Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

8/19/2019 Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

http://slidepdf.com/reader/full/dinh-luong-aflatoxins-trong-thuc-an-chan-nuoi-bang-phuong-phap 1/106

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA ----- -----

TRẦN VĂN PHI LONG

ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXINS TRONG THỨC ĂN CHĂN

NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆUNĂNG CAO GHÉP KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

Cần Thơ, 2015

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú




BỘ MÔN HÓA ----- -----

TRẦN VĂN PHI LONG

ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXINS TRONG THỨC ĂN CHĂN

NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO GHÉP KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. NGUYỄN TRỌNG TUÂN

Cần Thơ, 2015





Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long

i

LỜ I CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và rèn luyện ở trường Đại học Cần Thơ, tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức bổ ích cùng với những kỹ năng quý báu mà

quý thầy cô đã truyền dạy tận tình. Đặc biệt, trong quá trình thực hiện luận văntôi đã gặp không ít trở ngại nhưng nhờ sự giúp đỡ và hướng dẫn nhiệt tình củaquý thầy cô, sự động viên từ phía bạn bè, người thân đã giúp tôi hoàn thành

luận văn của mình. Với nhiều sự tri ân sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cámơn đến:

Quý thầy, cô trường Đại học Cần Thơ nói chung và Bộ môn Hóa học, khoa Khoa học Tự nhiên nói riêng đã truyền thụ nhiều kiến thức quý báu vềchuyên môn.

Thầy Nguyễn Trọng Tuân – Trưởng bộ môn Hóa học – Cố vấn học tậpđã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt

nghiệp.

Cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã tận tình hướng dẫn, cung cấp những kiếnthức cần thiết và bổ ích liên quan đến đề tài.

Công ty cổ phần chứng nhận và giám định Vinacert, chi nhánh Cần Thơ

đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện luận văn.

Anh La Văn Thái - Trưởng phòng Hóa và chị Võ Thị Thúy An - K ỹ

thuật viên sắc ký cùng với các anh chị chung phòng thí nghiệm đã chỉ bảonhững kiến thức quý báu khi làm việc và hướng dẫn các kỹ năng thao tác

trong thực hành thí nghiệm.

Tập thể lớp Hóa dược khóa 37 đã quan tâm, chia sẻ nhiều kinh nghiệm

học tập cũng như cuộc sống cho tôi trong suốt 4 năm qua. Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

Sinh viên thực hiện

Trần Văn Phi Long






ii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Bộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚ NG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Trọng Tuân

2. Đề tài: Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

3. Sinh viên thực hiện: Trần Văn Phi Long MSSV: 2112044

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4. Nội dung nhận xét: a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế: ............................................................................................................................................................................................................................................................

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dungchính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

TS. Nguyễn Trọng Tuân






iii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Bộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………

2. Đề tài: Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

3. Sinh viên thực hiện: Trần Văn Phi Long MSSV: 2112044

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:............................................................................................................................................................................................................................................................

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dungchính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ phản biện






iv

TÓM TẮT

Một phương pháp đơn giản và hiệu quả đã được phát triển để xác định

đồng thời các aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC-MS/MS). Chất phân tích được chiếtvới dung dịch MeOH:H2O (4:1) từ mẫu rắn đã được xay mịn, được làm sạch bằng cột chiết pha rắn. Quy trình định lượng sử dụng hệ thống HPLC-MS/MS,

cột pha đảo C18 (50 mm x 2mm, 3,5 μm), pha động là H 2O:ACN. Dãy chuẩnvới các nồng độ 0,75-6 ppb, các giá trị R2 đều lớn hơn 0,99. Các giá trị RSD< 4%. Độ đúng trong khoảng 87,8%-105,7%. Giới hạn phát hiện (LOD) là 1

ppb và giới hạn định lượng (LOQ) là 3 ppb. Kết quả trên cho thấy phương

pháp có độ đúng và độ nhạy cao, có thể dùng để xác định ở mức hàm lượngvết của các aflatoxins. Kết quả phân tích 30 mẫu thức ăn chăn nuôi có 8 mẫu

(chiếm 23,33%) nhiễm aflatoxins và có 1 mẫu (chiếm 3,33%) có hàm lượngaflatoxin B1 vượt mức quy định cho gà con và không có mẫu nào vượt mứcquy định cho gà trưởng thành.






v

ABSTRACT

A simple and effective method was developed for the simultaneous

determination of aflatoxins in feed by high performance liquid

chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Analytes wereextracted in MeOH:H2O (4:1) from pureed solid samples, purified using Oasis

cartridges. Determination by using HPLC-MS/MS system, RP-column C18

(50 mm x 2 mm, 3.5μm), mobile phase was H2O:ACN. The concentration of

standard solutions is from 0.75 to 6 ppb, R 2 values are greater than 0.99. RSD

values are less than 4% respectively. The recovery is from 87.8% to 105.7%.

The limit of detection (LOD) was 1 ppb and the limit of qualifycation was 3

ppb. The results showed that the developed method is sensitive, accurate and

can be used to determine the levels of aflatoxins. The result analysis of 30 feed

samples showed that there were only 8 samples (23.33%) infected aflatoxins,

1 sample (3.33%) exceeded the allowed limit with aflatoxin B1 for chicks and

no sample was out of regulation for mature chickens.






vi

Năm học 2014 – 2015

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứucủa tôi trong khuôn khổ của đề tài “Định lượng aflatoxins trong thức ăn chănnuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ”.

Ký tên

Tên của sinh viên/học viên

Ngày.........................

Luận văn tốt nghiệp ngành Hóa học

Mã số: ………

Đã bảo vệ và được duyệt

Hiệu trưởng:……………………………………

Trưởng khoa:……………………………………

Trưởng chuyên ngành

....................................

Cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Trọng Tuân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO







vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i

TÓM TẮT ......................................................................................................... iv

ABSTRACT ...................................................................................................... v

DANH MỤC BẢ NG ......................................................................................... x

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... xii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ................................................................................ 1

Đặt vấn đề ....................................................................................... 1 1.1

Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................... 2 1.2

CHƯƠNG 2 TỔ NG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3

Tổng quan về aflatoxins .................................................................. 3 2.1

2.1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxins [1], [3], [4] ................................. 3

2.1.2 Nguồn gốc lây nhiễm aflatoxins [1] ........................................ 4

2.1.3 Đặc điểm của Aspergillus flavus .............................................. 4

2.1.4 Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa các aflatoxins ................ 6

2.1.5 Độc tính của aflatoxins [1], [5] ................................................ 7

2.1.6 Một số tác dụng của aflatoxins ................................................ 8

2.1.7 Con đườ ng sinh tổng hợ p aflatoxin B1 [3], [5] ..................... 14

2.1.8 Những giải pháp phòng và chống độc tố nấm mốc ............... 17

2.1.9 Quy định về hàm lượ ng cho phép của Aflatoxin trong thức ănhỗn hợp chăn nuôi ................................................................................... 18

K ỹ thuật chiết pha r ắn (SPE) [6] ................................................... 19 2.2

2.2.1 Giớ i thiệu ............................................................................... 19

2.2.2 Phân loại ................................................................................. 20

2.2.3 Quy trình chiết SPE ............................................................... 24

Đại cương về HPLC và hệ thống HPLC-MS/MS [7] ................... 27 2.3

2.3.1 Đại cương về HPLC ............................................................... 27






viii

2.3.2 Hệ thống HPLC-MS/MS ....................................................... 29

Một số phương pháp nghiên cứu định lượ ng aflatoxins ............... 30 2.4

2.4.1 Các phương pháp xác định bằng HPLC [8], [9], [10] ........... 30

2.4.2 Phương pháp ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay)

[11] ........................................................................................................... 32

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U .............................................. 33

Thời gian, địa điểm ....................................................................... 33 3.1

Phương tiện nghiên cứu ................................................................ 33 3.2

3.2.1 Thiết bị ................................................................................... 33

3.2.2 Dụng cụ .................................................................................. 33

3.2.3 Hóa chất và thuốc thử ............................................................ 34

3.2.4 Cách pha các dung dịch, thuốc thử ........................................ 34

Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 35 3.3

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu ............................................................ 35

3.3.2 Phương pháp phân tích .......................................................... 35

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu ..................................................... 35

Hoạch định thí nghiệm .................................................................. 35 3.4

Tiến hành thí nghiệm .................................................................... 36 3.5

3.5.1 Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS [12], [13] ..................... 36

3.5.2 Tối ưu hóa quy trình chiết ...................................................... 38

3.5.3 Thẩm định quy trình phân tích ............................................... 39

3.5.4 Tiến hành phân tích trên một số mẫu thật ở công ty Vinacert 44

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N ................................................... 46

Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS ............................................. 46 4.1

4.1.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy máy HPLC .................................. 46

4.1.2 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ ............................................... 50

Tối ưu hóa quy trình chiết ............................................................. 51 4.2

K ết quả thẩm định ......................................................................... 53 4.3

4.3.1 Độ tuyến tính.......................................................................... 53






ix

4.3.2 Độ đúng .................................................................................. 53

4.3.3 Độ chính xác .......................................................................... 54

4.3.4 Giớ i hạn phát hiện (LOD) ...................................................... 54

4.3.5 Giớ i hạn định lượ ng (LOQ) ................................................... 54

K ết quả phân tích một số mẫu thức ăn hỗn hợ p cho gà tại công ty4.4

Vinacert ........................................................................................................ 54

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬ N VÀ KIẾ N NGHỊ .................................................... 56

K ết luận ......................................................................................... 56 5.1

Kiến nghị ....................................................................................... 56 5.2

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 60






x

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Một số tính chất lý hóa quan trọng của aflatoxins ............................. 7

Bảng 2.2 Quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B1 và hàm

lượng tổng số các aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà ........... 18

Bảng 2.3 Những quy định mức cho phép aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ (FAOnăm 1995) ........................................................................................................ 18

Bảng 2.4 Những quy định về hàm lượng aflatoxin B1 trong thức ăn gia súc, gia cầm ở các nước EU .................................................................................... 19

Bảng 2.5 Các pha tĩnh trong SPE và các điều kiện tương ứng ........................ 25

Bảng 2.6 Các loại sắc ký trong HPLC và đặc điểm của mỗi loại .................... 28

Bảng 3.1 Một số thông số cài đặt cho MS1 ..................................................... 36

Bảng 3.2 Một số thông số cài đặt cho MS2 ..................................................... 37

Bảng 3.3 Một số thông sô cài đặt cho MS3 ..................................................... 37

Bảng 4.1 Thành phần và tỉ lệ pha động ........................................................... 50

Bảng 4.2 Điều kiện của MS ............................................................................. 51

Bảng 4.3 Điều kiện phân mảnh ion ................................................................. 51

Bảng 4.4 Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của các chất .................. 53

Bảng 4.5 Kết quả phân tích nồng độ aflatoxins trên các mẫu ......................... 55

Bảng 5.1 Kết quả thẩm định quy trình phân tích aflatoxins ............................ 56






xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái nấm mốc A. Flavus ............................................................. 5

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các aflatoxins ........................................................ 6

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của aflatoxin M1 và M2 ....................................... 6

Hình 2.4 Con đường chuyển hóa của Aflatoxin B1 ........................................ 12

Hình 2.5 Quá trình sinh tổng hợp aflatoxin B1 ............................................... 16

Hình 2.6 Tương tác trong SPE pha thường ..................................................... 21

Hình 2.7 Tương tác trong SPE pha đảo ........................................................... 22

Hình 2.8 Tương tác trong SPE trao đổi ion ..................................................... 23

Hình 2.9 Tương tác trong SPE dạng kết hợp ................................................... 23

Hình 2.10 Quy trình chiết pha rắn (SPE) ......................................................... 24

Hình 3.1 Quy trình xử lý mẫu .......................................................................... 38

Hình 3.2 Quy trình chiết pha rắn thứ nhất ....................................................... 38

Hình 3.3 Quy trình chiết pha rắn thứ hai ......................................................... 39

Hình 3.4 Cách tính giá trị S/N ......................................................................... 43

Hình 3.5 Quy trình phân tích mẫu ................................................................... 45

Hình 4.1 Sắc ký đồ chuẩn AFs 0,75 ppb theo phương pháp 1 ........................ 47



Hình 4.4 Quy trình chiết pha rắn thứ nhất ....................................................... 52

Hình 4.5 Quy trình chiết SPE thứ hai .............................................................. 52

Hình 4.6 Độ thu hồi trung bình của các chất nhóm aflatoxins ........................ 53

Hình 4.7 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các chất nhóm aflatoxins ........ 54






xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa

AFB1

AFB2AFG1

AFG2

AFM1

AFM2

AFP1

AFQ1

AFsDNA

RND

LD50

DMSO

MeOH

ACN

HLPCMS

HPLC-MS/MS

UV

SPE

LLE

NP-HPLCRP-HPLC

P-HPLC

IE-HPLC

IPE-HPLC

LOD

LOQ

QCVN

Aflatoxin B1

Aflatoxin B2Aflatoxin G1

Aflatoxin G2

Aflatoxin M1

Aflatoxin M2

Aflatoxin P1

Aflatoxin Q1

Nhóm AflatoxinsDeoxyribo nucleic acid

Ribo nucleic acid

Lethal dose 50% animal testing

Dimethyl sulfoxide

Methanol

Acetonitril

High performance liquid chromatographyMass spectrometry

High performance liquid chromatography tandem masssectrometry

Ultraviolet

Solid – phase extraction

Liquid – liquid extraction

Normal phase – HPLC

Reverse phase – HPLC

Partition – HPLC

Ion exchange – HPLC

Ion pair exchange – HPLC

Limit of detection

Limit of qualifycation

Quy chuẩn Việt Nam






1

CHƯƠNG 1

GIỚ I THIỆU

Đặt vấn đề 1.1

Độc tố nấm mốc là những chất độc tiềm ẩn nhưng với khả năng gây hạicủa chúng thì vô cùng nghiêm trọng. Những loại thực phẩm bị mọc nấm và

biểu hiện ra bên ngoài như có đốm trắng, vàng hoặc đen thì chúng ta dễ dàng

nhận biết và loại bỏ chúng. Tuy nhiên những loại thực phẩm như ngô, đậu phộng, đậu xanh, các loại ngũ cốc khi chỉ mới phát triển nấm hoặc chỉ vô tình

nhiễm độc tố nấm mốc thì người ta vẫn sử dụng để làm bánh kẹo hay chế biếncác dạng bột dinh dưỡng, sữa bột...mà không hề hay biết rằng sử dụng những

loại thực phẩm này lâu ngày gây sẽ gây tổn hại đến các bộ phận trong cơ thể,nhẹ thì bị viêm, suy giảm chức năng, nặng thì bị hoại tử, ung thư.

