Die Rolle der Apoptose in in vitro Modellen neuronaler ... · Der Begriff Apoptose (griechisch:apo von weg, von ab, ptosis: u.a. herabfallen oder sinken; frei übersetzt Herabfallen

Die Rolle der Apoptose in in vitro Modellen neuronaler Degeneration

Dissertation zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr Universität Bochum

angefertigt am Lehrstuhl für Zellphysiologie (Leiter: Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt)

vorgelegt von Jürgen Doppke

Bochum 2001

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1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt

2. Gutachter: Prof. Dr. Hermann Lübbert

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Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Durchführung dieser Arbeit unterstützt haben. Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt für die Übernahme der Betreuung dieser Arbeit, für sein Interesse an deren Fortgang und für die vielen hilfreichen Kommentare. Herrn Dr. Adrian Carter danke ich für die großzügige Aufnahme in seinem Labor, sowie für gute Ideen, anregende Diskussionen und für die kritische Dursicht des Manuskripts. Weiterhin danke ich Prof. Dr. Hermann Lübbert für die Übernahme des Zweitgutachtens Bei den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe möchte ich mich für das ausgesprochen freundschaftliche und kollegiale Arbeitsklima bedanken. Besonderer Dank geht an Rosi Ewen, Sandra Reichert, Ruth Jostock, Steffanie Otto, Christina Bartmann-Lindholm, Hermann Dechent und allen anderen, die ich hier aus Platzgründen nicht aufführen kann. Ein ganz spezieller Dank geht an Tine. Und nicht zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, ohne die mein Studium so nicht möglich gewesen wäre.

INHALTSVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................. 1

EINLEITUNG............................................................................................................................ 5

Apoptose................................................................................................................................. 5 Geschichte .......................................................................................................................... 5 Grundsätzliches .................................................................................................................. 5 Apoptose in der Entwicklung............................................................................................. 7 Apoptose bei Zellschäden .................................................................................................. 8 Apoptose im Immunsystem des Körpers ........................................................................... 9

Induktionsphase...................................................................................................................... 9 Rezeptorinduzierte Apoptose ............................................................................................. 9 Entzug von trophischen Faktoren..................................................................................... 12 Proapoptotische Faktoren aus Mitochondrien.................................................................. 14 P53, Apoptose und Krebsinduktion ................................................................................. 15

Degradationsphase ............................................................................................................... 18 Caspasen........................................................................................................................... 18 Biochemie der Bcl-2 Proteine .......................................................................................... 20 Zelluläre Inhibitoren der Apoptose .................................................................................. 23 Abbau der DNA und des Nucleus .................................................................................... 24 Aufnahme der Zellreste und apoptotischer Körperchen .................................................. 25

Apoptose bei neurodegenerativen Erkrankungen ................................................................ 26 Amyotrophe Lateralsklerose ............................................................................................ 26 Huntington´s Disease ....................................................................................................... 27 Alzheimer´s Disease......................................................................................................... 28 Parkinson´s Disease.......................................................................................................... 29 Schlaganfall ...................................................................................................................... 30 Krebs ................................................................................................................................ 31

Nachweismethoden für Apoptose ........................................................................................ 32 Nachweis der DNA-Fragmentation.................................................................................. 32 Nachweis von Caspase-Aktivität ..................................................................................... 33 Nachweis der Exposition von Phosphatidylserin ............................................................. 34 Sonstige Färbemethoden .................................................................................................. 34 Morphologische Hinweise................................................................................................ 34

Apoptose induzierende und hemmende Substanzen ............................................................ 35 Staurosporin ..................................................................................................................... 35 Malonat / Methylmalonat ................................................................................................. 36 Deprenyl ........................................................................................................................... 36 Dipyridamol ..................................................................................................................... 37 Pramipexol ....................................................................................................................... 37 FK506............................................................................................................................... 37 ZVAD-fmk ....................................................................................................................... 39

Zielsetzung ........................................................................................................................... 40 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................ 41

Material ................................................................................................................................ 41 Chemikalien ..................................................................................................................... 41 Zellkultur.......................................................................................................................... 41 Verbrauchsmaterial .......................................................................................................... 42 Kits ................................................................................................................................... 42 Geräte ............................................................................................................................... 43 Software ........................................................................................................................... 43

Methoden.............................................................................................................................. 44

INHALTSVERZEICHNIS

Zellkultur.......................................................................................................................... 44 Astrozytenkonditioniertes Medium.................................................................................. 44 Beschichtung der Wachstumsfläche für Kortexneuronen und Striatumneuronen ........... 45 Präparation und Kultivierung von Kortex- und Striatumneuronen.................................. 45 Kultivierung und Differenzierung von PC12-Zellen ...................................................... 47 Neurodegenerationsmodelle............................................................................................. 47 MTT-Test ......................................................................................................................... 48 Laktat-Dehydrogenase-Test ............................................................................................. 48 DNA-Fragmentation (ELISA).......................................................................................... 49 Caspase-3 Test.................................................................................................................. 49 Proteinbestimmung........................................................................................................... 50 Annexin-Phosphatidylserin Färbung................................................................................ 50 Statistische Berechnungen................................................................................................ 51

ERGEBNISSE.......................................................................................................................... 52

Staurosporin-Modell............................................................................................................. 52 Glutamat-Modell .................................................................................................................. 57 Entzug von trophischen Faktoren......................................................................................... 59 H2O2/Radikalstreß-Modell ................................................................................................... 59 AraC-Modell ........................................................................................................................ 60 Ischaemie-Modell................................................................................................................. 61 Methylmalonat/ Malonat- Modell ........................................................................................ 61 Kortexneuronen im Methylmalonat-Modell ........................................................................ 62 Striatumneuronen im Methylmalonat-Modell...................................................................... 64 Kortex-Neuronen im Malonat-Modell ................................................................................. 65 Striatum-Neurone im Malonat-Modell................................................................................. 67 Einfluß des pH-Wertes im Methylmalonat-Modell ............................................................. 69

ZVAD-fmk im Staurosporin-Modell ............................................................................... 70 ZVAD-fmk im Methylmalonat-Modell ........................................................................... 72 ZVAD-fmk im Malonat-Modell....................................................................................... 73

Weitere Inhibitoren im Methylmalonat / Malonat-Modell oder im Staurosporin-Modell... 75 Caspase-3 Inhibitor im Staurosporin-Modell ................................................................... 75 Pramipexol im Staurosporin-Modell ................................................................................ 76 Deprenyl im Staurosporin-Modell ................................................................................... 77 Dipyridamol im Staurosporin-Modell .............................................................................. 78 FK506 im Staurosporin-Modell ....................................................................................... 79 FK506 im Malonat-Modell mit Kortexneuronen ............................................................. 80 FK506 im Malonat-Modell mit Striatumneuronen .......................................................... 81 FK506 im Methylmalonat-Modell mit Kortexneuronen.................................................. 82 FK506 im Methylmalonat-Modell mit Striatumneuronen ............................................... 83

DISKUSSION .......................................................................................................................... 85

Nachweismethoden für Apoptose / Zelltod.......................................................................... 86 Apoptose- / Neurodegenerationsmodelle ............................................................................. 88

Staurosporin als Apoptose-Induktor................................................................................. 88 Glutamat als Apoptosemodell .......................................................................................... 90 Entzug trophischer Faktoren als Apoptosemodell ........................................................... 91 Wasserstoffperoxid als Apoptosemodell.......................................................................... 92 AraC als Apoptosemodell ................................................................................................ 94 Entzug von Sauerstoff und Glukose als Apoptosemodell ................................................ 95 Methylmalonat / Malonat ................................................................................................. 96 Einfluss des pH-Wertes auf die Fragmentation.............................................................. 100

INHALTSVERZEICHNIS

Substanzen in Apoptosemodellen ...................................................................................... 101 ZVAD-fmk im Staurosporin-Modell ............................................................................. 101 ZVAD-fmk im Malonat-Modell..................................................................................... 102 Caspase-3 Inhibitor ........................................................................................................ 103 Pramipexol ..................................................................................................................... 103 Deprenyl ......................................................................................................................... 104 Dipyridamol ................................................................................................................... 105 Immunophilin-Ligand FK506 ........................................................................................ 106

ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................................... 110

LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................... 113

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

µg Mikrogramm µl Mikroliter µmol Mikromol 3-NP 3-Nitropropionic acid 6-OHDA 6-Hydroxydopamin

A ABTS 2,2´-Azino-bis(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid)

AIDS Aquired immune deficiency syndrome AIF Apoptosis inducing factor ALS Amyotrophe Lateralsklerose AMP Adenosin Monophosphat Apaf apoptotic protease activating factor Apo2L (auch TRAIL) Apoptosis Ligand 2 Apo3L (auch TWEAK) Apoptosis Ligand 3 APP Amyloid precursor protein ARC apoptosis repressor with Caspase-

recruitment domain AS Aminosäure ATM Ataxia talangiectasia Mutation ATP Adenosin Trisphosphat Aβ β-amyloid Protein

B B27 Brewers Medium Supplement 27 bcl-2 Gen bzw. Protein aus B-cell lymphoma BDNF Brain derived neurotrophic factor bFGF Basic fibroblast growth factor BH4-Domäne Bcl-2 homology domain 4 BSA Bovines Serum Albumin; Rinder Serum

Albumin bzw. beziehungsweise

C ca. circa C. elegans Caenorhabditis elegans Ca2+ Kalzium-Ionen CaCl2 Kalziumchlorid CAD (auch DFF40) Caspase activated DNAse CaM-Kinase II Calmodulin-Kinase II CARD Caspase recruitment domain Casp- Caspase- Caspase Cystein aspartatic acid protease CD 95 (auch Apo-1, Fas). Cell death receptor 95 Cdk Cyclin dependent kinase cdk-Kinase Cyclin dependent kinase kinase ced C. elegans death CED-4 C. elegans death Protein 4 c-Flip cellular FLICE inhibitory protein cGMP Cyclic Guanosin Monophosphat CHAPS 3-([3-

Cholamidopropyl]dimethylammonio)-1-

1


propane sulfonate cIAP cellular Inhibitor of Apoptosis protein cm Zentimeter CO2 Kohlendioxid CoA Coenzym A CREB cAMP-response element-binding-protein CsA Cyclosporin A CSS Canale-Smith Syndrom

D d Tag(e) d.h. das heißt DABCO DcR1 (auch TRID oder TRAIL-R3 oder

LIT) Decoy-receptor 1

DcR2 Decoy- receptor 2 DD death domain, Todesdomäne DED death effector domain DEVD-CHO Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (Casp-3

Peptid-Inhibitor) DIABLO (auch Smac) direct IAP-binding protein with low pI DISC Death inducing signalling complex DMEM Dulbecco´s minimal essential medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic acid DNA-PK DNA-abhängige Protein-Kinase DPBS Dulbecco´s phosphate buffered saline dUTP dUridintriphosphat

E EC50-Wert Exciting concentration 50% EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme linked Immunosorbent assay Erk extracellular signal regulated protein

kinase F FACS Fluorescence assisted cell sorting FADD (Mort1) Fas-associated death domain protein FADD-DN FADD dominant-negative Mutante FAK focal adhesion kinase FAP48 FKBP-associated protein 48 FCS fetal calf serum; fötales Kälberserum FeSO4 Eisensulfat FITC Fluorescein-isothiocyanat FKBP FK506 binding Protein FKBP12 FK506 binding Protein 12 Flip FLICE inhibitory protein

G G Glutamin GABA Gamma aminobutyric acid GAP43 growth associated protein 43 GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor GM-CSF granulocyte-makrophage colony

stimulating factor H h Stunden H2O2 Wasserstoffperoxid HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N´-(2-

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ethanesulfonic acid) HPV Human papilloma virus HSP-70 heat schock protein 70 I IAP inhibitors of apoptosis proteins IC50-Wert Inhibitory concentration 50% ICAD (auch DFF45) Inhibitor of Caspase activated DNAse ICAM-3 intercellular adhesion molecule-3 IGF insulin like growth-factor IGF-BP IGF-binding protein IGF-I-receptor insulin like growth-factor-I-receptor IKK inhibitor of κB Kinase IL Interleukin IP3 Inositol(1,4,5) Trisphosphat ISEL In situ end labeling ISNT in situ nick translation I-κB inhibitor of κB J JNK c-Jun NH2-terminale Kinase JNKK JNK Kinase

K K Kontrolle kD kilo Dalton

L L Liter LDH Laktatdehydrogenase

M MAO Monoaminoxidase MAO-B Monoamin Oxidase -B MAP Mitogen aktiviertes Protein MCAO Middel cerebral artery occlusion MCM Methylmalonyl-CoA Mutase MEK Map Kinase/Erk Kinase MEKK1 MAP Erk Kinase-Kinase-1 Met Methionin MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute(n) ml Mililiter MPP+ MPTP-Ion MPT mitochondrial permeability Transition MPTP 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-

tetrahydropyridin MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide mut mutiert MW Mittelwert

N n number (Anzahl der Versuche) Nr. Nummer NaCl Natriumchlorid NAD+ Nicotinamidadenindinucleotid (oxidiert) NADH Nicotinamidadenindinucleotid (reduziert) NaOH Natriumhydroxid NB Neurobasal Medium NF-AT nuclear factor AT NFT neurofibrilläre tangles NF-κB Nuclear factor kappa B

3


NGF Nerve growth factor NIK NFκB-inducing Kinase nm Nanometer NMDA N-methyl-D-aspartat nNOS neuronal nitric oxide synthase

O O2 Sauerstoff P PAK2 p21-activated Kinase PARP Poly-ADP-Ribose Polymerase PBS Phosphate buffered saline PC12-Zellen Phaeocromocytoma 12 Zellen PDE 5 cGMP phosphodiesterase PDK 3´-phosphoinositid-abhängige Kina PDL Poly-D-Lysin PI 3-K Phosphoinositid-3-Kinase PKA Protein Kinase A PKC Protein Kinase C PLADS pre-ligand binding assembly domains pNA para Nitroanillin PPIase Peptidyl-Prolyl-Isomerase (Rotamase) PTP permeability transition pore

R Rb retinoblastoma protein RIP receptor interacting protein ROS Reactive oxygen species Rsk pp90 ribosomal S6 kinase RT Raumtemperatur

S SE Standard error of the mean Smac (auch DIABLO) second mitochondria derived activator of

Caspases SOD-1 Superoxide dismutase 1 Stauro Staurosporin SV40 Simian virus 40

T TdT terminale Desoxynukleotidyl-Transferase TGF-β1 transforming growth factor β1 TNF Tumor-Nekrose-Faktor TNF-alpha Tumor-Nekrose-Faktor-alpha TNF-R1 (auch p55 oder CD120a) Tumor necrosis factor receptor 1 TRADD TNFR associated death domain TRAF2 TNFR associated factor-2 TrKA, TrKB oder TrKC Tropomyosin receptor-kinase A, B, C TrKA-R Tropomyosin receptor-kinase A receptor TUNEL TdT mediated dUTP Nick-End Labelling

U U/ml Units/ml UV ultraviolett

V VDAC voltage-dependent anion channel, V-FLIP´s (auch Casper, I-FLICE, FLAME,

CASH) viral FLICE inhibiting proteins

W willk. willkürlich Z z.B. Zum Beispiel ZNS Zentrales Nervensystem ZVAD-fmk benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (O-

methyl) fluoromethylketone

4

EI

EINLEITUNG

NLEITUNG 5

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Apoptose

Geschichte Lange bevor Apoptose ihre heutige Bedeutung in der biologischen Forschung erhalten hat,

wurde sie von verschiedenen Wissenschaftlern beschrieben und mit verschiedenen Begriffen

belegt. Der Begriff Apoptose (griechisch:apo von weg, von ab, ptosis: u.a. herabfallen oder

sinken; frei übersetzt Herabfallen der Blätter im Herbst) wurde dann von A.R. Currie und

seinen Kollegen J.F. Kerr und A.H. Wyllie 1972 geprägt (Kerr, J. F. et al., 1972). Zuvor war

der „spontane Zelltod“ schon von Walther Flemming 1885 als „Chromatolyse“ beschrieben

worden. Die typischen DNA-Leitern, die durch gezielten Abbau der DNA bei Apoptose

entstehen, wurden von Wyllie et al. in den 80er Jahren in Glucokortikoid-behandelten T-

Zellen entdeckt (Wyllie, A. H., 1980). Dann entdeckten Horvitz et al. nicht nur, daß bei der

Nematode Caenorhabditis elegans während der Entwicklung genau 131 der ursprünglichen

1090 Zellen durch Apoptose zugrunde gehen, sondern auch die regulierenden Gene und

Genprodukte, die sie ced-Gene nannten (C. elegans death) (Horvitz, H. R. und Sulston, J. E.,

1980). Ab 1990 wurden dann auch die ersten Familienmitglieder der pro- und

antiapoptotischen Bcl-2 Proteine entdeckt (von B-cell lymphoma). Die Forschung auf dem

Gebiet der Apoptose ist ab 1995 immer mehr intensiviert worden.

Grundsätzliches Beim Übergang des Lebens vom einzelligen Organismus zum Mehrzeller mußten

Mechanismen gefunden werden, um die Zellzahl und darüber auch die Form und die

Proportionen der einzelnen Organe zu steuern. Dabei kristallisierte sich heraus, daß die

Produktion einer Überzahl von Zellen und der anschließende geordnete Abbau dieser Zellen

einer der praktikablen Wege ist. Dieser Prozeß erwies sich auch beim ausgewachsenen

Organismus als geeignet, um die Homeostase zwischen Zellproliferation und Zellabbau zu

gewährleisten, sowie falsch lokalisierte aber auch infizierte oder geschädigte Zellen aus dem

Zellverband zu eliminieren. Ein Spezialfall ist das Immunsystem, in dem zum einen eine

Vielzahl von Antigenen abgefangen werden muß und zum anderen vermieden werden muß,

daß eigene Proteine angegriffen werden. Zudem müssen die bei einer Infektion stark

vermehrten Lymphozyten wieder auf die normale Anzahl reduziert werden, wobei jedoch

EINLEITUNG 6

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einige Zellen als Gedächtniszellen erhalten bleiben sollen. Diese Aufgaben im Immunsystem

werden größtenteils ebenfalls durch Apoptose gelöst (Steller, H., 1995).

Apoptose wird auch programmierter Zelltod genannt, weil die einzelnen

molekularbiologischen Schritte genetisch festgelegt sind und nach einem festen Muster

ablaufen. Dieses Programm wird entweder von äußeren oder inneren Faktoren gestartet,

jedoch von der Zelle selbst durchgeführt. Da die Durchführung der Apoptose eine sehr

weitreichende Konsequenz für die Zelle –nämlich den Tod der Zelle– zur Folge hat, sind

zahlreiche Sicherungsmechanismen vorhanden. Beim Start der Apoptose kann die Zelle das

Programm oft noch abbrechen oder überprüfen, wenn Signale oder innere Faktoren gegen die

Durchführung sprechen. Ist die Überprüfung positiv, wird durch Abbau den von

lebenswichtigen Proteinen und den Start oder die Verstärkung weiterer Programmschritte der

irreversible Teil des Apoptose-Programms gestartet. Dadurch beginnt der geordnete Abbau

der betroffenen Zelle, der meist in der Aufnahme der in kleinen Membranpaketen (apoptotic

bodies) verpackten Reste der Zelle durch andere Zellen endet. Der Vorgang, bei dem zunächst

Bläschen der Zellmembran entstehen, die später abgeschnürt werden, wird auch Zeiose

genannt.

Der Apoptose kommt eine extrem wichtige Bedeutung bei der Homeostase der Zellzahl und

der Entsorgung geschädigter oder überflüssiger Zellen zu. Daher können Fehlfunktionen zu

schweren Erkrankungen führen. So kann eine Unterfunktion der Apoptose Krebs oder

Autoimmunkrankheiten zur Folge haben; bei einer Überfunktionen können nicht ersetzbare

Zellen zerstört oder das Gleichgewicht von Zellpopulationen gestört werden. Beispiele für

Überfunktion sind AIDS (CD4 T-Lymphozyten), akutes Leberversagen, Wilson´s disease,

multiple Sklerose, neurodegenerative Erkrankungen, aplastische Anämie, chronische

Neutropenie, Diabetes mellitus Typ-1 und Hashimoto´s Thyroiditis. Eine Deregulation der

Apoptose, bei der zu wenig programmierter Zelltod stattfindet, kann zu Canale-Smith

Syndrom (CSS, ALPS), Lymphomen, Leukämie, soliden Tumoren, Autoimmunkrankheiten

(Hypereosinophilie, Lupus erythematosus, rheumatoide Arthritis, Graves´ Disease) führen

(Eguchi, K., 2001; Strand, S. et al., 1998; Ameisen, J. C. et al., 1995; Sathasivam, S. et al.,

2001; Muschen, M. et al., 1999; Zornig, M. et al., 2001).

Im Gegensatz zu Apoptose steht Nekrose: sie ist gekennzeichnet durch einen pathologischen

Prozeß, bei dem akute unphysiologische Bedingungen oder physikalische Einwirkungen die

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Zellen zerstören. Resultat ist letztlich eine zerstörte Zellmembran, die es erlaubt, Zellinhalte

in die Umgebung freizusetzen. Dadurch können Immunzellen angelockt werden, die dann

durch Zytokin-Produktion einen entzündlichen Prozeß induzieren (Kroemer, G. et al., 1998).

Offensichtlich gibt es auch zahlreiche Zwischenformen und Kombinationen des Zelltodes:

Epithelzellen der Haut und des Darms, die durch hohe Schadbelastungen besonders

mutations- und krebsgefährdet sind, werden durch postmitotische Differenzierung und

Abschilfern entfernt. Ob danach Apoptose oder Nekrose eintritt, ist unbekannt. Eine

Überexpression der antiapoptotischen Proteine Bcl-2 oder Bcl-xL hat jedenfalls keinen

Einfluss auf Regenerationsvorgänge in äußeren oder inneren Epithelien (Meier, P. et al.,

2000a). Auch ist es möglich, daß zur kompletten Durchführung der Apoptose die

Energiereserven fehlen. Schließlich können Einflüsse auf die Zelle das apoptotische

Programm starten, das dann aber von (meist schnelleren) nekrotischen Vorgängen überlagert

wird .

Apoptose in der Entwicklung Während der Ontogenese eines vielzelligen Organismus werden sehr viel mehr Zellen

produziert als später für die Funktion der Organe benötigt werden. Im Verlauf der

Entwicklung wird daher die Zellzahl durch Apoptose auf das richtige Maß korrigiert. Viele

Beispiele zeigen, daß sogar ganze Strukturen gebildet werden, nur um später ab- oder

umgebaut zu werden. Der Schwanz bei der Entwicklung von Kaulquappen zum adulten

Frosch oder die Bildung von Schwimmhäuten zwischen den Fingern vieler Landlebewesen

sind anschauliche Beispiele dafür. Weitere Beispiele sind der Müllersche und der Wolffsche

Gang, die sich zu den weiblichen respektive den männlichen Gonaden entwickeln. Bei der

Entwicklung zu männlichen oder weiblichen Tieren wird der jeweils nicht benötigte Teil

durch Apoptose entfernt (Meier, P. et al., 2000b).

Eines der hinsichtlich Apoptose am besten untersuchten Tiere ist C. elegans. Bei dieser

Nematode beträgt die maximale Zellzahl während der Ontogenese 1090 Zellen. Von diesen

werden 131 Zellen durch Apoptose entfernt, so daß ein adultes Tier 959 Zellen besitzt. Bei

diesem wichtigen Modellorganismus wurden erstmals für die Apoptose wichtige Gene

entdeckt. Zu jedem der an der Apoptose beteiligten Proteine aus C. elegans konnten analoge

Proteine in Insekten (Drosophila melanogaster) und Mammalia gefunden werden. Die

Komplexität und damit die Zahl der beteiligten Enzyme, Proteine und Rezeptoren ist aber bei

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den Mammalia am höchsten. Dennoch sind viele Proteine in höher als C.elegans organisierten

Metazoa konserviert. Ein Beispiel ist menschliches Bcl-2, das auch in C. elegans seine

Apoptose-inhibierende Wirkung ausübt, obwohl es nicht genau die gleiche Funktion in

Säugern hat (Meier, P. et al., 2000b) (Vaux, D. L. et al., 1992).

Während Apoptose in C. elegans und Drosophila vorwiegend auf frühe Entwicklungstadien

begrenzt ist, ist bei Säugern aufgrund der längeren Lebensspanne Apoptose auch in adultem

Stadium nötig. Je länger das Erwachsenenstadium andauert, desto wichtiger sind

Regeneration und Reaktionsmöglichkeiten auf Infektionen und andere schädliche Einflüsse.

Daraus ergibt sich auch die erhöhte Anforderung an die Steuerung der Apoptose. Außerdem

ist die Komplexität des Nervensystems und des Immunsystem so groß, daß sehr große

Mengen an Zellen gebildet werden müssen. Die Selektion erfolgt bei Neuronen größtenteils

über die positive Selektion durch aus der Umgebung stammende trophische Faktoren

(Hormone und Cytokine), physischen Kontakt zu benachbarten Zellen sowie richtiger

Verbindungen d. h. Synapsenbildung. Diese Mechanismen sorgen dafür, daß eine Nervenzelle

nur überlebt, wenn sie funktionsfähig d. h. richtig verschaltet und zusätzlich an der richtigen

Stelle ist. Nur so ist es möglich, ein so komplexes Gebilde wie das menschliche Gehirn zu

bilden. Daher zeigen sich Störungen des apoptotischen System am deutlichsten im

neuronalen- oder im Immunsystem. Z. B. zeigen Mäuse, denen Caspase-9, Caspase-3 oder

Apaf-1 fehlt, starke neuronale Hyperproliferation und Unordnung. Hingegen sterben die

Mäuse schon im Embryonalstadium, wenn antiapoptotische Proteine wie Bcl-xL deletiert sind.

(Meier, P. et al., 2000b). Aufgrund der starken Auswirkungen von Fehlfunktionen der

Apoptose sind die Mechansimen vor allem in Vertebraten meist stark redundant. Eine

einzelne Mutation hat oft keine sichtbaren oder nur begrenzte Auswirkungen in einzelnen

Organen.

Apoptose bei Zellschäden Intensiv untersucht ist Apoptose bei DNA-Schäden. Die Entstehung von Schäden am Erbgut

einer Zelle kann auf unterschiedliche Weise erfolgen: Einwirkung von ultravioletter oder

radioaktiver Strahlung, von genotoxischen Substanzen, von mutagenen Viren oder

physikalischer Krafteinwirkung. Zudem arbeiten die Enzyme der DNA-Replikation nie

vollkommen fehlerfrei. Entstandene Fehler werden normalerweise erkannt und die Zelle

versucht, diese zu reparieren. Erst wenn die Reparatur mißlingt, versucht die Zelle durch

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Selbstzerstörung eine Schädigung des Organismus zu vermeiden. Die Reparatur sowie die

Apoptose kann durch das Protein p53 (s.u.) eingeleitet werden.

Apoptose im Immunsystem des Körpers Wie wichtig die Entsorgung von infizierten Zellen ist, zeigt die Anpassung vieler Viren mit

Hilfe antiapoptotischer Proteine. V-FLIP´s (auch Casper, I-FLICE, FLAME, CASH genannt

(Ashkenazi, A. und Dixit, V. M., 1998) sind Proteine, die zwei DD (death domains,

Todesdomänen) besitzen, und damit mehrere Apoptose-induzierende Rezeptoren (CD 95,

TNF-R1, TRAMP/DR3, TRAIL-R1) auf der Ebene der Caspase-Ankoppelung inhibieren

können. Auch virale Proteine, die die Funktion des Bcl-2-Proteins nachahmen, sind bekannt.

Die Entsorgung von überflüssigen oder autoreaktiven Lymphozyten wird meist über

rezeptorvermittelte Apoptose durchgeführt.

Induktionsphase Während der Induktionsphase erhält die Zelle entweder exogen die Botschaft, Apoptose zu

begehen, oder interne Faktoren aktivieren die „Entscheidungsphase“. Externe Faktoren sind

oft von anderen Zellen abgegebene Liganden, die an spezielle Rezeptoren auf der Oberfläche

der betroffenen Zelle binden.

Rezeptorinduzierte Apoptose Auf der Zelloberfläche können unterschiedliche Rezeptoren sitzen, die eine Todesbotschaft

von außen direkt an das Zellinnere weiterleiten. Einer der bekanntesten Rezeptoren ist CD95

(auch Apo-1/Fas). Die Bindung des Fas-Liganden induziert eine Trimerisierung der

Rezeptoren, die einen DISC (Death inducing signalling complex) genannten Signalkomplex

bilden. Auf der Zytoplasmaseite kann daraufhin FADD (Fas-associated death domain protein;

oder Mort1) als Adaptermolekül an die DD (Death Domain) genannte Todesdomäne

andocken und mehrere Moleküle pro-Caspase-8 (auch FLICE oder MACH) rekrutieren. Wie

die Caspase daraufhin aktiviert wird, ist nicht genau bekannt. Eine Theorie ist, daß durch die

hohe Konzentration eine gegenseitige Aktivierung der Zymogene möglich ist. Wenn Caspase-

8 aktiviert ist und als Heterotetramer vorliegt, kann im nächsten Schritt Caspase-3 aktiviert

werden. Zusätzlich vermag aktive Caspase-8 Bid, ein Protein der bcl-2-Familie, zu spalten

und so die proapoptotische Wirkung von Bid zu steigern. Bid kann nach Spaltung zu

Mitochondrien translozieren und dort die Freisetzung von Cytochrom C und anderen

proapoptotischen Proteine wie Smac (auch DIABLO) verstärken. Dies ist jedoch nur in

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sogenannten Typ II-Zellen notwendig, die ohne diese Verstärkung viel zu wenig DISC

ausbilden und daher auch kaum Caspase-8 aktiviert wird. Typ I-Zellen können auch ohne

diesen Verstärkungsschritt Apoptose begehen. Die Unterschiede zwischen Typ I und Typ II

Zellen liegen wahrscheinlich in unterschiedlichen Funktionalitäten der Rezeptoren-Komplexe

In einem anderen postulierten Modell liegen die CD 95-Moleküle schon geclustert als

sogenannte PLADS (pre-ligand binding assembly domains) vor. Die Aktivierung würde in

diesem Fall von noch unbekannten antiapoptotischen Inhibitor-Proteinen verhindert. Wie die

Aktivierung der Rezeptoren in diesem Fall geschehen soll, ist bisher weitgehend unbekannt

(Hengartner, M. O., 2000; Krammer, P. H., 2000).

Rezeptoren wie CD95 sind besonders im Immunsystem wichtig: periphere Beseitigung von

aktivierten und reifen T-Zellen am Ende einer Immunantwort, Beseitigen von virusinfizierten

oder entarteten Zellen durch zytotoxische T-Zellen und natürliche Killerzellen und schließlich

das Abtöten von Immunzellen an immunprivilegierten Orten wie dem Auge. Diese

Rezeptoren gehören alle zur Superfamilie der TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) Rezeptoren.

Definiert wird diese Gruppe durch ähnliche, cysteinreiche extrazelluläre Domänen. Zusätzlich

haben alle diese Rezeptoren intrazelluläre Todesdomänen. Die am besten charakterisieren

Rezeptoren sind CD95 (auch Fas oder Apo 1) und TNFR1 (auch p55 oder CD120a). Weitere

Todes-Rezeptoren sind CAR1 (Aves), Todes-Rezeptor 3 (auch DR3 oder Apo3 oder WSL-1

oder TRAMP oder LARD), DR4, DR5 (auch Apo2 oder TRAIL-R2 oder TRICK 2 oder

KILLER). Der NGF-Rezeptor (Nerve growth factor) p75 enthält ebenfalls eine Todesdomäne.

Die Liganden, die diese Rezeptoren aktivieren, gehören zur Superfamilie der TNF-Proteine.

CD 95-Ligand bindet an CD 95, TNF und Lymphotoxin binden an TNFR1, Apo3-Ligand

(auch TWEAK) bindet an DR3 und Apo2-Ligand (Apo2L, auch TRAIL) bindet an DR4 und

DR5. Der Ligand für CAR1 ist bislang unbekannt. An CD95 können neben FADD, c-FLIP

oder v-FLIP noch weitere Proteine binden: z.B. Daxx. Daxx bindet ebenfalls an die

Todesdomäne und kann einen alternativen apoptotischen Pfad einschalten, der die Stress-

aktivierte c-Jun NH2-terminale Kinase (JNK) involviert (Ashkenazi, A. und Dixit, V. M.,

1998).

TNF wird vor allem von aktivierten Makrophagen oder von T-Zellen produziert. Durch die

Bindung des Liganden an seinen Rezeptor werden die Transkriptions-Faktoren NF-κB und

AP-1 aktiviert. Diese wiederum können proinflammatorische und immunmodulatorische

Gene induzieren. Ob eine „apoptotische“ Antwort induziert wird, hängt wahrscheinlich von

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der Existenz zellulärer Faktoren ab, die einen solchen Stimulus unterdrücken können. Diese

Faktoren werden möglicherweise durch NF-κB oder /und JNK/AP-1 kontrolliert, da eine

Hemmung einer der beiden Pfade eineSensibilisierung der Zellen gegenüber Apoptose nach

sich zieht. Nach Bindung von TNF trimerisiert TNRF1 wie CD95 und bindet im Zellinneren

TRADD (TNFR associated death domain), an das wiederum entweder RIP (receptor

interacting protein), TRAF2 (TNFR associated factor-2) oder FADD binden kann. Bei

Bindung von FADD wird der gleiche Pfad -Aktivierung von Caspase-8- wie bei CD95

eingeschlagen Bei der Rekrutierung von RIP/TRAF2 hingegen wird zunächst NFκB-inducing

Kinase (NIK) aktiviert, die dann den Komplex I-κB-(inhibitor of κB) Kinase (IKK) aktiviert.

Dadurch wird IκB phosphoryliert und anschliesssend aus dem Komplex entfernt. Die

Transkription von Genen im Kern wird durch die Wanderung von NfκB in den Kern möglich.

Ein weiterer Pfad der von TRAF2/RIP eingeschlagen werden kann, ist die JNK (c-jun NH2-

terminal activated kinase) Kaskade: dazu phosphoryliert MEKK1 (MAP (Mitogen aktiviertes

Protein)/Erk Kinase-Kinase-1) JNKK (JNK Kinase). Diese wiederum phosphoryliert JNK.

MEKK1 kann allerdings nicht direkt an TRAF2 binden. Daher vermutet man ein weitere

Kinase, die entweder MEKK1 ersetzt oder phosphoryliert. Mäuse-Null-Mutanten zeigen, daß

einige Proteine nicht unersetzlich sind. So kann z. B. durch eine Ausschaltung von TRAF2

der NFκB-Pfad nur unwesentlich gehemmt werden. Hingegen wird der JNK-Pfad komplett

durch einen TRAF2 Knockout abgeschaltet. Hingegen wirkt eine Entfernung von RIP genau

entgegengesetzt: der NFκB-Pfad wird komplett blockiert, hingegen der JNK-Pfad kaum

gehemmt. Ein weiterer wichtiger Pfad wird beschritten durch die Proteine cIAP (cellular

Inhibitor of Apoptosis-1/-2 proteins) aus einer Familie von Proteinen viraler oder

Säugerherkunft: diese können direkt von TRAF2 gebunden werden. Schließlich kann TNFR1

auch Adapter namens RAIDD oder CRADD binden, die ebenfalls eine Todesdomäne

besitzen. An das enthaltene CARD-Motiv kann Caspase-2 binden und dort aktiviert werden

(Ashkenazi, A. und Dixit, V. M., 1998).

Der Rezeptor DR3 (Apo3/Wsl1) ist dem TNFR1 äußerst ähnlich. Auch hier können nach

Bindung des Liganden Apo3L über die gleichen Adaptermoleküle und Pfade NFκB und/oder

Caspase-8 aktiviert werden. Apo3L ist eng verwandt mit TNF. Der entscheidende Unterschied

liegt in der regionalen Expression der Liganden sowie der Rezeptoren: TNF wird

hauptsächlich in aktivierten Makrophagen und Lymphozyten produziert; Apo3L wird

hingegen konstitutiv in vielen Geweben exprimiert. Der Rezeptor TNFR1 wird in allen

Geweben exprimiert, Apo3 jedoch vorwiegend im Thymus, Blut, der Milz und in aktivierten

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T-Zellen. Daher nimmt man eine unterschiedliche biologische Rolle für die

Rezeptoren/Liganden-Systeme an.

