Dispositivi e attrezzature Dispositivi e attrezzature per la vitrificazioneper la vitrificazione

Dr. Lodovico PARMEGIANIDr. Lodovico PARMEGIANIGynePro Medical CentersGynePro Medical Centers

Bologna, ItalyBologna, Italy

DisclosureDisclosure

Lodovico Parmegiani holds an international patent, PCT/IB2009/007801Lodovico Parmegiani holds an international patent, PCT/IB2009/007801

““Device and method for sterilizing liquid nitrogen by ultraviolet radiation”Device and method for sterilizing liquid nitrogen by ultraviolet radiation”

Vitrificazione di cellule e tessuto riproduttivo umanoVitrificazione di cellule e tessuto riproduttivo umano

ovociti ed embrioniovociti ed embrioni impiego clinico in costante crescitaimpiego clinico in costante crescita

spermatozoi e tessuto ovarico spermatozoi e tessuto ovarico testicolaretesticolare sperimentale/ impiego meno diffusosperimentale/ impiego meno diffuso

Parmegiani et al, Parmegiani et al, Journal of Reproductive and Journal of Reproductive and Stem Cell Biotechnology Stem Cell Biotechnology 20122012

tecnicatecnica volume minimo di terreno di vitrificazionevolume minimo di terreno di vitrificazione elevata viscositàelevata viscosità

alta concentrazione dei crioprotettorialta concentrazione dei crioprotettori alta velocità per “cooling” and “warming”alta velocità per “cooling” and “warming”

dominanza del warmingdominanza del warming dispositivi specificamente progettati: carriersdispositivi specificamente progettati: carriers immersione diretta in azoto liquidoimmersione diretta in azoto liquido

Open carriersOpen carriers

Open Pulled Straw Open Pulled Straw Vajta et al,1998Vajta et al,1998

Cryoloop Cryoloop Lane et al, 1999Lane et al, 1999

Hemi-Straw Hemi-Straw Vandervoost et al, 2001Vandervoost et al, 2001

Cryotop Cryotop Kuwayama et al, 2005Kuwayama et al, 2005

Cryoleaf Cryoleaf Chian et al, 2009Chian et al, 2009

Cryolock Cryolock Bernal et al, 2009Bernal et al, 2009

Vitri-inga Vitri-inga Almodin et al, 2010Almodin et al, 2010

Plastic-blade Plastic-blade Sugiyama et al, 2010Sugiyama et al, 2010

Rapid-I, Ultravit, etc…Rapid-I, Ultravit, etc… gli “open carriers” sono solitamente usati per il gli “open carriers” sono solitamente usati per il

congelamento di ovociti umanicongelamento di ovociti umani Antinori et al, 2007; Cobo et al, 2007; Rienzi et al, 2009; Ubaldi et al, 2010; Antinori et al, 2007; Cobo et al, 2007; Rienzi et al, 2009; Ubaldi et al, 2010;

Garcia et al, 2011Garcia et al, 2011

Closed carriersClosed carriers

Il modello “straw-in-straw”, isola il carrier interno Il modello “straw-in-straw”, isola il carrier interno che contiene le cellule dal LNche contiene le cellule dal LN22 attraverso una straw attraverso una straw esterna saldabileesterna saldabile Kuleshova and Shaw, 2000; Isachenko et al, 2005Kuleshova and Shaw, 2000; Isachenko et al, 2005

permette buoni risultati con zigoti, embrioni, permette buoni risultati con zigoti, embrioni, blastocisti e tessuto ovaricoblastocisti e tessuto ovarico Liebermann, 2010; Isachenko et al, 2005, 2010Liebermann, 2010; Isachenko et al, 2005, 2010

questo sistema saldato non è preferito per gli questo sistema saldato non è preferito per gli ovociti perchè determina una riduzione nella ovociti perchè determina una riduzione nella velocità di cooling/warmingvelocità di cooling/warming

in alternativa, sono stati sviluppati “single-straw in alternativa, sono stati sviluppati “single-straw closed systems” che permettono un cooling più closed systems” che permettono un cooling più rapido :rapido : CryoTipCryoTip Kuwayama et al, 2005Kuwayama et al, 2005 CryopetteCryopette Keskintepe et al, 2009Keskintepe et al, 2009

