KEMAMPUAN BIJI VITIS VINIFERA DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN SEL KANKER RONGGA MULUT SECARA IN VITRODiajukan kepada:

LEMBAGA PENELITIAN

UNIVERSITAS TRISAKTIPengusul:

Livia 04010119/ 081806962224/livia-junaidi@live.comPhoebe Claudia 04010154/ 0811850282/phoebeclaudia@gmail.comSeptyana Happysari 04010181/ 08115207192/happy_sari88@yahoo.com

JAKARTA, 1 November 2012

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang MasalahKanker rongga mulut merupakan kanker terburuk dalam tingkat usaha bertahan hidupnya lima tahun pada sekitar 54 persen dan dapat terjadi pada manusia dari semua kelompok usia dan ras. Jumlah kematian akibat kanker rongga mulut secara kasar mencapai 9000 jiwa setiap tahunnya, yaitu sekitar 3 persen dari semua jenis kanker yang dapat menyebabkan kematian.

Pengobatan medis kanker rongga mulut yang paling umum dilakukan saat ini untuk menghancurkan sel kanker adalah dengan radioterapi, kemoterapi dan pembedahan. Akan tetapi cara-cara tersebut berbiaya mahal dan juga dapat menimbulkan efek samping bagi tubuh.Anggur (Vitis vinifera) merupakan tanaman buah berupa perdu merambat yang termasuk ke dalam keluarga Vitaceae. Menurut sejarahnya, tanaman anggur diduga sudah ada sejak jaman Meocene dan Tertiary. Namun tanaman Anggur yang pertama kali dilihat manusia merupakan tanaman anggur yang tumbuh liar disekitar Pegunungan Kaukasus bagian Tenggara (Setiadi, 2007).

Indonesia mengenal anggur sekitar abad ke-19. Dalam perjalanannya, perluasan penanaman anggur mulai menggembirakan sejak memasuki dekada 1980-an. Selain Jawa Timur sebagai sentral utamanya, daerah lain yang banyak ditanami anggur yaitu Bali, Sulawesi dan sekarang anggur boleh dikatakan sudah menyebar ke berbagai penjuru Nusantara ini sehingga anggur memiliki nilai ekonomis rendah.

Anggur umumnya dapat di konsumsi langsung, namun kebanyakan masyarakat mengkonsumsi buah anggur dengan membuang bijinya, tanpa mengetahui bahwa biji anggur memiliki banyak manfaat. Biji anggur mengandung mineral, seng, dan Pycogenol yang bermanfaat bagi tubuh.

OPC (ekstrak biji anggur/ Pycogenol) merupakan nama ilmiah antioksidan kompleks yang berasal dari berbagai jenis tumbuhan terutama biji anggur dan batang pinus. OPC berarti oligomeric proanthocyanidin sebuah senyawa antioksidan yang sangat potensial. Banyak ahli percaya bahwa OPC dipercaya dapat membantu mencegah oksidasi lemak dalam darah dan kolesterol, yang banyak disalahkan sebagai penyebab penyakit jantung arteri (Nicholas Perricone, 2002).

Dengan dasar teori tersebut, kami ingin melakukan penelitian apakah ekstrak biji anggur dengan nilai ekonomis rendah dan mengandung antioksidan berupa OPC ini dapat berpengaruh sebagai zat antikanker. Pada penelitian kali ini, akan diuji manfaat dari ekstrak biji anggur yang mengandung antioksidan berupa OPC terhadap pengaruhnya sebagai zat antikanker.1.2 Perumusan Masalah

Apakah manfaat dari ekstrak biji anggur terhadap pertumbuhan sel kanker rongga mulut ?1.3 Tujuan

Untuk membuktikan kegunaan dari ekstrak biji anggur dalam menghambat pertumbuhan sel kanker rongga mulut.Untuk mengetahui konsentrasi ideal ekstrak biji anggur dalam menghambat pertumbuhan kanker rongga mulut.Pemanfaatan biji anggur sebagai obat herbal.1.4 Kontribusi Hasil Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan pengetahuan masyarakat luas di bidang kesehatan tentang manfaat biji anggur, khususnya dalam menghambat pertumbuhan kanker rongga mulut.BAB II

TINJAUAN PUSTAKA2.1Grape Seed (Biji Anggur)Dalam sistematika (taksonomi) tumbuh-tumbuhan, anggur (Vitis vinifera) diklasifikasikan sebagai berikut

Kingdom: PlantaeDivision: MagnoliophytaClass: MagnoliopsidaOrder: VitalesFamily: VitaceaeGenus: VitisSpecies: Vitis vinifera

