos. Tales insectos son atraídos a los conos de las
cícadas, algunas veces por fragancias, algunas veces por comida, albergue, lugar de cría y
probablemente por combinaciones de todas ellas (Norstog y Fawcett, 1989; Norstog et al.,
1992; Stevenson et al., 1998; Vovides, 1991; Vovides et al., 1997), dando oportunidad a la
polinización; sin embargo, con los cambios en la reducción de las poblaciones, el saqueo de
plantas, los incendios a los que se ven sometidas, causa que los polinizadores también se vean
afectados (cf. Negrón-Ortíz y Breckon, 1989; Negrón-Ortíz et al., 1996). Por lo que con el
transcurso del tiempo las poblaciones se vuelven cada vez más aisladas, y el tránsito de los
polinizadores es muy probable que sea cada vez más difícil. En este contexto, y acentuando el
aislamiento de las poblaciones de cícadas por la biología de los polinizadores, Hall et al., (2004)
encontraron que el movimiento del polen por parte de los machos de curculionidos es muy
bajo, menos de cinco metros en Lepidozamia peroffskyana.
58
En el cuadro 4.4, se resume la información de un estudio previo de Zamia loddigesii con
aloenzimas (González-Astorga et al., 2006), junto con los estudios que se han realizado en
cícadas que utilizan marcadores dominantes de DNA; se incluye el único artículo donde se
analizan ISSR en diferentes especies de plantas y se discute con su forma de vida, área de
distribución y forma de reproducción (Nybom, 2004), finalmente realizamos una revisión de
artículos donde se incluyen 74 plantas de larga vida y con algún grado de amenaza en sus
poblaciones, usando únicamente marcadores ISSR.
Cuadro 4.4 Resumen de diferentes estudios usando marcadores moleculares
Primers PP Na I HE GST/FST ΦST Nm Marcador Referencia
Zamia loddigesii 11 97.28 1.38 0.38 0.240 0.409 0.525 0.361 ISSR Presente tesis
Cycas fairylakea 6 60.22 0.356 0.315 0.257 0.544 AFLP Jian et al., 2006
Encephalartos latifrons 84.17 0.232 0.138 0.026 0.590 9.365 AFLP Da Silva et al., 2012
Encephalartos barteri 16 93.75 1.93 0.347 0.297 0.231 0.323 0.832 RAPD Ekué et al., 2008
Cycas guizhouensis 11 35.90 0.169 0.108 0.432 0.328 ISSR Xiao et al., 2004
Cycas parvula 12 25.00 1.09 0.083 0.054 0.098 0.125 2.305 ISSR Xiao et al., 2005
Cycas balansae 12 40.00 1.23 0.192 0.13 0.400 0.370 0.374 ISSR Xiao et al., 2005
Cycas debaoensis 9 57.40 0.315 0.215 0.342 0.481 ISSR Xie et al., 2005
Cycas balansae 12 60.19 1.36 0.316 0.211 0.602 0.330 ISSR Xiao y Gong 2006
Promedio sin los datos propios
11.14 57.03 1.40 0.236 0.188 0.305 0.226 0.727
14 estudios 0.220 0.340 0.350 ISSR Nybom 2004
74 árboles 11.9 64.62 1.30 0.250 0.232 0.379 0.368 0.735 ISSR
En un análisis con los principales marcadores moleculares dominantes Nybom (2004)
indica que las especies de larga vida son las que presentan los valores más bajos de
diferenciación genética entre poblaciones (ΦST = 0.25), así como los más altos en diversidad
genética dentro de las poblaciones (HS = 0.25), mientras que los valores más altos corresponden
a las formas de vida anuales (ΦST = 0.62 y HS = 0.13, respectivamente), los resultados obtenidos
en Zamia loddigesii, son más parecidos a los encontrados en especies anuales, que a especies de
larga vida. De igual forma, tomado en cuenta el sistema reproductivo en Z. loddigesii que es por
fecundación cruzada, respecto los valores que reporta Nybom (2004), en nuestro estudio es más
59
parecido a las especies vegetales con autofecundación (ΦST = 0.65), que a las especies con
fecundación cruzada (ΦST = 0.27).
Comparando los resultados presentados por Nybom (2004), con los obtenidos en
nuestro análisis de 74 especies, se nota que la información es muy similar a lo ya reportado. Se
observa que en las poblaciones de Zamia loddigesii hay valores de diversidad mayores a varias
especies de plantas de larga vida, así como en el número de alelos y el índice de diversidad de
Shannon, mientras es evidente que el grado de diferenciación entre las poblaciones es más alto
en Z. loddigesii que en especies de vida larga, este último resultado se puede deber a que las
poblaciones estudiadas estén expuestas al efecto de la fragmentación del hábitat, aunque aún
no ha habido efecto de pérdida de diversidad genética, la cual se mantiene en plantas las
adultas. Quizá una forma de detectar este efecto es evaluar otros estadios como semillas y
plántulas (cf. González-Astorga y Núñez-Farfán, 2001; González-Astorga y Castillo-Campos,
2004), aunque en un estudio por categorías de historia de vida en Dioon edule, Octavio-Aguilar
et al., (2009) encontraron que la cohorte de las semillas son un reservorio de variación
genética, cosa que también podría estar ocurriendo en las poblaciones de Z. loddigesii.
Al comparar únicamente entre especies de cícadas, vemos que Encephalartos barteri
Carruth ex Miq., posee también altos índices de diversidad, pero a pesar de ser una especie
vulnerable de acuerdo a la IUCN, se encuentran menos estructuradas sus poblaciones y
mantiene un flujo mayor de individuos que Z. loddigesii. En promedio para los datos
acumulados de cícadas, el porcentaje de polimorfismo que se obtiene es muy inferior (57.03%),
comparado a los valores de Z. loddigesii.
60
Con el número de primers usados, se obtuvieron buenos resultados para la detección de
diversidad genética en Zamia loddigesii, es hasta ahora la especie con más altos índices de
polimorfismo; así, en otras cuatro especies (Xiao et al., 2005; Xiao y Gong, 2006; Ekué et al.,
2008) se han empleado un mayor número de primers en sus estudios (de 12 a 16) y la
diversidad muestreada no ha sido tan alta, tampoco en el número de bandas reportadas por
individuo. Es de resaltar los bajos índices reportados en Cycas parvula (25% de polimorfismo),
donde se emplearon 12 primers, nuestros resultados indican que con el número de primers
usados, se tiene una buena representación del genoma, que aporta información sobre la
diversidad genética de Z. loddigesii.
Ha sido reportada una alta diversidad genética en otras cícadas que tienen distribución
restringida y bajas densidades poblacionales (cf. Macrozamia riedlei: Byrne y James, 1991;
Dioon edule: González-Astorga et al., 2003; D. angustifolium: González-Astorga et al., 2005; D.
sonorense, D. tomasellii y D. holmgrenii: González-Astorga et al., 2008).