An die Rezeptoren DR4 und DR5 schließlich kann der Ligand Apo2L (auch TRAIL) binden,

der eng mit CD95L verwandt ist. Auch diese Rezeptoren enthalten eine Todesdomäne im

Zellinneren. Die Art und Weise und welche Caspasen an diesen Domänen aktiviert werden,

ist noch unbekannt. Caspase-Aktivierung ist allerdings zwingend notwendig für die durch

Apo2L ausgelöste Apoptose. Die Expression von dominant negativen FADD-Mutanten

blockierte nicht die Apoptose, woraus auf einen unabhängigen Caspase-Aktivierungsweg

geschlossen werden kann. Die Ergebnisse in dieser Hinsicht sind allerdings nicht eindeutig:

Überexpression von DR4 oder DR5 löst Apoptose aus; diese wurde nur in einem Teil der

Experimente von FADD-DN (FADD dominant-negative Mutante) blockiert. Ebenso ist die

Bindung von Adapter-Molekülen (TRADD, FADD, TRAF2, RIP) umstritten: eine Bindung

könnte auch auf der starken Überexpression von Rezeptoren und Adaptern in Versuchen

beruhen und unphysiologisch sein. Ein völliges Fehlen von FADD konnte allerdings in Zellen

Apo2L-induzierte Apoptose nicht verhindern (Ashkenazi, A. und Dixit, V. M., 1998).

Sowohl Apo2L als auch DR4 und DR5 werden in verschiedenen Geweben exprimiert.

Apoptose in diesen Geweben kann durch Abfangmechanismen verhindert werden; es

existieren so genannte „Decoy-Rezeptoren“ DcR1 (auch TRID oder TRAIL-R3 oder LIT) und

DcR2 (auch TRAIL-R4), die auf der Außenseite der Zellmembran lokalisiert sind und

ebenfalls Apo2L binden können. Sie besitzen allerdings entweder, wie DcR1, gar keine

Domäne im Zellinneren, oder, -wie DcR2, eine verkümmerte und nicht funktionsfähige

intrazelluläre Todesdomäne. Ein homologes Protein, das sekretierte Osteoprotegerin, bindet

ebenfalls an Apo2L und verhindert Apoptose. Das Zusammenspiel der Rezeptoren DR4 und

DR5 sowie der Abfang-Rezeptoren DcR1 und DcR2 mit Apo2L ist noch nicht vollständig

verstanden (Ashkenazi, A. und Dixit, V. M., 1998).

Entzug von trophischen Faktoren Viele Zellen sind auf trophische Faktoren angewiesen; fehlen diese, kann Apoptose induziert

werden. Ein wichtiges Beispiel, bei dem dazu viel über die Signalpfade bekannt ist, stellt

NGF (nerve growth factor) dar. Generell binden Neurotrophine an die Zell-Oberflächen-

Rezeptoren TrKA, TrKB oder TrKC (tropomyosin receptor-kinase A, B, C). Nach Bindung

von NGF an TrKA kann dieser an mehreren Tyrosinen intrazellulär autophosphorylieren. An

den phosphorylierten Rezeptor können z.B. Phospholipase-Cγ, Phosphoinositid-3-Kinase (PI

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3-K) und das Adapter-Protein Shc binden. Aktivierte PI 3K kann über die Generierung von

3`phosphoryliertem Phosphoinositid die Serin/Threonin-Kinase Akt zur Membran

translozieren. Die Form c-Akt3/Rac-PKγ kommt in Neuronen von den drei möglichen

Formen am häufigsten vor. Nach der durch Bindung von 3´phosphoryliertem Phosphoinositid

induzierten Translokation zur zytoplasmatischen Seite der Zell-Membran kann Akt von den

3´-phosphoinositid-abhängigen Kinasen (PDK) phosphoryliert und damit aktiviert werden.

Akt wiederum kann verschiedenen Schlüssel-Enzyme phosphorylieren, darunter Apoptose-

Regulatoren und Transkriptionsfaktoren. Das proapoptotische Bad z. B. kann als

unphosphoryliertes Protein Bcl-xL binden und so dessen antiapoptotische Eigenschaften

blocken. Wird Bad durch Akt phosphoryliert, so kann dieses von 14-3-3 Proteinen im

Zytoplasma gebunden und inaktiviert werden. Akt beeinflußt auch drei verschiedene Familien

von Transkriptions-Faktoren: Forkhead, NFκB und CREB (cAMP-response element-binding-

protein). Die Phosphorylierung dieser Faktoren wirkt in jedem Falle positiv auf das Überleben

der Zelle: Forkhead-Proteinen, die proapoptotische Signale regulieren, werden durch Akt

negativ reguliert. Die Phosphorylierung von CREB und IκB steuert antiapoptotische Signal-

Pfade an (Franke, T. A., 1999; Yuan, J. und Yankner, B. A., 2000).

Durch die Bindung von NGF an den TrKA-R wird ebenfalls der MAP-Kinase-Pfad aktiviert:

zunächst kann das Adapter-Protein Shc an den TrKA-R binden. Dadurch wird letztendlich

Ras aktiviert, das wiederum Raf phosphoryliert. Die weitere Aktivierungs-Kaskade verläuft

über MEK (Map Kinase/Erk Kinase), Erk (extracellular signal regulated protein kinase), und

schließlich MAPK (Mitogen-activated protein kinase). Diese kann Proteine der Rsk-

(pp90ribosomal S6 kinase) Familie aktivieren, was ebenfalls in der Inaktivierung von Bad und

der Aktivierung von CREB resultiert. CREB kann die Transkription von Bcl-2 aktivieren und

so direkt das Überleben der Zelle beeinflussen.

Sind nicht genug trophische Faktoren für das Überleben der Zelle vorhanden, können neben

dem „ Abschalten “ der antiapoptotischen Signal-Ketten zusätzlich proapoptotische Faktoren

aktiviert werden. Beschrieben ist für verschiedene Zellarten die vermehrte Aktivität oder

Transkription von p38MAP Kinase und c-Jun N-terminaler Kinase oder deren Produkt c-Jun.

Auch kann DP5 (auch Hrk) –ein proapoptotisches Mitglied der bcl-2 Familie- z. B. in

sympathetischen Neuronen nach NGF-Entzug transkribiert werden. Die alleinige Aktivierung

von JNK scheint nicht für die Induktion der Apoptose auszureichen. Sympathetische

Neuronen können durch die Gabe eines Breitspektrum-Inhibitors von Caspasen vor der

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Apoptose bewahrt werden. Es wird vermutet, daß die Caspase-Aktivierung über die

Rekrutierung von Bax durch DP5 zu den Mitochondrien und Freisetzung von Cytochrom C

erfolgt.

Auch Neurotrophine können Apoptose induzieren (Chao, M. et al., 1998; Bredesen, D. E. und

Rabizadeh, S., 1997). Die Bindung von Neurotrophinen an den p75NTR (ein Mitglied der

TNF-Superfamilie) kann abhängig von dem Zustand und der Umgebung der Zelle Apoptose

auslösen. Dieser Aktivierungspfad scheint durch die Bindung von NGF an TrKR inhibiert zu

werden. Denkbar ist, daß eine Nervenzelle nicht nur durch fehlende trophische Faktoren,

sondern auch durch „falsche“ trophische Faktoren in einer unpassenden Umgebung untergeht

(Yuan, J. und Yankner, B. A., 2000; Encinas, M. et al., 1999).

Proapoptotische Faktoren aus Mitochondrien Einige Apoptose-induzierende Proteine befinden sich in den Mitochondrien und können aus

diesen in das Zytosol freigesetzt werden, um dort Apoptose auszulösen.

Diese proapoptotischen Faktoren sind neben Cytochrom C auch ein Flavoprotein namens AIF

(Apoptosis inducing factor) und Smac (second mitochondria derived activator of Caspases ,

auch DIABLO = direct IAP-binding protein with low pI) und die Procaspasen-2, -3 und -9.

Wie genau die Freisetzung der proapoptotischen Proteine bewirkt wird, ist nicht abschließend

geklärt. Folgende Hypothesen werden diskutiert: Basierend auf der strukturellen Ähnlichkeit

von Bcl-xL mit dem Diphterie-Toxin wird gemutmaßt, daß sich proapoptotische Bcl-2-

Proteine in die äußere Mitochondrienmembran einfügen und dort einen Kanal oder eine Pore

bilden. Tatsächlich können Bcl-2 Proteine in synthetischen Membranen Kanäle bilden.

Allerdings ist fraglich, ob durch diese Kanäle auch große Proteine passieren können. Diese

Frage stellt sich auch bei der zweiten Hypothese, nach der Bcl-2 Proteine zusammen mit

anderen Proteinen der äußeren Mitochondrien-Membran Kanäle bilden. Ein wahrscheinlicher

Kandidat wäre in diesem Fall der spannungsabhängige Anionen Kanal (voltage-dependent

anion channel, VDAC), weil mehrere Bcl-2 Proteine daran binden können. Auch hier reicht

die Porengrösse des Kanals ohne weitreichende Konformationsänderung nicht aus, um

Proteine hindurchzulassen. Die dritte Theorie weist den proapoptotischen Bcl-2 Proteinen

eine membranzerstörende Wirkung zu: durch Änderung der Physiologie der Mitochondrien

soll letztlich die Membran zerstört werden und die proapoptotischen Faktoren freigesetzt

werden. Hier ist wiederum der VDAC ein möglicher Kandidat, weil er ein Bestandteil der

MPTP (mitochondrial permeability transition pore) ist. Dieser Kanal ist verantwortlich für

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Potentialverluste an der Membran und Anschwellen der Mitochondrien, wenn er sich öffnet.

Substanzen, die das Öffnen des Kanals verhindern, können auch die Freisetzung von

Cytochrom C hemmen. Andererseits kann die Depolarisation der Mitochondrien die

Freisetzung von Cytochrom C bewirken. Auch hier muß wieder einschränkend hinzugesetzt

werden, daß Cytochrom C auch ohne Depolarisation von Mitochondrien freigesetzt werden

kann, so daß von weiteren Angriffspunkten für Bcl-2 Proteine ausgegangen werden muß.

Gerade die rezeptorinduzierte Apoptose führt oft zu sehr später oder sehr geringer Freisetzung

von Cytochrom C. Die Apoptose über diese Pfade ist dann auch relativ unempfindlich für eine

Blockade durch antiapoptotische Proteine der Bcl-2 Familie (Green, D. R. und Reed, J. C.,

1998; Kroemer, G. et al., 1997).

P53, Apoptose und Krebsinduktion Bei mehrzelligen Organismen besteht generell die Gefahr, daß durch Mutationen in den

Genen, die für Proliferation, für den Kontakt mit anderen Zellen oder für Apoptose zuständig

sind, eine Zelle zu stark oder an der falschen Stelle proliferiert. Daher werden diese

Mechanismen streng überwacht so daß bei einer Fehlfunktion die Zelle sich selbst durch

Apoptose beseitigen kann. Alternativ kann die Zelle versuchen, die DNA-Schädigung zu

reparieren. Dies ist natürlich nicht so sicher wie die Beseitigung. Bei postmitotischen Zellen

oder bei Zellen, die ständig entsorgt werden, wie zum Beispiel Hautzellen, ist die Gefahr einer

Neoplasie naturgemäß sehr gering. Grundsätzlich hängt die Entscheidung von der Schwere

der Schädigung, der Umgebung, der Zelle selbst und der Lokalisation ab.

Einer der Hauptpfade der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung bei Säugern involviert

eine Reihe von Protein-Kinasen, die verwandt sind mit der Phosphatidylinositol-Kinase (PI-3-

Kinase). Die Prototypen sind ATM (benannt nach der menschlichen autosomalen rezessiven

Krankheit Ataxia talangiectasia) und die DNA-abhängige Protein-Kinase (DNA-PK). Sie sind

homolog zu den Kinase aus der Hefe Rad-3/MEC1, die ebenfalls nach einer DNA-

Schädigung aktiviert werden. Beide Kinasen der Mammalia wirken über das Protein p-53, das

auch „Wächter des Genoms“ genannt wird. P-53 wird normalerweise mittels Abbau durch

Mdm-2 auf einem sehr niedrigen Level gehalten. Durch die Phosphorylierung entweder von

p-53 oder Mdm-2 können die Bindungspartner nicht interagieren und die Aktivität von p-53

steigt an. Die wichtige Rolle von p-53 zeigt sich daran, daß in vielen menschlichen Tumoren

p-53 nicht funktionsfähig ist. Die Folge einer Aktivierung von funktionsfähigem p-53 kann

ein Arrest in der G-1 oder G-2-Phase des Zellzyklus sein oder die Induktion von Apoptose.

Der Arrest des Zellzyklus scheint irreversibel zu sein, so daß die betroffene Zelle keine

EINLEITUNG 16

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weitere Gefahr darstellt. Ob Apoptose oder Zellzyklus-Arrest induziert wird, hängt wiederum

von mehreren Faktoren ab: neben dem Zelltyp, der Zellumgebung und der Art der Schädigung

spielt die Expression von Onkogenen eine wichtige Rolle.

Der Zellzyklus scheint durch einen Inhibitor der Cyclin-abhängigen-Kinasen -das p-21-

angehalten zu werden. Die Induktion von Apoptose scheint unter anderem durch

Beeinflussung des bcl-2-Proteins Bax, des IGF-I-Rezeptors (insulin like growth-factor-I-

receptor), des IGF-BP (IGF-binding protein), Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems

und Proteinen, welche die Angiogenese regulieren, beeinflußt zu werden. Auch die

Repression antiapoptotischer Proteine und Mechanismen ohne Transkription werden

diskutiert.

Die Bereitschaft der Zelle, Apoptose auszulösen, scheint durch die Phase des Zellzyklus bzw.

durch Proteine, welche die Proliferation zu induzieren vermögen, zu steigen. Dies konnte

z. B. bei dem Protein Myc gezeigt werden: Myc gehört zur Familie der bHLH-zip-

Transkriptions-Faktoren. Eine Deregulation des zugehörigen Gens c-myc ist oft bei Krebs zu

beobachten und bewirkt Zellproliferation. Myc ist bisher nur in sich teilenden Zellen

nachgewiesen worden, nicht jedoch in ruhenden Zellen. Eine ektopische Expression von Myc

reicht in vielen Zellen aus, um die Zellen in einen weiteren Zellzyklus zu zwingen.

Interessanterweise kann Myc ebenfalls proapoptotische wirken. Dabei sind die mitogenen

Eigenschaften nicht von den proapoptotische zu trennen. Als Effektor-Proteine werden vor

allem Cyclin-abhängige-Kinasen gehandelt, aber auch Ornithin-Decarboxylase, Cdc-25 sowie

Lactat-Dehydrogenase A. Die durch Myc induzierte Apoptose kann nicht nur durch Bcl-2

inhibiert werden, sondern auch durch verschiedene antiapoptotische Proteine wie IGF-I in

Fibroblasten oder Interleukin-3 in Myeloidzellen. E1A, ein Onkoprotein aus einem

Adenovirus, wirkt ebenfalls wachstumsfördernd auf Zellen. Tatsächlich fördert E1A auch

Apoptose und muß durch Genprodukte von e1b daran gehindert werden. Auch ein

ungeregelter Eintritt in die S-Phase kann eine Zelle dazu veranlassen, Apoptose zu begehen.

Zum Beispiel kann E2F, ein Mitglied einer Familie von Transkriptionsfaktoren, bei einer

ektopischen Expression den Eintritt in die S-Phase induzieren -auch ohne den Einfluß

weiterer Mitogene. Normalerweise wird E2F von Rb (retinoblastoma protein) gebunden und

inaktiviert. Eine Mutation in einem der beiden Proteine, die eine Interaktion zwischen ihnen

unmöglich macht, führt zu einem ungeregelten, beschleunigten Übergang von der G1 zur S1

Phase. Eine Phosphorylierung von Rb verhindert ebenfalls die Unterdrückung der

Zellproliferation. Diese Phosphorylierung wird durch einen Pfad vermittelt, der Cyclin D,

EINLEITUNG 17

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Cdk 4 sowie den Cdk-Inhibitor p16ink 4 beinhaltet. Eine Fehlfunktion innerhalb dieses Pfades

scheint bei Krebs weit verbreitet zu sein. Aber auch hier ist der Eintritt in die S1-Phase

normalerweise mit der Induktion von Apoptose verbunden. Daher ist es nicht verwunderlich,

daß Rb das Ziel von viralen Inhibitoren wie Adenovirus-Protein E1A, SV40 und HPV ist. Rb

wird in verschiedenen Geweben vor allem während der Entwicklung exprimiert, darunter im

Nervensystem, der Augenlinse, im Muskelgewebe und in der Leber. Knockout-Mäuse ohne

Rb sterben embryonal an Tag 12-13 und zeigen stark erhöhte Proliferations- und

Apoptoseraten. Rb kann auch durch Caspasen gespalten werden, was eine Voraussetzung für

TNF- und Fas- induzierte Apoptose zu sein scheint.

E1A induziert eine Akkumulation von p53, und die dadurch ausgelöste Apoptose kann durch

zwei weitere virale Proteine gehemmt werden: E1B-Proteine p19 -ein Bcl-2 homologes

Protein- und p55, das p53 inhibiert. Auch bei Myc induzierter Apoptose scheint p53 eine

wichtige Rolle zu spielen, obwohl auch eine von p53 unabhängig induzierte Apoptose duch

Myc dokumentiert wurde. Auch E2F induzierte Apoptose kann durch p53 vermittelt sein.

Allerdings scheint in diesem Fall ein Protein aus der Familie der auslösende Faktor zu sein:

nur E2F-1 löst Apoptose aus, während E2F-1,2,3 mitogen sind.

Proliferation scheint also eng mit Apoptose gekoppelt zu sein, wobei die Entscheidung

zugunsten einer der Möglichkeiten von dem Vorhandensein der entsprechenden

Überlebenssignale abhängt. Verkompliziert wird das System durch Hinweise, daß der Fas-

Signalweg durch z.B. Myc sensitiver wird oder auch durch autokrine Interaktionen induziert

werden kann. Zusätzlich können DNA-schädigende Substanzen und UV-Licht sogar direkt

den CD95-Rezeptor aktivieren (Evan, G. und Littlewood, T., 1998).

Interessanterweise hemmt Bcl-2 die Proliferation, wohingegen Bax die Proliferation fördert.

Bcl-2, das als Onkogen wirken kann, benötigt zur Tumorgenese noch weitere, mutierte

Proteine, die die Proliferationshemmung wieder aufheben: diesen Part kann z.B. Myc

übernehmen. Dies konnte in vitro sowie in entsprechenden transgenen Mäusen gezeigt

werden. Eine Mutation im Tyrosin 28 von Bcl-2 vermag ebenfalls die

proliferationshemmende Wirkung von Bcl-2 aufzuheben und konnte in vielen

fortgeschrittenen Lymphomen gezeigt werden. Genausogut kann jedoch eine Mutation in

einem antiapoptotischen Protein, welche die Funktion hemmt und damit Apoptose verhindert,

Krebs fördern. Bax zum Beispiel ist in einigen gastrointestinalen und in einigen Leukämien

mutiert nachgewiesen worden. Auch beruht der p53-Mechanismus zum Teil auf der

EINLEITUNG 18

18

Aktivierung von Bax. Ein Fehlen oder eine Fehlfunktion von Bax hemmt daher auch diesen

wichtigen Sicherheitsmechanismus (Adams, J. M. und Cory, S., 1998).

Eine Interaktion mit FADD, einem wichtigen Bestandteil des CD95-Signalweges, hemmt

ebenfalls die Zellproliferation. Auch das Onkoprotein Ras muß erwähnt werden: Ras kann

zum einen über die Aktivierung des Raf-Map Kinase Signalpfades mitogene Signale geben,

zum anderen sind Ras Proteine an der Weitergabe der Überlebenssignale vom IGF-I-Rezeptor

zu den weiter unten in der Kaskade stehenden Effektoren PI-3-Kinase, Akt und Bad beteiligt.

In nicht transformierten Zellen jedoch tritt genau das Gegenteil ein: Hemmung der

Zellproliferation begleitet von Apoptose. Es müssen also mehrere Mutationen

zusammenkommen, damit Apoptose unterdrückt und Zellproliferation gefördert wird.

Degradationsphase

Ist in einer Zelle die Entscheidung zugunsten von Apoptose gefallen, so steht ein ganzes

Arsenal von Proteinen bereit, diese Entscheidung auch umzusetzen. Die wichtigsten werden

im Folgenden beschrieben. Der gesamte Vorgang bis zur Auflösung der Zelle in apoptotische

Körperchen kann sehr schnell –in einigen Fällen in 30-60 min- erfolgen.

Caspasen Caspasen (Cystein aspartatic acid proteases) sind Proteasen, von denen bislang in Vertebraten

15 verschiedene identifiziert worden sind. Beim Menschen sind mehr als 12 verschiedene

Caspasen beschrieben. Die 15 Caspasen in Vertebraten werden in 4 Effektor-Caspasen und 11

Initiator-Caspasen mit der entsprechenden Prodomäne unterteilt. Viele wichtige Kriterien, die

eine Zelle als apoptotisch charakterisieren, sind durch die proteolytische Aktivität von

Caspasen verursacht. Die weiter oben beschriebene Desintegration der Kernmembran ist u.a.

Folge der Lamin-Spaltung und ist für die Schrumpfung des Kerns verantwortlich. Auch der

Verlust der äußeren Form der Zelle ist auf Proteolyse von Skelettelementen wie Fodrin oder

Gelsolin durch Caspasen zu erklären. Und die Bläschenbildung der äußeren Zellmembran

wird durch Caspase-aktiviertes PAK-2 (aus der Familie der p-21 aktivierten Kinasen)

vermittelt. Die Wichtigkeit der Caspasen wird auch durch die Vielzahl von Substraten

abgebildet: über 100 sind beschrieben. Oft ist das Substrat für überlebensnotwendige Prozesse

der Zelle wichtig oder die Caspase-Aktivität verstärkt proapoptotische Vorgänge und inhibiert

antiapoptotische Proteine.

EINLEITUNG 19

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Der Aufbau der Caspasen ist während der Evolution konserviert worden, so daß sich

Caspasen aus Säugern kaum von denen aus Würmern unterscheiden. Die Caspasen liegen in

der Zelle zunächst als Zymogene vor, also als inaktive Proenzyme, und sind 30-50 kD groß.

Diese inaktiven Procaspasen bestehen aus drei Domänen: einer N-terminalen Prodomäne, und

den Domänen p20 und p10, die auch im aktiven Enzym vorliegen. Die Länge und die

Aminosäure-Sequenz der N-terminalen Domäne kann stark variieren. Alle bis jetzt

untersuchten aktiven Enzyme liegen als Heterotetramer vor, das jeweils zwei p10 und p20

Domänen enthält .

Die Aktivierung kann über verschiedene Mechanismen laufen. Caspase-8 (genau wie

Caspase-2 oder auch CED-3 aus C.elegans = Initiator-Caspasen) kann z.B. durch das Binden

an einer Todesdomäne der entsprechenden Rezeptoren wie Fas oder TNF-α und die damit

induzierte Nähe („induced proximity“) aktiviert werden. Dabei werden mehrere Zymogene zu

den Adaptermolekülen rekrutiert und die intrinsische, sehr geringe Protease-Aktivität reicht

aus, sich gegenseitig durch Spaltung zu aktivieren. Diese Spaltungsaktivierung bedeutet, daß

eine geringe Anzahl aktivierter Caspasen weitere Caspasen aktivieren kann, um so in einer

Verstärkungsschleife schnell und viel proteolytische Aktivität zu erreichen. Wahrscheinlich

existieren aber noch weitere Faktoren, die die Aktivierung in diesen Fällen steuern. Caspase-8

und Caspase-10 enthalten Todes-Effektor-Domänen (DED); Caspase-2 und Caspase-9

enthalten hingegen eine sog. CARD (Caspase recruitment domain). Beide Domänen haben

wenig Sequenzähnlichkeiten, falten sich jedoch in sehr ähnliche Strukturen, die auch von den

Todesdomänen widergespiegelt werden. Die sechs antiparallelen α-Helizes bilden Strukturen,

die Protein-Protein Wechselwirkungen ermöglichen. Die Oberfläche der Todes-Adapter-

Proteine ermöglicht insbesondere intrafamiliäre Bindungen wie z.B. DED/DED, aber auch

weitere Bindungen mit anderen Proteinen sind nicht ausgeschlossen.

Die Caspasen mit einer kurzen Prodomäne werden durch die Spaltung des Moleküls zwischen

P10 und p20 und teilweise auch zwischen p10 und der Prodomäne aktiviert. Die Spaltstellen

bestehen aus einem Aspartat und weiteren spezifischen Aminosäuren; zum Teil ist auch die

Tertiästruktur wichtig. Dies eröffnet die Möglichkeit der Aktivierung durch andere, schon

aktive Caspasen bzw. den sehr schwach aktiven Procaspasen. Diese Verstärkungskaskade

wird vor allem von den Effektor-Caspasen-3, -6 und -7 benutzt. Caspase-9 hingegen wird

durch Spaltung kaum aktiviert. Eine hohe proteolytische Aktivität kann hingegen durch die

Bindung an einen Kofaktor, nämlich Apaf-1 und einen weiteren Faktor, das Cytochrom-C

erreicht werden. Dabei ändert Procaspase-9 die Konformation und wird aktiviert. Der

EINLEITUNG 20

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Komplex aus diesen drei Proteinen wird auch Apoptosom genannt. Es ist nicht

auszuschließen, daß noch weitere Proteine an dem Komplex beteiligt sind.

Die proteolytische Aktivität der Caspasen beruht auf einem Cysteinrest im aktiven Zentrum.

Die Substratschnittstelle wird von einem Aspartat gebildet, an das aminoterminal noch vier

wichtige Aminosäuren anschließen. Diese sind spezifisch für die jeweilige Caspase. Dazu

kommen zum Teil noch sekundäre und tertiäre Strukturen, welche die Spaltstelle zusätzlich

charakterisieren. Aus der hohen Spezifität resultiert, daß viele Zielproteine nur an einer oder

wenigen Stellen geschnitten werden und so ihrer Funktion beraubt werden. Dies ist bei dem

DNA-Reparaturenzym PARP (Poly-ADP-Ribose Polymerase) der Fall oder bei dem

Kernmembranprotein Lamin. Auch eine Aktivierung von Proteinen durch die Spaltung ist

möglich. Zum einen kann dies auf der Abspaltung eines Protein-Inhibitors beruhen; z.B. die

Abspaltung von ICAD von CAD (Inhibitor of Caspase activated DNAse, auch DFF45) durch

Caspase-3. Dieser Inhibitor verhindert die Aktivierung der DNAse und damit die

Kondensation der DNA. Zum anderen ist die Abtrennung einer inhibitorischen Domäne

möglich, wie dies bei der gegenseitigen Aktivierung der Caspasen der Fall ist. In einigen

Fällen kann das abgespaltene Teilstück sogar die Aktivität des Ursprungsproteins hemmen, so

z.B. bei Bcl-2 oder Bcl-XL.

Die Reorganisation der Zellstruktur wird durch Beeinflussung verschiedener Proteine

ermöglicht, die Regulationsfunktion oder strukturgebende Funktion beim Zytoskelett haben.

Beispiele sind hier Gelsolin, das einen regulierten Abbau von Aktin ermöglicht. Wird

Gelsolin durch Caspase gespalten, wird Gelsolin konstitutiv aktiv -spaltet also Aktin ständig.

Auch FAK (focal adhesion kinase) und PAK2 (p21-activated Kinase) können in diesem

Zusammenhang genannt werden. Diese werden ebenfalls in ihrer Funktion dereguliert.

Enzyme, die der DNA-Reparatur dienen, wie DNA-Fragmentation-PKcs, sind ebenfalls

Substrate von Caspasen. U1-70K, ein Enzym zum Spleißen von mRNA, wird ebenso von

Caspasen beeinflußt wie replication factor c, ein wichtiger Faktor für DNA-Replikation

(Hengartner, M. O., 2000) (Thornberry, N. A. und Lazebnik, Y., 1998; Kumar, S. und

Colussi, P. A., 1999; Nicholson, D. W. und Thornberry, N. A., 1997; Song, Z. und Steller, H.,

1999; Villa, P. et al., 1997; Thornberry, N. A. und Lazebnik, Y., 1998).

Biochemie der Bcl-2 Proteine Eine zweite wichtige Gruppe von Proteinen, die bei der Apoptose eine Rolle spielen, sind die

Mitglieder der Bcl-2-Familie.

EINLEITUNG 21

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In Vertebraten sind bislang 20 Bcl-2 Proteine in einer noch größeren Anzahl von

Spleißvarianten entdeckt worden. Zu diesen addieren sich noch eine Anzahl viraler Proteine

mit ähnlichen Eigenschaften. Die Mitglieder der Bcl-2 Familie werden in 3 Gruppen

unterteilt, wobei die Mitglieder der ersten Gruppe antiapoptotische Wirkung besitzen. Die

Proteine der Gruppe II und III hingegen fördern Apoptose. Aufgrund der Möglichkeit zur

Bildung von Homodimeren sowie Heterodimeren kann eine pro- oder antiapoptotische

Wirkung erreicht werden. Dabei scheint eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten

vorhanden zu sein. Wichtig für die Wirkung ist das Verhältnis von pro- zu antiapoptotischen

Proteinen: Bei einem Übergewicht von antiapoptotischen Proteinen ist die Zelle weitgehend

vor dem programmierten Zelltod geschützt. Sind hingegen proapoptotische Proteine im

Übergewicht, kann Apoptose eingeleitet werden. Dabei scheint auch die Verteilung innerhalb

der Zelle eine Rolle zu spielen: antiapoptotische Proteine können die Freisetzung von

proapoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien zumindest in Säugern verhindern.

Alle Mitglieder der Bcl-2-Familie besitzen mindestens eine zu Bcl-2 homologe BH1,2,3- oder

BH4-Domäne (Bcl-2 homology domain). Die meisten Proteine, die antiapoptotisch wirken,

haben mindestens die Domänen BH1 und BH2, diejenigen, die Bcl-2 am ähnlichsten sind,

besitzen auch noch BH3 und BH4. Demgegenüber finden sich bei den proapoptotischen

Proteinen meistens weniger Gemeinsamkeiten zu Bcl-2. Die proapoptotischen Proteine der

Bax Unterfamilie Bax, Bak und Bok besitzen noch die Domänen BH1, BH2 und BH3.

Hingegen wurde bei der Unterfamilie BH 3, zu der die restlichen sieben proapoptotischen

Proteine bei Säugern gehören, nur die relativ kurze, 9-16 Aminosäuren lange BH 3 Domäne

gefunden. Diese BH 3 Proteine unterscheiden sich auch untereinander sehr stark und zeigen

keinerlei Ähnlichkeit zu anderen bekannten Proteinen.

Die Domänen BH1-3 sind wichtig für die Funktionsweise der Bcl-2-Proteine. Sowohl pro- als

auch antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2-Familie können Homo- und Heterodimere bilden.

Die Interaktion findet in einer hydrophoben Spalte statt, die von den Domänen BH1, BH2 und

BH3 gebildet werden, in welche die amphipathische α-Helix der Domäne BH3 binden kann.

Diese bei Bcl-xL gefundene Konformation kann bei Proteinen der Bax-Unterfamilie auch

geändert sein. Eine Alternative ist die Konformation mit einer nach außen gedrehten BH3

α-Helix, eine Form, die das Binden in die Tasche antiapoptotischer Proteine erlaubt. Diese

Heterodimerisation ist für eine proapoptotische Funktion der Proteine der BH3-Unterfamilie

von Bedeutung. Familienmitglieder der Bax-Gruppe scheinen zusätzlich einen anderen

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apoptotischen Pfad einschlagen zu können. Welche pro- und antiapoptotischen Protein

aneinander binden ist nicht endgültig geklärt. Grundsätzlich läßt sich jedoch sagen, daß eine

Bindung von Gruppenmitgliedern der BH3- und der Bax-Unterfamilie an antiapoptotische

Proteine proapoptotisch wirkt.

Bcl-2 selbst ist an der Außenseite der Mitochondrienmembran, des endoplasmatischen

Reticulums sowie der Kernmembran lokalisiert. In den Membranen dienen wahrscheinlich

spezifische Proteine als Andockstelle. Allerdings ist die antiapoptotische Wirkung von Bcl-2

nicht auf das Vorhandensein des hydrophoben Membranankers gekoppelt. Ebenso scheinen

nicht alle Bcl-2-Proteine, obwohl sie einen Membrananker besitzen, ständig an Membranen

gebunden zu sein. Beispiele sind Bcl-xL und Bax, die zumindest teilweise zytoplasmatisch

lokalisiert sind.

An Mechanismen für die antiapoptotischen Proteine kommt z.B. die Blockade der

Aktivierung von Caspase-9 zusammen mit Apaf-1 in Frage: Bcl-xL kann mit seiner BH 4

Domäne an das C-terminale Ende von Apaf-1 binden. Vermutlich wird die Bindung von

Caspase-9 an die N-terminale CARD (Caspase recruitment domain) von Apaf-1 dadurch

unterbunden. Diese Blockade von Apaf-1 durch Bcl-2 könnte dann durch proapoptotische

Proteine wie Bik aufgehoben werden. Zudem ist die Unterstützung der Integrität von

Organellen -vor allem der Mitochondrien- eine wichtige Aufgabe von Βcl-2-Proteinen. Bcl-2

kann z.B. auf noch nicht völlig geklärte Weise die Freisetzung von proapoptotischem

Cytochrom C unterbinden. Zusätzlich kann Bcl-2 auch bei schon freigesetztem Cytochrom C

Apoptose verhindern. Wie weiter oben schon erwähnt, können Bcl-xL, Bcl-2 und Bax in

künstlichen Membranen Poren bilden, wobei die von Bcl-xL und Bcl-2 sogar bestimmte

Eigenschaften wie Ionen-Selektivität besitzen. Selbst in Hefe, wo normalerweise keine

Proteine der Bcl-2-Familie vorkommen, können Mitochondrien durch die überexprimierten

Proteine Bax und Bak zerstört werden; Bcl-2 hingegen kann diese Zerstörung verhindern.

Apoptose kann in Säugerzellen durch diesen Mechanismus sogar bei Anwesenheit eines

Caspase-Inhibitors stattfinden. Dabei finden sich dann auch typische Merkmale wie DNA-

Fragmentation oder Membranveränderungen. Wahrscheinlich wird die Apoptose durch

Einflußnahme auf die PTP (permeability transition pore) oder durch direkte Porenbildung

umgesetzt. Eine Regulation kann z. B. durch Cytokin-vermittelte Induktion antiapoptotischer

bcl-2-Gene erfolgen. Bax wird in einigen Zellarten durch p53 induziert. Bad kann

phosphoryliert werden und dann von 14-3-3-Proteinen im Zytosol gebunden und damit

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inaktiviert werden. Für Bcl-2 konnte gezeigt werden, daß eine Phosphorylierung einiger

Aminosäurereste das Protein inaktiviert. Dieses Signal wird vermutlich von JNK oder p38

vermittelt. Wichtig ist auch, daß Caspasen nicht nur antiapoptotische Bcl-2 Proteine

inaktivieren können, sondern daß die Spaltprodukte zudem proapoptotisch wirken können.

Der Schutz, den antiapoptotische Bcl-2-Proteine vermitteln können, erstreckt sich auf

Schädigungen durch UV-Licht, Gamma-Strahlung, Cytokin-Entzug und Exposition

gegenüber Dexamethason, Staurosporin und anderer toxischer Substanzen. Dagegen umgeht

der CD95-Signalweg größtenteils und nur mit wenigen Ausnahmen den durch Bcl-2

blockierbaren Schritt. Erschwert wird die Aufklärung der Funktion durch eine zeitlich sowie

örtlich unterschiedliche Expression der Bcl-2-Proteine. Beispielsweise. können sich Bcl-2

Knockout- Mäuse normal entwickeln, zeigen jedoch später in Neuronen erhöhte Apoptose.