Aflatoxins là một trong những nhóm chất độc mạnh nhất được sản sinhtừ các loài nấm mốc trong tự nhiên. Nó bao gồm một họ độc tố được sinh ra từ

nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus được tìm thấy rất nhiều ởkhắp nơi trên Việt Nam. Những loại thực phẩm thường nhiễm Aspergillus

flavus như đậu phộng, ngô, lúa mì và các loại hạt có dầu khác. Đã có nhiềunghiên cứu chứng minh aflatoxins gây tổn thương gan, thận; gây ung thư, hoại

tử; làm giảm khả năng miễn dịch của cơ thể. Trong rất nhiều loại aflatoxinstrong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất. Chất độcaflatoxins còn được bài tiết qua sữa bò dưới dạng đã chuyển hóa nhưng vẫncòn khả năng gây ung thư. Khi con người ăn thịt hay uống sữa của vật nuôi đã

ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxins thì khả năng độc tố đi vào cơ thể người là hoàntoàn có thể.

Các cơ sở chế biến thức ăn chăn nuôi cũng lấy nguyên liệu từ hạt ngô,đậu phộng, khoai mì, các loại đậu đỗ không thể dùng cho người đem sản xuất

thức ăn cho vật nuôi. Nếu hàm lượng độc tố nấm mốc trong thức ăn cho vậtnuôi quá cao, một mặt sẽ gây độc trực tiếp đến con vật, có thể gây ra vụ chếthàng loạt gây tổn thất về kinh tế; mặt khác, chất độc đi vào cơ thể vật nuôi và

tích trữ một thời gian, nếu đang giai đoạn cho ăn thúc để bán thì lượng độc tốcao đó sẽ chưa kịp đào thải hết và đi sang con người. Do đó cần phải có một

phương pháp định lượng đơn giản, chính xác để xác định hàm lượng độc tốaflatoxins trong thức ăn chăn nuôi, giúp kiểm soát lượng độc tố trong thức ăncho vật nuôi tránh thiệt hại về kinh tế và ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều thiết bị phân tích

được cải tiến để nâng cao hiệu quả phân tích. Trong đó, kỹ thuật sắc ký lỏng






2

hiệu năng cao (HPLC) ghép khối phổ (MS) làm tăng tính chính xác, độ nhạycũng như rút ngắn thời gian phân tích. Việc phát triển một quy trình phân tích

bằng hệ thống HPLC – MS/MS là cần thiết để có thể đáp ứng các yêu cầu định

lượng aflatoxins. Vì vậy đề tài “Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ” được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứ u1.2

- Thử nghiệm, lựa chọn quy trình chiết pha rắn phù hợp để làm sạchvà làm giàu mẫu trước khi đem tiến hành phân tích bằng HPLC.

- Tiến hành thẩm định quy trình phân tích định lượng bốn loạiaflatoxins (B1, B2, G1, G2) bằng HPLC - MS/MS.

-

Áp dụng quy trình phân tích, định lượng 30 mẫu thức ăn hỗn hợphoàn chỉnh cho gà được chọn ngẫu nhiên tại công ty cổ phần

chứng nhận và giám định Vinacert – Chi nhánh Cần Thơ.






3

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tổng quan về aflatoxins2.1

2.1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxins [1], [3], [4]

Sự nhiễm độc nấm trên động vật và cây trồng đã xuất hiện từ rất sớm,tuy nhiên các loại bệnh do sự nhiễm độc này nhìn chung vẫn bị bỏ quên cho

đến năm 1960. Khi có một căn bệnh mới lạ xuất hiện được gọi là căn bệnh gàtây X, bởi vì nó giết chết ít nhất 100 nghìn con gà tây ở nước Anh. Sau đó,

một kiểu bệnh tương tự cũng được phát hiện trên vịt con, lợn và các loại giasúc khác.

Song song đó, sự có mặt của đậu phộng trong khẩu phần ăn của gia súc ởBrazil thời gian này rất phổ biến và đó chính là yếu tố gây ra sự bùng nổ bệnh

tật. Các độc tố được ly trích từ thức ăn có đậu phộng và được xác định nógiống như một chất chuyển hóa của loài nấm Aspergillus flavus, loại nấm này

đã phát triển trên các hạt đậu phộng và sản sinh ra các độc tố được gọi làAflatoxins, xuất phát từ chữ Aspergillus flavus toxin.

Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất của aflatoxin và nó xuất phát

từ hai loại nấm phổ biến là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Tuynhiên còn một số loài nữa cũng có khả năng sản sinh ra aflatoxin là Aspergillus nomius và Aspergillus tamarii.

Việc ly trích ra được một chất độc từ chủng nấm A.Flavus cũng đã được báo cáo từ hai nhóm nghiên cứu năm 1962 và sau đó cấu trúc hóa học của nóđược xác định sớm bởi nghiên cứu của Asao và nghiên cứu của Chang.

Mặc dù Aflatoxin được biết đến chưa đầy 15 năm nhưng mối nguy hiểmtiềm năng của nó đối với con người đã trở thành nỗi lo lắng thật sự. Do đó,

Aflatoxin đã trở thành một trong những độc tố vi nấm được nghiên cứu nhiềunhất. Một số lượng lớn những nhà nghiên cứu đã tham gia vào công cuộc điều

tra về vấn đề này và cho ra hàng loạt các kết quả mà nó còn tồn đọng trongsuốt 20 năm qua.

Trong những ngiên cứu gần đây về việc tách chiết aflatoxin, Nesbitt thuđược hai loại: Aflatoxin B và Aflatoxin G. Một dạng phát ra ánh sáng quỳnh

quang màu xanh dương là Aflatoxin B (B = blue) và dạng còn lại phát ra ánhsáng màu xanh lá là Aflatoxin G (G = green). Hartley và những người bạn

đồng nghiệp đã chỉ ra rằng Aflatoxins có thể tồn tại riêng rẽ gồm 4 hợp chất có






4

liên hệ gần gũi nhau là: Aflatoxin B1, B2, G1 và G2. Gần đây hơn, những chấtcó liên quan được ly trích từ sữa của những con bò ăn thức ăn bị nhiễm

aflatoxin được xác định là Aflatoxin M (Milk toxin). Mặc dù có tổng cộng 12

cấu trúc có cấu hình tương tự nhau và chúng được chỉ định là các dạng củaaflatoxin nhưng giới hạn của aflatoxin được quy về 4 hợp chất trong tống sốcác nhóm và các chất chuyển hóa là: B1, B2, G1 và G2.

2.1.2 Nguồn gốc lây nhiễm aflatoxins [1]

Các loại nấm mốc A.flavus và A.parasiticus có ở khắp nơi trên thế giới

ngoại trừ các vùng cực. Sự phát triển và sản sinh ra các độc tố của chúng đòihỏi điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, đặc biệt thịnh hành ở vùng khí hậu

nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tuy nhiên vẫn có thể tìm thấy ở những vùng lạnhhơn như ở Mỹ và Châu Âu. Sự hình thành aflatoxins xảy ra trong suốt quátrình thu hoạch và bảo quản. Nhưng cũng có trường hợp những cánh đồngtrồng trọt bị xâm nhập bở i A.flavus trước lúc thu hoạch do những con côn

trùng mang bào tử nấm đến, và kết quả là aflatoxins hình thành trước khi thuhoạch. Aflatoxins có ở nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm cónguồn gốc thực vật nhưng chỉ trong một số loại nhất định như: Trong các loạihạt có dầu (đậu phộng, đậu Brazil, hạt hồ trăn, hạt giống bông, hạnh nhân, hạthồ đào, cái dừa khô) và một số ngũ cốc (bắp, gạo, lúa mì, lúa mạch, yến mạch,

bo bo). Aflatoxin cũng được tìm thấy trong hạt tiêu đỏ và quả sung ở Ấn Độ.

Khảo sát ở một số nước cho thấy có aflatoxin M1 trong sữa lỏng, sữa bộtvà các sản phẩm từ sữa. Mức độ aflatoxin M1 trong sữa tỷ lệ trực tiếp vớiaflatoxin B1 trong thức ăn của động vật. Dư lượng AFB1 được tìm thấy tronggan và trong thịt gia cầm cũng như trong gan, thận và thịt của lợn. AFB1 đượcchứng minh có trong trứng và trong mô của gà đẻ. Điều này cho thấy phạm vicác loại thực phẩm bị nhiễm aflatoxin là rất rộng. Một mặt là rau quả bị ônhiễm trực tiếp từ các bào tử nấm; mặt khác sữa, thịt, trứng bị nhiễm aflatoxin

trực tiếp từ trang trại hoặc do vật nuôi ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxin và tạothành những chất chuyển hóa của aflatoxin tích trữ trong cơ thể.

2.1.3 Đặc điểm của Aspergi ll us f lavus

2.1.3.1

Hình thái [4]

Aspergillus flavus là một loại nấm sợi rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơilục. Ở đỉnh các cuống, bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình

thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài.






5

Hình 2.1 Hình thái nấm mốc A. Flavus

Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7 μm) hình cầu, màuvàng nâu đến hơi lục, hơi sần sùi.

2.1.3.2 Sinh thái [5]

Aspergillus flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới

đất, trên các chất hữu cơ và các loại hạt nhất là các loại hạt có dầu. Khi gặpđiều kiện thuận lợi nó sẽ sinh sôi nảy nở, nhất là trên các loại hạt bị ẩm, thứcăn chăn nuôi dạng phức hợp và ngay cả trên cỏ khô. Trên lúa mì tồn trữ trongkho kín có độ ẩm 15,2% – 17% bào tử của nó chiếm từ 50% - 100% tổng số

bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vở cứng

sâu tới 0.6m. Nó cũng thường có mặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15,5%.

Bào tử của nấm A. flavus có khả năng phát tán trong không khí, trongnước, trong đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi chúng phát sinh phát triểntrên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số cây trồng.Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán lớn nên phòng trừ nấm hại nàythường rất khó khăn. Nấm A. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thựcnhư: lúa, ngô, sắn, trên một số loại hạt như: lạc, các loại đậu, vừng...,trên cácloại sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng...và ngay cả trên hoa quả tươi bị

dập úa. Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng và phát triển, chúng tiết rađộc tố aflatoxins.

2.1.3.3

Độc tố aflatoxin do A. flavus sản sinh [1]

Bộ khung giống nhau của 4 dạng chính aflatoxins gồm B1, B2, G1 và G2

được sinh ra từ Aspergillus, được quy định bởi cấu trúc di truyền của nó. Nhìnchung, dòng Aspergillus flavus chủ yếu sinh ra dạng aflatoxin B1. Trong khi

đó Aspergillus parasiticus có độc tính cao và thường sinh ra các aflatoxin B1,

B2 và G2.






6

2.1.4 Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa các aflatoxins

2.1.4.1 Cấu trúc hóa học [3]

Độc tố aflatoxins gồm nhiều chất khác nhau trong đó có 4 dạng phổ biếnlà: B1, B2, G1 và G2. Trong đó aflatoxin B2 và G2 giống với B1 và G1 chỉkhác là nối đôi trong vòng hydrofuran đã bị khử.

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các aflatoxins

Ngoài ra còn có hai dạng aflatoxin được tìm thấy trong sữa đó làaflatoxin M1 và M2, được xác định là chất chuyển hóa tương ứng củaaflatoxin B1 và B2. Trong đó M1 là 4-hydroxy của B1 và M2 là 4-hydroxy

của B2.

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của aflatoxin M1 và M2






7

2.1.4.2 Tính chất lý hóa [1], [2]

Aflatoxins tan tự do trong dung môi có độ phân cực trung bình(chloroform, methanol), đặc biệt trong dimethyl sulfoxide (DMSO). Ở trạng

thái tinh khiết, aflatoxin rất bền với nhiệt độ, nó tương đối không bền khi tiếpxúc với ánh sáng và tia UV. Hầu như không có sự phân hủy nào của aflatox ins

xảy ra dưới điều kiện nấu ăn thông thường do nhiệt độ nóng chảy của chúng

rất cao và trong các quá trình khử trùng. Tuy nhiên, có báo cáo rằng việc rangđậu phộng ở nhiệt độ rất nóng làm giảm aflatoxin.

Bảng 2.1 Một số tính chất lý hóa quan trọng của aflatoxins

Aflatoxins Công thức phântử

Khối lượ ng phântử

Nhiệt độ nóngchảy (oC)

B1 C17H12O6 312 268-269B2 C17H14O6 314 286-289G1 C17H12O7 328 244-246G2 C17H14O7 330 237-240M1 C17H12O7 328 299M2 C17H14O7 330 293

2.1.5 Độc tính của aflatoxins [1], [5]

2.1.5.1

Trên động vật

Độc tính của aflatoxin trong các loài động vật khác nhau được đánh giá bởi Allcroft, Newberne và Butler, tác dụng gây độc của aflatoxin được chứngminh trên nhiều loài động vật: Cá hồi, vịt con, gà tây, chuột lang, thỏ và chó

trong đó cừu là loài có khả năng chống lại cao nhất. Nghiên cứu này cho thấyaflatoxin gây tổn thương gan nghiêm trọng ở động vật linh trưởng. Sự thay đổi

giữa các loài đã tìm ra được các tác dụng chính với nhiều yếu tố như tuổi, tínhdục, trạng thái dinh dưỡng, mức độ độc tính. Tóm lại, aflatoxin độc hơn đối

với con vật nhỏ tuổi hơn và mức độ độc ở con đực nhiều hơn con cái.

Trên cơ thể tất cả các loài động vật được nghiên cứu, gan là mục tiêunghiên cứu chính. Dấu hiệu đầu tiên có aflatoxin trên động vật thể hiện qua sựchán ăn và sụt cân. Hoại tử tế bào gan, thoái hóa tổ chức các mô mỡ ở gan và

nghẽn ống dẫn mật là những bệnh lý phổ biến nhất. Bên cạnh gan, nhiều bộ phận khác cũng chịu các tác dụng của aflatoxin nhiều hơn hoặc ít hơn. Sự tắt

nghẽn phổi, hoại tử cơ tim và thận cũng được quan sát thấy trong quá trình thửnghiệm trên động vật. Hầu hết các thử nghiệm trên động vật cho kết quả LD 50

của liều đơn chỉ gồm AFB1 là 0.5 đến 10 mg/kg trọng lượng cơ thể. Độc tính

của aflatoxin cũng được kiểm chứng trên các tế bào được nuôi cấy bằng công






8

nghệ nuôi cấy mô. LD50 của AFB1 đối với tế bào phôi thai gà là 5μg/ml và0,05 μg/ml đối với tế bào phổi của người. AFB1 gây độc trên cả tế bào gan

người đã trưởng thành.

2.1.5.2 Trên ngườ i

Năm 1986, Payet và cộng sự đã quan sát trên 2 trẻ em bị suy dinh dưỡngKwarshiorkor được nuôi bằng thức ăn bổ sung đạm dưới dạng bột lạc, không

may bột lạc này đã bị nhiễm độc tố aflatoxins. Trẻ đã ăn mỗi ngày 70 – 100

gam bột lạc bị nhiễm aflatoxins với hàm lượng 0,5 – 1 ppm, ăn kéo dài trong

10 tháng. Đến khi trẻ 4 tuổi thì thấy xuất hiện các triệu chứng rối loạn chứcnăng gan. Sinh thiết gan thấy có hiện tượng loét mô gan ở cả hai trẻ.