Otra información que se obtiene de estas comparaciones es ver que en la mayoría de
estudios sobre diversidad genética con especies del orden cicadales, ha mostrado que las
cícadas se caracterizan por baja variación dentro de las poblaciones y alta diferenciación entre
poblaciones (Ellstrand et al., 1990; Walters y Decker Walters, 1991; Yang y Meerow, 1996;
Sharma et al., 1999; González-Astorga et al., 2003, 2005, 2006, 2008; Xiao et al., 2004, 2005;
Xiao y Gong, 2006; Cibrián-Jaramillo et al., 2010; Xiao et al., 2004; Xiao et al., 2005; Da Silva et
al., 2012), resultados que concuerdan con la hipótesis planteada para Z. loddigesii, donde se
esperaba que de acuerdo con estos antecedentes la diferenciación fuera mayor entre
poblaciones, que dentro de ellas.
61
4.5 Distancias genéticas
Las distancias genéticas en algunas poblaciones fueron muy similares. La menor distancia está
entre las poblaciones de Monte Oscuro y Tabasco (0.1289), se esperaría que estos valores bajos
fueran entre las poblaciones de Misantla y Monte Oscuro (ambas en Veracruz) por ser las más
próximas geográficamente. Por otro lado, las distancias genéticas entre las poblaciones de
Monte Oscuro, Oaxaca y Tabasco fueron muy parecidas, algo que en los dendrogramas complica
la construcción de los nodos. Esta falta de concordancia se puede deber al origen diferencial de
las poblaciones.
4.6 Análisis de agrupamiento
Debido a los resultados obtenidos y comentados en las distancias genéticas entre las
poblaciones y entre los individuos, los dos métodos de agrupación usados difieren en cuanto a
las agrupaciones obtenidas.
4.6.1 UPGMA
El dendrograma usando el método de Nei (1978) se construyó siguiendo varios algoritmos y
entre todas las repeticiones tenemos que en ocasiones las poblaciones de Oaxaca y Tabasco,
son las más emparentadas, mientras que en otras, se agrupan Monte Oscuro y Tabasco (como el
dendrograma mostrado en la figura 3.4). Esta dificultad obedece a que el método, ejecuta una
reducción progresiva de la matriz de similaridad por lo que en ocasiones el programa asocia de
una manera, y de forma diferente en otras, seleccionando a una población distinta con la misma
probabilidad.
Esto es evidente entre el nodo que agrupa a Monte Oscuro con Tabasco cuya distancia
es de 0.128, mientras que en el siguiente nivel que incluye a la población de Oaxaca la distancia
62
es de 0.130, por lo que la diferencia entre estas tres poblaciones es muy escasa.
4.6.2 Neighbor-Joining
Los resultados para Zamia loddigesii muestran que todos los individuos pertenecen a sus
correspondientes poblaciones, sin embargo debido a que los modelos utilizan distancias
genéticas y como se comentó previamente, los resultados variaron entre las diferentes
repeticiones. Manteniendo de forma general una agrupación entre las poblaciones de Monte
Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco.
4.6.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)
Los dendrogramas construidos para Zamia loddigesii, aportan poca información sobre la
distribución de las poblaciones, sin embargo con un PCoA se puede apreciar cómo se organizan
los individuos en un espacio tridimensional. Las poblaciones que resultaban en complicaciones
para los dendrogramas, cuando las poblaciones que resultaban en complicación para los
dendrogramas se visualizan en el espacio tridimensional, se puede notar que se encuentran
muy próximas y que cualquier individuo podría estar fácilmente relacionado con la población
vecina. Por otra parte, la población de Misantla en Veracruz, que se ubica en el centro de la
distribución de la especie, resultó ser la más distanciada de las demás poblaciones, lo que nos
proporciona indicios de una falta de relación entre la distancia genética y geográfica de la
especie.
4.7 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)
El SAMOVA, mostró que ninguno de los tres escenarios probados fuera significativo. Sin
embargo, la forma de agrupamiento entre poblaciones en consistente con los UPGMA
construidos. Cuando se formaron tres grupos (K = 3), el análisis incluyó en el mismo grupo a las
63
poblaciones de Monte Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco (sureste) y separó a Aldama en
Tamaulipas y Misantla en Veracruz, esto como resultado de las diferencias tanto en la mayoría
de índices, donde la población de Aldama es una de las menos diversas, mientras que Monte
Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco son muy similares entre ellas, incluso geográficamente y
Misantla es separada del análisis por poseer valores más altos que los demás, a pesar de
encontrarse geográficamente relacionada con el grupo del sureste, algo que podría deberse a
un origen relativamente reciente de la población de Misantla.
4.8 Prueba de Mantel
Respecto a la relación de la distancia geográfica con la distancia genética, nuestra hipótesis
planteada suscribe que las poblaciones más cercanas, serán más semejantes genéticamente. Sin
embargo la prueba de Mantel confirma que no existe una relación significativa entre ambas
distancias, lo cual sugiere que Zamia loddigesii no sigue un modelo de aislamiento por distancia
sensu Wright (1943). Éstos resultados contrastan con otros estudios en cícadas como el caso de
Dioon edule donde sí se encontró una relación entre la distancia geográfica y la genética
(Gonzalez-Astorga et al., 2003)
A pesar de que los resultados muestran que no existe correlación entre la distancia
geográfica y la distancia genética entre todas las poblaciones analizadas, se puede decir que hay
una tendencia a considerar que la distancia influye en la diferenciación genética de algunas
agrupaciones, en particular en la disminución de la diversidad. Por ejemplo, las poblaciones de
Aldama y Tabasco son las poblaciones que se encuentran más distanciadas, esto es, en ambos
extremos de la distribución de la especie y son también estas poblaciones las que poseen los
valores más bajos de diversidad en polimorfismos.
64
Generalmente, el grado de diferenciación de una especie surge con el incremento de la
distancia geográfica (Wright, 1946; Moyle, 2006; Pusadee et al., 2009), sin embargo esto no
aplica para Z. loddigesii (prueba de Mantel). Los resultados mostraron que la diferenciación
genética es afectada no solo por deriva genética y aislamiento geográfico, sino por otros
factores.
Primero, al comparar los resultados obtenidos con las distancias geográficas, la
población de Monte Oscuro en todos los análisis, se agrupa con las poblaciones del sur: Oaxaca
y Tabasco, donde la distancia que los separa es de 141.1 y 398.6 km respectivamente, mientras
que existe muy poca relación genética con la población de Misantla, donde la distancia que los
separa es de apenas 70km, estos resultados podrían sugerir que la deriva génica es una fuerza
que ejerce presión sobre estas poblaciones (Xiao et al., 2004).