Bcl-xL Knockout-Mäuse sterben sehr früh durch massive Apoptose neuronaler Zellen, die

wahrscheinlich von Bax vermittelt wird. Dies legen Kreuzungversuche mit Bax-Knockout-

Mäusen nahe (Adams, J. M. und Cory, S., 1998; Kroemer, G., 1997; Reed, J. C., 1997; Diaz,

J.-L. et al., 1997; Thornberry, N. A. und Lazebnik, Y., 1998; Meier, P. et al., 2000b;

Hengartner, M. O., 2000).

Zelluläre Inhibitoren der Apoptose In Säugern aber auch in Drosophila existieren zelluläre Inhibitoren der Apoptose (IAP;

inhibitors of apoptosis proteins). Diese dienen dazu, eine fälschlicherweise angestoßene

Apoptose zu stoppen. Aufgrund der starken Selbstamplifikation ist solch ein

Regelmechanismus erforderlich, da sonst schon nur. ein Molekül aktivierter Caspase zum

Zelluntergang führen könnte. Um einen vollständigen Zelluntergang zu sichern, sobald er

wirklich nötig ist, werden diese inhibitorischen Proteine z.B. durch Smac in ihrer Funktion

inhibiert. In Drosophila existieren weitere Beispiele für proapoptotische Proteine, die IAPs

hemmen: Reaper, Hid und Grim. Die Aktivierung von Caspase-8 kann wahrscheinlich durch

ein der Caspase-8 homologes Protein, dem c-Flip (cellular FLICE inhibitory protein) durch

Blockade von FADD gehemmt werden. FLIP kann an FADD binden, hat jedoch im

Gegensatz zu Procaspase-8 keine proteolytischen Fähigkeiten. Die Rolle von c-FLIP ist zur

Zeit noch unklar. Für ein virales Protein v-Flip sind antiapoptotische Wirkungen sicher

nachgewiesen; c-FLIP hat in einigen Modellen allerdings auch proapoptotische

Eigenschaften. Auch ARC (apoptosis repressor with Caspase-recruitment domain) konkurriert

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wahrscheinlich um die entsprechenden Bindestellen und verhindert so eine Aktivierung von

Caspasen.

An viralen Inhibitoren der Apoptose sind bisher drei bekannt: CrmA, p35 und die Familie der

IAP. CrmA aus dem Kuhpocken-Virus, ein Protein aus der Serpin-Familie, ist ein guter

Inhibitor verschiedener Initiator-Caspasen. Über p35 weiß man lediglich, daß bisher kein

homologes Protein entdeckt wurde. Inhibitoren der IAP-Familie sind die einzigen, die auch

bei Säugern bekannt sind. Bei der Wirkungsweise deuten erste Versuche auf die Hemmung

von Effektor-Caspasen wie Caspase-3 oder -7 hin -wahrscheinlich über die Inhibierung der

Aktivierung oder die Einschränkung des Feed-Back-Mechanismus (Hengartner, M. O., 2000;

Krammer, P. H., 2000; Thornberry, N. A. und Lazebnik, Y., 1998).

Abbau der DNA und des Nucleus Eines der wichtigsten Substrate, das bei Apoptose abgebaut wird, ist die DNA. Ohne DNA

kann keine Zelle langfristig überleben. Der Abbau des Kerns und der DNA ist nach Färbung

auch morphologisch zu erkennen. Ein wichtiges Phänomen ist Pyknosis, bei der DNA

kondensiert und mit Proteinen aggregiert. Ein weiteres Phänomen wird Karyorrhexis genannt

und beschreibt die Fragmentierung des Nucleus. Schließlich wird die DNA in verschieden

große Stücke fragmentiert. Letztlich dienen diese Ereignisse dazu, die Induktion des Zelltodes

unwiderruflich zu machen und die Aufnahme und Verwertung des Zellinhaltes durch andere

Zellen zu vereinfachen.

Inzwischen sind einige der Enzyme identifiziert, die Karyorrhexis und Pyknosis umsetzen.

Ein Beispiel ist CAD (Caspase activated DNAse, auch DFF40), die durch die Caspase-3 oder

-7 vermittelte Spaltung ihres Inhibitors ICAD aktiviert wird. CAD kann dann in den Nucleus

translozieren und dort DNA in die typischen 200 Basenpaar langen (oder ein mehrfaches

davon) Stücke schneiden. Weitere Beispiele sind L-DNAse II, die ebenfalls nach Aktivierung

in den Nucleus wandert und dort die DNA in Nucleosomen schneidet. L-DNAse II scheint

durch Ansäuerung des Zytosols aktiviert zu werden und entsteht aus einem Serpin ähnlichen

Protease-Inhibitor (Leukozyten Elastase Inhibitor) durch eine posttranslationale Modifikation.

Weitere Faktoren, die Einfluß auf die DNA-Integrität nehmen, sind AIF (Apoptosis inducing

factor), der aus Mitochondrien freigesetzt wird und DNA-Fragmente >50kD in der Peripherie

des Nucleus erzeugt, Cathepsin B und DNAse I, die Nucleosomen produzieren, DNAse II, die

DNA-Fragmente ≥50 kb produziert und evtl. Cyclophiline, die allerdings keine direkte DNA-

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Fragmentation umsetzen. Karyorrhexie wird u.a. von prozessiertem Acinus durchgeführt,

einem Protein, das von Caspase-3 und einem noch unbekannten Protein durch Proteolyse

aktiviert wird. Das entstehende Proteinfragment kann zusammen mit anderen, noch nicht

identifizierten Faktoren Chromatin-Kondensation bewirken, und zwar auch ohne gleichzeitige

DNAse-Aktivität anderer Enzyme (Zamzami, N. und Kroemer, G., 1999; Enari, M. et al.,

1998; Wyllie, A., 1998; Sahara, S. et al., 1999).

Aufnahme der Zellreste und apoptotischer Körperchen Letztendlich werden die Reste der Zellen, die Apoptose begangen haben, von anderen Zellen

aufgenommen. Dies können umliegende, gleichartige Zellen oder aber Phagozyten sein. Dazu

versehen sich die apoptotischen Zellen oder die inzwischen gebildeten kleineren

membranumhüllten Vesikel mit Signalmolekülen auf der Außenseite der Membran. Das

bekannteste Signalmolekül dieser Art ist Phosphatidylserin. Dieser Membranbestandteil ist im

Normalfall nur auf der Membraninnenseite lokalisiert, wird jedoch im Verlauf der Apoptose

sehr früh auf der Membranaußenseite präsentiert. Dazu muß zum einen eine Mg2+-abhängige

Aminophospholipid-Translokase gehemmt werden, zum anderen muß dazu eine Scramblase

durch Phosphorylierung und hohe Kalzium-Konzentrationen aktiviert werden. Auch

Veränderungen bei Zelloberflächen-Zuckern, die durch Lektine von Phagozyten erkannt

werden, sind relativ gut bekannte Marker. Weitere „friß mich“-Signale, die allerdings nicht so

gut wie Phosphatidylserin untersucht sind, sind z. B. C1q, einer von drei Bestandteilen (neben

C1r und C1s) des ersten Strukturkomplexes des Komplements. Weitere Kandidaten, die eine

Brückenfunktion bei der Attraktion und Bindung von Phagozyten spielen können, sind iC3b,

β2 Glycoprotein I, Thrombospondin und ICAM-3 (intercellular adhesion molecule-3). Auf

Seiten der phagozytierenden Zelle, sei es ein Makrophage oder eine „normale“ Zelle, sind

z.B. bei C.elegans CED-2, -5, -10 bei dem erforderlichen Umbau des Zytoskeletts zum

Umschließen der apoptotischen Zelle beteiligt. Bei Säugern sind es die homologen Proteine

CrKII, DOCK180 und Rac. Sowohl in der aufnehmenden als auch in der apoptotischen Zelle

sind bei C. elegans CED-7 und bei Mammalia ABC1 bei der Reorganisation der Membran

involviert. Als Erkennungssignal exponiert auch die aufnehmende Zelle Phosphatidylserin.

Normalerweise sekretieren Makrophagen nach Aufnahme von Partikeln in der Größe von

Bakterien Stoffe, die eine proinflammatorische Wirkung haben. Nicht so jedoch bei der

Aufnahme von apoptotischen Zellen. Im Gegenteil: die Sekretion von proinflammatorischen

Proteinen wie TNF-α wird sogar aktiv gehemmt. Dabei kann das antiinflammatorische und

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immunsupressive Cytokin TGF-β1 (transforming growth factor β1) sekretiert werden. Sobald

jedoch apoptotische Zellen zu sekundärer Nekrose übergehen, induzieren sie bei Aufnahme

durch Makrophagen wieder die proinflammatorische Antwort. Eine Fehlfunktion dieser

Inflammationssteuerung kann in Krankheiten münden: bei der Krankheit „Systemische Lupus

Erythematosus“ wird der apoptotische Marker Phosphatidylserin mit anti-Phospholipid

Autoantikörpern „getarnt“. Dadurch wird die Zelle von Makrophagen nicht als apoptotisch

erkannt, und durch Bindung an den Fc-Rezeptor wird eine inflammatorische Antwort mit

Ausschüttung von TNF-alpha ausgelöst. Allerdings kann in Geweben, die umgebaut werden,

von Makrophagen auch das Apoptose auslösende Zytokin CD95 (Apo-1, Fas) abgesondert

werden (Savill, J. und Fadok, V., 2000) (Fadok, V. A. et al., 1992).

Apoptose bei neurodegenerativen Erkrankungen Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen vermutet man eine Beteiligung des Arsenals

von apoptotischen Proteinen. Ob Apoptose den Zelltod verursacht oder ob nur „parallel“ zu

der eigentlichen Todesursache der Zellen Teile des apoptotischen Programms durchgeführt

werden, ist relativ unklar. Im Folgenden werden einige wichtige neurodegenerative

Erkrankungen kurz charakterisiert, bei denen möglicherweise Apoptose eine Rolle spielt.

Amyotrophe Lateralsklerose Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine Krankheit, bei der fortschreitend Motoneurone im

Spinaltrakt und im Hirn degenerieren. In familiären Formen konnten Mutationen im Gen für

SOD-1 (Superoxide dismutase) detektiert werden. Im Mausmodell kann durch Expression

entsprechend mutierter Formen ebenfalls die Degeneration von Motoneuronen induziert

werden. Warum die veränderte Form der SOD-1 toxisch für Neurone ist, ist nicht genau

geklärt. Es bilden sich jedoch aus SOD-1mut intrazelluläre Aggregate, die an entsprechende

Formen bei Alzheimer und Huntington erinnern. Zudem induziert die mutierte Form

oxidativen Streß.

Apoptose wird auch mit ALS in Verbindung gebracht: SOD-1mut induziert in neuronalen

Zellinien Apoptose, was von der zusätzlichen Überexpression von Bcl-2 gehemmt wird.

Sowohl bei Patienten als auch bei SOD-1mut transgenen Mäusen konnte aktivierte Caspase-1

und Caspase-3 in den Spinalganglien nachgewiesen werden. Zudem verlangsamte in den

transgenen Mäusen ein Caspase-1 Inhibitor den Krankheitsverlauf. Caspase-1 kann vor allem

inflammatorische Antworten über die Aktivierung von Interleukin-1 hervorrufen; jedoch ist

auch die proteolytische Aktivierung von Caspase-3 möglich (Yuan, J. und Yankner, B. A.,

2000; Sathasivam, S. et al., 2001).

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Huntington´s Disease Chorea Huntington, eine Krankheit die beim adulten Menschen auftritt, ist durch selektiven

Verlust bestimmter neuronaler Populationen gekennzeichnet. Dabei ist insbesondere das

Striatum betroffen und zwar besonders GABA- und Enekephalin-haltige mittelgroße

Pyramidenzellen; Afferenzen zum Striatum und durchlaufende Fasern bleiben größtenteils

ausgespart (Petersen, A. et al., 2000). Ursache ist eine Mutation im Gen von Huntingtin, die

zu einer erhöhten Anzahl von aufeinanderfolgenden Glutamin-Wiederholungen in diesem

Protein führt. Eine Anzahl von über 40 Glutamin-Wiederholungen -bis 35 Wiederholungen

sind normal- führt unweigerlich zu der auch Veitstanz genannten Krankheit. Die Anzahl der

Wiederholungen bestimmt den Zeitpunkt des Krankheitsbeginns und die Schwere des

Verlaufs. Charakterisiert ist die Krankheit durch schnelle, unwillkürliche Kontraktion

einzelner, wechselnder Muskeln oder Muskelgruppen, durch Sprachstörungen und schließlich

zunehmende Demenz und Tod.

Auch bei dieser Krankheit können sich aus dem mutierten Protein Ablagerungen bilden, die in

diesem Fall jedoch im Zellkern als ubiquitinierte Form vorliegen. Je länger die

Polyglutaminkette ist, desto mehr Huntingtin wird im Kern abgelagert. Man vermutet, daß ein

unzureichender Abbau durch das Proteasom mit verantwortlich für das abgelagerte Protein ist.

Die Aggregation von Proteinen mit verlängerten Polyglutaminketten ist auch in vitro zu

beobachten und führt zu Fibrillen ähnlich den von β-Amyloid gebildeten. In vivo wurde bei

transgenen Mäusen, die Huntingtin mit verlängerter Glutamin-Kette exprimieren,

neurologische Schäden zur gleichen Zeit beobachtet, zu der Ablagerungen in den Zellen

auftraten. Allerdings wurde auch beobachtet, daß die Verhinderung der Ablagerungen

neuronale Apoptose verstärkt. Weitere Untersuchungen zeigen jedoch, daß offensichtlich vor

allem die kleinen Aggregate des mutierten Proteins Apoptose-induzierend sind. Die Apoptose

wird in diesem Fall durch FADD und Caspase-8 vermittelt. Eine Theorie geht von der

Bildung toxischer Fragmente aus Huntingtin durch proteolytische Caspasen-Aktivität aus. Die

Bildung von Huntingtin-Abbauprodukten wird verhindert und Beginn und Fortschreiten der

Krankheit verzögert, wenn ein Breitspektrum-Caspase-Inhibitor verabreicht oder eine

dominant negative Mutante der Caspase-1 vorhanden ist. Obwohl also einige Fakten für eine

Mitwirkung von Apoptose sprechen, ist dies nicht sicher. Die Beobachtung, daß motorische

Störungen bereits bei Patienten auftreten, bei denen noch keine Anzeichen einer Atrophie des

Striatums zu entdecken ist, spricht dagegen. Zudem existieren Mausmodelle, die Symptome

motorischer Störungen zeigen, obwohl keine Apoptose im Hirn nachzuweisen ist. Auch führte

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das Beenden der Expression von mutiertem Huntingtin im Mäuse-Modell zu einer

Verbesserung der Symptome.

Der pathogene Mechanismus von Huntington ist zur Zeit noch ungeklärt. Es werden mehrere

Mechanismen diskutiert: Toxizität durch exzitatorische Übererregung mit Glutamat,

oxidativer Streß durch erhöhte Produktion von Radikalen oder/und erniedrigte antioxidative

Kapazität der Zelle, eine Fehlfunktion der Mitochondrien und schließlich Apoptose. Natürlich

können diese Mechanismen auch zusammenhängen oder sich gegenseitig bedingen (Petersen,

A. et al., 2000; Yuan, J. und Yankner, B. A., 2000; Reddy, P. H. et al., 1999).

Alzheimer´s Disease Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung, in deren Verlauf Neurone in bestimmten

Hirnarealen absterben. Dieser Verlust ist mit Gedächtnisstörungen verbunden. Meist tritt die

Krankheit im Alter und sporadisch, d.h. ohne eine genetische Korrelation auf. Ein geringer

Anteil der Patienten ist jedoch genetisch vorbelastet. Mutationen in den Genen für Presenilin-

1 oder -2 oder APP (Amyloid precursor protein) können dann meist früh einsetzende Formen

von Alzheimer verursachen.

Gekennzeichnet ist die Krankheit durch den Verlust von Synapsen, die Anwesenheit von

Neurofibrillen (NFT, neurofibrilläre tangles) und die Ablagerung von sogenannten senilen

Plaques. Die NFTs bestehen u.a. aus hyperphosphoryliertem mikrotubulärem Tau. Die

Plaques hingegen bestehen aus einem Komplex, der im Kern β-amyloid Protein (Aβ) enthält.

Plaques sind umgeben von aktivierten Mikroglia und Astrozyten. Die Ablagerung von

Plaques erfolgt vor der Formationen von Tau-positiven Filamenten in NFT´s. β-amyloid

entsteht aus dem Protein APP. Dieses wird in zwei Schritten zu A-β prozessiert: zunächst

wird das Amyloid-Vorläufer-Protein durch die β-Sekretase bei Met671 geschnitten, der zweite

Schnitt erfolgt durch die γ-Sekretase am C-terminalen Ende. Dabei entstehen die 40-43 AS

großen Bruchstücke, die dann sekretiert werden und die Plaques bilden. Dabei überwiegt der

Anteil von Aβ-42, welches auch schneller Aggregate ausbildet. Aβ kann oxidativen Streß

induzieren: die Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen (IL-1, IL-6) durch Mikroglia

wird angeregt und deren Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen

species) oder TNF-α kann verstärkt werden. Zusätzlich wird die Bildung von

Wasserstoffperoxid in einer SOD- (super oxide dismutase) bzw. Cu2+/Zn2+- abhängigen

Weise erhöht. Durch die Oxidation von Lipiden kann die Membran der Zelle geschädigt

werden.

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Die Bildung von hyperphosphoryliertem Tau ist eng verbunden mit oxidativem Stress, der

auch durch die Toxizität von Aβ entsteht. Vermittelt wird er durch den MAP-Kinase-Weg und

durch die Aktivierung von NFκB. In vitro wird Tau durch eine Vielzahl von Kinasen

phosphoryliert: CaM-KinaseII, Kasein-Kinase, PKA, ERK2 und GSK3. Ein weiterer

Mechanismus ist die Phosphorylierung von Tau durch die cdk5-Kinase und ihren

neuronenspezifischen Aktivator p35. Zusätzlich kann Calpain, eine Kalzium-aktivierte

Protease, p35 spalten und bewirkt damit die Anreicherung des entstehenden p25. Dieser

Mechanismus ist in kortikalen Neuronen durch Aβ induzierbar. Die Konsequenz aus der

Hyperphosphorylierung von Tau ist die Reduzierung der Fähigkeit, Mikrotubuli zu binden

und beim Zusammenbau zu unterstützen. Daraus resultiert ein destabilisiertes Netzwerk aus

Mikrotubuli, behinderter axonaler Transport und die Bildung von NFT. Der Abbau von

hyperphosphoryliertem Tau durch z.B. Calpain ist ebenfalls gestört. Eine oxidierende

Umgebung trägt neben der Hyperphosphorylierung ebenfalls zur gesteigerten

Selbstaggregation von Tau bei. Aggregiertes Tau wird jedoch schlechter abgebaut als nicht

aggregiertes Tau. Eine oxidierende Umgebung fördert auch die nichtenzymatische

Glykosilierung von Tau, die wiederum negativen Einfluß auf die Mikrotubuli-Bindefähigkeit

von Tau hat. Schließlich wird auch der Abbau von Proteinen durch das Proteasom durch

oxidatives cross-linking behindert. Für viele neurodegenerative Erkrankungen ist eine

Anreicherung von Ubiquitin, dem Abbau-Marker für das Proteasom, beschrieben worden.

In primären neuronalen Kulturen vermag Aβ (25-35) Apoptose auszulösen und Caspase-3 zu

aktivieren (Harada, J. und Sugimoto, M., 1999). In drei verschiedenen Zellkultursystemen –

hippocampale Neurone, Neurone des sympathischen Systems und in PC12-Zellen-

verursachte die Inkubation mit Aβ(1-42) Apoptose, die Caspase-2 vermittelt war. Inhibierung

von Caspase-2 durch den Breitspektrum Caspase-Inhibitor ZVAD-fmk oder durch Antisense-

Oligonukleotide verhinderte den Zelltod. Zellen, in denen Caspase-2 deletiert war, waren

völlig resistent gegen Aβ-induzierten Zelltod (Troy, C. M. et al., 2000; Barinaga, M., 1998a;

Cassarino, D. S. und Bennett, J. P. J., 1999).

Parkinson´s Disease

Parkinson´s Krankheit ist eine der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen des mittleren

und späten Lebensalters. Dabei tritt eine Degeneration von dopaminergen Neuronen in der

pars compacta in der substantia nigra auf. Diese Neuronen projizieren u.a. auf das Striatum

(Neostriatum = nucleus caudatus und putamen). Der Spiegel von Dopamin fällt in den

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betroffenen zwei Kernen der Basalganglien. Neben Muskel-Rigidität sind Tremor und

Bradykinesien die wichtigsten Symptome. Während die Krankheit zuerst von James

Parkinson 1817 entdeckt wurde, beschrieb Lewy 1912 zum ersten mal die typischen

pathologischen Ablagerungen in Gehirnen erkrankter Patienten. Diese werden als Lewy-

bodies bezeichnet und bestehen zu großen Teilen aus α-Synuclein. Neben dem Vorkommen in

Lewy-Körperchen sind auch Mutationen in dem entsprechenden Gen entdeckt worden, die

den Träger für eine familiäre, vererbbare Form der Krankheit prädisponieren. Auch das

Protein Parkin kann bei einer Mutationen oder Deletion eine familiär vererbbare, juvenile und

autosomal-rezessive Parkinson-Krankheit auslösen; allerdings treten bei dieser Variante keine

Lewy-bodies auf. Wenngleich ein Einfluß der genannten Mutationen nicht bestreitbar ist,

scheint der Großteil der Patienten sporadisch zu erkranken. In diesen Fällen werden neben

genetischen vor allem Umwelteinflüsse verantwortlich gemacht. Die Entdeckung des Toxins

MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin), das ein von der idiopathischen

Krankheit nicht unterscheidbares Parkinson-Syndrom hervorruft, hat diese Theorie an Einfluß

gewinnen lassen.

Es gibt auch bei Parkinson einige Hinweise, nach denen Apoptose beim Zelluntergang eine

Rolle spielt. Färbungen mit einer kombinierten Methode zeigten DNA-Fragmentation und

Chromatin-Kondensation in Zellen der betroffenen Areale. In einigen Parkinson-Modellen in

Tieren mit MPTP oder 6-OHDA haben zudem antiapoptotische Substanzen wie neurotrophe

Faktoren (BDNF, bFGF, neurotrophin-3, GDNF) den Verlust von dopaminergen Neuronen

verhindern können (Dunnett, S. B. und Bjorklund, A., 1999). Zudem können Immunophiline

wie FK506 in solchen Tiermodellen ebenfalls neuroprotektiv wirken (Steiner, J. P. et al.,

1997a). Schließlich besteht die Möglichkeit, daß proapoptotische Faktoren aus den

Mitochondrien freigesetzt werden, weil diese bei Parkinson oder zumindest in Parkinson-

Modellen besonders geschädigt werden (Snyder, S. H. et al., 1998a; Gu, W. J. et al., 2000;

Dunnett, S. B. und Bjorklund, A., 1999).

Schlaganfall

Als Schlaganfall bezeichnet man die Unterversorgung von Neuronen mit Blut und damit

Sauerstoff und Glukose im Gehirn. Dabei unterscheidet man zwischen der Verstopfung einer

Arterie, der Ruptur einer Arterie und einer globalen Ischaemie, die z.B. durch einen

Herzstillstand verursacht werden kann. Ungeachtet der Ursache ist die Folge zunächst ein

Funktionsausfall und nach wenigen Minuten das Absterben der betroffenen Zellen. Werden

Zellen nur kurze Zeit unterversorgt oder liegen sie in einem Areal, welches noch teilweise mit

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Blut versorgt wird, so überleben sie zunächst. Das nur teilweise versorgte Gewebe um den

völlig unterversorgten Kern heißt Penumbra. In diesen Zellen tritt Zelltod beim Menschen

noch mehrere Tage lang auf. Inzwischen gibt es Hinweise, daß diese Zellen durch Apoptose

oder eine Mischform aus Apoptose und Nekrose untergehen. Aufgrund des Energiemangels

ist auch nicht mit einer vollständigen Apoptose, die naturgemäß Energie benötigt, zu rechnen.

Daher sprechen einige Autoren auch von Caspase-bedingtem Zelltod. Tatsächlich wurde

festgestellt, daß die DNA-Fragmentationen bei ischaemischen Zellen ein anderes Muster

ergeben als bei normaler Apoptose. Die DNA-Enden zeigen statt glatter Schnitte ein

unregelmäßiges Schnittbild mit zum Teil überstehenden Einzelsträngen. Caspase-Aktivität

konnte jedoch zunächst für Caspase-1 mit Hilfe von Caspase-Inhibitoren gezeigt werden. Da

Caspase-1 jedoch vor allem Entzündungsreaktionen durch Spaltung von Interleukin-1β

induziert, ist dies allein noch kein befriedigender Beweis. Weitere Hinweise kamen durch den

Einsatz von spezifischen Antikörpern gegen aktivierte Caspase-3. Mit diesen Antikörpern

konnte im Tiermodell nachgewiesen werden, daß Caspase-3 nach einer Ischaemie stärker

aktiviert ist als in den Kontrolltieren. Caspase-3 könnte direkt von Caspase-11 aktiviert

werden, da diese Caspase nur bei ischämischen Schädigungen induziert wird (Yuan, J. und

Yankner, B. A., 2000; Charriaut-Marlangue, C. et al., 1996; Johnson Jr., E. M. et al., 1995;

Barinaga, M., 1998b).

Krebs Die oft erhöhte Lebensdauer von Vertebraten und die Regenerationsfähigkeit der Zellen wird

bezahlt mit der größeren Gefahr von Mutationen und damit einer Fehlfunktion der Apoptose.

Durch enges Zusammenspiel von Zellproliferation und Apoptose wird der Gefahr von

Neoplasien vorgebeugt. Proliferierende Zellen, die ein besonderes Krebsrisiko darstellen, sind

auch besonders anfällig für Apoptose. Hier greifen drei unterschiedliche Mechanismen:

Erstens können Onkoproteine wie Myc oder E2FG1 Cytochrom C aus Mitochondrien

freisetzen, das wie oben erwähnt über Aktivierung von Apaf-1/Caspase-9 die apoptotische

Kaskade in Gang setzen kann. Diese Freisetzung von Cytochrom-C wird von

Überlebenssignalen gehemmt, wenn die Zelle sich in der richtigen Umgebung befindet.

Zweitens wird durch wachstumsfördernde Onkoproteine p53 exprimiert, welches einen Status

extremer Sensitivität gegenüber DNA-Schädigung oder zellulärem Streß induziert. Drittens

werden durch die Expression von vielen Onkoproteinen Cadherine herunterreguliert. Dadurch

wird ein Status wie bei Anoikis (Ablösungs-Apoptose) erreicht, bis die betroffene Zelle die

benötigten externen Berührungssignale bekommt (Meier, P. et al., 2000b).

EINLEITUNG 32

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Nachweismethoden für Apoptose Um Apoptose sicher nachweisen zu können, sollten mehrere Verfahren kombiniert werden,

weil keines alleine sicher zwischen programmiertem Zelltod und Nekrose unterscheiden kann.

Da bei Apoptose verschiedene Pfade eingeschlagen werden können, die zum Teil unabhängig

voneinander den Zelltod verursachen können, gibt es „die“ Apoptose nicht, so daß die

einzelnen Verfahren nur Aussagekraft für das jeweils untersuchte Merkmal haben. Die

Verfahren können in verschiedene Bereiche eingeteilt werden:

Nachweis der DNA-Fragmentation Dies ist eine der ältesten Methoden zur Identifizierung von Apoptose. Der Nachweis kann

durch eine Auftrennung der durch Nukleasen in etwa. 180 Basepaare oder ein Vielfaches

davon geschnittenen DNA auf einem Agarose-Gel erfolgen. Die spezifisch nur bei Apoptose

induzierten DNAsen schneiden nur zwischen den Histonkomplexen, also im sog. „Linker-

Bereich“. Wurde in den Zellen „reine“ Apoptose induziert, so kann man auf dem angefärbten

Gel leiterförmig angeordnete Banden erkennen. War hingegen Nekrose die Todesursache der

Zellen, dann erkennt man auf dem Gel einen „Schmier“, d.h. die Größe der DNA-Stücke ist

zufällig, weil die bei Nekrose aktivierten DNAsen an jeder Stelle der DNA schneiden können.

Der Nachteil der Methode ist, daß eine Quantifizierung nicht möglich ist, ebensowenig die

Zuordnung zu einzelnen Zellen. Zudem benötigt man eine recht hohe Menge an Zellmaterial.

Ein relativ neu entwickelter Test umgeht diese Mängel: dabei werden Zellen auf einem

Objektträger in Agarose eingebettet, lysiert und die DNA denaturiert. Danach wird die DNA

direkt auf dem Objektträger elektrophoretisch aufgetrennt und angefärbt. Unter dem

Mikroskop erkennt man Zellen mit geschädigter DNA an einem von der Zelle ausgehenden

„Schweif“. Bei dieser Methode stellt sich die Frage der sicheren Unterscheidung zwischen

Apoptose und Nekrose.

Der Nachweis von geschnittener DNA ist auch durch den Einbau von markiertem dUTP

möglich: Dabei wird an das 3´OH Ende mittels der terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase

(TdT) dUTP ansynthetisiert. Das dUTP ist meist mit Fluorescein markiert und erlaubt über

anti-Fluorescein Antikörper, die enzymgekoppelt sind (z.B. Peroxidase), auch die Detektion

über eine sichtbare Farbreaktion. Dieses Verfahren wird TUNEL-Nachweis (TdT mediated

dUTP Nick-End Labelling) oder ISEL (In situ end labeling) genannt {38}. Ein ähnliches

Verfahren ist ISNT (in situ nick translation). Hier werden allerdings die markierten

Nukleotide durch DNA-Polymerase I in Einzelstrangbrüche eingebaut. Die Detektion erfolgt

EINLEITUNG 33

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in beiden Fällen unter dem Mikroskop oder durch ein FACS-Gerät (Fluorescence assisted cell

sorting). Der Vorteil dieser Methoden ist die Möglichkeit der Apoptose-Bestimmung in

Einzelzellen und damit die Quantifizierung in Kulturen oder Gewebeschnitten. Nachteil ist

die Spezifität: Untersuchungen haben gezeigt, daß auch nekrotische Zellen durch diese

Methoden falsch positiv getestet werden können.

Schließlich ist der Nachweis der zerschnittenen DNA auch durch einen ELISA (Enzyme

Linked Immunosorbent Assay) möglich: Die Fragmente, die bei Apoptose auch noch

Histonkomplexe enthalten und als Nucleosomen bezeichnet werden, werden mit Hilfe von

anti-DNA- und anti-Histon-Antikörpern, die mit Biotin bzw. Peroxidase markiert sind,

nachgewiesen. Der Vorteil ist die Möglichkeit der Quantifizierung und des hohen

Durchsatzes.

Nachweis von Caspase-Aktivität Caspase-Aktivität in Zellysaten kann über die Spaltung eines künstlichen fluorogenen oder

chromogenen Caspase-Substrates nachgewiesen werden: die Zellen werden lysiert und das

Lysat mit dem Substrat versetzt. Das Substrat besteht aus der Erkennungssequenz der

nachzuweisenden Caspase und einem Teil, der bei Abspaltung entweder fluoresziert (z.B.

AFC) oder das Absorptionsspektrum ändert (z.B. pNA). Nachteil ist, daß eine relativ große

Zahl von Zellen benötigt wird und die Substrate teilweise. hoch spezifisch sind. DerVorteil

liegt in der Möglichkeit einer Quantifizierung.

Der Nachweis von Caspaseaktivität ist auch über die Spaltung natürlicher Substrate der

Caspasen möglich: Oft benutzt wird hier die Spaltung von PARP, das z.B. von Caspase-3 zu

Bruchstücken bestimmter Größe geschnitten wird. Die zu untersuchenden Zellen werden

lysiert und der Zellextrakt elektrophoretisch aufgetrennt. Mit spezifischen Antikörpern kann

das Protein -z.B. PARP- auf einem Western-Blot nachgewiesen werden. Nachteil ist hier, daß

viel Zellmaterial benötigt wird und manche Proteine auch von anderen Proteasen (z.B.

Spektrin von Calpain) oder verschiedenen Caspasen geschnitten werden. Zudem ist ein

Western-Blot relativ aufwendig. Alternativ können Caspasen mit spezifischen Antikörpern,

die nur die aktivierten Proteasen erkennen und nicht die Zymogene, direkt in der Zelle oder

mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Schließlich existieren irreversibel bindende,

fluoreszenzmarkierte Inhibitoren. Damit lassen sich in der lebenden Zelle aktive Caspasen

unter dem Mikroskop oder mit einem FACS-Gerät nachweisen.

EINLEITUNG 34

34

Nachweis der Exposition von Phosphatidylserin Ein sehr frühes Merkmal für Apoptose ist die Lokalisation von Phosphatidylserin an der

Membranaußenseite von Zellen. Dieses läßt sich mit markiertem Annexin V nachweisen, da

Annexin V an Phosphatidylserin bindet. Je nach Markierung des Annexin V können die

Zellen unter dem Mikroskop oder in einem FACS-Gerät analysiert werden. Eine

Gegenfärbung mit Propidiumiodid verhindert falsch positive Detektion, da Annexin auch an

tote, nekrotische Zellen bindet. Dieser Nachweis ist an lebenden Zellen möglich und kann

Apoptose in einem sehr frühen Stadium erkennen.

Sonstige Färbemethoden Wenn Depolarisation und die Freisetzung von proapoptotischen Faktoren aus den

Mitochondrien eine Rolle spielen, kann auch dies zum Nachweis der Apoptose verwendet

werden. Die Detektion der Depolarisation von Mitochondrien mit Hilfe von Farbstoffen ist

eine Möglichkeit der extrem frühen Erkennung von Apoptose. Es gibt allerdings einige

Hinweise auf Artefakte, die durch die Verwendung der Farbstoffe entstehen. Eine Färbung

der Zellen mit Propidiumiodid, Acridin-Orange, DAPI oder anderen DNA-Farbstoffen wie

dem Farbstoff Hoechst 33342 läßt die Kondensation des Kerns gut unter dem Mikroskop

erkennnen -ebenfalls ein Hinweis auf Apoptose.

Morphologische Hinweise Elektronenmikroskopisch kann man ebenfalls wichtige Marker für Apoptose erkennen: Die

Bildung apoptotischer Körperchen oder der Zustand von Organellen geben wichtige Hinweise

auf Apoptose oder Nekrose.

In dieser Arbeit wurden zur sicheren Identifizierung von Apoptose folgende Verfahren

angewandt:

Nachweis der DNA-Fragmentation mit einem ELISA-Test

Nachweis von aktivierter Caspase-3

Nachweis von exponiertem Phosphatidylserin mit markiertem Annexin

Das Überleben der Zellen bzw. die Quantifizierung des Zelltodes wurde mit Hilfe folgender

Verfahren bestimmt:

Die Stoffwechselaktivität und damit die Vitalität der Zellen mit einem MTT-Test

EINLEITUNG 35

35

Da das in einigen Versuchen eingesetzte Malonat bzw. Methylmalonat mit der Succinat-

Dehydrogenase genau das Enzym hemmt, welches für die Umsetzung des MTT-Salzes

verantwortlich ist, wurde zusätzlich der LDH-Test eingesetzt:

DieBestimmung der von toten Zellen freigesetzten Laktatdehydrogenase

Apoptose induzierende und hemmende Substanzen

Staurosporin In dieser Arbeit wurden sowohl Substanzen verwandt, die Apoptose induzieren können als

auch Substanzen, die in Modellen Apoptose blockieren können.