Một trường hợp xảy ra ở Malaysia năm 1990 với 40 người bị ảnh hưởngvà 13 trẻ em tử vong sau khi ăn mì bị nhiễm hàm lượng cao aflatoxin và acid

boric. Mức độ aflatoxin cao được tìm thấy trong khắp các bộ phận của cơ thểkhi khám nghiệm tử thi như: gan, phổi, thận, tim, não và lá lách.

2.1.6 Một số tác dụng của aflatoxins

2.1.6.1 Khả năng gây ung thư [1]

Khả năng gây ung thư của aflatoxin được đề cập đầu tiên vào năm 1961

khi Lancaster và cộng sự chỉ ra sự ung thư gan trên chuột khi ăn những thứcăn có nguồn gốc từ đậu phộng có liên quan mật thiết với căn bệnh gà tây X.Sau đó, trong nhiều lần thử nghiệm ở một số phòng thí nghiệm trên động vật

linh trưởng trừ con người, AFB1 được chứng minh là chất gây ung thư ganmạnh nhất được biết.

Sự tương quan giữa hàm lượng aflatoxin trong chế độ ăn uống và tỷ lệung thư gan đã được chứng minh bởi Wogan và cộng sự trên chuột Fisher đực

với hàm lượng aflatoxin trong chế độ ăn từ 1 đến 100 μg/kg. Kết quả là 10%

bị ung bướu sau 104 tuần ở hàm lượng 1 μg/kg, 100% bị ung bướu ở hàmlượng 100 μg/kg sau 54 tuần.

AFB1 là chất gây ung thư trên cá hồi cầu vồng với mức nồng độ rất thấp.Chỉ 20 ppb AFB1 trong chế độ ăn hằng ngày, sau 9 tháng tỷ lệ ung thư gan lớnhơn 50%. Nghiên cứu tính gây ung thư gan của AFB1 trên vịt có 8 trong số 11con bị ung thư gan sau 14 tháng với hàm lượng 30 ppb trong khẩu phần ăn.Tác dụng gây ung thư của AFB1 cũng được nghiên cứu trên động vật linhtrưởng ngoại trừ con người. Một con khỉ cái bộc phát ung thư gan sau k hi ăntổng cộng 500 mg AFB1 trong vòng 6 năm. Trong số hai con khỉ được thử






9

nghiệm với AFB1 trong vòng 5 năm ở Viện nghiên cứu dinh dưỡng quốc giaHyderabad, Ấn Độ, con đực đã phát triển ung thư gan trong khi con cái chỉ bị

u đường mật.

Reddy đã chứng minh việc cho ăn gián đoạn trong khẩu phần ăn có chứa200 μg/kg AFB1 cũng gây ung thư gan với tỷ lệ 6/6 con chuột chù cái và 3/6con chuột chù đực sau 74 đến 172 tuần.

Mặc dù các thử nghiệm trên động vật đều lấy gan làm mục tiêu thửnghiệm chính cho AFB1 nhưng các khối u vẫn được tìm thấy trên các vị tríkhác ngoài gan. Sieber và cộng sự cũng đã thu được những khối u ác tính trênmột số loài khỉ với liều lượng AFB1 trung bình tổng cộng là 709 mg trongvòng 114 tháng. Có 13 trong số 35 con vật bị mổ xác để kiểm tra, chỉ có 5

khối u ở gan được tìm thấy (2 khối u ở tế bào gan và 3 khối u ở màng trongmạch máu). Ung thư dạ dày và u tuyến nhầy cũng được tìm thấy. Một tỷ lệ caocác khối u ác tính ở biểu mô thận thu được trên những con chuột đực Wistar

ăn khẩu phần ăn có chứa hàm lượng AFB1 là: 1,0; 0,5; 0,25 mg/kg thức ăntrong 147 ngày. Thêm những khối u khác cũng được tìm thấy ở lưỡi và cuống

họng.

Aflatoxin G1 cũng được chứng minh là chất gây ung thư rất mạnh. Nó đãđược báo cáo trong một nghiên cứu cho chuột uống nước có AFG1 với hàm

lượng 3 μg/ml. Kết quả là 21 trong số 26 con chuột có khối u trên gan sau khidùng tổng cộng 6 mg AFG1. Trong số 26 con chuột này có 6 con xuất hiệnkhối u trên thận.

Aflatoxin M1 gây ung thư trên tế bào gan của cá hồi và chuột nhưngkhông mạnh bằng AFB1 thử trên hai loài này.

Aflatoxin B2 có hoạt tính yếu hơn khi thử nghiệm gây ung thư trên tế bào gan ở chuột, liều sử dụng cao hơn 100 lần so với AFB1.

2.1.6.2

Tác dụng gây quái thai [1]

Butler và Wigglesworth đã nghiên cứu tác dụng của AFB1 trên nhữngcon chuột mang thai và thấy rằng việc cho uống AFB1 gây chậm phát triểnthai nhi. Các con vật được cho sử dụng độc tố ở giai đoạn mang thai sớm chothấy có sự giảm nhẹ khối lượng nhau thai. Độc tố được sử dụng sau khi thụ

tinh 16 ngày cho thấy hiện tượng quái thai phát triển nghiêm trọng. Một mặtlàm giảm khối lượng thai nhi và thứ hai là gây nhiều tổn thương khác trên con

vật mang thai. Trong một nghiên cứu theo dõi của Butler, ông thấy rằng việcgiảm khối lượng chỉ là một sự liên quan gián tiếp trong nhiều tổn thương ở






10

gan và kết luận rằng việc giảm khối lượng thai nhi là kết quả của sự giảm tiêuthụ thức ăn ở con mẹ.

Elis và DiPaolo đã chứng minh AFB1 là tác nhân gây quái thai mạnh cho

chuột đồng. Phương pháp thử nghiệm là tiêm một mũi AFB1 với hàm lượng 4mg/kg vào bụng vào ngày thứ 8 của chuột mang thai và kết quả là tỷ lệ thai bịdị hình và chết cao. Cũng như Butler đã tìm thấy thì có nhiều tổn thương trên

con mẹ. Sự dị tật xảy ra khi xử lý sớm là thiểu não, cấu trúc sọ vô tổ chức ởcuối ống thần kinh, một số tăng trưởng chậm và lệch dây.

Một số nghiên cứ khác trên phôi thai gà cho thấy AFB1 và một số chấtchuyển hóa liên quan có khả năng gây quái thai trên phôi thai đang phát triển.Sự phù nề và chậm tăng trưởng cũng thể hiện rõ ràng sau khi tiêm một mũi có

chứa độc tố vi nấm vào túi khí. Tuy nhiên, Hintz và cộng sự cũng nghiên cứutác dụng gây quái thai của aflatoxin trên lợn cái được cho ăn thức ăn có chứa450 ppb AFB1 nhưng không phát hiện dị tật trên heo con. Vì vậy họ nói rằng

AFB1 chỉ có khả năng gây quái thai trên một số loài thực nghiệm. Sự khácnhau trong con đường chuyển hóa aflatoxin giữa những con vật khác nhau có

thể tạo ra sự đặc biệt như vậy.

2.1.6.3 Tác dụng gây đột biến [1]

AFB1 được biết là một tác nhân gây đột biến mạnh. Nghiên cứu đầu tiênlà gây ra sự dị tật trên nhiễm sắc thể bằng aflatoxin bởi Lylli. Ông thí nghiệm

trên một loại cây giống Vicia faba, thực hiện ở nhiệt độ 21oC trong 3 giờ vớihỗn hợp 67 mM aflatoxin. Ông nhận thấy rằng aflatoxin gây ra sự gia tăng

đáng kể sự phân bào bất thường. Những bất thường bao gồm các đoạn nhiễmsắc thể bị đứt gãy ngẫu nhiên. Bạch cầu của người được nuôi cấy với điều kiện

aflatoxin tương tự tạo ra nhiều bất thường về nhiễm sắc thể với tần suất cao.Sự đứt gãy nhiễm sắc thể là một dạng bất thường phổ biến nhất nhưng lại

không được tìm thấy. Nhiều thử nghiệm khác cho thấy rằng tỷ lệ các tế bào có những dị

thường trong nhiễm sắc thể phụ thuộc vào nồng độ của độc tố và thời gianthực hiện. AFB1 gây ra sự biến đổi trong quá trình phiên mã DNA củaBacillus subtilis và gây đột biến trên những tế bào sinh dưỡng (không phải bàotử) của Neurospora crassa và Chlamydomonas reinhardii. Aflatoxin cũngđược chứng minh gây ra những đột biến gen lặn gây chết trên Drosophila

melanogaster . Khi được áp dụng trực tiếp để kiểm tra thử trên Salmonella

typhimurium, aflatoxin không cho tác dụng sinh học nhưng khi ủ aflatoxin với






11

hệ thống microsome trên gan người hoặc trên chuột cùng với S. typhimurium

tạo ra những đột biến đảo đoạn trên vi khuẩn. Những nghiên cứu này cho thấy

rằng sự chuyển hóa aflatoxin cũng cần thiết cho sự biểu hiện hoạt tính sinh

học. Độc tính của chất chuyển hóa của aflatoxin đối với vi khuẩn giảm bớt

khi thêm DNA hoặc RNA vào hệ thống thử nghiệm. Liên kết được tìm thấy có

tác dụng hơn khi DNA được thêm vào thay vì RNA. Một vài nghiên cứu chothấy rằng chất chuyển hóa của aflatoxin B1 phản ứng tạo liên kết cộng hóa trị

với acid nucleic. Những nghiên cứu sau đó của Garner, của Swenson và cộngsự cho thấy rằng AFB1 được chuyển hóa bởi gan chuột thường hoặc chuột

hamster trong thử nghiệm in vivo và chuyển hóa bởi microsome gan người

trong thử nghiệm in vitro tạo thành một hợp chất có hoạt tính khá mạnh. Nó cóthể là chất gây ung thư tối ưu, aflatoxin B1-2,3-oxide.

2.1.6.4 Tác dụng trên hệ miễn dịch [1]

Một trong những tác dụng rất dễ thấy của aflatoxin là làm suy yếu hệmiễn dịch. Aflatoxin được báo cáo là làm tăng các bệnh nhiễm trùng thêm dữ

dội như bệnh khuẩn salmon, nấm cây trồng, các bệnh aspergillus, bệnh trùng

cầu manh tràng và căn bệnh Marek.

Ở gà, aflatoxin gây ức chế sự đáp ứng miễn dịch của kháng thể và thoáihóa tuyến ức và kết cấu bìu, đó là những yếu tố quyết định cơ bản của khả

năng miễn dịch. Richard và Thurston nhận thấy afaltoxin làm giảm sự thực bào của bào tử nấm Aspergillus fumigatus. Michael và cộng sự thấy rằng

aflatoxin làm giảm hiệu lực của hệ lưới nội mô của gà (Reticuloendothelial

system – RES).

Aflatoxin B1 được cấy vào màng bụng của chuột, nơi có đại thực bào vàsợi nguyên bào. Nó ức chế sự hấp thu và sự kết hợp tri -leucine và uridine trên

cả hai loại tế bào, làm suy yếu khả năng thực bào của đại thực bào. Chang vàHamilton cũng nhận thấy aflatoxin làm suy giảm khả năng thực bào trên gàđồng thời làm suy yếu sự vận động của các chất và giảm khả năng giết vikhuẩn. Tác dụng của aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trên sự cảm ứng củainterferon bằng virus cúm trong tế bào đơn lớp được nghiên cứu bởi Hahon vàcộng sự. Trong số 4 loại aflatoxin là chất có hại nhất đối với tất cả các tế bàosinh tr ưởng và khả năng tồn tại của những tế bào trong môi trường nuôi cấy.Khi virus cúm được thử nghiệm bằng cách sử dụng những tế bào đã được xử

lý với aflatoxin trước đó, nó có tác dụng giống như người kiểm soát. Tốc độ






12

phát triển của virus trong các tế bào có aflatoxin và trong các tế bào bìnhthường tương đương nhau nhưng mức nồng độ virus đạt được cao hơn gấp 2

đến 4 lần lượng virus được nuôi cấy trong môi trường có aflatoxin. Độ lớn của

virus phát triển tỷ lệ với nồng độ của aflatoxin. Các nhà nghiên cứu cho rằngaflatoxin gây tác dụng bất lợi đối với sự cảm ứng interferon thông qua chứcnăng của phân tử cảm ứng, sự hoạt động hay trì trệ của gen interferon, sự saomã hay dịch mã của RNA interferon.

2.1.6.5 Hoạt tính của nhữ ng chất chuyển hóa từ Aflatoxins [1], [3]

Aflatoxins được chuyển hóa đầu tiên bởi các enzyme microsome, cácenzyme này nhiều nhất là ở gan. Vì vậy không có gì ngạc nhiên khi gan là cơ

quan mục tiêu để thử độc tính gây ung thư của aflatoxins.

Hình 2.4 Con đường chuyển hóa của Aflatoxin B1

Aflatoxin M11.

Aflatoxin M1 (AFM1) là chất chuyển hóa sinh học đầu tiên được xácđịnh. Butler và Clifford tìm ra một chất có độc hiện diện trong gan chuột khichỉ cho ăn một loại aflatoxin B1 duy nhất. Điều đó cho thấy rằng AFB1 đãđược chuyển hóa trong gan. Allcroft và cộng sự sau khi tách độc tố từ nướctiểu của cừu được cho ăn AFB1 đề nghị lấy tên là aflatoxin M.

Khả năng gây độc của AFM1 tương đương với AFB1 tuy nhiên độc tínhgây ung thư và gây đột biến nhỏ hơn đáng kể so với AFB1.






13

Aflatoxin B2A và G2A2.

Những chất đồng chất trong gan của một số gia cầm nhất định và một sốloài gặm nhấm chuyển đổi AFB1 và G1 thành dạng 2-hydroxy,2,3-

dihydroderivatives được gọi là aflatoxin B2A và G2A. Những chất chuyển hóanày có thể đại diện cho những chất chuyển hóa chính liên kết mạnh mẽ với

protein trong in vivo gây ra tác dụng độc hại nghiêm trọng.

Aflatoxicol3.

Aflatoxicol rất đặc biệt vì nó không được hình thành từ phản ứng chuyểnhóa của enzyme trong gan mà do một NADP liên kết vớ i enzyme

dehydrogenase của cytosol, nó cũng có hoạt tính của một enzyme 17-

ketosteriod dehydrogenase. Aflatoxicol chỉ là một chất chuyển hóa từ aflatoxintrong in vitro và nó được biết là nhạy cảm với các hormone. Hơn nữa đây làmột phản ứng thuận nghịch và có thể cung cấp một “bể chứa” cho AFB1 vàcác chất chuyển hóa của nó.

Độc tính của dạng chuyển hóa này được đo lường bằng khả năng gâychết đối với loài S. typhimurium trong sự hiện diện của các phần ty thể của

chuột, nhận thấy rằng độ mạnh của nó thấp hơn AFB1 nhưng cao hơn AFM1.

Aflatoxin P14.