Segundo, la destrucción/reducción del área de distribución, afecta el flujo génico de la
especie. Aldama puede representar una población genéticamente aislada con un tamaño de
población, relativamente pequeño, debido a su tamaño y endogamia en marcha, aumentada
por deriva genética, podría explicar la fijación de bandas y un número muy bajo en el número de
alelos efectivos (Templeton, 2006). Por lo tanto, una existencia discontinua y pequeños tamaños
de población relacionadas con esta distribución, son factores importantes que resultan en un
alto grado de diferenciación entre poblaciones.
Tercero, las distancias genéticas sugieren que existen ciertas restricciones geográficas
influenciando las agrupaciones entre las poblaciones. Un factor importante podría ser la franja
que representa el Eje Neovolcánico Transversal, ya que es una barrera geográfica que podría
limitar la distribución no solo de los individuos, sino constituir una barrera insuperable para los
65
polinizadores de Zamia loddigesii, principalmente insectos de la superfamilia Curculionoidea
(Norstog y Fawcett, 1989; Norstog et al., 1992, Vovides et al., 1997).
Finalmente, sustentados en la acumulación de esta información, así como el alto número
de bandas únicas que la caracteriza y estar alejada genéticamente del resto de las poblaciones
(PCoA, figura 3.6), nos lleva a proponer que Misantla es una población de origen reciente y
podría haberse originado a partir de la población de Monte Oscuro, considerando su alta
diversidad y sobre todo la proximidad geográfica y genética que las une.
4.9 Implicaciones para la conservación
El conocimiento de la variación genética entre y dentro de las poblaciones de especies raras y
amenazadas juega un papel muy importante en la formulación de estrategias apropiadas para
su manejo y conservación. Nuestros resultados indican que Zamia loddigesii posee
relativamente altos niveles de diversidad genética y una alta diferenciación espacial en su rango
de distribución. Considerando el alto nivel de diferenciación genética entre las poblaciones,
todas las poblaciones deben ser protegidas in situ para conservar la variación existente en la
especie. La preocupación principal está en las poblaciones de Monte Oscuro, Misantla y Oaxaca,
que son las más diversas y poseen alelos particulares, en contraste, son poblaciones que no
están protegidas localmente, por lo que es importante tomar acciones para resguardarlas. El
establecimiento de áreas protegidas alrededor de estas poblaciones podría ser la mejor opción
para conservar los recursos genéticos de la especie. La población de Monte Oscuro es la única
donde ya se han tomado ciertas medidas para proteger a la población y seguir un uso
sustentable de la población (Vovides et al., 2002). Dicho lo anterior, de considerarse la
66
conservación ex situ, las semillas deben ser colectadas, pero evitando ser mezcladas entre las
poblaciones para mantener su estructura genética.
El plan de acción de cícadas de la IUCN/SSC (Donaldson, 2003) identificó un número de
posibles intervenciones para el manejo de poblaciones pequeñas de cícadas, incluyendo la
introducción de plántulas a jardines botánicos, polinización artificial de plantas silvestres y la
translocación de plantas para crear subpoblaciones viables con proporciones de sexos
balanceadas. De este modo se favorecería la conservación in situ al disminuir la extracción de
ejemplares de las poblaciones naturales y la conservación ex situ al promover la supervivencia
de ejemplares fuera de su medio natural (Primack, 1993).
4.10 Conclusiones
Zamia loddigesii, es una especie de amplia distribución en México, puede vivir en diferentes
tipos de hábitats y adaptarse a condiciones adversas, lo que le ha permitido permanecer como
especie.
Los marcadores moleculares ISSR son una herramienta útil en el estudio de la diversidad
genética en especies que han sido poco estudiadas, estos marcadores, proveen de un alto
número de bandas, e información para caracterizar a nivel de individuos y poblaciones.
De acuerdo a nuestras hipótesis, los niveles de diversidad genética fueron superiores a
los reportados con aloenzimas y se encontró una mayor diversidad entre las poblaciones, que
dentro de ellas. Sin embargo a diferencia de lo que se esperaba en nuestra hipótesis, la
distribución de la especie no sigue un modelo de aislamiento por distancia, sino que la
distribución actual de las poblaciones obedece a procesos más allá de la distancia.
67
Zamia loddigesii, posee altos niveles de diversidad a nivel de especie, pero a nivel de
poblaciones su diversidad es baja. Los resultados indican que las poblaciones ubicadas en los
extremos de la distribución de la especie, presentan problemas en la fijación de bandas y
pérdida de diversidad. Numerosos estudios teóricos y empíricos predicen que la reducción en el
tamaño efectivo de la población y un incremento en el aislamiento de las poblaciones puede
llevar a una erosión genética a través de una mayor deriva genética (Ellstran y Elam, 1993),
mayor endogamia (Keller y Waller, 2002) flujo génico restringido y reducidas tasas de
inmigración (Couvet, 2002; Li y Jin, 2008). La dificultad para separar en los fenogramas a las
poblaciones de Monte Oscuro, Oaxaca y Tabasco, obedece a la similitud que comparten en el
número de alelos, diversidad de Shannon y de Nei. Esta información nos lleva a proponer una
reconstrucción de los eventos que pudieron dar origen a la estructuración actual de las
poblaciones (Figura 4.2).
Planteamos que Zamia loddigesii, tuvo una distribución continua desde Tamaulipas,
hasta Tabasco o Chiapas, posiblemente originado del Norte, debido a su mayor número de
bandas por individuo. En un segundo momento, hubo una reducción y aislamiento en la
población de Aldama, esto por su alto número de bandas fijas y sus bajos valores de diversidad
en general. Con el tiempo, surge la población de Misantla a partir de una población con alta
diversidad: Monte Oscuro (y tal vez Oaxaca), de igual forma, las distancias genéticas y
geográficas las avecinan. Finalmente, la población de Tabasco presenta bajos valores de
diversidad, pudiendo ser esto como consecuencia de un aislamiento que empieza a notarse en
la fijación de sus bandas, que para este caso, representa pocas bandas por individuo y por lo
68
tanto menor polimorfismo. Esto potenciado por los bajos valores de flujo génico que existe
entre todas las poblaciones.
Figura 4.2 Reconstrucción de escenarios
69
LITERATURA CITADA
Aboel-Atta, A.I.I. 2009. Isozymes, RAPD and ISSR Variation in Melilotus indica (L.) All. and M.
siculus (Turra) B.G. Jacks. (Leguminosae). Academic Journal of Plant Sciences 2 (2):113-
118.
Aiton, W. 1789. Zamia. Hortus Kewensis 3:477-479.
Ali, S., Muller, C.R., Epplen, J.T. 1986. DNA finger printing by oligonucleotide probes specific for
simple repeats. Human Genetics. 74:239-243.