Anggur dipercaya dapat menyembuhkan berbagai penyakit karena memiliki antioksidan yang sangat kuat. Antioksidan adalah zat yang menghancurkan radikal bebas - senyawa berbahaya dalam tubuh yang merusak DNA (bahan genetik) dan bahkan menyebabkan kematian sel. Radikal bebas diyakini berkontribusi terhadap penuaan, serta pengembangan sejumlah masalah kesehatan, termasuk penyakit jantung dan kanker. Hampir seluruh bagian dari anggur dapat digunakan untuk proses penyembuhan. Getah anggur dapat dibuat salep untuk mengobati kulit dan penyakit mata. Daun anggur digunakan untuk obat diare, sariawan, radang gusi dan sakit tenggorokan. Buah anggur mentah digunakan untuk mengobati sakit tenggorokan, dan anggur kering (kismis) digunakan untuk sembelit. Anggur manis digunakan untuk mengobati berbagai masalah kesehatan termasuk kanker, kolera, cacar, mual, infeksi mata, dan kulit, ginjal, dan penyakit hati (Rahmat Rukmana, tt).Beberapa penelitian laboratorium dalam kultur sel menunjukkan bahwa proanthocyanidins, bahan kimia yang ditemukan dalam ekstrak biji anggur, memiliki sifat antioksidan (Rajesh Agarwal, 2012). Antioksidan, seperti yang ditemukan dalam ekstrak biji anggur, diperkirakan dapat mengurangi risiko terkena kanker. Kelebihan dari ekstrak biji anggur ini hanya membunuh sel-sel kanker saja tanpa mengganggu sel yang sehat proanthocyanidins, bahan kimia yang ditemukan dalam ekstrak biji anggur, memiliki sifat antioksidan (Rajesh Agarwal, 2012). Ekstrak biji anggur juga dapat membantu mencegah kerusakan sel hati manusia yang disebabkan oleh obat kemoterapi.Kandungan Menurut USDA nutrient database tahun 2003, setiap 100 gram (3,5 oz) anggur hijau atau anggur ungu mengandung karbohidrat (18,1 gram), gula (15,48 gram), serat makanan (0,9 gram), lemak (0,16 gram), protein (0,72 gram); vitamin B1 (0,069 mg), B2 (0,07 mg), B3 (0,188 mg), B5 (0,05 mg), B6 (0,086 mg), B9 (2 g), C (10,8 mg), E (0,19 mg), K (22 g); fosfor (20 mg), kalium (191 mg), kalsium (10 mg), magnesium (7 mg), mangan (0,071 mg), natrium (3,02 mg), seng (0,07 mg), zat besi (0,36 mg), turunan stilbene, trans-Resveratrol (trans-3,5,40-trihydroxystilbene). Biji anggur mengandung flavonoid (4-5%), termasuk kaempferol-3-O-glucosides, quercetin-3-Oglucosides, quercetin, dan myricetin. Flavonoid merupakan senyawa fitokimia pemberi warna ungu pada anggur. Anggur juga kaya polifenol. Sekitar 6070% polifenol anggur ditemukan di bijinya (dr. Dito Anurogo, 2012).Secara umum, dosis optimum ekstrak biji anggur yang direkomendasikan adalah 150-200 mg/hari, 2-3x minum, atau sesuai saran dokter/ahli herbal. Ekstrak biji anggur memiliki aktivitas antioksidan dan penangkal radikal bebas. Procyanidin menghambat aktivitas xanthine oxidase; enzim pemicu oxy-radical cascade. Selain itu, procyanidin B4, catechin, dan asam galat dilaporkan sebagai agen pencegah kerusakan DNA oksidatif di tingkat seluler. Flavonoid pada anggur berfungsi sebagai antioksidan ampuh yang bekerja sebagai pencegah kanker, dapat menghambat oksidasi LDL pada dinding pembuluh koroner, memiliki efek antimikroba, memperbaiki fungsi endotel, menghambat aterosklerosis (timbunan lemak di pembuluh darah). Quercetin merupakan fitokimia yang termasuk flavonoid, memiliki aktivitas antioksidan, menghambat protein kinase dan DNA topoisomerases, mengatur ekspresi gen, juga memodulasi ekspresi gen yang berhubungan dengan oxidative stress dan di sistem pertahanan antioksidan (N.endodu. 2006).Buah anggur dikenal sebagai resveratrol, berfungsi menghambat enzim yang merangsang pertumbuhan sel kanker dan menekan sistem kekebalan tubuh. Resveratrol juga memiliki efek antiproliferasi sehingga dapat mencegah limfoma histiositik dan kanker kolon (usus besar), mengubah ekspresi gen pada aksis androgen dan pengaturan siklus sel sehingga efektif mencegah kanker prostat (dr. Dito Anurogo, 2011).2.2Kanker Rongga MulutKanker adalah salah satu penyakit penyebab terbesar kematian di dunia setelah infeksi dan penyakit jantung (Johnson, 2003). Kanker rongga mulut merupakan bagian dari kanker kepala dan leher. Kanker rongga mulut dapat berkembang dalam setiap bagian dari rongga mulut atau orofaring. Sebagian besar kanker rongga mulut dimulai di lidah dan di dasar mulut. Insidensi kanker rongga mulut adalah 6 dari seluruh kanker di dunia (Parkin, 2005). Hampir semua kanker rongga mulut dimulai di sel skuamosa yang menutupi permukaan mulut, lidah, dan bibir. Kanker-kanker ini disebut karsinoma sel skuamosa. Sebagian besar menyerang usia diatas 40 tahun. Penyebab dari kanker rongga mulut adalah komplek dan multifaktorial, dimana faktor penyebab akan berinteraksi dengan faktor yang lain dalam waktu yang lama untuk menghasilkan kelainan yang dapat dilihat secara klinis. Penyebab utama kanker rongga mulut adalah penggunaan tembakau dan alkohol, sedangkan genetik, pola makan, virus dan lain- lain hanyalah faktor kontribusi dalam perkembangan kanker mulut. Bila kanker rongga mulut menyebar (bermetastasis), biasanya perjalanan melalui sistem limfatik. (Fitry Fatima, 2008)Banyak peneliti yang juga mengatakan bahwa kekurangan makan buah-buahan serta sayuran dapat meningkatkan kemungkinan terkena kanker rongga mulut.