Aflatoxin P1 là chất chuyển hóa chính được tìm thấy trong nước tiểu của

khỉ rhesus được tiêm một mũi đơn AFB1 vào bụng. AFP1 được tạo thành bởi NADPH, một hệ thống enzyme có chức năng oxi hóa của microsome trong

gan. Nó không có độc tính trong hệ thống thử nghiệm trên phôi gà con cũngnhư không có tác dụng gây chết trên S. typhimurium.

Aflatoxin Q15.

Aflatoxin Q1 chiếm khoảng 1/3 các chất chuyển hóa được tạo thành từ

AFB1 bởi microsome của gan khỉ và gan người. Hsieh và cộng sự thu đượcAFQ1 có độc tính thấp hơn 18 lần so với AFB1 và không gây đột biến trên vikhuẩn trong thí nghiệm với S. typhimurium.

Các dạng có hoạt tính cao của Aflatoxin B16.

Hoạt tính từ việc chuyển hóa là cần thiết cho AFB1 liên kết cộng hóa trịvới DNA, cho thấy dạng 2,3-epoxide liên quan đến hoạt tính sinh học của nóvà liên kết cộng hóa trị này có thể là cơ sở cho độc tính và khả năng gây ung

thư. Sự thay đổi các loài đáp ứng hoạt tính gây ung thư của AFB1 tương quan






14

với liên kết cộng hóa trị với acid nucleic, sự trao đổi chất, khả năng gây đột biến của các chất chuyển hóa. Trong một báo cáo, Garner và các đồng sự của

ông có đề xuất rằng “gan là nhất, không phải tất cả”. Các loài động vật có khả

năng chuyển đổi AFB1 thành một chất chuyển hóa có độc không xác định, cóthể được thử nghiệm trong thí nghiệm gây đột biến trên vi khuẩn. Ông nhậnthấy rằng sản phẩm chuyển hóa này có thể là 2,3-oxide tồn tại thoáng qua vàđược alkyl hóa trong DNA vi khuẩn. Bằng chứng gián tiếp cho sự epoxide hóanày là một phản ứng chuyển hóa rất quan trọng do Swenson thu được khi thựchiện tách 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy-AFB1 sau khi thủy phân bởi acid nucleicđược chiết từ gan chuột đã tiêm AFB1 và từ acid nucleic đã xử lý với AFB1trong microsome của chuột và người. Điều giả định trước đó là một bằngchứng mạnh mẽ của dạng 2,3-oxide và trong sự tương tác với DNA được kếtluận rằng epoxide của AFB1 là tác nhân gây đột biến trên vi khuẩn và là tácnhân gây ung thư.

Từ đó có thể thấy rằng AFB1-epoxide và AFB2 được coi là những dạnghoạt động của AFB1 trong khi những dạng khác được coi là những sản phẩmgiải độc. Tuy nhiên AFM1 và Aflatoxicol vẫn có độc tính khá cao và có khảnăng gây ung thư.

2.1.7 Con đườ ng sinh tổng hợ p aflatoxin B1 [3], [5]

Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp aflatoxin:

Norsolorinic acid averatin averufin versicolorin A versiconal

hemiacetal acetate versiconal versicolorin A sterigmatocystin

aflatoxin B1.

Con đường sinh tổng hợp aflatoxin B1 được tóm tắt như sau:

- Sinh tổng hợp acid norsolorinic:

Polyketide là viên gạch cấu trúc cơ bản tạo AFB1 liên quan đến quá trìnhkéo dài một đơn vị hexanoate bởi enzyme polyketide synthase mà enzyme nàylà do tập hợp của 7 đơn vị acetyl từ malonyl CoA mà không qua sự khử ketonetạo noranthrone. Việc tổng hợp acid norsolorinic là giai đoạn trung gian bềnvững sau quá trình oxi hóa noranthrone từ enzyme oxidase.

- Việc chuyển từ norsolorinic acid thành averatin nhờ enzyme

ketoreductase.

- Từ averatin sau một số quá trình tạo thành versicolorin A.






15

- Từ versicolorin A tổng hợp sterigmatocystin: thông qua một số phảnứng enzyme gồm: phản ứng oxi hóa, khử ketone, decarboxyl hóa và methyl

hóa.

- Từ sterigmatocystin chuyển thành aflatoxin: Sterigmatocystin đượcchuyển thành O-methylsterigmatocystin nhờ enzyme O-methyltransferase. Sau

đó nhờ một đoạn gen chuyển O-methyltransferase thành Aflatoxin B1.

Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp aflatoxin B1 được thể hiện ở Hình 2.5.






16

Hình 2.5 Quá trình sinh tổng hợp aflatoxin B1






17

2.1.8 Nhữ ng giải pháp phòng và chống độc tố nấm mốc

- Kiểm tra chống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữnguyên liệu:

Nguyên liệu cần phải được sấy khô trước khi đưa vào kho dự trữ, luônkiểm tra sự cân bằng độ ẩm không khí và độ ẩm nguyên liệu, độ ẩm dự trữ antoàn là không quá 13%.

- Kiểm soát và khử côn trùng, sâu mọt trong kho:

Người ta nhận thấy có mối liên hệ giữa sự phá hại của sâu mọt, côn trùngtrong nguyên liệu và sự phát triển của nấm mốc. Điều này được giải thích bởihai lý do:

Hoạt động trao đổi chất của con trùng sử dụng chất hữu cơ trong nguyênliệu, hô hấp sinh ra nước làm cho môi trường dự trữ thức ăn ngày càng ẩmthêm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển.

Côn trùng sâu mọt đục khoét hạt, di chuyển trong nguyên liệu mang theo

những bào tử nấm trên mình nó phát tán trong nguyên liệu. Theo tài liệu FAO(1979) thì côn trùng sâu mọt có thể làm tăng sự phát triển của nấm mốc lên từ

10-30%.

- Sử dụng hóa chất để ngăn chặn nấm mốc xâm nhập vào thức ăn: Có nhiều chất hóa học khác nhau có thể khống chế sự nhiễm nấm mốc

trong thức ăn. Hợp chất tương đối an toàn không độc hại và có hiệu lực ngănchặn sự phát triển nấm mốc trong thức ăn là acid propionic và các muối củanó. Theo tài liệu FAO Rome (1979) thì hợp chất này ngăn chặn nấm mốc chokết quả đầy hứa hẹn.

- Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi amoniac:

Sự khử độc bằng amoniac (NH3) dưới áp suất cao đã được Dollear và

Gardner (1966) thực hiện ở áp suất 1,5-3 bar để khử độc bánh dầu phộng và bánh dầu hạt bông. Sự phá hủy gần như hoàn toàn aflatoxin trên đậu phộng và phương pháp này đã được ứng dụng ở Mỹ năm 1969 như là một phương phápxử lý bánh dầu, bông vải. Ở Pháp, phương pháp này được thử trên bánh dầu

phộng từ năm 1972 bở i Prevol. Tuy nhiên phương pháp xử lý này làm tổn hạiđến acid amin chứa lưu huỳnh trong thức ăn.

- Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi chất hấp phụ bề mặt:






18

Giải pháp khác ít tốn kém hơn mà cũng có thể cho kết quả tốt, đó là việcsử dụng các chất hấp phụ để kết dính các độc tố và thải ra ngoài theo phân,

làm giảm độc tính của chúng đối với cơ thể. Nếu thức ăn thường xuyên bị

nhiễm độc tố nấm mốc mà không có điều kiện phân tích kiểm tra thì nên sửdụng chất kết dính độc tố là giải pháp dễ thực hiện và hiệu quả.

Có thể lên men các sản phẩm sau thu họach theo nguyên lý ức chế các vi

sinh vật khác có thể ức chế sinh tổng hợp aflatoxin hay hấp thu aflatoxin.Cũng có thể sử dụng các tác nhân vật lý như tia gamma, tia cực tím và các tác

nhân hóa học để trích ly hoặc làm thay đổi cấu tạo phân tử mycotoxin. Tuynhiên những phương pháp này có những hạn chế vì đòi hỏi chi phí lớn, kém

hiệu quả kinh tế.

2.1.9 Quy định về hàm lượ ng cho phép của Aflatoxin trong thức ănhỗn hợp chăn nuôi

- Quy định của Việt Nam:

QCVN 01 - 10: 2009/BNNPTNT do Cục Chăn nuôi biên soạn, Vụ Khoahọc, Công nghệ và Môi trường trình duyệt và được ban hành theo Thông tư số81/2009/TT-BNNPTNT ngày 25 tháng 12 năm 2009 của Bộ Nông nghiệp vàPhát triển nông thôn.

Nội dung: Quy chuẩn này quy định giới hạn về hàm lượng kháng sinh,hóa dược, vi sinh vật và kim loại nặng tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợphoàn chỉnh cho gà (gà sinh sản, gà thịt).

Bảng 2.2 Quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B1 vàhàm lượng tổng số các aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà

- Tiêu chuẩn của FAO: Bảng 2.3 Những quy định mức cho phép aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ

(FAO năm 1995)

STTLoại độc tố

Hàm lượ ng aflatoxin tính theomicrogam/kg (ppb) tối đa cho phép Gà con từ 1-28

ngày tuổi Nhóm gà còn lại

1 Aflatoxin B1 10 302 Tổng số các aflatoxin

B1+B2+G1+G230 50






19

Loại thự c liệu Loại aflatoxin Mứ c cho phép (ppb)

Mọi thức ăn (ngườ i), tr ừ sữa B1+B2+G1+G2 20

Thức ăn hỗn hơp chăn nuôi B1+B2+G1+G2 20Sữa (làm thực phẩm cho ngườ i) M1 0.5

Bắ p cho thú non và bò sữa B1+B2+G1+G2 20

Bắ p và khô dầu phộng (cho bò, heo,gia cầm trưở ng thành vỗ béo)

B1+B2+G1+G2 200

Bắ p cho bò thịt, heo, gà giống B1+B2+G1+G2 100

- Tiêu chuẩn của các nước ở EU: Bảng 2.4 Những quy định về hàm lượng aflatoxin B1 trong thức ăn gia

súc, gia cầm ở các nước EU

Các loại nguyên liệu, thức ăn động vật Hàm lượ ng tối đa trong thứ căn quy về độ ẩm 12% (ppb)

Các loại thức ăn đơn chất 50Thức ăn hỗn hợ p cho bò (ngoại tr ừ bò sữa, bê vàcừu con)

50

Thức ăn hỗn hợ p cho heo và gia cầm trưở ng thành 20

Các loại thức ăn hỗn hợ p khác còn lại 10Thức ăn vỗ béo cho bò, dê, cừu trưở ng thành 50Thức ăn bổ sung cho heo, gia cầm trưở ng thành 30

Những thức ăn bổ sung khác (đặc biệt cho bò sữa) 10

Quy định của Việt Nam cũng giống như của Châu Âu về hàm lượngaflatoxin B1 tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp cho gà con là 10 ppb, chogà trưởng thành là 30 ppb.

K ỹ thuật chiết pha rắn (SPE) [6]2.2

2.2.1

Giớ i thiệu

Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật chiết được ứng dụng trong khâu chuẩn bịmẫu, dùng để tách một hoặc một vài chất từ một mẫu phức tạp và được sửdụng ngày càng phổ biến.

- Ưu điểm:

Với SPE, các vấn đề liên quan đến quá trình chiết lỏng-lỏng (LLE) có

thể được cải thiện như sự tách pha không hoàn toàn, độ thu hồi thấp, sử dụng

nhiều dung môi hữu cơ. SPE sử dụng hiệu quả hơn LLE vì dễ dàng thực hiện,






20

nhanh chóng và có thể tự động hóa. Dung môi chiết sử dụng tương đối ít vàthời gian thực hiện cũng được rút ngắn. Với LLE cần nhiều lần chiết để đạt

được độ thu hồi cao trong khi SPE có thể chỉ cần một bước.

- Nhược điểm:

Cơ chế tạo hỗn hợp trong SPE có thể xảy ra, sự hấp phụ không thuậnnghịch của một số chất phân tích trên cột, đòi hỏi kỹ thuật hiện đại và phức tạphơn.

SPE thường sử dụng để chuẩn bị mẫu lỏng với chất tan ít hoặc không

bay hơi. Đồng thời, SPE cũng có thể dùng chuẩn bị mẫu rắn – hòa tan vào

dung môi thích hợp trước khi chiết với SPE. Các sản phẩm SPE thật sự hữu

ích cho quá trình chiết, cô đặc và làm sạch mẫu. Chúng có cấu tạo đa dạng bởinhiều chất hấp phụ cũng như kích cỡ khác nhau. Việc lựa chọn một sản phẩm

phù hợp với mỗi chất hay mỗi mẫu phân tích là rất quan trọng.

2.2.2 Phân loại

2.2.2.1 SPE pha thườ ng

SPE pha thường với chất phân tích phân cực, có mẫu nền (pha động) íthoặc không phân cực và một pha tĩnh phân cực. Pha tĩnh cấu tạo bởi silica liên

kết với các nhóm chất phân cực như -CN, -NH2, -diol…Sự lưu giữ chất phântích dưới điều kiện pha thường là do tương tác giữa nhóm chức phân cực củachất phân tích và nhóm chức phân cực trên bề mặt chất hấp thu. Tương tác này

bao gồm liên kết hydrogen, tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, tương tác lưỡngcực – cảm ứng… Dung môi giải ly thường có độ phân cực cao hơn so vớidung môi trong mẫu nền ban đầu.






21

Hình 2.6 Tương tác trong SPE pha thường

2.2.2.2

SPE pha đảo

SPE pha đảo gồm pha động phân cực hoặc phân cực trung bình (mẫunền) và pha tĩnh không phân cực. Chất phân tích thường không phân cực hoặc

kém phân cực. Pha tĩnh được tạo bởi những hạt silica tạo liên kết với gốc -alkyl hoặc –aryl. Sự lưu giữ chất phân tích hữu cơ từ dung dịch phân cực trên

pha tĩnh SPE chủ yếu là do lực tương tác giữa liên kết carbon – hydrogen củachất phân tích và nhóm chức không phân cực trên bề mặt của silica. Lựctương tác không phân cực – không phân cực còn được gọi là lực khuếch tánhay lực Vander Waals. Để giải ly chất phân tích dung môi giải ly thườngkhông hoặc ít phân cực.






22

Hình 2.7 Tương tác trong SPE pha đảo

2.2.2.3 SPE trao đổi ion

SPE trao đổi ion thường dùng cho các chất phân tích mang điện tích

trong dung dịch. Cơ chế lưu giữ chủ yếu dựa trên lực hút tĩnh điện của nhómchức mang điện tích trên chất phân tích và nhóm chức mang điện tích trên bề

mặt liên kết với silica. Để hợp chất lưu giữ bằng cơ chế trao đổi ion thì pH của

mẫu nền phải làm cho chất phân tích và nhóm chức trên bề mặt silica mangđiện tích. Một dung dịch có pH mà cho chất phân tích hoặc nhóm chức phân

cực trên silica trở về trạng thái trung hòa điện thì có thể dùng như chất giải ly.Bởi vì khi một trong các nhóm chức này ở trạng thái trung hòa thì lực hút tĩnh

điện giữa chúng sẽ mất đi và hợp chất được giải ly. Ngoài ra, dung dịch có

tính ion hóa mạnh hoặc chứa các ion có thể thay thế chất phân tích cũng đượcdùng để rửa giải.