Ayers, D.R. & Ryan, F.J. 1999. Genetic diversity and structure of the narrow endemic Wyethia
reticulata and its congener W. bolanderi (Asteraceae) using RAPD and allozyme
techniques. American Journal of Botany 86:344–353.
Azofeifa-Delgado, A. 2006. Uso de marcadores moleculares en plantas: aplicaciones en frutales
del trópico. Agronomía Mesoamericana 17(2):221-242.
Balduzzi, A., De Luca, P., & Sabato S. 1982. A phytogeographical approach to the New World
cycads. Delphinoa, n.s., 24: 185-202.
Beckman, J.S. & Soller, M. 1983. Restriction fragment length polymorphism in genetic
improvement: methodologies, mapping and cost. Theoretical and Applied Genetics 67,
33-43.
Byrne, M. & James, S.H. 1991. Genetic diversity in the cycad Macrozamia riedlei. Heredity 67:
35–39.
Bonta, M. & Osborne, R. 2007. Cycads in the vernacular a compendium of local names. In A.P.
Vovides, D.W. Stevenson & R. Osborne (eds), Proceedings of the Seventh International
70
Conference on Cycad Biology (Xalapa, México, 2005). Memoirs of the New York
Botanical Garden 97: 143–175.
Bornet, B. & Branchard, M. 2001. Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers:
reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology
Reporter 19: 209-215.
Buso, G.S.C., Rangel, P.H. & Ferreira, M.E. 1998. Analysis of genetic variability of South American
wild rice populations (Oryza glumaepatula) with isozymes and RAPD markers.
Molecular Ecology, 7: 107–117.
Cabrera-Toledo, D., González-Astorga, J., Nicolalde-Morejón, F., Vergara-Silva, F. & Vovides, A.P.
2010. Allozyme diversity levels on two congeneric Dioon spp. (Zamiaceae, Cycadales)
with contrasting rarities. Plant Systematics And Evolution 290: 115-125.
Chemnick, J. & Gregory, T. 2010a. Zamia loddigesii. In: IUCN 2011. IUCN Red List of Threatened
Species. Version 2011.2. <www.iucnredlist.org>. Downloaded on 26 June 2012.
Chemnick, J. & Gregory, T. 2010b. Zamia furfuracea. In: IUCN 2012. IUCN Red List of Threatened
Species. Version 2012.1. <www.iucnredlist.org>. Downloaded on 26 June 2012.
Cibrián-Jaramillo, A., Daly, A., Brenner, E., Desalle, R., & Marler, T. 2010. When North and South
don’t mix: genetic connectivity of a recently endangered oceanic cycad, Cycas
micronesica, in Guam using ESTmicrosatellites. Molecular Ecology 19: 2364-2379.
Condit, R., & Hubbell, S.P. 1991. Abundance and DNA sequence of two-base repeats in plant
genomes. Genome, 34: 66-71.
71
Contreras-Medina, R., Luna, I. & Alcántara, O. 2003. Zamiaceae en Hidalgo, México. Anales del
Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Serie Botánica 74 (2):
289-301.
Couvet, D. 2002. Deleterious effects of restricted gene flow infragmented populations.
Conservation Biology 16: 369–376.
Culley, M.T. & Wolfe, A.D. 2001. Population genetic structure of the cleistogamous plant species
Viola pubescens Aiton (Violaceae), as indicated by allozyme and ISSR molecular
markers. Heredity 86: 545-556.
Da Silva, J., Donaldson, J.S., Gail-Reeves., & Hedderson T.A. 2012. Population genetics and
conservation of critically small cycad populations: a case study of the Albany Cycad,
Encephalartos latifrons (Lehmann). Biological Journal of the Linnean Society 105(2):
293-308.
Dalirsefat, S.B., Meyer, A., & Mirhoseini, S.Z. 2009. Comparison of similarity coefficients used for
cluster analysis with amplified fragment length polymorphism markers in the silkworm,
Bombyx mori. Journal of Insect Science , 9:71: 681-689.
Dice, L.R. 1945. Measures of the Amount of Ecologic Association Between Species. Ecology 26
(3): 297–302.
Donaldson, J.S. 2003. Introduction. En: Donaldson JD, ed. Cycads. Status survey and
conservation action plan. Switzerland and Cambridge, UK: IUCN-The World
Conservation Union. Pp. 1-2.
Dupanloup, I., Schneider, S. & Excoffier, L. 2002. A simulated annealing approach to define the
genetic structure of populations. Molecular Ecology 11(12): 2571-81.
72
Ekué M.R.M., Gailing, O., Hölscher, D., Sinsin, B. & Finkeldey, R. 2008. Population genetics of the
cycad Encephalartos barteri ssp. Barteri (Zamiaceae) in Benin with notes on leaflet
morphology and implications for conservation. Belgian Journal of Botany 141: 78–94.
Ellstrand N.C. & Ellam, D.R. 1993. Population genetic consequences of small population size:
implications for plant conservation. Annual Review of Ecology and Systematics 24: 217-
242.
Esselman, E.J., Jianqiang, L., Crawford, D.J., Windus, & Wolfe, A.D. 1999. Clonal diversity in the
rare Calamagrostis porteri ssp. insperata (Poaceae): comparative results for allozymes
and random amplified polymorphic DNA (RAPD) and intersimple sequence repeat
(ISSR) markers. Molecular Ecology 8: 443-451.
Excoffier, L., Smouse, P.E., & Quattro, J.M. 1992. Analysis of molecular variance inferred from
metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA
restriction data. Genetics 131: 479-491.
Excoffier, L.L.G. & Schneider, S. 2005. Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for
population genetics data analysis. Evolution, Bioinformatics and Evolutionary
Bioinformatics Online 1: 47-50.
Fahima, T., Sun, G.L., Beharav, A., Krugman, T., Beiles A. & Nevo, E. 1999. RAPD polymorphism
of wild emmer wheat populations, Triticum dicoccoides, in Israel. Theoretical and
Applied Genetics, 98: 434-447.
Falk, D.A., Knapp, E.E. & Guerrant, E.O. 2001. An Introduction to Restoration Genetics. Plant
Conservation Alliance, Bureau of Land Management, US Department of Interior,US
Environmental Protection Agency. USA
73
Galvan M.Z., Bornet, B., Balatti, P.A. & Branchard, M. 2003. Inter simple sequence repeat (ISSR)
markers as a tool for the assessment of both genetic diversity and gene pool origin in
common bean (Phaseolus vulgaris L.). Euphytica 132: 297-301.
Ge, X.J. & Sun, M. 1999. Reproductive biology and genetic diversity of a cryptoviviparous
mangrove Aegiceras corniculatum (Myrsinaceae) using allozyme and intersimple
sequence repeat (ISSR) analysis. Molecular Ecology, 8: 2061–2069.