MM

M

MM

M

MM

M

M

Oocyte/embryo

microorganism

LN2 (-196°C) Culture medium (37°C)

MM

M

M

MM

Adhesion of frozen microorganisms to oocyte/embryo and on carrier’s surface

Activation of warmed microorganisms and contamination of culture medium

Open Pulled StrawCryoloopHemi-StrawCryotopCryoleafCryolockVitri-ingaPlastic-blade

VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN2

THAWING: Immersion of contaminated carrier in warming solution at 37°C

Parmegiani RBM Online 2011

M

M

M

MM

M

MM

M

M

microorganism

LN2 (-196°C) Culture medium (37°C)

M

M

M

M

M

M

Adhesion of frozen microorganisms to sealed external straw

No contamination of culture medium

“Strawin Straw”High SecurityVitrification

VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN2

THAWING: Immersion of clean inner carrier in warming solution at 37°C

Oocyte/embryo

Parmegiani RBM Online 2011

VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN2

M

M

M

MM

M

M

M

M

M

microorganism

THAWING: Immersion of contaminated carrier in warming solution at 37°C

LN2 (-196°C) Culture medium (37°C)

M

MM

MM

Adhesion of frozen microorganisms to carrier’s surface

Activation of warmed microorganisms and contamination of culture medium

CryoTipCryopette

M

Oocyte/embryo

Parmegiani RBM Online 2011

“Open vitrification”

il rischio di contaminazione del terreno di coltura al il rischio di contaminazione del terreno di coltura al “warming” - a causa del precedente contatto tra le cellule “warming” - a causa del precedente contatto tra le cellule e/o la superficie esterna del carrier - non può essere e/o la superficie esterna del carrier - non può essere escluso, se il LNescluso, se il LN22 usato per la vitrificazione/stoccaggio è usato per la vitrificazione/stoccaggio è

stato accidentalmente contaminatostato accidentalmente contaminato Bielanski et al, Cryobiology 2000, 2003 -Theriogenology 2011Bielanski et al, Cryobiology 2000, 2003 -Theriogenology 2011

non tutti i closed-carriers sono sicurinon tutti i closed-carriers sono sicuri single straw closed carrierssingle straw closed carriers

Parmegiani et al, Fertil Steril 2012Parmegiani et al, Fertil Steril 2012 vitrificazione mediante “supercooled air”vitrificazione mediante “supercooled air”

Parmegiani, Fertil Steril 2011Parmegiani, Fertil Steril 2011 ultravitrificazioneultravitrificazione

Parmegiani and Vajta, Fertil Steril 2011Parmegiani and Vajta, Fertil Steril 2011

Sterilizzazione UV di LNSterilizzazione UV di LN22

irradiazione con la dose UV irradiazione con la dose UV necessaria per deattivare i necessaria per deattivare i microorganismi che microorganismi che sopravvivono in LNsopravvivono in LN22 Parmegiani Parmegiani PCT/IB2009/007801PCT/IB2009/007801

irradiazione UV erogata in irradiazione UV erogata in entro un periodo breve prima entro un periodo breve prima che l’azoto evapori che l’azoto evapori completamentecompletamente Time = UV dose/UV intensity (I)Time = UV dose/UV intensity (I)

Controllo dell’efficacia della sterilizzazione di LNControllo dell’efficacia della sterilizzazione di LN22