Staurosporin ist ein nicht-selektiver, Breitspektrum-Kinaseinhibitor, der unter anderem PKC

hemmt (Wiesner, D. A. und Dawson, G., 1996) aber auch andere Tyrosinkinasen und Serin-

Threonin Kinasen. Es ist ein Alkaloid aus dem Pilz Streptomyces Staurospores (Rasouly, D.

und Lazarovici, P., 1994). Staurosporin wurde in Zellkulturmodellen kortikaler Neuronen der

Maus eingesetzt, um Apoptose zu induzieren (Koh, J. Y. et al., 1995). Daneben hat

Staurosporin auch in sehr vielen anderen Zellen und Zellinien das Potential, programmierten

Zelltod auszulösen, so in MOLT-4, HL-60 (beides humane Leukämie-Zellinien), SUDHL16

und CA46 (Lymphom-Zellinien) , HT-29 (Kolon Karzinom Zellinien), sowie in reifen

Lymphozyten, Linsen-Epithelzellen, mutierten Fibroblasten und Chondrozyten (Bertrand, R.

et al., 1994; Falcieri, E. et al., 1993; Jarvis, W. D. et al., 1994; Lucas, M. et al., 1994; Raff, M.

C. et al., 1994). Ebenso wurde in MCF-7 Zellen, die Caspase-3 defizient sind, Zelltod durch

Staurosporin ausgelöst -interessanterweise ohne die typischen Kennzeichen wie DNA-

Fragmentation. Wurde ein funktionelles Caspase-3 Gen in die Zellen eingeführt, so waren

deutliche Zeichen für einen apoptotischen Zelltod zu entdecken (Janicke, R. U. et al., 1998).

Keane et al. (Keane, R. W. et al., 1997) konnten zeigen, daß Staurosporin in gemischten

Neuronenkulturen sowie in Astrozytenkulturen der Maus Caspase-3-Aktivierung und

Apoptose induziert. Chakravarthy und Walker et al. (chakravarthy, B. R. et al., 1999) konnten

nach der Behandlung von humanen Neuroblastomzellen SH-SY5Y mit Staurosporin ebenfalls

Apoptose und einen Anstieg in Caspase-3-Aktivität beobachten, was auch von McManus und

Posmantur (Posmantur, R. et al., 1997) beobachtet wurde. Apoptose wurde auch in Kulturen

von cerebralen Neuronen aus Hühnern durch Staurosporin ausgelöst (Wiesner, D. A. und

Dawson, G., 1996).

EINLEITUNG 36

36

Malonat / Methylmalonat Malonat ist ein reversibler Inhibitor der Succinat-Dehydrogenase im Komplex II der

Atmungskette in Mitochondrien. In vivo erzeugt eine Malonat-Injektion in das Striatum

Zelltod, dessen Muster zum Teil an den Zelluntergang bei Chorea Huntington und transienter

Ischaemie erinnert (Beal, M. F. et al., 1993; Dutra, J. C. et al., 1993; Greene, J. G. et al., 1993;

Maragos, W. F. et al., 1999; Malcon, C. et al., 2000). Ein anderer Inhibitor der Succinat-

Dehydrogenase, der irreversibel bindet, ist 3-NP (3-Nitropropionic acid). Wird dieser

natürlich vorkommende Inhibitor versehentlich vom Menschen aufgenommen, so läßt sich

ebenfalls eine Degeneration des Striatums und Dystonie beobachten. Im Tiermodell

verursacht eine systemische Gabe die selektive Zerstörung striataler GABAerger Projektionen

in Ratten (Brewer, G. J. et al., 1993) sowie in Primaten Dystonie, Dyskinesie und kognitive

Defekte (Brouillet, E. et al., 1995; Palfi, S. et al., 1996). In transgenen Mäusen, die eine

dominant-negative Mutante von Caspase-1 exprimieren, ist die durch Malonat und 3-NP

induzierte Neurotoxizität im Striatum stark abgeschwächt (Andreassen, O. A. et al., 2000).

Werden retinale oder mesencephale Neuronenkulturen mit Malonat behandelt, tritt ebenfalls

Zelltod ein, der ebenfalls apoptotische Züge trägt (Zeevalk, G. D. et al., 1998a; Zeevalk, G. D.

et al., 1998b).

Methylmalonat wird intrazellulär zu Malonat umgesetzt (McLaughlin, B. A. et al., 1998a). In

vitro konnte man mit Methylmalonat in striatalen sowie kortikalen Neuronen Zelltod mit

überwiegend apoptotischen Charakteristika induzieren. Das Überleben der Zellen konnte mit

Antioxidantien verbessert werden (McLaughlin, B. A. et al., 1998a). Wird Methylmalonat in

die Basalganglien injiziert, ergeben sich die gleichen Läsionen wie mit anderen Succinat-

Dehydrogenase Inhibitoren (Narasimhan, P. et al., 1996). Auch 3-NP kann in vitro Apoptose

induzieren (McLaughlin, B. A. et al., 1998b). Interessant ist auch, daß MCM (Methylmalonyl-

CoA Mutase) Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA umsetzt. Ist diese Umsetzung durch eine

Mutation gestört, so reichert sich Methylmalonat im Körper an; mit der Folge schwerer

metabolischer und neurologischer Abnormalitäten und schnellem Tod der betroffenen

Patienten. MCM wird nach transienter Ischaemie vermehrt exprimiert (Narasimhan, P. et al.,

1996).

Deprenyl Deprenyl (Selegilin) ist ein MAO-B (Monoamin Oxidase) Inhibitor. MAO katalysiert die

Oxidation von Dopamin zu Dihydroxyphenylacetat und H2O2 und ist damit eine Quelle von

Radikalstreß. Tatsächlich konnte gezeigt werden, daß eine Reduktion der Dopaminexposition

EINLEITUNG 37

37

in vivo und vitro auch die Schäden begrenzt, die striatale Neuronen erleiden, wenn sie mit

Glutamat-Agonisten, Succinat-Dehydrogenase Inhibitoren oder Hypoxie/Glukoseentzug

behandelt werden (Maragos, W. F. et al., 1999). Deprenyl könnte also zellulären Radikalstreß

verringern.

Dipyridamol Dipyridamol ist ein Inhibitor von PDE 5 (cGMP phosphodiesterase), hat aufgrund der

Hemmung des Adenosin-Transports in Epithelien vasodilatorische Eigenschaften (Hanson, K.

A. et al., 1998; Denis, D. und Riendeau, D., 1999; Sundaram, M. et al., 1998; Hogan, Y. H. et

al., 1998). Dipyridamol erwies sich beim Entzug von trophischen Faktoren in Kulturen von

hippocampalen oder kortikalen primären Neuronen als neuroprotektiv. Dieser Effekt ist

allerdings eher auf die antioxidativen Eigenschaften von Dipyridamol zurückzuführen. Dies

wurde in Versuchen bestätigt, bei denen die Neuronen entweder mit H2O2 oder FeSO4

inkubiert wurden (Farinelli, S. E. et al., 1998).

Pramipexol Pramipexol ist ein Dopamin-Agonist (mit hoher Affinität und Spezifität zu D2-Rezeptoren

und in dieser Familie vor allem zu D3), der schon zur Behandlung von Parkinson eingesetzt

wird (Mierau, J. et al., 1995). Darüber hinaus hat Pramipexol antioxidative Eigenschaften:

Sowohl in SH-SY5Y-Zellkulturen, die mit dem Komplex I Inhibitor MPP+ (MPTP) behandelt

wurden verhinderte Pramipexol die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies, als auch in in

vivo Modellen mit der Applikation von MPP+ über Mikrodialysesonden in das Striatum.

Zudem verhindert Pramipexol die Öffnung der MPT (Cassarino, D. S. et al., 1998a).

FK506 FK506 (auch Tacrolimus, Prograf (Butcher, S. P. et al., 1997)) ist ein immumsuppressives

Makrolid-Antibiotikum aus dem Pilz Streptomyces tsukabaesis (Kino, T. et al., 1987), das bei

der Immunsuppression etwa 10fach effektiver als CsA (Cyclosporin A) ist (Gold, B. G.,

1997).

Die Wirkung der Immunsuppression beruht auf der Hemmung von frühen, Kalzium-

abhängigen Schritten in der Immunantwort. FK506 kann an die Immunophiline FKBP

(FK506 binding Protein) binden, die eine Familie (12-52 kD) zytosolischer Proteine bilden.

EINLEITUNG 38

38

Eins dieser Proteine, das FKBP12, ist 108 Aminosäuren lang, hoch konserviert und kommt im

Hirn vor allem neuronal vor (Gothel, S. F. und Marahiel, M. A., 1999; Snyder, S. H. et al.,

1998b). Besonders hohe Konzentrationen von FKBP12 wurden im Hippocampus und in

striatonigralen Bahnen gefunden. Allgemein sind die Immunophiline 10-50fach höher in

neuronalem Gewebe als in Zellen des Immunsystems exprimiert sind (Steiner, J. P. et al.,

1997b). FKBP-Proteine besitzen die Eigenschaft einer Rotamase-Aktivität, d.h. einer

Peptidyl-Prolyl-Isomerase Aktivität. Diese scheint jedoch nicht für die immunsuppressive

Wirkung verantwortlich zu sein, da einige Liganden von Immunophilinen, die die Rotamase-

Enzymaktivität unterdrücken, nicht die Immunsuppression verhindern. Die immunsuppressive

Wirkung scheint vielmehr von der Interaktion der Immunophiline, den Inhibitoren und der

Kalzium/Calmodulin aktivierten Phosphoserin/ Phosphothreonin Protein-Phosphatase

Calcineurin abhängig zu sein. Die Bindung des FK506/FKBP-Komplexes an Calcineurin

führt zur verstärkten Phosphorylierung von nNOS (neuronal nitric oxide synthase) und

GAP-43 (Growth associated protein), einem Protein das bei dem Auswachsen von Neuriten

eine Rolle spielt. Da die Phosphorylierung von nNOS die Aktivität von nNOS deutlich

verringert, ist es nicht verwunderlich, daß FK506 ähnlich neuroprotektive Wirkungen hat wie

nNOS-Inhibitoren. FK506 kann beispielsweise neuronale Schäden in Zusammenhang mit

vaskularem Schlaganfall lindern (Sharkey, J. und Butcher, S. P., 1994).

FKBP12 kann auch an den TypI-Rezeptor für TGF-β und FAP48 (FKBP-associated protein)

binden. TGF-β kann durch Bindung an TGF-β-Rezeptor TypII den TGF-β-Rezeptor TypI

aktivieren. Die Bindung von FKBP an den TypI-Rezeptor unterbricht diese TGF-β

Signalkette (Snyder, S. H. et al., 1998b). FKBP12 kann auch mit Ryanodin- oder

Inositol(1,4,5)-Trisphosphat (IP3)-Rezeptoren Komplexe bilden und so die intrazelluläre

Freisetzung von Ca2+ verstärken. FKBP12 wird in Läsionsbereichen, z.B. des Nervus

Sciaticus oder des Nervus facialis, zusammen mit GAP43 (growth associated protein 43kD)

hochreguliert. Behandlung von PC-12 Zellen und sensorischen Ganglienzellen der Ratte oder

des Huhns mit FK506 und einigen FK506 Derivaten führte zu deutlich verstärktem

Auswachsen von Neuriten. Auch die Behandlung von Ratten mit FK506, bei denen der

Nervus Sciaticus verletzt wurde, führte zu einer deutlichen Verbesserung der funktionellen

und morphologischen Symptome (Steiner, J. P. et al., 1997b). FK506 bindet auch an FKBP-

52, das als Hitzeschock-Protein erkannt wurde; zusammen mit HSP-70 (heat schock protein)

und HSP-90 stellt es einen Teil eines Glukokortikoid-Rezeptors dar (Tai, P. K. et al., 1992;

Sanchez, E. R., 1990; Owens-Grillo, J. K. et al., 1995; Perdew, G. H. und Whitelaw, M. L.,

EINLEITUNG 39

39

1991; Lebeau, M. C. et al., 1992). Subkutane Injektion von FK506 erhöht den Level von

HSP-70 im Hirn (Goto, S. und Singer, W., 1994).

Die immunsuppressive Wirkung von FK506 wird über die Hemmung der Phosphatase-

Aktivität von Calcineurin, das normalerweise NF-AT (nuclear factor AT) dephosphoryliert,

erreicht. Dephosphoryliertes NF-AT kann in den Kern gelangen und dort die Expression von

Interleukin-2 (und auch IL-4, gamma Interferon und GM-CSF (granulocyte-makrophage

colony stimulating factor) stimulieren.

FK506 ist interessant, weil die neurotrophen Eigenschaften nicht auf ein bestimmtes

neuronales System wirken wie normale trophische Faktoren, sondern in bisher allen

untersuchten Systemen wirken, vorausgesetzt es handelt sich um geschädigte Neuronen

(Steiner, J. P. et al., 1997c). FK506 kann dazu die Expression der Protoonkogene c-myc und

c-fos hemmen. Zudem kann FK506 die Wirkung von Steroidhormonen verstärken (Gold, B.

G., 1997).

ZVAD-fmk ZVAD-fmk (benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (O-methyl) fluoromethylketone) ist ein nicht-

selektiver Peptid-Inhibitor von Caspase-1 und -3 ähnlichen Proteasen.

ZVAD-fmk vermag in einem MCAO-Modell (middle cerebral artery occlusion) in Mäusen

das Infarkt-Volumen um 40-50% zu senken. Zudem wird das in diesem Modell vorhandene

Schwellen des Hirns unterdrückt. Z-DEVD-fmk unterdrückt das Infarktvolumen im Hirn um

27%. In einem Modell , bei dem cerebelläre Körnerzellen mit Staurosporin behandelt wurden

und daraufhin Apoptose begingen, konnte ZVAD-fmk den Zelltod von ca. 65% auf ca. 20%

nach 48h senken. Über 100µM trat eine toxische Wirkung des Inhibitors ein (Taylor, J. et al.,

1997). Auch in Ratten-Fibroblasten, in denen durch Expression des Adenovirusproteins E1A

oder des proapoptotischen Proteins Bak oder durch Behandlung mit Etoposid Apoptose

ausgelöst werden konnte, unterdrückte Z-VAD-fmk den Zelltod stark (McCarthy, N. J. et al.,

1997).

EINLEITUNG 40

40

Zielsetzung Ziel der Arbeit war es, die Rolle der Apoptose in vitro Modellen neuronaler Degeneration zu

untersuchen.

In vitro Modelle haben den Vorteil, daß im Gegensatz zum Gehirn keine Blut-Hirn-Schranke

existiert und somit eingesetzte Substanzen freien Zugang zu den Zellen haben. Zudem können

Faktoren wie die Wechselwirkung zwischen Astrozyten und Neuronen eliminiert werden.

Aufgrund der einfacheren Verhältnisse lassen sich auch besser Aussagen treffen. Ein weiterer

Vorteil ist die Möglichkeit der Verwendung von Neuronen bestimmter Hirnareale, da

chronische neurodegenerative Erkrankungen oft in bestimmten Hirnarealen auftreten.

Gegenüber akuten Einflüßen wie beim Schlaganfall sind verschiedene Neuronenpopulationen

unterschiedlich empfindlich. Oft basieren in vitro Modelle neuronaler Degeneration auf einer

toxischen Substanz und einer Zellpopulation. In verschiedenen Modellen getestete, potentiell

neuroprotektive oder antiapoptotische Substanzen lassen sich daher in ihrer Wirkung nur

schwer vergleichen.

Daher sollten verschiedene in vitro Modelle für Apoptose und Neurodegeneration etabliert

werden. Nachweismethoden für Apoptose sollten an die Modelle adaptiert und schließlich

potentiell antiapoptotische Substanzen getestet werden.

Ein reines Apoptose-Modell sollte mit dem Toxin Staurosporin aufgebaut werden. Im

Vergleich dazu sollte ein Modell untersucht werden, das eine Mischform von Apoptose und

Nekrose darstellt. In beiden Modellen sollten dann Neurone unterschiedlich empfindlicher

Hirnareale eingesetzt werden. In diesen Modellen sollten dann vergleichend potentiell

neuroprotektive oder antiapoptotische Substanzen getestet werden, die an unterschiedlichen

Stellen in die apoptotische Kaskade eingreifen können. Durch diesen Vergleich sollten

weitere Aussagen auf die involvierten Prozesse beim Zelltod in den Modellen getroffen

werden.

MATERIAL UND ME

MATERIAL UND METHODEN

THODEN 41

41

Material

Chemikalien BSA (Bovines Serum Albumin; Rinder Serum Albumin)

Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Caspase- Inhibitor Z-Val-Ala-Asp (Ome)-FMK (260-039-M005) (Breitband Caspase-Inhibitor)

Alexis Deutschland GmbH, Grünberg

Caspase-3 Inhibitor I, cell permeable (Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala- Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Asp-Glu-Val-Asp-CHO) (235423)

Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden

DABCO Sigma-Aldrich, Deisenhofen Dipyridamol (D9766) Sigma-Aldrich, Steinheim DMSO; Dimethylsulfoxid (34943) Riedel de Haen AG, Seelze Essigsäure, Eisessig Sigma-Aldrich, Deisenhofen Ethanol 70%, technisch Boehringer Ingelheim, Ingelheim Ethanol, absolut Sigma-Aldrich, Deisenhofen Ethrane (Enfluran; 2-Chlor-1,1,2-trifluorethyl(difluormethyl)ether) (122-268-00)

Abbott GmbH, Wiesbaden

Glutamat Serva, Heidelberg Glutamin Serva, Heidelberg Malonat, diNatrium Salz (M-4795) Sigma-Aldrich; Deisenhofen Methylmalonat, freie Säure (151661) ICN Aurora, Ohio, USA Natronlauge, 1 mol/L (22915) Grüssing GmbH, Filsum NGF (Nerve growth factor) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Pramipexol (S)-2-Amino-4,5,6,7-tetrahydro-6-propyl-a benzothiazol-dihydrochlorid monohydrat

Boehringer Ingelheim, chemische Abteilung

Propidiumiodid Riedel de Haen AG, Seelze R(-)Deprenyl Hydrochlorid / Selegiline (M-003) (R(-)-N-alpha-Dimethyl-N-2-propynylbenzeneethanamine hydrochlorid)

Research Biochemicals International, Natick, MA, USA

Staurosporin, Streptomyces sp. (569397) Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden Trichloressigsäure, reinst (27242) Riedel de Haen AG, Seelze Wasserstoffperoxid, 30% (21,676-3) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Alle Chemikalien waren, wenn nicht anders angegeben, von der höchsten erhältlichen Reinheitsstufe.

Zellkultur B-27 serumfreies Supplement (50x) (17504-044)

Life Technologies, Eggenstein

MATERIAL UND METHODEN 42

42

Collagen Typ IV (C5533) Sigma-Aldrich, Deisenhofen DMEM Flüssigmedium, 1g/L Glukose (31885-023)


DMEM, Flüssigmedium, 4,5 g/L Glukose Life Technologies, Eggenstein DPBS, Fertiglösung, steril, ohne Succinat-Dehydrogenase, Magnesium

Bio-Whittaker, Verviers, Belgien

FCS (fetal calf serum; fötales Kälberserum) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Laminin (Lösung 1mg/ml) (aus Membranen von Maus-Sarkoma-Zellen)

Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Neurobasal-MediumTM, 4,5 mg Glukose (21103-049)


Pferdeserum Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Poly-D-Lysin, (Lösung 2mg/ml) Sigma-Aldrich, Deisenhofen RPMI 1640 (31870025) Life Technologies, Eggenstein Trypsin 0,05 % , EDTA 0,02%, Fertiglösung Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Verbrauchsmaterial 24 Loch Zellkulturplatten, Poly-D-Lysin beschichtet (Biocoat PDL) (35 6414)

Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg

24 Loch Zellkulturplatten, Primaria (35 3872) Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg 96 Loch Zellkulturplatten, Poly-D-Lysin beschichtet (Biocoat PDL) (356461)

Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg

96 Loch Zellkulturplatten, Primaria (353872) Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg Deckgläschen, 12mm (DKR1) Gesellschaft f. Laborbedarf mbH, Würzburg Einwegpipetten 1,5 und 10 ml Saarstedt, Heidelberg Einwegpipetten 25 ml Greiner-Labortechnik, Frickenhausen Einwegspritzen Ecoject 10ml Dispomed Witt OHG, Gelnhausen Einwegspritzenfilter, 0,2 µm Schleicher&Schüll, Dassel Objektträger, geschliffen (H870.1) Carl Roth GmbH&Co KG, Karlsruhe Pasteurpipetten, Glas (E-1097) neoLab Migge Laborbedarfs-Vertriebs

GmbH, Heidelberg Zellkulturflaschen, 75 cm2 Saarstedt, Heidelberg Zentrifugenröhrchen, 15 und 50 ml Greiner Labortechnik, Frickenhausen

Kits Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (PF 032)

Calbiochem (Oncogene)

Caspase-3 Cellular Activity Assay Kit (235419)

Calbiochem

Cell Death Detection ELISA plus Kit (1 774 425)

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Cell Titer 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (G4100)

Promega, Madison, WI, USA

LDH Cytotoxicity Detection Kit (MK401) Takara Shuzo Co., Ltd, Japan


43

Geräte Mikroskop, inverses Forschungsmikroskop IMT-2

Olympus Optical Co.Hamburg

Fluoreszenzlampe/Zubehör IMT-2-RFL Olympus Optical Co.Hamburg Fluoreszenzfilter Olympus Optical Co.Hamburg Farb-Videokamera Sony DXC-9100P Olympus Optical Co.Hamburg Adapter CMA-D2 Olympus Optical Co.Hamburg Remote control unit RM C950 Olympus Optical Co.Hamburg Software AnalySIS 3.0 Soft Imaging Systems GmbH, Münster,

Deutschland Mikroskop, invers, CK40 Olympus Optical Co.Hamburg Fluoreszenzmodul Blau (32067) Olympus Optical Co.Hamburg Fluoreszenzmodul Grün (32068) Olympus Optical Co.Hamburg Zentrifuge, BHG Hermle Z320 Berthold Hermle Labortechnik GmbH,

Gosheim Rotor 220.72 V01 (Röhrchen) Berthold Hermle Labortechnik GmbH,

Gosheim Rotor 220.50 V01 (Platten) Berthold Hermle Labortechnik GmbH,

Gosheim pH-Meter 761 Calimatic Knick elektronische Messgeräte GmbH & Co,

Berlin Eppendorf Thermomixer 5436 (E-5095) Merck Eurolab GmbH, Frankfurt Horizontal-Gelkammer BioMax (MP1015) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Tischzentrifuge B Braun Melsungen, Melsungen Schüttler, Certomat U (886312/1) B Braun Melsungen, Melsungen Wärmegerät, Certomat H (886342) B Braun Melsungen, Melsungen Tischzentrifuge Biofuge A Zählkammer „Neubauer improved“(631F1120)

Merck Eurolab GmbH, Frankfurt

Reinraumwerkbank horizontal, HF-48 (83 851 48)

Gelair Flow Laboratories, Meckenheim

Reinraumwerkbank vertikal, Herasafe HS18 (51012285)

Heraeus, Hanau (Kendro)

Wasserbad 3047 Köttermann, Uetze-Hänigsen Plattenphotometer, Uvmax kinetic microplate reader

Gesellschaft für angewandte Biotechnologie, Ebersberg

Plattenwascher, microplate washer Gesellschaft für angewandte Biotechnologie, Ebersberg

Software Das Plattenphotometer wurde mit der Software Softmax für Windows 2.3 (Gesellschaft für

angewandte Biotechnologie, Ebersberg ) betrieben. Auswertungen wurden mit Excel 97 SR-2

(Microsoft) durchgeführt. Die Graphiken und der t-Test wurden mit Sigmaplot 5.0 (Jandel

Scientific) angefertigt bzw. berechnet. Die Software AnalySIS 3.0 (Soft Imaging Systems


44

GmbH, Münster) wurde benutzt, um die Fluoreszenzbilder aufzunehmen, zu bearbeiten und

zu verwalten.

Methoden

Zellkultur Um den Neuronenkulturen ein optimales Wachstum zu ermöglichen, wurde das Medium für

die Neuronen mit Astrozytenkulturen konditioniert. Diese Methode ermöglicht eine serum-

und nahezu gliazellenfreie Neuronenkultur. Die Präparation und Kultivierung erfolgte im

wesentlichen wie von Stichel und Müller (1991) (Stichel, C. C. und Muller, H. W., 1991)

beschrieben. Ein bis drei Tage alte Rattenjungtiere wurden in einem Glasgefäß mit einer

Überdosis Ethrane® (Wirkstoff Enfluran) betäubt und anschließend in einem Glasgefäß mit 70

%igem technischen Ethanol desinfiziert. Der Kopf wurde dekapitiert und die Haut nach

Durchtrennung der Anwachspunkte der Ohren entfernt. Vom Rückenmarkskanal aus wurden

mit einer spitzen Schere drei Schnitte in die Hirnschale gesetzt: medial bis kurz vor den

Augen; lateral ca. 1 cm auf Maulhöhe. Die Kapsel wurde entfernt und das Hirn in eine flache

Petrischale zur weiteren Präparation befördert. Durch beträufeln mit DMEM wurde das Hirn

feucht gehalten. Die Innenseite des Kortex wurde von Hirnhaut befreit. Die beiden

Kortexhälften wurden abgetrennt und gedreht. Nach dem Entfernen der Haut auf der nun oben

liegenden Seite konnten die Hirnhälften in DMEM gesammelt werden. Nach Präparation aller

Hirne (maximal 1h) wurde das DMEM abdekantiert und die Hirne in ca. 3 ml DMEM mit

sukzessiv enger geschmolzenen Pipetten trituiert. Die Suspension wurde mit DMEM auf 50

ml aufgefüllt und für 5 min zentrifugiert (350 g; RT). Der Überstand wurde verworfen und

das Pellet in ca. 1 ml DMEM + 10 % FCS pro Hirn resuspendiert. Jeweils 1 ml Suspension

und ca. 15 - 18 ml DMEM + 10 % FCS wurden in 75 cm2 Kulturflaschen bei 37°C und 10 %

CO2 kultiviert. Das Medium wurde alle 3-4 Tage ausgetauscht.

Astrozytenkonditioniertes Medium

Nachdem die Zellen zu einem konfluenten Zellrasen gewachsen waren, was normalerweise

am Tag 14 nach der Präparation der Fall war, wurden die Astrozytenkulturflaschen über

Nacht bei 37°C geschüttelt (120 x min-1 ). Die Astrozyten wurden am nächsten Tag drei mal

mit ca. 20 ml DPBS kurz gewaschen, um das restliche Serum zu entfernen. Anschließend

wurden sie mit 35 ml B27/NB mit 0,5 mmol/l Glutamin (200 mM Stammlösung;


45

Aufbewahrung –20°C) beschickt. Das durch die Astrozyten konditionierte Medium wurde

nach drei Tagen abgenommen und entweder kurzzeitig (bis max. 1 Woche) bei 5°C

aufbewahrt oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt. Die Zellen

wurden für maximal 5 weitere Konditionierungen benutzt.

Beschichtung der Wachstumsfläche für Kortexneuronen und Striatumneuronen

Zur besseren Anheftung der Zellen wurden die Löcher der Kulturplatten mit oder ohne

Deckgläschen wie folgt beschichtet: die Platten wurden mit 0,2 mg/ml Poly-D-Lysin in

destilliertem Wasser 15 min bei RT inkubiert (96 Loch-Platten: 50 µl/Loch; 24 Loch-Platten:

500 µl/Loch) und anschließend drei mal mit destilliertem Wasser gewaschen (100 µl/Loch

bzw. 1 ml/Loch). Nach dem Trocknen der Platten konnten sie bis zu 7 Tage bei 4°C

aufbewahrt werden. Für die Versuche mit Methylmalonat und Malonat wurden mit Poly-D-

Lysin vorbeschichtete, kommerziell erhältliche Platten benutzt. Ein Vergleich der Anheftung,

Vitalität und Morphologie ergab keine Unterschiede zu selbstbeschichteten Platten.

Selbstbeschichtete und fertig beschichtete Platten wurden am Präparationstag mit 2 µg/ml

Laminin in PBS für 1h bei 37°C (96 Loch-Platten 50 µl/Loch; 24 Loch-Platten 500 µl/Loch)

beschichtet. Die Platten wurden danach zweimal mit DMEM gewaschen. Um ein

Austrocknen der Beschichtung zu verhindern, wurden pro Loch 60 µl (96 Loch-Platte) oder

500 µl (24 Loch-Platte) konditioniertes NB (Neurobasal-Medium) eingefüllt und die Platten

bis zur Aussat der Zellen bei 37°C im Brutschrank aufbewahrt.

Präparation und Kultivierung von Kortex- und Striatumneuronen

Die Präparation der Kortexhälften erfolgte im wesentlichen wie von Banker und Cowan

(1977) beschrieben. Die Kultivierung erfolgte in Anlehnung an die Veröffentlichung von

Stichel und Müller (1991). Wichtige Unterschiede waren zum einen die Benutzung von Ara-C

als Mitosehemmer für Gliazellen und zum anderen der Austausch von konditioniertem N2-

Medium mit DMEM als Grundmedium gegen konditioniertes B27-Medium mit Neurobasal

als Grundmedium (Brewer, G. J. et al., 1993). Eine 16-17 Tage vorher gedeckte Ratte (Stamm

Wistar, 12 h Hell-Dunkel Rhythmus, Futter und Wasser ad libitum, Quelle Dr. Karl Thomae

GmbH, Biberach) wurde mit einer Überdosis Ethrane® (Wirkstoff: Enfluran) getötet und die


46

Bauchdecke mit 70 %igem technischen Ethanol desinfiziert. Das Bauchfell wurde mit einer

Schere medial aufgeschnitten und zur Seite geklappt. Anschließend wurde die freigelegte

Bauchdecke mit 70 %igem technischen Ethanol desinfiziert und ebenfalls geöffnet. Die

Fruchtblase wurde entnommen und in einer Petrischale aufbewahrt. Alle weiteren Schritte der

Präparation erfolgten in der Sterilbank. Das in 70 %igem technischen Ethanol stehende

Präparationsbesteck wurde vor der Benutzung jeweils 2 x in PBS und 1 x in DMEM getaucht.

Die Embryonen wurden einzeln der Fruchtblase entnommen, der Kopf dekapitiert und in einer

Petrischale der Kortex herauspräpariert. Dazu wurde die Kopfhaut und die Schädelkapsel mit

zwei spitzen Pinzetten entfernt. Dann wurde das Hirn mit einem flachen Spatel entnommen.

Mit der dorsalen Seite oben liegend wurde das Hirn im Kortex-Bereich medial durchtrennt

und die Kortexhälften aufgeklappt. Die Hirnhaut über den Kortexhälften wurde mit spitzen

Pinzetten entfernt. Anschließend wurden die Kortexhälften abgetrennt und die Hirnhaut auch

auf der anderen Seite entfernt. Für Striatum-Kulturen wurde der Bereich des Striatums

entnommen. Die Hirnhälften bzw. das Striatum-Gewebe wurden in DMEM (4°C) gesammelt.

Nach Präparationende (max. 1 h) wurden die gesammelten Hirnstücke zentrifugiert (5 min;

350 g; RT). Das Pellet wurde für 8 min mit 10 ml Trypsin/EDTA-Lösung (die Originallösung

mit ca. 5 U/ml wurde 1:250 in DPBS verdünnt) bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch

Absaugen der Trypsinlösung und Zugabe von 10 ml DMEM mit 10% FCS abgestoppt.

Anschließend wurde zentrifugiert (5 min; 350 g; RT) und das Pellet durch zweimaliges kurzes

Waschen mit 10 ml DMEM von Serumresten befreit. In 1-2 ml NB/B27 (49 : 1) mit 2 mmol/l

Glutamin wurden das Gewebe mit sukzessiv enger geschmolzenen Pipetten trituiert. Die

Zellzahl der Suspension wurde in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Suspension

wurde dann für Toxizitätsversuche in einer Aussaatdichte von 110.000 Zellen/cm2

(Kortexneuronen) oder 160.000 Zellen/cm2 auf die 96-Loch-Kulturplatten in ein Endvolumen

von 120µl ausgesät. Die Einsaat für 24-Loch-Platten war für Caspase-3 Bestimmungen

entsprechend: Kortexneuronen 220.000 Zellen/cm2 und Striatumneuronen 310.000

Zellen/cm2. Für Immunfluoreszenzfärbungen wurden 30.000 Kortexneuronen/cm2 oder

60.000 Striatumneuronen/cm2 in 24-Loch-Platten mit Deckgläschen eingesät. Das

Endvolumen für 24-Loch-Platten war 900µl/Loch. Bei 96-Loch-Platten wurden die äußeren

Löcher mit 200µl destilliertem sterilen Wasser als Verdunstungsschutz befüllt. Die

Kultivierung erfolgte bei 37°C und 10 % CO2 . Am nächsten Tag wurde Ara-C (in NB) in

einer Endkonzentration von 5 µM dazugeben (96 Loch-Platten: 13µl/Loch; 24 Loch-Platten:

95µl/Loch). Nach drei Tagen wurde das Medium durch konditioniertes B27/NB-Medium

ersetzt (96 Loch-Platten: 80 µl/Loch; 24 Loch-Platten: 500 µl/Loch). Die Neuronen wurden


47

alle 3-4 Tage durch Austausch von 2/3 des Mediums gefüttert. Am Tag 13 oder 14 nach der

Präparation wurden Versuche oder Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt.

Kultivierung und Differenzierung von PC12-Zellen PC12-Zellen (Phaeochromocytoma-Zellen) wurden in einer Mischung aus 85% RPMI-

Medium, 10% Pferdeserum und 5% FCS (fetales Kälberserum) kultiviert. Die Aussaat betrug

nach der wöchentlich durchgeführten Subkultivierung 2-5x104 Zellen/cm2. Jeweils 2/3 des

Mediums wurde 3x wöchentlich gegen frisches Medium ausgetauscht. Die Kultivierung

erfolgte in mit Collagen beschichteten Schalen oder Kulturflaschen. Dazu wurden Flaschen

oder Schalen bei 37°C für mindestens 4h mit einer Lösung von Collagen in 0,25%iger

Essigsäure (5mg Collagen in 10ml 0,25%iger Essigsäure) inkubiert und der Rest der Lösung

abgesaugt. Die Beschichtung erfolgte mit 10µg/cm2 Collagen.

Die Differenzierung erfolgte in 96-Loch-Platten, die mit Collagenlösung (10µg/cm2)

beschichtet wurden. Die undifferenzierten Zellen wurden vom Flaschenboden abgeschabt,

Zellklumpen durch Trituieren aufgelöst und die Zellsuspension auf 50ml aufgefüllt und für

10 min bei 350g zentrifugiert. Von der resuspendierten Suspension wurden 5000 Zellen /Loch

in ein Endvolumen von 120 µl ausgesät (15600 Zellen/cm2). Das Differenzierungsmedium

bestand aus RPMI mit 1% Pferdeserum und 50 ng/ml (2 nM) NGF. Die Zellen wurden unter

dreimaligem Mediumwechsel (2/3) für 13-14d weiterkultiviert und differenziert.

Neurodegenerationsmodelle

Bei allen Neurodegenerationsmodellen wurde zunächst das gesamte Medium abgenommen

und anschließend jeweils 100 µl (96-Loch Platten) oder 500 µl (24-Loch Platten)

konditioniertes Medium (37°C) auf die Zellen pipettiert. Dieses Medium enthielt die

entsprechenden toxischen Substanzen und Inhibitoren, entweder direkt im Medium gelöst und

sterilfiltriert, oder als Stammlösung in DMSO gelöst und direkt zum Medium zugegeben. Die

Platten wurden dann für weitere 24h im Brutschrank belassen. Bei Substanzen, die weniger

als 24h auf den Zellen belassen wurden, wurde nach dem entsprechenden Zeitpunkt das

Medium abgenommen und 100µl (96-Loch Platten) oder 500µl (24-Loch Platten)

konditioniertes Medium zugegeben.


48

MTT-Test

Um das Überleben der Neuronen quantifizieren zu können, wurde ein kolorimetrischer Test

benutzt, wie er von Mosmann (1983) beschrieben wurde. Dazu wird ein gelbes

Tetrazoliumsalz (MTT) zu den Zellen gegeben, welches durch die Dehydrogenase der

Mitochondrien lebender Zellen in ein blaues Formazan-Derivat umgewandelt wird. Die

Menge des gebildeten blauen Farbstoffes kann dann photometrisch bestimmt werden.