Godwin, I.D., Aitken E.A.B. & Smith, L.W. 1997. Application of inter simple sequence repeat
(ISSR) markers to plant genetics. Electrophoresis, 18: 1524-1528.
González, A. & Aguirre, X. 2007. Capítulo 19: Inter simple sequence repeats (ISSR's). En Eguiarte,
Souza y Aguirre (comps). Ecología Molecular. Instituto Nacional de Ecología, Semarnat.
México.
González-Astorga, J., & Núñez-Farfán, J. 2001. Effect of habitat fragmentation on the genetic
structure of the narrow endemic Brongniartia vazquezii. Evolutionary Ecology
Research, 3: 861-872.
González-Astorga, J., & Castillo-Campos, G. 2004. Genetic variability of the narrow endemic tree
Antirhea aromatica (Rubiaceae, Guettardeae) in a tropical forest of Mexico. Annals Of
Botany, 93: 521-528.
González-Astorga, J., Vovides, A.P., Ferrer, M., & Iglesias, C. 2003. Population genetics of Dioon
edule Lindl. (Zamiaceae, Cycadales): biogeographical and evolutionary implications.
Biological Journal Of The Linnean Society, 80: 457-467.
González-Astorga, J., Vovides, A.P., Cruz-Angón, A., Octavio-Aguilar, P., & Iglesias, C. 2005.
Allozyme variation Miq. (Zamiaceae) from north eastern Mexico. in the three extant
74
populations of the narrowly endemic cycad Dioon angustifolium. Annals of Botany, 95:
999-1007.
González-Astorga, J., Vovides, A. P., Octavio-Aguilar, P., Aguirre-Fey, D., Nicolalde-Morejón, F. &
Iglesias, C. 2006. Genetic diversity and structure of the cycad Zamia loddigesii Miq.
(Zamiaceae): implications for evolution and conservation. Botanical Journal of the
Linnean Society, 152: 533-544.
González-Astorga J. A., Vergara-Silva, F., Vovides, A.P., Nicolalde-Morejón, F., Cabrera-Toledo, D.
& Pérez-Farrera, M. A. 2008. Diversity and genetic structure of three species of Dioon
Lindl. (Zamiaceae, Cycadales) from the Pacific seaboard of México. Biological Journal of
the Linnean Society, 94: 765-776.
Gregorius, H.R. 2010. Linking diversity and differentiation. Diversity 2: 370-394.
Gupta, M., Chyi, Y.S., Romero-Severson, J. & Owen, J.L. 1994. Amplification of DNA markers
from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats.
Theoretical and Applied Genetics, 89: 998-1006.
Hall, J.A., Walter, G.H., Bergstrom, D.M. & Machin, P.J. 2004. Pollination ecology of the
Australian cycad Lepidozamia peroffskyana (Zamiaceae). Australian Journal of Botany,
52: 333–343.
Hamada, H., & Kakunaga, T. 1982. Potential Z-DNA sequences are highly dispersed in the human
genome. Nature, 298: 396-398.
Hamrick, J.L. & Godt, M.J.W. 1996. Effects of life history traits on genetic diversity in plant
species. Philosophical Transactions of the Royal Society of London - Series B: Biological
Sciences, 351: 1291-1298.
75
Hamrick, J.L., Godt, M.J.W., Murawski, D.A. & Loveless, M.D. 1991. Correlations between
species traits and allozyme diversity: Implications for conservation biology. pp. 75-86.
In Falk, D. and K. Holsinger (eds.) Genetics and Conservation of Rare Plants, Oxford
Press. London.
Hartl, D.L. & Clark, A.G., 1997. Principles of Population Genetics. 3ª ed. Sinauer Associates,
Sunderland, MA.
Haymes, K.M., Ibrahim, I.A., Mischke, S., Scott, D.L., & Saunders, J.A. 2004. Rapid isolation of
DNA from chocolate and date palm tree crops. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 52(17): 5456-62.
Haynes, J.L. 2009. Etymological Compendium of Cycad Names. The Cycad Society. 19 pp
Hoffmann, M., Hilton-Taylor, C., Angulo, A., Böhm, M., Brooks, T.M., Butchart, S.H.M.,
Carpenter, K.E., Chanson, J., Collen, B., Cox, N. A., Darwall W.R.T., Dulvy, N.K., Harrison,
L.R., Katariya, V., Pollock C. M., Quader, S., Richman N.I., Rodrigues, A.S.L., Tognelli,
M.F. Vié J-C., Aguiar, J.M., Allen, D.J., Allen, G.R., Amori G., Ananjeva, N.B., Andreone,
F., Andrew, P., Aquino Ortiz A.L., Baillie, J.E.M., Baldi, R., Bell, Ben D., Biju, S.D., Bird, J.
P., Black-Decima, P., Blanc, J. J., Bolaños, F., Bolivar, W., Burfield, I. J., Burton, J.A.,
Capper, D.R., Castro, F., Catullo, G., Cavanagh, R.D., Channing, A., Chao, N.L., Chenery,
A. M., Chiozza, F., Clausnitzer, V., Collar, N. J., Collett, L. C., Collette, B. B., Cortez
Fernandez, C. F., Craig, M.T., Crosby, M.J., Cumberlidge, N., Cuttelod, A., Derocher,
A.E., Diesmos, A.C., Donaldson, J.S., Duckworth, J.W., Dutson, G., Dutta, S.K., Emslie,
R.H., Farjon, A., Fowler, S., Freyhof, J., Garshelis, D. L., Gerlach, J., Gower, D.J., Grant,
T.D., Hammerson, G.A., Harris, R.B., Heaney, L.R., Hedges, S.B., Hero, J-M., Baz Hughes,
76
Hussain, S.A., Icochea M.J., Inger, R.F., Ishii, N., Iskandar, D. , Jenkins, R.K. B., Kaneko,
Y., Kottelat, M., Kovacs, K.M., Kuzmin, S.L., La Marca, E., Lamoreux, J.F., Lau, M.W.N.,
Lavilla, E.O., Leus, K., Lewison, R.L., Lichtenstein, G., Livingstone, S.R., Lukoschek, V.,
Mallon, D.P., McGowan, P.J.K., McIvor, A., Moehlman, P.D., Molur, S., Muñoz Alonso,
A., Musick, J.A., Nowell, K., Nussbaum, R.A., Olech, W., Orlov, N., Papenfuss, T.J., Parra-
Olea, G., Perrin, W.F., Polidoro, B. A., Pourkazemi, M., Racey, P.A., Ragle, J.S., Ram, M.,
Rathbun, G., Reynolds, R.P., Rhodin, A.G.J., Richards, S.J., Rodríguez, L.O., Ron, S.R.,
Rondinini, C., Rylands, A B., Sadovy de Mitcheson, Y., Sanciangco, J.C., Sanders, K.L.,
Santos-Barrera, G., Schipper, J., Self-Sullivan, C., Shi, Y., Shoemaker, A., Short, F.T.,
Sillero-Zubiri, C., Silvano, D.L., Smith, K.G., Smith, A.T., Snoeks, J., Stattersfield, A.J.,
Symes, A.J., Taber, A.B., Talukdar, B.K., Temple, H.J., Timmins, R., Tobias, J.A,
Tsytsulina, K., Tweddle, D., Ubeda, C., Valenti, S.V., van Dijk, P.P., Veiga, L.M., Veloso,
A., Wege, D.C., Wilkinson, M., Williamson, E.A., Xie, F., Young, B.E., Akçakaya, H.R.,
Bennun, L., Blackburn, T.M., Boitani, L., Dublin, H. ., da Fonseca, G.A.B., Gascon, C.,
Lacher, Jr, T.E., Mace, G.M., Mainka, S.A., McNeely, J.A., Mittermeier, R.A., Reid, G.M.,
Rodriguez, J.P., Rosenberg, A.A., Samways, M.J., Smart, J., Stein, B.A., & Stuart, S.N.