Parmegiani et al, Fertil Steril 2010Parmegiani et al, Fertil Steril 2010

A: total bacteriaA: total bacteria

B: pseudomonas B: pseudomonas aeruginosaaeruginosa

C: escherichia coliC: escherichia coli

D: aspergillus nigerD: aspergillus niger

assenza di assenza di contaminazione nel contaminazione nel dewar che dewar che conteneva LNconteneva LN22 irradiato con UVirradiato con UV

contaminazione dei dewars prima contaminazione dei dewars prima

del riempimento con LNdel riempimento con LN22

contaminazione contaminazione nel dewar dopo nel dewar dopo

aggiunta ed aggiunta ed evaporazione di evaporazione di

LN2LN2

Efficiency of LNEfficiency of LN22 - UV sterilization - UV sterilization

la giusta dose di radiazione UV la giusta dose di radiazione UV deattiva la crescita di ogni deattiva la crescita di ogni microrganismomicrorganismo virus tipo Epatite: 8000 UV dosevirus tipo Epatite: 8000 UV dose fungi tipo Aspergillus niger: 330000 UV fungi tipo Aspergillus niger: 330000 UV

dosedose Parmegiani et al, Hum Reprod 2009Parmegiani et al, Hum Reprod 2009

la decontaminazione di piccoli la decontaminazione di piccoli volumi di LNvolumi di LN22 via UV è facile e via UV è facile e rapidarapida Nterilizer, strumento per la sterilizzazione Nterilizer, strumento per la sterilizzazione

UV- LNUV- LN22 assicura e certifica una dose UV assicura e certifica una dose UV minima di 660000 μWs/cmminima di 660000 μWs/cm22 per ogni cliclo per ogni cliclo di sterilizzazionedi sterilizzazione

Parmegiani et al, RBM Online 2010Parmegiani et al, RBM Online 2010

StoccaggioStoccaggio

lo stoccaggio dei tessuti riproduttivi è sicurolo stoccaggio dei tessuti riproduttivi è sicuro nessuna cross-contaminazione in 25 anninessuna cross-contaminazione in 25 anni

Pomeroy et al, Fertil Steril 2010; Bielanski et al, Theriogenology 2011Pomeroy et al, Fertil Steril 2010; Bielanski et al, Theriogenology 2011

..ma qualsiasi tecnica volta a prevenire il rischio ..ma qualsiasi tecnica volta a prevenire il rischio ipotetico di contaminazione deve essere benvenutaipotetico di contaminazione deve essere benvenuta nuove probabili legginuove probabili leggi diffusione della vitrificazionediffusione della vitrificazione

è urgente stabilire un sistema di vitrificazione che è urgente stabilire un sistema di vitrificazione che impedisca qualsiasi rischio di ipotetica impedisca qualsiasi rischio di ipotetica contaminazione delle cellule riproduttivecontaminazione delle cellule riproduttive questo sistema in futuro potrebbe essere utile anche per altre cellule questo sistema in futuro potrebbe essere utile anche per altre cellule

umane, tessuti, organi interi…umane, tessuti, organi interi…

European Community regulationsEuropean Community regulations

Italian IVF Law (40/2004)Italian IVF Law (40/2004) specimens from patients HIV/HBV/HCV positive must be cryostored specimens from patients HIV/HBV/HCV positive must be cryostored

in separate cryobanksin separate cryobanks

European Community directives European Community directives 2006/17/EC-2006/86/EC-2004/23/EC indicate:2006/17/EC-2006/86/EC-2004/23/EC indicate: procedures to avoid the risk of contaminationprocedures to avoid the risk of contamination sterile tools and devices for tissue/cells handling sterile tools and devices for tissue/cells handling procedures to sterilize tools and devicesprocedures to sterilize tools and devices suggested certified medical devicessuggested certified medical devices

allo stato attuale non ci sono linee guida o regolamenti allo stato attuale non ci sono linee guida o regolamenti che impediscano il contatto diretto tra tessuti e/o che impediscano il contatto diretto tra tessuti e/o cellule e LNcellule e LN22