23

Hình 2.8 Tương tác trong SPE trao đổi ion

2.2.2.4 SPE k ết hợ p

SPE kết hợp hai hay nhiều loại tương tác khác nhau, phù hợp với bảnchất của chất phân tích để có thể tách tối ưu chất cần phân tích.

Hình 2.9 Tương tác trong SPE dạng kết hợp






24

2.2.3 Quy trình chiết SPE

Trong những dạng thí nghiệm phổ biến nhất, các ứng dụng của SPEthường liên quan đến bốn bước. Mỗi bước đều phải được tối ưu hóa trong quá

trình xây dựng phương pháp.

Hình 2.10 Quy trình chiết pha rắn (SPE)

2.2.3.1

Bướ c 1: Quá trình chuẩn bị (Conditioning)Bước này được thực hiện trước khi cho mẫu vào cột, được gọi là bước

hoạt hóa cột. Bằng cách sử dụng một lượng dung môi nhất định “C” để hoạthóa, điển hình là methanol (MeOH) hoặc acetonitril (ACN). Bước này có 2 vai

trò chính: Thứ nhất, nó loại bỏ bất kỳ một tạp chất nào vô tình nhiễm vào, cóthể là do cột tiếp xúc với các hóa chất trong phòng thí nghiệm. Thứ hai, nó cho

phép chất hấp phụ được hòa tan và dễ dàng khuếch tán vào cột. Sự hòa tan là

rất quan trọng với cột pha đảo vì việc để khô thường cho thấy sự sụt giảm

đáng kể trong lưu mẫu của chất phân tích kỵ nước. Ngoài ra, việc thay đổitrạng thái khô dẫn đến không lặp lại độ thu hồi. Về mặt này, pha tĩnh có gắnnhóm polymer như Bond Elut Plexa (Agilent Technologies) với sự cân bằngtính thân nước và kỵ nước ở bề mặt, có thể để khô mà vẫn duy trì được hiệusuất. Plexa là một chất hấp phụ hình cầu với các hạt phân tán đơn lẻ cho phépcó khả năng lặp lại và một bề mặt được hydroxy hóa tránh sự liên kết giaothoa nhiều chất có điểm chung của nền mẫu.

Sau khi thực hiện điều kiện trên, người ta rửa bỏ dung môi hoạt hóa thừa

bằng một dung môi cân bằng “D”, thường là nước hoặc dung dịch đệm để làm






25

cân bằng cột trước khi cho mẫu qua. Đối với những thiết bị SPE có độ dày cộtnhỏ như SPE dạng đĩa, bước này ít quan trọng và có thể bỏ qua.

2.2.3.2

Bướ c 2: Cho mẫu qua cột (Loading sample)

Đối với cột pha đảo RP-SPE, chất phân tích được hòa tan trong một dungmôi yếu “L” sau đó được cho từ từ vào cột. Đối với cột trao đổi ion, có thể sửdụng dung môi tương tự nhưng độ mạnh của ion dung dịch mẫu phải càng yếu

càng tốt. Để cho mẫu vào cột có thể dùng pipette hay ống tiêm hoặc được bơmvào cột. Phương pháp thứ hai thuận tiên hơn cho lượng mẫu lớn hơn 50 mL

như trường hợp phân lập chất hữu cơ vi lượng từ các mẫu nước môi trường.Kích thước cột và lượng mẫu phải phù hợp để không làm quá tải sức chứa của

cột. Sức chứa hay lượng chất mà cột có thể lưu giữ phải đảm bảo sao cho chất phân tích có thể được lưu giữ lại tất cả. Bởi vì ngoài chất phân tích còn có nềnmẫu và các chất giao thoa với chất phân tích cũng được giữ lại trên cột. Mẫuđược cho qua cột xuyên suốt và không để cột bị khô. Trong quá trình cho mẫuqua cột, tốc độ dòng chảy không được kiểm soát một cách chính xác như tronghệ thống HPLC nhưng cũng có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi chânkhông, tốc độ tiêm hay tốc độ từ máy bơm. Tốc độ dòng cho phép là từ 2 -4

mL/phút.

Bảng 2.5 Các pha tĩnh trong SPE và các điều kiện tương ứng

Cơ chế tách

Pha tĩnh Cấu trúc Loại chấtphân tich

Dung môipha động

Dung môirử a giải

Pha thườ ng(hấ p phụ)

Silica; alumina;florisil

-SiOH; Al2O3;Mg2SiO3

Phân cựcnhẹ đếnvừa phải

hexane;CHCl3/hexa

-ne

Methanolethanol

Pha thườ ng(liên k ết

phân cực)

Cyano; amino; diol -CN; -NH2;-CH(OH)-CH(OH)-

Phân cựcvừa đếnmạnh

Hexane Methanolethanol

Pha đảo(không

phân cực vàk ỵ nướ cmạnh)

Octadecylsiloxane;Octylsiloxane;PS-DVB; DVB

(Polymeric)

(-CH2-)17CH3;(-CH2-)7CH3;

PS-DVB, DVB

K ỵ nướ c(không

phân cựcmạnh)

H2O;MeOH/H2O; ACN/H2O

MeOHACN

Pha đảo(không

phân cực vàk ỵ nướ c

trung bình)

Cyclohexyl; Phenyl;Diphenyl

Không phân cực

vừa

H2O;MeOH/H2O; ACN/H2O

MeOHACN

Pha đảo(không

phân cực vàk ỵ nướ c

yếu)

Butyl; Ethyl; Methyl (-CH2-)3CH3; -C2H5;-CH3

Không phân cựcvừa đến

phân cực

yếu

H2O MeOHACN

Pha đảo Polyamide; poly Various polymers Acidic; Nướ c hoặc MeOH






26

Polymer(cân bằng

k ỵ nướ c vàthân nướ c)

[n-vinylpyrrolidone-divinylbenzene(DVB];

methacrylate-DVB

basic;trung tính

dung dịchđệm

ACN

Trao đổiion âm(yếu)

Amino; 1

0

, 2

0

-amino (-CH2-)3 NH2;(-CH2-)3- NHCH2CH2 NH2

Ionic;acidic Nướ c hoặcdung dịchđệm

(pH=pKa+2)

-Dung dịchđệm(pH=pKa-2);-pH mà tại đó

chất phântích trung

tính;-Dung dịchđệm có ion

mạnhTrao đổiion âm

(mạnh)

Quaternary amine (-CH2-)3N+(CH3)3 Ionic;acidic

Nướ c hoặcdung dịch

đệm(pH=pKa+2)

-Dung dịchđệm

(pH=pKa-2);-pH mà tại đóchất phântích trung


mạnhTrao đổi

ion dương(yếu)

Carboxylic acid (-CH2-)3COOH Ionic; basic


đệm(pH=pKa-

2)

-Dung dịchđệm

(pH=pKa+2);-pH mà tại đó



mạnhTrao đổi

ion dương(mạnh)

Alkyl sulfonic acid;Aromatic sulfonic acid

Ionic; basic


đệm(pH=pKa-

2)

-Dung dịchđệm

(pH=pKa+2);-pH mà tại đó



mạnh

2.2.3.3

Bướ c 3: Loại tạp (washing)

Bước này tiến hành loại bỏ tạp ra khỏi cột mà vẫn giữ lại được chất phân

tích bằng một dung môi “R” có độ mạnh vừa phải. Lý tưởng nhất là chọn mộtdung môi có độ mạnh và thể tích sử dụng phù hợp. Nếu sử dụng một dung môi

quá mạnh hoặc thể tích dung môi rửa quá nhiều sẽ làm mất đi một phần chất






27

phân tích và độ thu hồi sẽ thấp. Vì vậy việc rửa cần dừng lại trước khi chất phân tích chuẩn bị ra khỏi cột, điều này có thể làm cho tạp vẫn còn giữ lại một

ít nhưng thay vì chất phân tích sẽ không bị mất đi. Trong cột pha đảo thường

hay sử dụng nước hoặc dung dịch đệm làm dung môi rửa. Một lượng nhỏ dungmôi hữu cơ được kiểm soát có thể được thêm vào, để hỗ trợ việc rửa tốt hơnchất kỵ nước nhưng phải cẩn thận rằng chất phân tích quan tâm không bị bỏ

cùng lúc.

Lưu ý rằng đối với các mẫu nước rất sạch như nước uống có thể bỏ qua

bước rửa (nhiều phương pháp ở Mỹ bỏ qua các bước rửa và đi thẳng tới làmkhô trước khi rửa giải). Nếu mẫu phức tạp có quá nhiều chất nền không mong

muốn thì việc rửa là hết sức cần thiết và phải được tối ưu hóa.

2.2.3.4 Bướ c 4: R ử a giải (Elution)

Sau khi đã loại tạp và chất phân tích bắt đầu ra khỏi cột, cần sử dụng mộtdung môi rửa giải khá mạnh “E” để tách lấy chất phân tích. Lưu ý rằng có thể

có nhiều chất nền khác có liên kết với pha tĩnh mạnh hơn chất phân tích, do đónếu sử dụng dung môi quá mạnh có thể kéo xuống hết tất cả chất phân tích lẫn

tạp nhiễu khác. Vì vậy cần lựa chọn dung môi rửa giải tối ưu sao cho chất phân tích được rửa hết mà chất nền vẫn còn giữ lại trên cột. Sau khi rửa giải

xong thường là làm bay hơi hết dung môi sau đó định mức lại bằng dung môi pha động rồi tiến hành chạy HPLC hoặc GC.

Đại cương về HPLC và hệ thống HPLC-MS/MS [7]2.3

2.3.1

Đại cương về HPLC

2.3.1.1 Định nghĩa và nguyên tắc

1. Định nghĩa:

Sắc ký là những kỹ thuật tách và xác định đồng thời các chất trong mộthỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, vật lý của các chất trongnhững điều kiện nhất định. Các tính chất đó là:

- Tính chất hấp phụ của các chất,

- Tính chất trao đổi ion hay cặp ion,

- Sự rây phân tử theo kích thước của chúng,

- Sự tạo phức và sự liên hợp phân tử,

- Sự phân bố của chất giữa hai pha không tan vào nhau.






28

Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu và pha độngkhi tiến hành sắc ký. Đó là:

- Kỹ thuật phân tích sắc ký khí, pha động là chất khí.

- Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng, pha động là chất lỏng.

Kỹ thuật sắc ký lỏng được chia làm hai nhóm, đó là:

Sắc ký lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển).

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. Nguyên tắc

Về nguyên tắc để thực hiện sắc ký phải có:

- Có cột tách có pha tĩnh. - Van nạp chất mẫu phân tích vào.

- Pha động và bơm pha động để rửa giải chất.

- Bộ phận phát hiện chất phân tích (detector).

- Bộ phận ghi nhận sắc ký đồ.

2.3.1.2 Phân loại

Trong HPLC tùy theo bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trongcột tách mà người ta chia thành nhiều loại. Bảng 2.6 Các loại sắc ký trong HPLC và đặc điểm của mỗi loại

Loại sắc ký Đặc điểm Phạm vi ứ ng dụngSắc ký hấ p phụ pha thườ ng

(NP-HPLC)- Pha tĩnh: hạt r ắn, xố p,

phân cực, ái nướ c.- Pha động: dung môi

không hay ít phân cực,k ỵ nướ c.

- Cơ chế tách: Sự hấ p phụ

của pha tĩnh. - Bị ảnh hưở ng nhiều bở i

độ ẩm nên độ lặ p lạikém.

- Tách và phân tích cácchất ít và không phâncực.

- Chủ yếu là các chất hữucơ.

Sắc ký hấ p phụ pha đảo(RP-HPLC)

- Pha tĩnh: hạt r ắn, xố p,không hay r ất ít phâncực.

- Pha động: dung môi phân cực và nướ c.

- Cơ chế tách: Sự hấ p phụ của pha tĩnh.

- Độ ổn định và lặ p lại

cao.

- Tách và phân tích cả chấtkhông phân cực và phâncực.

- Các chất vô cơ và hữucơ, amin, aminoacid, hợ pchất bảo vệ thực vật.






29

Sắc ký phân bố (P-HPLC)

- Pha tĩnh: chất lỏng,không hay r ất ít phâncực.

- Pha động: dung môi

không và ít phân cực.- Cơ chế tách: sự phân bố (sự chiết).

- Độ ổn định và lặ p lạikém.

- Tách và phân tích cả chấtkhông phân cực và phâncực.

- Cả chất vô cơ và hữu cơ.

Sắc ký trao đổi ion(IE-HPLC)

- Pha tĩnh: cấu tạo ion và bề mặt phân cực.

- Pha động: dung dịchnước, đệm pH, chất tạo phức...

- Cơ chế tách: sự trao đổiion.

- Độ ổn định và lặ p lại tốt.

- Tách và phân tích cácchất dạng ion, hay phânli thành ion.

- Các chất vô cơ và hữucơ.

Sắc ký trao đổi dạng cặ p ion(IPE-HPLC)

- Pha tĩnh: dùng loại RP-HPLC.

- Pha động: dung dịchnước, đệm pH, chất tạo phức...

- Cơ chế tách: sự trao đổikiểu cặ p ion.

- Độ ổn định và lặ p lạikhông cao.

- Tách và phân tích cácdạng ion, hay phân lithành ion.

- Các chất vô cơ và hữucơ.

Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC hay F-HPLC)

- Pha tĩnh: cấu tạo loại NP- và RP-HPLC.

- Pha động: dung môi hữucơ.

- Cơ chế tách: sự rây (haylọc) theo độ lớ n phân tử.

- Tách và phân tích các phân tử lớ n (>1000đvC).

- Trong lĩnh vực polymer.

2.3.2 Hệ thống HPLC-MS/MS

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High performanceliquid chromatography - tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)) là thiết

bị phân tích hiện đại, giúp quá trình phân tích nhanh chóng và chính xác trên

nhiều nền mẫu khác nhau. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC – MS/MS) dựa

trên việc sử dụng cột với kích thước hạt siêu nhỏ, có thể tách sắc ký rất tốtthông qua hệ thống áp suất cao (có thể lên đến 1000 atm). Hệ thống áp suấtcao được tạo bằng máy bơm có độ chính xác cao kết nối với hệ thống ống nốichịu được áp suất cao của chất lỏng. Điều này cải thiện độ phân giải peak, độnhạy, cũng như tốc độ phân tích.






30

HPLC – MS/MS là thiết bị được phát triển từ ứng dụng của hệ thốngHPLC. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ cho phép phân tích

các hợp chất với hàm lượng cực nhỏ (ppb), độ nhạy và độ chính xác cao.

2.3.2.1 Thành phần

a. Bơm cao áp

Gồm 2 bơm, 6 kênh kết nối với 6 hệ dung môi khác nhau tiện cho việc phân tích nhiều chỉ tiêu, cũng như rửa hệ thống trong quá trình phân tích.

Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký và rửa giải

chất tan khỏi cột sắc ký, bơm được điều chỉnh từ 0-15000 psi (1020 atm) để

tạo ra những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình

sắc ký.

b. Buồng tiêm mẫu

Gồm có thiết bị định vị ba chiều Oxyz giúp định vị, bơm, hút mẫu từ

k hay đựng mẫu theo chế độ autopsamler.

Khay đựng mẫu gồm 2 khay, mỗi khay có thể chứa 48 vial chất phân

tích.

c. Cột tách

Là cột chứa pha tĩnh, bên trong có chứa chất hấp phụ với kích thước hạtxác định, dùng để tách chất cần phân tích ra khỏi hỗn hợp mẫu và xác địnhhàm lượng của chất đó. Trong HPLC có thể phân tích nhiều chất cùng lúc dựavào khả năng tách từng chất tương ứng với thời gian lưu khác nhau.

d. Đầu dò

Trong HPLC có thể được ghép với các thiết bị đầu dò như UV-Vis

(ultraviolet-visible), FLD (fluorescence detector), MS (mass spectrometry),

MS/MS (tandem mass spectrometry).Hiện nay đầu dò MS/MS là thiết bị có độ nhạy cao nhất dùng trong phân

tích vi lượng.

Một số phương pháp nghiên cứu định lượ ng aflatoxins2.4

2.4.1 Các phương pháp xác định bằng HPLC [8], [9], [10]

Nhóm nghiên cứu của Hilal Colak (Istanbul University Faculty of

Veterinary Medicine, Department of Food Hygiene and Technology, Turkey,






31

2006) đã xác định aflatoxin trong các loại tiêu hạt bằng phương pháp HPLCvà ELISA. Phương pháp HPLC được thực hiện như sau:

- Cân 50 gam mẫu với 5 gam NaCl trộn chung, được chiết bằng hệ dung

môi methanol:nước (80:20) trong một máy xay tốc độ cao trong 3 phút, lọc bằng giấy lọc. Lấy 10 mL dịch lọc pha loãng với 60 mL dung dịch đệm PBS,lấy 66 mL dung dịch này cho qua cột hấp phụ miễn dịch (immunoaffinity

column), cột được hoạt hóa bằng 10 mL PBS, tốc độ qua cột khoảng 3mL/phút. Sau khi cho mẫu qua cột xong, rửa bằng 15 mL nước. Aflatoxins

được rửa giải bằng 1,25 mL methanol, sau đó được định mức bằng 1,75 mL

nước.

- Thể tích tiêm 100 μL.

- Bước sóng kích thích và bước sóng phát được thiết lập tại 333 nm và

460 nm.

- Cột C18, kích thước hạt 5 μm, 250 mm x 4.6 mm.

- Pha động: acetonitril:nước:methanol (17:54:29).

- Tốc độ dòng 1 mL/phút.

- Nhận xét: giới hạn phát hiện của phương pháp là 20 ppb vẫn là khá cao,

giá trị R

2

của afaltoxin B1 là 0,999, tuy nhiên R

2

tổng aflatoxins nhỏ hơn 0,99. Nhóm nghiên cứu của Anna Chiara Manetta, (Department of Food and

Feed Science, University of Teramo, Italy, 2005) đã tiến hành xác địnhaflatoxin M1 trong sữa và phô mai. Quy trình như sau:

- Đối với sữa: một mẫu sữa được đồng nhất và ly tâm ở tốc độ 3000

vòng/phút trong 10 phút. Sau đó hút 10 mL của phần nước pha loãng với cunglượng thể tích dung dịch nước đã khử ion (loại ion từ cột SPE). Cột SPE đượchoạt hóa bằng 5 mL acetonitril và 10 mL nước khử ion, cho mẫu qua và rửa

bằng 10 mL nước, 20 mL acetonitril:nước (20:80) và 10 mL n-henxane.AFM1 được rửa giải bằng 6 mL dichloromethane:acetone (95:5). Sau đó được

thổi khô bằng khí nitơ và được định mức lại bằng 200 μL acetonitril, đem phân tích bằng HPLC với mũi tiêm khoảng 10 μL.

- Pha động là acid acetic:acetonitril:2- propanol:nước (2:10:10:78).

- Tốc độ dòng 1,2 mL/phút.

- Nhận xét: Phương pháp đơn giản dễ thực hiện, độ thu hồi cao (90%),

giá trị SD = 2%, độ lệch chuẩn tương đối thấp từ 2,5 – 4%.






32

Nhóm nghiên cứu của Yan – Yun Hu (Department of Chemistry,

University of Science and Technology of China, 2006) đã định lượng

aflatoxins trong các mặt hàng nông sản như ớt, đậu xanh, mè đen bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang (HPLC-FLD). Kếtquả độ thu hồi của các aflatoxins dao động từ 88% đến 95%, với các giá trịRSD nhỏ hơn 6% (n=6). Các giới hạn phát hiện (LOD) là 0,25 ppb với AFB1

và AFG1, 0,1 ppb với AFB2 và AFG2. Phương pháp được đánh giá là đơngiản, nhanh chóng và độ tin cậy tương đối cao.

2.4.2 Phương pháp ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) [11]

Leszczynska. J, Maslowska. J, Owczarek. A và Kucharska. U (năm2001) đã xác định hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm bằng phương phápELISA. Cách xác định như sau:

Cân 2g mẫu vào ống ly tâm cùng với 6 mL MeOH:H2O (4:1), ly tâm 10

phút tốc độ 3500 vòng/phút. Hút 100 μL của phần nổi trên mặt pha loãng với700 μL dung dịch đệm cho vào các giếng dùng để phân tích tiếp.

Thêm vào mỗi giếng 100 μL dung dịch chuẩn và 50 μL dung dịch liênhợp aflatoxin- peoxidase, khuấy và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Tiếp theo

các giếng được rửa 5 lần bằng dung dịch đệm phosphate 0,1 mol/L (pH=7,2).Sau đó cho 150 μL tetramethylbenzidine-urea peoxide vào mỗi giếng, dung

dịch này được ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút trong bóng tối. Kết thúc phản ứng bằng một tác nhân dừng. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm, được đọc

bằng thiết bị đọc chuyên dụng ELISA. Nồng độ AFB1 được tính toán dựa vàođường cong hấp thụ.

Nhận xét: Đây là phương pháp thử nghiệm sinh học đơn giản nhưng thờigian thực hiện khá lâu, cần lựa chọn chấp hấp phụ miễn dịch và loại enzyme

phù hợp.






33

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Thời gian, địa điểm3.1

Thời gian: 01/01/2015 – 25/04/2015.

Địa điểm: Phòng Hóa – Công ty cổ phần chứng nhận và giám địnhVinacert – Chi nhánh Cần Thơ (Khu đô thị 586, quận Cái Răng, thành phốCần Thơ).

Phương tiện nghiên cứ u3.2

3.2.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS AB SCIEX QTRAP

4500;

- Máy ly tâm Mikro 220R;

- Máy rung lắc LAB. ORBITAL SHAKER;

- Máy đánh siêu âm;

- Cân phân tích KERN ABT 100-5M;

- Cân kỹ thuật SARTORIUS; - Bộ chiết pha rắn;

- Máy vortex;

- Máy xay mẫu;

- Hệ thống thổi khí nitơ.

3.2.2 Dụng cụ

- Kim tiêm 1 mL;- Vial 1.5 mL;

- Màng lọc Syringe Filters 0.2 µm;

- Micro pipette 20-200 μL;








34

- Đầu tip Micropipette loại 10-100µL màu vàng, 100-1000µL màu xanh,

1-5 mL màu trắng;

- Ống đong 50 mL;



- Pipette Pasteur;

- Ống ly tâm nhựa có nắp 50 mL, 30 x 115mm;

- Cột SPE Strata Florisil (FL-PR).

3.2.3 Hóa chất và thuốc thử

- Chuẩn aflatoxin B1 nồng độ 3 ppm;

- Chuẩn aflatoxin B2 nồng độ 3 ppm;

- Chuẩn aflatoxin G1 nồng độ 3 ppm;

- Chuẩn aflatoxin G2 nồng độ 3 ppm;

- Methanol tinh khiết;

- Nước cất 2 lần từ hệ thống cất nước của công ty;

- Acetonitrile HPLC;

- Acid formic (FA) tinh khiết;

- Acetone tinh khiết.

3.2.4 Cách pha các dung dịch, thuốc thử

3.2.4.1 Hệ dung môi methanol:nướ c (4:1)

Đong 800 mL MeOH cho vào bình 1000 mL, đong 200 mL H 2O cho tiếpvào, đậy kín nắp, lắc nhẹ sau đó đem đánh siêu âm 15 phút cho hệ đồng nhất.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

3.2.4.2 Hệ dung môi acetone:H2O:FA (96:3,7:0,3)

Đong 96 mL acetone cho vào bình 100 mL. Dùng micro pipette 5 mL hút

3,7 mL H2O cho tiếp vào bình. Dùng micro pipette 100-1000 μL hút 300 μLcho vào bình chứa hai dung môi trên, đậy nắp kín, lắc nhẹ và đánh siêu âm 30

phút. Cần thực hiện các thao tác nhanh để tránh sự bay hơi dung môi.






35


3.2.4.3 Hệ dung môi H2O:ACN (4:1)

Đong 400 mL H2O cho vào bình 500 mL, đong 100 mL ACN cho nhanhvào bình để tránh bay hơi, đậy nắp và lắc nhẹ, sau đó đem đánh siêu âm 30

phút.


3.2.4.4 Dung dịch chuẩn gốc Aflatoxins (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2)300 ppb

Cho vào bình định mức dung tích 10 mL khoảng 2 mL H2O:ACN (4:1),

sau đó hút chính xác 1 mL mỗi dung dịch chuẩn aflatoxins (B1, B2, G1, G2) 3 ppm cho vào bình định mức 10 mL. Thêm tiếp dung môi đến vạch, lắc nhẹ,đánh siêu âm 30 phút. Sau đó cho vào chai tối bảo quản trong tủ lạnh (khôngđông) để sử dụng.

Phương pháp nghiên cứ u3.3

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu phân tích (30 mẫu thức ăn hỗn hợp cho gà) được lấy ngẫu nhiên từ

công ty Vinacert - Chi nhánh Cần Thơ.

3.3.2

Phương pháp phân tích

Mẫu được xay cho đồng nhất, lấy một lượng nhất định hòa tan bằngMeOH:H2O (4:1), lắc và ly tâm bỏ cắn. Dịch lọc được sử dụng để thực hiệnchiết pha rắn để làm sạch và làm giàu mẫu. Mẫu được thổi khô sau đó đượcđịnh mức lại bằng H2O:ACN (4:1) và đem tiến hành phân tích bởi hệ thống

HPLC-MS/MS.

3.3.3

Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng chương trình ứng dụng Microsoft Excel.

Hoạch định thí nghiệm3.4

- Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS.

- Tối ưu hóa quy trình chiết.

- Thẩm định phương pháp phân tích theo AOAC.






36

- Tiến hành phân tích trên một số mẫu tại công ty Vinacert.

Tiến hành thí nghiệm3.5

3.5.1

Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS [12], [13]

Khảo sát một số điều kiện chạy máy HPLC được công bố trên một số bài

báo uy tín, kết hợp điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm để chọn các thôngsố tối ưu cho hệ thống.

Điều kiện hệ thống HPLC-MS/MS 1 (Phương pháp 1):

Nghiên cứu của Amedeo Pietri và cộng sự (2010) đã tìm được điều kiện

cho hệ thống HPLC-MS/MS như sau:

- Kích thước cột: cột pha đảo C18, 150 mm x 2,1 mm, 5μm; - Thể tích tiêm: 5 μL;

- Tốc độ dòng 0,3 mL/phút;

- Pha động A: ACN;

- Pha động B: H2O;

Cả hai pha được acid hóa với 0,4% acid acetic. Tại thời điểm bắt đầu, pha động A/pha động B (A/B) là 15/85; tăng dần tuyến tính đến tỉ lệ A/B là

65/35 trong vòng 9 phút, giữ nguyên tỉ lệ pha động và chạy tiếp 5 phút.

Bảng 3.1 Một số thông số cài đặt cho MS1

Source ESI+

Collision Gas Argon

Spray capillary voltage 4 kV

Sheath gas Nitrogen, 41 psi

Auxiliary gas Nitrogen, 5 psi

TEM 270 oC

Điều kiện hệ thống HPLC-MS/MS 2 (Phương pháp 2):

Nghiên cứu của Riwei Wei và cộng sự (2013) đã tìm được điều kiện tốiưu để phân tích aflatoxins và ochrotoxin A. Điều kiện như sau:

- Kích thước cột: C18, 50 mm x 2,5 mm, 3,5 μm;

- Pha động A: H2O;

- Pha động B: ACN;






37

Cả hai pha đều có 0,1% FA. Bắt đầu chạy với tỷ lệ A/B là 90 /10 trong

vòng 0,6 phút, thay đổi tuyến tính đến tỉ lệ A/B là 5/95, giữ 2,5 phút. Sau đó

trả về tỉ lệ ban đầu là 90/10.

Bảng 3.2 Một số thông số cài đặt cho MS2

Source ESI+

Ion spray voltage 5500 V

Curtain gas 15 psi

Ion source gas 1 55 psi


Điều kiện hệ thống HPLC-MS/MS 3:

Sau khi tham khảo các bài báo từ những nhà nghiên cứu khác nhau, tiếnhành thí nghiệm với điều kiện chạy HPLC-MS/MS như sau:

Cột C18, 50 mm x 2 mm, 3,5 µm;

Pha động A: H2O;

Pha động B: ACN;

Thể tích tiêm: 10 µL;

Tốc độ dòng 0,3 mL/phút. Bảng 3.3 Một số thông sô cài đặt cho MS3

Source ESI+

Ion source Turbo Spray

Curtain gas 25 psi


TEM 400 oC








38

3.5.2 Tối ưu hóa quy trình chiết

Mẫu sau khi được xay cho đồng nhất, cân 1 gam cho vào ống ly tâmnhựa 50 mL, được thực hiện như sau:

Hình 3.1 Quy trình xử lý mẫu

Sau khi lọc lấy dịch lọc đem tiến hành chiết pha rắn theo hai quy trìnhthử nghiệm sau, mỗi quy trình sử dụng 10 mL dịch lọc:

Quy trình SPE 1:

Hình 3.2 Quy trình chiết pha rắn thứ nhất

Thêm 20 mL MeOH:H2O (4:1) vào mẫu

Vortex 5 phút

Lắc 30 phút (Tốc độc rung lắc 250 vòng/phút)

Ly tâm 5 phút, tốc độ 5000 vòng/phút,nhi t đ cài đ t 25oC

Lọc lấy dịch lọc, hút lấy 10 mL đem tiến hành chiết pha rắn

Hoạt hóa cột SPE bằng 5 mL MeOH

Rửa bỏ MeOH thừa bằng 3-5 mL H2O

Cho 10 mL mẫu qua cột (loading sample)

Rửa cột bằng 2 mL MeOH:H2O (4:1)

Rửa giải bằng 5 mL acetone : H2O:FA (96:3,7:0,3)






39

Quy trình SPE 2:

Hình 3.3 Quy trình chiết pha rắn thứ hai

Tiến hành khảo sát 2 quy trình trên so sánh khả năng làm sạch mẫu, độnhiễu, độ thu hồi, độ nhạy, thời gian phân tích cũng như hiệu quả kinh tế củamỗi quy trình. Từ đó chọn ra quy trình tối ưu.