Tanda awal Kanker rongga mulut :1. Adanya luka atau sakit pada wajah, leher, serta ulkus atau sariawan dalam mulut yg tidak hilang dalam waktu 2 minggu.

2. Pembengkakan, perbesaran maupun benjolan pada gusi, bibir dan bagian lain di dalam mulut.

3. Bercak putih, merah atau gelap di dalam mulut.

4. Perdarahan yang berulang dari gusi atau luka dalam mulut.

5. Rasa kebal di sekitar wajah dan mulut dan leher.

6. Gigi-gigi yang goyang tanpa penyebab yang jelas.

Dengan melihat struktur histologis, maka karsinoma nasofaring dibagi menjadi beberapa jenis sesuai dengan pembagian WHO, yaitu :

WHO 1 : karsinoma sel sel skuamosa, berkeratin di dalam maupun di luar sel. Sel-sel kanker berdiferensiasi baik sampai sedang.

WHO 2 : termasuk adalah karsinoma non keratinsel- sel kanker berdiferensiasi baik sampai sedang.

WHO 3: karsinoma berdeferensiasi buruk, dengan gambaran sel kanker paling heterogen. Karsinoma anaplastik, clear cell carsinoma dan variasi sel spindel.Secara umum KNF WHO-3 memiliki prognosis paling baik dimana angka harapan hidup 5 tahun adalah 60-80%. Sebaliknya KNF WHO-1 memiliki prognosis paling buruk yaitu angka harapan hidup 5 tahun sebesar 20-40%.2.3 Fluoruoracil

Kemoterapi adalah segolongan obat-obatan yang dapat menghambat pertumbuhan kanker atau bahkan membunuh sel kanker. Obat-obat anti kaker ini dapat digunakan sebagai terapi tunggal (active single agents), tetapi kebanyakan berupa kombinasi karena dapat lebih meningkatkan potensi sitotoksik terhadap sel kanker. Selain itu sel-sel yang resisten terhadap salah satu obat mungkin sensitif terhadap obat lainnya. Dosis obat sitostatika dapat dikurangi sehingga efek samping menurun.