““Aseptic open vitrification”Aseptic open vitrification”Parmegiani et al, RBM Online 2011Parmegiani et al, RBM Online 2011

usando LNusando LN2 2 sterilizzato con UV, la vitrificazione può sterilizzato con UV, la vitrificazione può

essere eseguita in maniera asettica mediante “open essere eseguita in maniera asettica mediante “open carriers” che vengono racchiusi in astucci ermeticicarriers” che vengono racchiusi in astucci ermetici

primo studio al mondo sull’efficacia e sicurezza della primo studio al mondo sull’efficacia e sicurezza della sterilizzazione UV del sterilizzazione UV del LNLN22 combinata con lo combinata con lo

stoccaggio ermetico degli ovociti umanistoccaggio ermetico degli ovociti umani comparazione della performance di ovociti MII fratelli freschi e vitrificati comparazione della performance di ovociti MII fratelli freschi e vitrificati

in pazienti infertiliin pazienti infertili ovociti MII randomizzati per ICSI; gli ovociti fratelli soprannumerari ovociti MII randomizzati per ICSI; gli ovociti fratelli soprannumerari

vitrificativitrificati dopo l’insuccesso con ovociti freschi: ICSI degli ovociti vitrificatidopo l’insuccesso con ovociti freschi: ICSI degli ovociti vitrificati

Clinical Trials Registration number: ISRCTN51912603Clinical Trials Registration number: ISRCTN51912603

Materiali e metodiMateriali e metodi Cryotop

Kuwayama et al, 2005Kuwayama et al, 2005

sterilizzazione LN2 mediante Nterilizer Parmegiani et al, 2009, 2010, 2011Parmegiani et al, 2009, 2010, 2011

Cryotops racchiusi in goblets di alluminio (pre-raffreddati) per isolarli ermeticamente allo stoccaggio precedentemente immersi verticalmente

in LN2

Cryotops inseriti nei goblets tenendo la strip con gli ovociti nei vapori N2 sopra LN2

goblets chiusi ermeticamente con tappi sterilizzati e nastro adesivo

Risultati

La sterilizzazione UV di LNLa sterilizzazione UV di LN22 accoppiata con stoccaggio accoppiata con stoccaggio ermetico non influenza negativamente la competenza di ermetico non influenza negativamente la competenza di

sviluppo degli ovociti vitrificatisviluppo degli ovociti vitrificati

““Efficiency of aseptic open vitrificationEfficiency of aseptic open vitrificationand hermetical cryostorage of human oocytes”and hermetical cryostorage of human oocytes”

qualsiasi tipo di carrier per qualsiasi tipo di carrier per la vitrificazione può essere la vitrificazione può essere usatousato

si elimina qualsiasi rischio si elimina qualsiasi rischio di contaminazione di contaminazione

si implementa la sicurezza si implementa la sicurezza del cryo-bankingdel cryo-banking

si incoraggiano i produttori si incoraggiano i produttori a progettare, realizzare e a progettare, realizzare e commercializzare commercializzare contenitori ermetici per lo contenitori ermetici per lo stoccaggio dei carriersstoccaggio dei carriers

Hermetical goblets for cryostorage of human vitrifiedHermetical goblets for cryostorage of human vitrifiedspecimens – specimens – Parmegiani et Rienzi, Hum Reprod 2011Parmegiani et Rienzi, Hum Reprod 2011

Applicazioni futureApplicazioni future

decontaminazione di dewars e decontaminazione di dewars e criobanchecriobanche

““aseptic open vitrification”aseptic open vitrification” tessuto ovaricotessuto ovarico cellule staminalicellule staminali organi interiorgani interi

ovaio, testicolo, etc.? ovaio, testicolo, etc.?

procedura di decontaminazione procedura di decontaminazione prima del warmingprima del warming

Procedura di decontaminazione al warmingProcedura di decontaminazione al warming

microrganismi sopravvivono in LNmicrorganismi sopravvivono in LN22/NV/NV Parmegiani et al, Fertil Steril 2010; Grout and Morris, Parmegiani et al, Fertil Steril 2010; Grout and Morris, Theriogenology 2009Theriogenology 2009

patogeni rinvenuti in criobanche di cellule/tessuti patogeni rinvenuti in criobanche di cellule/tessuti riproduttivi umaniriproduttivi umani stoccaggio in LNstoccaggio in LN2/2//NV/NV