4h vor Versuchsende (d.h. Inkubation mit Noxen/Inhibitoren) wurden 15µl MTT-Lösung

(CellTiter 96TM Testkit) / 100 µl Medium hinzugegeben. Nach weiteren 4 h Kultivierung

wurde dem Medium pro Loch 100 µl einer sauren Isopropanol/Detergenz-Mischung

(CellTiter 96TM Testkit) zugegeben, um Zellen und wasserunlösliche Formazan-Kristalle

aufzulösen. Die Platten wurden dann für 24 h im Dunkeln bei RT aufbewahrt. Danach konnte

die Menge des gebildeten Farbstoffes bei 570 nm photometrisch im Plattenleser bestimmt

werden. Jeweils mindestens drei gleich behandelte Löcher wurden zu einem Wert gemittelt.

Der Wert der Reihe ohne Zelleinsaat wurde als Blindwert von den anderen Werten

abgezogen. Die Werte der äußeren Löcher wurden wegen stärkerer Schwankungen nicht

berücksichtigt.

Laktat-Dehydrogenase-Test Da das in einigen Versuchen eingesetzte Malonat bzw. Methylmalonat mit der Succinat-

Dehydrogenase genau das Enzym hemmt, welches für die Umsetzung des MTT-Salzes

verantwortlich ist, wurde zusätzlich der LDH-Test eingesetzt. Die Aktivität von

Laktatdehydrogenase, die von geschädigten/toten Zellen freigesetzt wird, wird anhand der

Umsetzung von Laktat zu Pyruvat gemessen. Bei dieser Reaktion wird NAD+ reduziert.

Diaphorase wiederum kann ein gelbes Tetrazoliumsalz unter Verbrauch des NADH+H+ zu

einem roten Formazansalz reduzieren, dessen gebildete Menge dann schließlich quantifiziert

wird.

Zur Bestimmung des Zelltodes anhand der Membranpermeabilität wurde der „LDH-activity-

assay“-Kit von Takara benutzt.

Direkt nach Versuchsende wurde von den auf 96 Loch-Platten eingesäten Zellen jeweils

100µl Zellkulturüberstand abgenommen, zusammengehörige Überstände gepoolt und 100µl

in einer Mikrotiterplatte mit 100µl einer Lösung die NAD+, Diaphorase und

Iodtetrazoliumchlorid (INT) enthielt, versetzt. Nach 30 und 60 min lichtgeschützter


49

Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Absorption bei 490-690 nm im Plattenlesegerät

gemessen. Als Positivkontrolle diente das Medium von Zellen, die 4h vor Versuchsende mit

Triton X-100 (Endkonzentration 1% Triton im Medium) behandelt wurden. Triton X-100

bewirkt eine nahezu 100%ige Freisetzung der gesamten LDH der Zellen.

DNA-Fragmentation (ELISA)

Zur Bestimmung der DNA-Fragmentation wurde das „Cell Death Detection ELISA Plus Kit“

von Roche benutzt.

Dazu wurde das Medium vorsichtig von den Zellen abgehoben, 100 µl Lysepuffer/Loch auf

die Zellen pipettiert, die Zellen im Lysepuffer resuspendiert und durch auf- und abpipettieren

lysiert. Die Mikrotiter-Platte wurde zentrifugiert (10 min; 200 x g) und 20µl des Überstandes

zusammen mit 80 µl Immuno-Mix (4µl Anti-Histon biotinmarkiert; 4 µl Anti-DNA

Peroxidase konjugiert; 78 µl Inkubationspuffer) in ein Loch der Streptavidin-beschichteten

Testplatte pipettiert. Nach 2h Inkubation in einem Schüttler (100 x min-1) wurde jedes Loch

der Platte 3 mal mit 250 µl Inkubationspuffer gespült und dann für 20 min mit 100 µl

Peroxidase-Substrat inkubiert. Die Messung der Absorption erfolgte bei 405 nm.

Caspase-3 Test

Benutzt wurde hierfür der „Caspase-3 Cellular Activity Assay Kit“ von Calbiochem.

Zur Bestimmung der Caspase-3 Aktivität wurden die Zellen behandelt wie bei den anderen

Tests, allerdings wurden die Neuronen in 24-Loch Platten ausgesät. Nach dem

entsprechenden Zeitpukt der Einwirkung von Neurotoxinen/Inhibitoren wurde das Medium

abgenommen und 200µl eiskalten PBS auf die Zellen pipettiert. Die folgenden Schritte

wurden bei 0°C durchgeführt. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber vorsichtig

abgeschabt und die Zellsuspension aus sechs Löchern gepoolt. Nach einem

Zentrifugationssschritt (5min; 4°C; 13.000/min = 12500g) wurde das Zellpellet in 30µl

Lysepuffer (50mM Hepes; 1mM Dithiotreitol; 100 µM EDTA; 0,1%CHAPS; pH 7,4)

aufgenommen und die Zellen durch auf- und abpipettieren gelöst. Nach 30 min Inkubation auf

Eis wurden eventuell vorhandene Zelltrümmer abzentrifugiert (10min; 4°C; 11.000/min =

1000 x g). 10µl des Überstandes wurden mit 80 µl Testpuffer (100 mm NaCl; 50mM Hepes;


50

10 mM Dithiotreitol; 1 mM EDTA; 10% Glycerin ; 0,1% CHAPS; pH 7,4) in einer

½ Volumen-Mikrotiterplatte (96 Löcher) gemischt, auf 37°C erwärmt und die Reaktion durch

Zugabe von 10µl Substrat (Caspase Substrat I; Ac-DEVD-pNA) gestartet. Die weitere

Inkubation erfolgte bei 37°C; nach den angegebenen Zeiten wurde die Absorption bei 405 nm

gemessen. Als Positivkontrolle diente rekombinante humane Caspase-3 (30 Units/Loch), und

die Spezifität der Spaltung wurde durch Zugabe von Caspase-3 Inhibitor I (Ac-DEVD-CHO;

0,1µmol/L Endkonzentration; Stammlösung 100 µmol/L in DMSO) bestätigt.

Proteinbestimmung

Der Überstand, der im Caspase-3 Test verwendet wurde, wurde turbidometrisch auf seinen

Proteingehalt untersucht, um die Caspase-Aktivitätswerte auf den Proteingehalt der Proben

beziehen zu können: 10µl der Probe wurden mit 140µl destilliertem Wasser in einer

Mikrotiterplatte gemischt, auf 4°C gekühlt und mit 100µl Trichloressigsäure versetzt. Nach

10-30 min wurde die Absorption bei 570 nm gemessen und die Werte anhand einer mit BSA

(Bovine Serum Albumin) erstellten Eichskala rechnerisch ermittelt (Karlsson, J. O. et al.,

1994).

Annexin-Phosphatidylserin Färbung

Zur Annexin-Färbung wurde ein Kit von Calbiochem (Annexin V-FITC Apoptosis Detection

Kit) benutzt.

Zur Anfärbung mit Annexin wurde zum entsprechenden Zeitpunkt (meist 16h) direkt in das

Kulturmedium (auf 300µl reduziert) eine Mischung aus 100 µl Bindepuffer (10mM Hepes pH

7,4; 150 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2 , 1mM MgCl2; 4% BSA), 100µl Propidiumiodidlösung

(30µg/ml in PBS) und 20µl Annexin-V-FITC Lösung (200µg/ml rekombinanates AnnexinV

in 50mM Tris pH 7,4; 0,1 M NaCl; 1% BSA; 0,02%NaN3) gegeben. Nach einer

Inkubationszeit von 15 min wurden die Deckgläschen mit den Zellen dem Medium

entnommen, in Bindepuffer gespült und direkt auf einem Objektträger in 3µl DABCO-Lösung

(1g/50ml PBS) eingebettet. Die Aufnahmen erfolgten unmittelbar danach mit Phasenkontrast

bzw. unter UV-Anregung mit Filtersets für Grünanregung.


51

Statistische Berechnungen Für sämtliche Versuche, bei denen quantitative Bestimmungen durchgeführt wurden (MTT-

Test, DNA-Fragmentations-Test, LDH-Test), wurde die Signifikanz der Ergebnisse mit Hilfe

des Computerprogramms Sigmaplot 5.0 (Jandel Scientific) berechnet. Benutzt wurde der

ungepaarte Student´s t-Test. Die Signifikanz-Grenzen wurden bei P-Werten <0,05 (**) sowie

P<0,01 (**) festgelegt. Berechnet wurden immer die Signifikanz zwischen Kontrollwerten

und Werten die die Behandlung mit Noxen darstellen. Zudem wurde die Signifikanz zwischen

Werten noxenbehandelter Zellen und Werten von Zellen, die mit Noxen plus potentiell

neuroprotektiven/antiapoptotischen Substanzen behandelt wurden, berechnet.

ERGEBNISSE 52

ERGEBNISSE

Staurosporin-Modell

Zunächst wurde ein sicher Apoptose-auslösendes Modell auf die benutzten Zellkultursysteme

übertragen. Anhand dieses Modells konnten die verschiedenen Verfahren zum Nachweis von

Apoptose auf ihre Tauglichkeit bewertet und angepaßt werden.

Benutzt wurden in dieser Phase der Arbeit zwei Zellkultursysteme: zum einen PC12 Zellen,

einer Tumor-Zellinie aus dem Mark der Nebenniere von Ratten, die nach Inkubation mit NGF

neuronenähnliche Eigenschaften, z.B. Ausbildung von Ausläufern, zeigt. Zum anderen

wurden primäre Neuronenkulturen aus dem Kortex der Ratte benutzt, die den Vorteil haben,

daß anders als bei vielen immortalisierten Zellinien die Apoptose-Mechanismen intakt sind.

Der Nachteil ergibt sich aus der Präparation der Primärkulturen, die viele Apoptose- und

Nekrose-induzierende Reize beinhaltet und daher sehr sorgfältig ausgeführt werden muß, um

diese Reize klein zu halten.

Staurosporin wird häufig zur Auslösung von Apoptose in in vitro- und in vivo-Modellen

benutzt. Auch bei verschiedenen neuronalen Zellen induziert Staurosporin programmierten

Zelltod; unter anderem konnte dies auch bei Kortexneuronen gezeigt werden. Die Ergebnisse

der Versuche mit Kortexneuronen dieser Arbeit bestätigen solche Literaturangaben: die

Zellen zeigen sowohl eine deutliche Zunahme der DNA-Fragmentation als auch eine

Abnahme der MTT-Reduktion. Beide Effekte treten dosisabhängig auf. Der EC50-Wert für

Staurosporin beim MTT-Test beträgt ca. 50 nmol/L (Abbildung Nr. 1).

52

ERGEBNISSE 53

Abzei∗P

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

Auch bei

Aktivität.

den folgen

Nr. 2).

AbSta

Schließlic

sich Phos

von Apop

Merkmal

A

bildung 1: 14d alte Kortexneuronen nach Behandgt die Fähigkeit der Zellen zur MTT-Reduktion; b)< 0,05

Staurosporin[µmol/L]

Kontro

lle 0,01 0,1 1

n = 6SE

*

*

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

300

der Bestimmung der Caspase-3 Aktivität ze

Aufgrund von Literaturangaben und der Best

den Versuchen die Konzentration von 1µmol/

bildung 2: 14d alte Kortexneuronen der Ratteurosporin behandelt und die Caspase-3 Aktivität b

Kontrolle Stauro 1µM

Cas

p-3

Aktiv

ität [

willk

. Ein

heite

n]

0

1

2

3

n = 5SEM

**

h wurden die Staurosporin-behandelten Korte

phatidylserin in der Außenseite der Zellmembr

tose gilt. Als eines der ersten bestimmbaren

schon nach ca. 6h beobachtet werden (Abbildu

53

B

lung mit Staurosporin für 24h. a) stellt die DNA-Fragmentation dar


Kontro

lle 0,01 0,1 1

n = 5SE

*

*

igt sich eine deutliche Zunahme der

ätigung durch Vorversuche wurde in

L Staurosporin verwandt (Abbildung

wurden für 20h mit 1µmol/L estimmt. ∗∗P< 0,01

xneuronen daraufhin untersucht, ob

an befindet, was als sicheres Zeichen

Zeichen von Apoptose konnte dieses

ng Nr. 3).

ERGEBNISSE 54

A B

Abbildung 3: 14d alte Kortexneuronen, die 6h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt wurden. Anschließend erfolgte die Detektion von Phosphatidylserin mit FITC-markiertem Annexin V. a) Kontrolle b) Staurosporin 1µM; Pfeile: apoptotische Zellen. Jeweils links Fluoreszenzanregung mit 375-495 nm und rechts Phasenkontrast-darstellung

In weiteren Versuchen wurden auch 7d alte Kortexneuronen untersucht, da in der Literatur

auf eine erhöhte Apoptose-Neigung jüngerer Neuronen hingewiesen wurde. Dies konnte in

dem benutzten Zellkultursystem ebenfalls beobachtet werden (Abbildung Nr. 4).

Abbildung 4: 7d alte Kortexneuronen nach BehandluFähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentat


Kontro

lle 0,01

0,10

1,00

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

140n = 5SE

0,0006*

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

300

350

n =MW

A

Schließlich wurde untersucht, ob eine längere Behan

Konzentrationen von Staurosporin die Induktion von Ap

eine Dosis von 0,01µM Staurosporin auch nach 48h kein

54

B

ng über 24h mit Stausosporin. a) ion. ∗P< 0,05


Kontro

lle 0.01

0.10

1.00

1-2

dlung über 48h mit verschiedenen

optose verstärkt. Hier zeigt sich, daß

e nennenswerte DNA-Fragmentation

ERGEBNISSE 55

hervorruft. Andererseits reduziert sich der meßbare Anteil an fragmentierter DNA bei hohen

Konzentrationen von Staurosporin (Abbildung Nr. 5).

Abbildung 5: 14d alte Kortexneuronen, die 48h mit verschiedenen Konzentrationen von Staurosporin behandelt wurden. a) Fähigkeit zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation. ∗∗P< 0,01

A


Kontrolle 0.010.10

1.0010.00

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

n = 2-6MW **

**

Staurosporin [µmol/L]Kontrolle 0,01 0,1 1 10

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 3-7SE

**

**** **

B

Da die Benutzung von 7d alten Kortexneuronen oder eine Behandlung mit Staurosporin

länger als 24h keine Vorteile für ein Apoptose-Modell aufwies, wurde als Standardalter für

Kulturen 14d und als Standardkonzentration 1µmol/L Staurosporin für zukünftige MTT- und

DNA-Fragmentationsversuche festgelegt.

Unter den gleichen Bedingungen wurden PC12-Zellen untersucht. Eine Behandlung mit

Staurosporin erzeugt auch bei diesen Zellen eine erhöhte DNA-Fragmentation und ein

verringertes Vermögen, MTT zu reduzieren. Der EC50 für den MTT-Versuch liegt bei ca. 70

nmol/L Staurosporin. PC-12 Zellen zeigen eine höhere Empfindlichkeit gegenüber

Staurosporin als Kortexneuronen. Deutlich erhöhte DNA-Fragmentation zeigen PC12-Zellen

schon bei Konzentrationen von 0,01 µmol/L Staurosporin (Abbildung Nr. 6).

55

ERGEBNISSE 56

Avv

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

Alle Er

Kortexn

in vitro-

Eigensc

Striatum

Striatum

eine sig

gleiche

Fragmen

Kortexn

A

bbildung 6: 14d alte, mit NGF differenzierte PCerschiedenen Konzentrationen 24h lang behandelton MTT b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

200

400

600

800


Kontrolle 0,01 0,1 1 10

n = 4SE

** **

**

**

gebnisse zeigen, daß durch 1µmol/L Stauros

euronen oder PC12-Zellen induziert wird. Ein

Modell für die neurodegenerative Erkrank

haften dieser Erkrankung ist die Beschränk

. Daher wurden ebenfalls arealtypische Kultur

neurone zeigen schon bei Konzentrationen vo

nifikante Fragmentation der DNA. Bei 10µm

Effekt auf wie bei Kortexneuronen nach

tation geht zurück. Im MTT-Test sind Stri

eurone: der EC50 beträgt ca. 0,2 µmol/L Stauro

56

B

12-Zellen, die mit Staurosporin in wurden. a) Fähigkeit zur Reduktion ,01


Kontrolle 0,01 0,1 1 10

n =4SE

*

** *

porin für 24h Apoptose in 14d alten

Großteil dieser Arbeit beschreibt ein

ung Chorea Huntington. Eine der

ung des Zelltodes vor allem auf das

en aus Zellen des Striatum untersucht.

n 0,01 µmol/L Staurosporin nach 24h

ol/L Staurosporin allerdings tritt der

48h: das Testsignal bzw. die DNA-

atumneurone weniger empfindlich als

sporin (Abbildung Nr. 7).

ERGEBNISSE 57

AKD

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

Glutam Es wurd

auf Anz

den and

als Stan

Möglich

Method

nicht mö

Ein wic

Konzen

beschrie

für die Z

Es zeigt

wird (A

A

bbildung 7: 14d alte Striatumneuronen der Ratte wuonzentrationen von Staurosporin behandelt. a) FähNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01


Kontrolle 0,01 0,1 1 10

n = 3SE

**

**

**

** DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

nS

at-Modell

en nun verschiedene in vitro-Modelle degenerat

eichen von Apoptose untersucht. Da die DNA-F

eren Markern von Apoptose korreliert, wurde d

dard ausgewählt. Ein weiterer Vorteil des D

keit der quantitativen Bestimmung der DNA

en wie Immunfluoreszenz-Färbungen oder de

glich ist.

htiger Mechanismus bei vielen degenerativen E

tration von Glutamat im betroffenen Bereich. In

ben worden, in denen Glutamat Apoptose induz

ellen tödliche Dosis von 10 µmol/L Glutamat n

e sich jedoch, daß bei keiner der verwendeten

bbildung Nr. 8).

57

B

rden 24h lang mit verschiedenen igkeit zur Reduktion von MTT b)


Kontrolle 0,01 0,1 1 10

= 3E

*

***

**

iver ZNS-Erkrankungen etabliert und

ragmentation in dieser Arbeit gut mit

iese auf ELISA basierende Methode

NA-Fragmentations-ELISAs ist die

-Fragmentation, was mit anderen

m gelelektrophoretischen Nachweis

rkrankungen des ZNS ist die erhöhte

der Literatur sind mehrere Modelle

iert hat. In Vorversuchen wurde eine

ach Einwirkung von 24 h beobachtet.

Konzentrationen DNA fragmentiert

ERGEBNISSE 58

A B

Abbildung 8: 14d alte Kortexneuronen wurden 24h lang mit verschiedenen Konzentrationen von Glutamat behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

Glutamat[µmol/L]

Kontrolle 0,1 1 10 100

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

n = 4SE

*

*

**

Glutamat[µmol/L]


MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 4SE

**

****

Aus der Literatur ist bekannt, daß schon nach kurzer Einwirkzeit von Glutamat die

intrazelluläre Kalziumkonzentration in Zellen stark erhöht sein kann. Daher wurden ebenfalls

Versuche mit kurzer Inkubationszeit durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß schon eine

10minütige Einwirkung von Glutamat (10µmol/L) Zelltod nach 24h verursacht. Der EC50-

Wert im MTT-Test beträgt ca. 4µmol/L Glutamat. Die Meßergebnisse der DNA-

Fragmentation sind allerdings auch hier nicht signifikant unterschiedlich gegenüber der

Kontrolle. Bei höheren Konzentrationen von Glutamat wurden wie bei den 24h-Versuchen

sogar niedrigere Werte gemessen (Abbildung Nr. 9).

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

140

A

Abbildung 9: 14d alte Kortexneuronen wurdeKonzentrationen Glutamat behandelt und nach 2MTT b) DNA-Fragmentation untersucht. ∗∗P< 0

Glutamat [µMol/L]


n = 5SE

**

**** D

NA-

Frag

men

tatio

n [K

=100

%]

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

58

B

n für 10 min mit verschiedenen 4h auf a) Fähigkeit zur Reduktion von ,01

Glutamat[µMol/L]

Kontrolle 0,1 1 10 1000

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

n = 5SE

ERGEBNISSE 59

Demnach scheint das Neurotoxizitätsmodell mit Glutamat unter den gegebenen Bedingungen ein reines Nekrose-Modell zu sein.

Entzug von trophischen Faktoren Ein Modell, das vor allem die Verhältnisse im sich entwickelnden Gehirn widerspiegelt, ist

der Entzug von trophischen Faktoren. Während der Entwicklung kann eine fehlende

Exposition der Neuronen gegenüber den richtigen Faktoren zu Apoptose führen. Da die

Neuronen auf die von den Astrozyten abgegebenen trophischen Faktoren im konditionierten

Medium angewiesen sind, ist der Entzug durch Austausch des konditionierten Mediums

gegen nichtkonditioniertes einfach zu bewerkstelligen. Allerdings konnte auch in diesem

Modell keine signifikant erhöhte DNA-Fragmentation gegenüber der Kontrolle nachgewiesen

werden, obwohl ein Trend zu erhöhter DNA-Fragmentation vorhanden war (Abbildung Nr.

10).

A B

Abbildung 10: zeigt 14d alte Kortexneuronen, die für 24h mit unkonditioniertem Medium (Neurobasalmedium mit oder ohne B27-Zusatz und Glutamin) kultiviert wurden. a) Fähigkeit nach 24h zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation nach 24h. ∗∗P< 0,01

Medium für 24 h

Kontrolle NB+B27+G NB + G

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

300

350

400

n = 5SE

Medium für 24h

Kontrolle NB+ G NB+B27+G

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 5SE

****

H2O2/Radikalstreß-Modell Ein auf Radikalstreß ausgerichtetes Neurodegenerations-Modell ist die Behandlung von

Zellen mit H2O2. Kortexneurone wurden über 24h mit Medium kultiviert, welches

verschiedene Konzentrationen von H2O2 enthielt. Auch hier konnte keine Apoptose in Form

von DNA-Fragmentation festgestellt werden. Dies kann daran gelegen haben, daß

Wasserstoffperoxid kein geeignetes Radikal war, oder daran, daß die Einwirkung von außen

59

ERGEBNISSE 60

zunächst die Zellmembran zerstört hat. Der IC50 für Wasserstoffperoxid im MTT-Test lag

zwischen 10 und 100µmol/L H2O2 (Abbildung Nr. 11).

A B

Abbildung 11: zeigt 14d alte Kortexneuronen, die für 24h mit H2O2 in verschiedenen Konzentrationen kultiviert wurden. a) Fähigkeit nach 24h zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation nach 24h. ∗∗P< 0,01

H2O2[mmol/L]

Kontrolle0,0001

0,0010,01 0,1 1,0 10,0

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

140

160n = 6SE

**** **

H2O2[mmol/L]

Kontrolle 0,01 0,1 1,0

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

n = 3SE

**

AraC-Modell In der Literatur werden auch Apoptose-Modelle beschrieben, die auf DNA-Schädigung und

dem p53 basierten Mechanismus aufbauen. Durch AraC, einen auf Einbau in DNA

basierenden Mitosehemmer, werden jedoch vor allem sich teilende Zellen wie Astrozyten

getroffen. Die Wahrscheinlichkeit, daß dadurch in postmitotische Zellen Apoptose induziert

wird, ist eher gering. Die Versuche bestätigen das. Bei keiner Konzentration von AraC wurde

ein erhöhter Zelltod beobachtet. Auf Messungen der DNA Fragmentation wurde daher

verzichtet (Abbildung Nr. 12).

60

AraC[µMol/L]

Kontro

lle 0,01 0,1 1,0 10

,0

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

50

100

150

200

250

n = 6SE

*

ERGEBNISSE 61

Abbildung 12: zeigt 14d alte Kortexneuronen, die für 24h mit verschiedenen Konzentrationen AraC behandelt wurden. Fähigkeit der Zellen nach 24h zur MTT-Reduktion. ∗P< 0,05

Ischaemie-Modell Häufig basiert akute Neurodegeneration auf der Unterbrechung von Sauerstoff- und Glukose-

Zufuhr betroffener Hirnareale. Bei diesem Schlaganfall genannten Vorgang wird der Zell-

Untergang größtenteils durch nekrotische Vorgänge bestimmt. Neben der Nekrose beschreibt

die Literatur jedoch auch apoptotische Vorgänge. Diese finden besonders in der Penumbra

genannten Zone statt, die nicht völlig von der Sauerstoff- und Glukosezufuhr abgeschnitten

ist. Apoptose und Nekrose können zeitlich versetzt stattfinden. Beim Menschen kann diese

Phase mehrere Tage andauern.

Bei eigenen in vitro-Versuchen konnte jedoch mit den vorhandenen Mitteln keine ausreichend

feine Justierung der Parameter Sauerstoff- und Glukosegehalt des Mediums über die benötigte

Dauer erreicht werden. Dies zeigte sich in stark schwankenden Ergebnissen. Sowohl der

DNA-Fragmentations-Test als auch der MTT- Test waren davon betroffen. Aus diesem Grund

wurde das Ischaemie-Modell nicht weiterverfolgt.

Methylmalonat/ Malonat- Modell Ein ebenfalls auf Energiemangel der Zelle basierendes Modell, welches allerdings auf einem

chemischen Inhibitor beruht, war wesentlich feiner zu regulieren. Die Zellen wurden mit

einem Inhibitor der mitochondrialen Succinat-Dehydrogenase behandelt. Der Inhibitor

Malonat bzw. die leichter zellgängige Substanz Methylmalonat, sind kompetitive Inhibitoren,

die mit Succinat um die Bindestelle am Enzym konkurrieren. Da es sich um einen reversiblen

Inhibitor handelt, kann das Ausmaß der Hemmung gut gesteuert werden. In vivo ist Malonat

ein gutes Modell für die Krankheit Huntington´s. Dazu wird Malonat direkt ins Striatum

gespritzt. Dort werden dann Neurone des Striatums geschädigt, mit der Folge einer

Symptomatik wie bei Huntington´s. Hingegen kann der irreversible Inhibitor der Succinat-

Dehydrogenase, 3-NP, auch systemisch gegeben werden und schädigt dann ebenfalls vor

allem Zellen im Striatum.

61

ERGEBNISSE 62

Da der MTT-Test auf der Reduktion von MTT in den Mitochondrien durch die Succinat-

Dehydrogenase beruht, konnte der MTT-Test nicht zur Bestimmung der Überlebensfähigkeit

der Zellen benutzt werden. Daher wurde ein weiterer Test zur Darstellung der Vitalität der

Neuronen benutzt. Hierzu wurde der Lactat-Dehydrogenase-Test verwandt. Dieser mißt die

Menge der von den Zellen freigesetzten Lactat-Dehydrogenase. Da dieses Enzym nur bei

zerstörter Zellmembran freigesetzt wird, ist der Test ein direktes Maß für den Zelltod. Da mit

dem MTT-Test direkt die erfolgreiche Hemmung der Succinat-Dehydrogenase beobachtet

werden kann, wurde er zusätzlich durchgeführt.

Kortexneuronen im Methylmalonat-Modell

Zunächst wurden Malonat und Methylmalonat im bestehenden Zellkultursystem mit

Kortexneuronen charakterisiert. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurve ergab für

Methylmalonat im MTT-Test einen IC50-Wert von ca. 30 mmol/L Methylmalonat Die DNA-

Fragmentation stieg kontinuierlich ab 8 mmol/L an. Der maximale Wert der DNA-

Fragmentation konnte bei 20 mmol/L Methylmalonat festgestellt werden und betrug ca.

210 % der Kontrolle. Bei höheren Konzentrationen fällt die DNA-Fragmentation stark ab. Die

halbmaximale DNA-Fragmentation wurde bei einer Konzentration von ca. 8 mmol/L

Methylmalonat erreicht. Im LDH-Test zeigte sich eine Erhöhung der LDH-Freisetzung erst

bei Konzentrationen von 50 mmol/L (Abbildung Nr. 13).

A B

Abbildung 13: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 4-100 mmol/L Methylmalonat behandelt. Untersucht wurde nach 24h a ) die Fähigkeit zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation und c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase ins Medium. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

Methylmalonat[mmol/L]

Kontrolle 1 10 100

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

n > 7SE

*

****


Kontrolle 1 10 100

DN

A Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

100

200

300

n > 4SE

*

**

** **

**

**

** **

62

ERGEBNISSE 63

C

Abbildung 13: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 4-100 mmol/L Methylmalonat behandelt. Untersucht wurde nach 24h a ) die Fähigkeit zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation und c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase ins Medium. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01


Kontrolle 1 10 100

LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on=1

00%

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

n = 6SE

Zusätzlich wurde in einer Kinetik untersucht, in welchem Zeitrahmen Veränderungen

auftraten. Bei der gewählten Konzentration von 20 mmol/L Methylmalonat konnte im MTT-

Test sowie im Lactat-Dehydrogenase-Test innerhalb 24h keine Veränderungen bei

Kortexneuronen festgestellt werden. DNA-Fragmentation konnte jedoch schon nach 4h

detektiert werden. Die höchste DNA-Fragmentation wurde nach 24h gemessen (Abbildung

Nr. 14).

%

]

=100

n [K

ktio

du

T-R

e

MT

0

20

40

60

80

100

120

140

A

Abbildung 14: 14d alte Kortexneuronen wurdebehandelt. Nach verschiedenen Zeiten wurde auf DNA-Fragmentation c) Freisetzung von L∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

MethylmalonatDauer [h]

Kontrolle 4 8 16 24

n = 6SE

****

* **

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

300

63

B

n mit Methylmalonat (20mmol/L) a) Fähigkeit zur MTT- Reduktion b) actat-Dehydrogenase untersucht.


Kontrolle 4 8 16 24

n = 6SE

**** **

**

ERGEBNISSE 64

Abbildung 14: 14d alte Kortexneuronen wurden mit Methylmalonat (20mmol/L) behandelt. Nach verschiedenen Zeiten wurde auf a) Fähigkeit zur MTT- Reduktion b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase untersucht. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

C


Kontrolle 4 8 16 24

LDH

Fre

iset

zung

[Trit

on=1

00%

]

-5

0

5

10

15

20

25

30

n = 6SE

*

Die Standard-Bedingungen wurden aufgrund der Ergebnisse auf 20 mmol/L Methylmalonat

für 24h festgelegt.

Striatumneuronen im Methylmalonat-Modell Striatumneuronen wurden ebenfalls mit dem Inhibitor Methylmalonat behandelt und

Überleben sowie DNA-Fragmentation untersucht. Dabei zeigte sich eine größere

Empfindlichkeit gegenüber dem Inhibitor, die sich in einer deutlichen Verringerung der

Fähigkeit MTT zu reduzieren, zeigte. Schon bei 16 mmol/L Methylmalonat sank diese

Fähigkeit. DerIC50 lag bei ca. 19 mmol/L Methylmalonat. Die DNA-Fragmentation war

ebenfalls bei 20 mmol/L Methylmalonat am größten und nahm wie bei Kortexneuronen bei

größeren Konzentrationen ab. Im Lactat-Dehydrogenase Test zeigte sich schon bei 12

mmol/L Methylmalonat ein stark erhöhter Zelltod von ca. 40 % (Abbildung Nr. 15).

64

ERGEBNISSE 65

C

Abbildung 15: 14d alte Striatumneuronen wurden über 24 h mit verschiedenen Konzentrationen von Methylmalonat behandelt. a) Fähigkeit zur Reduzierung von MTT b) DNA-Fragmentation c) Zelltod-Bestimmung mit dem Lactat-Dehydrogenase-Test. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

A B


Kontrolle 1 10 100

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 3SE

**

** **


Kontrolle 1 10 100

DN

A Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

n > 3SE

****

*

**

****


Kontrolle 1 10 100

LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on=1

00%

]

0

10

20

30

40

50

60

n = 5SE

** ***

** **

*

Kortex-Neuronen im Malonat-Modell Neben Methylmalonat wurde auch Malonat als Succinat-Dehydrogenase-Inhibitor benutzt.

Malonat war in kortikalen Kulturen toxischer als Methylmalonat, was sich in einem

niedrigeren IC50-Wert von ca. 12 mmol/L Malonat im MTT-Test darstellte. Die DNA-

Fragmentation war etwas geringer und lag im Maximum bei 160% der Kontrolle. Der

Konzentrations-Bereich, in dem die DNA-Fragmentation erhöht war, erstreckte sich von

5 mmol/L bis 25 mmol/L Malonat. Bei 30 mmol/L Malonat fiel der Wert der DNA-

Fragmentation unter den Kontrollwert ab. Die Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase war ab

10 mmol/L Malonat signifikant erhöht (Abbildung Nr. 16).

65

ERGEBNISSE 66

Abbildung 16: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit verschiedenen Konzentrationen von Malonat behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Lactat-Dehydrogenase-Freisetzung. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

A B

Malonat[mMol/L]

Kontro

lle 5 10 15 20 25 30 40 50

LDH

-Fre

iset

zung

[K=1

00%

]

0

5

10

15

20

25

30

35

40

n = 2MW *

** ** ** * ****

C

Malonat[mmol/L]

Kontrolle 5 10 15 20 25 30 35

DN

A-Fr

agm

enta

tion[

K=10

0%]

0

50

100

150

200

250

n > 3SE

**

Malonat[mmol/L]

Kontrolle 5 10 15 20 25 30 35 40 45

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120n >4SE

**

** **

****

**

Eine Kinetik wurde mit Malonat ebenfalls durchgeführt. Hierfür wurde eine Konzentration

von 15mmol/L Malonat eingesetzt. Im MTT-Test wurde eine Reduktion der Fähigkeit MTT

umzusetzen, zuerst nach 16h gemessen. Die Fähigkeit sank weiter nach 24h auf ca. 30% der

Kontrolle. Die DNA-Fragmentation war nach 4h signifikant erhöht und lag nach 4 bis 8h bei

ca. 160% der Kontrolle. Nach 16h sank dieser Wert etwa auf 140% und nach 24h wurde ein

Wert von ca. 120% gemessen (Abbildung Nr. 17).

66

ERGEBNISSE 67

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Stria Malon

bestäti

Wert

Konze

DNA-

Malon

Wert v

bis 10

Kontro

40% d

sehr h

A

Abbildung 17: 14d alte Kortexneuronen wurden mNach 4, 8, 16 und 24h wurden gemessen: a) FähigkFragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

MalonatDauer [h]

Kontrolle 4 8 16 24

n = 6SE

** **

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

300

350

tum-Neurone im Malonat-Modell

at wurde ebenfalls in Kulturen von primären S

gte sich die erhöhte Empfindlichkeit der Striatum

ca. 17 mmol/L Malonat. Die DNA-Fragmenta

ntration von 10 mmol/L Malonat einen Wert von

Fragmentation sank bei höheren Konzentratio

at lag dieser Wert schon unter dem Kontrollw

on 60 % zu erreichen. Der Lactat-Dehydrogena

mmol/L Malonat lagen die Werte unter d

lle). Höhere Konzentrationen (ab 15 mmol/L) M

er Triton-Kontrolle. Der Kontrollwert war alle

och (Abbildung Nr. 18).

67

B

it 15 mmol/L Malonat behandelt. eit zur Reduktion von MTT b) DNA-

MalonatDauer [h]

Kontrolle 4 8 16 24

n = 5SE

*

triatumneuronen eingesetzt. Auch hier

neuronen. Im MTT-Test war der IC50-

tion erreichte im Maximum bei einer

ca. 130 % der Kontrolle. Der Wert der

nen kontinuierlich ab. Bei 20mmol/L

ert um bei 30 mmol/L Malonat einen

se-Test ergab sehr hohe Werte: bei fünf

en Kontrollwerten (20% der Triton-

alonat resultierten in Werten von über

rdings bei diesen Versuchen ebenfalls

ERGEBNISSE 68

%

]

=100

n [K

ktio

Red

u

-

MTT

AbKoFra

Kontrolle0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Die durch

leichte Ab

nach 24h

ungefähr

Dehydrog

(Abbildun

A

bildung 18: 14d alte Striatumneuronen wurdennzentrationen von Malonat behandelt. a) Fähigkeit zgmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenas

Malonat[mMol/L]

Kontro

lle 5 10 15 20 25 30

LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on=1

00%

]

0

20

40

60

n = 2MW

Malonat[mmol/L]

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

n = 6SE

****

**** **

Kontrolle

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

geführte Kinetik zeigte nach 8h bei einer Behan

nahme der Reduktion von MTT auf 90%. Der W

auf knapp unter 50%. Die DNA-Fragmentati

120% (nicht signifikant). Eine Untersuchu

enase wurde bei diesen ergänzenden Un

g Nr. 19).