2010. The Impact of Conservation on the Status of the World’s Vertebrates. Science,
330: 1503-1509.
Hollingsworth, P.M., & Ennos, R.A. 2004. Neighbour joining trees, dominant markers and
population genetic structure. Heredity, 92: 490-498.
Holsinger, K.E., Lewis, P.O. & Dey, D. K. 2002. A Bayesian approach to inferring population
structure from dominant markers. Molecular Ecology 11: 1157-1164.
77
Holsinger, K.E., & Lewis, P.O. 2003. Hickory: A package for analysis of population genetic data
v1.1. Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Connecticut,
Storrs, Connecticut, USA.
Holsinger, K.E., & Wallace, L.E. 2004. Bayesian approaches for the analysis of population
structure: an example from Platanthera leucophaea (Orchidaceae). Molecular Ecology
13: 887-894.
INE-SEMARNAP. 2000. Prep 6: Protección, conservación y recuperación de la familia Zamiaceae
(Cycadales) de México. México D.F., INE-SEMARNAP.
IUCN 2012. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2012.1. www.iucnredlist.org
Jian, S., Zhong, Y., Liu, N., Gao, Z., Wei, Q., Xie, Z., & Ren, H. 2006. Genetic Variation in the
Endangered Endemic Species Cycas fairylakea (Cycadaceae) in China and Implications
for Conservation. Biodiversity and Conservation 15(5): 1681-1694.
Jianguang, X., Shuguang, J., & Nian, L. 2005. Genetic variation in the endemic plant Cycas
debaoensis on the basis of ISSR analysis. Australian Journal of Botany 53: 141–145.
Jiménez, P. & Collada, C. (2000). Técnicas para la evaluación de la diversidad genética y su uso
en los programas de conservación. Investigación agraria. Sistemas y recursos
forestales, 2: 237-248.
Jonavičienė, K., Paplauskienė, V., & Brazauskas, G. 2009. Isozymes and ISSR markers as a tool for
the assessment of genetic diversity in Phleum spp. Žemdirbystė-Agriculture, 96: 47–57.
Jones, D.L. 1993. Cycads of the World. Smithsonian Institution Press, Washington, D.C.
Jost, L. 2007. Partitioning diversity into independent alpha and beta components Ecology, 88:
2427–2439.
78
Keller, L.F, & Waller, D.M. 2002. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology &
Evolution, 17: 230-241.
Kimura, M., & Crow, J.F. 1964. The number of alleles that can be maintained in a finite
population. Genetics 49: 725-738.
Korbin, M., Kuras, A., & Zurawicz, E. 2002. Fruit Plant Germplasm characterization using
molecular markers generated in RAPD and ISSR-PCR. Cellular and Molecular Biology
Letters, 7(2B): 785–794.
Levin, D.A. 1981. Dispersal versus gene flow in plants. Annals of the Missouri Botanical Garden,
68: 233-253.
Levsen, N.D., Crawford, D.J., Archibald, J.K., Santos-Guerra, A., & Mort, M.E., 2008. Ney’s to
Bayes’: comparing computational methods and genetic markers to estimate patterns
of genetic variation in Tolpis (Asteraceae). American Journal of Botany, 95: 1466–1474.
Lewontin, R.C. 1972. The Apportionment of Human Diversity Evolutionary Biology 6: 391–398.
Lewontin, R.C. 1974. The Genetic Basis of Evolutionary Change. New York: Columbia University
Press.
Li, J.M. & Jin, Z.X. 2008. Genetic structure of endangered Emmenopterys henry Oliv. based on
ISSR polymorphism and implications for its conservation. Genetica, 133: 227-234.
Limón-Salvador, F., 2009. Genética de Poblaciones de Zamia furfuracea L. f. (Zamiaceae); una
cícada endémica al estado de Veracruz, México. Tesis de licenciatura, Universidad
Veracruzana, México.
Lynch, M., & Milligan, B. 1994. Analysis of population-genetic structure using RAPD markers.
Molecular Ecology 3: 91-99.
79
Mantel, N. 1967. The detection of disease clustering and a generalized regression approach.
Cancer Research 27 (2): 209–220.
Marchant, C. J., 1968. Chromosome patterns and nuclear phenomena in the cycad families
Stangeriaceae and Zamiaceae. Chromosoma 24: 100-134.
Meirmans, P.G., & Hedrick, P.W. 2011. Assessing population structure: FST and related
measures. Molecular Ecology Resources 11: 5-18.
Meyer A, Garcia AAF, Souza AP, & Souza CL. 2004. Comparison of similarity coefficients used for
cluster analysis with dominant markers in maize (Zea mays L). Genetics and Molecular
Biology 27:83-91.
Miller M.P., 1997. Tools for population genetic analyses (TFPGA) 1.3: A Windows program for
the genetic data. Computer software distributed by author.
Moretti, A. 1990a. Cytotaxonomy of cycads. Memoirs of the New York Botanical Garden, 57:
114-22.
Moretti A., 1990b. Karyotypic data on north and central American Zamiaceae (Cycadales) and
their phylogenetic implications. American Journal of Botany, 77: 1016–1029.
Moretti A., Caputo P., Gaudio L., & Stevenson D.W. 1991. Intraspecific chromosome variation in
Zamia (Zamiaceae, Cycadales). Caryologia 44: 1-10.
Moretti A. & Sabato S., 1984. Karyotype evolution by centromeric fission in Zamia (Cycadales).
Plant Systematics and Evolution 146: 215-223.