Beberapa sitostatika yang mendapat rekomendasi dari FDA (Amerika) untuk digunakan sebagai terapi keganasan didaerah kepala dan leher yaitu Cisplatin, Carboplatin, Methotrexate, 5-fluorouracil, Bleomycin, Hydroxyurea, Doxorubicin, Cyclophosphamide, Doxetaxel, Mitomycin-C, Vincristine dan Paclitaxel. Akhir-akhir ini dilaporkan penggunaan Gemcitabine untuk keganasan didaerah kepala dan leher. (Susworo, 2004)Adanya perbedaan kecepatan pertumbuhan (growth) dan pembelahan (division) antara sel kanker dan sel normal yang disebut siklus sel (cell cycle) merupakan titik tolak dari cara kerja sitostatika. Hampir semua sitostatika mempengaruhi proses yang berhubungan dengan sel aktif seperti mitosis dan duplikasi DNA. Sel yang sedang dalam keadaan membelah pada umumnya lebih sensitif daripada sel dalam keadaan istirahat. (Dr. Heru Noviat, 2008)Berdasar siklus sel kemoterapi ada yang bekerja pada semua siklus ( Cell Cycle non Spesific ) artinya bisa pada sel yang dalam siklus pertumbuhan sel bahkan dalam keadaan istirahat. Ada juga kemoterapi yang hanya bisa bekerja pada siklus pertumbuhan tertentu ( Cell Cycle phase spesific ). (Dr. Heru Noviat, 2008)Obat yang dapat menghambat replikasi sel pada fase tertentu pada siklus sel disebut cell cycle specific. Sedangkan obat yang dapat menghambat pembelahan sel pada semua fase termasuk fase G0 disebut cell cycle nonspecific. Obat-obat yang tergolong cell cycle specific antara lain Metotrexate dan 5-FU, obat-obat ini merupakan anti metabolit yang bekerja dengan cara menghambat sintesa DNA pada fase S. (Giovannetti, 2007). Obat antikanker yang tergolong cell cycle nonspecific antara lain Cisplatin (obat ini memiliki mekanisme cross-linking terhadap DNA sehingga mencegah replikasi, bekerja pada fase G1 dan G2), Doxorubicin (fase S1, G2, M), Bleomycin (fase G2, M), Vincristine (fase S, M). (Giovannetti, 2007)5-Fluorouracil (5-FU) merupakan agen kemoterapi utama yang digunakan untuk terapi berbagai macam kanker, termasuk kanker mulut. 5-FU adalah antimetabolit yang bekerja secara antagonis dengan timin terhadap aktivitas enzim timidilat sintetase (TS). 5-FU merupakan prodrug, metabolisme 5-FU menghasilkan fluoridin-5-trifosfat (FUTP) yang bergabung ke dalam RNA dan mempengaruhi fungsinya, dan fluorodeoksiuridilat (FdUMP) yang menghambat replikasi DNA (Giovannetti, 2007).Gambar . Struktur 5-Fluorouracil (kiri) dan timin (kanan) proanthocyanidins, bahan kimia yang ditemukan dalam ekstrak biji anggur, memiliki sifat antioksidan (Longley, 2007)Efek samping dari 5-FU yang ditemukan pada pasien antara lain neutropenia, stomatitis, diare, danhand-food syndrome. Masing-masing efek ini terkait dengan metode pemberian yang diterapkan pada pasien (Meyerhardt and Mayer, 2005). Pada kasus yang efek samping 5-FU yang paling parah adalah kardiotoksisitas meskipun hal ini jarang ditemui (Thomas et al., 2004). Dibandingkan dengan agen kemoterapi yang lain, 5-FU memiliki selektivitas yang tinggi pada aktivitas TS dan efek samping yang ditimbulkan relatif lebih ringan. Meskipun demikian, efektivitas 5-FU sebagai agen kemoterapi baru mencapai 15% sehingga diperlukan pengembangan agen kokemoterapi untuk meningkatkan efektivitas terapi dengan 5-FU (Meyerhardt and Mayer, 2005).BAB IIIHIPOTESISEkstrak biji anggur dapat memperlambat pertumbuhan sel kanker rongga mulut.BAB IV

METODE PENELITIAN4.1 Metode yang Digunakan

Metode penelitian : Eksperimental laboratorik Populasi penelitian: Sel kanker Sampel penelitian: Sel kanker dengan perlakuan yang berbeda-beda4.2 Variabel Penelitian

Variabel bebas

: Jenis bahan/obat (ekstrak biji anggur dan Fluoruoracil) Variabel terikat: Hambatan pertumbuhan sel kanker4.3 Definisi Operasional Variabel Ekstrak etanol biji anggur adalah ekstrak yang diperoleh dari biji anggur yang dikeringkan, dihaluskan, dan diencerkan dengan etanol. Ekstrak yang didapat berupa gel dalam berbagai konsentrasi. Evaluasi hambatan pertumbuhan sel kanker terhadap pemberian ekstrak biji anggur dilakukan melalui metode uji sitotoksitas ekstrak biji anggur terhadap sel kanker dengan pembanding kelompok yang tidak diberikan ekstrak daun teh hijau (kelompok kontrol negatif) dan kelompok yang diberikan fluorouracil (kelompok kontrol positif). DMEM adalah media yang digunakan untuk menumbuhkan sel kanker.4.4 Alat dan bahan