3.5.3 Thẩm định quy trình phân tích

3.5.3.1

Thí nghiệm về độ tuyến tính

a. Mục đích, yêu cầu

Khảo sát tính tuyến tính của quy trình ở các nồng độ 0,75; 1,5; 3; 4,5; 6

ppb.

Xác định phương trình hồi quy y = ax + b, hệ số tương quan r giữa nồngđộ chuẩn/nồng độ nội chuẩn và diện tích peak chuẩn/diện tích peak nội chuẩn.

Yêu cầu: r 2 > 0,99.

b. Cách tiến hành

Từ dung dịch chuẩn aflatoxins 300 ppb, tiến hành pha thành các dung

dịch của dãy chuẩn từ 0,75 đến 6 ppb.

- Pha dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb:

Dùng micropipette loại 100 – 1000 μL, hút chính xác 900 μL dung dịch

H2O:ACN (4:1) cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác




Rửa cột bằng 0,5 mL MeOH:H2O (4:1)

Rửa tiếp bằng 0,5 mL MeOH

Rửa giải bằng 5 mL acetone : H2O:FA (96:3,7:0,3)






40

100 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 300 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dánnhãn và vortex 1 phút.

- Pha dung dịch chuẩn 3 aflatoxins ppb:


H2O:ACN (4:1)cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác100 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán

nhãn và vortex 1 phút.

- Pha dung dịch chuẩn aflatoxins 4,5 ppb:


H2O:ACN (4:1)cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác

150 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dánnhãn và vortex 1 phút.

- Pha dung dịch chuẩn aflatoxins 6 ppb:


H2O:ACN (4:1)cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác200 μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán

nhãn và vortex 1 phút.

- Pha dung dịch chuẩn aflatoxins 1,5 ppb:Dùng micropipette loại 100 – 1000 μL, hút chính xác 950 μL dung dịch

H2O:ACN (4:1) cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác 50μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán nhãnvà vortex 1 phút.

- Pha dung dịch chuẩn 0,75 ppb:


H2O:ACN (4:1)cho vào vial. Dùng micropipette 20 - 200 μL hút chính xác 25

μL từ dung dịch chuẩn aflatoxins 30 ppb cho tiếp vào vial, đậy nắp dán nhãnvà vortex 1 phút.

Các dung dịch chuẩn pha xong đem tiến hành đo bằng máy HPLC-

MS/MS.

3.5.3.2 Thí nghiệm về độ đúng

a. Mục đích, yêu cầu






41

Xác định độ đúng của phương pháp thông qua việc so sánh giá trị tìm

được và giá trị thực ở nồng độ 1,5 ppb, 2,5 ppb và 5 ppb.

Tiến hành phân tích mỗi nồng độ 6 mẫu. Độ thu hồi mỗi mẫu phải nằm

trong khoảng từ 80-110%.


Lượng mẫu tối thiểu để phân tích là 200g, được xay nhuyễn , cho vào túi

PE để bảo quản, ép cho không khí thoát ra ngoài túi hết để tránh bị ẩm và oxihóa, để trong thùng chứa mẫu, bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân

tích.

Chọn 6 mẫu trắng đã được xay, cân 1 gam mỗi mẫu cho vào mỗi ống ly

tâm 50 mL. Vì khảo sát ở 3 mức nồng độ nên 6 mẫu này mỗi mẫu cân 3 lần. Đối với nồng độ khảo sát là 1,5 ppb, lượng mẫu là 1 gam thì thể tích

chuẩn aflatoxins (chuẩn sử dụng là 30 ppb, được pha từ chuẩn 300 ppb như thínghiệm trên) cần thêm như sau:

=ℎố ượ ẫ ồ độ

ồ độử ụ

Trong đó

: là thể tích cần lấy

ồ độ: Nồng độ đạt được sau khi thêm chuẩn vào 1 gam mẫu.

ồ độử ụ: Nồng độ chuẩn được sử dụng để thêm vào mẫu.

=1 () 1,5 ()

30 ()= 50 ()

Dùng micropipette 20 – 200 μL hút chính xác 50 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb cho vào 6 mẫu, để yên 15 phút. Thêm vào mỗi ống ly tâm 20 mL

MeOH:H2O (4:1), vortex 5 phút, lắc 30 phút (tốc độ 250 vòng/phút) sau đó lytâm 5 phút (tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ 25oC), lọc lấy dịch sau ly tâm và

hút chính xác 10 mL đem tiến hành chiết pha rắn.

Dung dịch sau rửa giải được làm khô bằng hệ thống thổi khí sau đó hòa

tan lại bằng 1 mL dung dịch H2O:ACN (4:1), vortex 1 phút.

Lọc qua màng lọc 0,2 μm vào vial và đem phân tích bằng hệ thống LC-

MS/MS.






42

Tiếp tục khảo sát ở nồng độ 2,5 ppb (= 83 μL chuẩn aflatoxins 30

ppb) và 5 ppb (= 167 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb).

3.5.3.3

Thí nghiệm về độ chính xáca. Mục đích, yêu cầu

Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của quá trình định lượng ở cácnồng độ 1,5 ppb, 2,5 ppb, 5 ppb. RSD càng nhỏ, phương pháp càng chính xác.

Theo Commision Decision 2002/657/EC của Cộng đồng Châu Âu (EC),

RSD < 10%.


Chọn 6 mẫu trắng đã được xay, cân 1 gam mỗi mẫu cho vào mỗi ống lytâm 50 mL. Đối với nồng độ khảo sát là 1,5 ppb, hút chính xác 50 μL chuẩnaflatoxins 30 ppb cho vào 6 mẫu, để yên 15 phút. Thêm vào mỗi ống ly tâm 20mL MeOH:H2O (4:1), vortex 5 phút, lắc 30 phút (tốc độ 250 vòng/phút) sauđó ly tâm 5 phút (tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ 25oC), lọc lấy dịch sau lytâm và hút chính xác 10 mL đem tiến hành chiết pha rắn.

Dung dịch sau rửa giải được làm khô bằng hệ thống thổi khí sau đó hòa

tan lại bằng 1 mL dung dịch H2O:ACN (4:1), vortex 1 phút.

Lọc qua màng lọc 0,2 μm vào vial và đem phân tích bằng hệ thống LC-

MS/MS.

Tiếp tục khảo sát ở nồng độ 2,5 ppb (= 83 μL chuẩn aflatoxins 30

ppb) và 5 ppb (= 167 μL chuẩn aflatoxins 30 ppb).

3.5.3.4 Giớ i hạn phát hiện (LOD)

a. Mục đích

Xác định các giá trị (LOD) đối với mỗi chất nhóm aflatoxins.

b. Cách xác định

Có hai phương pháp xác định giới hạn phát hiện:

Phương pháp không dụng cụ:

Tiến hành xác định giá trị LOD của phương pháp bằng cách pha loãngnồng độ aflatoxin chuẩn đã biết sau đó giảm dần bằng nồng độ pha loãng ½cho tới khi đạt tới mức tối thiểu nào đó còn phát hiện được bằng quy trình đề

xuất.






43

Phương pháp dụng cụ:

- Có thể tiến hành xác định bằng cách xác định phương trình hồi quy y =ax + b.

= 3,3

với a: độ dốc của đường tuyến tính.

SD: độ lệch chuẩn của kết quả đo chất phân tích.

- Đo tín hiệu thu được từ chuẩn là S (signal), tín hiệu nhiễu là N (noise),

tính toán giá trị S/N (chiều cao peak chất phân tích/nhiễu đường nền). LOD

được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường

nền, thông thường lấy S/N=3.

Hình 3.4 Cách tính giá trị S/N

Trong quy trình thẩm định này sử dụng phương pháp tính giá trị S/N.Tiến hành xác định giá trị LOD của phương pháp bằng cách: Thử lần lượt cácnồng độ 0,2 ppb, 0,5 ppb, 1 ppb, 2 ppb thêm vào mỗi mẫu có khối lượng 1gam, thực hiện giống như quy trình xử lý mẫu. Đo giá trị S/N ở nồng độ nào

nằm trong khoảng 2-3 thì lấy nồng độ đó làm giá trị LOD, mỗi nồng độ lặp lại3 lần.

3.5.3.5 Giớ i hạn định lượ ng (LOQ)

a. Mục đích

Xác định các giá trị LOQ đối với mỗi chất nhóm aflatoxins.


Xác định giá trị LOD từ phương pháp trên sau đó tính giá trị LOQ =3LOD.






44

3.5.4 Tiến hành phân tích trên một số mẫu thật ở công ty Vinacert

Áp dụng quy trình đã thẩm định, tiến hành phân tích trên 30 mẫu thức ănhỗn hợp cho gà được chọn ngẫu nhiên tại công ty Vinacert.

Kết quả phân tích được đánh giá bằng cách so sánh với quy chuẩn

QCVN 01-10:2009/BNNPTNT (hàm lượng aflatoxin B1 không vượt quá 10 ppb và hàm lượng tổng các aflatoxins không vượt quá 30 ppb).

Quy trình chung phân tích 30 mẫu thức ăn hỗn hợp cho gà được tiếnhành như Hình 3.5.






45

Hình 3.5 Quy trình phân tích mẫu

Thêm 20 mL MeOH:H2O (4:1) vào mẫu

Vortex 5 hút

Lắc 30 phút (Tốc độc rung lắc 250 vòng/phút)

Ly tâm 5 phút, tốc độ 5000 vòng/phút,nhiệt độ cài đặt 25oC

Lọc lấy dịch lọc, hút lấy 10 mL

đem tiến hành chiết pha rắn



Cho 10 mL mẫu ua cột loadin sam le

Rửa cột bằng 0,5 mL MeOH:H2O (4:1),

rửa tiếp bằng 0,5 mL MeOH

Rửa giải bằng 5 mL acetone:H2O:FA (96:3,7:0,3)

Thổi khô bằng hệ thống thổi khí,

định mức lại bằng 1 mL H2O:ACN (4:1)

Cân 1 gam mẫu đã xay cho vào ống ly tâm 50 mL

Lọc qua màng lọc 0,2 μm vào vial,

đem phân tích bằng LC-MS/MS






46

CHƯƠNG 4

K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS4.1

4.1.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy máy HPLCKết quả chạy HPLC-MS/MS theo 3 phương pháp đã nêu thu được theo

thứ tự Hình 4.1, Hình 4.2 và Hình 4.3.






47

Hình 4.1 Sắc ký đồ chuẩn AFs 0,75 ppb theo phương pháp 1

W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMng góp PDF bở i GV. Nguy n Thanh Tú




48







49







50

Nhận xét:

Dựa vào sắc ký đồ của 3 phương pháp thì phương pháp 1 thể hiện sựtách tốt nhất, các chất AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 xuất hiện với thời gian

lưu tách biệt rõ rệt, tiếp theo là phương pháp 3 và phương pháp 2 tách kémnhất.

Phương pháp 2 cho sắc ký đồ với tín hiệu peak bị nhiễu, peak quá tù(AFB1 và AFB2) và bị chẻ ngọn (AFG1). Trong khi đó phương pháp 1 và

phương pháp 3 cho tín hiệu peak rõ ràng và nhọn hơn. ở phương pháp 1 cómột tín hiệu peak của AFG2 bị tù hơn so với phương pháp 3 nên từ đó kết luận

phương pháp 3 cho tín hiệu peak tốt nhất. Mặt khác nếu xét về pha động thì phương pháp 1 sử dụng 0,4% acid acetic trong nước và 0,4% acid acetic trong

ACN, trong khi đó phương pháp 3 chỉ sử dụng nước và ACN.

Từ kết quả trên nên quyết định chọn phương pháp 3 làm phương pháp tốiưu cho hệ thống HPLC-MS/MS.

Các thông số đã được cài đặt để tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS theo

phương pháp 3 được thể hiện như sau: Bảng 4.1 Thành phần và tỉ lệ pha động

Thời gian (phút) Pha động A H2O (%)

Pha động B ACN (%)

0 90 10

2 90 10

6 25 75

7 90 10

9 90 10

- Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút;

- Nhiệt độ cột: 35°C;

- Thể tích tiêm 10 μL.

4.1.2 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ

Các thông số cài đặt cho MS được tóm tắt trong Bảng 4.2.






51

Bảng 4.2 Điều kiện của MS

Source ESI+

Ion source Turbo SprayCurtain gas 25 psi


TEM 400 oC



Bảng 4.3 Điều kiện phân mảnh ion

Compound Q1 mass Q3 mass Time DP EP CE CXP

AFB1312,9 285,1 5,0 60 11 34 9

312,9 241,8 5,0 72 11 39 8,5

AFB2315,1 287,2 4,8 73 7 34 8,5

315,1 259,1 4,8 73 8 41 10

AFG1329,1 311,2 4,8 76 10 30 7

329,1 242,6 4,8 79 9 34 7

AFG2330,9 245,1 4,6 100 12 40 8

330,9 217,4 4,6 104 14 47 8

Tối ưu hóa quy trình chiết4.2Hai quy trình chiết pha rắn được lựa chọn như sau

Quy trình SPE1:






52

Hình 4.4 Quy trình chiết pha rắn thứ nhất

Quy trình SPE2:

Hình 4.5 Quy trình chiết SPE thứ hai

Nhận xét:

Với quy trình thứ nhất chỉ sử dụng MeOH:H2O (4:1) để rửa, thể tíchdùng là 2 mL; trong khi quy trình thứ hai sử dụng 0,5 mL MeOH:H2O (4:1) và

0,5 mL MeOH để rửa; thời gian thực hiện của hai quy trình tương đương nhau,lượng dung môi sử dụng không chênh lệch nhiều. Vậy quy trình nào cho kết

quả phân tích có độ thu hồi cao hơn và độ nhiễu thấp hơn.


Rửa bỏ MeOH thừa bằn 3-5 mL H2O


Rửa cột bằng 2 mL MeOH:H2O (4:1)





Rửa cột bằng 0,5 mL MeOH:H2O (4:1)

Rửa tiếp bằng 0,5 mL MeOH







53

Quy tr ình thứ nhất chỉ sử dụng MeOH:H2O (4:1) để rửa nên tạp cònnhiều hơn, tuy sử dụng 2 mL nhưng chất phân tích bị rửa trôi không quá

nhiều, độ thu hồi vẫn thỏa điều kiện. Trong khi quy trình hai có sử dụng thêm

MeOH để rửa nên mẫu sạch hơn. Chất phân tích có bị rửa trôi bởi MeOHmạnh hơn MeOH:H2O (4:1), nhưng lượng dung môi sử dụng chỉ 0,5 mL nên

độ thu hồi vẫn còn khá cao và nằm trong khoảng chấp nhận được. Vậy quytrình thứ hai cho kết quả mẫu sạch hơn và độ thu hồi cao, nếu xét kĩ hơn vềlượng dung môi thì ít hơn so với quy trình thứ nhất nên chọn quy trình thứ hailàm quy trình chiết.