Moyle LC. 2006. Correlates of genetic differentiation and isolation by distance in 17 congeneric
Silene species. Molecular Ecolology. 15(4): 1067-1081.
80
Nagalingum, N. S., Marshall, C. R., Quental, T. B., Rai, H. S., Little D. P. & Mathews S., 2011.
Recent synchronous radiation of a living fossil. Science 334: 796-799.
Nagaoka, T. & Y. Ogihara, 1997. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in
wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theoretical
and Applied Genetics, 94: 597-602.
Narzary, D., Rana, T.S. & Ranade, S.A. 2010. Genetic diversity in ISSR profiles across natural
populations of Indian pomegranates (Punica granatum L.). Plant Biology (12): 806- 813.
Negrón-Ortiz, V. & Breckon, G. J. 1989. Population structure in Zamia debilis (Zamiaceae) I. Size
classes, leaf phenology, and leaf turnover. American Journal of Botany 76: 891-900.
Negrón-Ortiz, V., Gorchov, D. L. & Breckon, A. J. 1996. Population structure in Zamia
(Zamiaceae) in northern Puerto Rico. II. Seed germination and stage-structured
population projection. International Journal of Plant Sciences, 157: 605-614.
Nei M. 1972. Genetic distances between populations. American Naturalist 106: 283-292.
Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 70: 3321–3323.
Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of
individuals. Genetics 89: 583-590.
Nicolalde-Morejón F, Vergara-Silva F, González-Astorga J, & Vovides AP 2011. Perspectivas
Sistemáticas de Zamia (Zamiaceae) en Megaméxico: de la taxonomía alfa a los códigos
de barras genéticos. Revista Mexicana de Biodiversidad. 82: 341-355.
Nicolalde-Morejón, F., 2009. Revisión taxonómica y Códigos de Barras de DNA para Zamia L. en
MegaMéxico. Tesis de doctorado. Instituto de Ecología A.C., México.
81
Nicolalde-Morejón, F., Vovides, A.P., & Stevenson, D.W., 2009. Taxonomic revision of Zamia in
Mega-Mexico. Brittonia, 61: 301-335.
Norstog, K. J. & P. K. Fawcett, 1989. Insect-Cycad symbiosis and its relation to the pollination of
Zamia furfuracea (Zamiaceae) by Rhopalotria mollis (curculionidae), American Journal
of Botany, 76(9): 1380-1394
Norstog K.J. & Nicholls T.J. 1997. The biology of cycads. Cornell University Press. Ithaca, NY, USA.
Norstog, K. J., Fawcett P. K & A. P. Vovides, 1992. Beetle pollination of two species of Zamia:
evolutionary and ecological considerations Palaeobotanist, 41:149-158.
Nybom H. 2004. Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific
genetic diversity in plants Molecular Ecology, 13: 1143–1155.
Octavio-Aguilar P, González-Astorga J, & Vovides AP. 2009. Genetic diversity through life history
of Dioon edule Lindley (Zamiaceae, Cycadales). Plant Biology 11: 525-536.
Osborne R & Vovides A.P., 2007. The cardboard plant, the cardboard palm, or Zamia furfuracea.
Palms y Cycads 97: 23-30.
Peakall, R., & Smouse, P.E., 2006. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic
software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6: 288-295.
Primack, R.B. 1993. Essentials of Conservation Biology. Sinauer Associates, Inc., Sunderland U.K.
Pusadee T, Jamjod S, Chiang Y, Rerkasem B, & Schaal BA 2009. Genetic structure and isolation
by distance in a landrace of Thai rice. Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 106: 13880–13885.
Octavio-Aguilar, P., González-Astorga, J., & Vovides, A.P. 2009. Genetic diversity through life
history of Dioon edule Lindley (Zamiaceae, Cycadales). Plant Biology, 11: 525-536.
82
Qiagen., 2006. Protocol: purification of total DNA from plant tissue (mini protocol), In: DNeasy
plant mini kit for miniprep purification of total cellular DNA from plant cells and
tissues, or fungi. p. 19-21.
Qian, W., Ge, S., & Hong, D.Y. 2001: Genetic variation within and among populations of a wild
rice Oryza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers. Theoretical and
Applied Genetics, 102: 440-449.
Reátegui-Zirena, E., Jean-François, R., Carvajal Vallejos, F., Corvera, R., Del-Castillo, D. & García-
Dávila, C. 2009. Evaluación de la variabilidad genética de la castaña Bertholletia excelsa
en la región de Madre de Dios (Perú), mediante marcadores microsatélites. Folia
Amazónica 18: 41-50.
Reynolds, C.E. & Houle, G. 2002. Mantel and partial Mantel tests suggest some factors that may
control the local distribution of Aster laurentianus at Îles de la Madeleine, Québec.
Plant Ecology, 164: 19-27.
Ricotta, C. & Burrascano, S. 2008. Beta diversity for functional ecology Preslia, 80: 61–71.
Ryman, N., & Leimar, O. 2009. GST is still a useful measure of genetic differentiation - a comment
on Jost’s D. Molecular Ecology 18: 2084–2087.
Rzedowski, J., 1978. Vegetación de México. Limusa, S. A. México, D.F.
Sabato, S. 1990. West Indian and South American Cycads. Memoirs of the New York Botanical
Garden, 57: 173-185.
Saitou, N. & Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing
phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 4: 406-425.
83
Schlüter, P.M. & Harris, S.A. 2006. Analysis of multilocus fingerprinting data sets containing
missing data. Molecular Ecology Notes, 6: 569-572.
Sharma IK, Jones DL, Foster PI, Young AG. 1999. Low isozymic differentiation among five species
of the Macrozamia heteromera group (Zamiaceae). Biochemical Systematics and
Ecology, 27: 67–77.
Slatkin, M. 1985. Gene flow in natural populations. Annual Review of Ecology, Evolution, and
Systematics, 16: 393–430.
Slatkin, M. 1987. Gene flow and the geographic structure of natural population. Science 236:
787-792.
Staub, J. E., Danin-Poleg, Y., Fazio, G., Horejsi, T., Reis, N., & Katzir, N. 2000. Comparative
analysis of cultivated melon groups (C. melo L.) using random amplified polymorphic
DNA and simple sequence repeat markers. Euphytica 115: 225-241.
Stevenson, D.W. 2001. Orden Cycadales. Flora de Colombia. Monografía No. 21. Editorial
Unibiblos. Bogotá D.C.
Stevenson, D.W., Norstog, K. & Fawcett, P. 1998. Pollination biology of cycads. In: Reproductive
Biology: In systematics, conservation, and economic botany. Eds. S. Owens & P. Rudall.
pp. 277–294. Royal Botanic Gardens, Kew.