Alat :

Plat agar darah Blender Bahan :

Sel kanker Ekstrak biji anggur Etanol Fluoruoracil4.5 Cara Kerja4.5.1 Cara pembuatan ekstrak biji anggur

- Biji anggur dihaluskan menggunakan blender kemudian dicampur dengan pelarut etanol.- Disaring untuk mendapatkan ekstrak etanol biji anggur.- Hasilnya diuapkan menggunakan Rotary evaporator dengan suhu 40oC sehingga didapatkan hasil yang berupa gel.4.5.2 Uji sitotoksisitas- Sel ditanam pada 96-well plate yang sudah ditandai sebagai kelompok kontrol dan persentase yang berbeda-beda- Well dimasukan ke dalam inkubator 37oC dan 5% CO2 selama 24 jam- Ekstrak ditimbang dan diencerkan dengan teknik serial dilution- Setiap sel diberikan perlakuan yang berbeda-beda- Well dimasukan ke dalam inkubator 37oC dan 5% CO2 selama 48 jam- 10 l MTT Assay diberikan ke setiap sel- Well dimasukan ke dalam inkubator 37oC dan 5% CO2 selama 4 jam- 100 l cairan diambil- 100 l asam isopropanol ditambahkan- Inkubasi selama 2 jam pada orbital shaker- Hasil didapatkan dengan menggunakan ELISA plate reader.DAFTAR PUSTAKA

Chan TC, Teo PM. Nasopharyngeal Carcinoma : Review; Annals of Oncology 13. 2002: 1007-1015Ekstrak biji anggur membunuh sel kanker pada kepala dan leher. http://www.sciencedaily.com/releases/2012/01/120127140939.htmGiovannetti, E., Backus, H.H.J., Wouters, D., Ferreira, C.G., van Houten, V.M.M., Brakenhoff, R.H., Poupon, M-F., Azzarello, A., Pinedo, H.M. and Peters, G.J., 2007, Changes in the Status of p53 Affect Drug Sensitivity to Thymidylate Synthase (TS) Inhibitors by Altering TS Levels, British J. Can., 96:769-775.Kentjono, WA. Kemoterapi pada Tumor Ganas THT-Kepala Leher Pendidikan Kedokteran Berkelanjutan III Ilmu Penyakit Telinga Hidung Tenggorok-Kepala Leher, SMF Ilmu Penyakit THT FK Unair/ RSUD dr. Soetomo, Surabaya: Grasindo, 2002. 108- 21Lim, Y.J.L., Rhee, J.C., Bae, Y.M. and Chun, W.J., 2007, Celecoxib Attenuates 5-Fluorouracil-Induced Apoptosis in HCT-15 and HT-29 Human Colon Cancer Cells, World J. Gastroenterol., New York: Putnam, 1992.

Lin HS, Fee WE. Malignant Nasopharygeal Tumors. http://www.emedicine.com. 2003

Liu, H.C., Chen, G.G., Vlantis, A.C., Leung, B.C.S., Tong, M.C.E. and van Hasselt, C.A. 5-Fluorouracil Mediates Apoptosis and G1/S Arrest in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma via a p53-Independent Pathway, The Cancer J., 12(6):482-493.Longley, D.B. and Johnston, P.G., 2007, 5-Fluorouracil Molecular Mechanisms of Cell Death in Srivastava R., Apoptosis, Cell Signaling, and Human Diseases, Humana PressPerricone, Nicholas. The Perricone Prescription. New York: HaperCollins Publisers, 2002.

Quinn FB, Ryan,WM. Chemotherapy for Head and Neck Cancer; Grand Rounds Presentation, UTMB, Dept. of Otolaryngology; April 16, 2003.S. Shrotriya, G. Deep, M. Gu, M. Kaur, A. K. Jain, S. Inturi, R. Agarwal, C. Agarwal. Generation of reactive oxygen species by grape seed extract causes irreparable DNA damage leading to G2/M arrest and apoptosis selectively in head and neck squamous cell carcinoma cells. Carcinogenesis, 2012; DOI: 10.1093/carcin/bgs019Susworo. Dalam : Kanker Nasofaring Epidemologi dan Pengobatan Mutakhir. Cermin

Dunia Kedokteran. 2004 : 16-20Waffo-Teguo P, Hawthorne ME, Cuendet M, et al. Potential cancer- chemopreventive activities of wine stilbenoids and flavans extracted from grape ( Vitis vinifera) cell cultures. Nutr Cancer. New York: Rizzoli, 2001: 173- 179.14