68

B

Malonat[mmol/L]

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

n = 6SE**

*

*

**

**

C

für 24h mit verschiedenen ur Reduktion von MTT b) DNA-e. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

40 50

dlung mit 15mmol/L Malonat eine

ert sank nach 16h auf ca. 50% und

on stieg erst nach 24h leicht auf

ng der Freisetzung von Lactat-

tersuchungen nicht durchgeführt

ERGEBNISSE 69

A B

MalonatDauer [h]

Kontrolle 4 8 16 24

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

50

100

150

n = 6SE

***

MalonatDauer [h]

Kontrolle 4 8 16 240

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

n = 5SE

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]Abbildung 19: Kinetik der Wirkung von Malonat (15mmol/L) bei 14d alten Striatumneuronen. a) Fähigkeit zur Reduzierung von MTT b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

Einfluß des pH-Wertes im Methylmalonat-Modell Die Fragmentation von DNA beruht auf der Wirkung verschiedener DNAsen. Diese

Endonukleasen haben zum Teil eine erhöhte Aktivität bei saurem pH-Wert in der Zelle. Um

diesen Aspekt darzustellen, wurde in einigen Versuchen darauf verzichtet, die verwendete

Methylmalonsäure mit NaOH zu neutralisieren. Dadurch ergab sich ein pH-Wert im Medium

von ungefähr 3 bis 4. Der IC50-Wert im MTT-Test lag bei 9mmol/L Methylmalonat. Die

Werte im DNA-Fragmentations-Test erreichten bei 12mmol/L Methylmalonat den maximalen

Wert von 600%. Offensichtlich induziert Methylmalonat in saurem Medium deutlich mehr

Apoptose. Im LDH-Test zeigten sich ab 10mmol/L Methylmalonat erhöhte Freisetzungen, die

dann bei 12mmol/L deutlich auf 35% gegenüber 10% der Kontrolle stiegen

(Abbildung Nr. 20).

0%]

n [K

=10

ktio

-

MTT

Red

u

0

20

40

60

80

100

120
A
69

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

100

200

300

400

500

600

700


Kontrolle 4 6 8 10 12 14 16

n = 3SE*

**

**

**

** ** **

B


Kontrolle 8 10 12 14 16

n = 7 SE

**

**

**

ERGEBNISSE 70

Abbildung 20: 14d alte Konzentrationen MethylmaFähigkeit zur Reduktion ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

Kon

LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on=1

00%

]

0

5

10

15

20

25

30

35

40

n =SE

ZVAD-fmk im Staurospor Um die verschiedenen Modell

Breitspektrum-Inhibitor -ZVAD

Caspase-3 und Caspase-1 und

benutzten Konzentrationen um

Konzentrationen. Die Kortex-N

ZVAD-fmk zusammen inkubier

ZVAD-fmk eine deutlich verbe

10µmol/L ZVAD-fmk wurden

ZVAD-fmk war mit ca. 70%

Staurosporin behandelten Zelle

µmol/L ZVAD-fmk von 160% a

C

Kortexneuronen wurden für 24h mit verschiedenen lonat, das nicht mit NaOH neutralisiert war, behandelt. a) von MTT b) DNA-Fragmentation c) LDH-Freisetzung.


trolle 4 6 8 10 12 14

3 ** **

*

in-Modell

e pharmakologisch zu charakterisieren, wurde ein Caspase

-fmk- benutzt. Dieser Inhibitor hemmt unter anderen

wurde zunächst im Staurosporin-Modell eingesetzt. Die

fassten die in der Literatur als wirksam dargestellten

euronen wurden gleichzeitig mit 1µmol/L Staurosporin und

t. Nach 24h zeigte sich im MTT-Test bei Vorhandensein von

sserte Fähigkeit, MTT zu reduzieren. Bei Anwesenheit von

schon 40% erreicht; der Wert bei Zugabe von 100µmol/L

signifikant unterschiedlich von dem Wert der nur mit

n. Parallel dazu wurde die DNA-Fragmentation durch 100

uf ca. 60% gesenkt (Abbildung Nr. 21).

70

ERGEBNISSE 71

Abbildung 21: 14d alte Kortexneuronen wurden 24h lang mit 1µM Straurosporin und ZVAD-fmk (1-100 µM) inkubiert. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT nach 24h b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

A

ZVAD-fmk[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 1 10 100

DN

A Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

n = 5SE

**

*

ZVAD-fmk[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 1 10 10

0

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 4SE

**

*

B

Bei der Überprüfung der Eigenwirkung von ZVAD-fmk für 24h in Zellkulturen primärer

Kortexneuronen ergab sich eine leichte Eigenwirkung. Im MTT-Test zeigte sich bei keiner

untersuchten Konzentration eine toxische Wirkung. Im DNA-Fragmentations-Test zeigt sich

nur bei 1µmol/L ZVAD-fmk eine signifikante Steigerung der Fragmentation auf 120% und

ein nicht signifikanter Trend geringerer DNA-Fragmentation bei 100 µmol/L ZVAD-fmk

(Abbildung Nr. 22).

B

ZVAD-fmk[µmol/L]

Kontro

lle 0,01 0,1 1 10 10

0

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160n = 4SE

*

A

ZVAD-fmk[µmol/L]

Kontro

lle 0,01 0,1 1 10 10

0

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 4SE

Abbildung 22: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit ZVAD-fmk in verschiedenen Konzentrationen behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

71

ERGEBNISSE 72

ZVAD-fmk im Methylmalonat-Modell

Genau wie das Staurosporin-Modell wurde auch das Malonat-bzw. Methylmalonat-Modell

mit ZVAD-fmk weiter charakterisiert. Hierbei zeigte sich allerdings, daß ZVAD-fmk keinen

positiven Einfluß auf die Überlebensfähigkeit der Kortexneuronen im MTT-Test hat. Die

Fähigkeit zur Reduktion von MTT liegt mit 60-70% der Kontrolle noch etwas unterhalb der

Werte von Zellen, die mit Methylmalonat behandelt wurden. Der Unterschied ist allerdings

nicht signifikant. Bei der Untersuchung auf DNA-Fragmentation wurde eine Erhöhung auf

180% bei den mit 20 mmol/L Methylmalonat behandelten Zellen beobachtet. Diese

Fragmentation wurde nur durch 100µmol/L ZVAD-fmk signifikant auf ca. 125% gesenkt.

Jedoch zeigten auch die mit 1 und 10 µmol/L ZVAD-fmk behandelten Zellen eine leichte

Senkung der DNA-Fragmentation auf 150%, die jedoch nicht signifikant war. Im LDH-Test

zeigte sich durch Behandlung mit ZVAD-fmk keine signifikante Veränderung gegenüber den

Methylmalonat-behandelten Zellen (Abbildung Nr. 23).

%

]

=100

n [K

ktio

du

TT-R

e

M

A B

ZVAD[µmol/L]

Kontrolle

Methylmalonat 1 10 100

0

20

40

60

80

100

120

140

160

n = 10SE

ZVAD[µmol/L]

Kontrolle

Methylmalonat 1.0 10.0

100.0

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

n = 6SE

**

**

Abbildung 23: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 20 mmol/L Methylmalonat und verschiedenen Konzentrationen (1; 10; 100 µmol/L) ZVAD-fmk behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase. ∗∗P< 0,01

72

ERGEBNISSE 73

Abbildung 23: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 20 mmol/L Methylmalonat und verschiedenen Konzentrationen (1; 10; 100 µmol/L) ZVAD-fmk behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase. ∗∗P< 0,01

C

ZVAD[µmol/L]

Kontrolle

Methylmalonat 1 10 100

LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on=1

00%

]

0

20

40

60

n > 8SE

ZVAD-fmk im Malonat-Modell Mit Malonat behandelte Kortexneuronen zeigen ebenfalls eine leichte, nicht signifikante

Wirkung von ZVAD-fmk. Während im MTT-Test ebenfalls keine Wirkung zu sehen war,

wurde die DNA-Fragmentation bei Behandlung mit 100µmol/L ZVAD-fmk von ca. 180% auf

ca. 130% gesenkt. Auch im LDH-Test konnte ein leichter (nicht signifikanter) Trend zu

geringerer Freisetzung von LDH beobachtet werden (Abbildung Nr. 24).

A

ZVAD[µmol/L]

KontrolleMalonat 1 10 100

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

140n = 5SE

ZVAD-fmk[µmol/L]


DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

300

350

n = 4SE

B

Abbildung 24: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 15 mmol/L Malonat und verschiedenen Konzentrationen (1; 10; 100µmol/L) ZVAD-fmk behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase.

73

ERGEBNISSE 74

Abbildung 24: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 15 mmol/L Malonat und verschiedenen Konzentrationen (1; 10; 100µmol/L) ZVAD-fmk behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase.

C

ZVAD-fmk[µmol/L]


LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on =

100

%]

0

5

10

15

20

25

30

n = 2MW

Deutlicher wirkte ZVAD-fmk in Kulturen von striatalen Neuronen. Auch hier konnte keine

Wirkung im MTT-Test beobachtet werden, jedoch wurde die DNA-Fragmentation bei Einsatz

von 100µmol/L ZVAD-fmk signifikant von ca. 185% auf ca.110% gesenkt. Im LDH-Test

konnte ebenfalls ein Trend gesehen werden, die Freisetzung von LDH zu unterdrücken, der

jedoch nicht signifikant war (Abbildung Nr. 25).

]

=100

ion

[K

Red

u

MTT

-

Abbildung 25

ZVAD-fmk[µmol/L]

Kontrolle Malonat 1 10 100

kt%

0

20

40

60

80

100

120

n = 3SE

B

ZVAD-fmk[µmol/L]


DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

n = 3SE

**

A

74

ERGEBNISSE 75

Abbildung 25: 14d alte Striatumneuronen wurden 24h mit15mmol/L Malonat behandelt. Zusätzlich enthielt das Medium 1-100 µmol/L ZVAD-fmk. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase. ∗∗P< 0,01

C

ZVAD-fmk[µmol/L]


LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on =

100

%]

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

n = 2MW

Weitere Inhibitoren im Methylmalonat / Malonat-Modell oder im Staurosporin-Modell Eine Reihe weiterer Substanzen, die pharmakologisch bedeutsam bei der Beeinflussung der

Apoptose sein könnten, wurden ebenfalls im Malonat- sowie im Staurosporin-Modell getestet.

Darunter waren Substanzen, die schon in anderen Apoptose-Modellen eine Wirkung gezeigt

hatten.

Caspase-3 Inhibitor im Staurosporin-Modell Caspase-3 ist eine wichtigste Effektor-Caspase, die zudem am unteren Ende der Caspase-

Kaskade steht. Bis auf wenige, erst vor kurzem entdeckte Ausnahmen ist Caspase-3 beteiligt,

wenn eine Zelle Apoptose begeht. In vielen Experimenten konnte schon gezeigt werden, daß

eine Blockade von Caspase-3 die Unterdrückung der Apoptose bedeutet; zumindest für eine

bestimmte Zeit. Zum Teil konnte auch eine Verschiebung von Apoptose zu Nekrose

beobachtet werden. Aus diesem Grund wurde der relativ selektive Caspase-3-Inhibitor

DEVD-CHO sowohl im Staurosporin- als auch im Methylmalonatmodell auf protektive

Wirkung getestet.

Zunächst wurden mit 1 µmol/L Staurosporin behandelte Kortexneurone zusätzlich mit

Caspase-3 Inhibitor inkubiert. Im MTT-Test zeigte sich bei der Behandlung über 24h eine

konzentrationsabhängige, signifikanteVitalitätszunahme,d.h. Fähigkeit, MTT zu reduzieren.

Die durch Staurosporin auf ca. 40% abgesenkte Vitalität wurde durch 100 µmol/L DEVD-

75

ERGEBNISSE 76

CHO auf ca. 70% angehoben; bei 10 µmol/L DEVD-CHO waren es noch 60%. Nur ein sehr

leichter, nicht signifikanter Anstieg der Vitalität gegenüber den Staurosporin behandelten

Zellen ergab sich mit 1 µmol/L DEVD. Im DNA-Fragmentations-Test zeigte sich trotz der

höheren Vitalität im MTT-Test bei 1 und 10 µmol/L DEVD-CHO keine signifikante

Verringerung der DNA-Fragmentation. Bei 100 µmol/L stieg die Fragmentation sogar auf ca.

400% der Kontrolle und lag damit deutlich über der Steigerung durch Staurosporin-

Behandlung von ca. 250 % (Abbildung Nr. 26).

Abbildung 26: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin und verschiedenen Konzentrationen von Caspase-3-Inhibitor (1-100 µmol/L) behandelt. a) Fähigkeit MTT zu reduzieren b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

A B

DEVD-CHO[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 1 10 10

0

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 4SE

**

**

DEVD-CHO[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 1 10 100

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

100

200

300

400

500

n = 4SE

*

Aufgrund der widersprüchlichen Ergebnisse bzw. toxischen Wirkung wurde Caspase-3-

Inhibitor (DEVD-CHO) in anderen Modellen nicht weiter untersucht.

Pramipexol im Staurosporin-Modell Der Dopamin-Agonist Pramipexol wird normalerweise bei Morbus Parkinson eingesetzt.

Über die Eigenschaft als Dopamin-Agonist hinaus wird spekuliert, ob Pramipexol die

Öffnung der mitochondrialen Transitions Pore (MPT) bzw. die Freisetzung von Cytochrom C

hemmt. Daher wurde die potentiell antiapoptotische Wirkung dieser Substanz in dieser Arbeit

untersucht. Tatsächlich konnte Pramipexol die durch Staurosporin gegenüber der Kontrolle

auf 40% herabgesetzte Vitalität der Zellen dosisabhängig auf bis zu 85% steigern. Bei

gleichzeitiger Inkubation mit 10µmol/L Pramipexol änderte sich an der Fähigkeit MTT zu

reduzieren nichts, aber bei 100µmol/L konnte eine (nicht signifikante) Steigerung der Vitalität

76

ERGEBNISSE 77

gegenüber der Kontrolle auf ca. 50% beobachtet werden. Interessanterweise lagen die Werte

für alle eingesetzten Konzentrationen (10-1000µmol/L) bei der Untersuchung auf DNA-

Fragmentation geringfügig und nicht signifikant über dem Wert für Staurosporin (ca.

260%).Dies bedeutet, daß die DNA-Fragmentation zumindest nach 24h nicht beeinflußt wird.

Da in der Literatur eine Freisetzung von Cytochrom C durch Staurosporin beschrieben ist,

könnte die gleichbleibende DNA-Fragmentation durch andere Mechanismen verursacht sein.

Eventuell verhindert Pramipexol zumindest kurzfristig innerhalb 24h die Zerstörung der

Mitochondrien (Abbildung Nr. 27).

Abbildung 27: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt. Zusätzlich erfolgte eine Inkubation mit 10 -1000 µmol/L Pramipexol. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT nach 24h b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

A B

Pramipexol[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 10 10

010

00

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 5SE

**

*

Pramipexol[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 10 10

010

00

DN

A Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

100

200

300

400

n = 5SEM

**

Deprenyl im Staurosporin-Modell Es konnte gezeigt werden, daß beim Abbau von Dopamin in Zellen vermehrt O2-Radikale

gebildet werden. Eine Beschränkung der Dopamin-Exposition von Neuronen durch

verschiedene Massnahmen konnte auch die Radikalbilung und vermehrten Zelltod in einigen

Modellen verhindern. Auch eine Beschränkung des Dopamin-Abbaus kann die

Radikalbelastung senken. Da ein Grossteil des Abbaus von den Monoaminoxidasen (MAO)

durchgeführt wird, ist die Hemmung derselben ein Weg, den Radikalstress der Zellen zu

senken. Aus diesem Grund wurde der MAO-B Inhibitor Deprenyl im Staurosporin-Modell

angewandt und der Einfluß auf Überleben und DNA-Fragmentation untersucht.

77

ERGEBNISSE 78

Nach 24h Staurosporin-Inkubation war nur noch eine gegenüber der Kontrolle 20%ige

Reduktion von MTT durch die Kortexneuronen möglich. Eine signifikante Änderung dieses

Wertes konnte lediglich mit der Co-Inkubation von 1000 µmol/L Deprenyl erreicht werden.

Die Vitalität konnte auf 50% der Kontrolle gesteigert werden. Dieses Ergebnis spiegelt sich

allerdings nicht in den Untersuchungen zur DNA-Fragmentation wieder: die um 40%

gegenüber der Kontrolle gesteigerte DNA-Fragmentation wurde nicht signifikant durch

Deprenyl verändert (Abbildung Nr. 28).

Abbildung 28: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt. Zusätzlich wurden die Neuronen mit verschiedenen Konzentrationen Deprenyl behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT nach 24h b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

A B

Deprenyl[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 0,0

1 0,1 1 10 100

1000

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n > 6SE

**

*

Deprenyl[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin

0,001 0,0

1 0,1 1 10 100

1000

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

100

200

300

400

500

600

n = 6-8SE

**

Dipyridamol im Staurosporin-Modell Dipyridamol wurde getestet, weil Adenoside ebenfalls Apoptose auslösen können. Der

Adenosin Transport-Inhibitor Dipyridamol wurde in einigen Studien als neuroprotektiv

beschrieben. Aus der Literatur war bekannt, daß Dipyridamol in einer Konzentration von

100 µmol/L toxisch für Neuronen ist. Dies konnte im MTT-Test bestätigt werden: die durch

Staurosporin geschädigten Zellen, die MTT gegenüber der Kontrolle nur noch zu 40%

umsetzen konnten, wurden durch Dipyridamol zu ca. 90% beim Umsetzen von MTT inhibiert.

Konzentrationen von 1 oder 10µmol/L Dipyridamol hatten keinen Einfluß. Im DNA-

Fragmentations-Test konnte zwar eine konzentrationsabhängige Abnahme der DNA-

Fragmentation festgestellt werden, was jedoch aufgrund der Daten des MTT-Tests nicht als

Abnahme gewertet wurde. Vielmehr ist es wahrscheinlich, daß die DNA schon so weit

78

ERGEBNISSE 79

abgebaut worden war, daß sie nicht mehr als fragmentiert nachgewiesen werden konnte

(Abbildung Nr. 29).

Abbildung 29: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt. Zusätzlich erfolgte eine Inkubation mit 1-100 µmol/L Dipyridamol. Nach 24h wurde auf a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT und b) DNA-Fragmentation untersucht. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

A B

Dipyridamol[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 1 10 10

0

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 6SE

**

**

Dipyridamol[µmol/L]

Kontro

lle

Stauros

porin 1 10 10

0

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

50

100

150

200

250

n = 5SE

**

**

FK506 im Staurosporin-Modell FK506 ist eine interessante Substanz, die eine klinisch wichtige Funktion als

Immunsuppressivum hat. Diese Eigenschaft beruht auf der Komplexierung von FK506 mit

dem Protein FKBP12 und anschliessender Hemmung von Calcineurin durch diesen Komplex

beruht. Darüber hinaus hemmt FK506 die Peptidyl-Prolyl-Isomerase Enzymtätigkeit (PPIase)

(Rotamase) von FKBP12. Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß FK506 neuronale Zellen

sowohl gegen Ischaemie als auch gegen exzitatorische Toxizität und gegen apoptotische

Mechanismen nach einer Verletzung des nervus opticus schützt. Auch gegen einen Entzug

von NGF kann FK506 neuronale Zellkulturen schützen.

In den eigenen Versuchen konnte die neuroprotektive Wirkung von FK506 im Staurosporin-

Modell mit Kortexneuronen nicht beobachtet werden. FK506 zeigte in keinem der Tests

(MTT, DNA-Fragmentation, LDH) bei keiner der benutzten Konzentration eine signifikante

Wirkung (Abbildung Nr. 30).

79

ERGEBNISSE 80

Abbildung 30: 14d alte Kortex-Neurone wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt. Zusätzlich wurden die Neuronen mit FK506 in verschiedenen Konzentrationen behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat Dehydrogenase. ∗∗P< 0,01

A B

C

FK506[µmol/L]

Kontrolle

Staurosporin 0,1 1 10

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

n = 4SE

**

FK 506[µmol/L]

Kontrolle


DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

K]

0

20

40

60

80

100

120

140

n = 2MW

FK 506[µmol/L]

Kontrolle


LDH

-Fre

iset

zung

[% T

riton

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

n = 8SE

**

FK506 im Malonat-Modell mit Kortexneuronen

80

ERGEBNISSE 81

FK506 wurde ebenfalls im Malonat-Modell mit Kortexneuronen auf seine neuroprotektive

Wirkung hin untersucht. Auch in diesem Modell konnte keine signifikante Wirkung gegen

Zelltod oder DNA-Fragmentation detektiert werden: weder wurde im MTT-Test die Vitalität

der Zellen erhöht, noch wurde die DNA-Fragmentation unterdrückt. Auch die Freisetzung von

Lactat-Dehydrogenase wurde nicht unterbunden (Abbildung Nr. 31).

A B %

]

=100

n [K

ktio

Red

u

TT-

M

C

Abbildung 31: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit Malonat (15 mmol/L) behandelt. Zusätzlich wurden die Kulturen mit FK 506 in verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Nach 24h wurden die Zellen auf a) Fähigkeit zu Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase hin untersucht. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01

FK 506[µmol/L]

KontrolleMalonat 0,1 1 10

0

20

40

60

80

100

120

n = 3SE

** *

FK 506[µmol/L]


DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

n > 3SE

**

FK 506[µmol/L]


LDH

-Fre

iset

zung

[% T

riton

]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

n > 7SE

**

FK506 im Malonat-Modell mit Striatumneuronen

Ein ähnliches Ergebnis zeigte sich bei der Untersuchung von Striatumneuronen, die mit

Malonat behandelt wurden: weder konnte im MTT-Test die durch Malonatbehandlung auf

20% gesunkene Fähigkeit zur Reduktion von MTT signifikant verbessert werden, noch wurde

die Freisetzung von Lactat Dehydrogenase gehemmt. Die Ergebnisse des Tests zur DNA-

81

ERGEBNISSE 82

Fragmentation sind aufgrund der bei Malonatbehandlung niedrigeren Werte schlecht

auswertbar. Die normalerweise höhere Fragmentation von DNA-Fragmentation war in diesem

Versuch auf ca. 70% gesunken (Abbildung Nr. 32):

Abbildung 32: 14d alte StriT. mit FK506 in verschiedeauf a) Fähigkeit zu RedukLactat Dehydrogenase unte

FK 506[µmol/L]

Kontrolle Malonat 0,1 1 10

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

20

40

60

80

100

120

140

n = 9SE

**

FK 506[µmol/L]


DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

n > 6SE

**

LDH

-Fre

iset

zung

[% T

riton

]

0

20

40

60

FK506 im Methylmalonat- Im Methylmalonat-Modell kon

Änderung bei der Fähigkeit, MT

im DNA-Fragmentations-Test

konnte die auf 200% der Kontr

wurden ebenfalls keine Änderu

gefunden (Abbildung Nr. 33).

C

atumneuronen wurden für 24h mit15mmol/L Malonat und z. nen Konzentrationen inkubiert. Nach 24h wurden die Zellen tion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von rsucht. ∗∗P< 0,01

FK 506[µmol/L]


n = 9SE

**

Modell mit Kortexneuronen

nte bei den mit FK506 behandelten Kortexneuronen keine

T zu reduzieren beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde

bestätigt: keine der untersuchten FK506-Konzentrationen

olle gestiegenen DNA-Fragmentation senken. Im LDH-Test

ngen der LDH-Freisetzung durch Behandlung mit FK506

82

ERGEBNISSE 83

%]

100

n [K

=

dukt

io

-Re

MTT

A

FK 506[µmol/L]

Kontrolle

Methylmalonat 0,1 1 10

0

20

40

60

80

100

120

140

160

n = 12SE

Kontrolle

Methylmalonat 0,1

LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on=1

00%

]

0

20

40

60

80

100D

NA-

Frag

men

tatio

n [K

=100

%]

0

50

100

150

200

250

300

350

C

Abbildung 33: Zeigt 14d alte Kortexneuronen, dieund zum Teil zusätzlich mit 0,1–10 µmol/L FK506die Zellen auf a) Fähigkeit zur Reduktion vFreisetzung von LDH untersucht. ∗∗P< 0,01

FK506 im Methylmalonat-Modell mit Stria In den Striatum-Kulturen konnte im MTT-Test bei 1

der Fähigkeit, MTT zu reduzieren, beobachtet

behandelten Neuronen zeigten Werte von ca. 25% de

mit FK506 behandelten Neuronen einen Wert von c

Trend aufgrund der starken Streuung nicht si

Fragmentations-Test zeigten keine Reduktion der n

durch FK506. Auch die Freisetzung von Lactat De

gehemmt (Abbildung Nr. 34).

83

B

FK 506[µmol/L]

1 10

n = 11SE

FK 506[µmol/L]

Kontrolle


n = 10SE

**

für 24h mit 20 mmol/L Methylmalonat behandelt wurden. Nach 24h wurden on MTT b) DNA-Fragmentation c)

tumneuronen

0 mmol/L FK506 ein leichtes Ansteigen

werden. Die nur mit Methylmalonat

s Kontrollwertes, während die zusätzlich

a. 50% erreichten. Allerdings war dieser

gnifikant. Die Ergebnisse im DNA-

ur leicht erhöhten Fragmentationswerte

hydrogenase wurde nicht durch FK506

ERGEBNISSE 84

MTT

-Red

uktio

n [K

=100

%]

0

50

100

A

DN

A-Fr

agm

enta

tion

[K=1

00%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

FK 506[µmol/L]

Kontrolle


n = 12SE

**

Kontrolle

Methylmalonat 0,1

LDH

-Fre

iset

zung

[Trit

on=1

00%

]

0

20

40

60

80

**

Abbildung 34: 14d alte Striatumneuronen wurde24h behandelten. Zusätzlich wurden die Neurowurden die Zellen auf a) Fähigkeit zu ReduktionFreisetzung von LDH untersucht. ∗∗P< 0,01

84

B

FK506[µmol/L]

Kontrolle

Methylmalonat p 0,1 1 10

n = 7SE

C

FK 506[µmol/L]

1 10

n = 12SE

n mit 20 mmol/L Methylmalonat über nen mit FK506 inkubiert. Nach 24h von MTT b) DNA-Fragmentation c)

DISKUSSION 85

DISKUSSION

Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Apoptose bei der neuronalen Degeneration zu

untersuchen. Dazu wurden in vitro Modelle für Apoptose und Neurodegeneration etabliert,

Nachweismethoden für Apoptose an diese Modelle adaptiert und schließlich potentiell

antiapoptotischen Substanzen in den Modellen getestet.

Zunächst wurde in reinen, serumfreien Neuronenkulturen aus dem Kortex oder Striatum der

Ratte sowie in PC12-Zellen Apoptose durch die Zugabe von Staurosporin induziert. Mit Hilfe

dieser Standard-Substanz wurden geeignete Nachweismethoden ausgewählt: Die Vitalität der

Zellkulturen wurde durch die Reduktion eines zugegebenen Tetrazoliumsalzes bestimmt

(MTT-Test). Apoptose wurde anhand der DNA-Fragmente, die sich bei Apoptose bilden, mit

Hilfe eines ELISA quantifiziert. Tatsächlich sinkt die Zahl der lebenden Neurone nach

Staurosporin-Behandlung konzentrationsabhängig ab. Die DNA-Fragmentation nimmt

hingegen stark zu. Zusätzlich wurde die Aktivität von Caspase-3 im Lysat Staurosporin-

behandelter Zellen bestimmt. Auch hier zeigt sich eine Aktivitätssteigerung von Caspase-3

durch die Behandlung der Kortex-Neuronen mit Staurosporin. Ebenso konnte ein weiterer

wichtiger Marker für Apoptose, die Exposition von Phosphatidylserin, bei Staurosporin-

behandelten Zellen fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden. Neben Kortexneuronen

wurden auch Striatumneurone untersucht: auch hier induziert Staurosporin

konzentrationsabhängig Zelltod und DNA-Fragmentation. Durch Zugabe des Breitspektrum

Caspase-Inhibitors ZVAD-fmk kann sowohl Zelltod als auch DNA-Fragmentation in

Kortexneuronen gehemmt werden, während die Wirkung in Striatum-Neuronen weniger

ausgeprägt war. Die Substanzen Pramipexol, FK506 und Caspase-3-Inhibitor konnten den

durch Staurosporin induzierten Zelltod und die DNA-Fragmentation nicht signifikant

verhindern, jedoch vermochte eine Inkubation mit Deprenyl den Zelltod signifikant zu

verhindern.

In weiteren Modellen für Neurodegeneration wurde die Zellen mit Glutamat, H2O2, AraC

sowie Medium ohne trophische Faktoren inkubiert oder einer Hypoxie/Hypoglykämie

unterzogen. In diesen Modellen konnte jedoch keine Apoptose beobachtet werden. Durch

Inkubation der Neurone mit Malonat oder Methylmalonat wird hingegen sowohl Zelltod als

85

DISKUSSION 86

auch DNA-Fragmentation ausgelöst. Die Bestimmung des Zelltods im Malonat-Modell und

Methylmalonat-Modell erfolgte über die Quantifizierung der freigesetzten Lactat-

Dehydrogenase. Im Gegensatz zum Staurosporin-Modell hatte ZVAD-fmk im

Methylmalonat-Modell mit Kortex-Neuronen nur Einfluß auf die DNA-Fragmentation. Im

Malonat-Modell mit Kortex-Neuronen ergab sich kein signifikanter Unterschied durch die

Behandlung mit ZVAD-fmk. Dagegen konnte bei der Verwendung von Striatum-Neuronen

die durch Malonat induzierte DNA-Fragmentation signifikant reduziert werden. FK506

konnte weder im Malonat-Modell noch im Methylmalonat-Modell Zelltod oder DNA-

Fragmentation in Kortex- oder Striatum-Neuronen verhindern.

Nachweismethoden für Apoptose / Zelltod In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden zum Nachweis von Apoptose verwendet.

Letztlich kann man die einzelnen Methoden immer nur anwenden, um ein bestimmtes,

spezifisches Ereignis (z.B. Fragmentation von DNA) nachzuweisen, das Teil des gesamten

apoptotischen Vorgangs ist. Die TUNEL-Reaktion, die vor einigen Jahren noch eine der

Standard-Nachweisreaktionen für Apoptose darstellte, kann nach neueren Erkenntnissen auch

durch Nekrose verursachten DNA-Abbau markieren (Grasl-Kraupp, B. et al., 1995).Grasl-

Kraupp et al. haben festgestellt, daß in Leberzellen sowohl sicher Nekrose induzierende

Substanzen als auch Apoptose induzierende Substanzen eine positive TUNEL-Testung

ermöglichen. Außerdem ergaben Astrogliazellen, die in der Kultur abgetötet werden, bei der

TUNEL-Methode ebenfalls ein positives Ergebnis. Ein weiterer Nachteil ist die schlechte

Automatisierbarkeit, da die gefärbten Zellen jeweils unter einem Fluoreszenzmikroskop

ausgezählt werden müssen.

Der Nachweis der DNA-Fragmente mit Hilfe von Antikörpern in einem ELISA beruht auf der

Tatsache, daß die bei Apoptose aktivierten DNAsen nur zwischen den Nukleosomen

schneiden und die DNA-Fragmente durch die noch intakte Zellmembran im Zytoplasma

zurückgehalten werden. Die Histon-DNA-Komplexe bleiben bei Apoptose also zunächst

intakt; die bei Nekrose aktivierten DNAsen schneiden jedoch auch die mit Histon assoziierte

DNA und zerstören damit diese Bindung (Burgoyne, L. A. et al., 1974; Stach, R. W. et al.,

1979). Mehrere Autoren haben in den letzten Jahren mit diesem Test-Prinzip gearbeitet und

damit Apoptose auch bei neuronalen oder Neuronen-ähnlichen Zellen zeigen können (Maroto,

R. und Perez-Polo, J. R., 1997; Ray, A. M. et al., 2000; Ohgoh, M. et al., 2000; Bonfoco, E. et

al., 1995). Weitere Vorteile sind die Quantifizierbarkeit und die einfache Handhabung.

86

DISKUSSION 87

In den meisten Fällen ist Caspase-3 beim apoptotischen Zelltod aktiviert. Daher wird eine

Zunahme von Caspase-3 Aktivität von den meisten Autoren mit apoptotischem Zelltod

gleichgesetzt. Allerdings sind auch einige Beispiele bekannt, wo Caspase-3 deletierte Zellen

trotzdem apoptotisch zugrunde gehen oder wo der Einsatz von Caspase-3 Inhibitoren den

Zelltod nicht verhindern kann.

Der Nachweis von exponiertem Phosphatidylserin mit Annexin-Färbungen scheint sehr

spezifisch als Nachweis für Apoptose zu sein. Im allgemeinen ist diese Exposition auch einer

der frühesten Marker für Apoptose. Allerdings ist dieser Test vor allem bei nicht-neuronalen

Zellen angewandt worden. Adayev et al. berichten, daß in einer neuronalen Zellinie

hippocampalen Ursprungs, HN2-5-Zellen, die Exposition von Phosphatidylserin nach

Induktion von Apoptose erst in einem späten Stadium auftreten kann. In diesem Stadium ist

auch schon Caspase-3 aktiviert, die DNA fragmentiert und zum Teil die Zellmembran

zerstört. Dies steht im Gegensatz zu der Meinung, daß Phosphatidylserin in einem sehr frühen

Stadium der Apoptose auf der Außenseite der Zellen nachgewiesen werden kann (Adayev, T.

et al., 1998).

87

DISKUSSION 88

Apoptose- / Neurodegenerationsmodelle

Staurosporin als Apoptose-Induktor

Der Kinase-Inhibitor Staurosporin wurde und wird in sehr vielen Modellen als Apoptose-

auslösende Substanz benutzt. Auch in vielen neuronalen Zellen vermag Staurosporin

Apoptose zu induzieren (Koh, J. Y. et al., 1995; Ahlemeyer, B. et al., 2000; Small, D. L. et

al., 1999). Ein Angriffsziel bei Neuronen sind die Rezeptoren für neurotrophe Faktoren wie

NGF oder BDNF, die das Signal durch Phosphorylierung weitergeben (Ohmichi, M. et al.,

1992). Staurosporin inhibiert auch bei PC12-Zellen die NGF-abhängige Protein-

Phosphorylierung, ebenso wird die Induktion von c-fos gehemmt. Auch wird die trk-Onkogen

abhängige Phosphorylierung in der Zellinie NIH3T3 gehemmt (Miyasaka, T. et al., 1991;

Ohmichi, M. et al., 1992). In Neuronenkulturen des Huhns konnte Staurosporin auch die

Hydrolyse von Sphingomyelin zu Ceramid bewirken, was ebenfalls proapoptotisch wirkt

(Wiesner, D. A. und Dawson, G., 1996). Staurosporin kann Caspase-3 in Zellen aktivieren

(chakravarthy, B. R. et al., 1999; Keane, R. W. et al., 1997), jedoch auch in Caspase-3

deletierten Zellen Apoptose auslösen –hier allerdings ohne die typische DNA-Fragmentation

oder Blebbing (Janicke, R. U. et al., 1998). Die Wirkung von Staurosporin kann z.B. von

mutiertem Presenilin noch verstärkt werden (Kovacs, D. M. et al., 1999). In sehr geringen

Konzentrationen vermag Staurosporin allerdings auch das Auswachsen von Neuriten in

PC12-Zellen auszulösen (Rasouly, D. und Lazarovici, P., 1994; Rasouly, D. et al., 1993;

Rasouly, D. et al., 1992).