Stevenson, D.W. Stanberg, L. & Calonje, M. 2012. The world list of cycads. Memoirs of the New
York Botanical Garden. En Prensa.
Souframanien, J., & Gopalakrishna, T. 2004. A comparative analysis of genetic diversity in
blackgram using RAPD and ISSR markers. Theoretical and Applied Genetics, 109: 1687-
1693.
84
Templeton, A.R. 1991. Genetics and conservation biology. In: Seitz, A. and Loeschche V. (Ed.),
Species Conservation a Population‐biological Approach. Basel, Birkhauser Verlag.,
15‐29.
Templeton, A. R. 2006. Population Genetics and Microevolutionary Theory. John Wiley & Sons.
Tsumura, Y., K. Ohba & S.H. Strauss, 1996. Diversity and inheritance of inter-simple sequence
repeat polymorphisms in Douglasfir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria
japonica). Theoretical and Applied Genetics, 92: 40-45.
UNEP-WCMC. 4 June, 2012. UNEP-WCMC Species Database: CITES-Listed Species
Vázquez Torres, M., Torres Hernández, L. & Bojórquez-Galván, L.H. 1999. Aprovechamiento
sustentable y conservación de la palma bola (Zamia furfuracea), especie endémica
protegida, en la zona de Los Tuxtlas, Veracruz. Universidad Veracruzana. Instituto de
Investigaciones Biológicas. Informe final SNIB-CONABIO proyecto No. Q039. México
D.F.
Vergara-Silva, F., Nicolalde-Morejón, F., González-Astorga, J. & Stevenson, D.W. 2012.
Biodiversidad de Zamiaceae en México. Revista Mexicana de Biodiversidad. En prensa.
Vijayan, K., Awasthi, A.K., Srivastava, P.P. & Saratchandra, B. 2004. Genetic analysis of Indian
mulberry varieties through molecular markers. Hereditas, 141: 8–14.
Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans M., Van De Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman
J., Kuiper M., & Zabeau M., 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.
Nucleic Acids Research, 23: 4407-4414.
Vovides, A.P., Iglesias, C., Pérez-Farrera, M., Vázquez-Torres, M. & Schippmann, U. 2002.
Peasant Nurseries: a concept for an integrated conservation strategy for Cycads in
85
Mexico. En: Maunder M, Clubbe C, Hankamer C, Groves M, eds. Plant Conservation in
the Tropics. Perspectives and practice. Kew, UK: The Royal Botanic Garden. Pp. 423-
444.
Vovides, A.P., Rees, J.D. & Vázquez-Torres, M. 1983. Flora de Veracruz. Zamiaceae. Fascículo 26.
INIREB, Xalapa, Veracruz, México.
Vovides, A.P. 1991. Insect Symbionts of some Mexican Cycads in their natural habitat. Biotropica
23: 102-104.
Vovides, A.P., Ogata, N., Sosa, V. & Peña-Garcia, E. 1997. Pollination of endangered Cuban cycad
Mimocycas calocoma (Miq.) A.DC. Botanical Journal of the Linnean Society 125: 201-
210.
Vovides, A.P. & Olivares M. 1996. Karyotype polymorphism in the cycad Zamia loddigesii
(Zamiaceae) of the Yucatan peninsula, Mexico. Botanical Journal of the Linnean Society
120: 77-83.
Walters, T.W. & Decker-Walters, D.S. 1991. Patterns of Allozyme Diversity in the West Indies
Cycad Zamia pumila (Zamiaceae). American Journal of Botany 78: 436-445.
Wang, X.M. 2010. Optimization of DNA isolation, ISSR-PCR system and primers screening of
genuine species of rhubarb, an important herbal medicine in China. Journal of
Medicinal Plants Research, 4(10): 904-908.
Weir, B.S. & Cockerham, C.C. 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population
structure. Evolution 38: 1358-1370.
86
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. & Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms
amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research,
18: 6531-6535.
Whitlock, M. 2011. G’ST and D do not replace FST. Molecular Ecology 20: 1083-1091.
Wolfe A.D. 2005. ISSR techniques for evolutionary biology, Methods in Enzymology, 395: 134–
144.
Wolfe, A.D. & Liston, A. 1998. Contributions of PCR-Based methods to Plant Systematics and
Evolutionary Biology. En: Soltis, Soltis y Doyle (eds.) Molecular Systematics of Plants II,
45-82, Kluwer academic Publishers, USA.
Wolfe, A.D., Xiang, Q.Y. & Kephart, S. R. 1998. Diploid hybrid speciation in Penstemon
(Scrophulariaceae). Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 95: 5112-
5115.
Wright, S. 1946. Isolation by Distance Under Diverse Systems of Mating. Genetics 31: 39–59.
Wright, S. 1969. The Theory of Gene Frequencies. Chicago.
Wright, S. 1978. Evolution and the Genetics of Populations vol. 4, Variability Within and Among
Natural Populations. University of Chicago Press, Chicago, IL.
Wu, S., Collins, G. & Sedgley, M.A. 2004. Molecular linkage map of olive (Olea europea L.) based
on RAPD, microsatellites and SCAR markers. Genome. 47: 26-35.
Xiao, L.Q., Ge, X.J., Gong, X., Hao, G. & Zheng, S.X. 2004. ISSR variation in the endemic and
endangered plant Cycas guizhouensis (Cycadaceae). Annals of Botany 94: 133–138.
87
Xiao, L.Q, & Gong, X. 2006. Genetic differentiation and relationships of populations in the Cycas
balansae complex (Cycadaceae) and its conservation implications. Annals of Botany,
97: 807–812.
Xiao, L., Gong, X., Hao, G., Ge, X., Tian, B. & Zheng, S. 2005. Comparison of the genetic diversity
in two species of cycads. Australian Journal of Botany 53(3): 219-223.
Xie, J., Jian S., & Nian, L. 2005. Genetic variation in the endemic plant Cycas debaoensis on the
basis of ISSR analysis. Australian Journal of Botany 53: 141-145.
Yang, S.L. & Meerow, A.W. 1996. The Cycas pectinata (Cycadaceae) complex: genetic
structure and gene flow. International Journal of Plant Sciences, 157: 468-483.
Yeh, F.C., Yang, R.C. & Boyle, T. 1999. POPGENE 32-version 1.31. Population Genetics
Software
Yu, H.H., Yang, Z.L., Sun, B. & Liu, R.N. 2011. Genetic diversity and relationship of endangered
plant magnolia officials assessed with ISSR polymorphisms. Biochemical Systematics
and Ecology, 39(2): 71-78.
Zietkiewicz, E., Rafalski, A. & Labuda, D. 1994. Genome fingerprinting by Simple Sequence
Repeat (SSR)-Anchored polimerase chain reactions amplification. Genomics 20: 176-
183.