K ết quả thẩm định4.3

4.3.1

Độ tuyến tínhTrong khoảng nồng độ từ 0,75 đến 6 ppb, phương trình hồi quy của các

chất AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 có độ tuyến tính cao với hệ số r 2 > 0,99.

Bảng 4.4 Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của các chất

Chất Phương trình hồi quy R

Aflatoxin B1 y = 8,95e+004 x + 3,84e+003 0,9997Aflatoxin B2 y = 6,57e+004 x + 9,12e+003 0,9990Aflatoxin G1 y = 4,36e+004 x + 8,65e+003 0,9992Aflatoxin G2 y = 1,79e+004 x - 826 0,9998

4.3.2 Độ đúng

Độ thu hồi của các aflatoxins ở các nồng độ 1,5 ppb, 2,5 ppb, 5 ppb đượcthể hiện qua Hình 4.6.

Hình 4.6 Độ thu hồi trung bình của các chất nhóm aflatoxins






54

Nhận xét: Độ thu hồi của các chất AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 ở cácnồng độ 1,5 ppb, 2,5 ppb, 5 ppb đạt từ 87,8% - 105,7%. Phương pháp có độ

đúng cao (Theo EC độ thu hồi đạt trong khoảng từ 80-110%).

4.3.3 Độ chính xác

Độ chính xác của các aflatoxins ở các nồng độ 1,5 ppb, 2,5 ppb, 5 ppb

được thể hiện qua Hình 4.7.

Hình 4.7 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các chất nhóm aflatoxins

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của AFB1, AFB2, AFG1 AFG2 ở

các nồng độ 1,5 ppb, 2,5 ppb, 5 ppb nằm trong khoảng 1,17% đến 3,63%.

Phương pháp có độ chính xác cao, ở tất cả các nồng độ đều có giá trị RSD nhỏhơn 4%.

4.3.4 Giớ i hạn phát hiện (LOD)

Tại nồng độ 1 ppb của các aflatoxins, giá trị S/N của các chất nhómaf latoxins đều nằm trong khoảng 3-10 nên lấy nồng độ 1 ppb làm LOD chung

của phương pháp. Phương pháp có giá trị LOD thấp.

4.3.5 Giớ i hạn định lượ ng (LOQ)

Giới hạn định lượng LOQ được suy ra từ giá trị LOD.

LOQ = 3 LOD = 3 ppb.

Phương pháp có giá trị LOQ thấp.

K ết quả phân tích một số mẫu thức ăn hỗn hợ p cho gà tại công ty4.4

Vinacert

Qua quá trình phân tích 30 mẫu thức ăn, phát hiện 8 mẫu phân tích

(chiếm 23,33%) nhiễm aflatoxins, trong đó có 7 mẫu nhiễm nhưng với hàm






55

lượng rất nhỏ, trong mức cho phép và 1 mẫu vượt mức quy định về hàm lượngaflatoxin B1 là 10 ppb theo tiêu chuẩn Việt Nam QCVN 01-10:

2009/BNNPTNT.

Bảng 4.5 Kết quả phân tích nồng độ aflatoxins trên các mẫu Mẫu Hàm lượ ng phân tích (ppb) Mẫu Hàm lượ ng phân tích (ppb)

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

Sample-1 0 0 0 0 Sample-16 0 0 0 0Sample-2 0 0 0 0 Sample-17 0 0 0 0Sample-3 0 0 0 0 Sample-18 0 0 0 0Sample-4 4,68 0 0 0 Sample-19 0 0 1,28 1,7Sample-5 0 0 0 0 Sample-20 0 0 0 0Sample-6 0 0 0 0 Sample-21 0 0 0 0Sample-7 7,46 0,99 0,72 0,73 Sample-22 0 0 0 0

Sample-8 0 0 0 0 Sample-23 13,35 2,26 0 0,144Sample-9 0 0 0 0 Sample-24 0 0 0 0Sample-10 7,24 0,80 0,45 0,26 Sample-25 0 0 0 0Sample-11 0 0 0 0 Sample-26 0 0 0 0Sample-12 9,03 1,79 2,51 0,32 Sample-27 0 0 0 0Sample-13 0 0 0 0 Sample-28 0 0 0 0Sample-14 4,93 0,76 0,66 1,01 Sample-29 0 0 0 0Sample-15 0 0 0 0 Sample-30 0 0 1,56 1,78






56

CHƯƠNG 5

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

K ết luận5.1

Qua quá trình khảo sát quy trình định lượng 4 chất nhóm aflatoxins bằng phương pháp UPLC-MS/MS, luận văn đã đạt được các kết quả như sau:

Lựa chọn được điều kiện chạy hệ thống HPLC-MS/MS tối ưu cho

aflatoxins.

Tối ưu hóa quy trình chiết aflatoxins đạt được độ tinh sạch và độ thu hồi

cao bằng cột chiết pha rắn với dung môi giải ly acetone:H2O:FA (96:3,7:0,3)

Thẩm định quy trình phân tích bằng HPLC-MS/MS cho thấy độ đúng, độchính xác cao, giá trị LOD, LOQ thấp. Các giá trị được thể hiện cụ thể quaBảng 5.1.

Bảng 5.1 Kết quả thẩm định quy trình phân tích aflatoxins

AFB1 AFB2 AFG1 AFG21,5

ppb2,5

ppb5 ppb 1,5

ppb2,5

ppb5

ppb1,5

ppb2,5

ppb5

ppb1,5

ppb2,5

ppb5 ppb

Độ tuyến tính(R 2)

0,9997 0,9990 0,9992 0,9998

Độ đúng (%) 87,9 92,7 88,9 89,3 88,6 91,1 97,9 105,7 98,2 99,8 103,8 95,7Độ chính xác

(RSD, %)2,02 1,62 1,17 3,63 2,01 1,84 1,75 1,49 3,04 1,5 2,95 2,25

LOD (ppb) 1 1 1 1LOQ (ppb) 3 3 3 3

Kết quả phân tích 30 mẫu thức ăn chăn nuôi tại công ty CP chứng nhận

và giám định Vinacert – Chi nhánh Cần Thơ cho thấy số lượng mẫu nhiễmaflatoxins ở mức trung bình tuy nhiên nồng độ không cao, chỉ có 1 mẫu

(3,3%) trong 8 mẫu nhiễm (23,33%) có hàm lượng AFB1 vượt mức quy địnhlà 13,35 ppb. Do thức ăn được làm từ bắp, khoai mì mà những loại này rất dễ

bị nấm mốc kể cả ở giai đoạn thu hoạch, trữ kho và sau khi chế biến thành

thức ăn hỗn hợp nên không tránh khỏi việc bị nhiễm aflatoxins. Kết quả phântích giúp kiểm soát được hàm lượng aflatoxins trong thức ăn để tránh gâynguy hiểm trực tiếp đến vật nuôi và gián tiếp đến sức khỏe con người khi ănthịt từ vật nuôi đó; đồng thời giúp các công ty chế biến thức ăn chọn lựanguyên liệu sạch và có biện pháp bảo quản phù hợp.

Kiến nghị 5.2

Nếu có thêm thời gian và điều kiện vật chất, luận văn sẽ mở rộng nghiên

cứu:






57

- Chiết pha rắn:

Tìm hệ dung môi giải ly đơn giản hơn thay thế hệ dung môiacetone:H2O:FA (96:3,7:0,3).

Khảo sát quy trình làm sạch, làm giàu mẫu bằng loại cột khácnhư: Strata Silica, -NH2, -CN.

- Thử phương pháp chiết aflatoxins bằng cột immunoaffinity.

- Thử nghiệm so sánh quy trình định lượng bằng HPLC-UV/Vis, UPLC-

MS/MS và ELISA.

- Mở rộng định lượng thêm chất nhóm aflatoxins như AFM1 trên cácnền mẫu khác như sữa, thực phẩm,...






58

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dvorackova Ivana, 1990. Aflatoxin and human heath. CRCPress, Inc. Florida. pp. 1-12.

2. Leatherhead Food Research Association, Randalls Road,Leatherhead. The aflatoxins. Surrey KT22 7RY. England. pp 1-3.

3. Jörg Stroka, 2000. Determination of Aflatoxins in Food andFeed with Simple and Optimised Methods. pp. 8-13.

4. Võ thị Thanh Trang, 2009. Bước đầu xây dựng quy trình pháthiện Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương

pháp phát quang. Luận án Thạc Sĩ. Đại học Quốc gia TP. HCM – TrườngĐại học KHTN.

5. Huỳnh Nguyễn Quế Anh, 2009. Nấm mốc và độc tố aflatoxin.Luận văn cao học. Đại học Quốc gia TP. HCM – Trường Đại học Bách

Khoa.

6. Ronal E. Majors, 2013. Sample preparation fundamentals for

chromatography. Agilent technologies, Inc. Canada. pp 94-113.

7. Prof. Dr. Phạm Luận, 2014. Bài giảng Sắc ký lỏng hiệu năngcao. Đại học Quốc gia Hà Nội.

8. Hilal Colak, Enver Baris Bingol, Hamparsun Hampikyan and

Bulent Nazli, 2006. Determination of Aflatoxin Contamination in Red-

Scaled, Red and Black Pepper by ELISA and HPLC. Journal of Food

and Drug Analysis, Vol. 14, 3: 292-296.

9. Anna Chiara Manetta, Lorella Di Giuseppe, Melania

Giammarco, Isa Fusaro, Anselmo Simonella, Alessandro Gramenzi,

Andrea Formigoni, 2005. High-performance liquid chromatography with

post-column derivatisation and fluorescence detection for sensitive

determination of aflatoxin M1in milk and cheese. Journal of

Chromatography A, 1083: 219 – 222.

10. Yan – Yun Hu, Ding Zheng, Zhao – Xiang Zhang, You – Zhao

He, 2006. Determination of aflatoxins in High-pigment content samples

by Matrix Solid-phase Dispersion and High-performance Liquid

Chromatography. University of Science and Technology of China.






59

11. Leszczynska. J, Maslowska. J, Owczarek. A và Kucharska. U,

2001. Determination of aflatoxins in food products by the ELISA

method. Czech J. Food Sci.,19: 8-12.

12. Amedeo Pietri, Silvia Rastelli, Teremzio Bertuzzi, 2010.Ochratoxin A and Aflatoxins in Liquorice Products. Università Cattolica

del Sacro Cuore. Italy. Toxins (Basel), 2: 758-770.

13. Riwei Wei, Feng Qiu, Weijun Kong, Jianhe Wei, Meihua Yang,

Zuliang Luo, Jieping Qin and Xiujing Ma, 2013. Co-occurrence of

aflatoxin B1,B2,G1,G2 and ochrotoxin A inGlycyrrhiza uralensis

analyzed by HPLC-MS/MS. Food control, 32: 216-221.






60

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A:

PHỤ LỤC B:

PHỤ LỤC C:

PHỤ LỤC D:

SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN TÍNH

ĐỒ THỊ THỂ HIỆN ĐỘ TUYẾN TÍNH

BẢNG GIÁ TRỊ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG VÀ ĐỘCHÍNH XÁC

SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU NHIỄM AFLATOXINSVÀ MỘT SỐ MẪU KHÔNG PHÁT HIỆN

AFLATOXINS






61

PHỤ LỤC A: SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN TÍNH






62






63






64






65






66

PHỤ LỤC B: ĐỒ THỊ THỂ HIỆN ĐỘ TUYẾN TÍNH






67






68






69






70

PHỤ LỤC C: BẢNG GIÁ TRỊ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG VÀ ĐỘCHÍNH XÁC

Aflatoxin B1

Cspiked

(ppb)Crecovery

(ppb)Recovery

(%)Recoveryaverage

(%)RSD (%)

1,5 1,28 85,33

87.78 2,02

1,5 1,32 88,00

1,5 1,30 86,67

1,5 1,32 88,00

1,5 1,36 90,67

1,5 1,32 88,00

2,5 2,26 90,40

92,73 1,62

2,5 2,33 93,20

2,5 2,32 92,80

2,5 2,35 94,00

2,5 2,29 91,602,5 2,36 94,40

5 4.52 90,40

88,93 1,17

5 4,49 89,80

5 4,40 88,00

5 4,39 87,80

5 4,42 88,405 4,46 89,20






71

Aflatoxin B2

Cspiked

(ppb)

Crecovery

(ppb)

Recovery

(%)

Recoveryaverage

(%)

RSD (%)

1,5 1,33 88,67

89,33 3,63

1,5 1,28 85,33

1,5 1,29 86,00

1,5 1,40 93,33

1,5 1,36 90,67

1,5 1,38 92,00

2,5 2,25 90,00

88,6 2,01

2,5 2,18 87,20

2,5 2,28 91,20

2,5 2,22 88,80

2,5 2,20 88,00

2,5 2,16 86,40

5 4,56 91.20

91,13 1,84

5 4,48 89,60

5 4,62 92,40

5 4,43 88,60

5 4,62 92,40

5 4,63 92,60






72

Aflatoxin G1

Cspiked

(ppb)

Crecovery

(ppb)

Recovery

(%)

Recoveryaverage

(%)

RSD (%)

1,5 1,46 97,33

97.89 1,75

1,5 1,48 98,67

1,5 1,49 99,33

1,5 1,44 96,00

1,5 1,44 96,00

1,5 1,50 100,00

2,5 2,59 103,60

105.73 1,49

2,5 2,63 105,20

2,5 2,61 104,40

2,5 2,67 106,80

2,5 2,69 107,60

2,5 2,67 106,80

5 5,18 103.60

98,23 3,04

5 4,91 98,20

5 4,97 99,40

5 4,83 96,60

5 4,79 95,80

5 4,79 95,80






73

Aflatoxin G2

Cspiked

(ppb)

Crecovery

(ppb)

Recovery

(%)

Recoveryaverage

(%)

RSD (%)

1,5 1,49 99,33

99,78 1,50

1,5 1,48 98,67

1,5 1,49 99,33

1,5 1,48 98,67

1,5 1,50 100,00

1,5 1,54 102,67

2,5 2,57 102,80

103,80 2,95

2,5 2,68 107,20

2,5 2,46 98,40

2,5 2,63 105,20

2,5 2,59 103,60

2,5 2,64 105,60

5 4,98 99,60

95,67 2,25

5 4,82 96,40

5 4,77 95,40

5 4,73 94,60

5 4,68 93,60

5 4,72 94,40






74

PHỤ LỤC D: SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU NHIỄM AFLATOXINS VÀMỘT SỐ MẪU KHÔNG PHÁT HIỆN AFLATOXINS

D.1 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU NHIỄM AFLATOXINS






75






76






77






78






79






80






81






82






83






84






85






86






87






88






89






90

D.2 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU KHÔNG PHÁT HIỆN AFLATOXINS






91







Documents

Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