Die gewählten Staurosporin-Konzentrationen lagen meist zwischen 0,1 und 1µmol/L; die

Zeiten der Inkubation wurden je nach Apoptose-Nachweis zwischen 4h und 48h festgelegt.

Natürlich hängt die Inkubationszeit auch von der verwendeten Staurosporin-Konzentration

sowie von den Zellen und den Kulturbedingungen ab.

In eigenen Versuchen zunächst mit Kortexneuronen konnte ebenfalls DNA-Fragmentation

nachgewiesen werden. Dabei erwies sich die Konzentration von 1µmol/L Staurosporin und

die Einwirkzeit von 24h als geeignet, um Apoptose sicher zu induzieren. Die DNA-

Fragmentation erreicht bei dieser Kombination Werte von über 200% der Kontrolle, während

simultan die Fähigkeit, MTT zu reduzieren, auf ca. 20% der Kontrolle abnimmt. Eine längere

88

DISKUSSION 89

Inkubation über 48h läßt die Werte der DNA-Fragmentation wahrscheinlich aufgrund

weiterer Degradation der DNA-Histon-Komplexe bei Konzentrationen über 0,1 µmol/L

Staurosporin wieder kleiner werden. Die beschriebene größere Empfindlichkeit jüngerer

Neurone gegenüber Apoptose konnte in eigenen Versuchen bestätigt werden: 7d alte

Kortexneurone zeigen DNA-Fragmentationswerte von 250% der Kontrolle. Das Überleben

der jüngeren Neuronen ist allerdings besser. In diesem Alter sind jedoch NMDA-Rezeptoren,

die ebenfalls eine wichtige Rolle bei Neurodegeneration spielen können, noch nicht voll

entwickelt. Da in vitro Modelle für neurodegenerative Erkrankungen entwickelt werden

sollten, und diese hauptsächlich im Alter auftreten, wo Neurone im Gehirn voll entwickelte

Glutamat-Rezeptoren besitzen, wurden für weitere Untersuchungen 14tägige Kulturen

benutzt.

Der selbst bestimmte EC50-Wert für DNA-Fragmentation von ca. 70 nmol/L Staurosporin bei

24stündiger Exposition und von ca. 40 nmol/L Staurosporin bei 48stündiger Behandlung liegt

im Bereich der Werte, die andere Autoren bestimmt haben. Nach 48h Inkubation von Kortex-

Glia-Mischkulturen aus der Maus mit Staurosporin bestimmten sie einen EC50-Wert von

30 nmol/L (Koh, J. Y. et al., 1995). Andere Autoren konnten durch Staurosporin-Behandlung

mit 0,5 µmol/L in neuronalen Misch Kulturen aus Mäusen nach 16 Stunden eine Wirkung auf

die Vitalität der Neuronen erkennen (Keane, R. W. et al., 1997).

Die mit Staurosporin behandelten PC12-Zellen zeigen deutlich höhere DNA-Fragmentations-

Werte bei Staurosporin-Behandlung als Kortex-Neuronen. Allerdings überleben bei ca. 0,7

µmol/L Staurosporin 50% der Zellen. Die Abhängigkeit der Zellen von nur einem trophischen

Faktor im Medium, dessen Wirkung duch Staurosporin beeinflusst wird, könnte dafür der

Grund sein.

Striatale Kulturen zeigen einen ähnlichen EC50-Wert, was die DNA-Fragmentation betrifft:

ca. 20 nmol/L Staurosporin. Im MTT-Test zeigen sich die striatalen Neuronen sogar weniger

empfindlich gegenüber Staurosporin: der IC50-Wert liegt bei ca. 200 nmol/L Staurosporin.

Die um das ca. 2,5fache erhöhte Aktivität von Caspase-3 und die Exposition von

Phosphatidylserin zeigen ebenfalls Apoptoseinduktion durch Staurosporin in den

Kortexneuronen an. Da DNA-Fragmentation und andere Marker übereinstimmend auftraten,

89

DISKUSSION 90

wurde der Apoptose-Nachweis in weiteren Versuchen mittels Bestimmung der DNA-

Fragmentation per ELISA vorgenommen.

Glutamat als Apoptosemodell Obwohl die Aminosäure Glutamat einer der wichtigsten Botenstoffe im Säugerhirn ist, kann

Glutamat auf Neurone auch toxisch wirken (Rothman, S. M., 1983; Choi, D. W. et al., 1987;

Benveniste, H. et al., 1984). Bei einer zu hohen Konzentration kann es zur sogenannten

exzitatorischen Toxizität kommen, bei der die Zellen vor allem durch die Überaktivierung von

Glutamatrezeptoren geschädigt werden können. Obwohl man ursprünglich von einer rein

nekrotischen Schädigung ausging, gibt es seit einiger Zeit auch Hinweise auf einen

apoptotischen Beitrag zum Zelluntergang (Gwag, B. J. et al., 1995; Grilli, M. und Memo, M.,

1999; Liu, X. und Zhu, X. Z., 1999; Tenneti, L. und Lipton, S. A., 2000). Dabei wurde z.B. in

vivo in striatalen Zellen durch einen metabotropen Glutamat-Agonisten DNA-Fragmentation

ausgelöst (Wang, Y. et al., 1997). In PC12-Zellen wurde eine Schädigung durch Glutamat

(500 µmol/L; 2h) induziert, die durch Überexpression (ca. 100fach) des antiapoptotischen

Proteins Bcl-2 das Überleben der Zellen verbesserte (Tyurin, V. A. et al., 1998). In

cerebrokortikalen Neuronen bewirkte eine Inkubation mit 300 µmol/L NMDA für 20 min in

vitro die Kondensation von Chromatin. Der Inhibitor ZVAD-fmk senkt in diesem Modell die

Anzahl apoptotischer Zellen von ca. 35% auf ca. 15% (Tenneti, L. et al., 1998).

Eigene Versuche mit zunächst 24stündiger Behandlung der Zellen mit Glutamat bewirkte

zwar Zelltod mit einem EC50-Wert von ca. 1,5 µmol/L Glutamat im MTT-Test, jedoch keine

DNA-Fragmentation. Die Werte der DNA-Fragmentation sanken bei steigenden

Konzentrationen von Glutamat, was auf nekrotische Degradation von DNA hinweist.

Bestätigt werden diese Ergebnisse durch andere Studien: kortikale Zellen wurden nach 14d in

Kultur mit 100µM Glutamat behandelt. Nach 6h zeigte sich daß ca. 43% der Zellen eine

nekrotische Morphologie hatten. Staurosporin vermittelte in den gleichen Kulturen jedoch

Apoptose (Small, D. L. et al., 1999). Körnerzellen der Ratte zeigten weder DEVD-spaltende

Aktivitätserhöhung nach Glutamatexposition (0,1; 1mmol/L für 24h) noch wurden die Zellen

durch Apoptose-Inhibitoren geschützt (Simons, M. et al., 1999).

90

DISKUSSION 91

Da viele Autoren sehr kurze Einwirkzeiten für Glutamat wählen (Jiang, Q. et al., 2000; Grilli,

M. und Memo, M., 1999), wurden weitere Versuche mit nur 10minütiger Einwirkzeit von

Glutamat gemacht. Tatsächlich ist die Toxizität nach 24h mit derjenigen vergleichbar, bei der

die Neuronen 24h lang behandelt wurden: der EC50-Wert ist ähnlich. Die DNA-Fragmentation

ist auch hier nicht signifikant stärker als in der Kontrolle; wird bei hohen

Glutamatkonzentrationen aber auch nicht schwächer. Ein Grund für den nekrotischen Zelltod

könnte sein, daß die benutzten Kulturen sehr reine Neuronenkulturen sind, in denen keine

Astrozyten Glutamat abbauen oder Radikalstress abpuffern können. Bei vielen anderen

Autoren kommen Mischkulturen zum Einsatz (Ahlemeyer, B. et al., 2000; Hirashima, Y. et

al., 1999). Auch die Möglichkeit der Maskierung von Apoptose durch Nekrose ist beschrieben

worden. Eine pharmakologische Blockade der Glutamat-Toxizität bei Hypoxie bewirkte eine

klare Ausprägung apoptotischer Marker (Gwag, B. J. et al., 1995). Eine weitere Erklärung für

die unterschiedlichen Ergebnisse könnte die Verwendung unterschiedlich alter Neuronen sein.

Viele Autoren benutzen jüngere, ungefähr 7d alte Neuronenkulturen (Hirashima, Y. et al.,

1999). Chihab et al. haben 6 und 13d alte Kulturen aus dem Vorderhirn der Ratte auf die

Wirkung von Glutamat und Hypoxie untersucht. 6d alte Neuronen zeigten keine Schädigung

durch Glutamat (jedoch Apoptose durch Hypoxie). 13d alte Kulturen hingegen zeigten nach

Behandlung mit Glutamat Schädigung durch Nekrose. Eine Hypoxie bewirkte in 13d alten

Kulturen eine Mischform aus Nekrose und Apoptose (Chihab, R. et al., 1998).

Entzug trophischer Faktoren als Apoptosemodell Der Entzug von trophischen Faktoren ist einer der als erstes benutzten Induktoren um

Apoptose zu induzieren. Dabei kann sowohl auf den Zusatz von Serum mit z.T. undefinierten

Inhaltsstoffen als auch auf definierte Faktoren wie NGF bei PC12-Zellen verzichtet werden.

Je nach Kulturbedingungen sind diese Zusätze für das Überleben von neuronalen Zellen

zwingend notwendig, wenn nicht Gliazellen in Kultur vorhanden sind um die Faktoren zu

produzieren. Unter vielen Kulturbedingungen und in vielen Zellarten zeigt sich auch eine

Induktion proapoptotischer Faktoren durch den Entzug trophischer Faktoren (Solovyan, V. et

al., 1998; Owada, K. et al., 1999; Maroto, R. und Perez-Polo, J. R., 1997; Przywara, D. A. et

al., 1998; Ahlemeyer, B. und Krieglstein, J., 1997).

In eigenen Kortexkulturen wird durch den Entzug konditionierten Mediums nach 24h

tatsächlich ein Rückgang der MTT-Reduktion beobachtet. Es besteht auch ein Trend zu

91

DISKUSSION 92

erhöhter DNA-Fragmentation (bis 200% der Kontrolle), der allerdings nicht signifikant ist.

Ebenfalls nicht signifikant ist der Unterschied zwischen Neurobasal-Medium und Neurobasal-

Medium mit dem Zusatz von B27. Da B27 einige neuroprotektive Substanzen enthält, wäre es

durchaus möglich, daß dessen Zusatz die DNA-Fragmentation senkt. Da Apoptose aufgrund

von Faktor-Entzug vor allem im reifenden Hirn vorkommt, ist es möglich , daß die eigenen,

14d alten Kulturen weniger anfällig für diese Art der Induktion waren.

Da keine signifikanten Änderungen bei der DNA-Fragmentation durch den Entzug

konditionierten Mediums bedingt wurden, scheint es als Modell zur Induktion von Apoptose

unter den gegebenen Bedingungen nicht geeignet zu sein.

Wasserstoffperoxid als Apoptosemodell

Verstärkter Radikalstress kann ebenfalls in einer Vielzahl von Zellarten zum apoptotischen

Tod führen. Die Zugabe von H2O2 zu Zellkulturen wird oft als Modell für oxidativen Stress

benutzt (Maroto, R. und Perez-Polo, J. R., 1997; Uberti, D. et al., 1999; Mielke, K. et al.,

2000; Lee, M. S. et al., 2000). H2O2 gehört nicht zu den Sauerstoff-Spezies, die Radikale sind.

Es wird beim normalen Metabolismus der Neuronen durch die Superoxid-Dismutase beim

Abbau von Superoxid-Radikalen gebildet. Zudem entsteht es bei der Oxidation von

Katecholaminen durch die Monoamin-Oxidase (Halliwell, B., 1992). Die per Mikrodialyse

gemessene Konzentration von H2O2 kann in pathologischen Zuständen (Ischämie-

Reperfusion) durchaus über 100µM erreichen. In einzelnen Kompartimenten (direkt im

Mitochondrium) kann daher die Konzentration durchaus noch höher liegen (Hyslop, P. A. et

al., 1995). Neben den toxischen Wirkungen der Radikale, die aus H2O2 gebildet werden

können, kann H2O2 auch Spaltung des Neuronen-spezifischen Aktivators von CDK5 (cyclin

dependent kinase 5; zuständig unter anderem für das Auswachsen von Neuriten) p35 zu p25

bewirken. Dies führt zu einer Hyperphosphorylierung von Tau, zerstört das Zytoskelett und

fördert den apoptotischen Tod der Neuronen. Die Spaltung von p35 zu p25 wird

offensichtlich von Calpain durchgeführt und ist damit Kalzium-abhängig (Lee, M. S. et al.,

2000). Auch können die Proteine BAK, BAX und BCL-XL durch H2O2 Inkubation

hochreguliert werden (Maroto, R. und Perez-Polo, J. R., 1997). Schließlich kann H2O2 JNK

(Mielke, K. et al., 2000; Bhat, N. R. und Zhang, P., 1999), ERK und p38 MAPK

phosphorylieren und aktivieren (Bhat, N. R. und Zhang, P., 1999) oder die Produktion von

NADH im Zitronensäurezyklus verringern und damit die respiratorische Kapazität in Zellen

92

DISKUSSION 93

limitieren (Chinopoulos, C. et al., 1999) und in Folge davon auch den ATP-Gehalt (Tretter, L.

et al., 1997; Chinopoulos, C. et al., 2000; Sims, N. R. et al., 2000).

Wird H2O2 zu kultivierten Neuronen oder Gliazellen gegeben, erfolgt der Abbau relativ

schnell. Dringen et al. haben die Halbwertszeit von H2O2 und organischen Hydroperoxiden in

astrogliareichen Neuronenkulturen bestimmt. 100 µM H2O2 hat eine Halbwertszeit von

3,1 ± 0,5 min, tBHP (tertiary butylhydroperoxide) 3,5 ± 0,2 min und CHP (Cumene

Hydroperoxide) 4,2 ± 0,2 min. H2O2 und CHP sind im Medium ohne Zellen über 30 min

stabil, während tBHP bei 37°C schon nach 24,5 min zur Hälfte abgebaut ist (Dringen, R. et

al., 1998). In relativ reinen Neuronenkulturen wurde H2O2 (Anfangskonzentration 100µM)

nach 15,1 ± 1,4min zur Hälfte abgebaut. Der Gesamt-Proteingehalt der ausgesäten Neuronen

war allerdings geringer als in den astrogliareichen Kulturen. Bei entsprechender Korrektur

war die Abbaurate in beiden Kulturtypen vergleichbar. Unterschiedlich war allerdings die

Fähigkeit des Glutathion-Systems zum Abbau von H2O2, das bei Neuronen nicht so

ausgeprägt ist (Dringen, R. et al., 1999). Will man einen permanenten oxidativen Stress in

Zellkulturen induzieren, so empfiehlt sich die Benutzung eines Systems, das die Umsetzung

von Hypoxanthin durch Xanthin-Oxidase und Superoxid-Dismutase zu H2O2 nutzt

(Hirrlinger, J. et al., 1999).

Die in eigenen Versuchen verwendete H2O2-Inkubationszeit von 24h relativiert sich durch den

oben beschriebenen schnellen Abbau in Kultur. Damit sollten die Versuche vergleichbar mit

denen anderer Autoren sein, die kürzere Einwirkzeiten für H2O2 nutzen. Teilweise wird in der

Literatur ein apoptotischer Tod der Zellen beschrieben (Maroto, R. und Perez-Polo, J. R.,

1997; Uberti, D. et al., 1999); teilweise überwiegend Nekrose oder Mischformen (Bastianetto,

S. et al., 1999; Bhat, N. R. und Zhang, P., 1999; Duffy, S. et al., 1998; Sagara, Y. et al.,

1999). Die eingesetzten Konzentrationen, die Zelltod auslösten, lagen im Bereich 20µmol/L

bis 1mmol/L. In relativ reinen Kulturen mit Kortex-Neuronen der Ratte verursachte eine

30minütige H2O2 Inkubation nach 6h einen toxischen Effekt, der nach 24h maximal war (ca.

45% überlebende Zellen). Der LC50 betrug 41,8 ± 1,9µM (Fernández-Tomé, P. et al., 1999).

Der in eigenen Versuchen bestimmte Wert liegt im gleichen Bereich. Offensichtlich wurde

aber bei den eigenen Versuchen lediglich Nekrose induzierte. Vielleicht waren auch die

Konzentrationen von H2O2 nicht fein genug abgestuft. Die späteren Experimente mit Malonat

zeigen, daß Apoptose nur in einem engen Konzentrationsbereich von Malonat auftritt. Eine

ständige Inkubation mit geringen Konzentrationen von H2O2 statt einer einmaligen Gabe

93

DISKUSSION 94

hoher Konzentrationen hätte evtl. auch DNA-Fragmentation ausgelöst. Da keine erhöhte

DNA-Fragmentation durch Behandlung der Kortexneuronen mit H2O2 festgestellt werden

konnte, wurde das H2O2-Modell nicht weiterverfolgt.

AraC als Apoptosemodell Cytosin Arabinosid (AraC) ist ein kompetitiver Inhibitor des Einbaus von 2´Deoxycytidin in

DNA. Diese Substanz kann allerdings auch in postmitotischen Neuronen Zelltod auslösen. In

Kulturen des Sympathikus aus Ratten konnte mit AraC Apoptose induziert werden. Dazu war

es nicht nötig, den Neuronen NGF zu entziehen. Es konnte DNA-Fragmentation und auch

eine apoptotische Morphologie der Kerne nach Bisbenzimid-Färbung gezeigt werden

(Deckwerth, T. L. und Johnson Jr., E. M., 1993; Martin, D. P. et al., 1990). Neurone des

parasympathischen Systems benötigen für ihr Überleben in Kultur u.a. Insulin. AraC blockiert

konzentrationsabhängig diese trophische Wirkung des Insulin. Auch in DRG-Neuronen wird

die trophische Wirkung von NGF blockiert. Diese Inhibierung scheint nicht-kompetitiv zu

sein; der toxische Effekt kann jedoch von 2´Deoxycytidin blockiert werden. Der toxische

Effekt von AraC wurde bei anderen Mitose-Inhibitoren nicht beobachtet. Der IC50 für das

Überleben nach 4d betrug für beide Versuche 2 x 10-8M (Wallace, T. L. und Johnson Jr., E.

M., 1989). Im Gegensatz dazu kann AraC auch neurotroph wirken bzw. den Zelltod

verhindern: in nanomolaren Konzentrationen verhindert AraC den sonst in Zellkultur spontan

auftretenden apoptotischen Zelltod bei dopaminergen Neuronen des Mesencephalons. Die

Autoren gehen von einem indirekten trophischen Effekt aus, der über die Gliazellen in den

Kulturen vermittelt wird. Bei hohen Konzentrationen (>10µmol/L) sterben alle Neuronen in

den Kulturen. Einen Schutz gegen MPTP vermittelt AraC hingegen nicht (Michel, P. P. et al.,

1998).

Da in eigenen Versuchen selbst hohe Konzentrationen bis zu 10µmol/L AraC keine toxische

Wirkung in kortikalen Kulturen zeigten und zudem die Kulturen am Tag 2 mit AraC zur

Unterdrückung glialen Zellwachstums behandelt werden, wurde auf die Bestimmung der

DNA-Fragmentation verzichtet und das Modell nicht weiterverfolgt. Eine Ursache könnte

darin begründet sein, daß die eigenen neuronalen Kulturen kaum Gliazellen enthalten, die

eventuell für eine erhöhte DNA-Fragmentation verantwortlich sein könnten. Auch der Verlust

trophischer Aktivität durch den Tod von Gliazellen kann in der eigenen Zellkultur nicht

stattfinden.

94

DISKUSSION 95

Entzug von Sauerstoff und Glukose als Apoptosemodell In der Literatur finden sich auch Hinweise auf durch Sauerstoff-Glukose-Entzug verursachten

apoptotischen Zelltod. So konnten Gwag et al. zeigen, daß in kortikalen Neuronenkulturen der

Maus Sauerstoff-Glukose-Entzug nekrotischen Zelltod verursacht. Dieser Zelltod ist

wahrscheinlich durch Toxizität von ausgeschüttetem Glutamat verursacht, da diese Toxizität

durch Glutamat-Antagonisten gehemmt werden kann. Wurde die Hypoxie-Hypoglykämie

weiter verlängert, so trat Apoptose auf (Gwag, B. J. et al., 1995). In 4d alten kortikalen

Neuronen der Maus konnte der nekrotische Zelltod -induziert durch Sauerstoffentzug- durch

Behandlung mit DNQX (6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione; ein Kainat-Antagonist) und Trolox

(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid; ein Inhibitor von Lipid-Oxidation)

inhibiert werden. Trotzdem konnten die Neuronen Apoptose begehen. Besonders in DNQX-

behandelten Zellen war die apoptotische Tätigkeit hoch (TUNEL-Färbung). Bei der DNQX-

behandelten Gruppe wurde auch ein erhöhter Anteil von fragmentierten Zellkernen

festgestellt. Ebenfalls bei den DNQX-behandelten Zellen wurde ein erhöhter Wert von H2O2

gemessen. Offensichtlich wird durch die Blockade des nekrotischen Zelltods die Apoptose

ermöglicht bzw. deutlich gesehen (Copin, J.-C. et al., 1998). In einem in vivo-Modell

transienter globaler Ischämie im Hund konnte gezeigt werden, daß Apoptose und Nekrose

jeweils in bestimmten Neuronenpopulationen auftreten: CA1-Pyramidenzellen und Purkinje-

Zellen waren nekrotisch; degenerierte Körnerzellen jedoch apoptotisch. DNA-Extrakte des

Hippocampus und des Kortex zeigten sowohl apoptotische DNA-Fragmentation als auch

nekrotischen Zufalls-Abbau der DNA (Martin, L. J. et al., 2000). In Kulturen kortikaler

Neuronen der Maus konnte apoptotische DNA-Fragmentation durch den Entzug von

Sauerstoff festgestellt werden, jedoch nicht wenn den Neuronen Serum, Sauerstoff und

Glukose entzogen wurde (Copin, J. C. et al., 1996).

Obwohl in eigenen Versuchen zum Teil deutliche DNA-Fragmentation bei kortikalen

Kulturen festgestellt wurde, fehlte dieser Marker für Apoptose bei annähernd gleich

durchgeführtem Sauerstoff-Glukose-Entzug in anderen Kulturen völlig. Offensichtlich war

eine feine Justierung der Noxe mit den vorhandenen Mitteln nicht möglich, so daß die

Neuronen oft auch nekrotisch starben oder überlebten. Bei einer Induktion von Apoptose muß

die Zelle genügend Energie haben, die Apoptose auch durchzuführen (Nicotera, P. und

Lipton, S. A., 1999), was in eigenen Versuchen wohl nicht der Fall war. Dieses Modell wurde

daher nicht weiterverfolgt.

95

DISKUSSION 96

Methylmalonat / Malonat Die Verhältnisse bei neurodegenerativen Erkrankungen wurden in weiteren Versuchen durch

Inkubation der Zellen mit Malonat simuliert. Malonat hemmt reversibel Komplex II der

Atmungskette und verursacht auf diese Weise Energiemangel und Radiaklstress.

Methylmalonat wird besser von den Zellen aufgenommen und intern in Malonat

umgewandelt. NP-3 ist ein irreversibler Inhibitor von Komplex II der Mitochondrien und

verursacht bei systemischer Gabe in vivo ebenfalls vor allem Defekte im Striatum (Beal, F. M.

et al., 1993).

Komplex II Inhibitoren stellen gute Modelle für Chorea Huntington dar; Energiemangel und

Radikalstress sind jedoch Phänomene, die bei allen neurodegenerativen Erkrankungen

vorkommen (Malcon, C. et al., 2000). Daher verwundert es nicht, daß Methylmalonat auch als

Toxin für ein ALS-Modell in vitro benutzt wird. Behandlung von Motoneuronen mit Malonat

führt zu (wahrscheinlich apoptotischem) Zelltod, der mit Caspase-Inhibitoren verhindert

werden kann (Kaal, E. C. et al., 2000). Weitere Studien zeigen, daß Methylmalonat oder

Malonat die potentiell toxische Wirkung von Dopamin verstärkt, und zwar sowohl in

kortikalen als auch in striatalen Kulturen oder in vivo (McLaughlin, B. A. et al., 1998b; Moy,

L. Y. et al., 2000). Daß oxidativer Stress an der Toxizität von Malonat oder Dopamin beteiligt

ist, wird durch die Tatsache unterstützt, dass ein verringerter Glutathionlevel die Toxizität in

Kulturen des Mesenzephalons verstärkt. BSO (Buthionin sulfoximin) verhindert die Bildung

von Glutathion durch Blockade des ersten Glutathion Synthese-Enzyms (gamma-

Glutamylcystein-Synthetase). Eine Behandlung der Kulturen mit 10 µmol/L BSO für 24h

ergab einen um 68 % erniedrigten Level von Glutathion, der nach 24h alleine nicht toxisch

war. Eine Inkubation der Zellen für 24 mit Malonat (25 mmol/L) war ebenfalls nicht toxisch,

50 mmol/L zeigten einen ersten Trend zur Toxizität, jedoch nicht signifikant. Eine Inkubation

von zunächst mit BSO behandelten Zellen mit Malonat ergab eine signifikante Toxizität von

25 mmol/L Malonat (Zeevalk, G. D. et al., 1997). In einem ähnlichen Zellkultursystem konnte

die Behandlung mit Radikalfängern ebenfalls die Zellen vor dem Zelltod durch Behandlung

mit Malonat oder der Kombination aus BSO/Malonat schützen. Obwohl in dieser Studie

vermutet wird, daß Malonat seine toxische Wirkung auch über den NMDA-Rezeptor entfaltet,

und danach erst der oxidative Stress entsteht, wird auch gezeigt, daß gegen Glutamat selbst

nur ein Teilschutz durch radikalfangende Substanzen besteht. Zusätzliche Versuche zeigten,

daß die GABA-Population von Neuronen in Kultur zwar weniger sensitiv gegenüber Malonat

ist, daß dies jedoch durch BSO aufgehoben wird. Tatsächlich scheinen GABA-Neuronen

96

DISKUSSION 97

lediglich einen höheren Glutathion-Gehalt zu besitzen, der die Zellen vor Malonat bedingtem

Zelltod schützt (Zeevalk, G. D. et al., 1998b).

Einige Hinweise zu der Induktion von apoptotischem Zelltod wurden in folgenden Studien

erhalten: bei intrastriataler Injektion von Malonat in Mäusen wird Caspase-1 aktiviert. Eine

Bestimmung von Interleukin-1-beta ergab sowohl für Wildtypmäuse (125,2 ± 19,6 pg/g

Gewebe), als auch für die Caspase-1-Mutanten (53,2 ± 15,1pg/g) eine erhöhte Konzentration

von Interleukin-1beta gegenüber der Kontrolle (39,6 ± 1,7 pg/g). Die Injektion von Malonat

in Caspase-1 deletierte Mäuse allerdings ergibt einen um 65% kleineren Schaden im Striatum.

Bei der Gabe von 3-NP reduzierte sich der Schaden in den Mutanten sogar um 91,2% . In

anderen Arbeiten konnte gezeigt werden, daß intrastriatale Injektionen von Malonat in einer

Anzahl von TUNEL-positiven Neuronen zu einer Aktivierung von Caspase-2 führt. Läsionen

konnten durch ZVAD-fmk verringert werden (Schulz, J. B. et al., 1998). 3-NP verursacht bei

Applikation auch TUNEL-positive Neuronen und DNA-Fragmentation im Striatum (Sato, S.

et al., 1998; Andreassen, O. A. et al., 2000).

Methylmalonyl-CoA Mutationen (Methylmalonazidurie) sowie ein Mangel an B12 haben

erhöhte Serumkonzentrationen von Methylmalonat zur Folge, die ebenfalls neurotoxisch

wirken können. Untersuchungen dazu wurden u.a. von (de Mattos-Dutra, A. et al., 2000) und

(Narasimhan, P. et al., 1996) durchgeführt.

Die Wirkung von Malonat und Methylmalonat in striatalen und kortikalen Neuronenkulturen

haben McLaughlin et al. verglichen: Die benutzten Kulturen wurden nach 2 Tagen serumfrei

in NB-Medium mit B-27 Zusatz gehalten und enthielten dann maximal 25% Astrozyten. Die

Zellen wurden nach 6-8 Tagen in Kultur untersucht. Im Gegensatz dazu wurden die in der

vorliegenden Arbeit verwendeten Zellen ständig in B-27-haltigem, Astrozytenkonditioniertem

Medium kultiviert. Zudem wurden die Neuronen erst nach 14 Tagen in Kultur den Versuchen

unterzogen.

Bei Mc Laughlin et al. ergab eine Inkubation mit Medium ohne B-27 für 24h einen Zelltod

von 24 % für Kortexneuronen und 17 % für striatale Neuronen gegenüber den Kulturen vor

der Inkubation. Der Einfluß von B27 scheint in diesen Kulturen trotz der angegebenen 25%

Astrozyten stark zu sein.

97

DISKUSSION 98

Eine Behandlung mit 1mmol/L Methylmalonat resultierte bei Kortexkulturen in 50 % und bei

Striatumkulturen in 79 % Zelltod. Wurde mit einer höheren Konzentration von 10 mmol/L

Methylmalonat inkubiert, erreichte die Zahl toter Kortexneuronen 89 % und 95 % toter

striataler Neuronen. Ein Zusatz von B-27 zum Medium kortikaler Kulturen während der

Dauer der Methylmalonatinkubation senkte den Zelltod nicht signifikant. In striatalen

Kulturen hingegen ergab ein Zusatz von B-27 bei einer Inkubation mit 1mmol/L

Methylmalonat einen viel geringeren Anteil toter Zellen von 29 %.

Ein Vergleich von Malonat mit Methylmalonat in Striatumkulturen ergab eine deutlich höhere

Toxizität für Methylmalonat: nach 24h starben bei 1mmol/L Methylmalonat 48 % der Zellen

gegenüber 31 % bei 1mmol/L Malonat. Bei der höheren Konzentration von 10 mmol/L ergab

sich für Methylmalonat ein Wert von 88 % Zelltod gegenüber 39 % bei Malonat. Eine DNA-

Fragmentation wurde in striatalen Kulturen nach Inkubation mit 1 mmol/L Methylmalonat

schon nach 3h beobachtet;, am stärksten ausgeprägt war sie nach 6h. Nach 8h beobachteten

MCLaughlin et al. zusätzlich zum „Laddering“ eine unspezifische Degradation von DNA.

Beides wurde in Kontrollkulturen nicht beobachtet. Apoptose wurde in dieser Studie weiter

bestätigt durch Videoaufnahmen der Zellen: 46% der striatalen Neuronen, die mit 1mmol/L

Methylmalonat behandelt wurden, zeigten das typische „Blebbing“ apoptotischer Zellen; 31%

der Zellen starben jedoch nekrotisch mit typischem Schwellen des Zellkörpers und Platzen

der Zelle. Das Verhältnis ATP/ADP wurde ebenfalls untersucht und zeigte in kortikalen

Kulturen schon nach 20 min einen Rückgang von ca. 10-15%. Nach 3h zeigte sich in

kortikalen sowie striatalen Kulturen bei 1mmol/L Methylmalonat keine signifikante

Auswirkung auf das Verhältnis ATP/ADP, jedoch bei 10 mmol/L ein signifikant geringeres

Verhältnis. Dies war unabhängig von dem Zusatz von B-27. 10 mmol/L Methylmalonat

konnten in den Kortexneuronen in Kultur nach 3h den normalen Kalzium-Ionengehalt

vervierfachen, den K+-Gehalt in der Zelle erniedrigen und den Na+-Gehalt erhöhen. Das

Membranpotential sank schon nach ca. 20 min signifikant ab und erreicht nach 3h Werte von

-20 mV (Kontrollwert: 80mV). Allgemein nimmt die Empfindlichkeit von striatalen

Neuronen in vivo gegenüber Malonat mit dem Alter der Neuronen zu (Beal, F. M. et al.,

1993). Das gilt auch für Glutamat in kortikalen und striatalen Kulturen (Choi, D. W. et al.,

1987; Choi, D. W. et al., 1987).

In Kulturen von Kortex und Striatum treten bei eigenen Versuchen mit Methylmalonat und

Malonat ebenfalls konzentrationsabhängig Zelltod und DNA-Fragmentation auf. Mit dem

98

DISKUSSION 99

MTT-Test wird in diesem Modell nur die Hemmung der Succinat-Dehydrogenase durch

Malonat gemessen, daher wurde der Zelltod mit Hilfe des LDH-Tests bestimmt. Die

halbmaximale Inhibition der Succinat-Dehydrogenase in Kortexneuronen wird durch ca.

30 mM Methylmalonat erreicht; in Striatumkulturen durch ca. 20 mm. Bei 30 mmol/L setzt

auch im LDH-Test bei Kortexneuronen ein Trend zu erhöhtem Zelltod ein, der allerdings bis

100 mM nicht signifikant ist. Striatale Zellen hingegen zeigen schon bei 12 mmol/L

Methylmalonat deutliche LDH-Freisetzung (EC50 ca. 12 mmol/L). Die von McLaughlin et al.

beschriebene höhere Empfindlichkeit von striatalen Kulturen gegenüber Methylmalonat kann

also bestätigt werden. Eine DNA-Fragmentation wird schon bei Konzentrationen von

4 mmol/L Methylmalonat beobachtet, während die maximale (200% der Kontrolle) DNA-

Fragmentation in Kortexkulturen bei 20 mmol/L Methylmalonat auftritt. Diese DNA-

Fragmentation tritt schon nach 4h ein und wird noch stärker bis 24h nach Versuchsbeginn. In

striatalen Kulturen sehen die Werte für DNA-Fragmentation ähnlich aus: die maximalen

Werte werden bei 20 mmol/L Methylmalonat erreicht. Die Unterschiede zu der Studie von

McLaughlin et al. liegen u.a. in der Nutzung von sehr reinen, 14d alten Neuronenkulturen

gegenüber jüngeren Mischkulturen bei McLaughlin et al..

Die Verwendung von Malonat als Succinat-Dehydrogenase-Inhibitor ergab

überraschenderweise bei Kortex-Neuronen sowie bei Striatum-Neuronen eine höhere

Empfindlichkeit sowohl im MTT-Test, bei der DNA-Fragmentation als auch (zumindest für

Kortex-Neuronen) beim LDH-Test. Eine Erklärungs-Möglichkeit wäre, daß Malonat direkt

als Inhibitor vorliegt und sofort wirken kann. Interessant ist, daß Striatumneuronen gegenüber

Malonat bzw. Methylmalonat empfindlicher sind als Kortex-Neuronen, daß jedoch gegenüber

Staurosporin Kortexneuronen zumindest im MTT-Test empfindlicher sind. Die höhere

Empfindlichkeit der Striatumneuronen gegenüber Malonat ist auch in in vivo-Experimenten

gegeben (Beal, F. M. et al., 1993).

99

DISKUSSION 100

Einfluss des pH-Wertes auf die Fragmentation Die Behandlung von Kulturen kortikaler und striataler Neurone mit Methylmalonat in saurem

Medium ergab deutlich höhere Werte bezüglich der DNA-Fragmentation. Tatsächlich hat der

pH-Wert Einfluß auf die Apoptose: In Kulturen kortikaler Neuronen der Maus wurde die

Interaktion zwischen pH-Wert und oxidativen Streß untersucht: bei einem pH-Wert von 6,2

war die Toxizität (Nachweis durch Propidiumiodidfärbung, LDH-Freisetzung) von H2O2 nach

18 Stunden (Inkubation mit H2O2 für eine Stunde) deutlich größer als bei normalem pH-Wert.

Bei 150 µmol/L H2O2 starben ca. 70 Prozent der Neuronen bei einem pH-Wert von 6,2;

dagegen waren es bei einem neutralen pH-Wert von 7,2 nur ca. 20 %. Bei der Messung der

Freisetzung von LDH war die Freisetzung induziert durch 150 µM Wasserstoffperoxid bei

einem pH-Wert von 6,2 ungefähr 4 x so groß wie bei einem pH-Wert von 7,2. Im Gegensatz

zu H2O2 wurde der durch AAPH (2,2´-azobis(zwei-amidopropane) dihydrochlorid; ein

hydrophiler Peroxyl-Generator) induzierte Zelltod nicht durch den pH-Wert beeinflußt. Eine

Möglichkeit der Wirkung von niedrigem pH-Wert auf die Toxizität von Wasserstoffperoxid

könnte die damit verbundene Freisetzung von Eisenionen in der Zelle sein. Ist Eisen nicht

komplexiert, so können durch die Fenton-Reaktion toxische Hydroxyl-Radikale entstehen.