Morris, Cryobiology 2005; Bielanski,Morris, Cryobiology 2005; Bielanski,Theriogenology 2012Theriogenology 2012

l’esposizione a LNl’esposizione a LN22/NV è potenzialmente pericolosa /NV è potenzialmente pericolosa stoccaggio non ermeticostoccaggio non ermetico procedure di vitrificazione apertaprocedure di vitrificazione aperta

contaminazione delle cellule riproduttive umane e terreno contaminazione delle cellule riproduttive umane e terreno di coltura durante lo scongelamento/warmingdi coltura durante lo scongelamento/warming Parmegiani et al, RBM Online 2011; Hum Reprod 2011Parmegiani et al, RBM Online 2011; Hum Reprod 2011

3 wash procedure3 wash procedureParmegiani et al, Fertility and Sterility, In PressParmegiani et al, Fertility and Sterility, In Press

procedura di lavaggio prima dello scongelamento minimizza il rischio ipotetico di contaminazione della coltura

2 lotti di LN2 contaminati sperimentalmente Batteri: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,

Stenotrophomonas maltophilia Funghi: Aspergillus niger inoculazione di 109 CFU

10.000 volte più alta di quella mai rinvenuta in criobanche per uso umano

232 carriers per la vitrificazione immersi in LN2 contaminato

Cryotop, Cryoleaf, Cryopette 117 in LN2 con batteri 25 in LN2 con funghi 

carriers testati microbiologicamente randomizzati mediante software

senza alcun lavaggio (controllo) dopo tre lavaggi successivi con azoto sterile certificato

3-Wash with Sterile Liquid Nitrogen (SLN2)

WARMINGWARMING

CRYOCRYO

BANKBANK

SLNSLN22SLNSLN22 SLNSLN22

NTERILIZERNTERILIZER

Device for sterilization and certification of LNDevice for sterilization and certification of LN22

Parmegiani et al, Hum Reprod 2009Parmegiani et al, Hum Reprod 2009

Fertil steril 2010; RBM Online 2011Fertil steril 2010; RBM Online 2011

NTERILIZERNTERILIZER

Device for sterilization and certification of LNDevice for sterilization and certification of LN22

Parmegiani et al, Hum Reprod 2009Parmegiani et al, Hum Reprod 2009

Fertil steril 2010; RBM Online 2011Fertil steril 2010; RBM Online 2011

3-Wash with SLN3-Wash with SLN22 - risultati e conclusioni - risultati e conclusioni

efficiente decontaminazione in condizioni sperimentali estremeefficiente decontaminazione in condizioni sperimentali estreme scongelamento di cellule riproduttive umane in crio-contenitori "non-ermetici“scongelamento di cellule riproduttive umane in crio-contenitori "non-ermetici“

carriers per la vitrificazione, straws non ermetiche, etccarriers per la vitrificazione, straws non ermetiche, etc

certificazione della sterilità del lotto di SLNcertificazione della sterilità del lotto di SLN22 traccia dell’avvenuta decontaminazionetraccia dell’avvenuta decontaminazione

Controllo Qualità o per le legislazioni restrittive Controllo Qualità o per le legislazioni restrittive

la vitrificazione sta la vitrificazione sta emergendo come il emergendo come il metodo di metodo di criopreservazione più criopreservazione più impiegato per le cellule impiegato per le cellule riproduttive umaneriproduttive umane

l’ottimizzazione di alcuni l’ottimizzazione di alcuni aspetti tecnici, come la aspetti tecnici, come la sterilizzazione di LNsterilizzazione di LN22, ,

permette di migliorare permette di migliorare l’efficacia e la sicurezza l’efficacia e la sicurezza della vitrificazionedella vitrificazione

Dispositivi e attrezzature per la vitrificazioneDispositivi e attrezzature per la vitrificazioneLodovico ParmegianiLodovico Parmegiani