Eine weitere Möglichkeit wurde von den Autoren untersucht: sowohl die Aktivität von

Glutathion-Peroxidase als auch Glutathion-S-Transferase wurden durch den niedrigen pH-

Wert von 6,2 um 50-60% gesenkt. Die Aktivität von Glutathion-Reduktase war bei einem pH-

Wert von 6,2 um 20% kleiner als bei einem pH-Wert von 7,2. Eine Absenkung des pH-

Wertes verringert also deutlich die Aktivität von wichtigen antioxidativen Enzymen (Ying,

W. et al., 1999). Noch wichtiger in diesem Zusammenhang ist die Arbeit von Shigemi

Matsuyama et al., die zeigen konnten, daß ein saurer pH-Wert im Cytosol die Freisetzung von

proapoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien triggert und die Aktivierung von Caspase-9

und damit auch Caspase-3 ermöglicht (Matsuyama, S. et al., 2000).

100

DISKUSSION 101

Substanzen in Apoptosemodellen

ZVAD-fmk im Staurosporin-Modell ZVAD-fmk als Breitspektrum-Inhibitor von Caspasen kann in einer Vielzahl von Zellarten

und apoptotischen Induktoren Apoptose unterdrücken oder verzögern. Es tritt als Methylester

in die Zelle ein und wird von Esterasen zum aktiven Peptid gespalten (Tenneti, L. et al.,

1998). Da Staurosporin-induzierte Apoptose ebenfalls die Aktivierung von Caspasen

beinhaltet (Krohn, A. J. et al., 1998), sollte dieser Inhibitor die Apoptose blockieren können.

Tatsächlich konnte Kim et al zeigen, daß Zellen einer dopaminergen Zellinie, MN9D, eine

Behandlung mit 1µmol/L Staurosporin für 24h nur zu 8,6% überleben. Die Quantifizierung

erfolgte mit Hilfe des MTT-Tests. Ungefähr 50% der Zellen waren schon nach 10-12h tot.

Nach dieser Zeit war auch eine PARP-Spaltung zu beobachten. Zusätzlich untersuchte PC12-

Zellen starben nach der Behandlung mit 1µmol/L Staurosporin zu 80%. In MN9D-Zellen

wird durch die Staurosporinbehandlung auch ein kleines Bax-reaktives Spalt-Produkt (18 kD)

erzeugt. Der Caspase-Inhibitor Z-VAD-fmk sowie die Überexpression des Proteins Bcl-XL

konnten den Zelltod durch Staurosporin verhindern (ZVAD-fmk: 64,3%; Bcl-XL: ca. 100%

Überlebensrate). Ebenso wird die PARP-Spaltung und die Generation des Bax-reaktiven

Spaltproduktes verhindert (Kim, J. E. et al., 1999). In der Monozytenzellinie THP1 löst

Staurosporin (0,5 µmol/L) nach 4h Apoptose aber auch Nekrose aus. Die nekrotischen Zellen

gehen dabei nicht von apoptotischen Zellen aus; stellen mithin keine sekundäre Nekrose dar.

Z-VAD-fmk senkt die Zahl der apoptotischen Zellen von 18,1 ± 4 auf 3,2 ± 2,4%. Dabei

verhindert Z-VAD-fmk auch die DNA-Fragmentation sowie die für Apoptose typische

Spaltung von PARP. Die Anzahl der nekrotischen Zellen wird in diesem Zellsystem

allerdings nicht beeinflußt (Zhu, H. et al., 1995). ZVAD-fmk kann auch Apoptose, die durch

die Injektion von Cytrochrom-C in den Zellkörper von adrenokortikalen Y-1 Tumor-Zellen,

normalen Rattennierenzellen epithelialen Ursprungs (NRK), 3T3 Fibroblasten der Maus

sowie promyelozytären IPC81 Leukämie-Zellen der Ratte verhindern: 90 min nach Injektion

von Cytochrom-C waren je nach Zellart zwischen 28,3 ±4,3 und 52,6 ± 7,2% apoptotisch.

Eine Vorinkubation mit Z-VAD-fmk senkt diesen Wert auf unter 9% (NRK-Zellen; ohne Z-

VAD-fmk: 46,7 ±4,7%) (Zhivotovsky, B. et al., 1998).

Auch im eigenen Staurosporin-Modell zeigt ZVAD-fmk neuroprotektive Wirkung. Zelltod

sowie DNA-Fragmentation wurden konzentrationsabhängig von ZVAD-fmk verhindert.

Dabei stimmen die beobachteten Konzentrationen (100 µmol/L ZVAD-fmk zeigt gute

101

DISKUSSION 102

Wirksamkeit) gut mit den in der Literatur gefundenen Werten überein. Dies bestätigt noch

einmal, daß Staurosporin in den eigenen Modellen Apoptose auslöst.

ZVAD-fmk im Malonat-Modell Aufgrund der Wirksamkeit von ZVAD-fmk im Staurosporin-Modell wurde ZVAD-fmk auch

im Malonat-Modell auf neuroprotektive Wirkung getestet. Tatsächlich konnte die höchste

Konzentration von ZVAD-fmk -100µmol/L- die durch Methylmalonat induzierte DNA-

Fragmentation in Kortex-Neuronen signifikant verringern. Obwohl ein Trend zur

neuroprotektiven Wirkung im LDH-Test zu sehen war, konnte kein signifikanter Unterschied

zu den mit Methylmalonat behandelten Zellen entdeckt werden. Auch in Striatum-Neuronen

war der Effekt von ZVAD-fmk ähnlich.

ZVAD-fmk wurde auch von anderen Autoren getestet: ZVAD-fmk zeigt in einem ähnlichen

Modell, in dem Kortexneuronen in Kultur mit einem mitochondrialen Inhibitor behandelt

wurden, keine Wirkung auf das Ausmaß des Zelltodes. Dabei wurden die 6-7 Tage

kultivierten Zellen mit dem irreversiblen Succinat-Dehydrogenase Inhibitor NP-3 (bis

4mmol/L) behandelt; entweder in Cokultur mit Astrogliazellen oder alleine. Nur bei Cokultur

mit Astrozyten wurde ein apoptotischer Zelltod innerhalb 4d detektiert (DNA-Fragmentation

mit ELISA, Casp-3 Aktivität); in Abwesenheit von Gliazellen starben die Neuronen innerhalb

24h ohne Anzeichen von Apoptose. Weder ZVAD-fmk (3µmol/L) noch Ac-DEVD-CHO

(100 µmol/L) konnten den NP-3 induzierten Zelltod verhindern. Die Cokultur der Neuronen

mit Gliazellen konnte den Zelltod ebenso verzögern wie die Inkubation mit konditioniertem

Medium verzögern. Dieser Effekt ließ sich nicht mit neurotrophen Faktoren wie BDNF,

GDNF, NT-3, bFGF oder einer Kombination dieser Faktoren imitieren. Wichtig ist, daß in

dem hier dargestellten System MK-801 und NBQX ständig im Medium vorhanden waren -

und somit ein Zelltod via Glutamat-Rezeptoren ausscheidet (Ohgoh, M. et al., 2000). Die

Theorie, daß Fragmente von mutiertem (verlängertem) polyGlutamin-Ende toxisch für Zellen

sind (indem sie den Metabolismus stören), haben Wellington et al. untersucht: in Hek 293T

Zellen, in immortalisierten striatalen Zellen und in einer hippocampalen Zellinie HN33 wurde

ein Vektor exprimiert, der entweder 15 oder 138 Glutaminreste des Huntingtins bedingt.

Zusätzlich wurden die Zellen mit Tamoxifen, einem PKC-Inhibitor behandelt. Tamoxifen

kann abhängig von der Länge der Glutaminkette des Huntingtin in den behandelten Zellen

Apoptose-auslösen. Huntingtin wurde in den apoptotischen Zellen an Caspase-3 spezifischen

Schnittstellen gespalten und ergab auf Western-Blots spezifische Banden distinkter Größe.

Die Behandlung mit ZVAD-fmk oder Z-DEVD-fmk, die auch die Spaltung des Huntingtin

102

DISKUSSION 103

verhindert, blockiert auch die Toxizität fast völlig. Auch die Mutation der Caspase-3

Schnittstellen im Huntingtin verhindert eine Spaltung nach Tamoxifen-Behandlung;

allerdings wurden auch weitere Schnittstellen für z.B. Caspase-6 gefunden. Interessanterweise

senkt die Mutation von Caspase-Schnittstellen die Aktivierung von Caspase-3 oder ähnlichen

DEVD-spaltenden Proteasen, die ansonsten in Tamoxifen behandelten Huntingtin

transfizierten Zellen gefunden wird. Caspase-resistentes (mutiertes) Huntingtin verhindert

ebenfalls die Bildung von Aggregaten, die in vielen in vitro-Modellen auch als Indikator für

Toxizität dargestellt werden (Wellington, C. L. et al., 2000).

Caspase-3 Inhibitor Im Staurosporin-Modell wurde ebenfalls der Caspase-3 Inhibitor DEVD-CHO getestet.

Interessanterweise wirkt DEVD-CHO zwar neuroprotektiv, jedoch wird die DNA-

Fragmentation nicht verhindert. Bei 100µmol/L DEVD-CHO wird die DNA-Fragmentation

sogar deutlich erhöht. Eine Erklärung für dieses Phänomen könnte der verwendete Inhibitor

geben: dieser enthält n-terminal eine hydrophobe Sequenz aus dem Signal-Peptid des Kaposi

Fibroblasten-Wachstumsfaktors, das die Zellgängigkeit verbessern soll. Eventuell kann diese

Sequenz Apoptose auslösen oder toxisch wirken.

Pramipexol Im Staurosporin-Modell wurden weitere Substanzen auf antiapoptotische Wirkung getestet:

Pramipexol, ein Dopamin-Agonist mit antioxidativen Eigenschaften und Hinweisen auf die

Verhinderung der Apoptose durch Hemmung der Freisetzung von proapotpotischen Faktoren

aus Mitochondrien.

MPP+ hemmt Komplex I der mitochondrialen Atmungskette und erzeugt Radikal-Streß über

die Generierung von Hydroperoxiden und Hydroxyl-Radikalen (Cassarino, D. S. et al.,

1998a). Bei niedriger Dosierung von MPTP werden vor allem dopaminerge Neuronen

betroffen (Akaneya, Y. et al., 1995; Kitayama, S. et al., 1993). Pramipexol verhindert die

Entstehung von Radikalstreß sowohl in Zellkulturen, als auch in Mikrodialyse-Experimenten

mit MPTP-Infusionen in das Striatum. Zudem kann Pramipexol in Präparationen von

Mitochondrien das Öffnen der MPT verhindern (Cassarino, D. S. et al., 1998a). Zhao Dung

Ling spekulieren auf einen autotrophen Faktor in der Größe von 35kD, der durch Pramipexol

induziert wird, und/oder die Verhinderung der Expression von neuroinhibitorischen Faktoren

in der Größe von 31kD und 55kkD. Takata et al. (Takata, K. et al., 2000) konnten zeigen, daß

eine Behandlung über vier Tage zu einer deutlichen Steigerung von Bcl-2 Immunoreaktivität

103

DISKUSSION 104

in Ratten führt. Dabei waren die erhöhten Konzentrationen von Bcl-2 vor allem in

dendritischen Prozessen des zerebralen Kortex und des Hippocampus sowie in zerebralem

Kortex (Soma) zu finden.

Pramipexol ist ein synthetischer Dopamin-Agonist mit hoher Affinität und Selektivität für die

D2-Familie der Dopamin-Reezptoren (Mierau, J. et al., 1995; Piercey, M. F. et al., 1996;

Piercey, M. F. et al., 1997). Pramipexol kann zudem in vitro die Oxidation von Lipiden und

den Verlust der ATPase-Ionen-Transport-Aktivität verhindern. Die Substanz wirkt auch als

Sauerstoff-Radikal-Fänger (Cassarino, D. S. und Bennett, J. P. J., 1999). In vivo hat

Pramipexol neuroprotektive Eigenschaften: es reduziert die verzögerte Toxizität nach einer

Ischämie in dopaminergen Neuronen in Wüstenspringmäusen. Außerdem reduziert

Pramipexol den Verlust von dopaminergen Neuronen der Substantia Nigra in Mäusen nach

einer Behandlung mit Metamphetamin (Hall, E. D. et al., 1996). Pramipexol inhibiert auch die

Öffnung der MTP nach Induktion durch MPP+ , Ca2+ oder Pi und reduziert die Konzentration

von freien Radikalen nach MPP+-Behandlung von Zellen (Cassarino, D. S. et al., 1998b).

Tatsächlich konnte in eigenen Versuchen die neuroprotektive Eigenschaft von Pramipexol

bestätigt werden: die toxischen Eigenschaften von Staurosporin werden durch 1000µmol/L

Pramipexol blockiert. Dabei wird allerdings die DNA-Fragmentation nicht beeinflußt.

Wahrscheinlich werden durch Pramipexol die mitochondrialen Reduktionseigenschaften

geschützt, so das MTT nach 24h noch reduziert werden kann, während die DNA-

Fragmentation unbeeinflußt ist.

Deprenyl Ein weiterer Inhibitor der im Staurosporin-Modell getestet wurde, ist Deprenyl. Diese

Substanz ist ein MAO-Inhibitor, der den Radiaklstress durch den Abbau von Dopamin

verhindern kann. Bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit konnte L-Deprenyl die klinische

Situation verbessern (Martignoni, E. et al., 1991). Deprenyl wurde ebenfalls in einer Studie

zusammen mit Tocopherol für die Behandlung von Parkinson in einem frühen Stadium

getestet. Dabei zeigte sich ein signifikant verlangsamtes Fortschreiten der Krankheit;

allerdings war der therapeutische Effekt nicht von Dauer (Shoulson, I., 1998). Die in dieser

Studie gezeigten Ergebnisse könnten allerdings auch auf einem Mechansimus beruhen, der

nicht MAO-B -Inhibierung beinhaltet, sondern durch antiapoptotische Effekte des

Metaboliten Desmethyl-Deprenyl hervorgerufen sein. Dieser Metabolit beeinflußt die Protein-

Transkription (Marsden, C. D. und Olanow, C. W., 1998; Koller, W. C., 1998).

104

DISKUSSION 105

Auch Deprenyl zeigt in hohen Konzentrationen (1000µmol/L) im Staurosporin-Modell

signifikant neuroprotektive Wirkung. Auch in diesem Fall wird allerdings die DNA-

Fragmentation -ähnlich wie bei Pramipexol- nicht unterdrückt.

Dipyridamol Dipyridamol ist eine Substanz die den ATP-Kanal in Mitochondrien eventuell zu hemmen

vermag und dadurch vielleicht die Freisetzung von proapoptotischen Faktoren blockieren

kann.

Farinelli et al. zeigten, daß Dipyridamol in Hippocampus-Neuronen der Ratte, die in nicht

supplementiertem Medium nach 24h größtenteils tot waren, die Zellen

konzentrationsabhängig zu schützen vermag. Konzentrationen < 1µmol/L waren wirkungslos;

Konzentrationen > 20µmol/L toxisch für die Neuronen. Eine Überprüfung von Zellen anderer

Hirnregionen ergab ähnliche Überlebensraten wie bei hippocampalen Zellen (ca.70-80%),

wobei Neurone des Hippocampus und des Kortex am besten auf Dipyridamol ansprachen.

Allerdings wurde mit Dipyridamol kein Langzeit-Überleben gesichert: nach 7d in Kultur

waren nur noch weniger als 10% der Zellen am Leben. Dipyridamol hat folgende

pharmakologische Wirkungen: Hemmung von Phosphodiesterasen, Hemmung der Aufnahme

von Nukleosiden, Hemmung des Multi-Drug-Resistance Proteins, Blockade des

Chloridtransports und eine verstärkte Prostacyclin-Synthese. Der neuroprotektive

Mechanismus von Dipyridamol könnte auf allen diesen Eigenschaften beruhen. Andere

pharmakologische Substanzen, die ebenfalls diese Eigenschaften haben, zeigten allerdings

keine Schutzwirkung. Dipyridamol hat daneben auch antioxidative Eigenschaften. Tatsächlich

konnten N-acetylcystein (NAC) und Vitamin E, beide ebenfalls Antioxidativa, die Neuronen

ebenfalls zu 80% schützen. Der protektive Effekt der drei Substanzen war zudem nicht

additiv. Neurone, die oxidativem Stress (10µM FeSO4 oder 30µM H2O2) ausgesetzt waren,

konnten ebenfalls komplett mit Dipyridamol geschützt werden; zu 75-80% durch NAC oder

Vitamin E. Ein Langzeit-Überleben unter dem nicht supplementierten Medium konnte durch

die Gabe von Dipyridamol plus Insulin erreicht werden (Farinelli, S. E. et al., 1998).

In eigenen Versuchen, bei denen Dipyridamol im Staurosporin-Modell eingesetzt wurde,

wurde jedoch im MTT-Test keine neuroprotektive Wirkung gefunden. Eine Konzentration

von 100µmol/L Dipyridamol war toxisch. Hingegen wurden mit 100µmol/L Dipyridamol

105

DISKUSSION 106

kleinere DNA-Fragmentations-Werte gemessen. Aufgrund der Ergebnisse im MTT-Test kann

aber von einem sekundär-nekrotischem Abbau der DNA-Fragmente ausgegangen werden.

Immunophilin-Ligand FK506

FK506 ist ein Immunosuppressivum, das aber auch TGF-β induzieren kann und in der

Literatur in einigen Neurodegenerations-Modellen als neuroprotektiv beschrieben wurde. Eine

weitere wichtige Eigenschaft ist die Blockade der Rotamase-Aktivität der FKBP, vor allem

FKBP12. Viele neuroprotektive Wirkungen von FK506 lassen sich wahrscheinlich darauf

zurückführen. Die höchsten Konzentrationen an FKBP12 Transkripten wurden im Hirn durch

in situ- Hybridisation im Corpus Striatum gefunden {1056:Dawson et al 1994}; ähnlich hohe

Konzentrationen wurden in der Substantia nigra gefunden. Ebenfalls hohe Transkriptionsraten

sind im Hippocampus beobachtet wobei in der CA1 Zone die Rate am höchsten ist. Die

Verteilung von Calcineurin spiegelt die FKBP12 Verhältnisse wieder (Snyder, S. H. et al.,

1998a). Der Komplex FK506 / FKBP12 hemmt die Aktivität von NOS über die Bindung von

Calcineurin, welches NOS dephosphoryliert und damit aktiviert. Damit wird die Produktion

von NO, das in größeren Mengen toxisch wirken kann und zudem die Freisetzung von

Neurotransmittern bewirket, was ebenfalls toxisch sein kann, wenn z.B. zuviel Glutamat

ausgeschüttet wird, gehemmt. FKBP12 funktioniert als Binde-Protein für Calcineurin in dem

Komplex mit dem IP3-Rezeptor, an dem auch PKC (protein kinase C) beteiligt ist. Der IP3R

wird durch mehrere Kinasen phosphoryliert: u.a. PKC, PKA und die Kalzium-Calmodulin

abhängige Kinase II (CaM-K II); zudem kann sich der Rezeptor selbst phosphorylieren.

Während eine Phyosphorylierung durch PKA den Rezeptor nach Bindung von IP3 weniger

durchlässig für Kalzium macht, wird er durch die Phosphorylierung von PKC oder CaM-K II

anfälliger für Kalzium-Freisetzung nach IP3 Bindung (Snyder, S. H. et al., 1998a).

Inhibierung von Calcineurin durch FK506 führt also zu verstärkter Phosphorylierung durch

PKC; dies wiederum bedeutet erhöhte Wahrscheinlichkeit für Kalzium -Ausstrom.

TGF-beta Rezeptor II kann den TGF-beta Rezeptor I phosphorylieren; dadurch wird eine

Vielzahl von Ereignissen ausgelöst. Im Gehirn sind dies u.a.: LTP (Zhang, F. et al., 1997),

Schutz von Hippocampusneuronen vor ischämischer Schädigung und beta-amyloid-Toxizität

(Henrich-Noack, P. et al., 1996; Prehn, J. H. et al., 1996) und verstärkte axonale Regeneration

(Abe, K. et al., 1996). Einige Autoren beschreiben eine Verstärkung des TGF-beta Signals

106

DISKUSSION 107

durch die Aufhebung der Assoziation mit FKBP12 durch FK506 (Wang, T. et al., 1996; Chen,

Y. G. et al., 1997).

In der Literatur sind einige Untersuchungen über die neuroprotektiven Eigenschaften mit

FK506 gemacht worden: In einem MCAO-Modell (30 min) in hyperglykämischen Ratten

haben Cyclosporin und FK506 bei Gabe 30min vor dem Eingriff das Infarkt-Volumen von

35,7 mm3 auf 6,8 mm3 (FK506) und 9,9 mm3 (Cyclosporin) an Tag 3 nach der Operation

gesenkt (Kuroda, S. et al., 1999). Beim Vergleich von MCAO mit Toxizität durch Injektionen

von exzitatorischen Substanzen (Quinolinat, NMDA, AMPA) in Kortex, Hippocampus oder

Striatum zeigte sich nach 3d folgendes: bei intraperitonealer Gabe von FK506 (10 mg/kg) im

MCAO-Modell wurde eine 50 %ige Reduktion der Läsion beobachtet. In Modellen

exzitatorischer Toxizität sowohl in Hippocampus, Kortex oder Striatum hatte FK506 jedoch

keine Wirkung. Bei intravenöser Gabe von FK506 (1mg/kg) wurde sogar 120 min nach

Beginn der MCAO eine Reduktion von ca. 48-57 % des Läsionsvolumens im Kortex

(allerdings nicht im Striatum) detektiert. Es werden auch antiapoptotische Mechanismen für

den beobachteten Schutz der Neurone vorgeschlagen (Fruman, D. A. et al., 1992; Genestier,

L. et al., 1994; Shibasaki, F. und McKeon, F., 1995; Estevez, A. G. et al., 1995; Li, Y. et al.,

1995a; Li, Y. et al., 1995b; Bonfoco, E. et al., 1995; Linnik, M. D. et al., 1995). FK506

reduziert auch dosisabhängig in einem transienten MCAO-Modell in Ratten das

Infarktvolumen. Diese Eigenschaft korrelierte mit der Fähigkeit, Calcineurin zu hemmen und

war durch Rapamycin zu blocken (Bochelen, D. et al., 1999). FK506 kann in einem MCAO-

Modell (2h, danach 48h Reperfusion) das Infarktvolumen um 40-50% senken. Dabei wurde

FK506 zunächst 30min vor der Rezirkulation oder 1h nach Rezrkulation i.v. gegeben. Bei i.c.

(intrakarotider) Injektion (5min oder 1h nach Rezirkulation) wurde das Infarktvolumen

ähnlich beeinflußt. Cyclosporin A (10mg/kg) i.c. konnte das Infarkvolumen sogar um 90%

der Kontrolle (nach 5min Reperfusion) oder 35% nach 1h Reperfusion senken (Yoshimoto, T.

und Siesjö, B. K., 1999).

FK506 (10-6 M) aber nicht Cyclosporin blockierte die durch Entzug von Serum

hervorgerufene Apoptose in neuronalen Kulturen der Ratte. Zusätzlich wurde c-jun weniger

exprimiert(Yardin, C. et al., 1998). FK506 konnte in einem Modell, in dem Kainat

exzitatorisch-toxischen Zelltod auslöst (vor allem im Hippocampus in der CA1-Region), die

Neuronen schützen {Moriwaka A et al. Neuroscience 1998 Oct 86:3 855-65} Die Produktion

von Superoxid wird in Neutrophilen durch FK506 unterdrückt (Nishinaka, Y. et al., 1993).

107

DISKUSSION 108

FK506 hemmt Calcineurin und bewirkt damit eine verstärkte Phosphorylierung von NOS,

was einer verminderten Aktivität gleichkommt. Daher wirkt FK506 in Situationen, in denen

eine verstärkte NOS-Aktivität eine Rolle spielt, neuroprotektiv. Dies ist z.B. der Fall in

Glutamat-Toxizität und tatsächlich kann FK506 die NMDA Toxizität in kortikalen Kulturen

blocken (Dawson, T. M. et al., 1993). Auch wird Neurotoxizität durch beta-amyloid-Peptid

{1056: Pasinetti and Aisen, 1997 Soc Neurosci Abstract} oder Serum Entzug in kortikalen

Kulturen {1056: Hugon et al. 1997 Abstract} durch FK506 gehemmt. Weiterentwickelte

Substanzen, die nur die Rotamase-Aktivität von Immunophilinen hemmen, jedoch nicht

immunosuppressiv sind, können z.B. die zu 60-70% zerstörten Nervenendigungen

dopaminerger Zellen des nigrostriatalen Systems in einem MPTP-Modell in Ratten zum Teil

wieder herstellen. Die FKBP12 Liganden wurden dabei zeitgleich mit MPTP gegeben. Eine

weiterentwickelte Substanz konnte sogar die Läsionen zu mehr als 95% verhindern. In einem

zweiten Modell, in dem die FKBP 12-Liganden erst 3 Tage nach Gabe von MPTP verabreicht

wurden, konnte ebenfalls eine Verbesserung der Innervation des Striatum mit dopaminergen

Nervenenden gezeigt werden: bis zu 90% der Kontrollwerte wurden mit GPI 1046 erreicht

(Hamilton, G. S. und Steiner, J. P., 1997).

Zusätzlich zu den beschriebenen neuroprotektiven Eigenschaften kommen auch noch

neuroregenerative Eigenschaften: FK506 kann die neurotrophe Wirkung von relativ geringen

Dosen NGF bei PC-12 Zellen verstärken. Wird FK506 zu 0,5 ng/ml NGF zugegeben, kann

die Wirkung von hoch dosiertem NGF (50ng/ml) zu 75% erreicht werden. Der EC50-Wert ist

ungefähr 0,5 nM. Eine Quetschung des N. sciaticus bei Ratten konnte mit FK506 sowohl

morphologisch verbessert werden, als auch funktionell: im Gegensatz zu Ratten die nur eine

Kontrollsubstanz erhielten, konnten mit FK506 behandelte Ratten schon nach 18d wieder

ihre betroffenen Pfoten belasten – im Gegensatz dazu die nichtbehandelten Ratten erst am Tag

25 (Steiner, J. P. et al., 1997b). Die Konzentration des Immunophilins FKBP12 steigt

zusammen mit GAP43 in sich regenerierenden Neuronen an. Sowohl immunsuppressierende

als auch nichtimmun-suppressierende Immunophilin-Liganden können die Regeneration

geschädigter dopaminerger, serotonerger und cholinerger Neurone in vivo stimulieren

(Sabatini, D. M. et al., 1997). GAP43 ist selektiv in sich entwickelnden oder regenerierenden

Neuronen lokalisiert und ein Substrat von Calcineurin. Eine Phosphorylierung von GAP43 ist

mit einer verstärkten Funktion verbunden, und die Phosphorylierung wird durch FK506

verstärkt (Steiner, J. P. et al., 1992). Eine Regeneration von Neuronen durch FK506 konnte in

folgenden Modellen demonstriert werden: nach Läsion des Ischias-Nervs bei Ratten (Steiner,

108

DISKUSSION 109

J. P. et al., 1997c), dies auch durch nicht-immunosuppressive Substanzen: (Steiner, J. P. et al.,

1997a; Gold, B. G., 1997; Steiner, J. P. et al., 1997c). Im MPTP oder 6-OHDA Modell in

Ratten konnte ein nicht-immunosuppressives FK506 Derivat die geschädigten dopaminergen

Neurone z.T. schützen oder regenerieren (Steiner, J. P. et al., 1997a). In dopaminergen

Neuronen ist NGF allerdings nicht neurotroph, daher muss für diesen Fall ein anderer

Mechanismus als Verstärkung der Wirkung von NGF-Wirkung angenommen werden

(Snyder, S. H. et al., 1998a).

Trotz der von vielen Autoren beschriebenen neuroprotektiven Eigenschaften von FK506

konnte in eigenen Versuchen weder im Staurosporin-Modell mit Kortex-Neuronen noch im

Methylmalonat- oder Malonat-Modell mit Kortex- oder Striatum-Neuronen eine

neuroprotektive oder antiapoptotische Wirkung von FK506 beobachtet werden. Offensichtlich

werden in allen untersuchten Modellen nicht oder nicht ausschließlich die von FK506

beeinflußbaren apoptotischen Pfade beschritten. Im Staurosporin-Modell reicht offenbar die

bei PC12-Zellen beobachtete Eigenschaften von FK506, die Wirkung von NGF zu verstärken,

nicht aus, um die Zellen zu retten. Auch die in MCAO-Modellen erreichte neuroprotektive

Eigenschaften von FK506 scheint sich nicht auf die Situation der chemischen Blockade des

Metabolismus in Zellen übertragen zu lassen.

109

ZU

ZUSAMMENFASSUNG

SAMMENFASSUNG 110

110

Apoptose ist ein Programm von Zellen aus Metazoae, um überflüssige oder geschädigte

Zellen fast ohne Nebenwirkungen für umliegende Zellen zu beseitigen. Zum Teil wird dieser

auch “programmierter Zelltod“ genannte Vorgang zielgerichtet eingesetzt, um während der

Entwicklung und im ausgewachsenen Organsimus Organen ihre Gestalt zu geben oder

autoreaktive Zellen des Immunsystems unschädlich zu machen. Es gibt jedoch auch

zahlreiche Hinweise darauf, daß in vielen akuten oder chronischen, neurodegenerativen

Erkrankungen wie bei Schlaganfall, Morbus Parkinsons, Chorea Huntington, Amyotropher

Lateralsklerose und der Alzheimer Krankheit Apoptose oder Teile dieses Programms am

Zelltod in den betroffenen Hirnarealen beteiligt sind.

Apoptose kann durch unterschiedliche Ereignisse ausgelöst werden. Die wichtigsten sind

äußere Faktoren d.h. Proteine die an Rezeptoren binden, ein Mangel an antiapoptotischen

Faktoren d.h. lösliche oder zellständige trophische Faktoren und innere Faktoren wie

irreparable Schädigung der Erbinformation oder Infektionen. Mit Substanzen, die solche

Schäden auslösen oder das Gleichgewicht zwischen pro- und antiapoptotischen Proteinen der

Bcl-2-Familie beeinflussen, läßt sich ebenfalls Apoptose auslösen. Umgesetzt wird Apoptose

vor allem durch sich gegenseitig kaskadenartig aktivierende Proteasen der Caspase-Familie.

Ziel der Arbeit war es, die Rolle der Apoptose in in vitro Modellen neuronaler Degeneration

zu untersuchen. Dazu wurden in vitro Modelle für Apoptose und Neurodegeneration etabliert,

Nachweismethoden für Apoptose an die Modelle adaptiert und schließlich potentiell

antiapoptotische Substanzen in den Modellen getestet. Zunächst wurde in serumfreien, reinen

Neuronenkulturen aus dem Kortex oder Striatum der Ratte Apoptose durch die Zugabe von

Staurosporin induziert. Dieser Breitspektrum-Kinase Inhibitor vermag in vielen Zellarten

Apoptose zu induzieren. Anhand dieses Standard-Modells wurden geeignete

Nachweismethoden ausgewählt: Zelltod wurde mit zwei photometrischen Test bestimmt, bei

dem die Reduktion eines Tetrazoliumsalzes in Mitochondrien lebender Zellen oder die

Freisetzung von Laktatdehydrogenase Maß für das Überleben von Zellen ist. Apoptose wurde

anhand der DNA-Fragmente, die bei Apoptose gebildet werden, quantifiziert.

Die Verhältnisse bei neurodegenerativen Erkrankungen oder Ischämie wurden dann durch

Inkubation der Zellen mit Malonat simuliert. Malonat hemmt reversibel Komplex II der

Atmungskette und verursacht auf diese Weise Energiemangel und Radiaklstress. Komplex II

ZUSAMMENFASSUNG 111

111

Inhibitoren stellen gute Modelle für Chorea Huntington dar; Energiemangel und Radiaklstreß

sind jedoch Phänomene, die bei allen neurodegenerativen Erkrankungen vorkommen.

Staurosporin induziert in Striatum- und Kortexneuronen konzentrationsabhängig Zelltod und

DNA-Fragmentation. Zwei weitere Indikatoren für Apoptose, die Exposition von

Phosphatidylserin auf der Zellmembran sowie erhöhte intrazelluläre Caspase-3-Aktivität

lassen sich ebenfalls nachweisen. Durch Zugabe des Breitspektrum-Caspase-Inhibitors

ZVAD-fmk kann sowohl Zelltod als auch DNA-Fragmentation gehemmt werden. Auch im

Malonat-Modell tritt konzentrationsabhängig Zelltod und DNA-Fragmentation auf. Im

Gegensatz zum Staurosporin-Modell ist die Hemmung des Zelltods mit ZVAD-fmk nicht

signifikant und eine Inhibition der DNA-Fragmentation nur teilweise zu beobachten.

Weitere Substanzen, die oberhalb der Aktivierung terminaler Caspasen in die Ereigniskette

eingreifen können, wurden auf ihre antiapoptotische Wirkung getestet: 1) Pramipexol, ein

Dopamin-Agonist mit antioxidativen Eigenschaften und Hinweisen auf die Hemmung der

Freisetzung von proapotpotischen Faktoren aus Mitochondrien. 2) Deprenyl, ein

Monoaminoxidase-Inhibitor, der den durch Abbau von Dopamin verursachten Radiaklstress

verhindern kann 3) Dipyridamol, eine Substanz die den ATP-Kanal in Mitochondrien

blockieren kann und dadurch eventuell die Freisetzung von proapoptotischen Faktoren hemmt

und 4) FK506, ein Immunsuppressivum, das auch TGF-β induzieren kann und in der Literatur

als in einigen Degenerations-Modellen neuroprotektiv beschrieben wurde. Deprenyl kann in

hohen Konzentrationen den durch Staurosporin induzierten Zelltod signifikant verhindern,

jedoch nicht DNA-Fragmentation. FK506 hat weder im Staurosporin-Modell noch im

Malonat-Modell eine antiapoptotische oder neuroprotektive Wirkung. Da Zelltod und DNA-

Fragmentation mit ZVAD-fmk gehemmt werden können, scheint im Staurosporin-Modell nur

Apoptose aufzutreten. Die durch FK506 beeinflußbaren Schritte scheinen entweder im

Stauroporin-Modell und im Malonat-Modell keine Rolle zu spielen, oder es werden zusätzlich

andere Pfade beschritten. Da ZVAD-fmk im Malonat-Modell den Zelltod nicht verhindert,

sondern nur die DNA-Fragmentation inhibiert, scheint Malonat neben Apoptose auch Nekrose

zu induzieren.

Insgesamt ist in in vitro Modellen neuronaler Degeneration Apoptose nachgewiesen worden.

Durch den Einsatz verschiedener Zellpopulationen konnte deren unterschiedliches

Empfindlichkeitsprofil gegenüber Staurosporin und Malonat festgestellt werden. Es konnte

ZUSAMMENFASSUNG 112

112

auch gezeigt werden, daß die in vivo neuroprotektive Substanz FK506 in den benutzten in

vitro-Modellen nicht neuroprotektiv wirkten.

LITERATURVERZEICHNIS 113

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Die Rolle der Apoptose in in vitro Modellen neuronaler ... · Der Begriff Apoptose (griechisch:apo von weg, von ab, ptosis: u.a. herabfallen oder sinken; frei übersetzt Herabfallen